特許 5964298 ヒトパピローマウイルスＥ７抗原組成物およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5964298

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】ヒトパピローマウイルスＥ７抗原組成物およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/025 20060101AFI20160721BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20160721BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/025

   C12N15/00 AZNA

   A61K39/12

   A61K39/39

   A61K37/02

   A61P31/20

   A61P35/00

   A61K31/7088

   A61K35/76

【請求項の数】10

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2013-518914(P2013-518914)

(86)(22)【出願日】2011年7月15日

(65)【公表番号】特表2013-540421(P2013-540421A)

(43)【公表日】2013年11月7日

(86)【国際出願番号】CA2011000823

(87)【国際公開番号】WO2012006727

(87)【国際公開日】20120119

【審査請求日】2014年7月10日

(31)【優先権主張番号】61/364,750

(32)【優先日】2010年7月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511002951

【氏名又は名称】ブリティッシュ コロンビア キャンサー エージェンシー ブランチ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・アール・ウェブ

(72)【発明者】

【氏名】ダリン・アーネ・ウィック

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／０８９１６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３３３０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０２６３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３８８３６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３以上のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号１６または１７に記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。

【請求項2】

ポリペプチドが、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

ポリペプチドが、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

ポリペプチドが、配列番号３３を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

ポリペプチドが、配列番号３４を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項6】

請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。

【請求項7】

請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項６に記載の核酸分子を含み、キャリアをさらに含む、組成物。

【請求項8】

アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

アジュバントが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、インターフェロンアルファ、４−１ ＢＢ受容体のアゴニスト、ＣＤ４０受容体のアゴニスト、または抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

免疫応答を刺激するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項６に記載の核酸分子または請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトパピローマウイルス感染症および関連する状態を処置するための化合物および組成物に関する。特に、本発明は、ヒトパピローマウイルス感染症および関連する状態を処置するためのヒトパピローマウイルスＥ７抗原化合物および組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、１００を超える、関連するが遺伝的に別個の「型」のウイルスのグループであり、これらは、ローリスクおよびハイリスクとして広く分類することができる。ローリスクＨＰＶ型は、一般に良性で、生命を危うくするものではない尋常性疣贅（または乳頭腫）と関連する。対照的に、ハイリスク型のＨＰＶによる持続感染は、前癌性の子宮頸部異形成および子宮頸癌と関連する（１、２）。ハイリスクＨＰＶ型はまた、肛門癌、外陰癌、膣癌、および陰茎癌（３）ならびにある一部の頭頸部癌（４〜６）および乳癌（５７）とも関連する。

【0003】

子宮頸癌を引き起こすハイリスクＨＰＶ型は、性行為により伝染し、正常で健康な人々に非常に蔓延している。大多数の人々が、性行為が活発になった直後に感染するようになると推定される（７、５９）。大多数のハイリスクＨＰＶ感染症は、自己限定性であると考えられており、最小限の関連する病態を伴うが、ハイリスクＨＰＶによる感染症は、悪性疾患に発達し得る（８）。

【0004】

ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８がハイリスクＨＰＶ型の中で最も蔓延しているものであるが、多くのさらなるハイリスク型のＨＰＶがある。１，９１８人の子宮頸癌患者および１，９２８人の健康な対照の女性についての最近の比較分析により、癌患者における最も一般的なＨＰＶ型が（頻度の降順で）、ＨＰＶ型１６、１８、４５、３１、３３、５２、５８、および３５であることが明らかにされた（１１）。同様に、子宮頸癌におけるＨＰＶの蔓延についての全体的な分析により、ＨＰＶ１６が症例の５０％において存在し、ＨＰＶ１８が１４％、ＨＰＶ４５が８％、ＨＰＶ３１が５％であり、１３の「ハイリスク」型の他の型が、残りの症例を構成していることが明らかにされた（１２）。

【0005】

それらの蔓延により、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、ＨＰＶによる初感染を予防することを目的とする、広範囲の予防免疫キャンペーンの焦点となってきた（９、１０）。また、現在承認されている予防ワクチンは、予防ワクチン接種が、後年、ＨＰＶ関連性の悪性疾患の発生を減少させるまたは予防するであろうということを期待して、ハイリスク株ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８（ならびにローリスク株ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１）を標的にする。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の予防ワクチンが、他のハイリスク型のＨＰＶに対する部分的な交差免疫を与え得ることもまた示唆されている（１３〜１５）。

【0006】

現在臨床で使用されている予防ＨＰＶワクチンは、合成のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を自発的に形成する組換えウイルスカプシド糖タンパク質（Ｌ１）から構成される（６０、６１）。ＶＬＰベースの予防ワクチンによる免疫化は、Ｌ１タンパク質に対する強力な中和抗体応答を誘発し、これは、ウイルス感染症が慢性になるのを予防する。

【0007】

しかしながら、予防ワクチンは、慢性の感染症に対して最小限の効果しか有していないように思われる（１６）。たとえば、一度、ウイルスが細胞の中に入り込むと、ウイルスは、細胞外の抗体の中和作用から保護され、ウイルス複製（および潜伏感染）が進行するのを妨げられないようにするので、予防子宮頸癌ワクチンは、ＨＰＶに既に暴露されている個人に対しては効果がない。ハイリスクＨＰＶによる感染症は、宿主ＤＮＡへのウイルスエピソームの組み込みをもたらし得、多くの場合、いくつかの初期（Ｅ２、Ｅ４、およびＥ５）ならびに後期（Ｌ１およびＬ２）遺伝子の欠失をもたらし、感染細胞において発現され続けるただ一つのウイルスタンパク質として、ＨＰＶタンパク質、Ｅ６およびＥ７を残す（２３、２４、５９）。この状況において、Ｌ１カプシドタンパク質に対するワクチンによって誘導された免疫は、治療効果について効果がない。

【0008】

さらに、子宮頸部の発癌のゆっくりとした進行と組み合わせた、今日の成人人口におけるＨＰＶ感染症の高度な蔓延のために、予防ワクチンの大量実施が子宮頸癌の発生率に対して効果を有するまで、２０年以上かかるであろうということが予想される。さらに、予防ワクチンは、いくつかの実例において抵抗に遭っており、ワクチン接種の率は、様々である（１７）。いくつかの地域では、ワクチン費用が問題点となったままである（１８）。

【0009】

ウイルスタンパク質を発現するＨＰＶ感染細胞に対する細胞性免疫を生成させることによって、先在する病変を根絶することを目指した治療ＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ関連性の癌の処置のための選択肢として調査されてきており（概説については、１９、２０、６２〜６５を参照されたい）、現在承認されている多くのワクチンがＣＤ８免疫を誘発するのに一般に不十分であるので、これらのアプローチの多くは、強いＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発するワクチンの開発を目的としてきた（６６、６７）。ＨＰＶ Ｅ７治療ワクチン接種アプローチは、ペプチド免疫化（２６、２８〜３０）、ＤＮＡ免疫化（３１〜３３、６８）、組換えＥ７発現ワクシニアウイルス（２５、３４）、アデノウイルス（３５〜３７）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（３８、３９）、もしくはリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（４０、４１）による免疫化、Ｅ７パルス樹状細胞（４２〜４５）、またはＥ７含有ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（４６〜４９）を含み、これら多くの治療ワクチン戦略は、初期臨床試験に向かって前進している。

【0010】

これらの治療ワクチン戦略の多くは、多くの場合、ロジスティック的に（ｌｏｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ）厄介であり、誘発される応答は、真の抗ウイルスの免疫応答の急性期の間に見られるＣＤ８ Ｔ細胞増殖のレベルにめったに達しない（６９）。初回刺激−追加免疫用のＤＮＡ−ペプチド、ＤＮＡ−ウイルス、または２つの別個のウイルス媒体を含む、様々なタイプの異種初回刺激−追加免疫レジメンなどのような、追加免疫ワクチン接種を介してＣＤ８免疫を増強するための戦略は、ＣＤ８免疫を誘発するために使用されてきた（７０〜７２）。しかしながら、これらの方法は、診療所に移すのが困難となり得、どの方法論が最適であるかに関しての合意が不十分である。

【0011】

ＨＰＶワクチンは、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０８９１６４（２００５年９月２９日に公開）、ＷＯ２００７／１２１８９４（２００７年１１月１日に公開）、ＷＯ２００７／１２１８９５（２００７年１１月１日に公開）、ＷＯ２００８／０４９３２９（２００８年５月２日に公開）、およびＷＯ２００８／１４５７４５（２００８年１２月４日に公開）を含む多くの刊行物において記載されてきた。

【0012】

活性化されたヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ（２５）と共に、感染細胞の形質転換および不死化ならびに形質転換された状態の細胞の維持（２１、２２）に必要とされるＨＰＶ１６ Ｅ６ならびにＥ７癌遺伝子により形質転換されたマウス初代肺上皮細胞にもともと由来するＴＣ−１モデル腫瘍系は、ＨＰＶ治療ワクチン用の試験系として広く採用されるようになってきた。免疫応答性Ｃ５７Ｂ１／６マウスへのＴＣ−１腫瘍細胞の移植は、接種の部位で急速に進行する腫瘍の形成をもたらす。しかしながら、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質に対する特異的な細胞性免疫は、ＴＣ−１腫瘍増殖からの保護を与えることができる。たとえば、Ｅ７のＨ−２Ｄｂ拘束性エピトープ（Ｅ７４９〜５７；ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｅ７発現腫瘍細胞を溶解し、定着した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）ＴＣ−１腫瘍の退縮を引き起こすことができることが報告されている（２６、２７）。

【0013】

外因性タンパク質全体による免疫化は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するのに非効率的な手段であることが示唆されてきた（５０）。しかしながら、組換え（５１）または合成（５２）の完全長Ｅ７タンパク質による免疫化は、それぞれ、ＱｕｉｌＡまたはＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと組み合わせて送達される場合に、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を誘発することが報告されている。同様に、免疫原性熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）と選択される標的抗原との間の融合物から構成される組換えタンパク質もまた、標的抗原に対するＣＤ８＋免疫を誘発することが報告されている。外因性タンパク質全体プラスＴＬＲ３またはＴＬＲ９アゴニストによる免疫化は、交差提示のプロセスを促進し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発生を促すことが示唆されてきた（５５、５６）。

【0014】

現在、子宮頸部異形成および初期の子宮頸癌は、最も一般的に、電流をかけた細いワイヤーループを使用して異常組織が除去されるＬＥＥＰ（ループ切除）として知られている外科手技を使用して処置される。より進行期の子宮頸癌は、化学療法および／または（ａｎｄ ｏｒ）放射線療法と組み合わせた外科手術（部分的または広汎性子宮全摘出術）によって処置される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は、部分的に、ヒトパピローマウイルスＥ７抗原化合物および組成物を提供する。化合物および組成物は、ヒトパピローマウイルス感染症および関連する状態を処置するまたは診断するのに有用であってもよい。

【課題を解決するための手段】

【0016】

一態様では、本発明は、２以上のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、Ｅ７抗原が、少なくとも２つの異なるＨＰＶ株から選択される、ポリペプチドを提供する。

【0017】

代替の実施形態では、異なるＨＰＶ株は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、またはＨＰＶ８２などのようなハイリスク株であってもよい。代替の実施形態では、Ｅ７抗原は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ５２などのような５つの異なるＨＰＶ株から選択されてもよい。

【0018】

代替の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１６または１７に記載のアミノ酸配列などのような、配列番号１〜１５に記載のアミノ酸配列または配列番号１〜５に記載の２以上のアミノ酸配列を含んでいてもよい。

【0019】

代替の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１８〜３２に記載の２以上のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

【0020】

代替の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３３または３４などのような、配列番号１８〜２２に記載の２以上のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

【0021】

代替の実施形態では、Ｅ７抗原は、２つの異なるＨＰＶ株に対する免疫応答を誘導することができてもよい。

【0022】

他の態様では、本発明は、２以上のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原のヌクレオチド配列と実質的に同一の配列を含む核酸分子であって、Ｅ７抗原は、少なくとも２つの異なるＨＰＶ株から選択される、核酸分子を提供する。

【0023】

代替の実施形態では、異なるＨＰＶ株は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、またはＨＰＶ８２などのようなハイリスク株であってもよい。

【0024】

代替の実施形態では、Ｅ７抗原は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ５２などのような５つの異なるＨＰＶ株から選択されてもよい。

【0025】

代替の実施形態では、核酸分子は、配列番号１８〜３２に記載の２以上の核酸配列を含んでいてもよい。

【0026】

代替の実施形態では、核酸分子は、配列番号３３または３４などのような、配列番号１８〜２２に記載の核酸配列を含んでいてもよい。

【0027】

代替の態様では、本発明は、ＨＰＶ Ｅ７ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。

【0028】

代替の態様では、本発明は、宿主細胞における核酸配列の発現を可能にする配列に作動可能に連結された、本明細書に記載の核酸配列を含む発現ベクターを提供する。

【0029】

代替の態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0030】

代替の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞を含む組成物を提供する。組成物は、キャリアおよび／またはアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは、ＴＬＲ３アゴニスト［たとえばポリ（Ｉ：Ｃ）］またはＴＬＲ９アゴニスト（たとえばＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド）などのようなＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストであってもよい。その代わりにまたはさらに、アジュバントは、インターフェロンアルファ、４−１ ＢＢ受容体のアゴニスト、ＣＤ４０受容体のアゴニスト、または抗ＣＤ４０抗体であってもよい。

【0031】

代替の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞を対象に投与することによって、免疫応答の刺激を、それを必要とする対象において行うための方法を提供する。代替の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞を対象に投与することによって、ＨＰＶ感染症と関連する状態の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための方法を提供する。代替の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞を対象に投与することによって、ＨＰＶ感染症の処置を、それを必要とする対象において行うための方法を提供する。

【0032】

代替の態様では、本発明は、免疫応答の刺激を、それを必要とする対象において行うための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。代替の態様では、本発明は、ＨＰＶ感染症と関連する状態の処置または予防を、それを必要とする対象において行うための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。代替の態様では、本発明は、ＨＰＶ感染症の処置を、それを必要とする対象において行うための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。

【0033】

ＨＰＶ感染症と関連する状態は、乳癌、子宮頸部癌、肛門癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、頭頸部癌、および肺癌もしくはその前悪性病変の１もしくは２つ以上であってもよい、または前癌性の子宮頸部上皮腫瘍（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）（ＣＩＮ Ｉ〜ＣＩＮ ＩＩＩ）もしくは子宮頸癌であってもよい。

【0034】

代替の実施形態では、ＨＰＶ感染症は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、またはＨＰＶ８２などのようなハイリスクＨＰＶ型によるものであってもよい。代替の実施形態では、方法または使用は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト［たとえばポリ（Ｉ：Ｃ）のようなＴＬＲ３アゴニストまたはＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのようなＴＬＲ９アゴニスト］などのようなアジュバントを投与することをさらに含んでいてもよい。その代わりにまたはさらに、アジュバントは、インターフェロンアルファ、４−１ ＢＢ受容体のアゴニスト、ＣＤ４０受容体のアゴニスト、または抗ＣＤ４０抗体を含んでいてもよい。投与は、１４日未満の時間枠にわたる複数の用量の投与を含んでいてもよい、もしくは１〜４日にわたる複数の用量の投与を含んでいてもよい、および／または複数の１日量の投与を含んでいてもよい。

【0035】

代替の態様では、本発明は、１または２以上の配列ＴＳＮＹＮＩＶＴＦ（配列番号３５）、ＡＥＰＤＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号３６）、またはＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣＱＣＫＳ（配列番号３７）から本質的になるペプチドを提供する。代替の態様では、本発明は、１または２以上の配列ＴＳＮＹＮＩＶＴＦ（配列番号３５）、ＡＥＰＤＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号３６）、またはＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣＱＣＫＳ（配列番号３７）から本質的になるペプチドと試料を接触させることを含む、ＨＰＶ３１感染症を診断するための方法を提供する。代替の態様では、本発明は、１または２以上の配列ＴＳＮＹＮＩＶＴＦ（配列番号３５）、ＡＥＰＤＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号３６）、またはＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣＱＣＫＳ（配列番号３７）から本質的になるペプチドと試料を接触させる、ＨＰＶ３１感染症に対する対象の応答を決定するための方法を提供する。

【0036】

本発明のこの概要は、必ずしも、本発明のすべての特徴を記載するとは限らない。

【0037】

本発明のこれらのおよび他の特徴は、添付の図面について言及される以下の説明からより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】図１Ａ〜Ｂは（Ａ）アフィニティータグを有していない、または（Ｂ）切断可能な６×アフィニティータグおよびトロンビン切断部位を有するＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質の構造的な構成を示す模式図である。 図１Ｃは、切断可能な６×アフィニティータグを有するＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質の調製および精製を示す。図は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質の発現およびニッケルアフィニティー精製を使用する典型的な精製の例を示す。ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の通過前後の、ＩＰＴＧによって誘導されたイー・コリの溶解物内に含有される総タンパク質および増加性の濃度のイミダゾールの存在下においてカラムから溶離させたタンパク質（Ｆｒ＃１〜１２）を、クーマシー（Ｃｏｏｍｍａｓｓｉｅ）ブルー染色によって検出した（左のパネル）。精製Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質の同一性は、抗６×Ｈｉｓタグ抗体または抗ＨＰＶ １６Ｅ７抗体を使用して、誘導されていない培養物および誘導された培養物からの溶解物ならびに精製ＰｅｎｔａｒｉｘおよびＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のウエスタンブロット解析によって確認した。

【図2】図２Ａは、外因性ＯＶＡタンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）またはポリＩＣ／ＬＣによる免疫化に応じて誘発される、ＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８_＋Ｔ細胞応答を示すグラフである。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（条件当たり２匹のマウス）は、ＯＶＡタンパク質全体（５００μｇ）プラスまたはマイナスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）もしくはポリＩＣ／ＬＣ（１０μｇ／ｍｌ）により免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、免疫化マウスのバルク脾細胞（ｂｕｌｋ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）におけるＯＶＡ_{２５７〜２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって定量した。結果は、培地のみ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）（配列番号３９）、または無関係のＨ２Ｄｂ結合ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。 図２Ｂは、ＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答が、外因性ＯＶＡタンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）による免疫化後に用量依存性の様式において誘発されることを示すグラフである。

【図3】図３Ａ〜Ｅは、長いまたは短い間隔（クラスター）の相応する初回刺激−追加免疫化に応じて誘発されるＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＨＰＶ１６ Ｅ７応答を示す。Ａ、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（条件当たり２匹のマウス）は、−７日目、−２１日目、または−７日目および−２１日目に、ＯＶＡタンパク質全体（１００μｕｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）により免疫化し、０日目に安楽死させた。免疫化マウスのバルク脾細胞におけるＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって定量した。Ｂ、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（条件当たり３匹のマウス）は、示す数の連続的な１日量の、ポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）と混合した可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）により免疫化した。マウスのさらなる１つの群は、通常の１日量の４倍に等しい量で１回の免疫化を受けた［つまり、４００μｇのＯＶＡタンパク質プラス４０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）］。第１の免疫化の７日後に、マウスは、安楽死させ、ＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。ＡおよびＢにおける結果は、培地のみ、またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。Ｃ、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスは、示されるように、１回の用量または連続４回の１日量の可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）により免疫化した。Ｄ、１日量のＯＶＡタンパク質プラスポリ（Ｉ：Ｃ）を連続４回受けたパネルｃのマウスは、第１のラウンドの免疫化の模倣（ｉｍｉｔａｔｉｏｎ）の４７日後から、さらに連続４回の１日量の同じものにより再度免疫化した。末梢血は、免疫化後、示された日に連続的に採血した個々のマウスの伏在静脈から得た。末梢血中のＲＢＣを溶解し、リンパ球は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８およびＰＥコンジュゲートＨ−２Ｋｂ／ＯＶＡ_{２５７〜２６４}四量体により染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣおよびＤに示す事象は、ＣＤ８＋リンパ球に対してゲート制御したものであり、代表的な１匹の動物由来のものであり、ある期間にわたる所定の動物内の抗原特異的Ｔ細胞応答の進展についての正確なモニタリングを可能にする。Ｅ、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスは、１回の用量（左のパネル）、連続４回の１日量の可溶性ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質全体（１００ｕｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０ｕｇ）、または連続４回の１日量の可溶性ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質全体（１００ｕｇ）のみにより免疫化した。免疫化の７日後に、末梢血を免疫化マウスから得た。リンパ球は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８およびＰＥコンジュゲートＤ^ｂ／Ｅ７_{４９〜５７}四量体により染色し、フローサイトメトリーによって分析した。示す事象は、ＣＤ８＋リンパ球に対してゲート制御したものである。

【図4】図４は、可溶性タンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）による連続的な毎日の免疫化が、大きな定着した腫瘍の退縮を誘導することを示す一連のグラフである。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たり３匹のマウス）に、０日目に、ＯＶＡ発現ＥＧ７癌細胞（１×１０^５）を移植し、未処置のままとした（左上）、または１用量のポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）（右上）、１用量の可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）（左下）、または４回の連続的な１日量の可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）（右下）により処置した。各群の処置の時期は、矢印（複数可）によって示す。各群の処置時の平均腫瘍容量は、２２４ｍｍ^３［ポリ（Ｉ：Ｃ）のみ］、１９４ｍｍ^３［１用量のＯＶＡ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）］、または３４４ｍｍ^３［４用量のＯＶＡ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）］であった。最後のコホートのマウスは、連続的な毎日の免疫化の有益な効果を例示するために、腫瘍サイズがより大きい時期に意図的に処置した。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）による１回の免疫化に応じて誘発された、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示すグラフである。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスは、未処置のままとした、または１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）と混合した１００μｇの可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体により免疫化した、または１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）のみにより処置した（５Ｂ）。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。手短に言えば、個々の動物由来の脾細胞（ウェル当たり３×１０^５および条件当たり三通りのウェル）を、培地のみ、またはＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}ペプチド（１０ｕｇ／ｍｌ）もしくは無関係の対照ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ；配列番号４０）により一晩、刺激した。比較のため、ナイーブ（非免疫化）マウス由来の結果が含まれる。結果は、培地のみ、またはＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}もしくは無関係のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する（５Ｂ）。

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体プラスＴＬＲ９アゴニストＣｐＧオリゴヌクレオチドによる１回の免疫化に応じて誘発されたＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋_＋Ｔ細胞応答を示すグラフである。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスは、未処置のままとした。または１０μｇのＣｐＧオリゴ＃２３９５（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合した１００μｇの可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体により、もしくはＣｐＧオリゴのみにより免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。手短に言えば、個々の動物由来の脾細胞（ウェル当たり３×１０^５および条件当たり三通りのウェル）を、培地のみ、またはＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}ペプチド（１０ｕｇ／ｍｌ）もしくは無関係の対照ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ；配列番号４０）により一晩、刺激した。比較のため、ナイーブ（非免疫化）マウス由来の結果が含まれる。結果は、培地のみ、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}、または無関係のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。６Ｂに示すデータは、３回の実験を代表するものであり、結果は、それぞれの三通りについて、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数＋／−ＳＤとして報告する。

【図7】図７Ａ〜Ｂは、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）によるまたは連続４回の１日量のＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質プラスポリ（Ｉ：Ｃ）による１回の免疫化に応じて誘発されたＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋_＋Ｔ細胞応答を示すグラフである。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（図７Ｂについてはコホート当たり３匹）は、未処置（ナイーブ）のままとした。または１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）と混合した１００μｇの可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体により、１回もしくは４回（１〜４日目に毎日）、免疫化した。免疫化の７日（７Ａ）または８日（７Ｂ）後に、マウスを安楽死させ、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。結果は、培地のみ、またはＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}もしくは無関係のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する（７Ｂ）。個々の動物由来の脾細胞（ウェル当たり３×１０^５）は、培地のみ、またはＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}ペプチド（１０ｕｇ／ｍｌ）もしくは無関係の対照ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ；配列番号４０）により一晩、刺激した。７Ｂに示すデータは、３回の実験を代表するものであり、結果は、それぞれの三通りについて、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数＋／−ＳＤとして報告する。 図７Ｃは、１００ｕｇ Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質プラス１０ｕｇポリ（Ｉ：Ｃ）（左の２つのパネル）または１００ｕｇ Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質のみ（右のパネル）により連続４日間、免疫化したマウスの脾臓および末梢血中のリンパ球を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８およびＰＥコンジュゲートＤ^ｂ／１６ Ｅ７_{４９〜５７}四量体により染色し、フローサイトメトリーによって分析した研究からの結果を示す。示す事象は、ＣＤ８リンパ球に対してゲート制御したものであり、４匹のそのような動物を代表するものである。

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）による免疫化が、大きな定着したＴＣ１腫瘍の退縮を誘導することを示す一連のグラフである。Ａ、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たり３匹のマウス）に、−１４日目に、Ｅ７発現ＴＣ１腫瘍細胞（１×１０^５）を移植し、０日目に（腫瘍のサイズがおよそ２００ｍｍ^３に達した時）未処置のままとした（左）。または１用量のポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）（中央）もしくは１用量の可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）（右）により処置した。腫瘍は、２〜３日ごとに、電子デジタルキャリパーを使用して測定し、サイズは、式 幅^２×長さ×０．５を使用して計算した。Ｂ、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たり８匹）の皮下に、１×１０^５のＥ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞を移植した。腫瘍が３５０ｍｍ^３の平均容量に達した時点で、マウスは、１回の用量のＰｅｎｔａｒｉｘ（１００ｕｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０ｕｇ）、連続４回の１日量のＰｅｎｔａｒｉｘ（１００ｕｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０ｕｇ）、連続４回の１日量のポリ（Ｉ：Ｃ）のみ（用量当たり１０ｕｇ）により処置した。または、未処置のままとした。腫瘍は、２〜４日ごとに、電子キャリパーにより測定し、腫瘍ができているマウスは、腫瘍容量がおよそ２，０００ｍｍ^３を超過した場合、またはマウスが瀕死になった場合、もしくは２０％を超える体重減少があった場合に安楽死させた。データは、コホート内のすべてのマウス（左のパネル）、または生存したマウス（右のパネル）の平均腫瘍容量を示す。 図８Ｃは、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質プラスポリ（Ｉ：Ｃ）によるＴＣ１腫瘍ができているマウスの免疫化が、腫瘍の完全退縮および腫瘍進行後に持続するＥ７特異的ＣＤ８＋記憶細胞の確立を誘発することを示す一連のグラフである。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスの皮下に、１×１０^５のＥ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞を移植した。腫瘍が２００ｍｍ^３の平均容量に達した時点で、マウスは、１回の用量のＰｅｎｔａｒｉｘ（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）により処置し、腫瘍は、免疫化の１５日以内に完全に退縮した。末梢血の試料は、免疫化の２１日後に伏在静脈から採取し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８およびＰＥコンジュゲートＤ^ｂ／１６ Ｅ７_{４９〜５７}四量体ならびに記憶表現型マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、およびＫＬＲＧ１により染色し、フローサイトメトリーによって分析した。示す事象は、ＣＤ８＋リンパ球に対してゲート制御したものである。

【図9】図９ＡおよびＢは、ポリ（Ｉ：Ｃ）またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと組み合わせた可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体による免疫化が、定着したＴＣ１腫瘍の退縮を誘導することを示す一連のグラフである。Ａ、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たり４匹のマウス）に、−２１日目にＥ７発現ＴＣ１腫瘍細胞（１×１０^５）を移植し、０日目に、１用量の可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体（１００ｇ）プラスＣｐＧオリゴ＃２３９５（１０μｇ）（左上）もしくは１用量のＣｐＧオリゴ＃２３９５のみ（１０μｇ）（右上）により処置、または未処置のままとした（左下）。腫瘍は、２〜３日ごとに、電子デジタルキャリパーを使用して測定し、サイズは、式 幅^２×長さ×０．５を使用して計算した。左上、右上、および左下の３つのプロットは、個々のマウスにおける腫瘍の退縮を示し、一方右下のプロットは、各コホートについての平均腫瘍容量測定値の合計を示す。Ｂ、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たりに示すマウスの数）の皮下に、１×１０^５のＥ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞を移植した。腫瘍が２００ｍｍ^３の平均容量に達した時点で、マウスは、１回の用量のＰｅｎｔａｒｉｘ（１００ｕｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０ｕｇ）、１回の用量のＰｅｎｔａｒｉｘ（１００ｕｇ）プラスＣｐＧオリゴヌクレオチド（１０ｕｇ）、またはポリ（Ｉ：Ｃ）（１０ｕｇ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（１０ｕｇ）、もしくはＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質（１００ｕｇ）のみにより処置した（示されるように）、または未処置のままとした。腫瘍は、２〜４日ごとに、電子キャリパーにより測定し、データは、それぞれのコホート内の個々の動物についてのある期間にわたる腫瘍容量として（上６つのパネル）またはコホート内のすべてのマウスについての生存として（下の２パネル）示す。腫瘍ができているマウスは、腫瘍容量がおよそ２，０００ｍｍ^３を超過した場合、またはマウスが瀕死になった場合、もしくは２０％を超える体重減少があった場合に安楽死させ、ｐ値は、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して計算した。

【図10】図１０Ａは、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）による１回の免疫化に応じて誘発されたエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示すグラフである。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスは、１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と混合した１００μｇの可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体により免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、示された各ペプチドに対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。結果は、培地のみ、または示されたペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。 図１０Ｂ〜Ｄは、可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体プラスポリ（Ｉ：Ｃ）による免疫化が、ＨＰＶの複数の遺伝子型に対して免疫応答を誘発することを示すグラフである。Ｃ５７Ｂ１／６（Ｂ）、またはＨＬＡ−Ａ２／Ｄ^ｂトランスジェニックマウス（Ｃ）は、１０ｕｇポリ（Ｉ：Ｃ）と組み合わせた１００ｕｇ Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質により連続４日間、毎日、免疫化した（ｓ．ｃ）。免疫化の８日後に、マウスを安楽死させ、バルク（ＢおよびＣ）またはＣＤ４除去脾細胞調製物（Ｂのみ）は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって分析した（ＣＤ４除去は、除去後にＦＡＣＳ分析によって測定されるように９９％を超えた）。バルクおよびＣＤ４除去脾細胞調製物は、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体にわたる重複する１５アミノ酸のペプチド（１１アミノ酸が重複する）のパネルにより一晩刺激した。Ｄ、１０ｕｇ ポリ（Ｉ：Ｃ）と組み合わせたＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質により免疫化した（ｓ．ｃ）Ｃ５７Ｂ１／６マウス由来の脾細胞は、培地のみ、または最小限のペプチドエピトープＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}、ＨＰＶ３１ Ｅ７_{４９〜５７}、もしくは無関係の対照ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）により一晩刺激し、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。結果は、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告し、３回のそのような実験を代表するものである。

【図11】図１１は、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体のみ（アジュバントなし）による、または連続４回の１日量のＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質のみ（アジュバントなし）による１回の免疫化に応じて誘発されたＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋_＋Ｔ細胞応答を示すグラフである。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスは、ＰＢＳ中、１００μｇの可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体により１回または４回（１〜４日目に毎日）免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。結果は、培地のみ、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}、または無関係のネガティブ対照ペプチド（それぞれ１０μｇ／ｍｌで）による刺激後、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。

【図12】図１２Ａ〜Ｏは、それぞれ、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、およびＨＰＶ８２由来のＥ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１〜１５）およびヌクレオチド配列（配列番号１８〜３２）を示す。 図１２Ｐ〜Ｑは、アミノ末端６×Ｈｉｓアフィニティータグを有する（配列番号１６）および有していない（配列番号１７）、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１２Ｒ〜Ｓは、アミノ末端６×Ｈｉｓアフィニティータグを有する（配列番号３４）および有していない（配列番号３３）、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質のヌクレオチド配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明は、部分的に、ヒトパピローマウイルスＥ７抗原化合物および組成物を提供する。化合物および組成物は、ヒトパピローマウイルス感染症および関連する状態を処置するまたは診断するのに有用であってもよい。

【0040】

一部の実施形態では、本発明による化合物および組成物は、ハイリスクＨＰＶ型などのような、複数のＨＰＶ型、たとえば少なくとも２以上のＨＰＶ遺伝子型を標的にするのに有用である。したがって、本発明による化合物および組成物は、化合物または組成物を構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）ＨＰＶ Ｅ７抗原またはＨＰＶ Ｅ７抗原に実質的に同一の配列が由来する１または２以上のＨＰＶ型に対する免疫応答を誘導するのに有用であってもよい。広範囲の人々への適用範囲を有するそのような化合物および組成物は、それらが、より大規模な集団に適用可能であるので、商業上、有用であり得る。

【0041】

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
「ヒトパピローマウイルス」または「ＨＰＶ」とは、関連するが遺伝的に別個の１００を超える一群の「型」に属するウイルスを意味し、「ローリスク」型と「ハイリスク」型に大きく分類することができる。

【0042】

「ローリスク」ＨＰＶ型は、限定を伴うことなく、ＨＰＶ型ＨＰＶ１１、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ７２、およびＨＰＶ８１を含む。

【0043】

「ハイリスク」ＨＰＶ型は、限定を伴うことなく、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、およびＨＰＶ８２を含む。

【0044】

ＨＰＶゲノムは、一般に、タンパク質カプシドに囲まれた約７０００〜８０００塩基対の環状二本鎖ＤＮＡである。ゲノムは、早期抗原Ｅ１〜Ｅ７をコードする初期（Ｅ）領域ならびに構造Ｌ１およびＬ２カプシドタンパク質をコードする後期（Ｌ）領域を有する。Ｅ６およびＥ７タンパク質は、感染細胞の形質転換および不死化に必要とされ、これらのタンパク質の継続的な発現は、形質転換状態に細胞を維持するために必要とされる。時々、ＨＰＶ ＤＮＡは、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれるようになり、このプロセスは、いくつかのウイルス遺伝子の損失と関連する。たとえば、組み込みは、一般的に、いくつかの初期（Ｅ２、Ｅ４、およびＥ５）ならびに後期（Ｌ１およびＬ２）遺伝子の欠失に至り、感染細胞において発現され続けるただ一つのウイルスタンパク質として、Ｅ６およびＥ７を残す。ＨＰＶゲノム配列は、記載されており、様々な公的なデータベースで利用可能である。そのような配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７１８（ＨＰＶ１６）、Ｘ０５０１５（ＨＰＶ１８）、Ｊ０４３５３（ＨＰＶ３１）、Ｍ１２７３２（ＨＰＶ３３）、Ｍ６２８４９（ＨＰＶ３９）、Ｘ７４４７９（ＨＰＶ４５）、ＮＣ＿００１５３３（ＨＰＶ５１）、Ｘ７４４８１（ＨＰＶ５２）、Ｘ７４４８３（ＨＰＶ５６）、Ｄ９０４００（ＨＰＶ５８）、ＮＣ＿００１６３５／Ｘ７７８５８（ＨＰＶ５９）、Ｘ６７１６１（ＨＰＶ６８）などで見出すことができるだろう。

【0045】

様々なＨＰＶ型由来のＥ７抗原の配列は、記載されており、様々な公的なデータベースで利用可能である。そのような配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４１３２６（ＨＰＶ１６ Ｅ７）、ＮＰ＿０４０３１１（ＨＰＶ１８ Ｅ７）、ＡＡＡ４６９５１（ＨＰＶ３１ Ｅ７）、ＡＡＡ４６９５９（ＨＰＶ３３ Ｅ７）、ＡＡＡ４６９６７（ＨＰＶ３５ Ｅ７）、ＡＡＡ４７０５１（ＨＰＶ３９ Ｅ７）、Ｐ２１７３６（ＨＰＶ４５ Ｅ７）、Ｐ２６５５８（ＨＰＶ５１ Ｅ７）、Ｐ３６８３１（ＨＰＶ５２ Ｅ７）、Ｐ３６８３３（ＨＰＶ５６ Ｅ７）、Ｐ２６５５７（ＨＰＶ５８ Ｅ７）、ＣＡＡ５４８５０（ＨＰＶ５９ Ｅ７）、Ｐ５４６６８ （ＨＰＶ６８ Ｅ７）、ＣＡＡ６３８８３（ＨＰＶ７３ Ｅ７）、およびＡＡＫ２８４５０（ＨＰＶ８２ Ｅ７）などで見出すことができるだろう。

【0046】

治療指標
本発明による化合物および組成物は、ＨＰＶ感染症またはそのような感染症と関連する状態を処置するために使用されてもよい。ＨＰＶ感染症は、限定を伴うことなく、尋常性疣贅（または乳頭腫）、癌などを含む様々な状態と関連する。一般に、ローリスクＨＰＶ型は、尋常性疣贅（または乳頭腫）と関連するが、ハイリスクＨＰＶ型は、癌と関連する。

【0047】

「癌」または「新生物」とは、生理学的機能を果たさない細胞のいかなる望ましくない増殖も意味する。一般に、新生物の細胞は、その正常な細胞分裂制御から解放される、つまり、細胞の環境において通常の生化学的および物理的作用によって増殖が調節されない細胞である。ほとんどの場合、新生細胞は、増殖して、良性または悪性の細胞のクローンを形成する。癌または新生物の例は、限定を伴うことなく、形質転換および不死化細胞、腫瘍、ならびに乳房細胞の癌腫および子宮頸部の癌腫などのような癌腫を含む。癌という用語は、実際面で良性であるが、悪性になる危険性を持つ細胞増殖を含む。「悪性疾患」とは、任意の細胞型または組織の異常増殖を意味する。悪性疾患という用語は、実際面で良性であるが、悪性になる危険性を持つ細胞増殖を含む。この用語はまた、任意の癌、癌腫、新生物、新形成、または腫瘍を含む。

【0048】

したがって、「ＨＰＶ感染症と関連する状態」とは、既存のＨＰＶ感染症の存在と関連しているいかなる状態、疾患、または障害も意味し、たとえば、既存のハイリスクＨＰＶ感染症の存在と関連している任意の状態、疾患、または障害を意味する。一部の実施形態では、ＨＰＶ感染症と関連する状態は、子宮頸部、下部生殖管もしくは下部肛門生殖管、皮膚、または口腔の状態、疾患、または障害を含む。

【0049】

一部の実施形態では、ＨＰＶ感染症と関連する状態は、子宮頸部、下部生殖管、または下部肛門生殖管の悪性および／または前悪性病変、たとえば、子宮頸部、肛門、外陰、膣、会陰、陰茎などの癌またはその前悪性病変を含む。代替の実施形態では、ＨＰＶ感染症と関連する状態は、肺、気道、上皮、頭頸部の癌、乳癌、口腔癌などまたはその前悪性病変を含む。

【0050】

代替の実施形態では、ＨＰＶ感染症と関連する状態は、前癌性の子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）分類１、２、または３、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶＡＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）などのような前悪性異形成状態を含む。

【0051】

一部の実施形態では、本発明による化合物および組成物は、ＨＰＶ感染症を診断するために使用されてもよい。代替の実施形態では、１または２以上の配列ＴＳＮＹＮＩＶＴＦ（配列番号３５）、ＡＥＰＤＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号３６）、またはＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣＱＣＫＳ（配列番号３７）を含むペプチドは、ＨＰＶ３１感染症を診断するまたはＨＰＶ３１に対するＨＰＶ３１ Ｅ７配列を含む化合物の免疫応答を決定するために使用されてもよい。その代わりに、１または２以上のＴＳＮＹＮＩＶＴＦ、ＡＥＰＤＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣ、またはＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣＱＣＫＳ配列は、ＨＰＶ３１感染症の可能性を除外するために使用されてもよい。

【0052】

ＨＰＶ Ｅ７化合物、試験化合物、およびそれを作製するための方法
本発明による化合物は、限定を伴うことなく、異なるＨＰＶ遺伝子型由来の２以上のＨＰＶ Ｅ７抗原のアミノ酸配列を含むポリペプチド、その類似体、変異体、相同体、およびその断片ならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む。一部の実施形態では、２以上のＨＰＶ Ｅ７抗原は、それらが由来する異なるＨＰＶ遺伝子型に対して、Ｔ細胞ＣＤ８＋応答などのような免疫応答を誘発することができるであろう。

【0053】

「タンパク質」、「ペプチド」、または「ポリペプチド」は、翻訳後修飾（たとえばグリコシル化またはリン酸化）に関係なく、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸またはアミノ酸類似体を含む、２以上のアミノ酸の任意の鎖である。本発明の「アミノ酸配列」、「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、異常連結、架橋、およびエンドキャップ、非ペプチジル結合、または代替の修飾基を有するペプチドまたはタンパク質を含んでいてもよい。そのような修飾もまた、本発明の範囲内にある。用語「修飾基」は、ペプチド構造に直接付加される構造（たとえば共有結合によって）およびペプチド構造に間接的に付加される構造（たとえば、コアペプチド構造の側面に位置してもよいさらなるアミノ酸残基またはそのミメティック、類似体、もしくは誘導体への安定した非共有結合によってまたは共有結合によって）を含むように意図される。たとえば、修飾基は、ペプチド構造のアミノ末端もしくはカルボキシ末端にまたはコアドメインの側面に位置するペプチドもしくはペプチドミメティック領域に結合することができる。その代わりに、修飾基は、ペプチド構造の少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖またはコアドメインの側面に位置するペプチドもしくはペプチドミメティック領域に結合することができる［たとえば、リシル残基（複数可）のイプシロンアミノ基を通して、アスパラギン酸残基（複数可）またはグルタミン酸残基（複数可）のカルボキシル基を通して、チロシル残基（複数可）、セリン残基（複数可）、もしくはトレオニン残基（複数可）のヒドロキシ基またはアミノ酸側鎖上の他の適した反応性基を通して］。ペプチド構造に共有結合される修飾基は、たとえばアミド、アルキルアミノ、カルバメート、または尿素結合を含む、化学構造を連結するための、当技術分野においてよく知られている、手段によって、および方法を使用して付加することができる。

【0054】

「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＲＮＡ（プラスおよびマイナス鎖）ならびにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（たとえば化学的合成）ＤＮＡを含むＤＮＡの両方を包含する。核酸は、二本鎖または一本鎖であってもよい。一本鎖である場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であってもよい。核酸分子は、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログもしくは誘導体を含む、２以上の共有結合ヌクレオチドの任意の鎖であってもよい。「ＲＮＡ」とは、２以上の共有結合した、天然に存在するリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語内に含まれる修飾ＲＮＡの１つの例は、ホスホロチオエートＲＮＡである。「ＤＮＡ」とは、２以上の共有結合した、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドの配列を意味する。「ｃＤＮＡ」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によってＲＮＡ鋳型から産生される、相補的またはコピーＤＮＡを意味する。したがって、「ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクター中に保持される、興味のあるＲＮＡ分子に対して相補的な二重鎖ＤＮＡ配列を意味する。「相補的」とは、２つの核酸、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡが、ワトソンクリック塩基対を形成して、２つの核酸の間で二重鎖の領域を産生することができる、十分な数のヌクレオチドを含有することを意味する。したがって、ＤＮＡまたはＲＮＡの一方の鎖におけるアデニンは、反対の相補的ＤＮＡ鎖におけるチミンまたは反対の相補的ＲＮＡ鎖におけるウラシルと対になる。核酸分子におけるそれぞれのヌクレオチドが、二重鎖を形成するために、反対の相補鎖におけるヌクレオチドとマッチするワトソンクリック塩基対を形成する必要がないことが理解されるであろう。核酸分子は、それが第２の核酸分子と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする場合、他の核酸分子に対して「相補的である」。本発明による核酸分子は、両方の相補的分子を含む。

【0055】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、またはＨＰＶ８２などのような異なるＨＰＶ型由来の２以上のＥ７抗原のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

【0056】

代替の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、またはＨＰＶ８２などのようなＨＰＶ型などのような異なるＨＰＶ型由来の３または４以上のＥ７抗原のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

【0057】

代替の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、またはＨＰＶ８２などのようなＨＰＶ型などのような異なるＨＰＶ型由来の４または５以上のＥ７抗原のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

【0058】

代替の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、またはＨＰＶ８２などのような異なるＨＰＶ型由来の５または６以上のＥ７抗原のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

【0059】

代替の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ５２などのような異なるＨＰＶ型由来の５つのＥ７抗原のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

【0060】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１〜１５の２以上のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0061】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１〜１５の３または４以上のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0062】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１〜１５の４または５以上のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0063】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１〜１５の５または６以上のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0064】

たとえば、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１６または１７のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0065】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１８〜３２の２以上のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

【0066】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１８〜３２の３または４以上のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

【0067】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１８〜３２の４または５以上のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

【0068】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号１８〜２２の５つすべてのヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

【0069】

たとえば、本発明による化合物は、限定を伴うことなく、配列番号３３または３４のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。

【0070】

「実質的に同一の」配列は、本明細書で論じる１もしくは２以上の保存的置換によってのみ参照配列と異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列、または当該アミノ酸配列によって発現されるかもしくは当該核酸分子によってコードされるポリペプチドのＴ細胞認識および／もしくはＨＬＡ結合を破壊しないか、もしくは実質的に低下させない配列の位置に所在する、１もしくは２以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によってのみ参照配列と異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列である。そのような配列は、たとえばＡｌｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（Myers and Miller, CABIOS, 1989, 4:11-17）またはＦＡＳＴＡを使用して、比較のために使用される配列に対してアミノ酸またはヌクレオチドレベルで最適にアライメントされた場合に、５０％〜９９％またはより一般には少なくとも５０％、５５％、もしくは６０％または少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％または９６％、９７％、９８％、もしくは９９％も同一の任意の値とすることができる。ポリペプチドについて、比較配列の長さは、少なくとも２、５、１０、もしくは１５アミノ酸または少なくとも２０、２５、もしくは３０アミノ酸であってもよい。交替の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも３５、４０、もしくは５０アミノ酸または６０、８０、もしくは１００アミノ酸超であってもよい。核酸分子について、比較配列の長さは、少なくとも５、１０、１５、２０、もしくは２５ヌクレオチドまたは少なくとも３０、４０、もしくは５０ヌクレオチドであってもよい。交替の実施形態では、比較配列の長さは、少なくとも６０、７０、８０、もしくは９０ヌクレオチドまたは１００、２００、もしくは５００ヌクレオチド超であってもよい。配列同一性は、公的に利用可能な配列分析ソフトウェアを使用して容易に測定することができる（たとえばＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅまたはＮａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅから利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェアまたは本明細書に記載のもの）。有用なソフトウェアの例は、プログラムＰｉｌｅ−ｕｐおよびＰｒｅｔｔｙＢｏｘを含む。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、置換、および他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、類似する配列をマッチさせる。

【0071】

その代わりにまたはさらに、２つの核酸配列は、それらが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、「実質的に同一」であってもよい。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、たとえば、６５℃の温度の、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含有する緩衝剤、または４２℃の温度の、４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ ＳＤＳを含有する緩衝剤において少なくとも５００ヌクレオチド長のＤＮＡプローブを使用して行われるハイブリダイゼーションと同等のハイブリダイゼーションを可能にする条件である（これらは、高ストリンジェンシーノーザンまたはサザンハイブリダイゼーションについての典型的な条件である）。ハイブリダイゼーションは、約２０〜３０分間もしくは約２〜６時間もしくは約１０〜１５時間の期間にわたって、または２４時間超にわたって実行されてもよい。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはまた、高ストリンジェンシーＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、一本鎖配座多形分析、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどのような、分子生物学者によってルーチン的に実行される多数の技術の成功にも依存する。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの技術は、比較的短いプローブにより通常実行される（たとえば、通常、ＰＣＲもしくは配列決定については約１６ヌクレオチドまたはそれより長く、また、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションについては約４０ヌクレオチドまたはそれより長く）。これらの技術において使用される高ストリンジェンシー条件は、分子生物学の当業者らによく知られており、それらの例は、たとえば、参照によってこれに組み込まれるAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1998において見出すことができる。

【0072】

一部の実施形態では、本発明による化合物は、天然のＨＰＶ Ｅ７抗原配列と実質的に同一の化合物を含む。したがって、本発明による化合物における使用のための配列は、配列番号１〜３４のいずれかまたは任意の他のＨＰＶ Ｅ７配列と実質的に同一の配列を含んでいてもよい。

【0073】

異なるＨＰＶ遺伝子型由来の少なくとも２以上のＥ７抗原配列が単一の分子において存在する限り、個々のＥ７抗原配列は、本発明による化合物のアミノ酸またはヌクレオチド配列において任意の順で存在してもよいことを理解されたい。一部の実施形態では、異なるＨＰＶ型由来の３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそれより多くの異なるＨＰＶ Ｅ７抗原は、本発明による化合物において使用されてもよい。

【0074】

例示的なＨＰＶ Ｅ７抗原配列順序づけは、表１に記載のものを含む。

【0075】

表１：５つのＨＰＶ型由来のＥ７配列の例示的な順列

【表1-1】

【表1-2】

【0076】

一部の実施形態では、Ｅ７抗原配列は、「天然に存在する」または「天然の」ものである、つまり、人工的に修飾されるのではなく天然の供給源から単離される。そのような供給源は、限定を伴うことなく、感染対象または他の供給源から得られる生物学的試料（たとえば血液、血清、血漿、精液、粘液、尿、口腔液、膣液、および子宮頸部の体液、婦人科試料、生検材料など）を含んでいてもよい。

【0077】

代替の実施形態では、化合物は、たとえば、他の保存的アミノ酸残基、つまり、類似する物理的、生物学的、または化学的特性を有する残基を用いて、本明細書に記載の任意のＨＰＶ型またはポリペプチド由来のＥ７抗原配列の任意の位置で、アミノ酸残基を交換し、欠失させ、または挿入し、かつ、たとえば、本明細書に記載のまたは当技術分野において知られているように、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する化合物の能力についてスクリーニングすることによって調製することができる。一部の実施形態では、天然のＥ７抗原の断片は、断片が、Ｔ細胞認識および／またはＨＬＡ結合を全く示さないわけではなく、またはそれが実質的に低下していない限り、本発明の範囲内で企図される。

【0078】

本明細書において使用されるように、用語「保存的アミノ酸置換」は、ペプチドにおける所定の位置でのあるアミノ酸の他のアミノ酸への置換を指し、置換は、適切な機能の実質的な損失を伴うことなく行うことができる。そのような変化を加える際に、類似のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的な類似性、たとえばそれらのサイズ、荷電、疎水性、親水性、およびその他同種のものに基づいて行うことができ、そのような置換は、ルーチン的な試験によってペプチドの機能に対するそれらの影響についてアッセイされてもよい。

【0079】

本明細書において使用されるように、用語「アミノ酸」は、一般的に、天然に存在するタンパク質中に見出されるＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、およびそれらが修飾された場合のアミノ酸を意味する。したがって、本発明のアミノ酸は、たとえば、２−アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；ベータ−アラニン；ベータ−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸；ピペリジン酸；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソ酪酸；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリシン；アロヒドロキシリシン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロイソロイシン；Ｎ−メチルグリシン；サルコシン；Ｎ−メチルイソロイシン；６−Ｎ−メチルリシン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチンを含んでいてもよい。

【0080】

一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換が、行われてもよく、アミノ酸残基は、類似する親水性値（たとえば、プラスもしくはマイナス２．０、またはプラスもしくはマイナス１．５、またはプラスもしくはマイナス１．０、またはプラスもしくはマイナス０．５の値の範囲内）を有する他のアミノ酸に置換され、次のものは、アミノ酸残基に割り当てられる、Ｔｙｒ（−１．３）またはＰｒｏ（−１．６）などのような約−１．６のヒドロパシー指数を有するアミノ酸となってもよい（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号において詳述される）：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；およびＴｒｐ（−３．４）。

【0081】

代替の実施形態では、保存的アミノ酸置換が、行われてもよく、アミノ酸残基は、類似するヒドロパシー指数（たとえば、プラスもしくはマイナス２．０、またはプラスもしくはマイナス１．５、またはプラスもしくはマイナス１．０、またはプラスもしくはマイナス０．５の値の範囲内）を有する他のアミノ酸に置換される。そのような実施形態では、アミノ酸残基はそれぞれ、以下のように、その疎水性および荷電の特徴に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられてもよい：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。

【0082】

代替の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、類似度マトリックスの公的に利用可能なファミリーを使用して行われてもよい（７３〜７９）。ＰＡＭマトリックスは、進化モデルから導き出される計算に基づくが、Ｂｌｏｓｕｍマトリックスは、アライメント内の高度に保存されたブロックから導き出される計算を使用する。ＰＡＭまたはＢｌｏｓｕｍマトリックスにおける０を超える類似性スコアは、保存的アミノ酸置換を行うために使用されてもよい。

【0083】

代替の実施形態では、保存的アミノ酸置換が、行われてもよく、アミノ酸残基は、同じクラスの他のアミノ酸に置換され、アミノ酸は、以下のように、無極性、酸性、塩基性、および中性のクラスに分類される：無極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ。

【0084】

保存的アミノ酸変化は、対応するＤ−アミノ酸による、保存的Ｄ−アミノ酸による、またはアミノ酸の天然に存在する、遺伝的にコードされない形態によるＬ−アミノ酸の置換およびＬ−アミノ酸の保存的置換を含むことができる。天然に存在する、遺伝的にコードされないアミノ酸は、ベータ−アラニン、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−ナフチルアラニン（２−ｎａｐｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、ベータ−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリシン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２，４，−ジアミノ酪酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、イプシロン−アミノヘキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸、または２，３−ジアミノ酪酸を含む。

【0085】

代替の実施形態では、保存的アミノ酸変化は、親水性もしくは疎水性、サイズもしくは容量、または荷電の考慮に基づく変化を含む。アミノ酸は、主としてアミノ酸側鎖の特性に依存して、疎水性または親水性として一般に特徴付けることができる。Eisenberg et al.（８０）の標準化コンセンサス疎水性スケールに基づいて、疎水性アミノ酸は、ゼロを超える疎水性を示し、親水性アミノ酸は、０未満の親水性を示す。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、およびＴｒｐを含み、遺伝的にコードされる親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓを含む。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸は、ｔ−ブチルアラニンを含み、遺伝的にコードされない親水性アミノ酸は、シトルリンおよびホモシステインを含む。

【0086】

疎水性または親水性アミノ酸は、それらの側鎖の特徴に基づいてさらに細分することができる。たとえば、芳香族アミノ酸は、少なくとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を含有する側鎖を有する疎水性アミノ酸であり、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ_２、−ＮＯ、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどのような１または２以上の置換基を含有してもよく、Ｒは、独立して、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルケニル、置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルケニル、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキニル、置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキニル、（Ｃ_５〜Ｃ_２０）アリール、置換（Ｃ_５〜Ｃ_２０）アリール、（Ｃ_６〜Ｃ_２６）アルカリール、置換（Ｃ_６〜Ｃ_２６）アルカリール、５〜２０員ヘテロアリール、置換５〜２０員ヘテロアリール、６〜２６員アルクヘテロアリール（ａｌｋｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）、または置換６〜２６員アルクヘテロアリールである。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐを含むが、遺伝的にコードされない芳香族アミノ酸は、フェニルグリシン、２−ナフチルアラニン、ベータ−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、および４−フルオロフェニルアラニンを含む。

【0087】

非極性アミノ酸は、生理的ｐＨで無電荷であり、２つの原子によって共同で共有される電子対が、一般に、２つの原子のそれぞれによって等しく保持される結合を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸である（つまり、側鎖は極性ではない）。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、およびＭｅｔを含むが、遺伝的にコードされない非極性アミノ酸は、シクロヘキシルアラニンを含む。非極性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸を含むようにさらに細分することができ、これは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅを含むが、遺伝的にコードされない脂肪族アミノ酸は、ノルロイシンを含む。

【0088】

極性アミノ酸は、生理的ｐＨで無電荷であり、２つの原子によって共同で共有される電子対が、一方の原子のそばに、より接近して保持される、１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸である。遺伝的にコードされる極性アミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎを含むが、遺伝的にコードされない極性アミノ酸は、シトルリン、Ｎ−アセチルリシン、およびメチオニンスルホキシドを含む。

【0089】

酸性アミノ酸は、７未満の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、典型的に、水素イオンの損失により生理的ｐＨで負荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕを含む。塩基性アミノ酸は、７を超える側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、典型的に、ヒドロニウムイオンとの関連により生理的ｐＨで正荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓを含むが、遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸は、非環式アミノ酸オルニチン、２，３，−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、およびホモアルギニンを含む。

【0090】

したがって、保存的置換は、限定を伴うことなく、以下の置換を含む。

【0091】

【表2】

【0092】

上記の分類が絶対的なものではなく、１種のアミノ酸が１つを超えるカテゴリーに分類されてもよいことは当業者によって十分に理解されるであろう。さらに、アミノ酸は、指定されるアッセイに基づいて、または以前に同定されたアミノ酸と比較して、知られている挙動および／または特徴的な化学的、物理的、もしくは生物学的特性に基づいて分類することができる。アミノ酸はまた、アミノ酸様側鎖を有する二機能性の成分を含むことができる。

【0093】

保存的変化はまた、たとえばアミノ酸の機能的な側鎖基の反応による、非誘導体化残基からの、化学的に誘導体化された成分への置換を含むことができる。したがって、これらの置換は、遊離アミノ基がアミンハイドロクロライド、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基に誘導体化された化合物を含むことができる。同様に、遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチル、およびエチルエステルまたは他のタイプのエステルもしくはヒドラジドを形成することができ、側鎖は、誘導体化されて、遊離ヒドロキシル基についてＯ−アシルもしくはＯ−アルキル誘導体を、またはヒスチジンのイミダゾール窒素についてＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。ペプチド類似体はまた、たとえばメチル化によって、エチルアミン、エタノールアミン、もしくはエチレンジアミンなどのようなアルキルアミンによるＣ末端アミノ酸のアミド化、またはアミノ酸側鎖のアシル化もしくはメチル化（リシンのイプシロンアミノ基のアシル化など）によって化学的に修飾されたアミノ酸をも含む。ペプチド類似体はまた、置換アミド［たとえば式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲの基、ここで、Ｒは、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルケニル、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキニル、置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルケニル、もしくは置換（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキニル］またはアミド連結の同配体［たとえば−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＨ_２Ｓ、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−、もしくは−ＣＨ_２ＳＯ−］とのペプチドにおけるアミド連結の交換を含むことができる。

【0094】

化合物は、たとえば重合またはコンジュゲーションによって共有結合して、ホモポリマーまたはヘテロポリマーを形成することができる。生理学的条件下で無電荷のアミノ酸などのような小さな中性分子から典型的に構成されるスペーサーおよびリンカーを使用することができる。連結は、多くの方法で達成することができる。たとえば、システイン残基はペプチド末端に追加されてもよく、複数のペプチドは制御された酸化によって共有結合することができる。その代わりに、ジスルフィド／アミド形成剤またはチオエーテル／アミド形成剤などのようなヘテロ二機能性の作用物質を使用することができる。化合物はまた、免疫応答を調整することができる他の化合物に連結することもできる。化合物はまた、たとえば環式部分を有することによって、制限されてもよい。

【0095】

ポリペプチド、ペプチド、またはペプチド類似体は、標準的な化学的技術によって、たとえば、溶相または固相合成方法を使用する自動合成によって合成することができる。自動ペプチド合成装置は、市販で入手可能であり、当技術分野においてよく知られている技術を使用する。ポリペプチド、ペプチド、およびペプチド類似体はまた、たとえばSambrook, et al.（８１）またはAusubel et al.（８２）に記載されているような標準的な方法を使用する組換えＤＮＡ技術を使用してそれらの対応する核酸分子から調製することもできる。

【0096】

一部の実施形態では、核酸分子は、作動可能に連結されてもよい。「作動可能に連結された」とは、適切な分子（たとえば転写活性化因子タンパク質）が調節配列（複数可）に結合している場合に遺伝子発現を可能にするような方法で、遺伝子および調節配列（複数可）がつながれていることを意味する。そのような作動可能に連結された配列は、発現のために宿主細胞の中に形質転換する、またはトランスフェクトすることができるベクターまたは発現コンストラクトの形態をしていてもよい。たとえばｐＥＴ１５ｂ（アンピシリン抵抗性）またはｐＥＴ２４ａ（カナマイシン抵抗性）などのような任意の適したベクターを使用することができる。

【0097】

「組換え」という用語は、あるものが組換えられていることを意味し、核酸コンストラクトに関する場合、用語は、分子生物学的技術の手段によってともにつながれる、または産生される核酸配列から構成される分子について言及する。タンパク質またはポリペプチドに関する場合の「組換え」という用語は、分子生物学的技術の手段によって生成された組換え核酸コンストラクトを使用して発現されるタンパク質またはポリペプチド分子について言及する。組換え核酸コンストラクトは、それが自然界ではライゲーションされていない、またはそれが自然界では異なる位置でライゲーションされている核酸配列にライゲーションされる、またはライゲーションされるようになるように操作されるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そのため、「組換え」としての核酸コンストラクトについての言及は、核酸分子が、遺伝子工学を使用して、つまり、ヒトの介入によって操作されていることを示す。組換え核酸コンストラクトは、たとえば、形質転換によって宿主細胞の中に導入されてもよい。そのような組換え核酸コンストラクトは、単離され、宿主種の細胞の中に再導入された、同じ宿主細胞種または異なる宿主細胞種に由来する配列を含んでいてもよい。組換え核酸コンストラクト配列は、宿主細胞の本来の形質転換の結果として、または続く組換えおよび／もしくは修復事象の結果として、宿主細胞ゲノムの中に組み込まれるようになってもよい。

【0098】

有用であるとして同定された化合物は、ＴＣ１モデルまたはＨＰＶ感染症についての任意の他の動物モデルを使用して続いて分析されてもよい。

【0099】

医薬および動物用医薬組成物、投与量、および投与
本発明の化合物は、哺乳動物、たとえばヒト、ウシ、ヒツジなどへの投与に適した形態で、リポソーム、アジュバント、または薬学的に許容できるキャリアなどのような任意のキャリアの存在下において、単独でまたは他の化合物（たとえば核酸分子、小分子、ペプチド、もしくはペプチド類似体）と組み合わせて提供することができる。

【0100】

本明細書において使用されるように、「薬学的に許容できるキャリア」または「賦形剤」は、生理学的に適合性の、任意のおよびすべての溶剤、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびにその他同種のものを含む。一実施形態では、キャリアは、非経口投与に適している。その代わりに、キャリアは、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下、または経口投与に適していてもよい。薬学的に許容できるキャリアは、滅菌注射用溶液または分散液の即席の調製用の滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質についてのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野においてよく知られている。いかなる従来の媒体または作用物質も活性化合物と不適合性である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補足の活性化合物もまた、組成物の中に組み込むことができる。

【0101】

従来の薬務は、ＨＰＶ感染症に罹患している対象、またはＨＰＶ感染症と関連する状態を発症する前の対象に化合物を投与するための適した製剤、または組成物を提供するために用いられてもよい。投与の任意の適切なルートとして、たとえば非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、室内、被膜内、脊髄内、鞘内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、局所的、または経口投与が、用いられてもよい。治療製剤は、液体溶液または懸濁液の形態をしていてもよく、経口投与については、製剤は、錠剤またはカプセルの形態をしていてもよく、鼻腔内製剤については、粉末、点鼻剤、またはエアロゾルの形態をしていてもよい。

【0102】

製剤を作製するための当技術分野においてよく知られている方法は、たとえば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（８３）において見出すことができる。非経口投与についての製剤は、たとえば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのようなポリアルキルエングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）を含有していてもよい。生体適合性で生物分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出を制御するために使用されてもよい。他の可能性として有用な非経口デリバリー系は、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透性ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームを含む。吸入についての製剤は、賦形剤、たとえばラクトースを含有していてもよい、またはたとえば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート、およびデオキシコレートを含有する水溶液であってもよい、または点鼻剤の形態でのもしくはゲルとしての投与のための油性溶液であってもよい。一般に、化合物は、障害に応じて、ＨＰＶ感染症と関連する状態を停止させるもしくは遅らせるのにまたはＨＰＶ感染症を処置するのに十分な量で個人に投与される。

【0103】

ワクチン製剤の場合には、本発明の化合物の有効量は、単独で提供するかまたは他の化合物と組み合わせて、免疫アジュバント、たとえばフロインド不完全アジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムヒドロキシド、または水酸化アルミニウムと組み合わせて提供することができる。

【0104】

代替の実施形態では、本発明による化合物は、ＴＬＲ３アゴニスト［たとえばポリ（Ｉ：Ｃ）およびその誘導体、ポリＡ：Ｕおよびその誘導体、合成ＲＮＡ分子、天然に存在するＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ、微生物の核酸など］もしくはＴＬＲ９アゴニスト（たとえばＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、微生物の核酸など）などのようなＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、インターフェロンアルファ、４−１ ＢＢ受容体のアゴニスト、ＣＤ４０受容体のアゴニスト、または抗ＣＤ４０抗体から選択されるアジュバントと組み合わせて提供されてもよい。

【0105】

化合物はまた、免疫原性を増強するために、キャリア、またはウシ血清アルブミンもしくはキーホールリンペットヘモシニアンなどのような他の分子と連結されてもよい。一部の実施形態では、化合物は、カルレティキュリン、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）、ユビキチン、細菌毒素、サイトカイン（インターロイキンなど）、イミダゾキノリン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｍｏｌｉｎｅ）などと共に提供されてもよい。

【0106】

一部の実施形態では、本発明による化合物または組成物は、所望によりキャリアおよび／またはアジュバントと共に、使用のための説明書と一緒にキットにおいて提供されてもよい。

【0107】

本発明による化合物の「有効量」は、治療有効量、免疫学的有効量、または予防有効量を含む。「治療有効量」は、ＨＰＶ感染症またはそのような感染症と関連する状態の処置などのような所望の治療結果を達成するために、必要な投与量および期間での有効な量について言及する。処置の結果は、たとえば、ＨＰＶウイルス血症の減少、ウイルス遺伝子発現の阻害、ＨＰＶ感染症と関連する病態の発生の遅延、免疫系の刺激、または治療上の利点を決定するための任意の他の方法によって測定されてもよい。化合物の治療有効量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重ならびに個人において所望の応答を誘発する化合物の能力などのような因子によって変動してもよい。投与計画は、最適な治療応答をもたらすように調整されてもよい。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が化合物のいかなる毒性または有害作用にも勝る量である。「免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）有効量」とは、Ｔ細胞ＣＤ８＋応答などのような免疫応答の刺激または誘発などのような所望の免疫の結果を達成するのに必要な投与量および期間での有効な量を意味する。一部の実施形態では、「免疫応答の刺激」または「免疫応答を刺激すること」とは、対照または参照試料または化合物と比較した場合の、約５％〜約９５％もしくは約１０％〜約９０％もしくは約３０％〜約６０％の任意の値のＴ細胞ＣＤ８＋応答などのような免疫応答の測定における増加、または１００％以上の増加を意味する。代替の実施形態では、「免疫応答の刺激」または「免疫応答を刺激すること」とは、対照または参照試料または化合物と比較した場合の、約２倍および約１０００倍もしくは約１０倍〜約５００倍もしくは約３０倍〜約１００倍の任意の値のＴ細胞ＣＤ８＋応答などのような免疫応答の測定における増加または１０００倍を超える増加を意味する。「予防有効量」は、ＨＰＶ感染症と関連する状態の発病の予防などのような所望の予防の結果を達成するのに必要な投与量および期間での有効な量について言及する。典型的に、予防用量は、疾患の初期段階に先立ってまたはその段階で対象において使用され、予防有効量は、治療有効量未満であってもよい。化合物の有効量に適した範囲は、たとえば、０．１ｎＭ〜０．１Ｍ、０．１ｎＭ〜０．０５Ｍ、０．０５ｎΜ〜１５μΜ、または０．０１ｎΜ〜１０μΜの任意の整数である。

【0108】

投与量の値は、緩和されるべき状態の重症度により変動してもよいことに注意されたい。任意の特定の対象については、特定の投与計画は、個人の必要性および組成物の投与を施す、または管理する人の専門的な判断によって、ある期間にわたって調整されてもよい。本明細書に記載の投与量の範囲は、例示的なものに過ぎず、医師によって選択されてもよい投与量の範囲を限定するものではない。組成物における活性化合物（複数可）の量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重などのような因子によって変動してもよい。投与計画は、最適な治療応答をもたらすように調整されてもよい。たとえば、１回のボーラスが、施されてもよい、いくつかの分けられた用量が、ある期間にわたって投与されてもよい。または用量は、治療上の状況の要件によって示されるように、比例して減量もしくは増量してもよい。投与のしやすさおよび投与量の均一性のために計量装置の形態で非経口組成物を製剤することは好都合であってもよい。

【0109】

代替の実施形態では、ＴＬＲアゴニストまたは他のアジュバントと組み合わせて、本発明による化合物を含む組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増強を誘発するために「クラスター」投薬レジメンにおいて提供されてもよい。「クラスター」投薬レジメンとは、短期間、つまり約１４日未満、たとえば約１日〜約４、５、６、７、または８日にわたる組成物の投与を意味する。一部の実施形態では、クラスター投薬レジメンは、短期間、つまり約１４日未満、たとえば約１日〜約４、５、６、７、または８日にわたる組成物の複数の１日量の投与を含む。

【0110】

所望される場合、本発明による化合物による処置は、ＨＰＶ感染症またはそのような感染症と関連する状態のための、より従来の既存の療法と組み合わせてもよい。たとえば、本発明による化合物は、必要に応じて、放射線療法、化学療法、または外科手術（たとえばＬＥＥＰ）と組み合わせて提供されてもよい。

【0111】

本発明による化合物は、長期にわたってまたは断続的に提供されてもよい。「長期にわたる」投与は、長期間の間、初期の治療効果（活性）を維持するための、急性のモードに対立するものとしての継続的なモードにおける作用物質（複数可）の投与について言及する。「断続的な」投与は、中断なしでは連続的に行われないが、どちらかと言えば、事実上、周期的な処置である。

【0112】

一般に、本発明の化合物は、実質的な毒性を引き起こさないで使用されるべきである。本発明の化合物の毒性は、標準的な技術を使用して、たとえば、細胞培養物または実験動物において試験し、治療指数、つまり、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＬＤ１００（集団の１００％に対して致死的な用量）の間の比を決定することによって決定することができる。しかしながら、重症疾患状態などの一部の状況においては、実質的過剰量の組成物を投与することが必要であり得る。

【0113】

以下の説明の全体にわたって、具体的な詳細は、本発明のより完全な理解をもたらすために記載されている。しかしながら、本発明は、これらの詳細なしで実施され得る。他の実例として、よく知られている要素は、本発明を不必要に不明瞭にすることを避けるため、詳細に示されていないか、または記載されていない。したがって、本明細書および図面は、制限的な意味ではなく、説明的な意味で考慮されたい。

【0114】

本発明は、以下の実施例においてさらに例証される。

【実施例1】

【0115】

Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質の調製および精製
ＨＰＶ株１６、１８、３１、４５、および５２のＥ７腫瘍性タンパク質は、イー・コリにおいて完全長組換えタンパク質（「Ｐｅｎｔａｒｉｘ」と呼ばれる）として産生した（図１Ａ）。ある研究において、それぞれのＨＰＶ１６、１８、３１、４５、および５２由来の完全なＥ７タンパク質プラスアミノ末端６×ＨＩＳアフィニティーＴＡＧおよびトロンビン切断部位を含む単一の連続ＤＮＡを、合成ＤＮＡコンストラクトとして産生した（図１Ｂ）。多重遺伝子配列は、発現ベクターｐＥＴ１７およびｐＥＴ２４ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に続いてクローニングし、切断可能な６×ＨＩＳアフィニティーＴＡＧを有する完全長タンパク質（Ｐｅｎｔａｒｉｘ）を、イー・コリ遺伝子型ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて発現させた。

【0116】

手短に言えば、ｐＥＴ１７コンストラクトの場合にはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プラスクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有し、ｐＥＴ２４ａコンストラクトの場合にはカナマイシン（３４ｕｇ／ｍｌ）プラスクロラムフェニコール（３４ｕｇ／ｍｌ）を含有する５ｍｌのＬＢ培地に、組換えイー・コリの単一のコロニーを接種し、一晩、増殖させ、飽和させた。翌朝、５ｍｌの培養物は、ｐＥＴ１７コンストラクトの場合にはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プラスクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有し、ｐＥＴ２４ａコンストラクトの場合にはカナマイシン（３４ｕｇ／ｍｌ）プラスクロラムフェニコール（３４ｕｇ／ｍｌ）を含有する１０００ｍｌのＬＢ培地に接種するために使用した。１０００ｍｌの培養物における増殖が、０．２〜０．４のＯＤ_６００に達したら、ＩＰＴＧを２ｍＭの最終濃度まで培養物に追加し、組換えタンパク質の発現を可能にするために、さらに２〜３時間、増殖を続けた。細菌は、続いて、遠心分離によってペレットにし、３０ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、６Ｍ尿素、１ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁した。細菌は、凍結および解凍の２つの連続のサイクル、その後に続く超音波処理の４回の連続のサイクル（サイクル当たり３０秒）によって溶解した。デブリおよび不溶性タンパク質は、可溶性溶解物溶液を精製するために、１５，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によって除去した。切断可能な６×アフィニティータグを有するＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質は、ＡＫＴＡカラムクロマトグラフイーシステムに取りつけられたアフィニティーカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過させることによって、可溶性溶解物から精製した。溶解バッファーによる大規模な洗浄後に、切断可能な６×アフィニティータグを有するＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質は、５００ｍＭイミダゾールを含有する溶解バッファーを使用してカラムから溶離した。次いで、切断可能な６×アフィニティータグを有するＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質を含有する溶離画分は、プールし、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質の最終溶液を精製するために、組織培養グレードのリン酸緩衝食塩水を４回交換して透析した。タンパク質発現および精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に様々な中間および最終画分を流し、クーマシーブルー染色または抗６×ＨＩＳタグ抗体（ＡＢＭ）もしくは抗ＨＰＶ １６Ｅ７抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するウエスタンブロットを介してタンパク質を可視化することによってモニターした。（図１Ｃ）。精製タンパク質は、ＰＢＳ中で完全に可溶性であり、５９，０３７Ｄａのその予測される分子量に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動した（図１Ｃ）。

【実施例2】

【0117】

外因性タンパク質抗原に対するＣＤ８応答
外因性ＯＶＡタンパク質全体プラスＴＬＲ３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）またはポリＩＣ／ＬＣによる免疫化に応じて誘発される、ＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８＋_＋Ｔ細胞応答を決定するための研究を行った。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（条件当たり２匹のマウス）は、ＯＶＡタンパク質全体（５００μｇ）プラスまたはマイナスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）またはポリＩＣ／ＬＣ（１０μｇ／ｍｌ）により免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、免疫化マウスのバルク脾細胞におけるＯＶＡ_{２５７〜２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって定量した。結果は、培地のみ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）、または無関係のＨ２Ｄｂ結合ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。結果は、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリＩＣ／ＬＣがインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において同等のアジュバント活性を有することを示唆する（図２Ａ）。

【0118】

他の研究において、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（用量当たり２匹のマウス、合計１８匹のマウス）は、示された量の可溶性ＯＶＡタンパク質全体プラスポリ（Ｉ：Ｃ）により免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、バルク脾細胞調製物は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。個々の動物由来の脾細胞（ウェル当たり３×１０^５、条件当たり三通りのウェル）は、培地のみ、またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０ｕｇ／ｍｌ）により一晩、刺激し、結果は、それぞれのコホートについて、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数＋／−ＳＤとして報告する（図２Ｂ）。

【実施例3】

【0119】

投薬レジメン
長いか、または短い間隔（クラスター）の相応する初回刺激−追加免疫化に応じて誘発されるＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を以下のように決定した。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（条件当たり２匹のマウス）は、−７日目、−２１日目、または−７日目および−２１日目に、ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）により免疫化し、０日目に安楽死させた。免疫化マウスのバルク脾細胞におけるＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって定量した。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（条件当たり３匹のマウス）もまた、示された数の連続的な１日量の、ポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）と混合した可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）により免疫化した。マウスのさらなる１つの群は、通常の１日量の４倍に等しい量で１回の免疫化を受けた［つまり、４００μｇのＯＶＡタンパク質プラス４０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）］。第１の免疫化の７日後に、マウスは、安楽死させ、ＯＶＡ_{２５７〜２６４}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。図３ａおよびｂにおける結果は、培地のみ、またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスはまた、図３ｃにおいて示されるように、１回の用量または連続４回の１日量の可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）によっても免疫化した。連続４回の１日量のＯＶＡタンパク質プラスポリ（Ｉ：Ｃ）を受けたマウスは、第１のラウンドの免疫化の模倣の４７日後から、さらに連続４回の１日量の同じものにより再度免疫化した。末梢血は、免疫化後の示された日に連続的に採血した個々のマウスの伏在静脈から得た。末梢血中のＲＢＣを溶解し、リンパ球は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８およびＰＥコンジュゲートＨ−２Ｋｂ／ＯＶＡ_{２５７〜２６４}四量体により染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図３ｃおよびｄに示す事象は、ＣＤ８＋リンパ球に対してゲート制御したものであり、代表的な１匹の動物由来のものであり、ある期間にわたる所定の動物内の抗原特異的Ｔ細胞応答の進展についての正確なモニタリングを可能にする。ワクチン接種のこの第２のラウンド後に、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、一次免疫後に達成されたものよりもさらに高度なレベルまで増殖し、第２の免疫化の７日以内に末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の５２％に達した（図３ｄ）。したがって、後の時点で誘発された二次応答は、クラスターワクチン接種によって誘発された一次応答よりもかなり強力であった。

【0120】

他の研究において、モデル抗原ＯＶＡにより観察されるように、４用量のＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質プラスポリ（Ｉ：Ｃ）による免疫化は、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のみによる免疫化と比較して、強いＣＤ８免疫応答を誘発した（図３ｅ）。

【0121】

他の研究において、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たり３匹のマウス）に、０日目に、ＯＶＡ発現ＥＧ７癌細胞（１×１０^５）を移植し、図４に示すように、指定の期間、未処置のままとした、または１用量のポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）、１用量の可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）、または４回の連続的な１日量の可溶性ＯＶＡタンパク質全体（１００μｇ）プラスポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ）により処置した。各群の処置の時の平均腫瘍容量は、２２４ｍｍ^３［ポリ（Ｉ：Ｃ）のみ］、１９４ｍｍ^３［１用量のＯＶＡ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）］、または３４４ｍｍ^３［４用量のＯＶＡ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）］であった。最後のコホートのマウスは、連続的な毎日の免疫化の有益な効果を例示するために、腫瘍サイズがより大きい時期に意図的に処置した。

【実施例4】

【0122】

Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質の１回の用量または複数の用量による免疫化
マウス（ナイーブＣ５７Ｂ１／６）は、未処置のままとするか、または１０μｇのＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙＩ−Ｃ（ＡｍｅｒｓｈａｍもしくはＳｉｇｍａ）（図５Ａ）もしくはＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−２３９５（オリゴ＃２３９５、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合した１００μｇの組換えＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質により、もしくはＣｐＧオリゴのみ（図６Ａ）により皮下に免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、脾臓を切除した。脾細胞の単細胞浮遊液は、５ｍｌの注射器のプランジャーを使用して７０ｕＭフィルターを通して脾臓をつぶすことによって、１０ｍｌのｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０ｕＭ ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭピルビン酸ナトリウム）中に調製した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭＳＩＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体（ＡＮ１８−Ｍａｂｔｅｃｈ）により一晩あらかじめ被覆し、次いで、ｃＲＰＭＩにより３７℃で２時間ブロックした。脾細胞（ウェル当たり３×１０^５細胞）は、いかなる刺激もない状態で（培地のみ）、ＨＰＶ１６由来の１０μｇ／ｍｌのＨ−２Ｄ^ｂ拘束性Ｅ７_{４９〜５７}ペプチド、または無関係のＨ２Ｄ^ｂ結合対照ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＣ）の存在下において、三通り、平板培養した。３７℃での一晩のインキュベーション後に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ（ｍＡｂ Ｒ４−６Ａ２、Ｍａｂｔｅｃｈ）と共に３７℃で２時間インキュベートし、メーカーの指示（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）に従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ＥｌｉｔｅキットおよびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＥＣ基質試薬による発色を続けた。スポットは、市販のＥＬＩＳＰＯＴ計算サービス（Ｚｅｌｌｎｅｔ）を使用して定量した。結果は、培地のみ、培地プラスＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}ペプチド、または無関係のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）の存在下において培養した場合の１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として示す。

【0123】

他の研究（図７Ａ）において、マウス（ナイーブＣ５７Ｂ１／６）は、未処置のままとするか、または１０μｇのＴＬＲ３アゴニストポリＩ−Ｃ（ＡｍｅｒｓｈａｍもしくはＳｉｇｍａ）と混合した１００μｇの組換えＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質により、１回もしくは４回（１〜４日目に毎日）、皮下に免疫化した。複数回の連続する毎日の免疫を受けるマウスは、およそ２４時間の間隔で免疫化した。最初の免疫化の７日後に、マウスは、安楽死させ、脾臓を切除した。脾細胞の単細胞浮遊液は、５ｍｌの注射器のプランジャーを使用して７０ｕＭフィルターを通して脾臓をつぶすことによって、１０ｍｌのｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０ｕＭ ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭピルビン酸ナトリウム）中に調製した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭＳＩＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、１０μｇ／ｍｌ抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体（ＡＮ１８−Ｍａｂｔｅｃｈ）により一晩あらかじめ被覆し、次いで、ｃＲＰＭＩにより３７℃で２時間ブロックした。脾細胞（ウェル当たり３×１０^５細胞）は、いかなる刺激もない状態で（培地のみ）、または１０μｇ／ｍｌ Ｅ７_{４９〜５７}ペプチドの存在下において三通り平板培養した。３７℃での一晩のインキュベーション後に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ（ｍＡｂ Ｒ４−６Ａ２、Ｍａｂｔｅｃｈ）と共に３７℃で２時間インキュベートし、メーカーの指示（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）に従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ＥｌｉｔｅキットおよびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＥＣ基質試薬による発色を続けた。スポットは、市販のＥＬＩＳＰＯＴ計算サービス（Ｚｅｌｌｎｅｔ）を使用して定量した。結果は、培地のみ、または培地プラスＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}ペプチドの存在下において培養した場合の１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として示す。

【0124】

他の研究において、発明者らは、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質プラスポリ（Ｉ：Ｃ）の４回連続の用量を受けるマウスにおいて、末梢血における１１％までのＣＤ８ Ｔ細胞および脾臓における２２％までのＣＤ８ Ｔ細胞が、Ｈ−２Ｄ^ｂ ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}四量体によりポジティブに染色されたことを発見した（図７Ｃ）。この研究において、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞は、４用量のＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質のみにより免疫化したマウスの脾臓において検出可能ではなく、研究条件下でのＣＤ８ Ｔ細胞増殖のためのアジュバントの重要性を示す。

【0125】

他の研究（図８Ａ）において、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たり３匹のマウス）に、−１４日目に、Ｅ７発現ＴＣ１腫瘍細胞（マウス当たり１×１０^５）を左の側腹部の皮下に移植した。０日目に（腫瘍のサイズはおよそ２００ｍｍ^３に達した）、マウスは、未処置のままとした、またはポリＩ−Ｃのみ（１０μｇ）もしくはＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質（１００ｇ）プラスＴＬＲ３アゴニストポリＩ−Ｃ（１０μｇ）の１回の接種により処置した（首筋皮下に）。Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質（１００μｇ）プラスＴＬＲ３アゴニストポリＩ−Ｃ（１０μｇ）（図８Ａ、右のパネル）により免疫化したマウスは、腫瘍を完全に退縮させ、研究の間（６０日間）、腫瘍ができなかった。腫瘍は、２〜３日ごとに、電子デジタルキャリパーを使用して測定し、容量は、式 幅^２×長さ×０．５を使用して計算し、腫瘍容量がおよそ２０００ｍｍ^３に達したら、ＣＣＡＣ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）ガイドラインに従って、腫瘍ができているマウスを安楽死させた。

【0126】

他の研究において、ＴＣ−１腫瘍細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含有するｃＲＰＭＩ中で６０〜８０％の培養密度まで増殖させ、０．２５％トリプシンへの短時間の暴露によって収集し、ｃＲＰＭＩによる中和を続けた。ＴＣ−１腫瘍細胞（マウス当たり１×１０^５）を、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスの左側腹部皮下に移植し、腫瘍増殖は、２〜３日ごとに電子キャリパーで腫瘍を測定することによってモニターした。腫瘍容量は、式 幅^２×長さ×０．５を使用して計算した。腫瘍容量が２０００ｍｍ^３を超過したら、ＣＣＡＣ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）ガイドラインに従って、腫瘍ができているマウスを安楽死させた。

【0127】

この研究において、クラスターワクチン接種によって引き起こされたＥ７特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のレベルの増加はまた、Ｅ７発現（ｅｘｐｒｅｓｉｎｇ）ＴＣ１腫瘍を退縮させる能力をも改善し、これは、処置の開始に先立って、通常よりも大きなサイズまで腫瘍を増殖させた場合に実証された（図８Ｂ）。処置の時に３５０ｍｍ^３の平均容量を有する腫瘍を持っていたマウスは、１回の用量または連続４回の１日量のＰｅｎｔａｒｉｘプラスポリ（Ｉ：Ｃ）により免疫化した。１回の用量のワクチンを受けた８匹のマウスのうちの５匹は、一時的な（不完全であるが）腫瘍退縮を示し、未処置マウスまたはポリ（Ｉ：Ｃ）のみにより処置したマウスと比較して、生存の時間を有意に改善した。しかしながら、１回の用量のワクチンを受けたマウスはすべて、最終的に、進行性の腫瘍増殖のために死んだ。対照的に、４回連続の用量のＰｅｎｔａｒｉｘプラスポリ（Ｉ：Ｃ）を受けたマウスのうち、１００％（８匹のうち８匹）が、これらの大きな腫瘍を、それらがもはや触知可能でないという段階まで完全に退縮させた。いくつかの腫瘍は、処置の４〜５週間後に再発し始めたが、４用量のコホートにおけるマウスの７５％（８匹のうち６匹）は３８日目になお生きており、５０％は腫瘍ができなかった。他のすべてのコホートにおけるマウスはすべて、この時点までに進行性の腫瘍増殖により安楽死させた。

【0128】

ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスにＥ７発現ＴＣ１腫瘍細胞を移植した他の研究において、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質プラスポリＩ：ＣによるＴＣ１腫瘍ができているマウスの免疫化が、完全な腫瘍退縮および腫瘍退縮後に持続するＥ７特異的ＣＤ８記憶細胞の確立を誘発した（図８Ｃ）。

【0129】

他の研究（図９Ａ）において、ＨＰＶ Ｅ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞（マウス当たり１×１０^５細胞）は、−２１日目に、ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウス（コホート当たり４匹のマウス）の左の側腹部皮下に移植した。０日目に（腫瘍のサイズはおよそ２００ｍｍ^３に達した）、マウスは、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質（１００μｇ）プラス１０μｇのＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ ２３９５（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）もしくは１０μｇのＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ ２３９５のみ（Ｐｅｎｔａｒｉｘなし）の１回の接種（首筋皮下に）により処置するか、または未処置のままとした。Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質（１００μｇ）プラス１０μｇのＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ ２３９５により免疫化したマウスは、腫瘍を完全に退縮させ、研究の間、腫瘍ができなかった。腫瘍増殖は、２〜３日ごとに腫瘍をキャリパーで測定することによってモニターし、腫瘍容量は、式 幅^２×長さ×０．５を使用して計算し、腫瘍容量がおよそ２０００ｍｍ^３に達したら、ＣＣＡＣ（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）ガイドラインに従って、腫瘍ができているマウスを安楽死させた。

【0130】

定着したＥ７発現腫瘍を退縮させるそれらの能力の点から、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質プラスこれらのアジュバントによる１回の免疫化によって誘発されたＣＤ８ Ｔ細胞のエフェクター機能を評価するための他の研究において、ＨＰＶ１６ Ｅ７発現ＴＣ−１腫瘍を、ナイーブレシピエントマウスの皮下に移植し、腫瘍がおよそ２００ｍｍ^３の容量に達するまで増殖させた。ポリ（Ｉ：Ｃ）またはＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合したＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質により皮下に免疫化した動物は、概して免疫化の１週間以内にこれらの腫瘍を退縮させ始めた（図９Ｂ）。この研究において、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質プラスアジュバントにより免疫化した動物はすべて、免疫化の３週後までに完全に腫瘍を退縮させ、少なくとも３か月間、腫瘍ができなかった。対照的に、未処置のままとしたか、またはアジュバントのみもしくはＰｅｎｔａｒｉｘタンパク質のみにより処置したマウスは、進行性の腫瘍増殖を示し、過度の腫瘍量により安楽死させた（概して、腫瘍移植の２８日以内に）。

【0131】

要約すれば、ＯＶＡタンパク質により観察されたように、Ｐｅｎｔａｒｉｘは、ＴＬＲ３（図５Ａおよび５Ｂ）またはＴＬＲ９（図６Ａおよび６Ｂ）のアゴニストと混合した場合に、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性の免疫応答を誘発した。さらに、モデル抗原ＯＶＡにより観察されたように、連続的な毎日（クラスター）の免疫化戦略の適用は、Ｐｅｎｔａｒｉｘによって誘発されるＣＤ８＋免疫応答を実質的に増強した（図７Ａ〜Ｃ）。Ｐｅｎｔａｒｉｘはまた、アジュバントなしでもＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性の免疫応答を誘発した（図１１）。

【0132】

Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質によるワクチン接種によって誘発された免疫応答は、ワクチン接種の数日間以内に、定着したＴＣ−１腫瘍を退縮させることができた（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、および９Ｂ）。これは、Ｐｅｎｔａｒｉｘをポリ（Ｉ：Ｃ）（図８Ａ、８Ｂ、および９Ｂ）またはＣｐＧオリゴヌクレオチド（図９Ａおよび９Ｂ）と組み合わせた場合に該当した。２つの異なる実験において、定着したＴＣ−１腫瘍の完全なまたはほぼ完全な退縮は、Ｐｅｎｔａｒｉｘを受けたすべてのマウスにおいて達成されたのに対して、対照マウス（処置なしまたはアジュバントのみ）の１００％が、進行性に増殖する腫瘍のために死んだ。

【実施例5】

【0133】

Ｐｅｎｔａｒｉｘは、ＨＰＶ３１ Ｅ７エピトープに対する免疫を誘発する
ナイーブＣ５７Ｂ１／６マウスを、１０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と混合した１００μｇの可溶性Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質全体により免疫化した。免疫化の７日後に、マウスを安楽死させ、２つの異なる予測ＭＨＣ結合アルゴリズム（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩおよびＩＥＤＢ）を使用して同定したペプチドに対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量するために、バルク脾細胞調製物をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。結果は、培地のみ、または示されたペプチド（１０μｇ／ｍｌ）による刺激後の、１×１０^６脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞の数として報告する。ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}ペプチドの長い（１４アミノ酸および２０アミノ酸）ならびに短い（９アミノ酸）バージョンの両方は、両方のアルゴリズムで最も高度なＨ２Ｄ_ｂスコアを有するＨＰＶ３１由来の候補ペプチド（ＨＰＶ３１ Ｅ７_{２５２〜２６０}−ＴＳＮＹＮＩＶＴＦ；配列番号３５）と同様に、免疫化マウスから応答を誘発することが発見された（図１０Ａ）。この発見は、ＨＰＶ３１ Ｅ７についての新しいエピトープを示し、ＰｅｎｔａｒｉｘがＨＰＶ３１ Ｅ７エピトープに対する免疫を誘発することを実証する。

【実施例6】

【0134】

Ｐｅｎｔａｒｉｘは、ＨＰＶの複数の遺伝子型に対する免疫応答を誘発する
Ｐｅｎｔａｒｉｘによって誘発される細胞性免疫応答の範囲を評価するために、Ｐｅｎｔａｒｉｘプラスポリ（Ｉ：Ｃ）により免疫化したマウス由来のバルク脾細胞およびＣＤ４除去脾細胞は、Ｐｅｎｔａｒｉｘタンパク質配列全体にわたる重複１５アミノ酸のペプチドのライブラリーと共に、ＥＬＩＳＰＯＴによってｅｘ ｖｉｖｏにおいて直接分析した。望ましい場合には、ＣＤ４細胞は、磁気による除去を使用して、バルク脾細胞から除去した。手短に言えば、バルク脾細胞は、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ４抗体（クローンＬ３Ｔ４；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により染色し、標識された細胞は、メーカーの指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に従って、抗ＰＥマイクロビーズを使用して除去した。図１０Ｂに示されるように、ＰｅｎｔａｒｉｘによってＣ５７Ｂ１／６マウスにおいて誘発された応答は、ワクチン内に含有されるＨＰＶ株の５つすべてを網羅した。十分に特徴付けられているＨ−２Ｄ^ｂ拘束性エピトープＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号３８）を含有するペプチドは、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の絶対数の点から最も強力な応答を含んだ。次に最も強力な応答は、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{４９〜５７}よりもＨ−２Ｄ^ｂに対してさらに強力なバインダーであるとアルゴリズム分析によって予測される関連するペプチド（ＴＳＮＹＮＩＶＴＦ；配列番号３５）を包含するＨＰＶ３１由来の１５アミノ酸のペプチドによって誘発された。他のＨＰＶ Ｅ７タンパク質配列由来の様々な１５アミノ酸のペプチドもまた、バルクおよびＣＤ４除去脾細胞の両方から様々な強度の応答を誘発し、Ｐｅｎｔａｒｉｘが、限られたレパートリーのＭＨＣ分子を有する近交系マウスにおいてでさえ、広範囲の細胞性免疫応答を誘発することができることを確認した。さらに、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（ＨＬＡ−Ａ２／Ｄ^ｂ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、株＃００４１９１）もまた、Ｐｅｎｔａｒｉｘプラスポリ（Ｉ：Ｃ）により免疫化し、重複１５アミノ酸のペプチドの同じライブラリーを使用して、ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。興味深いことには、応答の全体的な強さは、ＨＬＡ−Ａ２／Ｄ^ｂマウスよりもＣ５７Ｂ１／６において大きかったが、応答の全体の複雑性は、非常に類似し（図１０Ｃ）、Ｈ２^ｂ拘束性の応答は誘発されたが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性の応答は誘発されなかったことを示唆した。さらに、ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原を使用する多くの他の研究において観察されたように、発明者らは、Ｐｅｎｔａｒｉｘプラスポリ（Ｉ：Ｃ）により免疫化したマウスにおいてＨＰＶ１６ Ｅ７のＨＬＡ−Ａ２拘束性１１〜２０または８６〜９３最小ペプチドエピトープに対する応答を検出することができなかった。

【0135】

ＴＳＮＹＮＩＶＴＦ（配列番号３５）が、強力に反応性のＨＰＶ３１ １５アミノ酸のペプチドＡＥＰＤＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣ（配列番号３６）およびＴＳＮＹＮＩＶＴＦＣＣＱＣＫＳ（配列番号３７）内の正確な最小エピトープであることを確認するために、Ｐｅｎｔａｒｉｘプラスポリ（Ｉ：Ｃ）により免疫化したマウス由来の脾細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴによって評価し、この９アミノ酸の最小ペプチドに対して応答性であることを発見した（図１０Ｄ）。

【0136】

他の実施形態
本発明の様々な実施形態が、本明細書において開示されるが、多くの修正および修飾は、当業者らの共通の一般知識に従って本発明の精神および範囲内で成されてもよい。そのような修飾は、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するための、本発明の任意の態様からの知られている等価物への置換を含む。本明細書において使用される受託番号は、ヌクレオチド配列についてのＧｅｎＢａｎｋ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＥＭＢＬ）、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、またはＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＧＳＤＢ）を含み、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＲＦ）、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（解明された構造からの配列）を含む複数のデータベース、ならびにポリペプチド配列についてのＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、またはＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列由来の注釈付きのコード領域由来の翻訳物からの受託番号を指すものであり得る。数値の範囲は、範囲を定める数およびその中に包含される部分範囲を含める。本明細書において使用されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、または、「有する（ｈａｓ）」という用語は、無制限の用語として使用され、「を含むが、これらに限定されない」という語句と実質的に等価である。「その（ｔｈｅ）」、「１つの（ａ）」、および「１つの（ａｎ）」などのような用語は、単数形または複数形を示すものとして解釈されたい。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術となることを自認するものとして解釈されるものではない。すべての刊行物は、個々の刊行物が、参照によって本明細書に組み込まれるように明確におよび個々に示されるように、また、あたかも、本明細書において完全に記載されるように、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明は、上記に概ね記載された実施形態および変形形態、ならびに実施例および図面に関するすべてを含む。

【0137】

本発明は、１または２以上の実施形態に関して記載された。しかしながら、多くの変形形態および変更形態を、請求項において定められる本発明の範囲から逸脱することなく成すことができることは、当業者らに明らかであろう。

【0138】

文献

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図12-6】

【図12-7】

【図12-8】

【図12-9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]