特許 5964277 試料中の抗体含量を判定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5964277

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】試料中の抗体含量を判定する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20160721BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20160721BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160721BHJP

   C12Q 1/42 20060101ALI20160721BHJP

   C12Q 1/28 20060101ALI20160721BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 545T

   G01N33/553

   G01N33/543 541B

   G01N33/543 545F

   C12Q1/68 A

   C12Q1/42

   C12Q1/28

【請求項の数】12

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2013-143157(P2013-143157)

(22)【出願日】2013年7月9日

(65)【公開番号】特開2014-202742(P2014-202742A)

(43)【公開日】2014年10月27日

【審査請求日】2013年7月9日

(31)【優先権主張番号】102111980

(32)【優先日】2013年4月2日

(33)【優先権主張国】TW

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】595165656

【氏名又は名称】行政院原子能委員会核能研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100080252

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 征四郎

(72)【発明者】

【氏名】陳俊穎

(72)【発明者】

【氏名】陳冠因

(72)【発明者】

【氏名】傅孟鈞

(72)【発明者】

【氏名】蔡青彦

(72)【発明者】

【氏名】林峰輝

(72)【発明者】

【氏名】劉家菁

【審査官】 長谷 潮

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５０１９２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６０−００１５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０７６０９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Janet Barletta，Immunomagnetic quantitative immuno-PCR for detection of less than one HIV-1 virion ，Journal of Virological Methods，２００９年，Vol. 157，pp. 122-132

【文献】 Kuiyang Jiang，Protein immobilization on carbon nanotubes via a two-step process of diimide-activated amidation，J. Mater. Chem.，２００４年，Vol. 14，pp. 37-39

【文献】 Carlos H. Villa et al.，Single-Walled Carbon Nanotubes Deliver Peptide Antigen into Dendritic Cells and Enhance IgG Responses to Tumor-Associated Antigens，ACSNANO，２０１１年，Vol. 5, No. 7，pp. 5300-5311

【文献】 Nabarun Roy et al.，Modifications of carbon for polymer composites and nanocomposites，Progress in Polymer Science，２０１２年 ２月 ３日，Vol. 37，pp. 781-819，Online

【文献】 Yi Lin，Carbon Nanotubes for Immunomagnetic Separation of Escherichia Coli O157:H7，J. Nanosci. Nanotec. ，２００６年，Vol. 6，pp. 868-871

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

Ｇ０１Ｎ ３３／５５３

Ｃ１２Ｑ １／２８

Ｃ１２Ｑ １／４２

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＡＣＳ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

臨床の場で大量のサンプルを生体外で定量測定することによる癌腫診断や治療の評価に適用される、試料中の抗体含量を判定する方法であって、
少なくとも、
（Ａ）球体の炭素ナノ粒子（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、前記炭素ナノ粒子の表面に分布する結合用官能性分子、および上記前記炭素ナノ粒子内に分布する磁性物質と、を有する樹枝状ナノ炭素キャリア構造である磁気ビーズを用意し、前記磁気ビーズ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ）を含む溶液を入れた容器を用意し、それに抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）を添加し、前記抗原が前記磁気ビーズに吸着または結合する、ステップと、
（Ｂ）上記容器の下に磁石をセットし、前記抗原が吸着または結合した前記磁気ビーズを上記容器の底に集中させ、反応していない残りの抗原とその溶液をニードル（Ｎｅｅｄｌｅ）で吸い上げて、抗原を有する磁気ビーズだけのものが得られる、ステップと、
（Ｃ）上記抗原が吸着または結合した磁気ビーズの溶液に、試料を添加して、上記試料中の抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）と、前記磁気ビーズに吸着または結合している上記抗原とを特異性反応させて、前記磁気ビーズに抗体を吸着または結合させ、その後、磁石を上記容器の下にセットし、抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズを上記容器の底に集中させ、抗体を吸着または結合していない試料中の他の物質と、抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズとを分離させる、ステップと、
（Ｄ）上記抗体を吸着または結合した磁気ビーズの溶液に、更に、二次抗体を添加して、この二次抗体を前記抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズに吸着または結合させ、その後、前記二次抗体を吸着または結合させた前記磁気ビーズを、磁界で前記容器の底に集中させ、吸着または結合していない二次抗体を分離する、ステップと、を含み、さらに、
上記二次抗体が吸着又は結合した磁気ビーズを指標としてマークして、次のステップ（Ｅ）、ステップ（Ｆ）およびステップ（Ｇ）のうちのいずれか一つの測定を実行し、
ステップ（Ｅ）は、上記二次抗体にヨウ素−１２５放射性同位体を結合させ、放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＲＩＡ）により、上記ヨウ素−１２５から放射したガンマ線（Ｇａｍｍａ Ｒａｙ， γ−ｒａｙ）で上記ガンマ線の強度を検知して上記試料中の抗体含量を判定し、
ステップ（Ｆ）は、上記二次抗体に、化学発光／酵素結合酵素を結合させ、上記化学発光／酵素結合酵素を化学発光基質（ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ）／酵素結合基質に作用させ、化学発光免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ， ＣＬＩＡ）や酵素結合免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）により、上記光子の発光強度／酵素結合吸光値を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
ステップ（Ｇ）は、上記二次抗体にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）を結合させ、また、一つの核酸分子にもビオチンを結合させ、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で上記核酸分子と上記二次抗体とが結合され、イムノＰＣＲ法（Ｉｍｍｕｎｏ ＰＣＲ）により、Ｔａｇ酵素でＰＣＲ反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子を分離して、上記試料中の抗体含量を判定する、
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項2】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記試料は、癌腫病者の血清である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項3】

請求項２に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記癌腫は、鼻咽頭癌である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項4】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記抗体は、Ａｎｔｉ−ＥＢＶ ＩｇＡである
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項5】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記二次抗体は、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＡである
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項6】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ（Ｆ）においては、化学発光／酵素結合酵素が、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅ ＲａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＡＰ）である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項7】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ（Ｆ）においては、自動化血清免疫測定器で、化学発光／酵素結合免疫測定法を行う
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項8】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ（Ｆ）においては、光電子増倍管（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ， ＰＭＴ）検知器で、光子の発光強度／酵素結合吸光値を検知する
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項9】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記ステップ（Ｇ）の分離プロセスは、ゲル電気泳動（Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項10】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記結合用官能性分子は、酸及びアルカリによって処理されて、電離放射線によって照射されることにより形成された官能基を有する
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項11】

請求項１０に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記官能基は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）やアミノ基（−ＮＨ_２）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＯＨ）或いはエステル基（−ＣＯＯ−）である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【請求項12】

請求項１に記載の試料中の抗体含量を判定する方法において、
上記磁性物質は、鉄やコバルト、ニッケル及び四三酸化鉄（Ｆｅ_４Ｏ_３）の磁石粉（Ｍａｇｎｅｔ）である
ことを特徴とする試料中の抗体含量を判定する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中の抗体含量を判定する方法に関し、特に、病気について、高い専用性の磁性炭素微粒子を利用して、特に、高精度の敏感度と正確度で検知でき、また、大幅にコストダウン且つ便利になる方法に関し、そして、サンプル純化や、臨床の場で大量のサンプルを生体外で定量測定することによる癌腫診断や治療の評価に適用できる。

【背景技術】

【0002】

従来の酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ， ＥＬＩＳＡ）は、図９のように、容器８の底部に、一層の抗原９を塗布するだけであるため、上記抗原９の表面積の使用が制限され、また、有効的に検知の敏感度を向上できない。
そのため、一般の従来のものは、ユーザーにとって実用的ではない。

【0003】

本発明者は、上記欠点を解消するため、慎重に研究し、また、学理を活用して、有効に上記欠点を解消でき、設計が合理である本発明を提案する。

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の主な目的は、従来技術の上記問題点を解消するため、病気に対して高い専用性の磁性炭素微粒子を利用して、その結合した官能性分子により、結合した抗原／抗体の表面積が増加され、そのナノ粒子表面に結合された抗原が、若干倍に増加され、検知の敏感度や正確度が向上され、また、有効に大幅にコストダウンと便利性とが向上され、臨床の場で大量のサンプルを生体外で定量測定することによる癌腫診断や治療の評価及びサンプル純化が行われる方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明では、
溶液により複数の炭素磁気ビーズ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ）が供給され、
それに抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）／抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）が添加され、
上記抗原／抗体が上記磁気ビーズに吸着または結合し、
磁界により上記磁気ビーズを容器の底に集中させ、
また、残りの反応していない抗原／抗体とその溶液をニードル（Ｎｅｅｄｌｅ）で吸い上げ、
純粋な抗原／抗体を有する磁気ビーズだけのものが形成され、
そして、試料を上記抗原／抗体を有する磁気ビーズの溶液に添加して、
上記試料の抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）／抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）と上記抗原／抗体とを特異性反応させて、
上記磁気ビーズに吸着或いは結合させ、
その後、磁界でそれらを容器の底に集中させ、
吸着または結合していない試料中の他の物質を分離させ、
上記抗体を結合した磁気ビーズの溶液において、更に、二次抗体が添加されて、
上記二次抗体が吸着または結合された磁気ビーズを指標としてマークして、
続きの放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＲＩＡ）や化学発光免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ，ＣＬＩＡ）、酵素結合免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）或いはイムノＰＣＲ法（Ｉｍｍｕｎｏ ＰＣＲ）の測定を行い、また、上記二次抗体が吸着や結合された後、同じように、磁界でそれらを容器の底に集中させ、吸着または結合していない二次抗体が分離され、
放射免疫測定法を行うことにより、上記二次抗体にヨウ素−１２５放射性同位体が結合され、上記ヨウ素−１２５から放射したガンマ線（Ｇａｍｍａ Ｒａｙ， γ−ｒａｙ）により、上記ガンマ線の強度を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
化学発光／酵素結合免疫測定法を行う時、上記二次抗体に化学発光／酵素結合酵素を結合させ、上記化学発光／酵素結合酵素を化学発光基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）／酵素結合基質に作用させ、上記光子の発光強度／酵素結合吸光値を検知して、上記試料中の抗体含量を判定し、
イムノＰＣＲ法を行う時、上記二次抗体にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）を結合させ、また、一つの核酸分子にもビオチンを結合させ、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で上記核酸分子と上記二次抗体とが結合され、Ｔａｇ酵素でＰＣＲ反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子を分離して、上記試料中の抗体含量を判定する。

【0006】

以下、図面を参照しながら、本発明の特徴や技術内容について詳しく説明するが、それらの図面等は参考や説明のためであり、本発明はそれによって制限されることが無い。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】本発明の試料中の抗体含量を判定する方法の流れ図である。

【図2】磁気ビーズに抗原を結合するステップ１１の流れ図である。

【図3】磁性吸着清浄ステップ１２の流れ図である。

【図4】磁気ビーズに抗体を結合するステップ１３の流れ図である。

【図5】磁気ビーズに二次抗体を結合するステップ１４の流れ図である。

【図6】放射免疫測定ステップ１５の流れ図である。

【図7】化学発光／酵素結合免疫測定ステップ１６の流れ図である。

【図8】イムノＰＣＲステップ１７の流れ図である。

【図9】従来の酵素結合免疫吸着測定法の概念図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

図１〜図８は、それぞれ、本発明の試料中の抗体含量を判定する方法の流れ図と磁気ビーズに抗原を結合するステップ１１の流れ図、磁性吸着清浄ステップ１２の流れ図、磁気ビーズに抗体を結合するステップ１３の流れ図、磁気ビーズに二次抗体を結合するステップ１４の流れ図、放射免疫測定ステップ１５の流れ図、化学発光／酵素結合免疫測定ステップ１６の流れ図及びイムノＰＣＲステップ１７の流れ図である。
図のように、本発明に係る試料中の抗体含量を判定する方法は、少なくとも次のステップを含む。
（Ａ）磁気ビーズに抗原を結合するステップ１１：
図２のように、溶液２０が収納された容器２に対して、複数の磁気ビーズ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ）３を供給し、また、それに抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）／抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）４０を添加し、上記抗原４０が上記磁気ビーズ３に吸着または結合する。
上記磁気ビーズ３が樹枝状ナノ炭素キャリア構造で、球体のナノ粒子（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）３１、上記ナノ粒子３１の表面に分布した結合用官能性分子３２及び上記ナノ粒子３１内に分布した磁性物質３３を備える。
（Ｂ）磁性吸着清浄ステップ１２：
図３のように、上記容器２の下方に磁石（Ｍａｇｎｅｔ）２１がセットされ、磁界で磁気ビーズ３を集中させ、また、残りの反応していない抗原／抗体４０とその溶液２０をニードル（Ｎｅｅｄｌｅ）５で吸い上げ、純粋な抗原／抗体４０を有する磁気ビーズ３を形成する。
（Ｃ）磁気ビーズに抗体を結合するステップ１３：
図４のように、試料４を上記抗原／抗体４０を有する磁気ビーズ３の溶液２０に添加し、上記試料４中の抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）／抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）４１と上記抗原４０とが特異性反応して、上記磁気ビーズ３に吸着や結合され、その後、ステップ（Ｂ）のように、磁界でそれらを集中させて、吸着または結合していない試料４中の他の物質を分離させる。
（Ｄ）磁気ビーズに二次抗体を結合するステップ１４：
図５のように、上記抗体４１を結合した磁気ビーズ３の溶液２０に、更に、二次抗体４２を添加することにより、上記二次抗体４２が吸着や結合された磁気ビーズ３を指標としてマークして、続きのステップ（Ｅ）やステップ（Ｆ）或いはステップ（Ｇ）の測定に利用する。
上記二次抗体４２に、それぞれ、放射性同位体（Ｉｓｏｔｏｐｅ）や酵素或いは核酸分子（ＤＮＡ）の三種類の異なる信号分子６を結合することができる。
（Ｅ）放射免疫測定ステップ１５：
図６のように、放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＲＩＡ）を行い、上記二次抗体４２にヨウ素−１２５放射性同位体６ａを結合させ、上記ヨウ素−１２５から放射したガンマ線（Ｇａｍｍａ Ｒａｙ， γ−ｒａｙ）で、上記ガンマ線の強度を検知して上記試料４中の抗体４１含量を判定する。
（Ｆ）化学発光／酵素結合免疫測定ステップ１６：
図７のように、化学発光免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ， ＣＬＩＡ）／酵素結合免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）を行い、上記二次抗体４２に化学発光／酵素結合酵素６ｂを結合させ、上記化学発光／酵素結合酵素６ｂを化学発光基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）／酵素結合基質に作用させ、上記光子の発光強度／酵素結合吸光値を検知して、上記試料４中の抗体４１含量を判定する。
（Ｇ）イムノＰＣＲステップ１７：
図８のように、イムノＰＣＲ法（Ｉｍｍｕｎｏ ＰＣＲ）を行い、上記二次抗体４２にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）６１ｃを結合させ、また、核酸分子６ｃにもビオチン６１ｃを結合させ、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）６２ｃで上記核酸分子６ｃと上記二次抗体４２とが結合され、それから、Ｔａｇ酵素でＰＣＲ反応させて信号を拡大し、分離プロセスにより核酸分子６ｃを分離して、上記試料４中の抗体４１含量を判定する。

【0009】

上記ナノ粒子３１はナノ炭素玉、すなわち、球体のナノ粒子であり、上記結合用官能性分子３２は酸及びアルカリ処理や電離放射線照射によって形成された、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）やアミノ基（−ＮＨ_２）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＯＨ）或いはエステル基（−ＣＯＯ−）の官能基が備えられ、上記磁性物質３３は、鉄やコバルト、ニッケル及び四三酸化鉄（Ｆｅ_４Ｏ_３）の磁石粉である。

【0010】

本発明のより良い実施例中によれば、上記磁気ビーズ３をキャリアとする構造で、結合官能性分子３２により、抗原４０を上記ナノ粒子３１の表面に結合させ、また、容器２の底部に磁石２１を設置することにより、上記磁気ビーズ３中の磁性物質３３が磁界により、上記磁石２１の方向へ移動して集中され、また、上記ニードル５により残りの溶液が吸い上げられ、これにより、簡単に反応していない抗原４０が清浄除去されて、純粋な抗原４０を有する磁気ビーズ３が形成され、また、試料４をそれに添加し、本実施例において、鼻咽頭癌患者の血清を使用する。病気に対して、専用性的に吸着する磁気ビーズ３を利用して、上記血清中のＡｎｔｉ−ＥＢＶ ＩｇＡ抗体４１だけを上記磁気ビーズ３に結合させることができ、また、同じように、磁界で上記磁気ビーズ３を集中して吸着し、吸着されていない血清中の他の物質が分離除去され、最後に、ＥＢＶ ＩｇＡが結合された磁気ビーズ３に、更に、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ二次抗体４２が結合され、磁界で集中させて吸着させ、吸着されていない二次抗体４２が分離除去され、その後、上記二次抗体４２に、それぞれ、選択的に三種類の異なる信号分子６が結合されて、放射免疫測定法や化学発光免疫測定法、酵素結合免疫測定法或いはイムノＰＣＲ法の測定が行われる。

【0011】

放射免疫測定法を行う時、上記二次抗体４２にヨウ素−１２５放射性同位体６ａが結合され、上記ヨウ素−１２５から放射したガンマ線により、ガンマ線検知器（Ｇａｍｍａ−ｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）７ａで上記ガンマ線の強度を検知すると、上記試料４中のＡｎｔｉ−ＥＢＶ ＩｇＡ抗体４１含量を判定でき、高い正確性且つ低コストの検知方法になる。

【0012】

化学発光／酵素結合免疫測定法を行う時、上記二次抗体４２に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨｏｒｓｅＲａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＡＰ）等の化学発光／酵素結合酵素６ｂが結合され、上記両種類の化学発光／酵素結合酵素を化学発光／酵素結合基質に作用させ、光電子増倍管（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ， ＰＭＴ）検知器で、上記光子の発光強度／酵素結合吸光値を検知して、上記試料４中の抗体４１含量を判定する。
上記方法による信号と比べると、上記放射免疫測定法の方が大幅に拡大され、より良い正確度が得られるだけでなく、既存の自動化血清免疫測定器に合わせて使用すると、より良い便利性が得られる。

【0013】

イムノＰＣＲ法を行う時、上記二次抗体４２にビオチン６１ｃを結合させ、また、上記核酸分子６ｃにもう一つのビオチン６１ｃを結合させ、上記ストレプトアビジン６２ｃがビオチンに対して強い吸着力があって、また、各ストレプトアビジンに四つのビオチンを結合することができるため、上記核酸分子６ｃと上記二次抗体４２とが結合され、その後、Ｔａｇ酵素を利用してＰＣＲ反応させ、そして、ゲル電気泳動（Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）７ｃにより核酸分子６ｃを分離して、上記試料４中の抗体４１含量を判定する。また、３０循環（Ｃｙｃｌｅ）に反応すれば得られる信号が１０億倍に拡大され、そのため、上記方法は、最も敏感の検知方法になり、約５８０分子の濃度まで検知できる。

【0014】

以上のように、本発明に使用された磁気ビーズが、病気に対して、高い専用性を有し、その結合用官能性分子により、抗原を結合するための表面積が増加され、上記ナノ粒子表面に結合される抗原が、従来の酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ， ＥＬＩＳＡ）に比較すると、明白に若干倍に増加され、検知の敏感度や正確度が向上され、大幅にコストダウン且つ便利になり、従来方法の代わりに利用でき、また、病気の純化医療に適用でき、臨床の場で大量のサンプルを生体外で定量測定することによる癌腫診断と治療の評価に適合する。

【0015】

以上のように、本発明に係る試料中の抗体含量を判定する方法は、有効に従来の諸欠点を解消でき、病気に対して高い専用性を有し、その結合用官能性分子により抗原を結合するための表面積が増加され、上記ナノ粒子表面に結合される抗原が明白に若干倍に増加され、検知の敏感度や正確度が向上され、また、有効に大幅にコストダウンと便利性が向上され、サンプル純化や臨床の場で大量のサンプルを生体外で定量測定することによる癌腫診断と治療の評価に適用でき、そのため、本発明は、より進歩的かつより実用的で、法に従って特許請求を出願する。

【0016】

以上は、ただ、本発明のより良い実施例であり、本発明は、それによって制限されることが無く、本発明に係わる特許請求の範囲や明細書の内容に基づいて行った等価の変更や修正は、全てが、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。

【符号の説明】

【0017】

（本発明部分）
ステップ（Ａ） 炭素磁気ビーズに抗原を結合する１１
ステップ（Ｂ） 磁性吸着清浄１２
ステップ（Ｃ） 炭素磁気ビーズに抗体を結合する１３
ステップ（Ｄ） 炭素磁気ビーズに二次抗体を結合する１４
ステップ（Ｅ） 放射免疫測定１５
ステップ（Ｆ） 化学発光／酵素結合免疫測定１６
ステップ（Ｇ） イムノＰＣＲ１７
２ 容器
２０ 溶液
２１ 磁石
３ 炭素磁気ビーズ
３１ ナノ粒子
３２ 結合用官能性分子
３３ 磁性物質
４ 試料
４０ 抗原／抗体
４１ 抗体／抗原
４２ 二次抗体
５ ニードル
６ 信号分子
６ａ 放射性同位体
６ｂ 化学発光／酵素結合酵素
６ｃ 核酸分子
６１ｃ ビオチン
６２ｃ ストレプトアビジン
７ａ ガンマ線検知器
７ｂ 光電子増倍管検知器
７ｃ ゲル電気泳動
（従来部分）
８ 容器
９ 抗原

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】