特許 5964280 ＩｇＥＣＨ３ペプチドワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5964280

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】ＩｇＥＣＨ３ペプチドワクチン

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20160721BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 39/385 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160721BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/00ZNA

   A61K39/00 H

   A61K39/385

   A61K39/39

   A61P37/08

   !C12N15/00 A

【請求項の数】18

【全頁数】121

(21)【出願番号】特願2013-167494(P2013-167494)

(22)【出願日】2013年8月12日

(62)【分割の表示】特願2012-175784(P2012-175784)の分割

【原出願日】2009年12月4日

(65)【公開番号】特開2014-12009(P2014-12009A)

(43)【公開日】2014年1月23日

【審査請求日】2013年9月9日

(31)【優先権主張番号】61/120,989

(32)【優先日】2008年12月9日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】311007693

【氏名又は名称】ファイザー バクシーンズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(72)【発明者】

【氏名】アラン ダニエル ブラウン

(72)【発明者】

【氏名】ブライアン ロバート チャンピオン

(72)【発明者】

【氏名】クレア クリスティ

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド ポール ジェルヴェー

(72)【発明者】

【氏名】リン ハワード ジョーンズ

(72)【発明者】

【氏名】アン マリア クリスティーナ ケルストロム

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド キャメロン プライド

(72)【発明者】

【氏名】リー リチャード ロバーツ

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド マイケル ワイアット

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５１８０３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１０２７０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５３７４０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２８１９８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−０４３３７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−２２５３９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１７０２２９（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫原性担体に連結された少なくとも１つの抗原性ＩｇＥペプチドを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥペプチドが、配列番号３１２のアミノ酸配列からなり、前記抗原性ＩｇＥペプチドが、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに結合するリンカーを介して前記免疫原性担体に連結している、免疫原。

【請求項2】

前記免疫原性担体が、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａ ＶＬＰからなる群から選択されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、請求項１に記載の免疫原。

【請求項3】

前記リンカーが、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に結合し、式（Ｇ）_ｎＣ［式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群から選択される整数である］を有する、請求項２に記載の免疫原。

【請求項4】

前記リンカーが、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＮ末端に結合し、式Ｃ（Ｇ）_ｎ、［式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群から選択される整数である］を有する、請求項２に記載の免疫原。

【請求項5】

式（Ｇ）_ｎＣ中、ｎは、０、１、２、および３からなる群から選択される整数である、請求項３に記載の免疫原。

【請求項6】

式Ｃ（Ｇ）_ｎ中、ｎは、０、１、２、および３からなる群から選択される整数である、請求項４に記載の免疫原。

【請求項7】

前記リンカーが、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に結合しているＧＧＣ（ペプチド−ＧＧＣ）である、請求項２に記載の免疫原。

【請求項8】

前記抗原性ＩｇＥペプチドが、配列番号３１２のアミノ酸配列からなり、前記免疫原性担体が、Ｑｂｅｔａ ＶＬＰである、請求項７に記載の免疫原。

【請求項9】

請求項２から８のいずれか一項に記載の免疫原を含む組成物。

【請求項10】

さらにアジュバントを含む、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記アジュバントがミョウバンである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記アジュバントがＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項13】

前記アジュバントがサポニン系アジュバントである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項14】

前記ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが配列番号４３３、配列番号４３２、および配列番号４３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の組成物。

【請求項15】

ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはサポニン系アジュバントから選択される第２のアジュバントをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項16】

前記第２のアジュバントがＣｐＧ２４５５５（配列番号４３１）である、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

請求項１に記載の免疫原および薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項18】

抗原性ＩｇＥペプチドが配列番号３１２のアミノ酸配列からなり、免疫原性担体がＱｂｅｔａ ＶＬＰであり、リンカーが抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に結合しているＧＧＣである、請求項１７に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＩｇＥ媒介性障害を予防、治療、または軽減するための、好ましくは免疫原性担体に連結した抗原性ＩｇＥペプチドを含む新規免疫原の提供に関する。本発明はさらに、これらの薬物、その免疫原性組成物および医薬組成物を製造するための方法、および医薬におけるこれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

過去数十年の間に、アレルギー性疾患は、蔓延していると言っていい規模まで増大しており、推定により、多くの西洋諸国において全人口の２０〜３０％が影響を受けていることが示されている。アレルギー反応の開始においてＩｇＥが果たす重要な役割は十分に立証されている。Ｂリンパ球から放出されると、ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基球上に存在する高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）に結合する。次いで、特定のアレルゲンによってこれらの細胞上の隣接するＩｇＥ分子が引き続いて架橋されることにより活性化され、いくつかの炎症促進性メディエーター（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジン）、ならびに主要なサイトカインおよびケモカインを放出する。その結果として、急性の局所的な応答の後に他の炎症細胞（例えば、好酸球、Ｔリンパ球）の動員および活性化が起こり、それによってアレルギーカスケードを増幅する。樹状細胞、例えば、アレルギー性炎症部位（例えば、肺）に存在する樹状細胞もＦｃｅＲ１を発現することができ、この受容体を使用することによって、ＩｇＥとの免疫複合体中に存在するアレルゲンを選択的かつ効率的に取り込み、アレルゲン特異的Ｔ細胞に提示するためにこれらのアレルゲンを選択的に処理することができ、こうして持続性のＴ細胞活性化および病的な炎症反応の機構をもたらす。

【0003】

ほとんどの現在の治療レジメンは、疾患の原因を治療するのでなく、症状を軽減することを目的とし、抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン、クロモグリク酸、β−アゴニストの使用、およびコルチコステロイドなどの一般的な抗炎症化合物に主に基づく。発症した患者の一部は、これらの薬剤を用いた比較的良好な制御下で疾患を有するが、その投与頻度（多くの場合、毎日またはさらには１日数回）は、患者のコンプライアンス低下およびその後の疾患の悪化につながることが多い。さらに、重度の喘息および重度のアトピー性皮膚炎などのいくつかの場合では、既存の療法は、疾患を制御するのに不十分である。

【0004】

ごく最近では、モノクローナル抗体（オマリズマブ、Ｅ２５とも呼ばれ、商標名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）で市販されている；Ｐｒｅｓｔａら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３年９月１日；１５１（５）：２６２３〜３２．）が、主に重度の喘息および鼻炎を治療するために、世界中のいくつかの機関から認可を得ている。重度の喘息に対して効力を示すにも関わらず、この抗体は、依然としていくつかの欠点を有する。第１に、これはヒト化マウスモノクローナル抗体であり、したがって、ヒト患者において免疫学的反応を完全には妨げず、したがって、いくつかの安全性の懸念が生じる可能性がある。第２に、重度の喘息を治療するのに使用されるオマリズマブの用量は、体重および循環遊離ＩｇＥのレベルの両方に基づく。体重および循環遊離ＩｇＥが指定された範囲から逸脱する患者は、この治療を使用することを推奨されない。治療することができる患者は、２週間毎に一度、最大３回の皮下注射を受けることを必要とする場合がある。治療の費用（患者一人当たり年間ＵＳ＄１５，０００〜４４，０００の範囲と推定される）、ならびに患者の生活の質に対するこの深刻な影響は、アレルギーを治療するための一般的なストラテジーとしてこの治療を使用することを困難にしている。

【0005】

高い費用および頻繁な投与の問題を克服するための代替案は、ワクチン接種によって自己の免疫系に治療抗体を産生させることである。

【0006】

その調査の過程で、アレルギー分野における以前の研究者らは、新しい抗アレルギー療法を設計する際に考慮されなければならない、いくつかの考慮事項および問題に遭遇した。最も危険な問題の１つは、ヒスタミン放出シグナルにおけるＩｇＥ架橋の関与を中心とするものである。ほとんどの場合、活性ワクチン接種の間の抗ＩｇＥ抗体の産生は、アレルゲンの非存在下での隣接するＩｇＥ受容体複合体の架橋によって、それ自体がヒスタミン放出の引き金を引くことができる。この現象は、アナフィラキシー誘発性（ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）と呼ばれる。実際に、ＩｇＥ検出アッセイのために通常使用される多くの市販の抗ＩｇＥモノクローナル抗体はアナフィラキシー誘発性であり、結果として、実用的でなく、患者に投与された場合は危険である可能性がある。したがって、安全で有効であるために、受動的に投与される、またはワクチンで誘発される抗体は、それ自体がアナフィラキシー性ではなくＩｇＥ活性を阻害することができるＩｇＥの領域内で結合しなければならない。

【0007】

ＩｇＥ高親和性受容体ＦｃｅＲＩ αサブユニットと相互作用するヒトＩｇＥ由来の定常ドメインＣＨ３−ＣＨ４の構造が解明された（Ｗｕｒｚｂｕｒｇ ＢＡら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３（３）３７５〜８５；Ｇａｒｍａｎ ＳＣら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ２０；４０６（６７９３）：２５９〜６６）。以前の研究でも、非アナフィラキシー誘発性抗ＩｇＥ抗体を誘発するのに有用であると考えられているいくつかのＩｇＥペプチド、または誘導ペプチドもしくはミモトープが同定されていた（ＷＯ１９９３／００５８１０；ＷＯ９９／６７２９３；ＷＯ２００４／０５８７９９、ＷＯ９７３１９４８、ＷＯ２０００／２５７２２、ＷＯ０５／０７５５０４、ＵＳ２００２／０６４５５２５、ＵＳ２００４／１４６５０４、およびＵＳ２００６／０６２７８２；ＷＯ００／０５０４６１、ＷＯ０２／３４２８８、およびＷＯ２００３／０９２７１４；Ｃｈｅｎら（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ．Ｍｅｔｈ．３３３：１０〜２３；Ｈｅｌｌｍａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ７（２）：１９３〜２０８（２００８））。そのようなＩｇＥドメインまたはペプチドは、個体におけるＩｇＥに対する自己寛容を破壊するために、通常担体に連結されることによってその免疫原性を増大させる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、免疫原性担体にカップリングされ、１つまたは複数のアジュバントとともに任意選択により投与され、循環遊離ＩｇＥのレベルを著しく低減することができる強力な非アナフィラキシー誘発性抗ＩｇＥ抗体を個体において誘発することができる、抗原性ＩｇＥペプチドまたはいくつかのその組合せなどの組成物を提供することが望ましい。効力の増大は一般に、以下の利点をもたらすであろう：臨床的利点を実現するのに必要とされる用量が低いこと、例えば、皮下または筋肉内投与に必要とされる注射の量が少ないこと（例えば、モノクローナル抗体療法と比較して）、治療の費用が低いこと、治療が成功する機会が増大すること、治療レジメンにおいて投与の頻度が減少すること、したがって、体重がより重くかつ／または循環ＩｇＥのレベルが高い患者を含めた、患者の広い集団に治療へのアクセスを提供すること、および患者の生活の質を改善すること。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、好ましくは免疫原性担体に連結した抗原性ＩｇＥペプチドを含む免疫原に関する。前記ＩｇＥ抗原性ペプチドは、配列番号１〜４３０からなる群、好ましくは配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは配列番号２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。前記抗原性ＩｇＥペプチドは、好ましくはシステインもしくはリシン残基の付加および／またはＧＣ／ＧＧＣリンカーなどのリンカーの付加によって、コンジュゲーションのために修飾することができる。好適な実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、立体配置的に束縛されており、好ましくは単に束縛されている。前記免疫原性担体は、異種タンパク質、好ましくはウイルス様粒子（ＶＬＰ）、より好ましくは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰである。本発明はまた、好ましくは免疫原性担体に連結したそのような抗原性ＩｇＥペプチドを製造するための方法に関する。

【0010】

本発明はまた、免疫原性担体、好ましくは免疫原性組成物に好ましくは連結したそのような抗原性ＩｇＥペプチドを含み、ミョウバン、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、好ましくはＣｐＧ７９０９およびＣｐＧ２４５５５、ならびにサポニン系アジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘからなる群から好ましくは選択されるアジュバントを任意選択により含む免疫原性組成物に関する。好ましくは、前記ＣｐＧ含有核酸は、１つまたは複数の修飾された連結、好ましくは１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含み、さらにより好ましくは、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。

【0011】

本発明の別の態様は、本発明による抗原性ＩｇＥペプチドを含む医薬組成物、またはその免疫原性組成物、ならびにそのような組成物の医療用途に関する。

【0012】

特に、本発明は、好ましくはＩｇＥ媒介性障害の治療、軽減、または予防における薬物として使用するための本発明の抗原性ＩｇＥペプチド、またはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物に関する。本発明はまた、自己ＩｇＥに対する個体における免疫応答を誘発する方法、およびＩｇＥ媒介性障害を治療、軽減、または予防するための方法であって、有効量の前記抗原性ＩｇＥペプチド、またはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ヒトＩｇＥのＣＨ３−ＣＨ４領域と、その高親和性受容体ＦｃｅＲＩとの相互作用の構造を示す図である。それぞれ配列番号１６５、３１２、１、および２２０の４つのペプチドに対応する４つのループ（青、紫、橙および黄）が表示されている。

【図2】ヒトＩｇＥの構造が確定しているエピトープに対する抗体応答を誘発するためのペプチドフォーマットを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

定義および一般的な技法
本明細書で別段の定義のない限り、本発明に関連して使用される科学的用語および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。一般に、本明細書で記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにこれらの技法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。

【0015】

本発明の方法および技法は、別段の指定のない限り、当技術分野で周知の従来方法によって、かつ本明細書全体にわたって引用され、論じられる様々な一般的な参考文献およびより具体的な参考文献において記載されているように一般に実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照。酵素反応および精製技法は、当技術分野において一般に実現され、または本明細書に記載されるように、製造者の仕様書に従って実施される。

【0016】

本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに薬化学および医薬品化学に関連して使用される命名法、ならびにこれらの実験室手順および技法は、当技術分野において周知のものであり、一般に使用される。

【0017】

本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、指定した整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことを示すと理解されるであろう。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる」、および「から本質的になる」は、互換性であることを意味する。本開示において、用語「ｏｎｅ」、「ａ」、または「ａｎ」が使用される場合、これらは、別段の指定のない限り、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を意味する。さらに、文脈による別段の要求のない限り、単数形の用語は、複数存在することを含むものとし、複数用語は、内容による明らかな別段の指示のない限り、単数形を含むものとする。

【0018】

上記であっても下記であっても、本明細書に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0019】

一般的な定義：
用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ポリマーの長さに関係なく、アミノ酸のポリマーを指し、したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾を指定または除外せず、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合的な付着を含むポリペプチドは、用語ポリペプチドによって明白に包含される。アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、天然に存在しないアミノ酸、無関係の生物系においてのみ天然に生ずるアミノ酸、哺乳動物系由来の修飾アミノ酸などを含む）、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するもの、および天然に存在しないものの両方の、当技術分野で知られている他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義内に含まれる。

【0020】

用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離されたペプチド」は、その起源または誘導源によって、（１）その天然状態において付随する、天然に付随する成分を伴わない、（２）同じ種に由来する他のタンパク質を含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）自然において生じないタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである。したがって、化学的に合成され、またはペプチドが天然に発生する細胞と異なる細胞系において合成されるペプチドは、その天然に付随する成分から「単離される」ことになる。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製技法を使用して単離することによって、天然に付随する成分を実質的に含まないようにすることもできる。

【0021】

本明細書で使用する場合、用語「精製された」が、分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）に関して使用される場合、これは、精製される分子の濃度が、その天然の環境、または精製される分子が産生、発見、もしくは合成された環境においてこれに関連する分子と比べて増大されたことを意味する。天然に付随する分子は、タンパク質、核酸、脂質、および糖を含むが、しかし一般に、完全性を維持し、または精製される分子の精製を促進するのに添加される水、バッファー、および試薬を含まない。

【0022】

いくつかの実施形態では、化合物は、これが、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、または少なくとも６０重量％、これが天然に付随し、またはこれが製造の間に付随する有機分子を含まないとき、実質的に純粋であるか、精製されている。いくつかの実施形態では、配合物は、その混入物に対して、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、または少なくとも９９重量％の対象とする化合物である。

【0023】

実質的に純粋な化合物または精製された化合物は、例えば、天然源（例えば、細菌）から抽出することによって、化合物を化学合成することによって、または精製および化学修飾の組合せによって得ることができる。実質的に純粋な化合物または精製された化合物は、例えば、対象とする抗体に結合する化合物を有する試料を濃縮することによっても得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、クロマトグラフィー、質量分析、高速液体クロマトグラフィー分析などによって測定することができる。

【0024】

用語「異種の」は、ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドとの関連で本明細書で使用する場合、ＩｇＥポリペプチド融合タンパク質が、ＩｇＥペプチドまたはポリペプチド、および「異種の」ポリペプチドを含む場合、ＩｇＥペプチドまたはポリペプチド以外であるポリペプチド、例えば、ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドに天然において通常伴われないポリペプチドを指す。例えば、異種ポリペプチドは、ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドとの有意なアミノ酸配列同一性をまったく有さず、例えば、異種ポリペプチドは、ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満である。

【0025】

本明細書で使用する場合、用語「ＩｇＥ媒介性障害」または「ＩｇＥ関連障害」は、免疫グロブリンＩｇＥに対する過剰産生および／または過敏症を特徴とする状態または疾患を意味する。特に、これは、例えば、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎および結膜炎（枯草熱）、湿疹、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、ならびにピーナッツアレルギーを含む食物アレルギーを含めたアナフィラキシー性過敏症ならびにアトピー性アレルギーに関連する状態を含むと解釈される。例えば、ハチ刺され、蛇咬、食物または薬物療法によって引き起こされるアナフィラキシーショックの深刻な生理的状態も、この用語の範囲下に包含される。他のＩｇＥ媒介性障害として、アナフィラキシー、接触性皮膚炎、アレルギー性胃腸病、アレルギー性肺アスペルギルス症、アレルギー性紫斑、湿疹、過剰ＩｇＥ（ヨブ）症候群、アナフィラキシー性過敏症、ＩｇＥ骨髄腫、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、および感染性大腸炎）、じん麻疹、および乾癬が挙げられる。

【0026】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチド
本発明は、ＣＨ３−ＣＨ４領域とその高親和性受容体ＦｃｅＲＩとの相互作用に関与するループを形成することができるＩｇＥ ＣＨ３ドメインの部分として同定された、ＩｇＥペプチドおよびこれに由来するペプチドに関する（図１を参照）。そのようなＩｇＥペプチドは、免疫原性であり、非アナフィラキシー誘発性であることが示された。

【0027】

そのような抗原性ＩｇＥペプチドは、ＩｇＥ関連障害を治療、予防し、または回復させるために、単独または組合せで使用することによって、好ましくは免疫原性担体とコンジュゲートしたとき、対象において自己抗ＩｇＥ抗体を誘発することができる。

【0028】

特に、本発明は、好ましくは免疫原性担体に連結した抗原性ＩｇＥペプチドからなる、このペプチドから本質的になる、またはこのペプチドを含む免疫原に関する。

【0029】

一実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜４３０、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群から選択され、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、これらのアミノ酸配列から本質的になり、またはこれらのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜１５３、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群から選択され、好ましくは、配列番号１〜１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、これらのアミノ酸配列から本質的になり、またはこれらのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４〜２１９、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群から選択され、好ましくは、配列番号１５４〜２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、これらのアミノ酸配列から本質的になり、またはこれらのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０〜３１０、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群から選択され、好ましくは、配列番号２２０〜３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、これらのアミノ酸配列から本質的になり、またはこれらのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１〜４３０、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群から選択され、好ましくは、配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、これらのアミノ酸配列から本質的になり、またはこれらのアミノ酸配列を含む。

【0030】

用語「抗原性ＩｇＥペプチド」は、本発明の意味の範囲内で、好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒトに由来するすべてのＩｇＥ ＣＨ３誘導ペプチド、ならびに「抗原性ＩｇＥペプチド生物活性」を示す、これらの変異体、類似体、オルソログ、相同体、および誘導体、ならびにこれらの断片を含む。好ましくは、用語「抗原性ＩｇＥペプチド」は、配列番号１〜４３０、ならびに本質的に同じ生物活性を示す、これらの変異体、相同体、および誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらのアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になるペプチドを指す。より好ましくは、用語「抗原性ＩｇＥペプチド」は、配列番号１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらのアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になるペプチド、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらのアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になるペプチド、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらのアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になるペプチドを指す。

【0031】

一実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0032】

別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0033】

好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４１、１４４、１４５および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０９、１１０、１１１、１１２、１１８、１１９、１２０、１２６、１２７、１３３、および１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４９、５０、５１、５２、５３、５４、６３、６４、６５、６６、６７、７６、７７、７８、７９、８８、８９、９０、９９、１００、１０１、および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、１８、１９、２０、２１、２２、３４、３５、３６、３７、４９、５０、５１、６３、６４、および７６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、１８、１９、および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１または１８のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0034】

別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０１、２０２、２０５、２０６、２０７、２１０、２１１、２１４および２１７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、１７７、１７８、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９９、および２００からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１６５、１６６、および１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４または１６５のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0035】

別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、および３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９６、２９７、２９８、３０１、３０２および３０５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６６、２６７、２６８、２６９、２７５、２７６、２７７、２８３、２８４、および２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２３３、２３４、２３５、２３６、２４５、２４６、２４７、２５６、２５７、および２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２３３、２３４、および２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0036】

さらに別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４１０、４１１、４１２、４１３、４１６、４１７、４１８、４２１、４２２および４２５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８６、３８７、３８８、３８９、３９５、３９６、３９７、４０３、４０４および４１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３５３、３５４、３５５、３５６、３６５、３６６、３６７、３７６、３７７、および３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３２６、３２７、３２８、３４０、３４１、および３５３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、および３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0037】

用語「抗原性ＩｇＥペプチド生物活性」は、本明細書で使用する場合、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドの、アンタゴニスト特性を伴って、患者において自己抗ＩｇＥ抗体を誘発することができる能力を指し、そのような自己抗体は、循環遊離ＩｇＥのレベルを減少させることができる一方で、炎症性メディエーターの著しいＩｇＥ媒介放出をまったく引き起こさず、高親和性受容体に結合したＩｇＥに実質的に結合することができない。特定のコンストラクトが本発明の範囲内に入るかどうかを確認するのに、どの技法を使用することができるかは、当業者に明らかとなるであろう。そのような技法には、本願の実施例の節、およびまた以下に記載される技法が含まれるが、それだけに限定されない。推定ペプチドは、推定ペプチドによって生じた抗血清が、天然ＩｇＥ分子と交差反応し、アレルギー性効果細胞からのアレルギー性メディエーター放出を遮断することにおいても機能的であるという点において、コンストラクトの免疫原性を確認するためにアッセイすることができる。

【0038】

これらの応答の特異性は、ＩｇＥのプルダウンを定量化することができる機能的なアッセイおよび／またはＩｇＥ受容体を発現する細胞の脱顆粒の阻害によって、あるいはペプチド自体もしくは天然ＩｇＥ、および／またはＩｇＥ内のエピトープに結合することが知られている特定のモノクローナル抗体を用いて抗血清の活性を遮断することによる競合実験によって確認することができる。ＩｇＥ−ＦｃＲＩへの結合を確認するための技法も、当業者に周知である。

【0039】

一実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、天然エピトープが見出されるＩｇＥドメイン全体から選択される領域を模倣するようなサイズのものである。特定の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、長さが１００アミノ酸未満であり、好ましくは７５アミノ酸より短く、より好ましくは５０アミノ酸未満であり、さらにより好ましくは４０アミノ酸未満である。本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは一般に、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸、好ましくは４〜２０アミノ酸、例えば、６〜１２、または６〜９アミノ酸である。

【0040】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドの具体例は、配列リストに提供されており、長さが４〜２０アミノ酸の範囲のペプチドを含む。

【0041】

本発明の抗原ペプチドは、ヒトＩｇＥ ＣＨ３の部分に由来するアミノ酸配列を含み、そのようなヒトＣＨ３由来部分は、天然に存在するＩｇＥのアミノ酸配列に対応するか、または変異体ＩｇＥ、すなわち、少数のアミノ酸が、置換、付加、または欠失しているが、本質的に同じ免疫学的特性を保持する、天然に存在するＩｇＥのアミノ酸配列に対応する。さらに、そのようなＩｇＥ ＣＨ３由来部分は、特にＮ末端およびＣ末端で、アミノ酸によりさらに修飾することによって、適切な化学反応が実施された後、抗原性ＩｇＥペプチドを立体配置的に束縛し、かつ／または抗原性ＩｇＥペプチドの免疫原性担体へのカップリングを可能にすることができる。

【0042】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、その免疫学的特性を本質的に損ねることなく、アミノ酸が欠失、挿入、または置換されたＩｇＥ ＣＨ３のアミノ酸配列に由来する機能的に活性な変異体ペプチドを包含し、すなわち、そのような機能的に活性な変異体ペプチドは、実質的な抗原性ＩｇＥペプチド生物活性を保持する。一般に、そのような機能的変異体ペプチドは、配列番号１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と相同、好ましくは高度に相同なアミノ酸配列を有する。

【0043】

一実施形態では、そのような機能的に活性な変異体ペプチドは、配列番号１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、より好ましくは配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を示す。

【0044】

配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドについての配列類似性は、配列分析ソフトウェアを使用して一般に測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めた、様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似配列をマッチングする。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含有し、これは、デフォルトパラメータを用いて使用することによって、生物の異なる種に由来する相同ポリペプチドなどの密接に関係したポリペプチド同士間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照。ポリペプチド配列も、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムである、デフォルトまたは推奨パラメータを使用するＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と探索配列の間のベストオーバーラップの領域のアラインメントおよび配列同一性率を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００））。本発明の配列を、様々な生物に由来する多数の配列を含有するデータベースと比較する際の代替アルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用する、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２（１９９７）を参照。

【0045】

機能的に活性な変異体は、対立遺伝子変異体および種変異体などの天然に存在する機能的に活性な変異体、ならびに例えば、突然変異生成技法または直接合成によって生成することができる天然に存在しない機能的に活性な変異体を含む。

【0046】

機能的に活性な変異体は、配列番号１〜４３０、より好ましくは配列番号１〜１５３および２２０〜４３０、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０で示されるペプチドのいずれかと、約、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基が異なり、それでも抗原性ＩｇＥ生物活性を保持する。この比較がアラインメントを必要とする場合、配列は、最大の相同性についてアラインメントされる。変異は、生物活性が、配列番号１〜４３０中に示されるペプチドと実質的に類似、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０中に示されるペプチドと実質的に類似、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０中に示されるペプチドと実質的に類似である限り、ペプチド中のどの部位でも起こり得る。

【0047】

表現型がサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に提供されており、これは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための、２つの主なストラテジーがあることを教示している。

【0048】

第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然選択によるアミノ酸置換の寛容性を活用する。様々な種におけるアミノ酸配列を比較することによって、種の間で保存されてきたアミノ酸位置を同定することができる。これらの保存アミノ酸は、タンパク質機能にとって重要であると思われる。対照的に、置換が、自然選択によって寛容性を示してきたアミノ酸位置は、タンパク質機能にとって決定的でない位置を示す。したがって、アミノ酸置換に寛容性を示す位置は、修飾することができる一方で、依然として修飾ペプチドの特定の免疫原性活性を維持する。

【0049】

第２のストラテジーは、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するために遺伝子操作を使用することによって、タンパク質機能にとって決定的な領域を同定する。例えば、部位特異的突然変異生成またはアラニン走査突然変異生成を使用することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。次いで得られた変異体ペプチドは、特定の抗原性ＩｇＥ生物活性について試験することができる。

【0050】

Ｂｏｗｉｅらによれば、これらの２つのストラテジーにより、タンパク質は、意外にも、アミノ酸置換に寛容性があることが明らかになった。著者らは、タンパク質中のある特定のアミノ酸位置で、どのアミノ酸変化が許容的であると思われるかをさらに示している。例えば、ほとんどの埋没または内部（タンパク質の３次構造内）アミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とする一方で、表面または外側側鎖のわずかな特徴が一般に保存される。

【0051】

タンパク質のアミノ酸中に突然変異を導入する方法は、当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照。

【0052】

突然変異は、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販キットを使用して、またはペプチド合成によって直接導入することもできる。抗原性ＩｇＥペプチドの機能に著しく影響しないアミノ酸を置換することによる、前記抗原性ＩｇＥペプチドに対する機能的に活性な変異体の生成は、当業者によって実現することができる。

【0053】

本発明によるペプチドの１つにおいて行うことができるアミノ酸置換の型は、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的な特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合では、置換の保存的性質を修正するために、配列同一性率または類似性の程度を上方に調整する場合がある。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１（１９９４）を参照。

【0054】

類似の化学的性質を伴う側鎖を有するアミノ酸の基の例として、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好適な保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパルテート、およびアスパラギン−グルタミンである。

【0055】

あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３〜４５（１９９２）において開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。

【0056】

機能的に活性な変異体ペプチドは、ハイブリダイゼーション技法を使用して単離することもできる。簡単に言えば、対象とするペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列、例えば、配列番号１〜４３０の全体または一部と高い相同性を有するＤＮＡが、機能的に活性なペプチドを調製するのに使用される。したがって、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドには、配列番号１〜４３０のペプチドの１つまたは複数と機能的に等価であり、配列番号１〜４３０のいずれか１つ、またはその補体をコードする核酸とハイブリダイズする核酸分子によってコードされるペプチドも含まれる。当業者は、容易に入手可能なコドン表を使用して、本発明のペプチドをコードする核酸配列を容易に求めることができる。したがって、これらの核酸配列は、本明細書に提示されていない。

【0057】

機能的に活性な変異体であるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸についてのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、１０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート液、および１×サケ精子ＤＮＡ（低いストリンジェンシー条件）である。より好ましい条件は、２５％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート液、および１×サケ精子ＤＮＡ（中等度のストリンジェンシー条件）であり、さらにより好ましい条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート液、および１×サケ精子ＤＮＡ（高いストリンジェンシー条件）である。しかし、いくつかの要因は、上述したホルムアミド濃度以外のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し、当業者は、類似のストリンジェンシーを実現するためにこれらの要因を適切に選択することができる。

【0058】

機能的に活性な変異体をコードする核酸分子はまた、対象とするペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、例えば、配列番号１〜４３０に示されたペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子ＤＮＡの一部をプローブとして使用して、ＰＣＲなどの遺伝子増幅法によって単離することができる。

【0059】

本発明の目的のために、いくつかの本発明の抗原性ＩｇＥペプチドを組み合わせて使用することができることも考慮されるべきである。可能な組合せのすべての型を想定することができる。例えば、配列番号１〜４３０、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０から好ましくは選択される、１つを超える抗原性ＩｇＥペプチドを含むポリペプチドを使用することができ、同じ抗原性ＩｇＥペプチドが、同じポリペプチド分子上でいくつかのコピーで使用され、または異なるアミノ酸配列の抗原性ＩｇＥペプチドが同じポリペプチド分子上で使用され、異なる抗原性ＩｇＥペプチドまたはコピーは、互いに直接融合され、または適切なリンカーによって間隔をあけられている。本明細書で使用する場合、用語「多量体を形成した抗原性ＩｇＥ（ポリ）ペプチド」は、異なる、または同じアミノ酸配列の抗原性ＩｇＥペプチドが、１つのポリペプチド分子上に存在する両方の型の組合せを指す。したがって、２〜約２０の同一および／または異なる抗原性ＩｇＥペプチド、好ましくは、２、３、４、５、６、または７つの抗原性ＩｇＥペプチドが、１つの多量体を形成した抗原性ＩｇＥポリペプチド分子上に存在し得る。

【0060】

本発明の一態様では、免疫原は、配列番号１〜４３０、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群から選択され、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなり、これらのアミノ酸配列から本質的になり、またはこれらのアミノ酸配列を含む、多量体を形成した抗原性ＩｇＥペプチドからなり、このペプチドから本質的になり、またはこのペプチドを含む。一実施形態では、前記多量体を形成したＩｇＥペプチドは、配列番号１〜１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の抗原性ＩｇＥペプチド、および配列番号１５４〜２１９、または配列番号２２０〜３１０、または配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の抗原性ＩｇＥペプチドを含む。別の実施形態では、前記多量体を形成したＩｇＥペプチドは、配列番号１５４〜２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の抗原性ＩｇＥペプチド、および配列番号１〜１５３、または配列番号２２０〜３１０、または配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の抗原性ＩｇＥペプチドを含む。さらに別の実施形態では、前記多量体を形成したＩｇＥペプチドは、配列番号２２０〜３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の抗原性ＩｇＥペプチド、および配列番号１〜１５３、または配列番号１５４〜２１９、または配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の抗原性ＩｇＥペプチドを含む。さらに別の実施形態では、前記多量体を形成したＩｇＥペプチドは、配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の抗原性ＩｇＥペプチド、および配列番号１〜１５３、または配列番号１５４〜２１９、または配列番号２２０〜３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の抗原性ＩｇＥペプチドを含む。さらに別の実施形態では、前記多量体を形成したＩｇＥペプチドは、配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の抗原性ＩｇＥペプチド、配列番号２２０〜３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の抗原性ＩｇＥペプチド、および配列番号１５４〜２１９または配列番号１〜１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第３の抗原性ＩｇＥペプチドを含む。

【0061】

本発明の一実施形態では、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然源に由来し、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、マウス、またはラットなど、好ましくはヒト源から単離される。したがって、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、標準的なタンパク質精製技法を使用して、細胞源または組織源から単離することができる。

【0062】

あるいは、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、化学的に合成し、または組換えＤＮＡ技法を使用して生成することができる。

【0063】

例えば、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、当技術分野で周知の固相手順によって合成することができる。適当な合成は、「Ｔ−ｂｏｃ」または「Ｆ−ｍｏｃ」手順を利用することによって実施することができる。環状ペプチドは、完全に自動化された装置で、周知の「Ｆ−ｍｏｃ」手順およびポリアミド樹脂を使用して固相手順によって合成することができる。あるいは、当業者は、手作業でプロセスを実施するための必要な実験室手順が分かるであろう。固相合成についての技法および手順は、ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって出版された、Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄによる「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（１９８９）、ならびにＤ．Ａｎｄｒｅａｕらによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３５巻：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎおよびＢ．Ｍ．Ｄｕｎｎ編）、７章、ｐｐ９１〜１７１に記載されている。

【0064】

あるいは、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で周知の技法を使用して、適当な発現系において発現することができる発現ベクター中に導入し、その後、発現された対象とするペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を単離または精製することができる。様々な細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫発現系が当技術分野で入手可能であり、任意のそのような発現系を使用することができる。任意選択により、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、無細胞翻訳系で翻訳することができる。

【0065】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、複数の遺伝子の存在、代替の転写事象、代替のＲＮＡスプライシング事象、ならびに代替の翻訳および翻訳後事象の結果として生じるものも含むことができる。ペプチドは、系、例えば、培養細胞内で発現することができ、ペプチドが、天然細胞、または天然細胞において発現されるとき存在する翻訳後修飾の変化または除外、例えば、グリコシル化もしくは切断をもたらす系において発現されるとき存在するのと、実質的に同じ翻訳後修飾をもたらす。

【0066】

抗原性ＩｇＥペプチドなどの、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、他の非ＩｇＥまたは非ＩｇＥ由来アミノ酸配列、例えば、本明細書に定義されるようなアミノ酸リンカー、またはシグナル配列、または免疫原性担体、ならびにタンパク質精製において有用なリガンド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌タンパク質Ａなどを含有する融合タンパク質として生成することができる。１つを超える本発明の抗原性ＩｇＥペプチドが、融合タンパク質中に存在することができる。異種ポリペプチドを、例えば、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、相同アミノ酸配列、すなわち、他のＩｇＥまたはＩｇＥ由来配列を含む融合タンパク質として生成することもできる。

【0067】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、鎖状であっても、立体配置的に束縛されていてもよい。本発明の好適な実施形態では、抗原性ＩｇＥペプチドは立体配置的に束縛されている。分子に関して本明細書で使用する場合、用語「立体配置的に束縛された」は、３次元構造が、経時的に１つの空間的な配置内に実質的に維持されている分子、例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などを意味する。立体配置的に束縛された分子は、親和性の増大、代謝安定性、膜浸透性、または溶解度などの改善された特性を有する場合がある。

【0068】

さらに、そのような立体配置的に束縛された分子は、その固有のループ立体配座と類似した立体配座内で、抗原性ＩｇＥエピトープを提示し、それによって無傷の、天然の自己ＩｇＥ分子をより認識しやすいか、または自己ＩｇＥ分子を認識する親和性が増大した抗ＩｇＥ抗体を誘発することが予期される。立体配置的に束縛する方法は、当技術分野で周知であり、限定することなく、架橋および環化を含む。

【0069】

鎖状ペプチドまたはポリペプチド鎖中に立体配置的束縛を導入するための、従来技術において知られているいくつかの手法がある。例えば、ペプチド中の２つの隣接するアミノ酸間の架橋は、局所的な立体配置的修飾に導き、その融通性は、通常のペプチドの融通性と比較して制限されている。そのようなブリッジを形成するためのいくつかの可能性には、ラクタムおよびピペラジノンの取込みが含まれる（概説については、ＧｉａｎｎｉｓおよびＫｏｌｔｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、１９９３、３２：１２４４を参照）。

【0070】

ペプチドに関して本明細書で使用する場合、用語「環状の」は、２つの隣接しないアミノ酸またはアミノ酸類似体の間に分子内結合を含む構造を指す。環化は、共有結合または非共有結合によって行うことができる。分子内結合には、それだけに限らないが、主鎖と主鎖、側鎖と主鎖、側鎖と側鎖、側鎖と末端基、末端間の結合が含まれる。環化の方法として、限定することなく、隣接しないアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖同士間のジスルフィド結合の形成；ＬｙｓおよびＡｓｐ／Ｇｌｕ残基の側鎖同士間のアミド結合の形成；セリン残基とＡｓｐ／Ｇｌｕ残基の間のエステル結合の形成；例えば、１つのアミノ酸またはその類似体の側鎖基とアミノ−末端残基のＮ末端アミンの間のラクタム結合の形成；ならびにリシノノルロイシン結合およびジチロシン結合の形成が挙げられる。ジスルフィド連結の炭素版、例えば、エテニルまたはエチル連結（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃ．、２００８、１４、８９８〜９０２）、ならびに適切に多置換された求電子性試薬、例えば、ジハロアルカン、トリハロアルカン、またはテトラハロアルカンを用いたアルキル化反応（ＰＮＡＳ、２００８、１０５（４０）、１５２９３〜１５２９８；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５、６、８２１〜８２４）も使用することができる。様々な修飾されたプロリン類似体も、ペプチド中に立体配置的束縛を組み込むのに使用することができる（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、１９９６、３９：２７３８〜２７４４；ＰｆｅｉｆｅｒおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１９９８、１９７７〜１９７８）。本発明のペプチドを環化するのに使用することができる化学反応は、以下のものを含めた結合であるが、それだけに限らない結合で環化したペプチドをもたらす：ラクタム、ヒドラゾン、オキシム、チアゾリジン、チオエーテル、またはスルホニウム結合。

【0071】

ＵＳ１０／１１４９１８に記載されている、立体配置的に束縛されたペプチドの設計におけるさらに別の手法は、環状の束縛されたペプチドを生成するために、対象とする短いアミノ酸配列を鋳型に付着させることである。そのような環状ペプチドは、その鋳型によって構造的に安定化され、それによって天然タンパク質、例えば、ウイルスおよび寄生虫、または自己タンパク質（ＩｇＥなどの自己哺乳動物タンパク質）上などの立体配置的エピトープを模倣することができる３次元立体配座を提供するだけでなく、これらはまた、血清中でのタンパク質分解に対して鎖状ペプチドより耐性である。ＵＳ１０／１１４９１８は、ペプチドの超二次構造を安定化させるために、適切に配置されたアミノ酸に主鎖をカップリングさせるための合成アミノ酸の調製による、立体配置的に束縛された架橋ペプチドの合成をさらに開示している。架橋は、直交保護された（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノプロリン残基の１級アミノ基の、グルタミン酸の適切に配置された側鎖カルボキシル基へのアミドカップリングによって実現することができる。この手法は、ＣＳタンパク質の立体配置的に束縛されたテトラペプチドリピートの調製において採用され、少なくとも１つのプロリンが（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノプロリンによって置換され、側鎖カルボキシル基を導入するために、グルタミン酸がアラニンの置換として組み込まれた。

【0072】

架橋ストラテジーには、α−らせん状立体配座を模倣するために設計された「ステープルド」ペプチドを形成するためのＧｒｕｂｂｓ閉環メタセシス反応の適用（Ａｎｇｅｗ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１９９８、３７、３２８１；ＪＡＣＳ、２０００、１２２、５８９１）；多官能化サッカリドの使用；トリプタチオニン連結の使用（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｅｕ．Ｊ．、２００８、２４、３４０４〜３４０９）；側鎖アミノ酸残基として組み込むか、またはペプチド配列の主鎖内に位置することができるアジドおよびアルキンの「クリック」反応の使用（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ、２００３、８（２４）、１１２８〜１１３７）も含まれる。金属イオンは、金属陽イオンに配位する特定の残基、例えばヒスチジンを隔離することにより、鎖状ペプチドの束縛された立体配座を安定化することができることも文献で知られている（Ａｎｇｅｗ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２００３、４２、４２１）。同様に、非天然の酸およびアミン官能性、またはポリアミンおよびポリ酸官能性を用いた鎖状ペプチド配列の官能化を使用することによって、活性化およびアミド結合形成の後に、環化した構造へのアクセスを可能にすることができる。

【0073】

一実施形態によれば、抗原性ＩｇＥペプチドは、抗原性ＩｇＥペプチドの互いに隣接しない２つのアミノ酸、例えば、Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸の分子内共有結合によって立体配置的に束縛される。別の実施形態によれば、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、足場分子への共有結合によって立体配置的に束縛される。さらなる実施形態によれば、抗原性ＩｇＥペプチドは単に束縛され、すなわち、一方の末端、（Ｃ末端もしくはＮ末端）で、またはいずれの末端にも位置しない別のアミノ酸によって、足場分子にカップリングされる。別の実施形態によれば、抗原性ＩｇＥペプチドは二重に束縛され、すなわち、Ｃ末端およびＮ末端の両方で足場分子にカップリングされる。別の実施形態によれば、抗原ペプチドは、ヘテロキラルなジプロリン単位（Ｄ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｒｏ）の鋳型効果を介して環化することによって束縛される（Ｓｐａｔｈら、１９９８、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ８１、ｐ１７２６〜１７３８）。本発明による立体的に束縛されたペプチドの例示であるが限定ではない例を、図２に表す。

【0074】

足場（「プラットフォーム」とも呼ばれる）は、抗原性ＩｇＥペプチドがとることができる構造の数を、共有結合によって低減することができる任意の分子とすることができる。立体配座を束縛する足場の例として、タンパク質およびペプチド、例えば、リポカリン関連分子、例えば、β−バレル含有チオレドキシン、およびチオレドキシン様タンパク質など、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＡ）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、エグリンＣ）、抗体またはその構造的に剛性の断片、ＧＦＰまたはＹＦＰなどの蛍光タンパク質、コノトキシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのループ領域、ＣＴＬ−Ａ４、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）が挙げられる。

【0075】

他の適当なプラットフォーム分子には、セファロースなどの炭水化物が含まれる。プラットフォームは、鎖状分子であっても、例えば、ループを形成するために閉じられた環状分子であってもよい。プラットフォームは一般に、抗原性ＩｇＥペプチドに対して非相同である。プラットフォームに連結したそのような立体配置的に束縛されたペプチドは、鎖状ペプチドよりタンパク質分解に対して耐性であると考えられている。

【0076】

好適な実施形態によれば、足場は、本願において定義される免疫原性担体、好ましくは、非相同の担体タンパク質またはＶＬＰである。さらなる実施形態では、抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体上に単に束縛されている。別のさらなる実施形態では、抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体上に二重に束縛されている。このようにして、抗原性ＩｇＥペプチドは、立体配置的に束縛されたループ構造を形成し、これは、細胞内認識分子として特に適した構造であることが証明されている。

【0077】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、プラットフォームへのコンジュゲーションを容易にするために、例えば、一方または両方の末端で末端システインを付加する、かつ／またはリンカー配列、例えば、ダブルグリシン先端または末端（ｈｅａｄ ｏｒ ｔａｉｌ）、リシン残基で終止するリンカー、もしくはそのような機能を行うことが当業者に知られている任意の他のリンカーなどを付加することによって修飾することができる。全ペプチド配列を担体にカップリングさせ、こうして任意の位置化学問題および化学選択性問題を回避するために、バイオ直交性化学（上述したクリック反応など）も使用することができる。Ｊｏｎｅｓら Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２、４１：４２４１〜４２４４に記載されたものなどの剛性リンカー（ｒｉｇｉｄｉｆｉｅｄ ｌｉｎｋｅｒ）は、免疫応答の改善を誘発することが知られており、これも使用することができる。

【0078】

さらなる実施形態では、抗原性ＩｇＥペプチドは、多価の鋳型に付着しており、鋳型自体は担体にカップリングされており、したがって抗原の密度を増大させている（以下を参照）。多価の鋳型は、（それだけに限らないが、）オリゴグルタミン酸（ｏｌｉｇｏｇｌｕｔａｍａｔｅ）またはオリゴキトサンなどの適切に官能化されたポリマーまたはオリゴマーとすることができる。

【0079】

【化1】

【0080】

前記リンカーは、ペプチドのＮ末端またはペプチドのＣ末端に位置しても、ペプチドの両末端に位置してもよい。前記リンカーは、０〜１０アミノ酸の長さ、好ましくは、０〜６アミノ酸の長さ、さらにより好ましくは、２〜３アミノ酸の長さとすることができる。あるいは、アミノ酸の１つまたは複数のＤ−立体異性体形態の付加または置換を実施することによって、例えば、ペプチドの安定性を増強するための有益な誘導体を作り出すことができる。

【0081】

すべて本発明の範囲内であり、様々な実施形態を構成し、様々なリンカーを使用するコンジュゲーションの例示的な組合せを以下に提供する。
ペプチド−ＧＧＧＧＧＣ−足場
ペプチド−ＧＧＧＧＣ−足場
ペプチド−ＧＧＧＣ−足場
ペプチド−ＧＧＣ−足場
ペプチド−ＧＣ−足場
ペプチド−Ｃ−足場
ペプチド−ＧＧＧＧＧＫ
ペプチド−ＧＧＧＧＫ
ペプチド−ＧＧＧＫ
ペプチド−ＧＧＫ
ペプチド−ＧＫ
ペプチド−Ｋ
ペプチド−ＧＧＧＧＳＣ
ペプチド−ＧＧＧＳＣ
ペプチド−ＧＧＳＣ
ペプチド−ＧＳＣ
ペプチド−ＳＣ
ＣＳＧＧＧＧ−ペプチド
ＣＳＧＧＧ−ペプチド
ＣＳＧＧ−ペプチド
ＣＳＧ−ペプチド
ＣＳ−ペプチド

【0082】

一実施形態では、ペプチドは、本明細書に開示される任意の抗原性ＩｇＥペプチドからなり、足場は、本明細書に開示される任意の免疫原性担体、好ましくはＶＬＰからなる。

【0083】

様々なリンカーおよび二重に束縛されたペプチドを使用するコンジュゲーションの例示的な組合せを以下に提供する。この場合、担体は、同一のモノマーの担体であっても、他と異なるモノマーの担体であってもよい。（以下の例では、ＧＣリンカーは、上記に例示した任意のＧＫリンカーもしくはＧＳＣリンカー、または当業者に知られている任意の他のものによって置換することができる）：
担体−ＣＧＧＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＧＧＣ−担体
担体−ＣＧＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＧＣ−担体
担体−ＣＧＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＧＣ−担体
担体−ＣＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＣ−担体
担体−ＣＧ−ペプチド−ＧＣ−担体
担体−Ｃ−ペプチド−Ｃ−担体

【0084】

一実施形態では、ペプチドは、本明細書に開示される任意の抗原性ＩｇＥペプチドからなり、担体は、本明細書に開示される任意の免疫原性担体、好ましくはＶＬＰからなる。

【0085】

一実施形態では、末端システイン残基が、抗原性ＩｇＥペプチドのアミノ酸配列中にまだ存在しない場合、配列番号１〜４３０の任意の抗原性ＩｇＥペプチドの一方または両方の末端に付加されることによって、立体配置的に束縛されたペプチドが生成される。好適な実施形態では、本発明の立体配置的に束縛された抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜４３０およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択される。一実施形態では、前記末端システイン残基は、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に付加される。別の実施形態では、前記末端システイン残基は、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＮ末端に付加される。別の実施形態では、末端システイン残基は、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端およびＮ末端の両方に付加される。

【0086】

別の実施形態では、多様な数のグリシン残基および１つの末端システイン残基を含むＧＣリンカーが、配列番号１〜４３０の任意の抗原性ＩｇＥペプチドの一方または両方の末端に付加されることによって、立体配置的に束縛されたペプチドが生成される。好ましくは、ＧＣリンカーは、１〜１０のグリシン残基、より好ましくは、１、２、３、４、または５つのグリシン残基を含む。さらに好適な実施形態では、本発明の立体配置的に束縛された抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜４３０、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択される。一実施形態では、前記ＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に付加される。別の実施形態では、前記ＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＮ末端に付加される。別の実施形態では、前記ＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端およびＮ末端の両方に付加される。

【0087】

さらに別の実施形態では、多様な数のグリシン残基および１つの末端システイン残基を含むＧＣリンカーが、配列番号１〜４３０の抗原性ＩｇＥペプチドの一方の末端に付加され、末端システイン残基が、抗原性ＩｇＥペプチドの他方の末端にまだ存在していない場合、この抗原性ペプチドのその他方の末端に付加される。好ましくは、ＧＣリンカーは、１〜１０のグリシン残基、より好ましくは、１、２、３、４、または５つのグリシン残基を含む。さらに好適な実施形態では、本発明の立体配置的に束縛された抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜４３０、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択される。一実施形態では、前記ＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に付加され、前記末端システイン残基は、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＮ末端に付加される。別の実施形態では、前記ＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＮ末端に付加され、前記末端システイン残基は、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に付加される。

【0088】

さらに好適な実施形態では、ＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドにカップリングされた前記リンカーの足場分子へのコンジュゲーションを可能にするために、好ましくはリシン残基の付加によって修飾される。なおさらに好適な実施形態では、本発明の立体配置的に束縛された抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜４３０、およびこれらの機能的に活性な変異体からなる群、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択される。一実施形態では、前記修飾されたＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＣ末端に付加される。別の実施形態では、前記修飾されたＧＣリンカーは、前記抗原性ＩｇＥペプチドのＮ末端に付加される。

【0089】

一実施形態では、本発明の立体配置的に束縛された抗原性ＩｇＥペプチドは、表９に開示される任意のペプチドである。

【0090】

本発明の免疫原性担体
本発明の一実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドは、免疫原性担体分子に連結されることによって、ワクチン接種プロトコールのための免疫原を形成し、好ましくは、担体分子は、天然ＩｇＥ分子に関係していない。

【0091】

本明細書での用語「免疫原性担体」は、宿主動物において免疫原性応答を独立して誘発する特性を有し、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に、このペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質中の遊離カルボキシル基、アミノ基、もしくはヒドロキシル基と、免疫原性担体物質上の対応する基との間のペプチドもしくはエステル結合の形成を介して直接、または代わりに、従来の二官能性連結基を通じた結合によって、または融合タンパク質として共有結合的にカップリングすることができる物質を含む。

【0092】

本発明の免疫原において使用される担体の型は、当業者に容易に分かるであろう。そのような免疫原性担体の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン；グロブリン；サイログロブリン；ヘモグロビン；ヘモシアニン（特にキーホールリンペットヘモシアニン［ＫＬＨ］）；回虫から抽出されたタンパク質、不活化された細菌毒素もしくはトキソイド、例えば破傷風毒素もしくはジフテリア毒素（ＴＴおよびＤＴ）など、またはＣＲＭ１９７、ツベルクリン（ＰＰＤ）精製タンパク質誘導体；あるいはヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に由来するタンパク質Ｄ（ＷＯ９１／１８９２６）またはその組換え断片（例えば、ＴＴの断片Ｃのドメイン１、またはＤＴの転位ドメイン、またはヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質ＤのＮ末端１００〜１１０アミノ酸を含むタンパク質Ｄ１／３）（ＧＢ９７１７９５３．５）；ポリリジン；ポリグルタミン酸；リシン−グルタミン酸コポリマー；リシンまたはオルニチンを含有するコポリマー；リポソーム担体などである。

【0093】

一実施形態では、免疫原性担体（ｉｍｍｕｎｏｇｉｃ ｃａｒｒｉｅｒ）はＫＬＨである。別の実施形態では、免疫原性担体は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、好ましくは組換えウイルス様粒子である。

【0094】

本明細書で使用する場合、用語「ウイルス様粒子」は、ウイルス粒子に類似しているが、非病原性であることが実証されている構造を指す。一般に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの少なくとも一部を欠いている。また、ウイルス様粒子は、多くの場合、非相同発現によって大量に製造することができ、容易に精製することができる。本発明によるウイルス様粒子は、そのゲノムと異なる核酸を含有することができる。一般的で好適な実施形態の本発明によるウイルス様粒子は、対応するウイルスのウイルスカプシドなどのウイルスカプシド、バクテリオファージ、またはＲＮＡファージである。

【0095】

本明細書で使用する場合、用語「バクテリオファージのウイルス様粒子」は、バクテリオファージの構造に類似し、非複製的かつ非感染性であり、バクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも１つまたは複数の遺伝子を欠いており、典型的に、ウイルスの宿主への付着または宿主中への流入に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子も欠いているウイルス様粒子を指す。しかしこの定義は、前述の１つまたは複数の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがって、バクテリオファージの非複製的かつ非感染性のウイルス様粒子にも導くバクテリオファージのウイルス様粒子も包含するべきである。

【0096】

ＲＮＡファージコートタンパク質の１８０サブユニットの自己組織化から形成され、宿主ＲＮＡを任意選択により含有するカプシド構造は、「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と本明細書で呼ばれる。具体例は、Ｑｂｅｔａコートタンパク質のＶＬＰである。この特定の場合では、Ｑｂｅｔａコートタンパク質のＶＬＰは、Ｑｂｅｔａ ＣＰサブユニットからもっぱら構築され（例えば、抑制によって、より長いＡ１タンパク質の任意の発現を妨げるＴＡＡ終止コドンを含有するＱｂｅｔａ ＣＰ遺伝子の発現によって生成される、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：９〜１５（１９９６）を参照）、またはカプシドアセンブリ中にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含有することができる。一般に、カプシドアセンブリ中のＱｂｅｔａ ＣＰと比べたＱｂｅｔａ Ａ１タンパク質の割合は、カプシド形成を保証するために制限される。

【0097】

本発明との関連で免疫原性担体として適したＶＬＰの例として、それだけに限らないが、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質（Ｕｌｒｉｃｈら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、麻疹ウイルス（Ｗａｒｎｅｓら、Ｇｅｎｅ １６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および同第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１６０３〜１６１０、（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９６／３０５２３号）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌ、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウイルス（ＷＯ９８／１５６３１）、ヒトポリオーマウイルス（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ Ｋ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（３）：３８１〜３８６（１９９９）；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．３ｒｄ Ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ「Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ．」Ｂｅｒｌｉｎ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２６〜２９（２００１））、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒｐｈａｇｅ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、特に、Ｑｂｅｔａ−ファージ、ササゲクロロティックモットルウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ウシパピローマウイルス、ブタパルボウイルス、パルボウイルス、カリチウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、ウサギ出血性疾患ウイルス、動物ヘパドナウイルスコア抗原ＶＬＰが挙げられる。

【0098】

当業者に容易に明らかとなるように、本発明の免疫原性担体として使用されるＶＬＰは、いずれの特定の形態にも限定されない。粒子は、化学的に、または生物学的プロセスによって合成することができ、これは、天然であっても非天然であってもよい。例として、この型の実施形態は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を含む。より具体的な実施形態では、ＶＬＰは、ＶＬＰを形成することが知られているウイルスのいずれかの組換えポリペプチドを含み、または代わりにこの組換えポリペプチドからなることができる。ウイルス様粒子は、そのようなポリペプチドの１つまたは複数の断片、ならびにそのようなポリペプチドの変異体をさらに含み、または代わりにこれらからなることができる。ポリペプチドの変異体は、その野生型の対応物とアミノ酸レベルで、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を共有することができる。本発明において使用するのに適した変異体ＶＬＰは、これらが、「ウイルス様粒子」を形成することができる限り、いずれの生物に由来してもよく、本明細書で定義されるような「免疫原性担体」として使用することができる。

【0099】

本発明による好適なＶＬＰは、ＨＢＶのカプシドタンパク質または表面抗原（それぞれＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ）、またはその組換えタンパク質もしくは断片、およびＲＮＡファージのコートタンパク質、またはその組換えタンパク質もしくは断片、より好ましくは、Ｑｂｅｔａのコートタンパク質、またはその組換えタンパク質もしくは断片が含まれる。

【0100】

一実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドと組み合わせて使用される免疫原性担体は、ＨＢｃＡｇタンパク質である。本発明との関連で使用することができるＨＢｃＡｇタンパク質の例は、当業者によって容易に決定することができる。例として、Ｙｕａｎら、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））、ならびにＷＯ００／１９８３３３、ＷＯ００／１７７１５８、ＷＯ００／２１４４７８、ＷＯＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０１／８５２０８、ＷＯ０２／０５６９０５、ＷＯ０３／０２４４８０、およびＷＯ０３／０２４４８１に記載されているＨＢＶコアタンパク質が挙げられ、これらに限定されない。本発明において使用するのに適したＨＢｃＡｇは、これらが、「ウイルス様粒子」を形成することができる限り、いずれの生物に由来してもよく、本明細書で定義されるような「免疫原性担体」として使用することができる。

【0101】

本発明との関連で使用することができる、特に対象とするＨＢｃＡｇ変異体は、１つまたは複数の天然に常在するシステイン残基が欠失または置換された変異体である。遊離システイン残基は、ジスルフィド交換を含めたいくつかの化学副反応、他の物質を用いた併用療法において注射もしくは形成される化学物質もしくは代謝産物との反応、または直接の酸化、およびＵＶ光に曝された際のヌクレオチドとの反応を含めた、いくつかの化学副反応に関与する場合があることは、当技術分野で周知である。したがって、特に、ＨＢｃＡｇが核酸に結合する強い傾向を有するという事実を考慮すると、毒性の付加体が生成し得る。したがって、毒性の付加体は、多数の種の間に分布し、低濃度でそれぞれ存在する場合があるが、一緒になったとき毒性レベルに到達する。上記を考慮すると、天然に常在するシステイン残基を除去するように修飾された、ワクチン組成物中のＨＢｃＡｇの使用に対する１つの利点は、抗原または抗原決定基が付着されたとき有毒種が結合し得る部位の数が低減され、またはこの部位が全部排除されることである。

【0102】

さらに、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列を欠くＨＢｃＡｇのプロセシングされた形態も、特にＨＢｃＡｇが、プロセシングが起こらない条件下（例えば、細菌系における発現）で生成される場合、本発明との関連で使用することができる。

【0103】

本発明による他のＨＢｃＡｇ変異体として、ｉ）既知のコンピュータープログラムを慣例的に使用して、野生型ＨＢｃＡｇアミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の同一性を有するポリペプチド配列、またはそのサブポーション、ｉｉ）１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、または３５のアミノ酸がＣ末端から除去された突然変異体を含むＣ末端切断突然変異体、ｉｉ）１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７のアミノ酸がＮ末端から除去された突然変異体を含むＮ末端切断突然変異体、ｉｉｉ）１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＮ末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、または３５のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇを含むＮ末端およびＣ末端の両方において切断された突然変異体、が挙げられる。

【0104】

本発明の範囲内のさらに他のＨＢｃＡｇ変異体タンパク質は、４つのアルギニンリピートのうちの１つまたは複数が欠失しているが、Ｃ末端のシステインは保持されている、異種エピトープの免疫原性提示を増強するために修飾された変異体（例えば、ＷＯ０１／９８３３３を参照）、ならびにＷＯ０２／１４４７８、ＷＯ０３／１０２１６５、およびＷＯ０４／０５３０９１において記載されているものなどのキメラＣ末端切断ＨＢｃＡｇである。

【0105】

別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドと組み合わせて使用される免疫原性担体は、ＨＢｓＡｇタンパク質である。本発明との関連で使用することができるＨＢｓＡｇタンパク質は、当業者によって容易に決定することができる。例には、ＵＳ５７９２４６３、ＷＯ０２／１０４１６、およびＷＯ０８／０２０３３１に記載されたＨＢＶ表面タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するのに適したＨＢｓＡｇは、これらが、「ウイルス様粒子」を形成することができる限り、いずれの生物に由来してもよく、本明細書で定義されるような「免疫原性担体」として使用することができる。例えば、サブタイプａｄｗ（文献本書の実施例部分を参照）。

【0106】

さらに別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドまたはポリペプチドと組み合わせて使用される免疫原性担体は、Ｑｂｅｔａコートタンパク質である。

【0107】

Ｑｂｅｔａコートタンパク質は、大腸菌において発現される場合、自己組織化してカプシドになることが見出された（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ ＴＭ．ら、ＧＥＮＥ １３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたカプシドまたはウイルス様粒子は、２５ｎｍの直径およびＴ＝３の準対称性を有する正二十面体ファージ様カプシド構造を示した。さらに、ファージＱｓｓの結晶構造が解明された。カプシドは、１８０コピーのコートタンパク質を含有し、これらは、ジスルフィドブリッジによって共有結合性の五量体および六量体に連結され（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：５４３５５５４（１９９６））、Ｑｂｅｔａコートタンパク質のカプシドの注目すべき安定性に導いている。Ｑｂｅｔａカプシドタンパク質は、有機溶媒および変性剤に対して普通でない耐性も示す。Ｑｂｅｔａコートタンパク質のカプシドの高い安定性は、本発明による哺乳動物およびヒトの免疫化およびワクチン接種において使用するのに有利な特徴である。

【0108】

本発明との関連で使用することができるＱｂｅｔａコートタンパク質の例は、当業者によって容易に決定することができる。ＷＯ０２／０５６９０５、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１（その全体が参照により組み込まれている）に、例が広範に記載されており、これらの例として、それだけに限らないが、ＰＩＲデータベースに開示されているアミノ酸配列、Ｑｂｅｔａ ＣＰに関するアクセション番号ＶＣＢＰＱｂｅｔａ；Ｑｂｅｔａ Ａｌタンパク質に関するアクセション番号ＡＡＡ１６６６３；ならびにＮ末端メチオニンが切断されている変異体タンパク質を含めたこれらの変異体；１００、１５０、または１８０ものアミノ酸が欠損したＱｂｅｔａ Ａ１のＣ末端切断形態；欠失もしくは置換によるリシン残基の除去、または置換もしくは挿入によるリシン残基の付加によって修飾された変異体タンパク質（例えば、その全体が参照により組み込まれているＷＯ０３／０２４４８１に開示されているＱｂｅｔａ−２４０、Ｑｂｅｔａ−２４３、Ｑｂｅｔａ−２５０、Ｑｂｅｔａ−２５１、およびＱｂｅｔａ−２５９を参照）、ならびに上述したＱｂｅｔａコアタンパク質のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示す変異体が挙げられる。本発明において使用するのに適した変異体Ｑｂｅｔａコートタンパク質は、これらが、「ウイルス様粒子」を形成することができる限り、いずれの生物に由来してもよく、本明細書で定義されるような「免疫原性担体」として使用することができる。

【0109】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、化学的なコンジュゲーションを介して、または遺伝子操作された融合パートナーの発現によって免疫原性担体にカップリングすることができる。このカップリングは、必ずしも直接である必要はないが、リンカー配列によって行うことができる。より一般的に、抗原ペプチドが、免疫原性担体に融合、コンジュゲート、または別の方法で付着されている場合では、スペーサー配列またはリンカー配列が、抗原ペプチドの一方または両方の末端に典型的には付加される。そのようなリンカー配列は一般に、プロテアソーム、エンドソームのプロテアーゼ、または細胞の他の小胞コンパートメントによって認識される配列を含む。

【0110】

一実施形態では、本発明のペプチドは、免疫原性担体を有する融合タンパク質として発現される。ペプチドの融合は、免疫原性担体の一次配列中への挿入、または免疫原性担体のＮ末端もしくはＣ末端への融合によって行うことができる。以下、免疫原性担体へのペプチドの融合タンパク質に言及する場合、サブユニット配列のいずれかの末端への融合、または担体配列内のペプチドの内部挿入が包含される。融合は、以下に言及する場合、担体の配列中への抗原ペプチドの挿入、担体の配列の一部の抗原ペプチドとの置換、または欠失、置換、もしくは挿入の組合せによって行うことができる。

【0111】

免疫原性担体がＶＬＰであるとき、キメラ抗原ペプチド−ＶＬＰサブユニットは一般に、自己組織化してＶＬＰになることができる。エピトープのサブユニットに融合した、エピトープをディスプレイするＶＬＰも、本明細書でキメラＶＬＰと呼ばれる。例えば、ＥＰ０４２１６３５Ｂには、ウイルス様粒子中の異種ペプチド配列を提示するために、キメラヘパドナウイルスコア抗原粒子を使用することが記載されている。

【0112】

ＶＬＰのサブユニットの配列のいずれかの末端に融合される抗原ペプチドの配列のいずれかの末端に、またはＶＬＰのサブユニットの配列中にそのようなペプチド性配列を内部挿入するために、隣接アミノ酸残基を付加することができる。グリシンおよびセリン残基は、融合されるペプチドに付加される隣接配列において使用される、特に好都合なアミノ酸である。グリシン残基は、追加の融通性を付与し、これは、ＶＬＰサブユニットの配列中に異種配列を融合することの潜在的不安定化効果を減らすことができる。

【0113】

本発明の特定の実施形態では、免疫原性担体はＨＢｃＡｇ ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ末端への抗原ペプチドの融合タンパク質（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：１１５７１１６３（１９９９））、またはいわゆる主要免疫優性領域（ＭＩＲ）中での挿入が記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８１１４（２００１）、ＷＯ０１／９８３３３）、本発明の具体的な実施形態である。ＭＩＲ中に欠失を伴うＨＢｃＡｇの天然に存在する変異体も記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１））、Ｎ末端またはＣ末端への融合、ならびにｗｔ ＨＢｃＡｇと比較した場合の欠失の部位に対応する、ＭＩＲの位置での挿入は、本発明のさらなる実施形態である。Ｃ末端への融合も記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者は、古典的な分子生物学技法を使用して融合タンパク質を構築する方法のガイダンスを容易に見出すであろう。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用なベクターおよびプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．および＃３８；Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）、Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、本発明を実行するのに使用することができる。自己組織化の効率、およびＨＢｃＡｇのＭＩＲ中に挿入されるエピトープのディスプレイの最適化についての重要な要因は、挿入部位の選択、ならびに挿入の際に、ＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失されるアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ０４２１６３５；米国特許第６，２３１，８６４号）、または言い換えれば、ＨＢｃＡｇからのどのアミノ酸が新しいエピトープと置換されるかである。例えば、ＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５、または８０〜８１の異種エピトープとの置換が記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ０４２１６３５；ＵＳ６，２３１，８６４、ＷＯ００／２６３８５）。ＨＢｃＡｇは、長いアルギニン末端を含有し（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１））、これは、カプシドアセンブリにとって必須ではなく、核酸に結合することができる（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：９８〜１１４（２００１））。このアルギニン末端を含むか、または欠いているＨＢｃＡｇはともに、本発明の実施形態である。

【0114】

本発明の別の特定の実施形態では、免疫原性担体は、ＲＮＡファージ、好ましくはＱｂｅｔａのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主要なコートタンパク質は、細菌、および特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されると、自発的に集合してＶＬＰになる。抗原ペプチドが、ＱｂｅｔａのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合され、またはＡ１タンパク質内に挿入された融合タンパク質コンストラクトが記載されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ終止コドンでの抑制によって生成され、Ｎ末端メチオニンの切断を考慮する場合、３２９ａａまたは３２８ａａの長さを有する。アラニン（Ｑｂｅｔａ ＣＰ遺伝子によってコードされる第２のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断は通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で起こり、そのようなことは、Ｑｂｅｔａコートタンパク質のＮ末端についても当てはまる。Ａ１遺伝子の一部である、ＵＧＡアンバーコドンの３’は、ＣＰ伸長をコードし、これは１９５アミノ酸の長さを有する。ＣＰ伸長部の位置７２と７３の間に抗原ペプチドを挿入すると、本発明のさらなる実施形態になる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端で切断されたＱｂｅｔａ Ａ１タンパク質のＣ末端で抗原ペプチドを融合すると、本発明のさらに好適な実施形態になる。例えば、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））は、エピトープが、位置１９で切断されたＱｂｅｔａ ＣＰ伸長部のＣ末端で融合されているＱｂｅｔａ Ａ１タンパク質融合を記載している。

【0115】

Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））によって記載されているように、融合エピトープをディスプレイする粒子のアセンブリは、典型的には、モザイク粒子を形成するために、Ａｌタンパク質−抗原融合物およびｗｔ ＣＰの両方の存在を必要とする。しかし、ウイルス様粒子を含む実施形態、および本明細書で特に、融合した抗原ペプチドを有するＶＬＰサブユニットからもっぱらなる、ＲＮＡファージＱｂｅｔａコートタンパク質のＶＬＰも、本発明の範囲内である。

【0116】

モザイク粒子の生成は、いくつかの方法で行うことができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）は３つの方法を記載しており、これらはすべて、本発明を実行するのに使用することができる。第１の手法では、ＶＬＰ上の融合エピトープの効率的なディスプレイは、ＵＧＡコドンをＴｒｐ（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Ｓｍｉｌｅｙ Ｂ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ １３４：３３〜４０（１９９３）））に翻訳するクローン化ＵＧＡ抑制因子ｔＲＮＡをコードするプラスミドを内部に持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系統内のＣＰとＣＰ伸長部の間にＵＧＡ終止コドンを有するＱｂｅｔａ Ａ１ｌタンパク質融合物をコードするプラスミドの発現によって媒介される。別の手法では、ＣＰ遺伝子終止コドンは、修飾されてＵＡＡになり、Ａ１タンパク質−抗原融合物を発現する第２のプラスミドが同時形質転換される。この第２のプラスミドは、異なる抗生物質耐性をコードし、複製起点は、第１のプラスミドと適合性である。第３の手法では、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）の図１に記載されているように、ＣＰおよびＡ１タンパク質−抗原融合物がバイシストロニック様式でコードされ、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結される。

【0117】

抗原または抗原決定基の融合に適したさらなるＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８１に記載されており、バクテリオファージｆｒ、ＲＮＡフェーズＭＳ−２、パピローマウイルスのカプシドタンパク質、レトロトランスポゾンＴｙ、酵母、およびまた、レトロウイルス様粒子、ＨＩＶ２ Ｇａｇ、Ｃｏｗｐｅａモザイクウイルス、パルボウイルスＶＰ２ ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇを含む（ＵＳ４，７２２，８４０、ＥＰ００２０４１６Ｂ１）。本発明を実行するのに適したキメラＶＬＰの例はまた、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：１（１９９６）に記載されているものである。本発明で使用するのに企図されているＶＬＰのさらなる例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ ＧＡＧ、タバコモザイクウイルス、ＳＶ−４０のウイルス様粒子、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、およびノーウォークウイルスである。

【0118】

免疫原性担体にカップリングした、またはカップリングしていない本発明による抗原性ＩｇＥペプチドを含めて、本発明の一部を形成する任意の組換え発現されたペプチドまたはタンパク質について、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸もまた、核酸を含む発現ベクター、および発現ベクター（自発的にまたは染色体に挿入された）を含有する宿主細胞と同様に、本発明の態様を形成する。上記宿主細胞中でペプチドまたはタンパク質を発現させ、そこから免疫原を単離することによってこのペプチドまたはタンパク質を組換えで生成する方法は、本発明のさらなる態様である。全長の天然のＩｇＥ分子またはこれをコードする全長の天然ＤＮＡ配列は、本発明によって網羅されない。

【0119】

別の実施形態では、本発明のペプチドは、当技術分野で周知の技法を使用して免疫原性担体に化学的にカップリングされる。コンジュゲーションが起こることによって、単一点コンジュゲーション（例えば、Ｎ末端点もしくはＣ末端点）を介した、またはペプチドの両末端が、免疫原性担体タンパク質、もしくはＶＬＰなどの足場構造にコンジュゲートしたロックダウン構造（ｌｏｃｋｅｄ ｄｏｗｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）として、ペプチドの自由な移動を可能にすることができる。この場合、コンジュゲーションは、当業者に知られるコンジュゲーション化学作用を介して、例えば、システイン残基、リシン残基、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などのコンジュゲーション点として一般に知られる他のカルボキシ部分などを介して起こる。したがって、例えば、直接の共有結合性のカップリングについて、ＣＤＡＰおよびＳＰＤＰなどの一般的な市販のヘテロ二官能性リンカーを利用して（製造者の指示書を使用して）、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または（Ｎ−［ｙ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを利用することが可能である。アシルヒドラジンペプチド誘導体を介した、ペプチド、特に環化ペプチドのタンパク質担体へのコンジュゲーションの例は、ＷＯ０３／０９２７１４に記載されている。カップリング反応の後、免疫原は、透析法、ゲル濾過法、分画法などの手段によって、容易に単離および精製することができる。システイン残基（好ましくは環化領域の外側のリンカー）で終止するペプチドは、好都合には、マレイミド化学反応を介して担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。

【0120】

免疫原性担体がＶＬＰである場合、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有するいくつかの抗原ペプチドは、１個のＶＬＰ分子にカップリングし、好ましくはＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０３／０２４４８１、ＷＯ０２／０５６９０５、およびＷＯ０４／００７５３８に記載されているように指向的に、いくつかの抗原決定基を提示する反復および秩序構造に導くことができる。

【0121】

本発明の一態様では、抗原ペプチドは、化学的架橋によって、典型的に、かつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用してＶＬＰに結合される。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、第１の付着部位、すなわち、ＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットのリシン残基の側鎖アミノ基と反応することができる官能基、および好適な第２の付着部位、すなわち、抗原ペプチドに融合され、任意選択により、還元による反応に利用可能にもされたシステイン残基と反応することができるさらなる官能基を含有する。誘導体化と典型的に呼ばれる、手順の第１の工程は、ＶＬＰの架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化ＶＬＰであり、活性化担体とも呼ばれる。第２の工程では、未反応の架橋剤が、ゲル濾過または透析などの通常の方法を使用して除去される。第３の工程では、抗原ペプチドが活性化ＶＬＰと反応され、この工程は典型的には、カップリング工程と呼ばれる。未反応の抗原ペプチドは、第４の工程において、例えば、透析によって任意選択により除去することができる。いくつかのヘテロ二官能性の架橋剤が当技術分野において知られている。これらとして、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能であり、アミノ基に対して反応性である１つの官能基、およびシステイン残基に対して反応性である１つの官能基を有する、好適な架橋剤のＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、および他の架橋剤が挙げられる。上述した架橋剤はすべて、チオエーテル連結を形成する。

【0122】

本発明を実行するのに適した別のクラスの架橋剤は、カップリングの際に、抗原ペプチドとＶＬＰの間にジスルフィド連結を導入することを特徴とする。このクラスに属する好適な架橋剤には、例えば、ＳＰＤＰおよびスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。架橋剤を用いたＶＬＰの誘導体化の程度は、様々な実験条件、例えば、反応パートナーのそれぞれの濃度、一方の反応物の他方に対する過剰、ｐＨ、温度、およびイオン強度などによって影響され得る。カップリングの程度、すなわちＶＬＰのサブユニット当たりの抗原ペプチドの量は、上述した様々な実験条件により調整することによって、ワクチンの必要条件に合わせることができる。

【0123】

抗原ペプチドをＶＬＰに結合させる別の方法は、ＶＬＰの表面上のリシン残基を、抗原ペプチド上のシステイン残基と連結することである。いくつかの実施形態では、ＶＬＰへのカップリングのために、第２の付着部位として、またはその一部としてのシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーを抗原ペプチドに融合することが必要とされる場合がある。一般に、フレキシブルアミノ酸リンカーが好都合である。アミノ酸リンカーの例は、（ａ）ＣＧＧ；（ｂ）Ｎ末端γ１−リンカー；（ｃ）Ｎ末端のγ３−リンカー；（ｄ）Ｉｇヒンジ領域；（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー；（ｆ）ｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５を有する（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎ；（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー；（ｈ）ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｉ＝０〜２を有する（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｉ（ＧＧＧＧＳ）ｎ；（ｉ）ＧＧＣ；（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２；（１）Ｃ末端γ１−リンカー；（ｍ）Ｃ末端γ３−リンカー；（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー；（ｏ）ｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５を有する（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋ；（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー；（ｑ）ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、１＝０〜２、およびｏ＝０〜８を有する（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｔ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）からなる群から選択される。アミノ酸リンカーのさらなる例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ、およびグリシンリンカー（Ｇ）ｎであり、すべて、第２の付着部位としてのシステイン残基、および任意選択により、さらなるグリシン残基をさらに含有する。前記アミノ酸リンカーの典型的に好適な例は、Ｎ末端γ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ；Ｃ末端γ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ；Ｎ末端γ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ；Ｃ末端γ３：ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ；Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ、およびＣ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧである。

【0124】

本発明を実行するのに特に適した他のアミノ酸リンカーは、疎水性抗原ペプチドがＶＬＰに結合される場合、Ｎ末端リンカーについてＣＧＫＫＧＧもしくはＣＧＤＥＧＧ、またはＣ末端リンカーについてＧＧＫＫＧＣおよびＧＧＥＤＧＣである。Ｃ末端リンカーについては、末端システインは、任意選択により、Ｃ末端にアミド化されている。

【0125】

本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドのＣ末端でのＧＧＣＧ、ＧＧＣ、もしくはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化を表す）リンカー、またはそのＮ末端でのＣＧＧが、アミノ酸リンカーとして好適である。一般に、グリシン残基が、かさ高いアミノ酸と、第２の付着部位として使用されるシステインとの間に挿入されることによって、カップリング反応における、よりかさ高いアミノ酸の潜在的な立体障害が回避される。本発明のさらなる実施形態では、アミノ酸リンカーＧＧＣ−ＮＨ２は、抗原ペプチドのＣ末端に融合される。

【0126】

抗原ペプチド上に存在するシステイン残基は、活性化されたＶＬＰ上のヘテロ二官能性架橋剤と反応するために、その還元された状態でなければならず、すなわち遊離システインまたは遊離スルフヒドリル基を有するシステイン残基が、利用可能でなければならない。結合部位として機能するためのシステイン残基が酸化形態である場合、例えば、これがジスルフィドブリッジを形成している場合では、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはｐ−メルカプトエタノールを用いてこのジスルフィドブリッジを還元することが必要とされる。ＷＯ０２／０５６９０に記載されているように、低濃度の還元剤がカップリングと適合性であり、より高い濃度はカップリング反応を阻害し、当業者は分かるように、この場合、例えば、透析、ゲル濾過、または逆相ＨＰＬＣによって、カップリングの前に、還元剤は除去されるか、またはその濃度が下げられなければならない。

【0127】

上述した方法に従って、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することによってＶＬＰに抗原ペプチドを結合させることにより、抗原ペプチドのＶＬＰへの指向的なカップリングが可能になる。抗原ペプチドをＶＬＰに結合させる他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、およびＮＨＳを使用して、抗原ペプチドがＶＬＰに架橋される方法が含まれる。

【0128】

他の方法では、抗原ペプチドは、ホモ二官能性架橋剤、例えば、グルタルアルデヒド、ＤＳＧＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３など、（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）、またはＶＬＰのアミン基またはカルボキシル基に対して反応性である官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤を使用して、ＶＬＰに付着される。

【0129】

ＶＬＰを抗原ペプチドに結合させる他の方法には、例えば、ＷＯ００／２３９５５に記載されているように、ＶＬＰがビオチン化されており、抗原ペプチドがストレプトアビジン融合タンパク質として発現される方法、または抗原ペプチドおよびＶＬＰの両方がビオチン化されている方法が含まれる。この場合、抗原ペプチドは、遊離結合部位がＶＬＰの結合に依然として利用可能であるように、抗原ペプチドとストレプトアビジンの比を調整することによって、ストレプトアビジンまたはアビジンに最初に結合することができ、これは、次工程において添加される。あるいは、すべての成分を「ワンポット」反応において混合することができる。他のリガンド−受容体対は、受容体およびリガンドの可溶性形態が利用可能であり、ＶＬＰまたは抗原ペプチドに架橋され得る場合、抗原ペプチドをＶＬＰに結合させるための結合剤として使用することができる。あるいは、リガンドまたは受容体は、抗原ペプチドに融合し、こうして、それぞれ、受容体に化学的に結合もしくは融合されたＶＬＰ、またはリガンドへの結合を媒介することができる。融合は、挿入または置換によっても行うことができる。

【0130】

１つまたはいくつかの抗原分子は、好ましくは、立体的に許容できる場合、ＶＬＰまたはＲＮＡファージの露出したリシン残基によって、ＲＮＡファージコートタンパク質のカプシドまたはＶＬＰの１つのサブユニットに付着することができる。したがって、ＲＮＡファージのコートタンパク質のＶＬＰ、特に、ＱＰコートタンパク質ＶＬＰの具体的な機能は、サブユニット当たりいくつかの抗原をカップリングする可能性である。これにより、高密度な抗原アレイの生成が可能になる。

【0131】

本発明の一実施形態では、それぞれ、少なくとも１つの抗原または抗原決定基のウイルス様粒子への結合および付着は、それぞれウイルス様粒子の少なくとも１つの第１の付着部位と、抗原ペプチドの少なくとも１つの第２の付着との間の相互作用および会合によるものである。

【0132】

Ｑコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、その表面上に規定された数のリシン残基をディスプレイし、カプシドの内部に向き、ＲＮＡと相互作用する３つのリシン残基、およびカプシドの外側に露出した４つの他のリシン残基を有する規定されたトポロジーを伴う。これらの規定された特性は、リシン残基がＲＮＡと相互作用する粒子の内側より、粒子の外側に抗原が付着することの方が好都合である。他のＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰも、その表面上に規定された数のリシン残基、およびこれらのリシン残基の規定されたトポロジーを有する。

【0133】

本発明のさらなる実施形態では、第１の付着部位はリシン残基であり、かつ／または第２の付着は、スルフヒドリル基またはシステイン残基を含む。本発明のなおさらなる実施形態では、第１の付着部位はリシン残基であり、第２の付着はシステイン残基である。本発明のさらなる実施形態では、抗原または抗原決定基は、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰのリシン残基、特に、Ｑｂｅｔａコートタンパク質のＶＬＰに、システイン残基を介して結合される。

【0134】

ＲＮＡファージに由来するＶＬＰの別の利点は、細菌中でのその高い発現収率であり、これは、手頃な費用で大量の物質の製造を可能にする。さらに、担体としてＶＬＰを使用することにより、それぞれ、多様な抗原密度を伴った、頑強な抗原アレイおよびコンジュゲートの形成が可能になる。特に、ＲＮＡファージのＶＬＰを使用することにより、本明細書では特に、ＲＮＡファージＱｂｅｔａコートタンパク質のＶＬＰを使用することにより、非常に高いエピトープ密度を実現することが可能になる。

【0135】

本発明のいくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫原性コンジュゲートの混合物、すなわち、１つまたは複数の本発明の抗原性ＩｇＥペプチドにカップリングした免疫原性担体を含み得る。したがって、これらの免疫原性組成物は、アミノ酸配列が異なる免疫原性担体からなる場合がある。例えば、「野生型の」ＶＬＰ、および１つまたは複数のアミノ酸残基が変更された（例えば、欠失、挿入、または置換された）修飾ＶＬＰタンパク質を含むワクチン組成物を調製することができる。あるいは、同じ免疫原性担体を使用するが、異なるアミノ酸配列の抗原性ＩｇＥペプチドにカップリングすることができる。

【0136】

したがって本発明は、本発明による免疫原を生成するための方法であって、ｉ）本発明による抗原性ＩｇＥペプチドを提供するステップと、ｉｉ）本発明による免疫原性担体、好ましくはＶＬＰを提供するステップと、ｉｉｉ）前記抗原性ＩｇＥペプチドおよび前記免疫原性担体を組み合わせるステップとを含む方法にも関する。一実施形態では、前記組み合わせるステップは、化学的な架橋、好ましくはヘテロ二官能性架橋剤によって行われる。

【0137】

一実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0138】

別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、および１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４１、１４４、１４５および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０９、１１０、１１１、１１２、１１８、１１９、１２０、１２６、１２７、１３３、および１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４９、５０、５１、５２、５３、５４、６３、６４、６５、６６、６７、７６、７７、７８、７９、８８、８９、９０、９９、１００、１０１、および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、１８、１９、２０、２１、２２、３４、３５、３６、３７、４９、５０、５１、６３、６４、および７６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、１８、１９、および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１または１８のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0139】

別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、および２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０１、２０２、２０５、２０６、２０７、２１０、２１１、２１４および２１７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、１７７、１７８、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９９、および２００からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１６５、１６６、および１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４または１６５のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0140】

別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、および３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９６、２９７、２９８、３０１、３０２および３０５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６６、２６７、２６８、２６９、２７５、２７６、２７７、２８３、２８４、および２９０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２３３、２３４、２３５、２３６、２４５、２４６、２４７、２５６、２５７、および２６６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２３３、２３４、および２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらから本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0141】

さらに別の実施形態では、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４１０、４１１、４１２、４１３、４１６、４１７、４１８、４２１、４２２および４２５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。より好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８６、３８７、３８８、３８９、３９５、３９６、３９７、４０３、４０４および４１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３５３、３５４、３５５、３５６、３６５、３６６、３６７、３７６、３７７、および３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３２６、３２７、３２８、３４０、３４１、および３５３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。さらにより好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、および３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる。

【0142】

本発明の一実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体分子に連結される。一実施形態では、前記免疫原性担体は、本明細書に記載される免疫原性担体のいずれかからなる群から選択される。別の実施形態では、前記免疫原性担体は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン；グロブリン；サイログロブリン；ヘモグロビン；ヘモシアニン（特にキーホールリンペットヘモシニアン［ＫＬＨ］）、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる群から選択される。好適な実施形態では、前記免疫原性担体は、キーホールリンペットヘモシニアンまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。さらに好適な実施形態では、前記免疫原性担体は、ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ、Ｑｂｅｔａ ＶＬＰ、または本明細書に開示される任意の変異体からなる群から選択されるＶＬＰである。さらに好適な実施形態では、前記免疫原性担体は、Ｑｂｅｔａ ＣＰ；Ｑｂｅｔａ Ａ１、Ｑｂｅｔａ−２４０、Ｑｂｅｔａ−２４３、Ｑｂｅｔａ−２５０、Ｑｂｅｔａ−２５１、およびＱｂｅｔａ−２５９（ＷＯ０３／０２４４８１に開示される）からなる群から選択されるＱｂｅｔａ ＶＬＰである。

【0143】

一実施形態では、前記免疫原性担体は、直接に、またはリンカーを介して、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドに共有結合的に連結される。一実施形態では、前記免疫原性担体は、本明細書に記載されるような融合タンパク質の発現によって、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドに連結される。別の実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、本明細書に記載されるような化学的架橋、好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用することによって、免疫原性担体、好ましくはＶＬＰに連結される。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、第１の付着部位、すなわち、ＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットのリシン残基の側鎖アミノ基と反応することができる官能基、および好適な第２の付着部位、すなわち、還元による反応に利用可能にされた抗原ペプチドに融合されたシステイン残基と反応することができるさらなる官能基を含有する。

【0144】

したがって、本発明の一実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＮ末端、またはそのＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方で、化学的架橋反応において免疫原性担体の付着部位と反応することができるリンカーをさらに含む。一実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＣ末端で、式（Ｇ）_ｎＣを有するリンカーをさらに含み、式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは、０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは、０、１、２、および３からなる群中で選ばれる整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、前記式はシステインを表す）。好ましくは、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＣ末端で、式ＧＧＧＣ、ＧＧＣ、ＧＣ、またはＣを有するリンカーをさらに含む。

【0145】

本発明の別の実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＮ末端で、式Ｃ（Ｇ）_ｎを有するリンカーをさらに含み、式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは、０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは、０、１、２、および３からなる群中で選ばれる整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、この式はシステインを表す）。好ましくは、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＮ末端で、式ＣＧＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧ、またはＣを有するリンカーをさらに含む。

【0146】

別の実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＮ末端で、式ＧＧＧＣ、ＧＧＣ、ＧＣ、またはＣを有するリンカーをさらに含む。

【0147】

別の実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＣ末端で、式（Ｇ）_ｎＣを有するリンカーであって、式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは、０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは、０、１、２、および３からなる群中で選ばれる整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、前記式はシステインを表す）リンカー、およびそのＮ末端で、式Ｃ（Ｇ）_ｎを有するリンカーであって、式中、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは、０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは、０、１、２、および３からなる群中で選ばれる整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、この式はシステインを表す）リンカーをさらに含む。好ましくは、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＮ末端で、式ＧＧＧＣ、ＧＧＣ、ＧＣ、またはＣを有するリンカー、およびそのＣ末端で、式ＧＧＧＣ、ＧＧＣ、ＧＣ、またはＣを有するリンカーをさらに含む。より好ましくは、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＮ末端でシステイン、およびそのＣ末端でシステインをさらに含む。

【0148】

そのようなリンカーをさらに含む前記抗原性ＩｇＥペプチドの代表は、配列番号４３４、４３６、４３７、４３８、および４３９に開示されている。本発明の一実施形態では、リンカーを含む抗原性ＩｇＥペプチドは、表９で開示されるペプチドのいずれかである。

【0149】

ＩｇＥ抗原性ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加されたシステイン残基は、典型的には還元（化学的架橋）、好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用することによる反応に利用可能である。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるリンカーをさらに含むＩｇＥ抗原性ペプチドは、ＶＬＰのリシン残基の側鎖アミノ基で架橋されている。

【0150】

したがって、一実施形態では、上述したリンカーをさらに含むＩｇＥ抗原性ペプチドは、免疫原性担体、特に、ＶＬＰ、好ましくはＨＢｃＡｇ ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに架橋されている。誘導体化と典型的に呼ばれる、手順の第１の工程は、ＶＬＰの架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化ＶＬＰであり、活性化担体とも呼ばれる。第２の工程では、未反応の架橋剤が、ゲル濾過または透析などの通常の方法を使用して除去される。第３の工程では、抗原ペプチドが活性化ＶＬＰと反応され、この工程は典型的には、カップリング工程と呼ばれる。未反応の抗原ペプチドは、第４の工程において、例えば、透析によって任意選択により除去することができる。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において知られている。これらとして、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能であり、アミノ基に対して反応性である１つの官能基、およびシステイン残基に対して反応性である１つの官能基を有する、好適な架橋剤のＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、および他の架橋剤が挙げられる。上述した架橋剤はすべて、チオエーテル連結を形成する。

【0151】

一実施形態では、本発明は、配列番号１、２、３、１８、１９、または３４、最も好ましくは、配列番号１もしくは１８のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0152】

一実施形態では、本発明は、配列番号１、２、３、１８、１９、または３４、最も好ましくは、配列番号１もしくは１８のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＮ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0153】

一実施形態では、本発明は、配列番号１５４、１５５、１５６、１６５、１６６、および１７５、最も好ましくは、配列番号１５４もしくは１６５のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0154】

一実施形態では、本発明は、配列番号１５４、１５５、１５６、１６５、１６６、および１７５、最も好ましくは、配列番号１５４もしくは１６５のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＮ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0155】

一実施形態では、本発明は、配列番号２２０、２２１、２２２、２３３、２３４、および２４５、最も好ましくは、配列番号２２０もしくは２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0156】

一実施形態では、本発明は、配列番号２２０、２２１、２２２、２３３、２３４、および２４５、最も好ましくは、配列番号２２０もしくは２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＮ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0157】

一実施形態では、本発明は、配列番号３１１、３１２、および３２６、最も好ましくは、配列番号３１１もしくは３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0158】

一実施形態では、本発明は、配列番号３１１、３１２、および３２６、最も好ましくは、配列番号３１１もしくは３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、前記抗原性ＩｇＥは、そのＮ末端で、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されたシステインをさらに含む免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0159】

一実施形態では、本発明は、配列番号３１１、３１２、および３２６、最も好ましくは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原に関する。好ましくは、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端でＧＣリンカー、好ましくは式ＧＧＣを有するリンカーをさらに含み（好ましくは、そのＣ末端でＧＣリンカーを含む前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号４５７のアミノ酸配列からなる、またはこれから本質的になる）、これは、架橋剤としてＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）を使用して、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されており、前記連結は、ＶＬＰのリシン残基と前記Ｃ末端リンカーのシステイン残基との間にある。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0160】

一実施形態では、本発明は、配列番号２２０、２２１、２３３、２３４、２４４、および２４６、最も好ましくは、配列番号２２０もしくは２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されており、前記連結が、ＶＬＰのリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥペプチドのシステイン残基との間にある免疫原に関する。前記実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、本明細書に記載されるような化学的架橋によって、好ましくは、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することによって、免疫原性担体、好ましくはＶＬＰに連結される。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、第１の付着部位、すなわち、ＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットのリシン残基の側鎖アミノ基と反応することができる官能基、および好適な第２の付着部位、すなわち、還元による反応に利用可能にされた抗原ペプチドのシステイン残基と反応することができるさらなる官能基を含有する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0161】

一実施形態では、本発明は、配列番号２２０のアミノ酸配列からなる、またはこのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原であって、架橋剤としてＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）を使用して、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されており、前記連結が、ＶＬＰのリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥペプチドのシステイン残基との間にある免疫原に関する。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰはＱｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0162】

特定の実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドの配列がシステインを含む場合、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、前記システインを介して直接、免疫原性担体に共有結合的に連結される。前記実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドは、本明細書に記載されるような化学的架橋によって、好ましくは、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することによって、免疫原性担体、好ましくはＶＬＰに連結される。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、第１の付着部位、すなわち、ＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットのリシン残基の側鎖アミノ基と反応することができる官能基、および好適な第２の付着部位、すなわち、還元による反応に利用可能にされた抗原ペプチドに融合したシステイン残基と反応することができる、さらなる官能基を含有する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドの配列がシステインを含む場合、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、チオエーテル連結を介して免疫原性担体に化学的に架橋され、前記連結は、免疫原性担体のリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥのシステイン残基との間にある。好適な実施形態では、前記免疫原性担体はＶＬＰ、好ましくは、Ｑｂｅｔａウイルス様粒子（さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａ）である。

【0163】

さらなる態様では、本発明は、少なくとも２つの本明細書に記載される免疫原を含む組成物に関する。一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの免疫原を含む組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。一実施形態では、前記組成物は、２、３、４、または５つの本発明の免疫原を含み、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む。

【0164】

好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体の異なる分子に個々に連結される（免疫原性担体の各分子は、これにコンジュゲートされた１つの型の抗原性ＩｇＥペプチドのみを有する）。前記実施形態では、抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされると言える。

【0165】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。

【0166】

一実施形態では、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、および１５３からなる群、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４１、１４４、１４５および１４８からなる群、より好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０９、１１０、１１１、１１２、１１８、１１９、１２０、１２６、１２７、１３３、および１３９からなる群、さらにより好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４９、５０、５１、５２、５３、５４、６３、６４、６５、６６、６７、７６、７７、７８、７９、８８、８９、９０、９９、１００、１０１、および１０９からなる群、さらにより好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、１８、１９、２０、２１、２２、３４、３５、３６、３７、４９、５０、５１、６３、６４、および７６からなる群、さらにより好ましくは、配列番号１、２、３、１８、１９、および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１または１８のアミノ酸配列からなる。

【0167】

一実施形態では、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、および２１９からなる群、好ましくは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０１、２０２、２０５、２０６、２０７、２１０、２１１、２１４、および２１７からなる群、より好ましくは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、１７７、１７８、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９９、および２００からなる群、さらにより好ましくは、配列番号１５４、１５５、１５６、１６５、１６６、および１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４または１６５のアミノ酸配列からなる。

【0168】

別の実施形態では、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、および３１０からなる群、好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９６、２９７、２９８、３０１、３０２および３０５からなる群、より好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６６、２６７、２６８、２６９、２７５、２７６、２７７、２８３、２８４、および２９０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２３３、２３４、２３５、２３６、２４５、２４６、２４７、２５６、２５７、および２６６からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２３３、２３４、および２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる。

【0169】

さらに別のものでは、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群、好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４１０、４１１、４１２、４１３、４１６、４１７、４１８、４２１、４２２および４２５からなる群、より好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８６、３８７、３８８、３８９、３９５、３９６、３９７、４０３、４０４および４１０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３５３、３５４、３５５、３５６、３６５、３６６、３６７、３７６、３７７、および３８６からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３２６、３２７、３２８、３４０、３４１、および３５３からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、および３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる。

【0170】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された抗原性ＩｇＥペプチドを含み、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなり、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、１６５からなる組成物に関する。別の実施形態では、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなり、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなり、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１２のアミノ酸配列からなる。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。

【0171】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。一実施形態では、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、および２１９からなる群、好ましくは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２００、２０１、２０２、２０５、２０６、２０７、２１０、２１１、２１４および２１７からなる群、より好ましくは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７５、１７６、１７７、１７８、１８４、１８５、１８６、１９２、１９３、１９９、および２００からなる群、さらにより好ましくは、配列番号１５４、１５５、１５６、１６５、１６６、および１７５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４または１６５のアミノ酸配列からなる。

【0172】

一実施形態では、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、および３１０からなる群、好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９６、２９７、２９８、３０１、３０２および３０５からなる群、より好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６６、２６７、２６８、２６９、２７５、２７６、２７７、２８３、２８４、および２９０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２３３、２３４、２３５、２３６、２４５、２４６、２４７、２５６、２５７、および２６６からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２３３、２３４、および２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる。

【0173】

別の実施形態では、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群、好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４１０、４１１、４１２、４１３、４１６、４１７、４１８、４２１、４２２および４２５からなる群、より好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８６、３８７、３８８、３８９、３９５、３９６、３９７、４０３、４０４および４１０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３５３、３５４、３５５、３５６、３６５、３６６、３６７、３７６、３７７、および３８６からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３２６、３２７、３２８、３４０、３４１、および３５３からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、および３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる。

【0174】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された抗原性ＩｇＥペプチドを含み、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１６５のアミノ酸配列からなり、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、２２０からなる組成物に関する。別の実施形態では、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１６５のアミノ酸配列からなり、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１２のアミノ酸配列からなる。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。

【0175】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。一実施形態では、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、および３１０からなる群、好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９６、２９７、２９８、３０１、３０２および３０５からなる群、より好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６６、２６７、２６８、２６９、２７５、２７６、２７７、２８３、２８４、および２９０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２３３、２３４、２３５、２３６、２４５、２４６、２４７、２５６、２５７、および２６６からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０、２２１、２２２、２３３、２３４、および２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる。

【0176】

一実施形態では、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群、好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４１０、４１１、４１２、４１３、４１６、４１７、４１８、４２１、４２２および４２５からなる群、より好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８６、３８７、３８８、３８９、３９５、３９６、３９７、４０３、４０４および４１０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３５３、３５４、３５５、３５６、３６５、３６６、３６７、３７６、３７７、および３８６からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、３１３、３１４、３２６、３２７、３２８、３４０、３４１、および３５３からなる群、さらにより好ましくは、配列番号３１１、３１２、および３２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、最も好ましくは、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる。

【0177】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された抗原性ＩｇＥペプチドを含み、第１の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０のアミノ酸配列からなり、第２の免疫原の抗原性ＩｇＥペプチドは、３１２からなる組成物に関する。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。

【0178】

本発明の実施形態によれば、ここで上記に開示される組成物の免疫原は、直接に、または本明細書で開示されるようなリンカーを介して免疫原性担体に、連結、好ましくは化学的に架橋される。一実施形態では、免疫原性担体は、キーホールリンペットヘモシアニン［ＫＬＨ］またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。好適な実施形態では、前記免疫原性担体は、ＨＢｃＡｇ ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ、Ｑｂｅｔａ ＶＬＰ、または本明細書に開示される任意の変異体からなる群から選択されるＶＬＰである。さらに好適な実施形態では、前記免疫原性担体は、Ｑｂｅｔａ ＣＰ；Ｑｂｅｔａ Ａ１、Ｑｂｅｔａ−２４０、Ｑｂｅｔａ−２４３、Ｑｂｅｔａ−２５０、Ｑｂｅｔａ−２５１、およびＱｂｅｔａ−２５９からなる群から選択されるＱｂｅｔａＶＬＰである。

【0179】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。一実施形態では、第１の免疫原は、配列番号２２０、２２１、２３３、２３４、２４４、および２４６、最も好ましくは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原からなり、この抗原性ＩｇＥは、チオエーテル連結を介してＱｂｅｔａウイルス様粒子（より好ましくは配列番号４３５のＱｂｅｔａ）に化学的に架橋されており、前記連結が、ＶＬＰのリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥペプチドのシステイン残基との間にあり、第２の免疫原は、配列番号３１１、３１２、および３２６、最も好ましくは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれから本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原からなり、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、Ｑｂｅｔａウイルス様粒子、より好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａに化学的に架橋されたシステインをさらに含む。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。

【0180】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。一実施形態では、第１の免疫原は、配列番号２２０、２２１、２３３、２３４、２４４、および２４６、最も好ましくは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原からなり、この抗原性ＩｇＥは、チオエーテル連結を介してＱｂｅｔａウイルス様粒子（より好ましくは配列番号４３５のＱｂｅｔａ）に化学的に架橋されており、前記連結が、ＶＬＰのリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥペプチドのシステイン残基との間にあり、第２の免疫原は、配列番号１、２、３、１８、１９、または３４、最も好ましくは、配列番号１または１８のアミノ酸配列からなる、またはこれから本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原からなり、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、Ｑｂｅｔａウイルス様粒子、より好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａに化学的に架橋されたシステインをさらに含む。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。

【0181】

一実施形態では、本発明は、３つの免疫原を含み、またはこれらからなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。一実施形態では、第１の免疫原は、配列番号２２０、２２１、２３３、２３４、２４４、および２４６、最も好ましくは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれから本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原からなり、この抗原性ＩｇＥは、チオエーテル連結を介してＱｂｅｔａウイルス様粒子（より好ましくは配列番号４３５のＱｂｅｔａ）に化学的に架橋されており、前記連結が、ＶＬＰのリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥペプチドのシステイン残基との間にあり、第２の免疫原は、配列番号３１１、３１２、および３２６、最も好ましくは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原からなり、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、Ｑｂｅｔａウイルス様粒子、より好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａに化学的に架橋されたシステインをさらに含み、第３の免疫原は、配列番号１、２、３、１８、１９、または３４、最も好ましくは、配列番号１または１８のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥを含む免疫原からなり、前記抗原性ＩｇＥは、そのＣ末端で、Ｑｂｅｔａウイルス様粒子、より好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａに化学的に架橋されたシステインをさらに含む。好ましくは、各抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされる。

【0182】

一実施形態では、本発明は、２つの免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、免疫原性担体に個々にコンジュゲートされた、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物に関する。一実施形態では、第１の免疫原は、配列番号２２０、２２１、２３３、２３４、２４４、および２４６、最も好ましくは、配列番号２２０または２３３のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥペプチドを含む免疫原からなる。好ましくは、前記第１の抗原性ＩｇＥペプチドは、架橋剤としてＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）を使用して、チオエーテル連結を介してＱｂｅｔａウイルス様粒子（より好ましくは配列番号４３５のＱｂｅｔａ）に化学的に架橋されており、前記連結は、ＶＬＰのリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥペプチドのシステイン残基との間にある。好ましくは、第２の免疫原は、配列番号３１１、３１２、および３２６、最も好ましくは、配列番号３１１または３１２のアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる抗原性ＩｇＥペプチドを含む免疫原からなる。好ましくは、前記第２の抗原性ＩｇＥペプチドは、そのＣ末端でＧＣリンカー、好ましくは式ＧＧＣを有するリンカーをさらに含み（好ましくは、そのＣ末端でＧＣリンカーを含む前記第２の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号４５７のアミノ酸配列からなる、またはこのアミノ酸配列から本質的になる）、これは、架橋剤としてＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）を使用して、チオエーテル連結を介してウイルス様粒子に化学的に架橋されており、前記連結は、ＶＬＰのリシン残基と前記Ｃ末端リンカーのシステイン残基との間にある。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａからなる群から選択される。好ましくは、前記ＶＬＰは、Ｑｂｅｔａ、さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａである。

【0183】

一実施形態では、本発明は、２、３、４、またはそれ以上の免疫原を含み、またはこれらの免疫原からなる組成物であって、これらの免疫原のそれぞれは、免疫原性担体に連結された抗原性ＩｇＥペプチドを含み、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９および４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、またはこれらのアミノ酸配列から本質的になる組成物に関する。一実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、同じ免疫原性担体に連結される。別の実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、異なる免疫原性担体に連結され、次いで混合される。

【0184】

本発明の免疫原の製造方法
本発明はさらに、本明細書に開示される免疫原を製造するプロセスに関する。一実施形態では、前記免疫原は、少なくとも１つの、本明細書に開示される免疫原性担体に連結された本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを含む。したがって、本発明はさらに、免疫原を製造するためのプロセスであって、少なくとも１つの本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを、本明細書に開示される免疫原性担体に連結するステップを含むプロセスに関する。一実施形態では、前記連結は、直接に、または本明細書に開示されるようなリンカー、特に、ＧＣリンカー（例えば、システイン）を介して、化学的な架橋によって実施される。一実施形態では、本発明は、免疫原を製造するためのプロセスであって、本明細書に開示されるようなリンカーを任意選択によりさらに含む、少なくとも１つの本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドを、本明細書に開示されるＶＬＰに連結するステップを含み、前記連結が、直接に、または本明細書に開示されるようなリンカー、特に、ＧＣリンカー（例えば、システイン）を介して、化学的な架橋によって実施されるプロセスに関する。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗原性ＩｇＥペプチドの配列がシステインを含む場合、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、前記システインを介して直接、ＶＬＰに共有結合的に連結される。前記実施形態では、このプロセスは、本明細書に記載されるように、かつ好ましくは、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば、Ｎ−γ−マレイミド−ブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）またはスクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ））を使用して、化学的に架橋するステップを含む。したがって、いくつかの実施形態では、化学的架橋工程は、チオエーテル連結を介して架橋されたＶＬＰをもたらし、前記連結は、ＶＬＰのリシン残基と、前記抗原性ＩｇＥのシステイン残基との間にある。好適な実施形態では、前記ＶＬＰは、好ましくはＱｂｅｔａウイルス様粒子（さらにより好ましくは、配列番号４３５のＱｂｅｔａ）である。本発明のさらなる実施形態は、本明細書に開示されるプロセスによって得られる免疫原に関する。

【0185】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドを含む組成物
本発明はさらに、組成物、特に、「対象免疫原性組成物（ｓｕｂｊｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とも呼ばれる免疫原性組成物であって、好ましくは、免疫原性担体、より好ましくは、ＶＬＰ、さらにより好ましくは、ＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結された本発明の抗原性ＩｇＥペプチド、および任意選択により、少なくとも１つのアジュバントを含む組成物に関する。そのような免疫原性組成物は、特に医薬組成物として製剤化される場合、ＩｇＥ関連障害を予防、治療、または軽減するのに有用であるとみなされている。

【0186】

いくつかの実施形態では、本発明による対象免疫原性組成物は、配列番号１〜４３０、およびこれらの機能的に活性な変異体から、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗原性ＩｇＥペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記抗原性ＩｇＥペプチドは、免疫原性担体、好ましくはＶＬＰ、より好ましくは、ＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結される。

【0187】

本発明による抗原性ＩｇＥペプチドを含む対象免疫原性組成物は、以下により詳細に記載されるように、いくつかの方法で製剤化することができる。

【0188】

いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、１つの種の抗原性ＩｇＥペプチドを含み、例えば、免疫原性組成物は、実質的にそのすべてが同じアミノ酸配列を有する、抗原性ＩｇＥペプチドの集団を含む。他の実施形態では、対象免疫原性組成物は、２つ以上の異なる抗原性ＩｇＥペプチドを含み、例えば、免疫原性組成物は、抗原性ＩｇＥペプチドの集団を含み、この集団のメンバーのアミノ酸配列は異なる場合がある。対象免疫原性組成物は、２〜約２０の異なる抗原性ＩｇＥペプチドを含む場合があり、例えば、対象免疫原性組成物は、それぞれが他の抗原性ＩｇＥペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸を有する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜１５、または１５〜２０の異なる抗原性ＩｇＥペプチドを含むことができる。

【0189】

例えば、いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、好ましくは免疫原性担体、より好ましくはＶＬＰ、さらにより好ましくは、ＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結され、配列番号１〜４３０からなる群、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択される第１のアミノ酸配列を含む第１の抗原性ＩｇＥペプチド；および好ましくは免疫原性担体、より好ましくはＶＬＰ、さらにより好ましくは、ＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結され、配列番号１〜４３０からなる群、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択される、第２のアミノ酸配列を含む、少なくとも第２の抗原性ＩｇＥペプチドを含み、第２のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と、少なくとも１、２、３、４、５、６〜１０、または１５のアミノ酸が異なる。さらなる実施形態では、第１の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜３１０からなる群、好ましくは配列番号２２０〜３１０、または配列番号１〜１５３、または配列番号１５４〜２１９からなる群、より好ましくは、配列番号２２０〜３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別のさらなる実施形態では、第１の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０〜３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜２１９および３１１〜４３０からなる群、好ましくは、配列番号３１１〜４３０、または配列番号１〜１５３、または配列番号１５４〜２１９からなる群、より好ましくは、配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別のさらなる実施形態では、第１の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４〜４３０からなる群、好ましくは、配列番号２２０〜３１０、配列番号３１１〜４３０、または配列番号１５４〜２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別のさらなる実施形態では、第１の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１５４〜２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群、好ましくは、配列番号２２０〜３１０、または配列番号１〜１５３、または配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0190】

別の例として、対象免疫原性組成物は、好ましくは免疫原性担体、より好ましくはＶＬＰ、さらにより好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結され、配列番号１〜４３０からなる群から選択される第１のアミノ酸配列を含む第１の抗原性ＩｇＥペプチド；好ましくは免疫原性担体、より好ましくはＶＬＰ、さらにより好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結され、好ましくは配列番号１〜４３０からなる群から選択される第２のアミノ酸配列を含む第２の抗原性ＩｇＥペプチドであって、第２のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と、少なくとも１、２、３、４、５、６〜１０、または１５のアミノ酸が異なる第２の抗原性ＩｇＥペプチド；および好ましくは免疫原性担体、より好ましくはＶＬＰ、さらにより好ましくはＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結され、好ましくは配列番号１〜４３０からなる群から選択される第３のアミノ酸配列を含む少なくとも第３の抗原性ＩｇＥポリペプチドであって、第３のアミノ酸配列が、第１および第２のアミノ酸配列の両方と、少なくとも１、２、３、４、５、６〜１０、または１５のアミノ酸が異なる第３の抗原性ＩｇＥポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、第１の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号３１１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２および第３の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜３１０からなる群、好ましくは、配列番号２２０〜３１０、または配列番号１〜１５３、または配列番号１５４〜２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0191】

別のさらなる実施形態では、第１の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号２２０〜３１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２および第３の抗原性ＩｇＥペプチドは、配列番号１〜２１９および３１１〜４３０からなる群、好ましくは、配列番号３１１〜４３０、または配列番号１〜１５３、または配列番号１５４〜２１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0192】

他の実施形態では、対象免疫原性組成物は、上述したような、多量体を形成した抗原性ＩｇＥポリペプチドを含む。本明細書で使用する場合、用語「抗原性ＩｇＥペプチドを含む免疫原性組成物」、または「本発明の免疫原性組成物」、または「対象免疫原性組成物」は、免疫原性担体にカップリングした、またはしていない１種（多量体を形成した、もしくは形成していない）または複数種の抗原性ＩｇＥペプチド（複数可）を含む免疫原性組成物を指す。２つ以上のペプチドが担体にカップリングされる場合、ペプチドは、同じ担体分子にカップリングし、または担体分子に個々にカップリングし、次いで組み合わせることによって免疫原性組成物を生成することができる。

【0193】

本発明の別の態様は、本発明による免疫原を製造するための方法であって、免疫原性担体に抗原性ＩｇＥペプチドをカップリングするステップを含む方法に関する。一実施形態では、前記カップリングは化学的である。

【0194】

いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含む。適当なアジュバントには、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて使用するのに適したものが含まれる。ヒトにおいて使用することができる既知の適当なアジュバントの例として、必ずしもそれだけに限らないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ ｗ／ｖのスクアレン、０．５％ ｗ／ｖのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％のｗ／ｖソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５））、ＣｐＧ含有核酸（シトシンはメチル化されていない）、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ０６／１３４４２３、およびＷＯ０７／０２６１９０を参照）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキンなどが挙げられる。それだけに限らないが、動物実験を含めた獣医学用途については、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、および２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中の細菌、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出される３つの成分を含有するＲＩＢＩを使用することができる。

【0195】

組成物の有効性を増強するためのさらなる例示的なアジュバントとして、それだけに限らないが、（１）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照）または細菌性細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤を伴って、または伴わずに）、例えば、（ａ）５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および０．５％のＳｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）を含有し（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）に共有結合的に連結したムラミルトリ−ペプチドを任意選択により含有する）、微小流動化剤を使用して製剤化してサブミクロン粒子にしたＭＦ５９（商標）（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５の１０章）（ｂ）１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、微小流動化されてサブミクロンのエマルジョンにされたか、ボルテックスされてより大きい粒径のエマルジョンにされたＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびに１つまたは複数の細菌性細胞壁成分、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）など、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）など；（２）サポニンアジュバント、例えば、ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、Ａｂｉｓｃｏ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、スウェーデン）、またはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストラリア）などを使用することができ、またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）などの粒子をこれらから生成することができ、このＩＳＣＯＭＳは、追加の界面活性剤を欠いている場合がある、例えば、ＷＯ００／０７６２１；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（５）肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）サッカリドとともに使用される場合、任意選択によりミョウバンの実質的な非存在下での（例えば、ＷＯ００／５６３５８）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４；（６）３ｄＭＰＬの例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組合せ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅｇ Ｖａｃｃｉｎｅ ２０００、１９、６１８〜６２２；Ｋｒｉｅｇ Ｃｕｒｒ ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２００１ ３：１５〜２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、８７０〜８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、５３９４〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；国際特許出願第ＷＯ９６／０２５５５号、同第ＷＯ９８／１６２４７号、同第ＷＯ９８／１８８１０号、同第ＷＯ９８／４０１００号、同第ＷＯ９８／５５４９５号、同第ＷＯ９８／３７９１９号、および同第ＷＯ９８／５２５８１号］、すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有し、シトシンはメチル化されていない；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、ＷＯ９９／５２５４９；（９）オクトキシノール（ＷＯ０１／２１２０７）もしくはポリオキシエチレンアルキルエーテルと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）；（１１）免疫賦活剤および金属塩の粒子、例えば、ＷＯ００／２３１０５；（１２）サポニンおよび水中油型エマルジョン、例えば、ＷＯ９９／１１２４１；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意選択により＋ステロール）、例えば、ＷＯ９８／５７６５９；（１４）ムラミルペプチドなどの、組成物の効力を増強するための免疫賦活剤として作用する他の物質には、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタルニニル（ｉｓｏｇｌｕｔａｒｎｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる、（１５）ポリＩ：ＣなどのＴＬＲ３リガンド、ならびにＨｉｌｔｏｎｏｌおよびＡｍｐｌｉｇｅｎなどの同様の化合物を含めた、天然または合成の、トール様受容体についてのリガンド（例えば、Ｋａｎｚｌｅｒら ２００７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３、ｐ１５５２〜９に記載されているような）が挙げられる。

【0196】

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含む。特定の実施形態では、前記アジュバントは、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、より好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、核酸配列５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（ＯＤＮ ＣｐＧ ２４５５５；配列番号４３１）を有する。配列番号４３１の免疫賦活性オリゴヌクレオチド核酸配列は、以前に報告された免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１０１０３）５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（配列番号：４３２）と、３’に最も近いＣＧジヌクレオチドが反転していることによって異なる。これらの２つの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの間の活性の類似性は意外であり、その理由は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫賦活作用は、ＣｐＧモチーフの数、ＣＧジヌクレオチドに隣接する配列、ＣｐＧモチーフ（複数可）の位置、ＣｐＧモチーフ同士間の間隔に依存すると以前に報告されているためである（Ｂａｌｌａｓら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；Ｈａｒｔｍａｎｎら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；Ｋｌｉｎｍａｎら、２００３、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）。免疫賦活性オリゴヌクレオチドＣｐＧ ＯＤＮ２４５５５（配列番号４３１）中の３’に最も近いＣＧジヌクレオチドを除去しても、以前の開示から予期されるように、この免疫賦活性オリゴヌクレオチドの抗原特異的免疫応答を増強する能力に悪影響をもたらさなかった。ＣｐＧ ＯＤＮ２４５５５は、ＣｐＧ ＯＤＮ１０１０３と比較した場合、同様の免疫賦活作用、いくつかの場合では増強された免疫賦活作用を実証した。

【0197】

免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一般に、二本鎖の分子は、インビボでより安定である一方で、一本鎖の分子は、免疫活性を増大させた。したがって、本発明のいくつかの態様では、核酸は一本鎖であることが好適であり、他の態様では、核酸は二本鎖であることが好適である。

【0198】

用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基、および置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））、または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）））である、交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味するのに、本明細書で互換的に使用される。本明細書で使用する場合、この用語は、オリゴリボヌクレオチド（すなわち、リン酸が抜けたポリヌクレオチド）、および任意の他の有機の塩基を含有するポリマーを指す。核酸分子は、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、合成である（例えば、核酸合成によって生成される）ことが好ましい。

【0199】

一実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡと比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジ、β−Ｄ−リボース単位および／または天然のヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）を伴う、様々な化学修飾および置換を包含することができる。化学修飾の例は、当業者に知られており、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ」Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ＆Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ Ｊ．ら、（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：３３１〜４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を有することができ、各修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡからなる同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジ、および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位、および／または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に配置される。

【0200】

例えば、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を含むことができる。そのような修飾は、ａ）修飾されたヌクレオシド間ブリッジによる、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置したホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジの置換、ｂ）デホスホブリッジによる、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置したホスホジエステルブリッジの置換、ｃ）別の単位による、糖リン酸主鎖に由来する糖リン酸単位の置換、ｄ）修飾糖単位によるβ−Ｄ−リボース単位の置換、およびｅ）天然のヌクレオシド塩基の置換から選択することができる。

【0201】

核酸は、置換プリンおよび置換ピリミジン、例えば、Ｃ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリン修飾塩基なども含む（Ｗａｇｎｅｒら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０〜４）。プリンおよびピリミジンには、それだけに限らないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在する、および天然に存在しない核酸塩基、置換および非置換の芳香族部分が含まれる。他のそのような修飾も当業者に周知である。

【0202】

修飾塩基は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に典型的に見出される、天然に存在する塩基、例えば、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵなどと化学的に異なるが、これらの天然に存在する塩基と基本的な化学構造を共有する任意の塩基である。修飾ヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキルニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキルニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、好ましくは、７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えば、Ｎ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、Ｃ５−プロピニルピリミシン、ならびにジアミノプリン、例えば、２，６−ジアミノプリン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、または天然のヌクレオシド塩基の他の修飾から選択することができる。このリストは、例示的であることを意味し、限定的であると解釈されるべきでない。

【0203】

本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される免疫賦活性オリゴヌクレオチドのＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていないことが好ましい。非メチル化ＣｐＧモチーフは、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが後に続き、リン酸結合によって連結された非メチル化５’シトシン）である。他の態様では、ＣｐＧモチーフはメチル化されている。メチル化ＣｐＧモチーフは、メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが後に続き、リン酸結合に連結されたメチル化５’シトシン）である。

【0204】

本発明のいくつかの態様では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、修飾シトシンを含有することができる。修飾シトシンは、オリゴヌクレオチドの免疫賦活作用を損なうことなくこの塩基を置換することができるシトシンの天然に存在し、または天然に存在しないピリミジン塩基類似体である。修飾シトシンとして、それだけに限らないが、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、シュード−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）が挙げられる。いくつかの好適なシトシンには、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、およびＮ４−エチル−シトシンが含まれる。本発明の別の実施形態では、シトシン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基）、芳香環系（例えば、フルオロベンゼンもしくはジフルオロベンゼン）、または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって置換される。

【0205】

本発明のいくつかの態様では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、修飾グアニンを含有することができる。修飾グアニンは、オリゴヌクレオチドの免疫賦活作用を損なうことなくこの塩基を置換することができるグアニンの天然に存在し、または天然に存在しないプリン塩基類似体である。修飾グアニンとして、それだけに限らないが、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニン、および８−ブロモグアニン）、ならびに６−チオグアニンが挙げられる。本発明の別の実施形態では、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、およびＫ塩基）、芳香環系（例えば、ベンゾイミダゾール、もしくはジクロロ−ベンゾイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）、または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって置換される。

【0206】

ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド間連結を含むことができる。これらの修飾された連結は、分解に対してある程度耐性となり得る（例えば、安定化される）。「安定化された核酸分子」は、インビボ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）に対して相対的に耐性である核酸分子を意味するものとする。安定化は、長さまたは二次構造の機能である場合がある。数十〜数百キロベースの長さである核酸は、インビボ分解に対して相対的に耐性である。より短い核酸については、二次構造がその効果を安定化および増大させることができる。ステムループ構造の形成は、核酸分子を安定化することができる。例えば、核酸の３’末端が、上流の領域に対して自己相補性を有し、その結果これが、折り畳むことができ、ステムループ構造を形成することができる場合、核酸は安定化され、より大きい活性を示すことができる。

【0207】

核酸安定化はまた、リン酸主鎖の修飾によって実現することができる。ホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、最大の活性をもたらし、細胞内エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護することができる。

【0208】

インビボを使用するために、核酸は、分解（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる）に対して相対的に耐性であることが好ましい。核酸主鎖の修飾により、インビボで投与される場合、核酸の活性が増強されることが実証された。ステムループなどの二次構造は、分解に対して核酸を安定化することができる。あるいは、核酸の安定化は、リン酸主鎖の修飾によって実現され得る。好適な安定化された核酸は、少なくとも１つの部分的なホスホロチオエート修飾主鎖を有する。ホスホロチオエートは、ホスホラミデートまたはＨ−ホスホネート化学反応を使用して、自動化された技法を使用して合成することができる。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように作成することができ、アルキルホスホトリエステル（帯電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されているようにアルキル化されている）は、市販の試薬を使用して、自動固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換を行うための方法も記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５）。ＣｐＧモチーフを有する２’−Ｏ−メチル核酸も、エトキシで修飾されたＣｐＧ核酸が引き起こすように、免疫活性化を引き起こす。実際には、ＣｐＧ効果を完全に無効にする主鎖の修飾はまったく見つかっていないが、ＣｐＧ効果は、Ｃを５−メチルＣで置換することによって大いに低減される。ホスホロチオエート連結を有するコンストラクトは、最大の活性をもたらし、細胞内エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する。他の修飾核酸として、ホスホジエステルで修飾された核酸、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート核酸の組合せ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ｐ−エトキシ、ならびにこれらの組合せが挙げられる。これらの組合せ、ならびに免疫細胞に対するこれらの特定の効果のそれぞれは、ＰＣＴ公開特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１５７０（ＷＯ９６／０２５５５）およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１（ＷＯ９８／１８８１０）、ならびに２００１年２月２７日に発行された米国特許第６，１９４，３８８（Ｂ１）号、および２００１年５月２９日に発行された米国特許第６，２３９，１１６（Ｂ１）号において論じられており、その内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。これらの修飾核酸は、ヌクレアーゼ耐性の増強、細胞取込みの増大、タンパク質結合の増大、および／または細胞内局在化の変化のために、より刺激性の活性を示すことができると考えられている。

【0209】

インビボでの投与については、核酸は、（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、単球細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）表面へのより高い親和結合ならびに／または「核酸送達複合体」を形成するための標的細胞による細胞取込みの増大をもたらす分子と付随することができる。核酸は、当技術分野で周知である技法を使用して、適切な分子とイオン的、または共有結合的に付随することができる。様々なカップリング剤または架橋剤、例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用することができる。核酸は、あるいは、周知の技法を使用してリポソームまたはビロソーム中にカプセル化することができる。

【0210】

他の安定化された核酸には、それだけに限らないが、非イオン性ＤＮＡ類似体、例えば、アルキルリン酸およびアリールリン酸（帯電したホスホネート酸素がアルキルまたはアリール基によって置換されている）など、帯電した酸素部分がアルキル化されているホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルが含まれる。いずれか、または両方の末端に、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含有する核酸も、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている。いくつかの実施形態では、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの親油性置換ヌクレオチド類似体および／またはピリミジン−プリンジヌクレオチドを含むことができる。

【0211】

オリゴヌクレオチドは、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有することができる。例えば、３’−３’連結によって２つのオリゴヌクレオチドを付着させて、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することによって、２つのそのような５’末端を有する修飾オリゴヌクレオチドを作り出すことが可能である。３’３’連結は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、または任意の他の修飾ヌクレオシド間ブリッジとすることができる。そのような連結を実現するための方法は、当技術分野で知られている。例えば、そのような連結は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｌ ３’−３’−ａｎｄ ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅｓ ａｓ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１）、１０（１〜３）、４６９〜７７、およびＪｉａｎｇら、Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）、７（１２）、２７２７〜２７３５に記載されている。

【0212】

さらに、３’末端ヌクレオシド同士間の連結がホスホジエステル、ホスホロチオエート、または他の修飾されたブリッジでない３’３’で連結されたＯＤＮは、トリエチレングリコールホスフェートまたはテトラエチレングリコールホスフェート部分などの追加のスペーサーを使用して調製することができる（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．ら、Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｎｅ（ｄＡ）１２ ａｎｄ ｔｗｏ（ｄＴ）１２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｒｉｄｇｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）、３１（３８）、９１９７〜２０４、米国特許第５，６５８，７３８号、および米国特許第５，６６８，２６５号）。あるいは、非ヌクレオチドリンカーは、標準的なホスホラミジット化学反応を使用して、エタンジオール、プロパンジオール、または脱塩基デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位（Ｆｏｎｔａｎｅｌ，Ｍａｒｉｅ Ｌａｕｒｅｎｃｅら、Ｓｔｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｏｆ ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ５’−ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、２２（１１）、２０２２〜７）から導き出すことができる。非ヌクレオチドリンカーは、１回もしくは複数回組み込み、または互いに組み合わせることができ、連結される２つのＯＤＮの３’末端間の任意の望ましい距離を可能にする。

【0213】

ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置したホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジは、修飾ヌクレオシド間ブリッジによって置換することができ、修飾ヌクレオシド間ブリッジは、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホラミデート、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルホスホネートおよび／または（Ｃ６〜Ｃ１２）アリールホスホネートブリッジ、（Ｃ７〜Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ９５／０１３６３に開示された）から選択され、（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノによって置換されていてもよく、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６〜Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであり、またはＲ１およびＲ２は、これらを担持している窒素原子と一緒に、５〜６員複素環を形成し、これは、Ｏ、Ｓ、およびＮの群からのさらなるヘテロ原子をさらに含有することができる。

【0214】

ホスホジエステルブリッジの置換は、デホスホブリッジ（デホスホブリッジは、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ Ａ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２０巻、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ １９９３、１６章、ｐｐ．３５５以下に記載されている）によって、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置した。デホスホブリッジは、例えば、デホスホブリッジのホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基から選択される。

【0215】

本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、キメラ主鎖を任意選択により有することができる。キメラ主鎖は、１つを超える型の連結を含むものである。一実施形態では、キメラ主鎖は、式：５’Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２ ３’によって表すことができる。Ｙ１およびＹ２は、１から１０の間のヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｙ１およびＹ２はそれぞれ、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を含む。キメラオリゴヌクレオチドの少なくとも２つのヌクレオチドは、主鎖修飾を含むので、これらの核酸は、「安定化された免疫賦活性核酸」の１つの型の例である。

【0216】

キメラオリゴヌクレオチドに関して、Ｙ１およびＹ２は、互いに独立していると考えられている。これは、Ｙ１およびＹ２のそれぞれは、同じ分子内で互いに異なる配列および異なる主鎖連結を有していても、有していなくてもよいことを意味する。いくつかの実施形態では、Ｙ１および／またはＹ２は、３から８の間のヌクレオチドを有する。Ｎ１およびＮ２は、Ｎ１ＺＮ２が合計で少なくとも６ヌクレオチドを有する限り、０から５の間のヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｎ１ＺＮ２のヌクレオチドは、ホスホジエステル主鎖を有し、修飾主鎖を有する核酸を含まない。Ｚは免疫賦活性核酸モチーフであり、好ましくは本明細書で列挙されたものから選択される。

【0217】

式Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２の中央のヌクレオチド（Ｎ１ＺＮ２）は、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有し、Ｙ１およびＹ２は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結を有するが、１つを超える、またはさらにはすべて修飾ヌクレオチド間連結を有することができる。好適な実施形態では、Ｙ１および／またはＹ２は、少なくとも２つ、もしくは２つから５つの間の修飾ヌクレオチド間連結を有し、またはＹ１は、５つの修飾ヌクレオチド間連結を有し、Ｙ２は、２つの修飾ヌクレオチド間連結を有する。修飾ヌクレオチド間連結は、いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートで修飾された連結、ホスホロジチオエート連結、またはｐ−エトキシで修飾された連結である。

【0218】

核酸には、２’位のヒドロキシル基以外、および５’位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合的に付着された主鎖糖を有する核酸も含まれる。したがって、修飾核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含むことができる。さらに、修飾核酸は、リボースの代わりにアラビノースまたは２’−フルオロアラビノースなどの糖を含むことができる。したがって、核酸は、主鎖の組成が不均一であってもよく、それによってペプチド−核酸（核酸塩基を伴ったアミノ酸主鎖を有する）などの、一緒に連結されたポリマー単位の任意の可能な組合せを含有する。いくつかの実施形態では、核酸は、主鎖の組成が均一である。

【0219】

糖リン酸主鎖に由来する糖リン酸単位（すなわち、β−Ｄ−リボースおよびホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジが一緒に糖リン酸単位を形成している）（すなわち、糖リン酸主鎖は、糖リン酸単位からなる）は、別の単位によって置換することができ、他の単位は、例えば、「モルホリノ−誘導体」オリゴマー（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ Ｅ．Ｐ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：６１２９〜４１に記載されているような）、すなわち、例えば、モルホリノ−誘導体による置換を構築する；またはポリアミド核酸（「ＰＮＡ」；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．Ｅ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３〜７に記載されているような）、すなわち、例えば、ＰＮＡ主鎖単位、例えば、２−アミノエチルグリシンによる置換を構築するのに適している。オリゴヌクレオチドは、他の炭水化物主鎖の修飾および置換、例えば、リン酸基（ＰＨＯＮＡ）を有するペプチド核酸、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴った主鎖を有するオリゴヌクレオチドなどを有することができる。アルキルリンカーは、分岐されていても非分岐であっても、置換されていても非置換であっても、キラルに純粋であってもラセミ混合物であってもよい。

【0220】

β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’デオキシリボース単位は、修飾糖単位によって置換することができ、修飾糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースから選択され、好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−ｘｙｌｏ−フラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ヘキソ−ピラノース、ならびに炭素環式の（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ Ｊ．（１９９２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：８３２０に記載されている）および／または鎖状の糖類似体（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：７２２３に記載されている）、および／またはビシクロ糖（ｂｉｃｙｃｌｏｓｕｇａｒ）類似体（例えば、Ｔａｒｋｏｖ Ｍ．ら（１９９３）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７６：４８１に記載されている）から選択される。

【0221】

いくつかの実施形態では、特に、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ヌクレオシド間連結によって連結された一方または両方のヌクレオチドについて、糖は２’−Ｏ−メチルリボースである。

【0222】

本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知のいくつかの手順のいずれかを使用して新規に合成することができる。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミジット法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１５８９）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７；Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）２７：４０５５〜４０５８；Ｇａｆｆｎｅｙら、（１９８８）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２）。これらの化学反応は、市販されている、様々な自動核酸シンセサイザーによって実施することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。あるいは、Ｔに富む、および／またはＴＧジヌクレオチドは、プラスミド中で大規模に製造し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｔ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照）、より小さい断片に分け、または全体を投与することができる。核酸は、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを使用するものなどの既知の技法を使用して、既存の核酸配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から調製することができる。

【0223】

ホスホロチオエートなどの修飾主鎖は、ホスホラミデートまたはＨ−ホスホネート化学反応を使用して、自動化された技法を使用して合成することができる。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように作製することができ、アルキルホスホトリエステル（帯電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号に記載されているようにアルキル化されている）は、市販の試薬を使用して、自動固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換を行うための方法も記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４、１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５、１９９０）。

【0224】

このようにして調製された核酸は、単離核酸と呼ばれる。「単離核酸」は一般に、細胞、核、ミトコンドリア、またはクロマチンから分離される成分、および混入物とみなすことができる任意の他の成分から分離される核酸を指す。

【0225】

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである少なくとも１つのアジュバントを含む。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；および同第６，３３９，０６８号を含めた、いくつかの発行済み特許、公開特許出願、および他の刊行物に記載されている。

【0226】

様々なクラスのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドが同定されている。これらは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＰクラスと呼ばれ、以下により詳細に記載される。本発明の方法および組成物は、これらの様々なクラスのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドの使用を包含する。

【0227】

これらのクラスのいずれも、その効力を増強するＥ修飾に従属させることができる。Ｅ修飾は、５’末端ヌクレオチドに対するハロゲン置換とすることができ、そのような置換の例には、それだけに限らないが、ブロモ−ウリジンまたはヨード−ウリジン置換が含まれる。Ｅ修飾は、５’末端ヌクレオチドに対するエチル−ウリジン置換も含むことができる。

【0228】

「Ａクラス」のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）から高レベルのインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）を誘発する能力、およびＢ細胞活性化に対して最小の効果を有する一方でＮＫ細胞活性化を誘発することを機能的に特徴とする。構造的に、このクラスは一般に、５’および３’末端で安定化されたポリ−Ｇ配列を有する。これは、少なくとも６ヌクレオチドの、パリンドロームのホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチド含有配列も有し、例えば、必ずしもではないが、これは、Ｙａｍａｍｏｔｏらによって記載された以下の六量体パリンドローム、すなわちＧＡＣＧＴＣ、ＡＧＣＧＣＴ、またはＡＡＣＧＴＴの１つを含有する。Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：４０７２〜６（１９９２）。ＡクラスのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチド、およびこのクラスの例示的な配列は、ともに２０００年９月２７日に出願された、米国通常特許出願第０９／６７２，１２６号および公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／２６５２７（ＷＯ０１／２２９９０）に記載されている。

【0229】

一実施形態では、本発明の「Ａクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列：５’ＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧ３’（配列番号：４４０）を有する。

【0230】

Ａクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定例には、
５’Ｇ^＊Ｇ^＊Ｇ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｇ＿Ｇ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｇ３’が含まれ、^＊は、ホスホロチオエート結合を指し、＿は、ホスホジエステル結合を指す。

【0231】

「Ｂクラス」のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞を活性化する能力を機能的に特徴とし、ただしｐＤＣは、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞活性化を誘発することにおいて相対的に弱い。構造的に、このクラスは一般に、ホスホロチオエート連結で完全に安定化され得るが、これは、好ましくは、ＣｐＧモチーフ（複数可）のシトシンとグアニンの間に１つまたは複数のホスホジエステル連結も有することもでき、この場合、この分子は、半軟質（ｓｅｍｉ−ｓｏｆｔ）であると呼ばれる。一実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも式：
５’Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４３’によって表されるＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ヌクレオチドである。一実施形態では、Ｘ_２は、アデニン、グアニン、またはチミンである。別の実施形態では、Ｘ_３は、シトシン、アデニン、またはチミンである。

【0232】

別の実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも式：
５’Ｎ_１Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４Ｎ_２３’によって表されるＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、ヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎ_１およびＮ_２はそれぞれ、約０〜２５のＮからなる核酸配列である。一実施形態では、Ｘ_１Ｘ_２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり、Ｘ_３Ｘ_４は、ＴｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、およびＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドである。好ましくは、Ｘ_１Ｘ_２はＧｐＡまたはＧｐＴであり、Ｘ３Ｘ４はＴｐＴである。他の実施形態では、Ｘ_１もしくはＸ_２または両方はプリンであり、Ｘ_３もしくはＸ_４または両方はピリミジンであり、あるいはＸ_１Ｘ_２はＧｐＡであり、Ｘ_３もしくはＸ_４または両方はピリミジンである。好適な一実施形態では、Ｘ_１Ｘ_２は、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＣ、ＡｐＧ、およびＧｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、Ｘ_３Ｘ_４は、ＴｐＴ、ＴｐＡ、ＴｐＧ、ＡｐＡ、ＡｐＧ、ＧｐＡ、およびＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドである。Ｘ_１Ｘ_２は、別の実施形態では、ＴｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＴ、ＧｐＣ、ＣｐＣ、ＣｐＴ、ＴｐＣ、ＧｐＴ、およびＣｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり、Ｘ_３は、ＡおよびＴからなる群から選択されるヌクレオチドであり、Ｘ_４はヌクレオチドであるが、Ｘ_１Ｘ_２がＴｐＣ、ＧｐＴ、またはＣｐＧであるとき、Ｘ_３Ｘ_４はＴｐＣ、ＡｐＴ、またはＡｐＣではない。

【0233】

別の好適な実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’ＴＣＮ_１ＴＸ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４３’を有する。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、およびＡｐＡからなる群から選択されるＸ_１Ｘ_２、およびＴｐＴ、ＣｐＴ、およびＴｐＣからなる群から選択されるＸ３Ｘ４を含む。

【0234】

本発明のＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、上記に広く記載されたもの、ならびに公開ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１５７０およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１、ならびに米国特許第６，１９４，３８８号、同第６，２０７，６４６号、同第６，２１４，８０６号、同第６，２１８，３７１号、同第６，２３９，１１６号、および同第６，３３９，０６８号に開示されたものである。例示的な配列には、それだけに限らないが、これらの後者の出願および特許に開示されたものが含まれる。

【0235】

一実施形態では、本発明の「Ｂクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列を有する：
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ ３’（配列番号４３１）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ ３’（配列番号４３２）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ ３’（配列番号４３３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ ３’（配列番号４４１）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡ ３’（配列番号４４２）。

【0236】

これらの配列のいずれにおいても、連結のすべては、すべてホスホロチオエート結合である場合がある。別の実施形態では、これらの配列のいずれにおいても、連結の１つまたは複数は、好ましくは、ＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」の間のホスホジエステルである場合があり、半軟質のＣｐＧオリゴヌクレオチドにしている。これらの配列のいずれにおいても、エチル−ウリジンまたはハロゲンは、５’Ｔと置換することができ、ハロゲン置換の例には、それだけに限らないが、ブロモ−ウリジンまたはヨード−ウリジン置換が含まれる。

【0237】

Ｂクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定例には、
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ ３’が含まれ、^＊はホスホロチオエート結合を指す。

【0238】

「Ｃクラス」のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−αを誘発する能力を機能的に特徴とする。構造的に、このクラスは典型的に、１つまたは複数のＢクラス型免疫賦活性ＣｐＧモチーフを有する領域、および分子が、二次の（例えば、ステムループ）または三次の（例えば、二量体）型の構造を形成することを可能にするＱＣに富むパリンドロームまたはパリンドロームに近い領域を含む。いくつかのこれらのオリゴヌクレオチドは、従来の「刺激性」ＣｐＧ配列、および「ＧＣに富む」または「Ｂ細胞中和」モチーフの両方を有する。これらの組合せモチーフオリゴヌクレオチドは、従来のＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドに関連する効果（すなわち、Ｂ細胞活性化および樹状細胞（ＤＣ）活性化の強い誘発）と、ＡクラスのＣｐＧ ＯＤＮに関連する効果（すなわち、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞活性化の強い誘発であるが、Ｂ細胞およびＤＣ活性化の相対的に劣った誘発）の間のどこかに入る免疫刺激作用を有する。Ｋｒｉｅｇ ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜９；Ｂａｌｌａｓ ＺＫら（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：１８４０〜５；Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓら（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：４０７２〜６。

【0239】

Ｃクラスの組合せモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチドは、安定化された（例えば、すべてホスホロチオエート）、キメラ（ホスホジエステル中心領域）、または半軟質（例えば、ＣｐＧモチーフ内のホスホジエステル）主鎖を有することができる。２００２年８月１９日に出願された米国特許出願第１０／２２４，５２３号に記載されている。

【0240】

ＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドの１つの刺激性ドメインまたはモチーフは、式：５’Ｘ_１ＤＣＧＨＸ_２３’によって定義される。Ｄは、Ｃ以外のヌクレオチドである。Ｃはシトシンである。Ｇはグアニンである。Ｈは、Ｇ以外のヌクレオチドである。Ｘ_１およびＸ_２は、０〜１０ヌクレオチドの長さの任意の核酸配列である。Ｘ_１はＣＧを含むことができ、この場合、このＣＧの直前にＴが存在することが好ましい。いくつかの実施形態では、ＤＣＧはＴＣＧである。Ｘ_１は、長さが０〜６ヌクレオチドであることが好ましい。いくつかの実施形態では、Ｘ_２は、任意のポリＧまたはポリＡモチーフを含有しない。他の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、５’末端または３’末端でポリＴ配列を有する。本明細書で使用する場合、「ポリＡ」または「ポリＴ」は、それぞれ４つ以上の連続したＡ’またはＴ’のストレッチ、例えば、５’ＡＡＡＡ３’または５’ＴＴＴＴ３’を指すものとする。本明細書で使用する場合、「ポリＧ末端」は、核酸の５’末端または３’末端で起こる４つ以上の連続したＧのストレッチ、例えば、５’ＧＧＧＧ３’を指すものとする。本明細書で使用する場合、「ポリＧオリゴヌクレオチド」は、式５’Ｘ_１Ｘ_２ＧＧＧＸ_３Ｘ_４３’を有するオリゴヌクレオチドを指すものとし、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４はヌクレオチドであり、好ましくは、Ｘ_３およびＸ_４の少なくとも１つはＧである。この式の下でのＢ細胞刺激性ドメインについてのいくつかの好適な設計は、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、ＴＣＧＴＣＧＴを含む。

【0241】

ＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドの第２のモチーフは、ＰまたはＮと呼ばれ、Ｘ_１の５’側に直ちに、またはＸ_２の３’側に直ちに位置する。

【0242】

Ｎは、ＣＧＧトリヌクレオチドから始まるＢ細胞中和配列であり、少なくとも１０ヌクレオチドの長さである。Ｂ細胞中和モチーフは、ＣＧにＣが先行し、またはＧが後に続く少なくとも１つのＣｐＧ配列（Ｋｒｉｅｇ ＡＭら（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｄ ＵＳＡ ９５：１２６３１〜１２６３６）を含み、またはＣＧのＣがメチル化されている、ＣＧを含有するＤＮＡ配列である。中和モチーフまたは配列は、別の非刺激性モチーフ中に存在する場合、ある程度の免疫賦活性能力を有するが、他の免疫賦活性モチーフとの関連で存在する場合、他のモチーフの免疫賦活性の潜在性を低減するように機能を果たす。

【0243】

Ｐは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さの、ＧＣに富むパリンドロームを含有する配列である。

【0244】

本明細書で使用する場合、「パリンドローム」および同等に「パリンドローム配列」は、逆方向反復、すなわち、ＡとＡ’、ＢとＢ’などが、通常のワトソン−クリック塩基対を形成することができる塩基であるＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列を指すものとする。

【0245】

本明細書で使用する場合、「ＧＣに富むパリンドローム」は、少なくとも３分の２のＧおよびＣの塩基組成を有するパリンドロームを指すものとする。いくつかの実施形態では、ＧＣに富むドメインは、「Ｂ細胞刺激性ドメイン」の３’側にあることが好ましい。１０塩基の長さのＧＣに富むパリンドロームの場合では、したがって、このパリンドロームは、少なくとも８個のＧおよびＣを含有する。１２塩基の長さのＧＣに富むパリンドロームの場合では、このパリンドロームも、少なくとも８個のＧおよびＣを含有する。１４ｍｅｒのＧＣに富むパリンドロームの場合では、このパリンドロームの少なくとも１０個の塩基は、ＧおよびＣである。いくつかの実施形態では、ＧＣに富むパリンドロームは、ＧおよびＣでもっぱら構成される。

【0246】

いくつかの実施形態では、ＧＣに富むパリンドロームは、少なくとも８１％のＧおよびＣの塩基組成を有する。そのような１０塩基の長さのＧＣに富むパリンドロームの場合では、したがって、このパリンドロームは、ＧおよびＣでもっぱら作られている。そのような１２塩基の長さのＧＣに富むパリンドロームの場合では、このパリンドロームの少なくとも１０塩基（８３％）がＧおよびＣであることが好適である。いくつかの好適な実施形態では、１２塩基の長さのＧＣに富むパリンドロームは、ＧおよびＣでもっぱら作られている。１４ｍｅｒのＧＣに富むパリンドロームの場合では、このパリンドロームの少なくとも１２塩基（８６％）がＧおよびＣである。いくつかの好適な実施形態では、１４塩基の長さのＧＣに富むパリンドロームは、ＧおよびＣでもっぱら作られている。ＧＣに富むパリンドロームのＣは、メチル化されていなくてもよく、これらは、メチル化されていてもよい。

【0247】

一般にこのドメインは、少なくとも３個のＣおよびＧ、より好ましくは４個のそれぞれ、最も好ましくは５個以上のそれぞれを有する。このドメイン中のＣおよびＧの数は、同一である必要はない。ＣおよびＧは、これらが、自己相補性の二本鎖、またはＣＣＧＣＧＣＧＧなどのパリンドロームを形成することができるように配列されることが好適である。これは、ＡまたはＴによって中断される場合があるが、自己相補性は、例えば、モチーフＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＣＧまたはＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧにおいて見られるように、少なくともある程度保存されていることが好適である。相補性が保存されない場合、非相補性塩基対はＴＧであることが好適である。好適な実施形態では、パリンドロームの一部でない連続した塩基は３個以下、好ましくは２個以下、最も好ましくは１個のみである。いくつかの実施形態では、ＧＣに富むパリンドロームは、少なくとも１つのＣＧＧ三量体、少なくとも１つのＣＣＧ三量体、または少なくとも１つのＣＧＣＧ四量体を含む。他の実施形態では、ＧＣに富むパリンドロームは、ＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＧまたはＧＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧまたはＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣでない。

【0248】

ＧＣに富む領域のＧのうちの少なくとも１つは、イノシン（Ｉ）で置換することができる。いくつかの実施形態では、Ｐは、１個を超えるＩを含む。

【0249】

ある特定の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、以下の式、すなわち、５’ＮＸ_１ＤＣＧＨＸ_２３’、５’Ｘ_１ＤＣＧＨＸ_２Ｎ３’、５’ＰＸ_１ＤＣＧＨＸ_２３’、５’Ｘ_１ＤＣＧＨＸ_２Ｐ３’、５’Ｘ_１ＤＣＧＨＸ_２ＰＸ_３３’、５’Ｘ_１ＤＣＧＨＰＸ_３３’、５’ＤＣＧＨＸ_２ＰＸ_３３’、５’ＴＣＧＨＸ_２ＰＸ３ ３’、５’ＤＣＧＨＰＸ_３３’、または５’ＤＣＧＨＰ３’のうちの１つを有する。

【0250】

本発明は、式５’Ｎ_１ＰｙＧＮ_２Ｐ３’によって定義される他の免疫刺激オリゴヌクレオチドを提供する。Ｎ_１は、１〜６ヌクレオチドの長さの任意の配列である。Ｐｙはピリミジンである。Ｇはグアニンである。Ｎ_２は、０〜３０ヌクレオチドの長さの任意の配列である。Ｐは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さの、ＧＣに富むパリンドロームを含有する配列である。

【0251】

Ｎ_１およびＮ_２は、５０％を超えるピリミジン、より好ましくは５０％を超えるＴを含有することができる。Ｎ_１は、ＣＧを含むことができ、この場合、このＣＧの直前にＴが存在することが好ましい。いくつかの実施形態では、Ｎ１ＰｙＧはＴＣＧ、最も好ましくはＴＣＧＮ_２であり、Ｎ_２はＧでない。

【0252】

Ｎ_１ＰｙＧＮ_２Ｐは、１つまたは複数のイノシン（Ｉ）ヌクレオチドを含むことができる。Ｎ_１中のＣまたはＧは、イノシンによって置換することができるが、ＣｐＩがＩｐＧより好適である。ＩｐＧなどのイノシン置換について、最適な活性は、ＩＧまたはＣＩの間の連結がホスホジエステルである、「半軟質」またはキメラ主鎖を使用することによって実現することができる。Ｎ１は、少なくとも１つのＣＩ、ＴＣＩ、ＩＧ、またはＴＩＧモチーフを含むことができる。

【0253】

ある特定の実施形態では、Ｎ_１ＰｙＧＮ_２は、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、およびＴＣＧＴＣＧＴからなる群から選択される配列である。

【0254】

一実施形態では、本発明の「Ｃクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列を有する：
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４４３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４４４）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４４５）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４４６）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４４７）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４４８）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４４９）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４５０）、または
５’ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４５１）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４５２）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ ３’（配列番号４５３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ ３’（配列番号４５４）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴ ３’（配列番号４５５）。

【0255】

これらの配列のいずれにおいても、連結のすべては、すべてホスホロチオエート結合である場合がある。別の実施形態では、これらの配列のいずれにおいても、連結の１つまたは複数は、好ましくは、ＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」の間のホスホジエステルである場合があり、半軟質のＣｐＧオリゴヌクレオチドにしている。

【0256】

Ｃクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定例には、
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ ３’、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ ３’
が含まれ、^＊はホスホロチオエート結合を指し、＿はホスホジエステル結合を指す。

【0257】

これらの配列のいずれにおいても、エチル−ウリジンまたはハロゲンは、５’Ｔと置換することができ、ハロゲン置換の例には、それだけに限らないが、ブロモ−ウリジンまたはヨード−ウリジン置換が含まれる。

【0258】

「Ｐクラス」のＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００７／０９５３１６に記載されており、これらが、５’および３’末端の両方で、またはこれらの付近で、二本鎖形成領域、例えば、完全または不完全なパリンドロームを含有し、これらに、コンカタマーなどのより高い秩序構造を形成する潜在性を与えているという事実を特徴とする。Ｐクラスのオリゴヌクレオチドと呼ばれるこれらのオリゴヌクレオチドは、Ｃクラスより、はるかに高いレベルのＩＦＮ−α分泌を誘発する能力を場合によって有する。Ｐクラスのオリゴヌクレオチドは、インビトロおよび／またはインビボで、自発的に自己組織化してコンカタマーになる能力を有する。これらの分子の作用機序（ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ）についてのいずれの特定の理論にも束縛されることなく、１つの可能な仮説は、この特性は、Ｐクラスのオリゴヌクレオチドに、以前に述べたクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して、異なるパターンの免疫活性化を含めて、ある特定の免疫細胞内部のＴＬＲ９により高度に架橋する能力を授けるということである。

【0259】

一実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメイン、および少なくとも２つのパリンドローム領域を含有するＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、１つのパリンドローム領域は、長さが少なくとも６ヌクレオチドの５’パリンドローム領域であり、長さが少なくとも８ヌクレオチドの３’パリンドローム領域に、直接、またはスペーサーによって接続されており、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＹｐＲジヌクレオチドを含む。一実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇでない。一実施形態では、ＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＹｐＲ、ＴＴＹｐＲ、ＴＴＴＹｐＲ、ＵＣＧ、ＵＵＣＧ、ＵＵＵＣＧ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴである。さらに別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’パリンドローム領域内にある。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’パリンドローム領域の５’側の直後である。さらに別の実施形態では、５’パリンドローム領域は、長さが少なくとも８ヌクレオチドである。別の実施形態では、３’パリンドローム領域は、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである。別の実施形態では、５’パリンドローム領域は、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、３’パリンドローム領域は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、３’パリンドローム領域は、２つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、５’パリンドローム領域は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、５’パリンドローム領域は、２つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも２５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも３０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも３５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも４０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも４５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも５０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも５５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも６０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’パリンドローム領域は、少なくとも６５の二本鎖安定性値を有する。

【0260】

一実施形態では、２つのパリンドローム領域は、直接接続されている。別の実施形態では、２つのパリンドローム領域は、３’−３’連結を介して接続されている。別の実施形態では、２つのパリンドローム領域は、１つのヌクレオチドが重なっている。さらに別の実施形態では、２つのパリンドローム領域は、２つのヌクレオチドが重なっている。別の実施形態では、２つのパリンドローム領域は重なっていない。別の実施形態では、２つのパリンドローム領域は、スペーサーによって接続されている。一実施形態では、スペーサーは、１〜５０ヌクレオチドの長さを有する核酸である。別の実施形態では、スペーサーは、１ヌクレオチドの長さを有する核酸である。別の実施形態では、スペーサーは、非ヌクレオチドスペーサーである。一実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはＤスペーサーである。別の実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはリンカーである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式５’ＸＰ_１ＳＰ_２Ｔ３’を有し、式中、Ｘは、ＴＬＲ活性化ドメインであり、Ｐ_１パリンドロームであり、Ｓはスペーサーであり、Ｐ_２はパリンドロームであり、Ｔは、長さが０〜１００ヌクレオチドの３’末端である。一実施形態では、Ｘは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、またはＴＴＴＣＧである。別の実施形態では、Ｔは、長さが５〜５０ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、Ｔは、長さが５〜１０ヌクレオチドである。一実施形態では、Ｓは、１〜５０ヌクレオチドの長さを有する核酸である。別の実施形態では、Ｓは、１ヌクレオチドの長さを有する核酸である。別の実施形態では、Ｓは非ヌクレオチドスペーサーである。一実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはＤスペーサーである。別の実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはリンカーである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでもリボザイムでもない。一実施形態では、Ｐ_１は、ＡおよびＴに富む。別の実施形態では、Ｐ_１は、少なくとも４個のＴを含む。別の実施形態では、Ｐ_２は、完全なパリンドロームである。別の実施形態では、Ｐ２は、Ｇ−Ｃに富む。さらに別の実施形態では、Ｐ_２は、ＣＧＧＣＧＣＸ_１ＧＣＧＣＣＧであり、Ｘ_１はＴであるか、存在しない。

【0261】

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル様連結を含む。別の実施形態では、ホスホジエステル様連結は、ホスホジエステル連結である。別の実施形態では、親油性基が、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性基はコレステロールである。

【0262】

一実施形態では、本発明において使用するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメイン、および少なくとも２つの相補性含有領域、すなわち、５’および３’相補性含有領域を有するＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、各相補性含有領域は、長さが少なくとも８ヌクレオチドであり、直接に、またはスペーサーによって互いに接続され、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのピリミジン−プリン（ＹｐＲ）ジヌクレオチドを含み、相補性含有領域のうちの少なくとも１つは、完全なパリンドロームでない。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＹｐＲ、ＴＴＹｐＲ、ＴＴＴＹｐＲ、ＵＣＧ、ＵＵＣＧ、ＵＵＵＣＧ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴである。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’相補性含有領域内にある。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’相補性含有領域の５’側の直後にある。別の実施形態では、３’相補性含有領域は、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、５’相補性含有領域は、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである。一実施形態では、３’相補性含有領域は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、３’相補性含有領域は、２つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、５’相補性含有領域は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、５’相補性含有領域は、２つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、相補性含有領域は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。別の実施形態では、相補性含有領域は、分子内二本鎖を形成する。一実施形態では、分子内二本鎖は、少なくとも１つの非ワトソンクリック塩基対を含む。別の実施形態では、非ワトソンクリック塩基対は、Ｇ−Ｔ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｇ、またはＣ−Ａである。一実施形態では、相補性含有領域は、分子間二本鎖を形成する。別の実施形態では、分子間二本鎖のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの非ワトソンクリック塩基対を含む。別の実施形態では、非ワトソンクリック塩基対は、Ｇ−Ｔ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｇ、またはＣ−Ａである。さらに別の実施形態では、相補性含有領域は、１つのミスマッチを含有する。さらに別の実施形態では、補性含有領域は、２つのミスマッチを含有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、介在性ヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、２つの介在性ヌクレオチドを含有する。

【0263】

一実施形態では、５’および３’相補性含有領域は、少なくとも２５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’相補性含有領域は、少なくとも３０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、５’および３’相補性含有領域は、少なくとも３５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、少なくとも４０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、少なくとも４５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、少なくとも５０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、少なくとも５５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、少なくとも６０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態では、相補性含有領域は、少なくとも６５の二本鎖安定性値を有する。

【0264】

別の実施形態では、２つの相補性含有領域は、直接接続される。別の実施形態では、２つのパリンドローム領域は、３’−３’連結を介して接続される。さらに別の実施形態では、２つの相補性含有領域は、１つのヌクレオチドが重なっている。別の実施形態では、２つの相補性含有領域は、２つのヌクレオチドが重なっている。別の実施形態では、２つの相補性含有領域は重なっていない。別の実施形態では、２つの相補性含有領域は、スペーサーによって接続される。別の実施形態では、スペーサーは、１〜５０ヌクレオチドの長さを有する核酸である。別の実施形態では、スペーサーは、１ヌクレオチドの長さを有する核酸である。一実施形態では、スペーサーは非ヌクレオチドスペーサーである。別の実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはＤスペーサーである。さらに別の実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはリンカーである。

【0265】

一実施形態では、Ｐクラスのオリゴヌクレオチドは、式５’ＸＮＳＰＴ３’を有し、式中、ＸはＴＬＲ活性化ドメインであり、Ｎは完全でないパリンドロームであり、Ｐはパリンドロームであり、Ｓはスペーサーであり、Ｔは、長さが０〜１００ヌクレオチドの３’末端である。別の実施形態では、Ｘは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、またはＴＴＴＣＧである。別の実施形態では、Ｔは、長さが５〜５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、Ｔは、長さが５〜１０ヌクレオチドである。別の実施形態では、Ｓは、１〜５０ヌクレオチドの長さを有する核酸である。別の実施形態では、Ｓは、１ヌクレオチドの長さを有する核酸である。別の実施形態では、Ｓは非ヌクレオチドスペーサーである。別の実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはＤスペーサーである。別の実施形態では、非ヌクレオチドスペーサーはリンカーである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでもリボザイムでもない。別の実施形態では、Ｎは、ＡおよびＴに富む。別の実施形態では、Ｎは、少なくとも４個のＴを含む。別の実施形態では、Ｐは、完全なパリンドロームである。別の実施形態では、Ｐは、Ｇ−Ｃに富む。別の実施形態では、ＰはＣＧＧＣＧＣＸ_１ＧＣＧＣＣＧであり、式中、Ｘ_１は、Ｔであるか、存在しない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。別の実施形態では、すべてのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル様連結を含む。別の実施形態では、ホスホジエステル様連結は、ホスホジエステル連結である。別の実施形態では、親油性基が、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性基はコレステロールである。

【0266】

一実施形態では、本発明の「Ｐクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列、すなわち、５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号：４５６）を有する。

【0267】

前記配列において、連結のすべては、すべてホスホロチオエート結合である場合がある。別の実施形態では、連結の１つまたは複数は、好ましくは、ＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」の間のホスホジエステルである場合があり、半軟質のＣｐＧオリゴヌクレオチドにしている。これらの配列のいずれにおいても、エチル−ウリジンまたはハロゲンは、５’Ｔと置換することができ、ハロゲン置換の例には、それだけに限らないが、ブロモ−ウリジンまたはヨード−ウリジン置換が含まれる。

【0268】

Ｐクラスのオリゴヌクレオチドの非限定例には、５’Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ＿Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ３’が含まれ、式中、^＊はホスホロチオエート結合を指し、＿はホスホジエステル結合を指す。

【0269】

一実施形態では、本明細書に開示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結は、ホスホジエステル結合である（ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０に記載されたような「軟質」オリゴヌクレオチド）。別の実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、分解に対して耐性にされる（例えば、安定化される）。「安定化されたオリゴヌクレオチド」は、インビボ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）に対して相対的に耐性であるオリゴヌクレオチドを指す。核酸の安定化は、主鎖の修飾によって実現することができる。ホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドは、最大の活性をもたらし、細胞内エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護する。

【0270】

免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、キメラ主鎖を有することができ、これは、ホスホジエステル連結とホスホロチオエート連結の組合せを有する。本発明の目的に関して、キメラ主鎖は、部分的に安定化された主鎖を指し、少なくとも１つのヌクレオチド間連結は、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、少なくとも１つの他のヌクレオチド間連結は、安定化されたヌクレオチド間連結であり、少なくとも１つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様連結、および少なくとも１つの安定化された連結は異なる。ホスホジエステル連結が、ＣｐＧモチーフ内に選択的に配置される場合、そのような分子は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０に記載されているように「半軟質」と呼ばれる。

【0271】

他の修飾オリゴヌクレオチドには、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／またはｐ−エトキシ連結の組合せが含まれる。

【0272】

ボラノホスホネート連結は、主鎖のキメラの性質の目的に関して、ホスホジエステル連結と比べて安定化されることが報告されているので、ボラノホスホネート連結は、脈絡に応じて、ホスホジエステル様または安定化されていると分類することができる。例えば、本発明によるキメラ主鎖は、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのホスホジエステル（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）連結、および少なくとも１つのボラノホスホネート（安定化された）連結を含むことができる。他の実施形態では、本発明によるキメラ主鎖は、ボラノホスホネート（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）、およびホスホロチオエート（安定化された）連結を含むことができる。「安定化されたヌクレオチド間連結」は、ホスホジエステルヌクレオチド間連結と比較して、インビボ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）に対して相対的に耐性であるヌクレオチド間連結を意味するものとする。好適な安定化されたヌクレオチド間連結には、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、およびメチルホスホロチオエートが含まれる。他の安定化されたヌクレオチド間連結には、限定することなく、ペプチド、アルキル、デホスホ、および上述したような他のものが含まれる。

【0273】

ホスホロチオエートなどの修飾主鎖は、ホスホラミデートまたはＨ−ホスホネート化学反応を使用して、自動化された技法を使用して合成することができる。アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように作製することができ、アルキルホスホトリエステル（帯電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されているようにアルキル化されている）は、市販の試薬を使用して、自動固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換を行うための方法も記載されている。Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １：１６５。キメラオリゴヌクレオチドを調製するための方法も知られている。例えば、Ｕｈｌｍａｎｎらに発行された特許には、そのような技法が記載されている。

【0274】

混合された主鎖修飾ＯＤＮは、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０に記載されているように合成することができる。

【0275】

本発明のオリゴヌクレオチドは、他の修飾も含むことができる。これらには、非イオン性ＤＮＡ類似体、例えば、アルキルリン酸およびアリールリン酸（帯電したホスホネート酸素がアルキルまたはアリール基によって置換されている）など、帯電した酸素部分がアルキル化されているホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルが含まれる。いずれか、または両方の末端に、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含有する核酸も、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている。

【0276】

ＣｐＧオリゴヌクレオチドのサイズ（すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに沿ったヌクレオチド残基の数）もオリゴヌクレオチドの刺激性活性に寄与し得る。細胞内への取込みを促進するために、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド残基の最小長を有することが好ましい。６ヌクレオチドを超える任意のサイズ（何ｋｂの長さでさえ）のオリゴヌクレオチドは、より大きいオリゴヌクレオチドは、細胞内部で分解されるので、十分な免疫賦活性モチーフが存在する場合、免疫応答を誘発することができる。ある特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６〜１００ヌクレオチドの長さ、優先的に８〜３０ヌクレオチドの長さである。重要な実施形態では、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドは、プラスミドでも発現ベクターでもない。

【0277】

一実施形態では、本明細書に開示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００７／０２６１９０の段落１３４〜１４７に記載されているように、塩基および／または糖などにおいて置換または修飾を含む。

【0278】

一実施形態では、本発明ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、化学修飾されている。化学修飾の例は、当業者に知られており、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．ら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ Ｊ．ら、（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：３３１〜４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を有することができ、各修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡからなる同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間ブリッジ、および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位、および／または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に配置される。

【0279】

本発明のいくつかの実施形態では、ＣｐＧ含有核酸は、当業者に知られている方法によって、免疫原性担体と単に混合することができる（例えば、ＷＯ０３／０２４４８０を参照）。

【0280】

本発明の特定の実施形態では、本明細書に開示されるワクチンのいずれも、２μｇ〜１００ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．１ｍｇ〜５０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．２ｍｇ〜１０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．３ｍｇ〜５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．３ｍｇ〜５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、０．５〜２ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、０．７５〜１．５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。好適な実施形態では、本明細書に開示されるワクチンのいずれも、約１ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。

【0281】

本発明のいくつかの実施形態では、ＣｐＧ含有核酸は、当業者に知られている方法によって、免疫原性担体と単に混合することができる（例えば、ＷＯ０３／０２４４８０を参照）。本発明の他の実施形態では、ＣｐＧ含有核酸は、ＶＬＰ内に封入することができる（例えば、ＷＯ０３／０２４４８１を参照）。

【0282】

本発明との関連で好適なアジュバントには、ミョウバン；ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、好ましくはＣｐＧ７９０９（配列番号４３３）およびＣｐＧ２４５５５（配列番号４３１）；ならびにサポニン系アジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘが含まれ、これらは単独で、または組み合わせて使用することができる。好ましくは、前記ＣｐＧ含有核酸は、１つまたは複数の修飾された連結、好ましくは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含み、さらにより好ましくは、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。

【0283】

本発明はしたがって、抗原性ＩｇＥペプチドを含み、好ましくは、配列番号１〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号１〜１５３および２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、さらにより好ましくは、配列番号２２０〜４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに少なくとも１つのアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。前記抗原性ＩｇＥペプチドは、好ましくは、本明細書に開示される免疫原性担体、好ましくは、ＶＬＰ、より好ましくは、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、またはＱｂｅｔａ ＶＬＰに連結される。一実施形態では、前記アジュバントは、サポニン系アジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘである。別の実施形態では、前記アジュバントはミョウバンである。さらに別の実施形態では、前記アジュバントはＣｐＧ含有核酸である。好ましくは、前記アジュバントはＣｐＧ７９０９である。より好ましくは、前記アジュバントはＣｐＧ２４５５５である。好ましくは、前記ＣｐＧ含有核酸は、１つまたは複数の修飾された連結、好ましくは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含み、さらにより好ましくは、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。

【0284】

さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのアジュバントは、好ましくは、ミョウバン、サポニン系アジュバント、およびＣｐＧ含有核酸からなる群から選択される２つのアジュバントを含む。好適な実施形態では、前記アジュバントは、ミョウバン、およびＣｐＧ含有核酸、好ましくはＣｐＧ７９０９またはＣｐＧ２４５５５、より好ましくはＣｐＧ２４５５５である。好ましくは、前記ＣｐＧ含有核酸は、１つまたは複数の修飾された連結、好ましくは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含み、さらにより好ましくは、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。別の好適な実施形態では、前記アジュバントは、サポニン系アジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ、およびＣｐＧ含有核酸、好ましくはＣｐＧ７９０９、より好ましくはＣｐＧ２４５５５である。好ましくは、前記ＣｐＧ含有核酸は、１つまたは複数の修飾された連結、好ましくは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含み、さらにより好ましくは、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。別の好適な実施形態では、前記アジュバントは、ミョウバン、およびサポニン系アジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘである。

【0285】

さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのアジュバントは、好ましくは、ミョウバン、サポニン系アジュバント、好ましくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ、およびＣｐＧ含有核酸、より好ましくはＣｐＧ７９０９、さらにより好ましくは、ＣｐＧ２４５５５からなる群から選択される３つのアジュバントを含む。好ましくは、前記ＣｐＧ含有核酸は、１つまたは複数の修飾された連結、好ましくは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含み、さらにより好ましくは、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。

【0286】

本発明の医薬組成物
本発明は、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤（複数可）とともに、製剤中に、１つまたは複数のアジュバント（上述したアジュバントのような）と任意選択により組み合わせて、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドまたはその免疫原性組成物を含む医薬組成物も提供する。用語「賦形剤」は、活性成分、すなわち、免疫原性担体に最終的にカップリングされ、１つまたは複数のアジュバントと任意選択により組み合わされた本発明の抗原性ＩｇＥペプチド以外の任意の成分を記述するのに本明細書で使用される。賦形剤（複数可）の選択は、要因、例えば、特定の投与モード、溶解度および安定性に対する賦形剤の効果、ならびに剤形の性質などに大体において依存することになる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる賦形剤」には、生理学的に適合性である、任意かつすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる賦形剤のいくつかの例は、水、食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せである。多くの場合では、組成中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。薬学的に許容できる物質の追加の例は、湿潤剤、あるいは軽微な量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤またはバッファーなどであり、これらは、活性成分の有効期間または有効性を増強する。

【0287】

本発明の医薬組成物およびこれらを調製するための方法は、当業者に容易に明らかとなるであろう。これらを調製するためのそのような組成物および方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）において見出すことができる。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。

【0288】

本発明の医薬組成物は、単一単位用量、または複数の単一単位用量として、バルクで調製、包装、または販売することができる。本明細書で使用する場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の別個の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投与量、または例えば、そのような投与量の２分の１もしくは３分の１などのそのような投与量の好都合な画分に等しい。

【0289】

当技術分野で認められたペプチドまたはタンパク質を投与するための任意の方法を、本発明のペプチドまたはタンパク質のために適切に使用することができる。

【0290】

本発明の医薬組成物は一般に、非経口投与に適している。本明細書で使用する場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織に物理的な裂け目を入れること、および組織中の裂け目を通じた医薬組成物の投与を特徴とする任意の投与経路を含み、したがって一般に、血流、筋肉、または内臓器官中への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与には、それだけに限らないが、組成物の注射、外科的切開を通じた組成物の適用、組織を貫通する非外科的な創傷を通じた組成物の適用による医薬組成物の投与などが含まれる。特に、非経口投与は、それだけに限らないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、クモ膜下、脳室内、尿管内、頭蓋内、滑液包内注射または注入；および腎透析注入技法を含むことが企図されている。好適な実施形態は、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内経路を含み、さらにより好適な実施形態は、筋肉内または皮下経路である。

【0291】

非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的に、一般に、薬学的に許容できる担体、例えば、滅菌した水または滅菌した等張性食塩水などと組み合わせた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続的な投与に適した形態で、調製、包装、または販売することができる。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプルまたは保存剤を含有する複数回投与容器などで、調製、包装、または販売することができる。非経口投与用製剤には、それだけに限らないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペーストなどが含まれる。そのような製剤は、それだけに限らないが、懸濁剤、安定化剤、または分散剤を含めた、１つまたは複数の追加成分をさらに含むことができる。非経口投与用製剤の一実施形態では、活性成分は、再構成された組成物を非経口投与する前に、適当なビヒクル（例えば、滅菌した発熱物質なしの水）を用いて再構成するために、乾燥（すなわち、粉末または顆粒状）形態で提供される。非経口製剤は、賦形剤、例えば、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは、３〜９のｐＨまで）などを含有することができる水溶液も含むが、いくつかの用途については、これらは、滅菌した非水性溶液として、または滅菌した発熱物質なしの水などの適当なビヒクルとともに使用される乾燥形態として、より適切に製剤化することができる。例示的な非経口投与形態には、溶液、または滅菌した水溶液中の懸濁液、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液が含まれる。そのような剤形は、必要に応じて適切に緩衝することができる。有用である他の非経口投与可能な製剤には、微結晶性形態で、またはリポソーム配合物中に活性成分を含むものが含まれる。非経口投与用製剤は、即時放出および／または調整放出であるように製剤化することができる。調整放出製剤として、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的化放出、およびプログラム放出が挙げられる。

【0292】

例えば、一態様では、滅菌した注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中で、必要とされる量で、最終的に１つまたは複数のアジュバントと組み合わせて、好ましくは免疫原性担体とカップリングした抗ＩｇＥペプチドを組み込み、その後に濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、基本の分散媒および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌した注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、調製の好適な方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは、その以前に滅菌濾過した溶液に由来する活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を生じる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散物の場合における必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。

【0293】

例示的な、限定されない本発明の医薬組成物は、約５．０〜約６．５の範囲のｐＨを有し、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの本発明のペプチド、約１ミリモル〜約１００ミリモルのヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモル〜約４００ミリモルのトレハロース、および約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルの二ナトリウムＥＤＴＡ二水和物を含む滅菌水溶液としての製剤である。

【0294】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドは、典型的には、適当な噴霧剤を用いて、もしくは用いずに、加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは、細かいミストを生成するために、電気流体力学を使用する噴霧器）、もしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、または経鼻液滴として、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独で、混合物として、または例えば、適当な薬学的に許容できる賦形剤を混合した混合成分粒子として）の形態で、鼻腔内に、または吸入によって投与することもできる。

【0295】

加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器、またはネブライザーは、一般に、例えば、活性物を分散、可溶化させ、または活性物の放出を延ばすための適当な作用剤、溶媒としての噴霧剤（複数可）を含む本発明の抗体の溶液または懸濁液を含有する。

【0296】

乾燥粉末または懸濁液製剤で使用する前に、薬剤製品は一般に、吸入によって送達するのに適したサイズに微粒子化される（典型的には、５ミクロン未満）。これは、任意の適切な粉砕方法、例えば、スパイラルジェット粉砕、流動床ジェット粉砕、ナノ粒子を形成するための超臨界流体プロセシング、高圧均質化、または噴霧乾燥などによって実現することができる。

【0297】

吸入器または注入器で使用するためのカプセル、ブリスター、およびカートリッジを製剤化することによって、本発明の化合物の粉末混合物、適当な粉末基剤、および性能調節剤を入れることができる。

【0298】

細かいミストを生成するために電気流体力学を使用する噴霧器で使用するための適当な溶液製剤は、１回の作動当たり適当な用量の本発明の抗原性ＩｇＥペプチドを含有することができ、作動量は、例えば、１μＬから１００μＬまで変化し得る。

【0299】

メントールおよびレボメントールなどの適当な香料、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味料を、吸入／鼻腔内投与のために意図された本発明の製剤に添加することができる。

【0300】

吸入／鼻腔内投与用製剤は、即時放出および／または調整放出であるように製剤化することができる。調整放出製剤として、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的化放出、およびプログラム放出が挙げられる。

【0301】

乾燥粉末吸入器およびエアロゾルの場合では、投与量単位は、計量された量を送達するバルブによって決定される。本発明による単位は、典型的には、定量または「ひと吹き」の本発明の抗体を投与するように整えられる。全１日量は、典型的には単一用量で、またはより通常には、１日を通して分割量として投与される。

【0302】

抗原性ＩｇＥペプチドを含む医薬組成物は、経口経路投与用にも製剤化することができる。経口投与は、化合物が胃腸管に入るような嚥下、および／または化合物が口から血流に直接入る、頬側投与、舌投与、もしくは舌下投与を伴うことができる。

【0303】

経口投与に適した製剤として、固体、半固体、および液体系、例えば、錠剤；多微粒子もしくはナノ微粒子、液体、または粉末を含有する軟カプセルまたは硬カプセル；ロゼンジ（液体を満たしたものを含む）；咀嚼剤；ゲル；高速分散剤形；フィルム；オビュール；スプレー；および頬側／粘膜付着性パッチが挙げられる。

【0304】

液体製剤には、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれる。そのような製剤は、軟カプセルまたは硬カプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース製）中の充填剤として使用し、典型的には、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適当な油、ならびに１つもしくは複数の乳化剤および／もしくは懸濁剤を含むことができる。液体製剤は、例えば、サッシェから固体を再構成することによって調製することもできる。

【0305】

本発明の組成物は、ＩｇＥ媒介性障害または症状のリスクがあり、またはこれらを罹患している対象におけるそのような障害または症状を、免疫療法によって前記対象における免疫応答を刺激することによって、治療、軽減、または予防するために使用することができる。免疫療法は、最初の免疫化、その後の追加の、例えば、１回、２回、３回、またはそれ以上の追加免疫を含むことができる。

【0306】

本発明の抗原性ＩｇＥペプチドまたはその組成物の「免疫学的有効量」は、単一用量で、またはシリーズの一部として哺乳動物対象に送達され、前記対象においてＩｇＥに対して免疫応答を誘発するのに有効である量である。この量は、治療される個体の健康および身体状態、治療される個体の分類群、個体の免疫系が抗体を合成する能力、ワクチンの製剤、ならびに他の関連した要因に依存して変化する。この量は、比較的広い範囲内にあり、これは、日常的な試行によって求めることができることが予期される。

【0307】

「医薬として有効な用量」または「治療有効用量」は、対象における１つまたは複数のＩｇＥ関連障害または症状を治療、または予防、または軽減するのに必要とされる用量である。医薬として有効な用量はとりわけ、投与するための特定の化合物、症状の重症度、副作用に対する対象の感受性、疾患の型、使用される組成物、投与経路、治療されている哺乳動物の種類、健康および身体状態などの、考慮下の特定の哺乳動物の身体的特性、同時の薬物療法、個体の免疫系が抗体を合成する能力、望まれる保護の程度、ならびに医学分野における当業者が認識する他の要因に依存する。予防目的に関して、各用量中のペプチドの量は、典型的なワクチン中の、著しい有害な副作用を伴うことなく免疫保護応答を誘発する量として選択される。最初のワクチン接種の後に、対象は、適切に間隔をあけられた１回または数回のブースター免疫化を受けることができる。

【0308】

任意の特定の患者についての特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別、飲食物、投与の時間、投与経路、および排泄率、薬物の組合せ、および療法を受けている特定の疾患の重症度を含めた様々な要因に依存することが理解される。

【0309】

例えば、本発明の抗原性ＩｇＥペプチドまたは医薬組成物は、約０．１μｇ〜約２００ｍｇ、例えば、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇの用量で対象に投与することができ、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、２カ月、３カ月、６カ月および／または１年後に追加免疫が任意選択で投与される。

【0310】

いくつかの実施形態では、単一用量の本発明による抗原性ＩｇＥペプチドまたは医薬組成物が投与される。他の実施形態では、複数回用量の本発明による抗原性ＩｇＥペプチドまたは医薬組成物が投与される。投与の頻度は、様々な要因、例えば、症状の重症度、望まれる免疫保護の程度、組成物が、予防的目的で使用されるのか、または治癒的目的で使用されるのかなどのいずれかに応じて変更することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明による抗原性ＩｇＥペプチドまたは医薬組成物は、１カ月に１回、１カ月に２回、１カ月に３回、１週間おき（ｑｏｗ）、１週間に１回（ｑｗ）、１週間に２回、（ｂｉｗ）、１週間に３回（ｔｉｗ）、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日おき（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与される。本発明の組成物が予防目的で使用される場合、これらは、プライミング投与およびブースティング投与の両方のために投与される。ブースティング投与は、適切に間隔をあけられ、または好ましくは毎年、もしくは循環抗体のレベルが所望のレベル未満に下がるときに投与されることが予期される。ブースティング投与は、元の免疫原性担体分子の非存在下での抗原性ＩｇＥペプチドからなることができる。そのような追加免疫コンストラクトは、代替の免疫原性担体を含んでいてもよく、いずれの担体も存在しない中にあってもよい。そのような追加免疫組成物は、アジュバントとともに、またはアジュバントなしで製剤化することができる。

【0311】

本発明による抗原性ＩｇＥペプチドの投与の継続時間、例えば、抗原性ＩｇＥペプチドが投与される時間は、様々な要因、例えば、患者の応答などに応じて変更することができる。例えば、抗原性ＩｇＥペプチドは、約１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１カ月〜約２カ月、約２カ月〜約４カ月、約４カ月〜約６カ月、約６カ月〜約８カ月、約８カ月〜約１年、約１年〜約２年、または約２年〜約４年の範囲、またはそれ以上の時間にわたって投与することができる。

【0312】

様々な治療方法も、本開示によって企図されており、これらの方法は、本発明による抗原性ＩｇＥペプチドを投与するステップを含む。対象の治療方法は、自己ＩｇＥに対する個体における免疫応答を誘発する方法、および個体におけるＩｇＥ媒介性障害または症状を予防、軽減、または治療する方法を含む。

【0313】

一態様では、本発明は、対象におけるＩｇＥ関連障害または症状を治療、予防、または軽減するための方法であって、治療有効量の本発明の抗原性ＩｇＥペプチド、またはその免疫原もしくは医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。

【0314】

別の態様では、本発明は、対象において自己ＩｇＥに対する免疫応答を誘発するための方法であって、治療的または免疫原性的に（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）有効な量の本発明の抗原性ＩｇＥペプチド、またはその免疫原もしくは医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。

【0315】

「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、生物学的な障害および／またはその付帯的な症状のうちの少なくとも１つを軽減または抑制する方法を指す。本明細書で使用する場合、疾患、障害、または状態を「軽減する」ことは、疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または発生頻度を低減することを意味する。さらに、本明細書での「治療」への言及は、治癒的、対症的、および予防的な治療への言及を含む。前記対象は、ヒトであることが好ましく、任意の年齢の男性であっても女性であってもよい。

【0316】

本発明の他の態様は、ＩｇＥ関連障害の治療、軽減、または予防において薬物として使用するための、本発明による、もしくは免疫原性組成物の抗原性ＩｇＥペプチド、またはその医薬組成物に関する。

【0317】

さらに別の態様では、本発明は、好ましくはＩｇＥ媒介性障害を治療するための薬物の製造における、本発明の抗原性ＩｇＥペプチド、またはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物の使用を提供する。

【0318】

本発明の使用または方法のいくつかの態様では、前記ＩｇＥ媒介性障害は、結膜炎、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、喘息、接触性皮膚炎、アレルギー性胃腸病、アレルギー性肺アスペルギルス症、アレルギー性紫斑、湿疹、過剰ＩｇＥ（ヨブ）症候群、アナフィラキシー性過敏症、ＩｇＥ骨髄腫、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、食物アレルギー、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、および感染性大腸炎）、じん麻疹、および乾癬からなる群、好ましくは、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、および食物アレルギーからなる群から選択される。

【0319】

喘息は、気道の慢性炎症性障害であり、感受性の個体において、喘鳴、息切れ、胸苦しさ、および／または咳嗽の再発性エピソードを引き起こす。当業者は、環境アレルゲンに対して過敏症を発症させた患者において生じると考えられているアレルギー性喘息；アスピリンまたは他のＣＯＸ阻害剤に対する感受性が典型的に引き金となる薬剤誘発性喘息；運動で誘発される喘息；ほぼ致命的で超急性の喘息；夜間性喘息；仕事場にある特定の化学物質に曝されることによって一般に引き起こされる職業性喘息を含めた、様々な型の喘息を区別する。したがって、喘息は、風媒性アレルゲン、例えば、イエダニ、花粉、動物の鱗屑、真菌胞子、羽毛など（外因性喘息）；非特異的刺激物、例えば、タバコ煙、化学物質の蒸気、汚染、二酸化硫黄など（内因性喘息）を含めた様々な刺激が引き金となり得る。

【0320】

アレルギー性鼻炎は一般に、主に鼻部、洞、および眼における炎症症状を含めた一連の症状を伴い、これは、風媒性粒子に曝された後に起こる。症状として、くしゃみ；鼻閉塞；鼻水（および時折鼻血）；咳嗽；頭痛；アレルゲンに曝された鼻部、口、眼、のど、皮膚、または他の範囲のかゆみ；嗅覚（およびしたがって香りへの感受性）の障害；鼻詰まり（鼻充血）；結膜炎；流涙；咽頭炎；および喘鳴が挙げられる。

【0321】

アレルギー性鼻炎は、通年性および／または季節性である場合がある。通年性アレルギー性鼻炎は、年中続くアレルギー性鼻炎である。典型的には、アレルゲン、例えば、動物の鱗屑、屋内のカビ胞子、またはイエダニなどに連続的に曝されることによって引き起こされる。季節性アレルギー性鼻炎は、１年のある特定の時期の間のみに起こるアレルギー性鼻炎である。これは一般に、季節的に発生する樹木、草、および雑草の花粉に対するアレルギーによって引き起こされる。

【0322】

食物アレルギーは、卵、ピーナッツ、乳、またはいくつかの他の特定の食物が引き金となった、悪化した免疫応答である。いずれの食物もアレルギー反応を引き起こす場合があるが、少数の食物が主な原因である。小児において、最も一般的な食物アレルギーは、卵、ピーナッツ、乳、ダイズ、樹木の木の実、コムギ、甲殻類（エビ、カニ、イセエビ、カタツムリ、ハマグリ）である。年長児および成人において、最も一般的な食物アレルギーは、ピーナッツ、樹木の木の実、甲殻類、魚である。症状は、主に胃および腸に限定される場合があり、食物が消化または吸収された後、体の多くの部分を巻き込む場合がある。症状として、のどのいがらっぽさ、アナフィラキシー（死亡をもたらし得る重度の全身アレルギー反応）；腹痛；下痢；吐き気；嘔吐；胃痙攣；口、のど、眼、皮膚、または任意の範囲のかゆみ；じん麻疹；血管性浮腫（特に眼瞼、顔、唇、および舌の腫張）；フラフラ感または失神；鼻充血；鼻水；息切れ；喘鳴；嚥下困難；口腔アレルギー症候群を挙げることができる。口腔アレルギー症候群は、一般に、唇、舌、およびのどのかゆみ、ならびに時折腫大した唇を含む。

【0323】

本発明の使用または方法の他の態様では、前記対象は哺乳動物、好ましくはヒト対象である。

【0324】

本発明の使用または方法のさらに他の態様では、前記対象は、前記ＩｇＥ媒介性障害を罹患している。あるいは、前記対象は、前記ＩｇＥ媒介性障害を罹患するリスクにある。

【実施例】

【0325】

以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように提示され、本発明者らが、その発明としてみなす範囲を限定するように意図されておらず、これらの実施例は、以下の実験がすべてである、または実験のみが実施されることを表すとも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力をしたが、いくらかの実験誤差および偏差も計上されるべきである。別段の指示のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は、大気またはほぼ大気のものである。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内の（筋肉内に）；ｉ．ｐ．、腹腔内の（腹腔内に）；ｓ．ｃ．、皮下の（皮下に）；などを使用する場合がある。

【0326】

（実施例１）
抗原性ＩｇＥペプチドの選択
ＩｇＥ高親和性受容体ＦｃｅＲＩ αサブユニットと相互作用するヒトＩｇＥ由来の定常ドメインＣＨ３−ＣＨ４の構造は、解明および公開されている（Ｗｕｒｚｂｕｒｇ ＢＡら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｉ３（３）、３７５〜８５；Ｇａｒｍａｎ ＳＣら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ２０、４０６（６７９３）、２５９〜６６）。この構造上の情報を、結合が起こる２つの領域を示す文献と一緒に使用することによって、主要な相互作用点として４つの可能なループを同定し、ＩｇＥ−ＦｃｅＲＩ相互作用に重要な範囲に対応する以下の４ペプチドを設計した（図１参照）。
紫：ＡＤＳＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰ（配列番号３１２）
青：ＬＶＶＤＬＡＰＳＫＧＴＶＮ（配列番号１６５）
橙：ＳＴＲＫＥＥＫＱＲＮＧＴＬＴＶＴＳＴＬＰ（配列番号１）
黄：ＱＣＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳ（配列番号２２０）。

【0327】

（実施例２）
紫−ＶＬＰコンジュゲートの調製
末端システイン残基が結合を目的として付加された紫ペプチド（配列番号３１２）（配列ＡＤＳＮＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＣ（配列番号４３４））を、ＣＬＥＡＲアミド樹脂上に標準的なＦｍｏｃプロトコールを使用して合成した。アミノ酸カップリング反応は、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）の存在下で、１当量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）を用いて活性化した、５倍過剰のＦｍｏｃ保護アミノ酸を使用して実施した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、２０％のピペリジン／ＤＭＦを用いて実現した。次いで、試薬Ｄ（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤＴ：８９／３／８）を用いて、樹脂に結合したペプチドを切断し、同時に側鎖保護基を除去した。このペプチドは、遊離Ｎ末端およびアミド化されたＣ末端を用いて作製した。粗ペプチドは、ＢＥＨ １３０ Ｃ１８カラム、および０．１％のＴＦＡの存在下での水／アセトニトリル勾配を使用して、ＨＰＬＣによって精製して均質にした。精製ペプチドを、凍結乾燥器を使用して真空乾燥させた。質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用してペプチドを分析したところ、十分なデータを得た（以下を参照）。

【0328】

【表1】

【0329】

紫＋Ｃｙｓｔ（配列番号４３４）ペプチドを、２つの別個のコンジュゲーション実験において、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ＱβおよびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）にコンジュゲートさせた。本試験で使用したＱβは、１４ｋＤのモノマータンパク質：ＭＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＡＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ（配列番号４３５）をコードするｐＥＴ２８プラスミドを組み込んでいるＢＬ２１（ＤＥ３）系統中で、細菌の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵によって生成した。発酵は、ＩＰＴＧを用いて、０．８のＯＤ６００で誘発し、カナマイシンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中で一晩進行させる。次いで、特許出願ＥＰ２００５０１０５５１３に記載された方法を、以下の差異とともに使用して、宿主細胞内で自己組織化するＶＬＰを発酵細胞ペレットから精製した：細胞を破壊した後、澄んだホモジネートを５０％飽和した硫酸アンモニウムで処理し、細胞ペレットを遠心分離によって回収した。次いで、ペレットをＨＥＰＥＳバッファー中に再溶解させ、ＨＥＰＥＳバッファーに対して透析した後、公開された方法における第１のカラム工程に進めた。イオン交換カラム工程およびヒドロキシルアパタイトカラム工程の後、さらなる陰イオン交換カラム工程を使用してこの物質を精製し、滅菌濾過することによって、最終的なＶＬＰバルク物質を作製し、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および電子顕微鏡法によってこれを分析し、許容できる結果を得た。

【0330】

本試験で使用したＨＢｓＡｇ（サブタイプａｄｗ）は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（ＮＤ、ＵＳＡ）から購入した。ＨＢｓＡｇは、直径が約２２ｎｍの球状粒子として存在し、これは、脂質二重層ベシクル中に埋め込まれた２４ｋＤのモノマータンパク質の多数のコピーからなる。この型のＨＢｓＡｇを生成するためのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）系統も、ＡＴＣＣカルチャーコレクションから入手可能である。

【0331】

ＶＬＰ（ＱβおよびＨＢｓＡｇの両方）は、Ｎ−γ−マレイミド−ブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）連結試薬を使用して活性化した。ＧＭＢＳ試薬は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させ、１０倍以上のモル過剰でＶＬＰ溶液に添加した。活性化反応を３０分以上進行させ、次いでこの溶液を、ＮＡＰ−２５脱塩カラムを使用して、５ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）中に脱塩した。必要であれば、１０ｋＤのスピンマイクロコンセントレーターを使用して、タンパク質溶液をわずかに濃縮した後、次のコンジュゲーション反応を行った。

【0332】

コンジュゲーション反応の前に、紫ペプチドを、添加剤として５ｍＭのＥＤＴＡを含む、ｐＨ７．４のＤＰＢＳのアリコート中に溶解させた。溶液中のペプチドの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。可溶化したペプチドを、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＤＰＢＳ中で洗浄されていた、ＴＣＥＰ固定化還元剤（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のアリコートに添加した。ペプチドのアリコートを、ＴＣＥＰゲルの存在下で約１時間、混合しながらインキュベートし、その時間の後、微量遠心管中でこのアリコートを遠心沈殿させ、固体ペレットを廃棄した。還元されたペプチドを含有する上清を、先に調製されていた活性化されたＶＬＰに直接付加した。

【0333】

ＶＬＰと、還元されたペプチドの間の反応は、非常に穏やかに混合しながら、少なくとも３０分間進行させた。反応時間の最後に、ＮＡＰ−１０またはＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中に各試料を脱塩した。脱塩し、コンジュゲートしたペプチドを、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）アッセイを使用して、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質含量について分析した。コンジュゲート生成物を、０．２２μｍのフィルターを使用して滅菌濾過し、使用するまで２〜８℃で貯蔵した。凍結または極端な温度への曝露を防止するために、貯蔵している間、これらの試料に細心の注意を払った。

【0334】

２つのＶＬＰ−ペプチド試料についてのコンジュゲーションの程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して測定し、分子量の増加が両試料について観察された。これは、ＶＬＰタンパク質モノマーへのペプチドの付加と一致する。さらに、Ｑβ−ペプチド試料は、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーアッセイ（Ｔｏｓｏｈ ＰＷＸＬ５０００ ＨＰＬＣカラムを使用して）において試験したところ、ＶＬＰのコンジュゲートされていない試料と比較した場合、組織化されたＶＬＰを含有することが見出された。さらに、このＱβ−ペプチド試料は、８０ｋＶのビームを用いてＪＥＯＬ １２３０ＴＥＭを使用する電子顕微鏡法を使用して観察したところ、組織化された均一な粒子を含有することが見出された。ＨＢｓＡｇ−ペプチドコンジュゲート粒子の完全性を、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して試験したところ、タンパク質はゲルに入らなかったので、この試料は、高分子質量種を含有し、インビボでの使用に適しているとみなした。

【0335】

（実施例３）
橙、紫、黄、および青−ＶＬＰコンジュゲート、ならびに紫−束縛された、および青−改善された−ＶＬＰコンジュゲートの調製
アミノ酸配列が表２に示されている、黄、青＋Ｃｙｓｔ、紫＋Ｃｙｓｔ、および橙＋Ｃｙｓｔペプチドは、以下のように、当技術分野で知られている方法に従って、かつ主に実施例２におけるプロトコールに従って合成した。ペプチドは、ペプチド黄を除いて、ＣＬＥＡＲアミド樹脂上で、標準的なＦｍｏｃプロトコールを用いて、Ｓｙｍｐｈｏｎｙペプチドシンセサイザーで合成し、ペプチド黄は、プレロードされたＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢＵ）−Ｗａｎｇ樹脂上で作製した。カップリング反応および脱保護についての詳細については実施例２を参照。すべてのペプチドは、ペプチド黄を除いて、遊離Ｎ末端およびアミド化されたＣ末端とともに作製し、ペプチド黄は、アセチル化されたＮ末端およびカルボキシル化されたＣ末端とともに作製した。粗ペプチドは、実施例２と同様に、ＢＥＨ １３０ Ｃ１８カラムを有するＨＰＬＣシステムで精製した。精製ペプチドは、凍結乾燥器を使用して真空乾燥させた。最後に、ＬＣ−ＭＳを用いてペプチドを分析したところ、すべてのペプチドは、十分なデータを得た（以下の表３を参照）。

【0336】

青−改善されたペプチドおよび紫−束縛されたペプチドは、ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、ＮＣ、ＵＳＡ）によって製造された。これらのペプチドは、標準的なペプチド化学反応技法を使用して製造され、クロマトグラフィーを使用して精製された。精製ペプチドは、ＬＣ−ＭＳを使用して分析したところ、高純度（＞９５％）であることが見出された（以下の表３を参照）。

【0337】

【表2】

【0338】

【表3】

【0339】

各ペプチドは、別個のバッチでウイルス様粒子（ＶＬＰ）Ｑβにコンジュゲートさせた。本試験において使用したＱβは、実施例２と同様に、細菌の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵および広範な精製によって生成した。

【0340】

ＶＬＰ（ブラッドフォードアッセイよって１ｍｇ／ｍｌ超のタンパク質濃度）は、上記の実施例２に記載したように、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌからの Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）連結試薬を使用して活性化した。

【0341】

コンジュゲーション反応の前に、添加剤として５ｍＭのＥＤＴＡを含む、ｐＨ７．４のダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）のアリコート中に各ペプチドを溶解させた。溶液中の各ペプチドの濃度は、８〜１２ｍｇ／ｍｌの範囲であった。正確なデータについては、以下の表４を参照。可溶化したペプチドを、上記の実施例２に記載したように、ＴＣＥＰ固定化還元剤のアリコートに添加した。還元されたペプチドを含有する上清を、先に調製されていた活性化されたＶＬＰに直接添加した。

【0342】

ＶＬＰと、還元されたペプチドの間の反応は、非常に穏やかに混合しながら、少なくとも３０分間進行させた。反応時間の最後に、ＮＡＰ−１０またはＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中に各試料を脱塩した。次いで、脱塩し、コンジュゲートしたペプチドを、１０ｋＤのＭＷＣＯスピンコンセントレーターを使用して濃縮し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）アッセイを使用して、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質含量について分析した。さらなる詳細については以下を参照。コンジュゲート生成物を、０．２２μｍのフィルターを使用して滅菌濾過し、使用するまで２〜８℃で貯蔵した。凍結または極端な温度への曝露を防止するために、貯蔵している間、これらの試料に細心の注意を払った。ＶＬＰ−ペプチドコンジュゲートは、実施例２に上述したように、コンジュゲーションおよび粒子アセンブリの程度について分析した（濃度測定を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ、電子顕微鏡法、およびサイズ排除ＨＰＬＣ）。

【0343】

【表4】

【0344】

（実施例４）
橙、紫、黄、および青−ＫＬＨコンジュゲート、ならびに紫−束縛された、および青−改善された−ＫＬＨコンジュゲートの調製
表２のペプチドを、以下のように、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）から購入したＫＬＨにコンジュゲートさせ、精製した。ペプチドは、上記の実施例２および３に詳述したように作製した。使用したＫＬＨは、凍結乾燥した固体としてＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌによって供給されたＩｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｍｉｄｅ−活性化ＫＬＨであった。このＫＬＨのバイアルを、組織培養グレード水で再構成した後、ペプチドに添加した。実施例２および３に上述したようにペプチドをＴＣＥＰゲルで処理し、還元されたペプチドを含有する上清を、活性化されたＫＬＨ溶液のアリコートに直接添加し、穏やかに混合しながらインキュベートした。カップリング反応を２時間進行させ、この時間で、溶液を遠心分離することによって固体を除去し、以前のように重力滴下脱塩カラムを使用して脱塩した。脱塩したコンジュゲートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ブラッドフォードタンパク質アッセイ、およびトリプシン消化した後のＭＳ−ＭＡＬＤＩ分析によって分析した。コンジュゲートを、０．２２μｍのフィルターを使用して滅菌濾過し、ＫＬＨ溶液を凍結させることは推奨されないので、試用するまで２〜８℃で保持した。

【0345】

（実施例５）
ＩｇＥペプチドの同定
本試験は、Ｑｂｅｔａ ＶＬＰにコンジュゲートしたペプチド（上記の実施例２および３に詳述したような）が、ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答の誘発においてどの程度効果的であるかを評価することを目的とした。０、１９、および３４日目に、メスのＢａｌｂ／ｃ（６〜８週）に、筋肉内経路によって注射した（５０マイクロリットルの量を各前脛骨筋中に注射した）。剖検を４６日目に行った。剖検において、心穿刺によって、安楽死させたマウスから４００〜６００マイクロリットルの血液を試料採取した。血液を一晩放置することによって凝血させ、次の日に血清を収集した。

【0346】

免疫動物からの抗体応答を、以下のアッセイのいくつか、またはすべてについて調査した：ａ）ＩｇＧ力価決定、ｂ）無血清ＩｇＥへの結合、ｃ）ＦｃｅＲＩに結合したＩｇＥへの結合、ｄ）脱顆粒アッセイ、およびｅ）ＩｇＥ定量化アッセイ。

【0347】

ａ）全ＩｇＧ力価決定
概要：ワクチンに特異的である全ＩｇＧ分子のレベルを表すための、逆数力価（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｔｉｔｅｒ）（ＲＴ）を生じる比色分析ＥＬＩＳＡ。連続希釈液を血清試料から調製し、アッセイにおいて試験した。プールしたＣｅ３ワクチン接種マウス血清試料から調製した血清試料を陽性対照として使用した。Ｈａｒｌａｎ ＬａｂｓからのＢａｌｂ／ｃ陰性血清を陰性対照として使用した（４００匹の動物 Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ コード番号Ｒ−０１３１Ｄからプールした）。アッセイプレートのコーティング：３８４ウェル高結合アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ カタログ番号３７００）に、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した２５μＬ／ウェルのヒトＣｅ３Ｃｅ４タンパク質ストックでコーティングし、振盪機上で、室温で３時間インキュベートした。ｐＨ７．４のＰＢＳで２回洗浄した後、８０μＬ／ウェルの０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡを使用してプレートをブロックし、室温で１時間インキュベートした後、最後にｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。試料調製およびアッセイ：翌日、１：１００希釈（ＰＢＳ／１％のＢＳＡ希釈剤）から開始して、各試料の８点１／２対数連続希釈液を調製し、２５μＬ／ウェルの連続希釈液を、ヒトＣｅ３Ｃｅ４をコーティングしたプレート中に２つ組で移し、次いで振盪しながら室温で１．５時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：６０００の２５μＬ／ウェルの全ＩｇＧ検出抗体（ウサギ抗−ｍｕ ＩｇＧ−Ｆｃ、カタログ番号Ａ９０−１３０Ａ Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、次いで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／ｐＨ７．４の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で１：３０００の、２５μＬ／ウェルのＢｉｏ−Ｒａｄキットヤギ抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ カタログ番号１７２−１０１９）を添加し、次いで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、次いでｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳのみで１回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのマウスＴｙｐｅｒ ＨＲＰ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ カタログ番号１７２−１０６４）を添加し、次いで室温で３０分間インキュベートした。２５μＬ／ウェルの２％のシュウ酸を添加し、４０５ｎｍの吸光度を読み取った。データ分析：カットオフ値（４０５ｎｍの吸光度）は、最低濃度の適切な試験陰性対照群によって生じた２つ組の読みの平均を取り、この値に２．５を乗じることによって計算した。滴定曲線を各試験試料についてプロットし（試料力価対４０５ｎｍの吸光度）、試料力価（引き続いて逆数力価に変換した）を、計算したカットオフ値から予測した。

【0348】

ｂ）遊離ＩｇＥの結合力価
概要：高濃度のヒトＩｇＥとともに、試験血清の連続希釈液を一晩インキュベートした後に形成されるマウスＩｇＧ：ヒトＩｇＥ複合体のレベルを表すための、逆数力価（ＲＴ）および最大値を生じる電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイ。プールしたＣｅ３ワクチン接種マウス血清試料から調製した血清試料は、Ｈａｒｌａｎ ＬａｂｓからのＢａｌｂ／ｃ陰性血清（４００匹の動物 Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ コード番号Ｒ−０１３１Ｄからプールした）中に５０μｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬで添加したヒトＩｇＥ Ｃｅ３ドメインの一領域に対するマウス抗体（ＡｂＤｓｅｒｏｔｅｃ ０１００−０４１３（Ｅ４１１（５Ｈ２））とともに、陽性対照として使用し、Ｂａｌｂ／ｃ陰性血清はまた、陰性対照として単独で使用した。ヒトＩｇＥを用いた試料のインキュベーション：対照を含む、各試料の８点１／２対数連続希釈液を、１：３希釈（ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡ希釈剤）から開始して調製した。各試料濃度の１０μＬの量を、１００μｇ／ｍＬのヒトＩｇＥ １０μＬ（ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡを使用してストックから希釈した）と混合し、次いでプレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。アッセイプレートのコーティング：翌日、３８４ウェルアッセイプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）標準的な結合 カタログ番号Ｌ１１ＸＡ−１、０３７０ＰＡ）に、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した、１２μＬ／ウェルのヒトＩｇＥに対するヒツジｐＡｂ（Ｇｅｎｔａｕｒ、ＩＣＬ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂ）カタログ番号ＳＥ−８０Ａ）でコーティングし、次いで振盪機上で、室温で２時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのＰｉｅｒｃｅスターティングブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．カタログ番号３７５３８）を使用してプレートをブロックし、振盪機上で、室温で４０分間インキュベートした後、最後にｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した。試料調製およびアッセイ：２０μＬの量のヒトＩｇＥとの血清の一晩インキュベートした混合物を、８０μＬ／ウェルの、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：５に希釈し、次いで１２μＬ／ウェルを、コーティングしたＭＳＤアッセイプレート中に２つ組で移した。振盪機上で、室温で２時間インキュベートした後、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０でプレートを３回洗浄した。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：５０００の１２μＬ／ウェル検出抗体（マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌに対するロバｐＡｂ Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ６７０７、ＭＳＤカタログ番号Ｒ９１ＡＮ−１を使用した、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯタグ付き）を添加し、次いで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＭＱ水で１：２の、界面活性剤を含む５０μＬ／ウェルのＭＳＤ ＲｅａｄバッファーＴ（４×）（ＭＳＤ カタログ番号Ｒ９２ＴＣ）を添加した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を使用してプレートを読み取った。

【0349】

データ分析：カットオフ値（ピクセル）は、最低濃度の適切な試験陰性対照群によって生じた２つ組の読みの平均を取り、この値に５を乗じることによって計算した。滴定曲線を各試験試料についてプロットし（試料力価対ピクセル）、試料力価（引き続いて逆数力価に変換した）を、計算したカットオフ値から予測した。滴定曲線の最大ピーク値も記録した。

【0350】

ｃ）受容体に結合したＩｇＥへの結合
このアッセイは、ワクチン接種されたマウス由来の血清中の抗体が、ＲＢＬ−ＴＨＥ細胞の表面上でＦｃｅＲＩ受容体に結合したいくつかのヒトＩｇＥに結合することができるかどうかを測定し、次いでこうした抗体を、フィコエリトリンにコンジュゲートした抗マウスＦｃ特異抗体によって検出し、蛍光をフローサイトメトリーによって測定する。ワクチン接種されていないＢＡＬＢｃ血清中で希釈されたＢｉｏｄｅｓｉｇｎからの抗ヒトＩｇＥ抗体を、陽性対照として使用した。アッセイ：凍結したＲＢＬ−ＴＨＥ細胞（ｐ１２ １０×１０^６細胞／ｍｌ）を解凍し、アッセイバッファー（ＰＢＳ−５％のヤギ血清）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ−５％のヤギ血清−０．１ｍｇ／ｍｌのマウスＦａｂ（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅマウスＩｇＧ、Ｆａｂ断片−Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））中の２×１０^５細胞／ウェルを、９６ウェルプレート中に播種し、４℃の振盪機上で１時間３０分間インキュベートした。１ウェル当たり４μｇ／ｍｌのヒトＩｇＥ ５０μｌを添加し（アッセイバッファー中で希釈した）（対照ウェルを除く Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ＩｇＥなし、細胞のみ、およびａＭｏ−ＰＥ）、プレートを４℃の振盪機上で１時間インキュベートした。細胞をアッセイバッファーで１回洗浄し、５％のＢＡＬＢｃ血清中で希釈し、またはアッセイバッファー中で１：２０、１：４０、および１：８０に希釈した、ワクチンを接種したマウス由来の血清試料を用いて希釈した、抗ヒトＩｇＥ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ １０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ−陽性対照）３０μｌ中で再懸濁した。血清試料を３つ組で蒔き、対照を２つ組で蒔いた。プレートを、４℃の振盪機上で１時間３０分間インキュベートし、次いでアッセイバッファーで洗浄し、ヤギ抗マウスＦｃ特異的−ＰＥ抗体（アッセイバッファー中で１：２００、Ｇｏａｔ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μｌ中で再懸濁し、４℃の振盪機上で４５分間インキュベートした。細胞を、アッセイバッファーで３回洗浄し、ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒド８０μｌ中で再懸濁し、４℃で一晩インキュベートした。蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。データ分析：各試料の平均蛍光強度を分析に使用した。陰性対照（ａＭｏ−ＰＥ単独）を平均し、その値を各ウェルから減じた。陽性対照を平均し、各試料を、そのそれぞれの血清希釈での陽性対照（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）の百分率として表した。次いで、１：４０の血清希釈液を抽出し、ＡＮＯＶＡを実施した。

【0351】

ｄ）脱顆粒アッセイ
このアッセイにより、培地中でＲＢＬ−ＴＨＥ細胞によって放出されるｂ−ヘキソサミニダーゼ酵素の活性を測定することによって、ワクチン接種されたマウスに由来する血清が、ＲＢＬ−ＴＨＥ細胞の脱顆粒を誘発するかどうかを測定する。ワクチン接種されていないＢＡＬＢｃ血清中で希釈したＥ２５（Ｘｏｌａｉｒ）を陰性対照（４０μｇ／ｍｌ）として使用し、ワクチン接種されていないＢＡＬＢｃ血清中で希釈した、Ｓｉｇｍａからのヤギポリクローナル抗体を陽性対照として使用した。細胞播種：凍結したＲＢＬ−ＴＨＥ ｐ１２（１０×１０^６細胞／バイアル；ヒトＦｃｅＲＩで安定にトランスフェクトしたラット好塩基球性白血病細胞）を解凍し、ＲＢＬ−Ｐ培地（１５％のＦＣＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＭＥＭ−Ｅａｒｌｅｓサプリメント）中で洗浄し、８×１０^５細胞／ｍｌのＲＢＬ−Ｐ培地中で、０．２５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＥとともに再懸濁した。８×１０^４細胞／ウェルを、平底９６ウェルプレート中に播種し、３７℃／５％のＣＯ２で４８時間インキュベートした。試料およびバッファーの調製：３日目に、タイロードバッファー１×（ＮａＣｌ １３５ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、グルコース ５．６ｍＭ、ＢＳＡ １ｍｇ／ｍｌ、Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４）を調製した。タイロードバッファー−５％のＢＡＬＢｃ血清、タイロードバッファー−２．５％のＢＡＬＢｃ血清、およびタイロード中Ｔｒｉｔｏｎ １％−５％のＢＡＬＢｃ血清も調製した。陽性対照（ヤギポリクローナル抗ＩｇＥ抗体（ＰＢＳ中８２ｍｇ／ｍｌ）−Ｓｉｇｍａ、Ｉ０６３２）を、タイロードバッファー−５％のＢＡＬＢｃ血清中（第１のウェルは、タイロードバッファー−５％のＢＡＬＢｃ血清中、次いでタイロードバッファー中）で、１０μｇ／ｍｌから２．５μｇ／ｍｌに連続的に希釈した。陰性対照（Ｅ２５）は、希釈したＢａｌｂｃ血清（１：２０、１：４０、および１：８０の血清希釈液）中で、４０μｇ／ｍｌで一定に保持した。ワクチン接種されたマウスに由来する試験血清試料は、１：２０、１：４０、および１：８０の血清希釈液で試験した。対照および試験血清試料のすべては、各プレート上で３つ組で試験した。アゴニストアッセイ：３日目に、細胞プレートをインキュベーターから取り出した。培地９５μｌをウェルから取り出し、細胞をタイロードバッファー１×２００μｌで洗浄し、洗浄バッファーを除去し、希釈した抗体（陽性対照、陰性対照、または試験血清試料）７０μｌを添加した。細胞を３７℃／５％のＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、プレートをインキュベーターから取り出し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、剥離したいずれの細胞も沈降させた。上清６５μｌを取り出し、滅菌した９６ウェルプレート中に入れた。上清２５ｕｌをβ−ヘキソサミニダーゼ活性について試験した。β−ヘキソサミニダーゼ活性：上清２５μｌを９６ウェルプレートに添加した。クエン酸バッファー中４ｍＭのＮＡＧＡ（ｐＨ４．５の５０ｍＭのクエン酸バッファー中４ｍＭのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ＮＡＧＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｎ９３７６））２５μｌを、すべてのウェルに添加し（新たに調製した）、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ｐＨ１０．７の０．２Ｍのグリシン１５０μｌを添加することによって反応を停止した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎを用いて４０５ｎｍでプレートを読み取った。データ分析：脱顆粒は、全ウェルについての値からの全β−ヘキソサミニダーゼ活性の百分率として表した（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した）。次いで、希釈１：４０での脱顆粒の％を分析のために抽出し、血清試料に対してＡＮＯＶＡを実施した。

【0352】

ｅ）遊離ヒトＩｇＥアッセイの還元
概要：ヒトＩｇＥの連続希釈液とともに、試験血清のアリコートを一晩インキュベートし、その時間の間にマウスＩｇＧ：ヒトＩｇＥ複合体が形成した後に残っている遊離ヒトＩｇＥのレベルを定量化する電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイ。ヒトＩｇＥ定量化アッセイの精度を保証するために、プロテインＧをコーティングした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄを使用していずれのマウスＩｇＧ：ヒトＩｇＥ複合体も最初に除去することが必須であり、この磁気Ｄｙｎａｂｅａｄは、マウスＩｇＧ Ｆｃ領域を介して存在する複合体を結合して除外する。ヒトＩｇＥレベルの、適切な陰性対照群のレベルからの減少率についての値は、各試料について計算することができる。陽性対照として、Ｈａｒｌａｎ ＬａｂｓからのＢａｌｂ／ｃ陰性血清（４００匹の動物 Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ コード番号Ｒ−０１３１Ｄからプールした）中に４０μｇ／ｍＬ（標準的な療法の用量）でＸｏｌａｉｒ／Ｅ２５を添加し、Ｂａｌｂ／ｃ陰性血清も、陰性対照として単独で使用した。ヒトＩｇＥを用いた試料のインキュベーション：ヒトＩｇＥの８点１／２対数連続希釈液（ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡ希釈剤）の各濃度の２μＬの量を、陽性対照Ｘｏｌａｉｒ／Ｅ２５（４０μｇ／ｍＬ）、３０μｇ／ｍＬの最終濃度から開始するＩｇＥを含めて、８×１０μＬの量の試験血清試料のそれぞれに添加した。プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。アッセイプレートのコーティング：翌日、３８４ウェルアッセイプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）標準的な結合 カタログ番号Ｌ１１ＸＡ−１、０３７０ＰＡ）に、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した、１２μＬ／ウェルのヒトＩｇＥに対するヒツジｐＡｂ（Ｇｅｎｔａｕｒ、ＩＣＬ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂ）カタログ番号ＳＥ−８０Ａ）でコーティングし、次いで振盪機上で、室温で２時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのＰｉｅｒｃｅスターティングブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．カタログ番号３７５３８）を使用してプレートをブロックし、振盪機上で、室温で４０分間インキュベートした後、最後にｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した。試料およびＤｙｎａｂｅａｄの調製：５μＬの量のヒトＩｇＥとの血清の一晩インキュベートした混合物を、９５μＬ／ウェルの、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：２０に希釈した。［注：１：２０の希釈液の１０μＬはまた、ｐＨ７．４の０．０１のＰＢＳ／１％のＢＳＡでさらに１：２に希釈することによって、遊離ＩｇＥ結合アッセイにおいて試験してｍｕ ＩｇＧ：ｈｕ ＩｇＥ複合体の測定値を得た後、プロテインＧビーズのインキュベーションを行った］。必要とされる量の１倍濃度のプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号１０００４Ｄ）を、パックインサート（ｐａｃｋ ｉｎｓｅｒｔ）と同様に洗浄し、調製し、次いで、最初のビーズ量の０．２５倍で再懸濁することによって４倍に濃縮した。Ｄｙｎａｂｅａｄを用いた試料のインキュベーション：各１：２０の試料３０μＬを１５μＬ／ウェルの４×ビーズと混合し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。Ｄｙｎａｌ磁気棒プレート（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂａｒ ｐｌａｔｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号１２０２７）を使用して試料からビーズを除去し、残っている試料４０μＬを新鮮な４×ビーズ混合物２０μＬと混合し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。４５μＬ／ウェルの残っている試料を新鮮なウェル中に移し、１０００ｒｐｍで１分遠心分離し、磁気棒プレート上にプレートを戻し、４０μＬ／ウェルを新鮮なウェル中に移した。［注：すべての複合体が除去されたことを保証するために、プロテインＧビーズをインキュベートした後に、残っている試料３０μＬを使用することによって、遊離ＩｇＥ結合アッセイにおいて試験してｍｕ ＩｇＧ：ｈｕ ＩｇＥ複合体の測定値を得た］。定量化アッセイ：５μｇ／ｍＬの濃度から開始して、８０％のＭＳＤマウス血清アッセイ希釈剤／２０％の、ｐＨ７．４、０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡ中でヒトＩｇＥの１２点１／２対数連続希釈検量線を準備した。ＭＳＤマウス血清アッセイ希釈剤（ＭＳＤ カタログ番号Ｒ５２ＢＢ−２）を使用して、ビーズインキュベーションからの残っている試料を１：５に希釈した。１２μＬ／ウェルで、３つ組で、検量線および試料の連続希釈液を、コーティングしたＭＳＤウェル中に移し、振盪しながら室温で２時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０でプレートを３回洗浄した後、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：３００の１２μＬ／ウェルの検出抗体（ウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体ε鎖特異的Ｂｅｔｈｙｌ カタログ番号Ａ８０−１０９Ａ、ＭＳＤカタログ番号Ｒ９１ＡＮ−１を使用した、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯタグ付き）を添加し、次いで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＭＱ水で１：２の、界面活性剤を含む５０μＬ／ウェルのＭＳＤ ＲｅａｄバッファーＴ（４×）（ＭＳＤ カタログ番号Ｒ９２ＴＣ）を添加した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を使用してプレートを読み取った。［注：ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：２０００のロバ検出抗体を使用し、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：４０００の、Ｅ２５／Ｘｏｌａｉｒ陽性対照のみについての抗ヒト検出抗体（ＳＵＬＦＯタグ付き ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＭＳＤ カタログ番号Ｒ３２ＡＪ−５）を使用することを除いて、以前に述べたのと同じプロトコールを使用して、ビーズインキュベーションの前から、およびビーズインキュベーションの後に試料を試験するために、この定量化アッセイと並行して遊離ＩｇＥ結合アッセイを行った］。データ分析：未処理データ（ピクセル）の対数をとり、検量線をプロットし（Ｌｏｇ ｕｍａｎ ＩｇＥ濃度ｎｇ／ｍＬ対Ｌｏｇピクセル）、非対称５−パラメータ曲線フィッティングを適用した。試験試料のＬｏｇ ＩｇＥ濃度を検量線から予測し、引き続いて逆対数をとり、２００を乗じることによって、実際の残っている遊離ＩｇＥ濃度をｎｇ／ｍＬで導出した。各試料および対照について、適切な対照群と比較した、ヒトＩｇＥレベルの減少率を計算し、血清試料に最初に添加したヒトＩｇＥ（ｎｇ／ｍＬ）に対して、両軸を対数尺度でプロットすることによって、滴定曲線を作成した。

【0353】

結果
結果を以下の表５に要約する。より具体的には、また意外にも、この試験は、２５マイクログラムのコンジュゲートの全用量（すなわち、１２．５マイクログラムの個々のコンジュゲート）で筋肉内経路を介して投与される場合、黄および紫Ｑｂｅｔａコンジュゲーションの組合せが最も有効であり、２倍の用量で単一の抗原としてペプチドコンジュゲートを使用するより有効であったことを示した。本発明者らは本試験において、この組合せは、遊離ＩｇＥに結合する高い能力を伴って抗体応答を誘発すること、ならびにこれらの抗体は、ＩｇＥチャレンジの用量に応じて最大８０％までＩｇＥのレベルを低減することができることを示した。これらの抗体応答は、ＩｇＥに噛み合った受容体に結合することができず、受容体を発現する標的細胞の脱顆粒を引き起こさなかった。ＱｂｅｔａをアジュバントのミョウバンおよびＣＰＧ２４５５５と組み合わせること（ここで、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である）は、これらの抗体応答を誘発することにおいて非常に効率的である。総合すると、遊離ヒトＩｇＥに結合する強い能力を有するマウスＩｇＧ抗体を誘発する観点から、黄ペプチドは、個々に、あるいは高い用量および体積でワクチン接種された、紫もしくは橙ペプチドコンジュゲート、または紫および橙ペプチドコンジュゲートの両方と組み合わせて投与される場合、最も有望なペプチドであると結論づけることができる。

【0354】

【表5】

【0355】

（実施例６）
過免疫試験
本試験は、ＩｇＥに対する高親和性抗体の誘発についての急速な免疫化スケジュールの効果を評価することを目的とした。０、３、８、および１１日目に、８匹のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（生後６〜８週間）の群に、ペプチドＫＬＨ−コンジュゲート（上記の実施例４に詳述したような）を腹腔内および皮下に注射した。ＣＰＧ７９０９とＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（２０％ ｖ／ｖでのミョウバン１．３％）の組合せ、および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を、本試験におけるアジュバントとして使用した。すべてのペプチドをＫＬＨにコンジュゲートさせた。実施例５と同様に、２２日目に剖検を実施し、血液を収集した。

【0356】

以下のアッセイのうちのすべてまたはいくつかを使用して、免疫動物からの抗体応答を調査した：ａ）ＩｇＧ力価決定、ｂ）無血清ＩｇＥへの結合、ｃ）ＦｃｅＲＩに結合したＩｇＥへの結合、ｄ）脱顆粒アッセイ、およびｅ）ＩｇＥ定量化アッセイ。すべてのアッセイは、実施例５の下に詳細に記載されている。

【0357】

結果
表６は、実施例６からのデータを要約する。本試験における全力価は、ＶＲＳ−ＩｇＥ−００８−００３の約１０分の１であった。本試験からのデータは、紫、束縛された紫、黄、および橙ペプチドは、免疫原であることを示す。意外にも、青ペプチドは非常に弱い抗原であり、ペプチドを収斂させ、溶解度を増大させることにより、免疫原性の増大が示され、このペプチドは、許容できる免疫原性を示すために束縛される必要がある場合があることを示した。

【0358】

【表6】

【0359】

（実施例７）
ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答の誘発におけるＫＬＨ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａにコンジュゲートしたペプチドの効力
本試験は、ＫＬＨ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａにコンジュゲートしたペプチド（上記の実施例２、３および４に詳述したような）が、ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答の誘発においてどの程度効果的であったかを評価することを目的とした。０、１９、および３４日に、メスのＢａｌｂ／ｃ（６〜８週）に筋肉内経路によって注射した（５０マイクロリットルの量を各前脛骨筋中に注射した）。剖検を４６日目に行った。剖検において、心穿刺によって、安楽死させたマウスから４００〜６００マイクロリットルの血液を試料採取した。血液を一晩放置することによって凝血させ、次の日に血清を収集した。

【0360】

免疫動物からの抗体応答を、以下のアッセイのすべて、またはいくつかを使用して調査した：ａ）ＩｇＧ力価決定、ｂ）無血清ＩｇＥへの結合、ｃ）ＦｃｅＲＩに結合したＩｇＥへの結合、ｄ）脱顆粒アッセイ、およびｅ）ＩｇＥ定量化アッセイ。すべてのアッセイは、実施例５の下に詳細に記載されている。

【0361】

結果
本試験は、紫および黄ペプチドは、高度に免疫原性であることを示した。ＫＬＨ、Ｑｂｅｔａ、およびＨＢｓＡｇに紫ペプチドをコンジュゲートさせることにより、非常に高い程度に遊離ＩｇＥに結合することができる高い抗体応答を誘発することが可能になった。これらの抗体応答は、ＩｇＥに噛み合った受容体に結合することができず、受容体を発現する標的細胞の脱顆粒を引き起こさなかった。両アジュバント（ＡｂｉＳＣＯおよびＣＰＧ７９０９およびミョウバン組合せ）は、高レベルの抗体応答を誘発することに有効であった。

【0362】

【表7】

【0363】

（実施例８）
ＫＬＨ上のペプチド免疫原の組合せ
本試験は、ＫＬＨにコンジュゲートしたペプチドの組合せ（上記実施例４に詳述したような）が、ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答の誘発においてどの程度効果的であったかを評価することを目的とした。０、１９、および３４日目に、メスのＢａｌｂ／ｃ（６〜８週）に、筋肉内経路によって注射した（５０マイクロリットルの量を各前脛骨筋中に注射した）。剖検を４６日目に行った。剖検において、心穿刺によって、安楽死させたマウスから４００〜６００マイクロリットルの血液を試料採取した。血液を一晩放置することによって凝血させ、次の日に血清を収集した。

【0364】

免疫動物からの抗体応答を、以下のアッセイのすべて、またはいくつかを使用して調査した：ａ）ＩｇＧ力価決定、ｂ）無血清ＩｇＥへの結合、ｃ）ＦｃｅＲＩに結合したＩｇＥへの結合、ｄ）脱顆粒アッセイ、およびｅ）ＩｇＥ定量化アッセイ。すべてのアッセイは、実施例５の下に詳細に記載されている。

【0365】

結果
本試験は、黄と橙、青と紫、黄と紫の組合せは、利用可能なペプチドの量が制限されているために、本試験において使用した用量が少ないにも関わらず、高度に免疫原性であり、遊離ＩｇＥに効率的に結合することができる抗体応答を誘発することを示した。これらの抗体応答は、ＩｇＥに噛み合った受容体に結合することができず、受容体を発現する標的細胞の脱顆粒を引き起こさなかった。

【0366】

【表8】

【0367】

（実施例９）
インビボ（動物モデル）で寛容を破壊するための共役ワクチンの効力
ＩｇＥペプチドワクチンがインビボでＩｇＥレベルを低減する能力を、上昇したレベルのＩｇＥを天然に発現する（例えば、アレルギーによって）種を使用して、または動物を免疫化するためのモデルもしくは実際のアレルゲンを使用して実験的にＩｇＥレベルの上昇を誘発して、動物モデルにおいて評価する。例えば、オボアルブミン（ＯＶＡ）に対するＩｇＥ応答を誘発するためにミョウバンを用いて製剤化されたモデル抗原として、エンドトキシンを含まないＯＶＡでマウスを免疫化する（参考文献例 Ｌｌｏｙｄ Ｃら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１、１６６、ｐ２０３３〜２０４０）。ＩｇＥ応答を誘発した後、担体にカップリングされ、アジュバントとともに製剤化された抗原ペプチドをマウスにワクチン接種する。（マウスにおいて）マウスＩｇＥの相同領域、それぞれの動物種において他の種の相同領域由来のペプチド、ならびに非ヒト霊長類についてヒトＩｇＥペプチドを使用することができる。次いで、ＩｇＥレベルを低下させることにおけるワクチン接種の効力は、ワクチン接種前後で血清中のＩｇＥレベルを測定することによってモニターすることができる。さらに、ペプチドがアレルギー性炎症反応を減少させる能力は、鼻腔内のまたは気管内のＯＶＡをマウスにチャレンジし（例えば、２〜５連続日にわたって）、肺洗浄試料中の白血球サブセットの浸潤をカウントすることにより肺内のアレルギー性炎症反応を評価することによって、かつ肺柔組織内への好酸球動員、ならびに杯細胞異形成および粘液生成を組織評価することによってモニターすることができる（例えば、Ｃｏｙｌｅ Ａ．ら、１９９６ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３、１３０３〜１３１０．）。

【0368】

（実施例１０）
ヒトＩｇＥに結合することができる抗体の誘発における、ＱｂｅｔａまたはＨＢｓＡｇにコンジュゲートした鎖状ペプチドおよび化学的に束縛されたペプチドの効力および適性
抗ＩｇＥ応答を誘発するために、免疫原として短い鎖状ペプチドを使用することの課題の１つは、ＩｇＥの二次構造を正確に表現し、こうして、ワクチン接種によって生成した抗体が、遊離循環ＩｇＥを効率的に認識するのを保証することである。鎖状親アミノ酸配列中に適当な二次構造を導入するための化学的束縛により、ＩｇＥに対する抗体応答を誘発するための代替の免疫原を提供することができる。

【0369】

ＰＤＢ １Ｆ６Ａ中に存在するＩｇＥのＣε３Ｃε４の三次元構造の分析（Ｇａｒｍａｎら、２０００ Ｎａｔｕｒｅ ４０６：ｐ２５９〜２６６）により、Ｃε３Ｃε４とＦＣεＲＩ受容体の界面の標的配列のいくつかは、表９中に詳述した鎖状配列によって十分に表現することができない非鎖状配置をとることが明らかになった。したがって、束縛されたペプチドが、遊離ＩｇＥ結合アッセイにおいて検出可能な抗ＩｇＥ抗体を誘発する（インビボ投与後に）能力を評価する試みにおける化学的束縛の候補である配列を同定した。

【0370】

黄（配列番号２２０）配列および橙＋Ｃｙｓｔ（配列番号４３６）配列の両方の変異体を、２つの異なる方法によって別個に束縛し、一方の方法では、ペプチド配列の２つの隣接する原子にわたってトリアゾール部分を導入するためにクリック化学反応を使用した。この方法によってペプチド配列上に発揮される束縛の程度は、トリアゾール部分にメチレン基を付加することによって調整することができる（この方法によって、橙０４６、橙０４７、黄０４３、黄０４４を生成した）。第２の方法は、ヘテロキラルなジプロリン単位（Ｄ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｒｏ）の鋳型効果による環化を伴った。この単位は、文献においてβターンを誘発する潜在性を有することが言及されている（Ｓｐａｔｈら、１９９８、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ８１、ｐ１７２６〜１７３８）；（この方法によって、橙０４４、橙０４５、黄０４０、黄０４１、黄０４２を生成した）。これらの束縛されたペプチドの化学構造を、表９に示す。

【0371】

いくつかの試験を実施することによって、ＨＢｓＡｇおよびＱｂｅｔａにコンジュゲートした（実施例２および３に詳述されたようなコンジュゲーション）、様々な長さの鎖状ペプチドまたは束縛されたペプチドによる抗ヒトＩｇＥ免疫応答誘発を評価した。

【0372】

束縛されたペプチドの橙＋Ｃｙｓｔ（配列番号４３６）、黄（配列番号２２０）、橙０４４、橙０４５、橙０４６、橙０４７、黄０４０、黄０４１、黄０４２、黄０４３、および黄０４４を、１．５倍のモル過剰でスクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）化学反応を使用してＱｂｅｔａウイルス様粒子にコンジュゲートさせ、マウスにおける免疫原として使用した。表９で以下に記載したような日に、メスのＢａｌｂ／ｃ（６〜８週）に、抗原およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとＣｐＧ−２４５５５（すべてのヌクレオチド間連結がホスホロチオエート連結）アジュバントを、筋肉内経路によって注射した（５０μｌを各前脛骨筋中に注射した）。最後のブーストの１週間後に調製した血清を、実施例５に記載したように、ＩｇＥ結合アッセイにおいて、抗ＩｇＥ抗体活性について試験した。

【0373】

結果
表９に要約した試験は、ＱｂｅｔａおよびＨＢｓＡｇにコンジュゲートされた紫、橙、および黄のペプチドに由来し、組み合わせたアジュバントのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌおよびＣｐＧ２４５５５とともに送達される鎖状ペプチドは、遊離ＩｇＥに結合することができる抗体応答を誘発することを示した。

【0374】

さらに、ほとんどの束縛されたペプチド免疫原は、遊離ヒトＩｇＥに結合することができる抗血清を誘発した。青００３、００４、および００５は、意外にも、弱い抗ＩｇＥ応答しか誘発しなかった。橙０４７および橙０４８は、バックグラウンドレベルを超える抗ＩｇＥ抗体を誘発しなかった。

【0375】

【表9-1】

【0376】

【表9-2】

【0377】

【表9-3】

【0378】

【表9-4】

【0379】

【表9-5】

【0380】

（実施例１１）
ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答を誘発する際の、Ｑｂｅｔａ、ＨＢｓＡｇ、およびＤＴにコンジュゲートされたペプチドの効力
本試験は、様々な担体、例えば、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、ＨＢｓＡｇ、およびＱｂｅｔａなどにコンジュゲートしたペプチド（上記実施例に詳述したような）が、ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答を誘発する際に、どの程度効果的であったかを評価することを目的とした。ＤＴコンジュゲートを生成するために、ジフテリアトキソイド（濃度３ｍｇ／ｍｌ）を、１０倍モル過剰で、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）を用いて誘導体化した。この活性化工程の後、過剰のＳＭＰＨ試薬を、ＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、５ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）中に除去した。次いで、凍結乾燥したペプチド固体を、マレイミド活性化ジフテリアトキソイドに直接添加し、穏やかに混合しながら９０分間インキュベートした。その後、試料をＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）で溶出することによって遊離ペプチドを除去した。この後、タンパク質溶液を、１０ｋＤのスピンマイクロコンセントレーターを使用して濃縮し、０．２２μｍのフィルターを使用して滅菌し、使用するまで−８０℃で保持した。Ｑｂ−ペプチドおよびＨｂｓＡｇ−ペプチドコンジュゲートを、以下のように生成した：ともにＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から得た、Ｎ−γ−マレイミド−ブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）連結試薬またはスクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）を使用して、ＶＬＰ（ＱβおよびＨＢｓＡｇの両方）を活性化した。ＧＭＢＳまたはＳＭＰＨ試薬は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させ、５倍以上のモル過剰でＶＬＰ溶液に添加した。活性化反応を３０分以上進行させ、次いで溶液を、ＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、５ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）中に脱塩した。この後、適切な量の固体凍結乾燥ペプチドを、マレイミド活性化ＶＬＰに直接添加し、ＶＬＰとペプチドの反応を、非常に穏やかに混合しながら少なくとも３０分間進行させた。反応時間の最後に、各試料を、ＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中に脱塩した。脱塩し、コンジュゲートされたペプチドを、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）アッセイまたはＢＣＡタンパク質アッセイ（ビシンコニン酸、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、タンパク質含量について分析した。

【0381】

表１０で以下に記載したように、０、１９＆３４日目に、メスのＢａｌｂ／ｃ（６〜８週）に、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとＣｐＧアジュバントとともに、Ｑｂｅｔａ、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはジフテリアトキソイド（ＤＴ）にコンジュゲートされたペプチドを筋肉内経路によって注射した（５０μｌを各前脛骨筋中に注射した）。最後のブーストの１週間後に調製した血清を、実施例５に記載したように、ＩｇＥ結合アッセイにおいて、抗ＩｇＥ抗体活性について試験した。応答を表１０に示す。

【0382】

結果
本試験（表１０）は、紫００１および黄００１ペプチド（表９で示した配列）は、ＤＴ、Ｑｂｅｔａ、またはＨＢｓＡｇにコンジュゲートされたとき、抗ヒトＩｇＥ抗体を誘発することができることを示した。抗ヒトＩｇＥ抗体は、ＧＭＢＳリンカーまたはＳＭＰＨリンカーを使用して誘発された。

【0383】

【表10】

【0384】

【表11】

【0385】

（実施例１２）
ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答の誘発において、ペプチドの組合せの効力は、Ｑｂｅｔａにコンジュゲートした単一のペプチドを使用するより大きい。
ヒトＩｇＥに結合することができる抗体応答の誘発において、Ｑｂｅｔａにコンジュゲートしたペプチド（上記実施例に詳述したような）がどのようであったかを評価することを目的としたいくつかの試験を実施した。表に示したような特定のタイミングの詳細で、実施例５に記載したように、メスのＢａｌｂ／ｃ（６〜８週）を筋肉内経路によって免疫化した。抗ＩｇＥ応答、脱顆粒誘導活性、およびＩｇＥ枯渇活性を、実施例５に詳述したように測定した。

【0386】

結果
表１１に示したように、ペプチドの（表９での配列を参照）Ｑｂｅｔａへのコンジュゲーションは、対照値を超えて脱顆粒を引き起こすことなく、遊離ＩｇＥに結合することができる抗体応答を誘発した。単一アジュバントとしてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを使用することは有効であり、紫ペプチドと黄ペプチドの組合せは、より高いＩｇＥ結合抗体応答を誘発した。さらに、このペプチドの組合せは、ＩｇＥに結合すること、および枯渇させることにおいてより強力な抗体応答を誘発した。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ製剤にＣＰＧ２４５５５を付加することにより、脱顆粒活性を誘発することなく、抗ＩｇＥ抗体応答がさらに増大した。

【0387】

（実施例１３）
紫００１および黄００１のマウス相同体による抗自己ＩｇＥ応答の誘発
ＩｇＥペプチドワクチンが、インビボでＩｇＧ抗自己ＩｇＥ抗体を誘発し、ＩｇＥレベルを低減する能力を、ＩｇＥレベルが上昇したマウス（ミョウバンを用いて製剤化されたモデル抗原として、エンドトキシンを含まないオボアルブミン（ＯＶＡ）で予備免疫することによって誘発した−参考文献例 Ｌｌｏｙｄ Ｃら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１、１６６、ｐ２０３３〜２０４０）において評価した。ＩｇＥ抗ＯＶＡ応答の誘発後に、Ｑｂｅｔａ担体にカップリングされ、アジュバントとともに製剤化された抗原ペプチドをマウスにワクチン接種した。マウスＩｇＥの相同領域に由来するペプチドを使用した（マウス黄００１＝ＱＣＩＶＤＨＰＤＦＰＫＰＩＶＲＳ（配列番号４５８）；マウス紫００１＝ＰＤＨＥＰＲＧＶＩＴＹＬＩＰＰＳＰＣ（配列番号４５９））。ＩｇＥレベルを低下させることにおけるワクチン接種の効力は、ワクチン接種前後で血清中のＩｇＥ抗ＯＶＡのレベルを測定することによってモニターした。

【0388】

ａ）オボアルブミン特異的ＩｇＥの定量化アッセイ
要約：ＯＶＡ特異的マウスＩｇＥの濃度を求める電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイ。ＯＶＡ特異的ＩｇＥモノクローナル抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ カタログ番号ＰＭＰ６８）を、各アッセイにおいて試験した、この標準物質（Ｈａｒｌａｎ ＬａｂｓからのＢａｌｂ／ｃ陰性血清（４００匹の動物 Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ コード番号Ｒ−０１３１Ｄからプールした）中に３０μｇ／ｍＬのトップ濃度で添加した）の定量的な１２点１／２対数希釈液とともに、陽性対照として使用した。このプールした通常血清は、陰性対照として単独でも使用した。アッセイプレートのコーティング：３８４ウェルアッセイプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）標準的な結合 カタログ番号Ｌ１１ＸＡ−１、０３７０ＰＡ）を、０．０１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳを用いて１５μｇ／ｍＬに希釈した、１２μＬ／ウェルのマウスＩｇＥに対するラットｐＡｂ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号０４７００でコーティングし、次いで振盪機上で室温で２時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのＰｉｅｒｃｅスターティングブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．カタログ番号３７５３８）を使用してプレートをブロックし、振盪機上で、室温で４０分間インキュベートした後、最後にｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した。試料調製およびアッセイ：各血清試料を２００中１および５００中１に希釈し（ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡの希釈剤）、各希釈液１２μＬをコーティングしたＭＳＤプレートに３つ組で添加し、試験した標準物質を並行して希釈した。振盪機上で、室温で２時間インキュベートした後、プレートを、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：３００の、１２μＬ／ウェルの検出用、ＳＵＬＦＯタグ付きオボアルブミンを添加し、次いで、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＭＱ水で１：２の、界面活性剤を含む５０μＬ／ウェルのＭＳＤ ＲｅａｄバッファーＴ（４×）（ＭＳＤ カタログ番号Ｒ９２ＴＣ）を添加した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を使用してプレートを読み取った。データ分析：未処理データ（ピクセル）の対数をとり、検量線をプロットし（ＬｏｇマウスＩｇＥ抗ＯＶＡ濃度ｎｇ／ｍＬ対Ｌｏｇピクセル）、非対称５−パラメータ曲線フィッティングを適用した。試験試料のＬｏｇ ＩｇＥ濃度を検量線から予測し、引き続いて逆対数をとり、２００または５００を乗じることによって、実際のＩｇＥ濃度をｎｇ／ｍＬで導出した。

【0389】

ｂ）抗マウスＩｇＥ全ＩｇＧ力価の決定
要約：マウスＩｇＥに特異的な全ＩｇＧ分子のレベルを表すための逆数力価（ＲＴ）を生じる比色分析ＥＬＩＳＡ。連続希釈液を血清試料から調製し、アッセイにおいて試験した。１０μｇ／ｍＬでＨａｒｌａｎ ＬａｂｓからのＢａｌｂ／ｃ陰性血清中に添加し、８点１／２対数連続希釈液中で滴定したマウスＩｇＥに対するラットｐＡｂ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号０４７００を陽性対照として使用した。Ｈａｒｌａｎ ＬａｂｓからのＢａｌｂ／ｃ陰性血清を、試験陰性群（試料と同様に処理した）からのプールした試料とともに、陰性対照として使用した（４００匹の動物 Ｈａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ コード番号Ｒ−０１３１Ｄからプールした）。アッセイプレートのコーティング：３８４ウェル高結合アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号３７００）に、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した２５μＬ／ウェルの、ＯＶＡに対するマウスＩｇＥ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ カタログ番号ＰＭＰ６８）のストックでコーティングし、振盪機上で、室温で２時間インキュベートした。ｐＨ７．４のＰＢＳで２回洗浄した後、８０μＬ／ウェルの０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡを使用してプレートをブロックし、室温で１時間インキュベートした後、最後にｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。試料調製およびアッセイ：各試料の８点１／１０連続希釈液を、１：１０の希釈から開始して調製し（ＰＢＳ／１％のＢＳＡ希釈剤）、２５μＬ／ウェルの連続希釈液をマウスＩｇＥでコーティングしたプレート中に２つ組で移し、次いで、振盪しながら室温で１．５時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：６０００の、２５μＬ／ウェルの全ＩｇＧ検出抗体を添加し（ウサギ抗−ｍｕ ＩｇＧ−Ｆｃ、カタログ番号Ａ９０−１３０Ａ Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、次いで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／ｐＨ７．４の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で１：３０００の、２５μＬ／ウェルのＢｉｏ−Ｒａｄキットヤギ抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ カタログ番号１７２−１０１９）を添加し、次いで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、次いでｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳのみで１回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのマウスＴｙｐｅｒ ＨＲＰ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ カタログ番号１７２−１０６４）を添加し、次いで室温で３０分間インキュベートした後、２５μＬ／ウェルの２％のシュウ酸を添加することによって反応を停止し、４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。データ分析：滴定曲線を各試験試料についてプロットし（試料力価対４０５ｎｍの吸光度）、試料力価（引き続いて逆数力価に変換した）を、ＯＤ１のカットオフ値から予測した。

【0390】

結果
２つの試験（表１２）は、黄００１のマウス相同体（ｍ黄−００１＝ＱＣＩＶＤＨＰＤＦＰＫＰＩＶＲＳ（配列番号４５８））と、紫００１のマウス相同体（ｍ紫−００１＝ＰＤＨＥＰＲＧＶＩＴＹＬＩＰＰＳＰＣ（配列番号４５９））との組合せは、ＩｇＥの内因性レベルを効率的に低下させることができる（Ｑｂｅｔａ ＶＬＰ免疫化対照中のレベルと比較して）抗自己ＩｇＥ抗体応答を誘発することができることを示した。したがって、機構の証明は、ＩｇＥペプチドコンジュゲートは、内因性ＩｇＥ分子に対するＢ細胞寛容を破壊することができ、これは、内因性ＩｇＥレベルの低減と相関することを示すことによって実現された。

【0391】

【表12】

【0392】

（実施例１４）
カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）の紫０１４、および黄００１または黄０１４でのワクチン接種
ヒトＩｇＥペプチドワクチンが、インビボで自己ＩｇＥに対する寛容を破壊する能力を、担体（Ｑ ｂｅｔａ ＶＬＰ）にカップリングさせ、アジュバントとともに製剤化した抗原ペプチドでワクチン接種したカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）において評価した。ヒトＩｇＥ由来のペプチドを使用した。次いで、抗自己ＩｇＥ免疫応答を誘発することにおけるワクチン接種の効力を、ワクチン接種前後で血清中のＩｇＧ抗ＩｇＥのレベルを測定することによってモニターした。

【0393】

カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）アッセイ
ａ）以下の抗原／ＶＬＰに特異的なＩｇＧについての全ＩｇＧ力価決定：カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）ＩｇＥ Ｃε２−Ｃε４ドメイン、ヒトＩｇＥ Ｃε３Ｃε４ドメイン、ＫＬＨにコンジュゲートした、およびＱｂｅｔａにコンジュゲートした個々のペプチド（黄および紫）。
要約：ワクチンまたはＶＬＰに特異的な全ＩｇＧ分子のレベルを表すための逆数力価（ＲＴ）を生じる電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイ。連続希釈液を血清試料から調製し、アッセイにおいて試験した。ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体（Ｅ２５、Ｘｏｌａｉｒ）で添加したカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）血清を、陽性対照として４０μｇ／ｍＬで使用した。添加していないカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）血清を陰性対照として使用した。アッセイプレートのコーティング：３８４ウェルのアッセイプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）ストレプトアビジンでコーティングされた カタログ番号Ｌ２１ＳＡ−１）を、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで１μｇ／ｍＬに希釈した１２μＬ／ウェルのビオチン化カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）ＩｇＥ Ｃε２−Ｃε４またはヒトＩｇＥ Ｃε３Ｃε４でコーティングした。３８４ウェルアッセイプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）標準的な結合 カタログ番号Ｌ１１ＸＡ−１、０３７０ＰＡ）を、１２μＬ／ウェルの、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ（ＢＳＡなし）で１μｇ／ｍＬに希釈した個々のペプチド（ＫＬＨにコンジュゲートした）、または２〜５μｇ／ｍＬに希釈したＱｂｅｔａでコーティングした。次いでプレートを、振盪機上で、室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのＰｉｅｒｃｅスターティングブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．カタログ番号３７５３８）を使用してプレートをブロックし、振盪機上で、室温で４０分間インキュベートした後、最後にｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳで３回洗浄した。試料調製およびアッセイ：対照を含む各試料の８点１／２対数連続希釈液を、１：２０の希釈から開始して調製し（ＰＢＳ／１％のＢＳＡ希釈剤）、１２μＬ／ウェルの連続希釈液を試験抗原／ＶＬＰでコーティングしたプレートのウェル中に移し、次いで、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、０．０２μｇ／ｍＬに希釈した（ＰＢＳ／１％のＢＳＡ希釈剤）ＳＵＬＦＯタグ付きプロテインＧを、プレートに添加した（１２μＬ／ウェル）。プレートを、振盪しながら室温で１時間インキュベートし、次いで、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＭＱ水で１：２の、５０μＬ／ウェルの、界面活性剤を含むＭＳＤ Ｒｅａｄ バッファーＴ（４×）（ＭＳＤ カタログ番号Ｒ９２ＴＣ）を添加した。ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００を使用してプレートを読み取った。データ分析：滴定曲線を各試験試料についてプロットし（試料力価対ピクセル）、試料力価（引き続いて逆数力価に変換した）を、カットオフ値（ピクセル）から予測した。

【0394】

ｂ）カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）抗体の結合活性アッセイ
要約：ヒトＣε３Ｃε４に特異的な全ＩｇＧ分子の結合強度を表すための結合活性指数（ＡＩ）を生じる比色分析ＥＬＩＳＡ。ヒト化抗ＩｇＥ抗体Ｘｏｌａｉｒ（Ｅ２５）は、４０および４μｇ／ｍＬで、プールしたカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）血清（本試験のＱｂ−ＶＬＰ対照群から調製した）中に添加し、陽性対照として１２点１／２対数連続希釈液で滴定した。試験Ｑｂ−ＶＬＰ群からのカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）血清を、市販のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）血清とともに、陰性対照として使用した。アッセイプレートのコーティング：ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキングバッファー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ Ｌｔｄ ＰＩ１５５０４）を含む、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ストレプトアビジンがコーティングされたＨＢＣ透明３８４ウェルプレートを、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬで、１２μＬ／ウェルのビオチン化ヒトＣε３Ｃε４でコーティングし、振盪機上で、室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄した後、２５μＬ／ウェルの０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡを使用してプレートをブロックし、室温で４０分間インキュベートした後、最後にｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。試料調製およびアッセイ：試料を、０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡで希釈した。各試料により滴定曲線を作成し、この曲線から、１８０，０００のピクセル値を使用することによって、各試料について使用するための個々の逆数力価（ＲＴ）希釈を計算した。各試料を希釈するためにこのＲＴを使用することによって、各試料からの同様のレベルの抗体が、結合活性アッセイにおいて使用されることを保証した。１２μＬの各希釈した試料を、コーティングされた３８４ウェルプレートの２４ウェルに添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、チオシアン酸アンモニウムを、異なる濃度で、１２μＬ／ウェルでプレートに添加し、次いで、振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。（１２の濃度のチオシアン酸アンモニウムを使用した：１２、１０、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、および０Ｍを、２つ組試料に添加した）。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で４回洗浄した後、０．０１ＭのＰＢＳ／１％のＢＳＡを含む、１２μＬ／ウェルのＨＲＰを標識したマウス抗−ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ９０４２−０５）を添加し、次いで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１ＭのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ Ｐ−８６６５）を添加し、次いで、暗所で、室温で３０分間インキュベートした。反応を停止させるために、２５μＬ／ウェルの２％のシュウ酸を添加し、吸光度４５０ｎｍでプレートを読み取った。データ分析：各チオシアン酸アンモニウム濃度の各試料についての低減率を、０Ｍのチオシアン酸アンモニウム試料の４０５ｎｍの平均吸光度を０％の低減として使用して計算した。次いで、滴定曲線を各試験試料についてプロットし（低減率対４５０ｎｍの吸光度）、５０％の低減のカットオフ値からＡＩを予測した。

【0395】

結果
本試験（表１３）は、黄００１または黄０１４と紫０１４の組合せ（表９の配列を参照）は、免疫原性であり、抗自己（カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ））ＩｇＥおよび抗ヒトＩｇＥ抗体応答を誘発し、これは、特定のペプチドに対する応答と相関することを示した。さらに本試験は、抗体応答の結合活性は、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）において投薬を繰り返すことによって増大させることができることを示す。

【0396】

【表13】

【0397】

【表14-1】

【0398】

【表14-2】

【0399】

【表14-3】

【0400】

【表14-4】

【0401】

【表14-5】

【0402】

【表14-6】

【0403】

【表14-7】

【0404】

【表14-8】

【0405】

【表14-9】

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]