特許 5965389 クロストリジウム・ディフィシル関連感染症および疾患を治療するための抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5965389

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】クロストリジウム・ディフィシル関連感染症および疾患を治療するための抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/02 20060101AFI20160721BHJP

   C07K 16/12 20060101ALI20160721BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 5/20 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160721BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 31/4164 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 31/4188 20060101ALI20160721BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160721BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 CZNA

   C07K16/12

   C07K16/46

   C12N5/20

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

   A61K39/395 R

   A61K45/00

   A61K31/4164

   A61K31/4188

   A61K48/00

【請求項の数】39

【全頁数】128

(21)【出願番号】特願2013-505183(P2013-505183)

(86)(22)【出願日】2011年4月15日

(65)【公表番号】特表2013-523190(P2013-523190A)

(43)【公表日】2013年6月17日

(86)【国際出願番号】US2011032713

(87)【国際公開番号】WO2011130650

(87)【国際公開日】20111020

【審査請求日】2014年4月14日

(31)【優先権主張番号】61/324,503

(32)【優先日】2010年4月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/381,669

(32)【優先日】2010年9月10日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-9692

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-9693

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-9694

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-9888

(73)【特許権者】

【識別番号】512228509

【氏名又は名称】プロゲニクス ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＧＥＮＩＣＳ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】マア，ダンシエ

(72)【発明者】

【氏名】ナガシマ，カーステン

(72)【発明者】

【氏名】ケネディー，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ドノバン，ジェラルド，ピー．

(72)【発明者】

【氏名】カン，ユン

(72)【発明者】

【氏名】オルソン，ウィリアム，シー．

(72)【発明者】

【氏名】クマール，サンカー

(72)【発明者】

【氏名】鶴下 直也

(72)【発明者】

【氏名】マロジャン，アンドレ，ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】キュポ，アルバート

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５３３３３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Infect. Immun., (2006), 74, [11], p.6339-6347

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＰＡ−４１もしくはその抗原結合性断片、モノクローナル抗体ＰＡ−４１のキメラ形態もしくはその抗原結合性断片、またはモノクローナル抗体ＰＡ−４１のヒト化形態もしくはその抗原結合性断片を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項2】

抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体ＰＡ−４１である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項3】

単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項4】

単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、該抗体またはその抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合し、ＶＨが、配列番号８または配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＶＬが、配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項5】

単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、該抗体またはその抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合し、ＶＨが、配列番号８のアミノ酸残基３１〜３６を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸残基５０〜６６を含むＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸残基９９〜１０８を含むＣＤＲ３を含み、ＶＬが、配列番号１０のアミノ酸残基２４〜３４を含むＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸残基５０〜５６を含むＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸残基８９〜９７を含むＣＤＲ３を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項6】

Ｌ鎖のＶ領域が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み、および／またはＨ鎖のＶ領域が、配列番号８または配列番号９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項7】

二重特異性抗体またはその抗原結合性断片であって、
（ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する抗体の抗原結合性断片を含む第一抗原結合領域；および
（ｉｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する抗体の抗原結合性断片を含む第二抗原結合領域
を含む、前記二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項8】

請求項７に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合性断片であって、第二抗原結合領域が、
（ａ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の可変重鎖（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに可変軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む抗体の抗原結合性断片；または
（ｂ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む抗体の抗原結合性断片；または
（ｃ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む抗体の抗原結合性断片
を含む、前記二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項9】

ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。

【請求項10】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする、単離された核酸。

【請求項11】

配列番号２３または配列番号２５に記載の配列を有する、請求項１０に記載の単離された核酸。

【請求項12】

請求項１０または１１に記載の核酸を含む、発現ベクター。

【請求項13】

請求項１０または１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターを発現するために操作された、宿主細胞。

【請求項14】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、請求項７または８に記載の二重特異性抗体、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、および／または請求項１３に記載の宿主細胞、ならびに取扱説明書を含む、キット。

【請求項15】

キメラまたはヒト化形態である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項16】

ＣＨ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭから選択される、および／またはＣＬ領域が、κまたはλアイソタイプから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項17】

ＣＨ領域がＩｇＧ１である、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項18】

ＣＬ領域が、λまたはκアイソタイプから選択される、請求項１〜６および１５〜１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項19】

抗原結合性断片が、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片から選択される、請求項１〜６および１５〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項20】

ＥＣ_５０値が１．１^−１１Ｍ〜６．５^−１０Ｍであることを理由に判断して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株のトキシンＢを中和する、請求項１〜６および１５〜１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項21】

請求項１〜６および１５〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、請求項７または８に記載の二重特異性抗体、請求項１０または１１に記載の核酸、請求項１２に記載の発現ベクター、および／または請求項１３に記載の宿主細胞を含む、組成物。

【請求項22】

薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤、または溶媒をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

（ｉ）請求項１〜６および１５〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、および（ｉｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片を含む、組成物。

【請求項24】

請求項２３に記載の組成物であって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が、
（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の可変重鎖（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに可変軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；または
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；または
（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３
を含む、前記組成物。

【請求項25】

少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

少なくとも１つの追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニン、またはこれらの組み合わせである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療に使用するための、請求項１〜６および１５〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項28】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療に使用するための、請求項７または８に記載の二重特異性抗体。

【請求項29】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療に使用するための、請求項１０または１１に記載の核酸。

【請求項30】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療に使用するための、請求項１２に記載のベクター。

【請求項31】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療に使用するための、請求項１３に記載の宿主細胞。

【請求項32】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療に使用するための、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療のための医薬剤の調製における、請求項１〜６および１５〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。

【請求項34】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療のための医薬剤の調製における、請求項７または８に記載の二重特異性抗体の使用。

【請求項35】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療のための医薬剤の調製における、請求項１０または１１に記載の核酸の使用。

【請求項36】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療のための医薬剤の調製における、請求項１２に記載のベクターの使用。

【請求項37】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療のための医薬剤の調製における、請求項１３に記載の宿主細胞の使用。

【請求項38】

被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）の治療のための医薬剤の調製における、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項39】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢによる、細胞に対する毒性を阻害または中和する、ex vivoでの方法であって、前記細胞を、有効クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ阻害もしくは中和用量の抗体またはその抗原結合性断片、および有効クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ阻害もしくは中和用量の請求項１〜６および１５〜２０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片、請求項７または８に記載の二重特異性抗体、または請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の組成物に曝露することを含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条に基づき、２０１０年４月１５日にファイルされた米国仮特許出願第６１／３２４５０３号および２０１０年９月１０日にファイルされた同第６１／３８１６６９号の優先権の利益を主張するものであり、それぞれの内容全体を本明細書に援用する。

【0002】

本発明は、広義には、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌への感染が原因となり得る、Ｃ．ｄｉｆｆ．関連下痢症（ＣＤＡＤ）などのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の症状および病理の治療に用いることが可能な組成物および治療法に関する。本発明はさらに、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢのエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片、このような抗体を含む組成物ならびに、この抗体または組成物の使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（またはＣ．ｄｉｆｆ．）は、院内（病院で獲得される）抗生剤関連下痢症および偽膜性大腸炎の主な原因となっているグラム陽性で胞子形成性の嫌気性細菌である。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症は、米国内で年間の合計で７５０，０００を超える症例があると推定され、他の腸感染の合計よりも死因として多くなっている（１）。多くの病院で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、患者にとってはメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）または他のどの細菌よりも大きなリスクとなっている（２）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患（ＣＤＡＤ）を管理するための年間のコストは、米国内で推定３２億ドルを超える（３）。病原性または抗生剤耐性が高まったクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株が最近流行したことで、治療の失敗、再発の頻発、死亡率の増加などにつながっている（４）。

【0004】

ＣＤＡＤは一般に、クリンダマイシン、セファロスポリン、フルオロキノロンなどの抗生剤を用いることで結腸細菌叢が破壊されて誘発される。（３，８）このような結腸微小環境の混乱が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子への曝露とあいまって、コロニー形成につながる。コロニー形成が起こった全患者の約３分の１でＣＤＡＤが発症し（９）、これが重症の下痢症、結腸穿孔、結腸切除、死を引き起こし得る（１０）。ＣＤＡＤは、腸がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染してこれが増殖した後に生じるが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌は腸で、ＣＤＡＤの２つの重要な病原因子であるトキシンＡおよびトキシンＢを産生する。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡとＢは、配列および構造の点でかなりの相同性を示す。どちらも複数の繰り返し配列を含むＣ末端受容体結合ドメイン、中央の疎水性のドメイン、Ｎ末端グルコシルトランスフェラーゼドメインを有する。受容体結合ドメインは、ヒトではあまり規定されていないままの宿主受容体を介した腸上皮細胞へのトキシンの結合を媒介する。エンドソーム経路による内部移行後、中央の疎水性ドメインがエンドソームの膜に入り込む。エンドソームの酸性のｐＨがポア形成の引き金となり、トキシンのアミノ末端ドメインがサイトゾルに移動する。細胞質標的Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓのグルコシル化によって、細胞骨格の破壊と細胞死が引き起こされる。トキシンＡおよびＢは、疾患を引き起こす可能性のある相乗効果を持つ異なる病理学的プロファイルを示す。

【0005】

最近、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株が流行したことで、重症の疾患の率が上がり、再発頻度が増し、死亡率も高まっている。高病原性株のひとつであるＢＩ／ＮＡＰ１／０２７ ｔｏｘｉｎｔｏｙｐｅ ＩＩＩは、歴史的に珍しいが現在は流行している。Ｂ１／ＮＡＰ１／０２７などの高病原性株は、非クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株よりも数倍多くのトキシンＡおよびトキシンＢを産生し、このような株による疾患を感染後に治療しにくいものとしている。高病原性株が、一般に用いられている抗菌剤や抗生剤に対して耐性を持つことが、これらの株による疾患を治療・阻止しにくくする大きな問題となっているため、高病原性に対処し、高病原性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）分離株に関連した疾患の再発をなくすための別の治療手法とさらに強力な治療法が必要である。

【0006】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する現行の抗生剤治療には、バンコマイシンおよび／またはメトロニダゾールを用いることを含む。しかしながら、反応率が不完全で再感染や再発率が高まることから、これらの抗生剤には制約がある。２０００年以降、メトロニダゾール療法の失敗率が実質的に高くなっていることが報告されている（２３〜２５）。抗生剤治療後の再発率の高さは、正常な結腸細菌叢が破壊されつづけ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に、ほとんど競争なく回復する機会を与えていることによる可能性がある（２６〜２８）。一度再発の経験がある患者で再発のリスクが増し、最初の発症後の約２０％から２回以上の再発後の６０％を超える比率に増している。（２９、３０）この再発リスクの増加は、適切な抗トキシン抗体反応を開始できなかったことと関連している。（３１）特に、抗菌療法の最後に血清ＩｇＧ抗トキシンの力価が最も高い患者では、再発率が下がっていた。（３２）別の研究では、血清抗トキシンＢ抗体レベルが、再発性ＣＤＡＤからの保護と相関していた。（３３）

【0007】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の罹患率は着実に増えており、特に虚弱であることの多い高齢者で増えている。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症患者の約３分の１で、通常は最初の疾病から２か月以内に感染が再発する。感染を繰り返すと、もとの疾患よりも重症になりやすく、死に至ることも多くなる。高齢の成人や免疫系の弱い人々が特に再発感染にかかりやすい。適時に適切な治療をしないと、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の合併症には、結腸の破裂と死にいたりかねない脱水症、腎不全、腸穿孔、中毒性巨大結腸を含む。

【0008】

米国で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症は、入院患者がかかる最も一般的な感染症であるが、地域社会における院外でかかることもある。毎年、米国の地域社会で２０，０００例のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染が起こると推定されている。国際的には、出現率には極めてばらつきがあり、診断を確定するのに内視鏡検査を用いる頻度、抗菌剤の使用パターン、疫学的なパターンをはじめとする、複数の要因に左右される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

よって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症によって引き起こされる疾患が、院内環境と地域社会全体の両方で、あらゆる年齢の人々の生活を危険にさらしていることは明らかである。昨今の世界には、入院する患者や病院で長期間にわたって手当を受ける患者に、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のリスクが絶えず存在する。病院外の環境でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症にかかることもあるため、幼い子どもや赤ちゃんが疾患にかかる可能性が大きい。また、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に用いられている現在の抗生剤治療計画が、最適に効果的とはいえない可能性もある。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のある患者には、広範囲におよぶ入院患者のケアが必要で、長期間病院に入院しなければならない。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患患者に求められる、病院で高度な支援的ケアと治療を受けることに伴うコストは大きく、医師や看護要員の人数が多くなる、研究室での試験と監視、併用医薬剤、追加の支援的測定などのために、高価な資源を必要とする。

【0010】

結果として、予防および治療上の利点を得るために、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって引き起こされる生命をおびやかす疾患、特に、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって産生される強力なトキシンを標的とした一層効果的な医薬剤、医薬品、治療薬に需要がある。耐性が生じる可能性を抑え、患者の反応と疾患からの回復が成功する可能性を高め、疾患の根絶につながる、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患に対する成功して長続きする治療に対する、いまだ対処されていない医療上の需要がある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、少なくとも部分的に、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体および／またはトキシンＢ抗体を含む新規な抗体試薬および組成物を提供するものである。この試薬および組成物には、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連感染および疾患で悩んでいる、数が増え続ける被検体を治療し、生活の質を改善し、ＣＤＡＤおよびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症から回復させ、これらの感染個体の生存を助ける上で利点があり得る。

【0012】

一態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する結合と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。

【0013】

もうひとつの態様では、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。

【0014】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する結合と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。

【0015】

もうひとつの態様では、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を中和する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片が、０．１〜１０００μｇの量で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を中和する。

【0016】

もうひとつの態様では、モノクローナル抗体ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号９６９２）またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、モノクローナル抗体ＰＡ−５０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４）またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、モノクローナル抗体ＰＡ−３８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８）またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、モノクローナル抗体ＰＡ−４１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３）またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。

【0017】

さらに別の態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む発現ベクターが得られる。さらに別の態様では、上述した、あるいは本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片の重鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む発現ベクターが得られる。さらに別の態様では、上述した、あるいは本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む発現ベクターが得られる。さらに別の態様では、上述した、あるいは本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合断片の重鎖またはその一部と、軽鎖またはその一部とをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む発現ベクターが得られる。

【0018】

もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するいずれかの発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合断片のいずれかをコードするプラスミドが得られる。

【0019】

もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を中和する、抗体または抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片が、０．１μｇ〜１０００μｇまたは１μｇ／ｋｇ〜１００，０００μｇ／ｋｇの量で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を中和する。もうひとつの実施形態では、単離された抗体または抗原結合性断片が、０．５μｇ〜１０００μｇまたは５μｇ〜２５０μｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇから選択される量で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を中和する。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号９６９２）またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体ＰＡ−５０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４）またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体ＰＡ−３８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８）またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。

【0020】

もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を中和する、抗体または抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性断片が、０．５μｇ〜１０００μｇ、０．５μｇ、５μｇ、４０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、１０００μｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇから選択される量で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を中和する。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号９６９２）またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体ＰＡ−４１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３）またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。

【0021】

もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合するおよび／またはこれを中和する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に投与されると、ＣＤＡＤを処理および／または被検体の生存性を高める、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体またはその断片を同時に投与する。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体またはその断片を異なる時点で投与する。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体またはその断片を逐次投与する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＡに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＢに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。

【0022】

もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合するおよび／またはこれを中和する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に投与されると、ＣＤＡＤを処理および／または被検体の生存性を高める、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体またはその断片を同時に投与する。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体またはその断片を異なる時点で投与する。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体またはその断片を逐次投与する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＡに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＢに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。

【0023】

もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に投与されると、ＣＤＡＤを処理および／または被検体の生存性を改善する、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片を、１μｇ〜１０００μｇまたは１μｇ〜２５０μｇまたは５μｇ〜１００μｇの量で投与し、抗トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片の用量を、０．１μｇ〜１０００μｇ．または１μｇ〜２５０μｇまたは５μｇ〜１００μｇの量で投与する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＡに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＢに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。

【0024】

もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に投与されると、ＣＤＡＤを処理および／または被検体の生存性を改善する、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片を、５０ｍｇ／ｋｇの量で投与し、抗トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片を、５０ｍｇ／ｋｇの量で投与する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＡに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンＢに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。

【0025】

もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に投与されると、治癒するまたは生存率を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にする、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片を、４０〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で、２日ごとに４回投与する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたモノクローナル抗体のうちの１つ以上の、トキシンＡに対する結合と交差競合するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２またはＰＴＡ−９６９３で寄託されたモノクローナル抗体のうちの１つ以上の、トキシンＢに対する結合と交差競合するモノクローナル抗体である。

【0026】

もうひとつの態様では、本明細書で説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体または抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体のうちの１つ以上の形態をとるか、あるいはその１つ以上から選択される、抗体またはその抗原結合性断片が得られる。

【0027】

もうひとつの態様では、本明細書で説明するような単離された抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体または抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体またはその抗原結合性断片が、二重特異性抗体または二官能性抗体の形態をとるか、あるいは．二重特異性抗体または二官能性抗体からなるものである。

【0028】

（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび／または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインと、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび／または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片が得られる。

【0029】

もうひとつの態様は、抗体が、（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび／または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインと、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび／または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片を提供するものである。

【0030】

さまざまな実施形態では、上述し、かつ本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片であって、抗原結合性断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片から選択される抗体またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体またはその抗原結合性断片が単鎖抗体であるか単鎖抗体を含む、抗体またはその抗原結合性断片が得られる。

【0031】

もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明の抗体またはその抗原結合性断片の１つ以上と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。一実施形態では、組成物が、少なくとも１種類の本発明の抗トキシンＡ抗体、たとえば、ｍＡｂ ＰＴＡ−９６９２、ｍＡｂ ＰＴＡ−９６９４、ｍＡｂ ＰＴＡ−９８８８、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、少なくとも１種類の本発明の抗トキシンＢ抗体、たとえば、ｍＡｂ ＰＴＡ−９６９２、ｍＡｂ ＰＴＡ−９６９３、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態とを含む。一実施形態では、組成物が、本発明の１種類の抗トキシンＡ抗体、たとえば、ｍＡｂ ＰＴＡ−９８８８、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、本発明の１種類の抗トキシンＢ抗体、たとえば、ｍＡｂ ９６９３、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態とを含む。一実施形態では、組成物が、本発明の１種類の抗トキシンＡ抗体、たとえば、ｍＡｂ ＰＴＡ−９６９４、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、本発明の１種類の抗トキシンＢ抗体、たとえば、ｍＡｂ ９６９３、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態とを含む。一実施形態では、各ｍＡｂが、組成物中に同一の量で存在する。一実施形態では、各ｍＡｂが、互いに重量で１：１の比で組成物中に存在する。一実施形態では、各ｍＡｂが、組成物中に異なる量で存在する。一実施形態では、各ｍＡｂが、互いに重量で１：１以外の比で組成物中に存在し、その比については本明細書に記載してある。一実施形態では、組成物が、追加の治療剤をさらに含む。一実施形態では、追加の治療剤が、抗生剤、抗菌、殺菌、静菌剤またはこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシンまたはこれらの組み合わせである。

【0032】

もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明の発現ベクターと、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明の発現ベクターを持つ宿主細胞と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明のプラスミドと、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む組成物が得られる。

【0033】

もうひとつの態様は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢを結合するための結合部位を含む少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、少なくとも１つのポリペプチド鎖が、第１の重鎖可変ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメインまたはその一部を含み、少なくとも１つのポリペプチド鎖が、第１の軽鎖可変ドメイン、第２の軽鎖可変ドメイン、軽鎖定常ドメインまたはその一部を含み、ポリペプチド鎖を含む可変ドメインが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢに対する機能的結合部位を形成する、結合タンパク質が得られる。一実施形態では、結合タンパク質の第１の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する機能的結合部位を形成し、結合タンパク質の第２の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する機能的結合部位を形成する。一実施形態では、結合タンパク質の第１の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する機能的結合部位を形成し、結合タンパク質の第２の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する機能的結合部位を形成する。一実施形態では、結合タンパク質がＦｃ領域を含む。一実施形態では、結合タンパク質が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの毒性を中和する。さまざまな実施形態では、結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴で測定した場合の少なくとも１０^２Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^３Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１；または少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１から選択される、トキシンＡまたはトキシンＢに対する結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。さまざまな実施形態では、結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴で測定した場合の最大で１０^−３ｓ^−１；最大で１０^−４ｓ^−１；最大で１０^−５ｓ^−１；または最大で１０^−６ｓ^−１から選択される、トキシンＡまたはトキシンＢに対する解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。さまざまな実施形態では、結合タンパク質が、最大で１０^−７Ｍ；最大で１０^−８Ｍ；最大で１０^−９Ｍ；最大で１０^−１０Ｍ；最大で１０^−１１Ｍ；最大で１０^−１２Ｍ；または最大で１０^−１３Ｍから選択される、トキシンＡまたはトキシンＢに対する解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

【0034】

もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような結合タンパク質と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。一実施形態では、組成物が、追加の治療剤をさらに含む。一実施形態では、組成物の追加の治療剤が、抗生剤、抗菌、殺菌、静菌剤またはこれらの組み合わせである。一実施形態では、組成物の追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせである。

【0035】

もうひとつの態様では、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９３、ＰＴＡ−９４９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託された、ハイブリドーマ細胞株が得られる。

【0036】

もうひとつの態様は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のある被検体を治療する方法であって、本明細書に記載の少なくとも１種類の組成物を被検体に投与することを含む、方法を提供するものである。一実施形態では、組成物が、本発明の抗体、好ましくはヒト化形態の抗体を１種類以上含む。一実施形態では、組成物が、ヒト化形態での本明細書に記載の少なくとも１種類の抗トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片と、ヒト化形態での本明細書に記載の少なくとも１種類の抗トキシンＢ抗体とを含む。さまざまな実施形態では、１つ以上の追加の治療用試薬、医薬品、化合物または成分を組成物中に含有させてもよい。一実施形態では、組成物が、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、溶媒または賦形剤をさらに含む。一実施形態では、組成物を、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、たとえば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）を治療するのに有効な量で投与する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患を治療するのに有効な量で、２種類の組成物を被検体に投与する。一実施形態では、２種類の組成物を同時に投与する。一実施形態では、２種類の組成物を異なる時点で投与する。

【0037】

もうひとつの態様は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢによる、細胞に対する毒性を阻害または中和する方法であって、細胞を、有効クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ阻害用量または中和用量の本発明による抗トキシンＡモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片および有効クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ阻害用量または中和用量の本発明による抗トキシンＢモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片に曝露することを含む、方法を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体は、ヒト化形態のものである。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体が、キメラ形態のものである。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、同時に投与する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、異なる時点で投与する。この方法の一実施形態では、細胞が被検体に存在し、抗体またはその抗原結合性断片を、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢを阻害または中和するのに有効な量で被検体に投与する。

【0038】

もうひとつの態様は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンによる細胞の毒性を阻害または中和する方法であって、細胞を、有効クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン阻害用量または中和用量の本明細書で説明するような本発明の組成物少なくとも１種類に曝露することを含む、方法を提供するものである。この方法の一実施形態では、細胞を、有効クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン阻害用量または中和用量の２種類の組成物に曝露し、一方が抗トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片を含み、他方が抗トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片を含む。一実施形態では、抗体がヒト化されている。一実施形態では、抗体がキメラである。実施形態では、２種類の組成物を同時に投与するか、異なる時点で投与する。一実施形態では、細胞が被検体に存在し、少なくとも１つの組成物を、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンを阻害または中和するのに有効な量で被検体に投与する。

【0039】

もうひとつの態様は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株によって産生されるトキシンを中和する方法であって、（ｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに結合してこれを中和する本発明の抗体またはその抗原結合性断片と、（ｉｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに結合してこれを中和する本発明の抗体またはその抗原結合性断片とを、高病原性株によって産生されるトキシンを中和するのに有効な量で、それが必要な被検体に投与することを含む、方法を提供するものである。一実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）の抗体がヒト化抗体である。一実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）の抗体がキメラ抗体である。実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、同時に投与するか、異なる時点で投与する。一実施形態では、高病原性株のトキシンが、トキシンＡおよびトキシンＢである。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株が、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７、ＣＣＬ６７６、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ４５、ＣＤ１９６、ｍｏｎｔｒｅａｌ ５またはｍｏｎｔｒｅａｌ ７．１のうちの１つ以上である。一実施形態では、抗トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片が、ＥＣ_５０値が２．６^−１２Ｍ〜７．７^−１１Ｍまたは７．７^−１２Ｍ〜４．８^−８Ｍであることを理由に判断して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株によって産生されるトキシンＡに対する中和活性を有する。一実施形態では、抗トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片が、ＥＣ_５０値が１．１^−１１Ｍ〜６．５^−１０Ｍであることを理由に判断して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株によって産生されるトキシンＢに対する中和活性を有する。

【0040】

もうひとつの態様では、本発明による、本明細書で説明するような抗体、特にヒト化形態の抗体またはその抗原結合性断片と、取扱説明書とを含む、キットが得られる。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片が、キットの同一の容器に収容される。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片キットの別の容器に収容される。一実施形態では、キットが、抗体またはその抗原結合性断片をコンジュゲートするためのリンカーをさらに含む。一実施形態では、キットが、抗生剤、抗菌剤、殺菌剤または静菌剤であってもよい追加の治療剤を含む。一実施形態では、追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド_、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせである。

【0041】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株のトキシンＡまたはトキシンＢを中和するモノクローナル抗体、特にヒト化形態のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４、ＰＴＡ−９８８８、またはＰＴＡ−９６９３で示され、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４、ＰＴＡ−９８８８またはＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される。一実施形態では、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４、ＰＴＡ−９８８８、ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体が、ヒト化されているか、キメラ形態である。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株が、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７、ＣＣＬ６７６、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ４５、ＣＤ１９６、ｍｏｎｔｒｅａｌ ５、ｍｏｎｔｒｅａｌ ７．１のうちの１つ以上である。

【0042】

もうひとつの態様では、無症状であるが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症にかかりやすいか罹患するリスクがある被検体を治療する方法であって、（ｉ）本明細書で提供し、説明する抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片と、（ｉｉ）本明細書で提供し、説明するような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片とを、被検体を治療するのに有効な量で被検体に投与することを含む、方法が得られる。この方法の一実施形態では、被検体が入院している。

【0043】

もうひとつの態様では、ヒト化クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対して生成されるモノクローナル抗体が得られる。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。

【0044】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対して作製されたヒト化モノクローナル抗体が得られる。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、ヒトＣＨ領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域と、ヒトＣＬ領域とを含有する。

【0045】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片が得られる。配列番号１４で示される抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１５に示す（図３８Ｂ）。配列番号１６で示される抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１７に示す（図３８Ａ）。

【0046】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片が得られる。配列番号１８で示される抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１９に示す（図３９Ｂ）。配列番号２０で示される抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２１に示す（図３９Ａ）。

【0047】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片が得られる。配列番号２２で示される抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２３に示す（図４０Ｂ）。配列番号２４で示される抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２５に示す（図４０Ａ）。

【0048】

上述した本発明のヒト化モノクローナル抗体のいずれかを対象とするさまざまな実施形態において、モノクローナル抗体のＣＨ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭから選択される。一実施形態では、ＣＨ領域がＩｇＧ１である。一実施形態では、ＣＬ領域が、κアイソタイプまたはλアイソタイプから選択される。一実施形態では、ＣＬ領域がκアイソタイプのものである。他の実施形態では、本明細書で説明するような、ヒト化抗体のＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、あるいはその抗原結合性断片が、本発明による生成物および方法でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに結合および／またはこれを中和することを包含する。

【0049】

もうひとつの態様では、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体またはその断片であって、Ｌ鎖のＶ領域が、配列番号３、配列番号４、配列番号７のうちの１つ以上から選択される配列を含む、抗体またはその断片が得られる。また、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体またはその断片であって、Ｌ鎖のＶ領域が配列番号１０に記載の配列を含む、抗体またはその断片も得られる。また、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体またはその断片であって、Ｈ鎖のＶ領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６のうちの１つ以上から選択される配列を含む、抗体またはその断片も得られる。また、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ抗体またはその断片であって、Ｈ鎖のＶ領域が、配列番号８または配列番号９のうちの１つ以上から選択される配列を含む、抗体またはその断片も得られる。

【0050】

もうひとつの態様では、（ｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する結合と交差競合するか、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、トランスロケーションドメインなど、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡの受容体結合ドメイン外の領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。

【0051】

もうひとつの態様では、（ｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する結合と交差競合するか、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのＣ末端受容体結合エピトープなどの受容体結合ドメインに少なくとも２つの部位を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。

【0052】

もうひとつの態様では、（ｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する結合と交差競合するか、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのＣ末端受容体結合エピトープを含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。

【0053】

もうひとつの態様では、（ｉ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する結合と交差競合するか、（ｉｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのＮ末端酵素ドメインを含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのＮ末端酵素ドメインを含むトキシンＢのカスパーゼ１処理によって生成される６３ｋＤａの断片を含む。一実施形態では、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのトランスロケーションドメインを含む。

【0054】

一実施形態では、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２ので寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、トキシンＢのカスパーゼ１処理によって生成された１６７ｋＤａの断片と、未処理のトキシンＢを含む６３ｋＤａのタンパク質と、を含む。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。

【0055】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡまたはトキシンＢに結合してこれを中和するモノクローナル抗体を作製する方法であって、１匹以上のレシピエント動物を、不活性トキソイドＡで一定間隔で免疫し、この動物を、活性トキシンＡまたは活性トキシンＢの量を増して一定間隔でブーストし、好適な不死化細胞株に融合させた、免疫してブーストした動物の免疫細胞からハイブリドーマ細胞を得ることを含み、ハイブリドーマ細胞が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに結合してこれを中和する抗トキシンＡ抗体またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに結合してこれを中和する抗トキシンＢ抗体を産生して分泌する、方法が得られる。一実施形態では、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ中和モノクローナル抗体および／または抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ中和モノクローナル抗体が単離されている。この方法の実施形態では、免疫するステップとブーストするステップが、アジュバントを含む。一実施形態では、アジュバントがＱｕｉｌ Ａである。この方法の他の実施形態では、免疫するステップとブーストするステップを、３週間ごとの一定間隔で実施する。他の実施形態では、レシピエント動物を２用量または３用量のトキソイドＡで免疫した後、活性トキシンＡまたは活性トキシンＢのいずれかの用量を増量して３〜５回ブーストする。

【0056】

もうひとつの態様では、トキシンＡの内部移行と細胞毒性（ｃｙｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を阻害、ブロックまたは防止することによって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡの毒性を阻害、ブロックまたは防止する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である。一実施形態では、抗体が、ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２）またはヒト化ＰＡ−３９である。一実施形態では、抗体が、ＰＡ−５０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６４）またはヒト化ＰＡ−５０である。他の実施形態では、抗体が、ＰＡ−３９、ヒト化ＰＡ−３９、ＰＡ−５０またはヒト化ＰＡ−５０の、トキシンＡに対する結合と競合する。一実施形態では、抗体が、トキシンＡの受容体結合ドメイン外のトキシンＡの領域における単一部位に結合する。一実施形態では、抗体が、トキシンＡの受容体結合ドメイン外のトキシンＡの領域における単一部位に結合することによって、ＰＡ−３９またはそのヒト化形態と競合する。一実施形態では、抗体が、トキシンＡの受容体結合ドメインの少なくとも２つの部位に結合する。一実施形態では、抗体が、トキシンＡの受容体結合ドメインの少なくとも２つの部位に結合することによって、ＰＡ−５０またはそのヒト化形態と競合する。一実施形態では、抗体が、混合−競合的作用機序によってトキシンＡの毒性を阻害する。一実施形態では、抗体が、競合的作用機序によってトキシンＡの毒性を阻害する。上記の実施形態はいずれも、抗体の抗原結合性断片を包含するものとする。

【0057】

もうひとつの態様では、トキシンＢのＮ末端酵素領域のエピトープ部位に結合することによって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢの毒性を阻害、ブロックまたは防止する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である。一実施形態では、抗体がＰＡ−４１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３）またはＰＡ−４１のヒト化形態である。一実施形態では、抗体が、ＰＡ−４１またはヒト化ＰＡ−４１の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのＮ末端酵素領域に対する結合と競合する。一実施形態では、抗体が、ＰＡ−４１またはヒト化ＰＡ−４１の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのＮ末端酵素領域における単一部位に対する結合と競合する。一実施形態では、抗体が、混合−競合的作用機序によってトキシンＢの毒性を阻害する。

【0058】

もうひとつの態様は、モノクローナル抗体ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２）、ＰＡ−３９のヒト化形態、モノクローナル抗体ＰＡ−５０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４）、ＰＡ−５１のヒト化形態、モノクローナル抗体ＰＡ−４１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３）、ＰＡ−４１のヒト化形態、モノクローナル抗体ＰＡ−３９またはそのヒト化形態の、トキシンＡに対する結合と競合する抗体、モノクローナル抗体ＰＡ−５０またはそのヒト化形態の、トキシンＡに対する結合と競合する抗体またはモノクローナル抗体ＰＡ−４１またはそのヒト化形態の、トキシンＢに対する結合と競合する抗体のうちの１つ以上によって認識および／または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢの一部、断片またはペプチドを含むワクチンまたは免疫原を提供するものである。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原が、モノクローナル抗体ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２）、ＰＡ−３９のヒト化形態またはモノクローナル抗体ＰＡ−３９のトキシンＡおよびトキシンＢへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態のうちの１つ以上によって認識および／または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの一部、断片またはペプチドを含む。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンＡおよび／またはトキシンＢのエピトープ含有部分、断片またはペプチドが、タンパク質分解性の切断によって、トキシンＡまたはトキシンＢのタンパク質から得られる。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンＡの断片、一部またはペプチドが、エンテロキナーゼによるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンＢの断片、一部またはペプチドが、カスパーゼ（カスパーゼ１）によるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のエピトープ含有部分または断片が、トキシンＡまたはトキシンＢのタンパク質の化学的または組換え的に合成されたペプチドである。一実施形態では、抗体によって認識および結合される、トキシンＡおよび／またはトキシンＢの１つ以上のエピトープ領域を含有するワクチンまたは免疫原の断片、一部またはペプチドが、トキシンＡのアミノ末端、トキシンＢのアミノ末端、トキシンＡのカルボキシ末端、トキシンＢのカルボキシ末端、トキシンＡの受容体結合ドメイン、トキシンＡの受容体結合ドメイン外の領域、トキシンＢの受容体結合ドメイン、トキシンＢのＮ末端酵素領域、トキシンＡのグルコシルトランスフェラーゼドメイン、トキシンＢのグルコシルトランスフェラーゼドメイン、トキシンＡのタンパク質分解ドメイン、トキシンＢのタンパク質分解ドメイン、トキシンＡの疎水性のポア形成ドメインまたはトキシンＢの疎水性のポア形成ドメインのうちの１つ以上に由来する。一実施形態では、トキシンＡまたはトキシンＢのエピトープ含有断片または部分の大きさが、＜３００ｋＤａ、約１５８〜１６０ｋＤａ、約１００〜１０５ｋＤａ、たとえば、１０３ｋＤａ、約９０〜９５ｋＤａ、たとえば、９１ｋＤａおよび／または約６３〜６８ｋＤａ、たとえば、６３ｋＤａまたは６８ｋＤａである。一実施形態では、トキシンＡのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約１５８〜１６０ｋＤａ、約９０〜９５ｋＤａ、たとえば、９１ｋＤａおよび／または約６３〜６８ｋＤａ、たとえば、６８ｋＤａである。一実施形態では、トキシンＢのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約１００〜１０５ｋＤａ、たとえば、１０３ｋＤａおよび／または約６３〜６８ｋＤａ、たとえば、６３ｋＤａである。ワクチンまたは免疫原のいずれの実施形態でも、トキシンＡまたはトキシンＢ、またはその断片一部またはペプチドは、本明細書に記載のいずれかの株のものである。

【0059】

もうひとつの態様は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の中和、阻害、ブロック、低減、緩和、治療（ｃｕｒｅ）または治療（ｔｒｅａｔ）を必要とする被検体において、これをする方法であって、上述したワクチンまたは免疫原を有効量で被検体に投与することを含む。この方法の一実施形態では、ワクチンまたは免疫原の投与後のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する液性反応が被検体で誘発されることで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患またはＣＤＡＤを特異的に中和、阻害、ブロック、低減、緩和、治療（ｃｕｒｅ）または治療（ｔｒｅａｔ）可能な抗トキシンＡ抗体および／または抗トキシンＢ抗体が産生される。これらの疾患としては、被検体における、偽膜性大腸炎、中毒性巨大結腸、腸穿孔、敗血症および死亡など、場合によっては重度で生命をおびやかす合併症とも関連している、軽度から重度の下痢症があげられる。この方法の一実施形態では、被検体の液性反応によって誘発される抗体が、本発明のｍＡｂと同様または同一の特異性および作用機序を有する抗体あるいは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢの中和で本発明のｍＡｂと競合するか、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢの中和に必要な作用機序の点で本発明のｍＡｂと競合する抗体を含む。

【0060】

もうひとつの態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症にかかりやすい細胞においてまたは細胞に対してトキシンＡおよび／またはトキシンＢの活性を中和、阻害またはブロックする方法であって、細胞を、本発明による抗体またはその抗原結合性断片と接触させることを含み、抗体またはその抗原結合性断片が、トキシン阻害の競合的または混合競合的作用機序によって、細胞においてまたは細胞に対してトキシンＡおよび／またはトキシンＢの活性を中和、阻害またはブロックする、方法が得られる。この方法の一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体のうちの１つ以上である。この方法の一実施形態では、腸上皮細胞などの細胞が、被検体にあり、抗体またはその抗原結合性断片を、被検体に有効量で投与する。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンＡである。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンＢである。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンＡであり、作用機序が競合的阻害作用機序である。この方法の一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、ＰＡ−５０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４）、そのヒト化形態であるか、ＰＡ−５０のトキシンＡ活性の中和と競合する抗体またはその断片である。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンＡであり、作用機序が混合−競合的阻害作用機序である。この方法の一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２）、そのヒト化形態であるか、ＰＡ−３９のトキシンＡ活性の中和と競合する抗体またはその断片である。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンＢであり、作用機序が混合競合的阻害作用機序である。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、ＰＡ−４１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３）、そのヒト化形態であるか、ＰＡ−４１のトキシンＢ活性の中和と競合する抗体またはその断片である。

【0061】

本発明の上述した態様および他の態様について、本発明の詳細な説明に鑑みてさらに詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1A】ＥＬＩＳＡで測定した場合のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂの特異性を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、トキシンＡ（黒い丸）またはトキシンＢ（白い正方形）で４℃にて一晩、コートした。プレートを洗浄してブロックし、マウスｍＡｂ ＰＡ−３８を滴定してプレートに加えた。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃでモノクローナル抗体の結合を検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でＯＤを測定した。

【図1B】ＥＬＩＳＡで測定した場合のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂの特異性を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、トキシンＡ（黒い丸）またはトキシンＢ（白い正方形）で４℃にて一晩、コートした。プレートを洗浄してブロックし、マウスｍＡｂ ＰＡ−３９を滴定してプレートに加えた。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃでモノクローナル抗体の結合を検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でＯＤを測定した。

【図1C】ＥＬＩＳＡで測定した場合のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂの特異性を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、トキシンＡ（黒い丸）またはトキシンＢ（白い正方形）で４℃にて一晩、コートした。プレートを洗浄してブロックし、マウスｍＡｂ ＰＡ−４１を滴定してプレートに加えた。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃでモノクローナル抗体の結合を検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でＯＤを測定した。

【図2A】マウスｍＡｂ ＰＡ−３８を用いたＢｉａｃｏｒｅ結合性試験の結果を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合特異性を判断した。アミンカップリングに対する製造業者の指示に従って、ｍＡｂ（ＰＡ−３８または対照としての非特異的ｍＡｂ）を、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面に約１０，０００レゾナンスユニット（ＲＵ）で共有結合的に固定化した。ＰＢＳを用いて２５℃で結合実験を実施した。精製したトキシンＡまたはトキシンＢ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３０ｎＭを、結合相（６００秒）と解離相（３００秒）の間、流速５μＬ／分で対照のフローセル（非特異的ｍＡｂ）と試験用フローセルに通した。グラフはＲＵを時間の関数で示したものである。

【図2B】マウスｍＡｂ ＰＡ−３９を用いたＢｉａｃｏｒｅ結合性試験の結果を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合特異性を判断した。アミンカップリングに対する製造業者の指示に従って、ｍＡｂ（ＰＡ−３９または対照としての非特異的ｍＡｂ）を、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面に約１０，０００レゾナンスユニット（ＲＵ）で共有結合的に固定化した。ＰＢＳを用いて２５℃で結合実験を実施した。精製したトキシンＡまたはトキシンＢ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３０ｎＭを、結合相（６００秒）と解離相（３００秒）の間、流速５μＬ／分で対照のフローセル（非特異的ｍＡｂ）と試験用フローセルに通した。グラフはＲＵを時間の関数で示したものである。

【図2C】マウスｍＡｂ ＰＡ−５０を用いたＢｉａｃｏｒｅ結合性試験の結果を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合特異性を判断した。アミンカップリングに対する製造業者の指示に従って、ｍＡｂ（ＰＡ−５０または対照としての非特異的ｍＡｂ）を、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面に約１０，０００レゾナンスユニット（ＲＵ）で共有結合的に固定化した。ＰＢＳを用いて２５℃で結合実験を実施した。精製したトキシンＡまたはトキシンＢ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３０ｎＭを、結合相（３００秒）と解離相（６００秒）の間、流速５μＬ／分で対照のフローセル（非特異的ｍＡｂ）と試験用フローセルに通した。グラフはＲＵを時間の関数で示したものである。

【図2D】マウスｍＡｂ ＰＡ−４１を用いたＢｉａｃｏｒｅ結合性試験の結果を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合特異性を判断した。アミンカップリングに対する製造業者の指示に従って、ｍＡｂ（ＰＡ−４１または対照としての非特異的ｍＡｂ）を、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面に約１０，０００レゾナンスユニット（ＲＵ）で共有結合的に固定化した。ＰＢＳを用いて２５℃で結合実験を実施した。精製したトキシンＡまたはトキシンＢ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３０ｎＭを、結合相（６００秒）と解離相（３００秒）の間、流速５μＬ／分で対照のフローセル（非特異的ｍＡｂ）と試験用フローセルに通した。グラフはＲＵを時間の関数で示したものである。

【図3A】Ｂｉａｃｏｒｅで求めた抗体トキシン結合カイネティクスの結果を示す。図３Ａでは、Ｂｉａｃｏｒｅのマウス抗体キャプチャーキットで用意したＣＭ５センサーチップを用いて、マウスｍＡｂをキャプチャーした。次に、さまざまな濃度（０．４〜１００ｎＭ、２倍増大）のトキシンを流速３０μＬ／分でフローセルに通した。すべてのｍＡｂ濃度を二重に試験し、測定実施後に毎回、キットに指定された条件でチップ表面を再生した。トキシンに対するｍＡｂのＫ_Ｄを算出するＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて、ＲＵの変化を記録し、分析した。図３Ａ：トキシンＡに対するＰＡ−３８の結合。

【図3B】Ｂｉａｃｏｒｅで求めた抗体トキシン結合カイネティクスの結果を示す。図３Ｂでは、Ｂｉａｃｏｒｅのマウス抗体キャプチャーキットで用意したＣＭ５センサーチップを用いて、マウスｍＡｂをキャプチャーした。次に、さまざまな濃度（０．４〜１００ｎＭ、２倍増大）のトキシンを流速３０μＬ／分でフローセルに通した。すべてのｍＡｂ濃度を二重に試験し、測定実施後に毎回、キットに指定された条件でチップ表面を再生した。トキシンに対するｍＡｂのＫ_Ｄを算出するＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて、ＲＵの変化を記録し、分析した。図３Ｂ：トキシンＡに対するＰＡ−５０の結合。

【図3C】Ｂｉａｃｏｒｅで求めた抗体トキシン結合カイネティクスの結果を示す。図３Ｃでは、Ｂｉａｃｏｒｅのマウス抗体キャプチャーキットで用意したＣＭ５センサーチップを用いて、マウスｍＡｂをキャプチャーした。次に、さまざまな濃度（０．４〜１００ｎＭ、２倍増大）のトキシンを流速３０μＬ／分でフローセルに通した。すべてのｍＡｂ濃度を二重に試験し、測定実施後に毎回、キットに指定された条件でチップ表面を再生した。トキシンに対するｍＡｂのＫ_Ｄを算出するＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて、ＲＵの変化を記録し、分析した。図３Ｃ：トキシンＡに対するＰＡ−３９の結合。

【図3D】Ｂｉａｃｏｒｅで求めた抗体トキシン結合カイネティクスの結果を示す。図３Ｄでは、Ｂｉａｃｏｒｅのマウス抗体キャプチャーキットで用意したＣＭ５センサーチップを用いて、マウスｍＡｂをキャプチャーした。次に、さまざまな濃度（０．４〜１００ｎＭ、２倍増大）のトキシンを流速３０μＬ／分でフローセルに通した。すべてのｍＡｂ濃度を二重に試験し、測定実施後に毎回、キットに指定された条件でチップ表面を再生した。トキシンに対するｍＡｂのＫ_Ｄを算出するＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて、ＲＵの変化を記録し、分析した。図３Ｄ：トキシンＢに対するＰＡ−３９の結合。

【図3E】Ｂｉａｃｏｒｅで求めた抗体トキシン結合カイネティクスの結果を示す。図３Ｅでは、Ｂｉａｃｏｒｅのマウス抗体キャプチャーキットで用意したＣＭ５センサーチップを用いて、マウスｍＡｂをキャプチャーした。次に、さまざまな濃度（０．４〜１００ｎＭ、２倍増大）のトキシンを流速３０μＬ／分でフローセルに通した。すべてのｍＡｂ濃度を二重に試験し、測定実施後に毎回、キットに指定された条件でチップ表面を再生した。トキシンに対するｍＡｂのＫ_Ｄを算出するＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて、ＲＵの変化を記録し、分析した。図３Ｅ：トキシンＢに対するＰＡ−４１の結合。

【図3F】図３Ｆでは、上記同様に、マウスｍＡｂすなわちｍＰＡ−５０をアミンカップリング法によって共有結合的にＣＭ５センサーチップに固定化した。３０ｎＭのトキシンＡ（「（赤）」で示したライン）またはトキシンＢ（「（青）」で示したライン）を、流速５μＬ／分で試験用フローセル（ｍＰＡ−５０）に通した。この結果から、ｍＰＡ−５０がトキシンＡと選択的に結合することがわかる（図３Ｆ）。

【図3G】図３Ｇでは、上記同様に、マウスｍＡｂすなわちｍＰＡ−４１をアミンカップリング法によって共有結合的にＣＭ５センサーチップに固定化した。３０ｎＭのトキシンＡ（「（赤）」で示したライン）またはトキシンＢ（「（青）」で示したライン）を、流速５μＬ／分で試験用フローセル（ｍＰＡ−４１）に通した。この結果から、ｍＰＡ−４１がトキシンＢと選択的に結合することがわかる（図３Ｇ）。

【図3H】図３Ｈでは、上記同様に、マウスｍＡｂすなわちｍＰＡ−３９をアミンカップリング法によって共有結合的にＣＭ５センサーチップに固定化した。３０ｎＭのトキシンＡ（「（赤）」で示したライン）またはトキシンＢ（「（青）」で示したライン）を、流速５μＬ／分で試験用フローセル（ｍＰＡ−３９）に通した。ｍＰＡ−３９は、トキシンＡと優先的に結合するが、トキシンＢに対する交差反応性も示す（図３Ｈ）。

【図4】ＣＨＯ−Ｋ１細胞上の精製マウスｍＡｂ ＰＡ−３９を用いたトキシンＢ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性を示す。細胞毒性を測定するために、さまざまな濃度のＰＡ−３９を用いて、３７℃で１時間トキシンＢをインキュベートした（実施例３Ｂ）。次に、９６ウェルのプレートに２，０００個／ウェルで蒔いたＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ｍＡｂトキシン混合物を加え、７２時間インキュベートした。処理培養と未処理培養とで細胞生存率を比較し、細胞毒性の５０％中和に必要なｍＡｂ濃度（ＥＣ_５０）を算出した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅで細胞生存度を求めた；生データを未処理の対照ウェルに対して正規化した。Ｐｒｉｓｍを用いて値をプロットし、シグモイド用量反応曲線（可変勾配）モデルを用いて曲線を算出した。次に、この曲線を用いてｍＡｂ ＥＣ_５０を求めた。データ点は、同一プレートでの３つのウェルの平均を表している。

【図5】ＣＨＯ−Ｋ１細胞上の精製マウスｍＡｂ ＰＡ−４１を用いたトキシンＡ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性を示す。細胞毒性を測定するために、さまざまな濃度のＰＡ−４１を用いて、３７℃で１時間トキシンＡをインキュベートした（実施例３Ｂ）。次に、９６ウェルのプレートに２，０００個／ウェルで蒔いたＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ｍＡｂトキシン混合物を加え、７２時間インキュベートした。処理培養と未処理培養とで細胞生存率を比較し、細胞毒性の５０％中和に必要なｍＡｂ濃度（ＥＣ_５０）を算出した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅで細胞生存度を求めた；生データを未処理の対照ウェルに対して正規化した。Ｐｒｉｓｍを用いて値をプロットし、シグモイド用量反応曲線（可変勾配）モデルを用いて曲線を算出した。次に、この曲線を用いてｍＡＢ ＥＣ_５０を求めた。データ点は、同一プレートでの３つのウェルの平均を表している。

【図6】Ｔ−８４細胞上の精製マウスｍＡｂ ＰＡ−３８およびＰＡ−５０を用いたトキシンＡ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性を示す。（実施例３Ｃ）。９６ウェルのプレートでＴ−８４細胞を播種し（１５，０００個／ウェル）、滴定後のｍＡｂ（ＰＡ−３８（■）またはＰＡ−５０（▲））とトキシンＡ（６０ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで処理した。インキュベーション（７２時間）後、処理培養と未処理培養とで細胞生存率を比較し、細胞毒性の５０％中和に必要なｍＡｂ濃度（ＥＣ_５０）を算出した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅで細胞生存度を求めた；生データを未処理の対照ウェルに対して正規化した。Ｐｒｉｓｍを用いて値をプロットし、シグモイド用量反応曲線（可変勾配）モデルを用いて曲線を算出した。次に、この曲線を用いてｍＡｂ ＥＣ_５０を求めた。データ点は、同一プレートでの３つのウェルの平均を表している。

【図7】ウサギ赤血球（ＲＢＣ）のトキシンＡ誘導血球凝集をブロックまたは防止する機能についてマウスｍＡｂ ＰＡ−３８（■）またはＰＡ−５０（▲）を試験した結果を示す。トキシンＡ（２μｇ／ｍｌ）を、さまざまに希釈したＰＡ−３８またはＰＡ−５０と組み合わせ、この混合物を、５０μＬのウサギ赤血球を入れたプレートに加えた。プレートを４℃で４時間インキュベートした。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ４００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ドットアレイ解析を利用して、血球凝集を色の濃淡として定量化した。データを対照に対する割合（％）で示し、血球凝集のない状態を１００％とする。データ点は、同一プレートでアッセイした３つのウェルの平均を表している。

【図8】トキシンＡによってＣａｃｏ−２細胞単層が破壊されるのを防ぐ上での本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂの活性を示す。Ｃａｃｏ−２細胞を、９６ウェルのＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｃａｃｏ−２アッセイプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上部チャンバーに播種した（２５，０００個／ウェル）。１０〜１４日間のインキュベーション後、上皮細胞抵抗測定器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することで、「隙間なく形成された単層の形成を確認した。完全な単層を形成し、計測した後、トキシンＡ（２５ｎｇ／ｍＬ）と段階希釈したマウスｍＡｂ（ＰＡ−３８（■）またはＰＡ−５０（▲））とをアッセイプレートの上部チャンバーに加えた。プレートを１８〜２４時間インキュベートし、抵抗測定器を用いてＴＥＥＲ値を測定した。未処理のウェルとトキシン処理したウェルで、単層の完全性を比較した。５０％トキシン阻害（ＥＣ_５０）に必要なｍＡｂの濃度を判断するために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて阻害データを非線形回帰のシグモイド用量反応曲線にフィッティングした。

【図9A】抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−３８（図９Ａ）およびＰＡ−５０（図９Ｂ）がトキシンＡ活性をｉｎ ｖｉｖｏで中和する機能を示す。０日目に、メスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（６〜８週齢、５匹／群）に、標記の量でのマウスｍＡｂ ＰＡ−３８またはマウスｍＡｂ ＰＡ−５０あるいは、ＰＢＳ（２００μｌ）を注射した（腹腔内）。本明細書ではＣＤＡ−１と呼ぶ、対照の抗トキシンＡモノクローナル抗体の中和活性を、標記の抗体量で評価した（図９Ｃ）。３Ｄ８（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする（ＤＮＡ２．０）核酸を合成して、抗トキシンＡ対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１を作製し、これを全長ヒトＩｇＧ１発現ベクター（ｐＣＯＮ−γ１およびｐＣＯＮ−κ）にクローニングした。本明細書の実施例部分で説明するように、ＣＤＡ−１対照のｍＡｂを発現させ、ＣＨＯ−ＫＳＶ１細胞で作製および精製した。次に、１日目にマウスに１００ｎｇのトキシンＡ（２００μｌ）を注射して、最初の７２時間は毎日、その後は毎週監視した。その結果から、単一用量２μｇのｍＡｂ／匹を注射後はＰＡ−３８ ｍＡｂとＰＡ−５０ ｍＡｂはともにトキシンＡ関連毒性を完全に阻害できるのに対し、対照のＣＤＡ−１ ｍＡｂ（５μｇ／動物）ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ関連毒性を完全に阻害できなかったことがわかる。

【図9B】抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−３８（図９Ａ）およびＰＡ−５０（図９Ｂ）がトキシンＡ活性をｉｎ ｖｉｖｏで中和する機能を示す。０日目に、メスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（６〜８週齢、５匹／群）に、標記の量でのマウスｍＡｂ ＰＡ−３８またはマウスｍＡｂ ＰＡ−５０あるいは、ＰＢＳ（２００μｌ）を注射した（腹腔内）。本明細書ではＣＤＡ−１と呼ぶ、対照の抗トキシンＡモノクローナル抗体の中和活性を、標記の抗体量で評価した（図９Ｃ）。３Ｄ８（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする（ＤＮＡ２．０）核酸を合成して、抗トキシンＡ対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１を作製し、これを全長ヒトＩｇＧ１発現ベクター（ｐＣＯＮ−γ１およびｐＣＯＮ−κ）にクローニングした。本明細書の実施例部分で説明するように、ＣＤＡ−１対照のｍＡｂを発現させ、ＣＨＯ−ＫＳＶ１細胞で作製および精製した。次に、１日目にマウスに１００ｎｇのトキシンＡ（２００μｌ）を注射して、最初の７２時間は毎日、その後は毎週監視した。その結果から、単一用量２μｇのｍＡｂ／匹を注射後はＰＡ−３８ ｍＡｂとＰＡ−５０ ｍＡｂはともにトキシンＡ関連毒性を完全に阻害できるのに対し、対照のＣＤＡ−１ ｍＡｂ（５μｇ／動物）ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ関連毒性を完全に阻害できなかったことがわかる。

【図9C】抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−３８（図９Ａ）およびＰＡ−５０（図９Ｂ）がトキシンＡ活性をｉｎ ｖｉｖｏで中和する機能を示す。０日目に、メスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（６〜８週齢、５匹／群）に、標記の量でのマウスｍＡｂ ＰＡ−３８またはマウスｍＡｂ ＰＡ−５０あるいは、ＰＢＳ（２００μｌ）を注射した（腹腔内）。本明細書ではＣＤＡ−１と呼ぶ、対照の抗トキシンＡモノクローナル抗体の中和活性を、標記の抗体量で評価した（図９Ｃ）。３Ｄ８（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする（ＤＮＡ２．０）核酸を合成して、抗トキシンＡ対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１を作製し、これを全長ヒトＩｇＧ１発現ベクター（ｐＣＯＮ−γ１およびｐＣＯＮ−κ）にクローニングした。本明細書の実施例部分で説明するように、ＣＤＡ−１対照のｍＡｂを発現させ、ＣＨＯ−ＫＳＶ１細胞で作製および精製した。次に、１日目にマウスに１００ｎｇのトキシンＡ（２００μｌ）を注射して、最初の７２時間は毎日、その後は毎週監視した。その結果から、単一用量２μｇのｍＡｂ／匹を注射後、ＰＡ−３８ ｍＡｂとＰＡ−５０ ｍＡｂはともにトキシンＡ関連毒性を完全に阻害できるのに対し、対照のＣＤＡ−１ ｍＡｂ（５μｇ／動物）ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ関連毒性を完全に阻害できなかったことがわかる。

【図10】ｍＡｂ ＰＡ−４１がトキシンＢ活性をｉｎ ｖｉｖｏで中和する機能を示す。０日目に、メスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（６〜８週齢、５匹／群）に、標記の量でのマウスｍＡｂ ＰＡ−４１またはＰＢＳ（２００μｌ）を注射した（腹腔内）。次に、１日目にマウスに１００ｎｇのトキシンＢ（２００μｌ）を注射して、最初の７２時間は毎日、その後は毎週監視した。この実験の結果から、単一用量５μｇのｍＡｂ／匹を注射後、ＰＡ−４１ ｍＡｂがクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ関連毒性を完全に阻害することがわかる。本明細書ではＣＤＢ−１対照のｍＡｂと呼ぶ、対照の抗トキシンＢモノクローナル抗体を用いて、同様の実験を実施した。１２４（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする（ＤＮＡ２．０）核酸を合成して、抗トキシンＢ対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１を作製し、これを全長ヒトＩｇＧ１発現ベクター（ｐＣＯＮ−γ１およびｐＣＯＮ−κ）にクローニングした。本明細書の実施例部分で説明するように、ＣＤＢ−１対照のｍＡｂを発現させ、ＣＨＯ−ＫＳＶ１細胞で作製および精製した。これらの実験の結果から、２５０μｇという量ですら、対照のＣＤＢ−１ ｍＡｂによるトキシンＢ中和活性がないことがわかる。

【図11】本発明のマウスｍＡｂ ＰＡ−３８とＰＡ−４１の組み合わせ（ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１）がトキシンＡ活性およびトキシンＢ活性をｉｎ ｖｉｖｏで中和する機能を示す。０日目に、メスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（６〜８週齢、５匹／群）に、ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１ ｍＡｂの組み合わせまたはＰＢＳ（２００μｌ）を注射した（腹腔内）。次に、１日目にマウスに１００ｎｇのトキシンＡおよびトキシンＢの組み合わせ（２００μｌ）を注射して、最初の７２時間は毎日、その後は毎週監視した。ＰＡ−３８単独（白い丸）とＰＡ−４１単独（黒い菱形）のトキシンのプロットがグラフで重なっている。これらの結果から、ＰＡ−３８ ｍＡｂ（白い丸）とＰＡ−４１ ｍＡｂ（黒い菱形）単独のどちらも、両方のトキシンの作用を阻害するには十分ではなく、動物をクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症から保護しないことがわかる。対照的に、ＰＡ−３８とＰＡ−４１の組み合わせ（ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１）を各５０μｇで用いると（白い逆三角形）、被験動物５匹のうち４匹で感染動物を保護し、トキシン関連死を防止できた。各５μｇのＰＡ−３８とＰＡ−４１（ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１）の組み合わせ（黒い丸）では、感染した被験動物で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの毒性に対していくらか保護することができた。

【図12A】マウスｍＡｂ ＰＡ−３８に対するハムスターでの薬物動態（ＰＫ）結果を示す。ハムスターに２ｍｇ／ｋｇ（○）または１０ｍｇ／ｋｇ（■）のｍＡｂ ＰＡ−３８を腹腔内投与した。規定の間隔で動物から採血し、トキシン結合プレートおよびヤギ抗マウスＩｇＧ、検出用のＨＲＰ結合を用いるＥＬＩＳＡで、血清を分析した。得られる曲線は、２ｍｇ／ｋｇおよび１０／ｍｇ／ｋｇのコホートでの各抗体に対する用量依存反応を示す。それぞれの曲線についてＷｉｎＮｏｎＬｉｎ解析を実施した。どちらのモノクローナル抗体も終末半減期が６日間を超えている。

【図12B】マウスｍＡｂ ＰＡ−４１に対するハムスターでの薬物動態（ＰＫ）結果を示す。ハムスターに２ｍｇ／ｋｇ（○）または１０ｍｇ／ｋｇ（■）のｍＡｂ ＰＡ４１を腹腔内投与した。規定の間隔で動物から採血し、トキシン結合プレートおよびヤギ抗マウスＩｇＧ、検出用のＨＲＰ結合を用いるＥＬＩＳＡで、血清を分析した。得られる曲線は、２ｍｇ／ｋｇおよび１０／ｍｇ／ｋｇのコホートでの各抗体に対する用量依存反応を示す。それぞれの曲線についてＷｉｎＮｏｎＬｉｎ解析を実施した。どちらのモノクローナル抗体も終末半減期が６日間を超えている。

【図13】は、実施例５Ｂで説明するハムスターでの研究における生存結果を示す。この研究では、ハムスターをクリンダマイシンで処理し、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を接種した（■感染対照、群３）後、バンコマイシン（◆２０ｍｇ／ｋｇ、群４）、マウスｍＡｂ ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１の組み合わせ（△５０、５０ｍｇ／ｋｇ、群６）またはｍＡｂ ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１の組み合わせ（○５０、４０ｍｇ／ｋｇ、群７）で処理した。未感染の対照（群１）およびヤギポリクローナルＡｂで処理した対照（群５）の動物はいずれも生存した。本発明による抗トキシンＡ ｍＡｂと抗トキシンＢ ｍＡｂの組み合わせで処理した動物は、研究期間のあいだ生存し、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒性から保護された。

【図14】実施例５Ｂで説明する研究におけるハムスターの平均体重（グラム）を示す。動物の処理群は以下のとおりである。未感染の対照（◆、群１）、バンコマイシン処理対照（■、群４）、ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１マウスｍＡｂ組み合わせ処理群（ｘ、群６）またはＰＡ−３９＋ＰＡ−４１マウスｍＡｂ組み合わせ処理群（●、群７）。感染対照群（群３）の動物は５日間生存しなかった。よって、群３では感染後の体重測定を実施できなかった。

【図15A-D】実施例５Ｂで説明するハムスターでの研究における死後剖検の結果を示す。研究の関連群各々での代表的な動物を評価した。（図１５Ａ）群１、未感染の対照。（図１５Ｂ）群３、感染対照。矢印は、各ハムスターの盲腸を示す。感染対照群３の盲腸は顕著に赤く、炎症を起こしていた。（図１５Ｃ）群６、ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１マウスｍＡｂ組み合わせ処理群。矢印は、各ハムスターの盲腸を示す。感染対照群３の盲腸は顕著に赤く、炎症を起こしていた（図１５Ｂ）。対照的に、群６（図１５Ｃ）のハムスターの盲腸は、群１（図１５Ａ）の健康な未感染の対照動物の盲腸と同様であった。（図１５Ｄ）群７、ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１マウスｍＡｂ組み合わせ処理群。矢印は、各ハムスターの盲腸を示す。感染対照群３の盲腸は顕著に赤く、炎症を起こしていた（図１５Ｂ）。対照的に、群７（図１５Ｄ）のハムスターの盲腸は、群１（図１５Ａ）の健康な未感染の対照動物の盲腸と同様であった。

【図16A】実施例５Ｃで説明するハムスターでの研究における生存結果を示す。この研究では、ハムスターをクリンダマイシンで処理し、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を接種した（■感染対照、群１）後、異なる群の動物を、バンコマイシン（◆２０ｍｇ／ｋｇ、群２）、マウスｍＡｂ ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１の組み合わせ（▲５０＋５０ｍｇ／ｋｇ、群３）、マウスｍＡｂ ＰＡ−４１単独（○５０ｍｇ／ｋｇ、群４）、マウスｍＡｂ ＰＡ−３８単独（▽５０ｍｇ／ｋｇ、群５）、マウスｍＡｂ ＰＡ−３９単独（□５０ｍｇ／ｋｇ、群６）またはマウスｍＡｂ ＰＡ−５０単独（◇５０ｍｇ／ｋｇ、群７）で処理した。研究の過程で、未感染の対照（群１）の動物はいずれも生存した。

【図16B1-2】図１６Ｂ−１は、実施例５Ｅで説明するハムスターでの研究における動物の生存結果を示す。クリンダマイシンで処理した後、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を接種した動物（■、感染対照、群２）、バンコマイシンで処理した動物（◇、２０ｍｇ／ｋｇ、群３）、ヒト化ＰＡ−５０＋ＰＡ−４１ ｍＡｂの１：１の組み合わせで処理した動物（（ｈＰＡ−５０＋ｈＰＡ−４１）、△、５０＋５０ｍｇ／ｋｇ、群４）、ヒト化ＰＡ−５０＋ＰＡ−４１ ｍＡｂの１：１の組み合わせで処理した動物（（ｈＰＡ−５０＋ｈＰＡ−４１）、○、２０＋２０ｍｇ／ｋｇ、群５）、対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１＋ＣＤＢ−１の１：１の組み合わせで処理した動物（（ＣＤＡ−１＋ＣＤＢ−１）、▽、５０＋５０ｍｇ／ｋｇ、群６）または対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１＋ＣＤＢ−１１：１の組み合わせで処理した動物（（ＣＤＡ−１＋ＣＤＢ−１）、□２０＋２０ｍｇ／ｋｇ、群７）のカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１６Ｂ−２は、実施例５Ｅで説明するハムスターでの研究における体重変化の結果を示す。図１６Ｂ−１で説明した異なる処理群での動物の経時的な平均（±ＳＤ）体重を未感染の対照動物と比較した。

【図17A-C】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢのカスパーゼ１処理を示す。（図１７Ａ）：全長クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢおよびそのドメイン。（図１７Ｂ）：トキシンＢ（ＴｃｄＢ）とカスパーゼ１処理トキシンＢの３〜８％トリス酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）分析。１９３ｋＤａ、１６７ｋＤａ、１０３ｋＤａ、６３ｋＤａの４つのトキシン断片を観察した。（図１７Ｃ）：トキシンＢのカスパーゼ１処理後に生成される、考えられる断片。

【図18A-C】抗トキシンＢ ｍＡｂを用いたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を示す。（図１８Ａ）：カスパーゼ１処理（図１７Ｂと同一）によって生成されるトキシンＢ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（図１８Ｂ）：ｍＡｂ ＰＡ−４１を用いるトキシンＢ断片のウェスタンブロット検出。（図１８Ｃ）：マウスｍＡｂ ＰＡ−３９を用いるトキシンＢ断片のウェスタンブロット検出。

【図19A】Ｂｉａｃｏｒｅ結合による抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンマウスｍＡｂのキャラクタリゼーションを示す。抗トキシンｍＡｂの競合的結合を評価した。（図１９Ａ）：ｍＡｂ ＰＡ−４１がトキシンＢの単一のエピトープに結合する。

【図19B】Ｂｉａｃｏｒｅ結合による抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンマウスｍＡｂのキャラクタリゼーションを示す。抗トキシンｍＡｂの競合的結合を評価した。（図１９Ｂ）：ｍＡｂ ＰＡ−３９がトキシンＡの単一のエピトープに結合する。

【図19C】Ｂｉａｃｏｒｅ結合による抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンマウスｍＡｂのキャラクタリゼーションを示す。抗トキシンｍＡｂの競合的結合を評価した。（図１９Ｃ）：ｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−４１がトキシンＢの異なるエピトープに結合する。トキシンＢに対するｍＡｂ ＰＡ−４１の結合は、トキシンＢに対する対照のＣＤＢ−１抗トキシンＢ抗体の結合とはエピトープ的に異なる。

【図19D】Ｂｉａｃｏｒｅ結合による抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンマウスｍＡｂのキャラクタリゼーションを示す。抗トキシンｍＡｂの競合的結合を評価した。（図１９Ｄ）：ＣＭ５チップに固定化したｍＰＡ−４１は、トキシンＢをキャプチャーするが、他のｍＡ−４１には結合できないため、ｍＰＡ−４１の結合エピトープが１つしかないことがわかる。対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１を加えると、シグナルが増したことから、ｍＰＡ−４１および対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１がトキシンＢの異なるエピトープに結合することがわかる。

【図19E】Ｂｉａｃｏｒｅ結合による抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンマウスｍＡｂのキャラクタリゼーションを示す。抗トキシンｍＡｂの競合的結合を評価した。（図１９Ｅ）：未処理の場合とカスパーゼ１で処理した場合におけるトキシンＢを用いたウェスタンブロット分析から、ｍＰＡ−４１および対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１が異なる結合パターンを有し、トキシンＢの異なるエピトープに結合することがわかる。

【図20A】エンテロキナーゼ（ＥＫ）を用いるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡの切断を示す。（図２０Ａ）：全長クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびそのドメイン。

【図20B】エンテロキナーゼ（ＥＫ）を用いるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡの切断を示す。（図２０Ｂ）：トキシンＡ（ＴｃｄＡ）とＥＫ処理トキシンＡの３〜８％トリス酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）分析。

【図20C】エンテロキナーゼ（ＥＫ）を用いるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡの切断を示す。（図２０Ｃ）：トキシンＡを２５℃で４８時間ＥＫ処理した後に生成される、考えられる断片。

【図21A-C】抗トキシンＡマウスｍＡｂを用いたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ断片のクーマシーブルー染色（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。（図２１Ａ）：ＥＫ処理（図２０Ｂと同一）によって生成されるトキシンＡ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（図２１Ｂ）：ｍＡｂ ＰＡ−５０を用いるトキシンＡ断片のウェスタンブロット検出。図２１Ｂおよび図２１Ｃでは、ｋＤａバンドが約１５８ｋＤａであり、約１５８〜１６０ｋＤａであるとみなせる。（図２１Ｃ）：ｍＡｂ ＰＡ−３９を用いるトキシンＡ断片のウェスタンブロット検出。図２１Ｂおよび図２１Ｃでは、ｋＤａバンドが約１５８ｋＤａであり、約１５８〜１６０ｋＤａであるとみなせる。

【図22A1-2】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイを用いたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対するマウス抗トキシンＡ ｍＡｂ結合のキャラクタリゼーションを示す。（図２２Ａ−１）：トキシンＡの複数の部位に結合するＰＡ−５０ ｍＡｂが観察された。（図２２Ａ−２）：ＰＡ−５０ ｍＡｂをセンサーチップに固定化した後、精製トキシンＡ、別のＰＡ−５０、対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）と順次接触させた。

【図22B】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイを用いたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対するマウス抗トキシンＡ ｍＡｂ結合のキャラクタリゼーションを示す。（図２２Ｂ）：Ｂｉａｃｏｒｅチップ上の対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１によってキャプチャーされたトキシンＡは、さらに別のＣＤＡ−１およびＰＡ−５０ ｍＡｂに結合することから、抗体に結合されるトキシンＡエピトープの差が示される。

【図22C】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイを用いたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対するマウス抗トキシンＡ ｍＡｂ結合のキャラクタリゼーションを示す。（図２２Ｃ）：トキシンＡのＰＡ−３９ ｍＡｂ結合エピトープは、トキシンＡの対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１結合エピトープとは異なる。

【図22D】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイを用いたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対するマウス抗トキシンＡ ｍＡｂ結合のキャラクタリゼーションを示す。（図２２Ｄ）：Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、トキシンＡに対するマウスｍＡｂ ＰＡ−５０およびＰＡ−３９の競合的結合を実施した。ＣＭ５チップに固定化したＭＡｂ ＰＡ−５０はトキシンＡをキャプチャーし、これが別のｍＰＡ−５０およびｍＰＡ−３９も結合できることから、ｍＰＡ−５０エピトープの複数のコピーがトキシンＡにあり、ｍＰＡ−５０およびｍＰＡ−３９がトキシンＡの異なるエピトープに結合することがわかる。

【図22E-F】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイを用いたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対するマウス抗トキシンＡ ｍＡｂ結合のキャラクタリゼーションを示す。Ｂｉａｃｏｒｅでの結果を、未処理または酵素エンテロキナーゼ（ＥＫ）で処理したトキシンＡを用いるウェスタンブロット分析で確認した。（図２２Ｅ）：ｍＰＡ−３９および対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１は、ＥＫ処理したトキシンＡ（レーン：ＴｃｄＡ／ＥＫ）に対して異なる結合パターンを示すことから、トキシンＡに異なる結合ドメインおよびエピトープがあることがわかる。（図２２Ｆ）：ｍＰＡ−５０および対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１は、トキシンＡの同一のドメインであるが異なるエピトープに結合する。

【図23A】６種類のＢＩ／ＮＡＰ１／０２７分離株、３種類の参考株（ＶＰＩ １０４６３、ＡＴＣＣ ４３５９６および６３０）、２種類のトキシンＡ陰性／トキシンＢ陽性（ｔｏｘＡ−／ｔｏｘＢ＋）分離株、３種類の外来患者分離株、６種類の他の共通臨床分離株を含む、２０種類のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素産生性臨床分離株の多種多様なパネルに対するＰＡ−４１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性を示す。図２３Ａは、実施例８の表６に示すように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、異なるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）臨床分離株培養から生成した上清の作用を中和するマウスｍＡｂ ＰＡ−４１の中和活性を示す。精製ｍＡｂ ＰＡ−４１を段階希釈した後、＞９０％細胞死を引き起こし得る予め規定した希釈係数の上清と混合した。混合物を３７℃で１時間インキュベートした後、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加えた。細胞を７２時間インキュベートし、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅを用いて細胞生存度を測定した。

【図23B】６種類のＢＩ／ＮＡＰ１／０２７分離株、３種類の参考株（ＶＰＩ １０４６３、ＡＴＣＣ ４３５９６および６３０）、２種類のトキシンＡ陰性／トキシンＢ陽性（ｔｏｘＡ−／ｔｏｘＢ＋）分離株、３種類の外来患者分離株、６つの他の共通臨床分離株を含む、２０種類のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素産生性臨床分離株の多種多様なパネルに対するＰＡ−４１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性を示す。図２３Ｂは、２種類のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）参考株（ＶＰＩ １０４６３、ＡＴＣＣ ４３５９６）と６種類のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＢＩ／０２７／０２７株（ＣＣＬ６７８、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ ４５、ＣＤ１９６、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ５．１、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ７．１）に対するヒト化ｍＡｂ ｈＰＡ−４１の中和活性ならびに対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１の中和活性を示す。参考株（ＶＰＩ １０４８３、ＡＴＣＣ ４３５９６）およびＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株（ＣＣＬ６７８、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ ４５、ＣＤ１９６、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ５．１、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ７．１）由来の上清に対するＣＨＯ−Ｋ１細胞でのｈＰＡ−４１ ｍＡｂ（黒い正方形）の中和活性および対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１（黒い三角形）の中和活性を示す。

【図24A】図２３Ａおよび図２３Ｂで説明したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素産生性臨床分離株に対するｍＡｂ ＰＡ−５０のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける中和活性を示す。図２４Ａは、実施例８の表６に示すように、Ｔ−８４細胞において、異なるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）臨床分離株培養から生成した上清の作用を中和するマウスｍＡｂ ＰＡ−５０の中和活性を示す。精製ｍＡｂ ＰＡ−５０を段階希釈した後、＞９０％細胞死を引き起こし得る予め規定した希釈係数の上清と混合した。混合物を３７℃で１時間インキュベートした後、Ｔ−８４細胞に加えた。細胞を７２時間インキュベートし、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅを用いて細胞生存度を測定した。図２４Ａ中の記号の意味は以下のとおりである。＊：Ｎ／Ａ：該当なし；トキシンＡ−／トキシンＢ＋株Ｆ１４７０、８８６４、ＣＣＬ１３８２０、ＣＣＬ１４４０２からトキシンＡは産生されなかった；”：トキシンＡの力価が極めて低かった；上清を用いた場合にＴ−８４で測定可能な細胞毒性なし；＾：該当なし；トキシンＡ−／トキシンＢ＋株からトキシンＡが産生されなかったか、濃度が低すぎた。

【図24B】図２３Ａおよび図２３Ｂで説明したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素産生性臨床分離株に対するｍＡｂ ＰＡ−５０のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける中和活性を示す。図２４Ｂは、Ｔ−８４細胞でヒト化ｍＡｂ ｈＰＡ−５０および対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１を用いて実施した同様の実験の結果を示す。６種類のＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株（ＣＣＬ６７８、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ ４５、ＣＤ１９６、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ５．１およびＭｏｎｔｒｅａｌ ７．１）から生成した上清に対するＴ−８４細胞でのｈＰＡ−５０（黒い正方形）およびＣＤＡ−１対照の（黒い三角形）の中和活性を示す。

【図25A】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の多種多様な株によって産生されたトキシンの中和について示す。図２５Ａおよび図２５Ｂは、実施例８の表６に示すように、Ｔ−８４細胞において、異なるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）臨床分離株培養から生成した上清の作用を中和するマウスｍＡｂ ＰＡ−３９の中和活性を示す。ｍＡｂ ＰＡ−３９（ハイブリドーマ上清）を段階希釈し、各上清の希釈係数を示す。図２５Ａ中の記号の意味は以下のとおりである。＊：Ｎ／Ａ：該当なし；トキシンＡ−／トキシンＢ＋株Ｆ１４７０、８８６４、ＣＣＬ１３８２０、ＣＣＬ１４４０２からトキシンＡは産生されなかった；”：トキシンＡの力価が極めて低かった；上清を用いた場合にＴ−８４で測定可能な細胞毒性なし；＾：該当なし；トキシンＡ−／トキシンＢ＋株からトキシンＡが産生されなかったか、濃度が低すぎた。

【図25B】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の多種多様な株によって産生されたトキシンの中和について示す。図２５Ａおよび図２５Ｂは、実施例８の表６に示すように、Ｔ−８４細胞において、異なるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）臨床分離株培養から生成した上清の作用を中和するマウスｍＡｂ ＰＡ−３９の中和活性を示す。ｍＡｂ ＰＡ−３９（ハイブリドーマ上清）を段階希釈し、各上清の希釈係数を示す。ｍＡｂ ＰＡ−３９（ハイブリドーマ上清）を段階希釈し、各上清の希釈係数を示す。また、図２５Ｂは、Ｔ−８４細胞上のマウスｍＡｂ ＰＡ−３９および対照のＣＤＡ−１ ｍＡｂを用いて実施した同様の実験の結果を示す。６種類のＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株（ＣＣＬ６７８、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ ４５、ＣＤ１９６、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ５．１、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ７．１）から生成した上清に対するＴ−８４細胞でのＰＡ−３９（黒い正方形）および対照のＣＤＡ−１ ｍＡｂ（黒い三角形）の中和活性を示す。

【図25C】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の多種多様な株によって産生されたトキシンの中和について示す。図２５Ｃでは、Ｔ−８４細胞に対するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養上清の細胞毒性の中和について、ヒト化抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−５０および対照の抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＡ−１を試験した（実施例８、表７）。

【図25D】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の多種多様な株によって産生されたトキシンの中和について示す。図２５Ｄでは、Ｔ−８４細胞に対するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養上清の細胞毒性の中和について、ヒト化抗トキシンＢ ｍＡｂ ＰＡ−４１および対照の抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＢ−１を試験した（実施例８、表７）。

【図26】キメラｍＡｂ ＰＡ−４１（ｃＰＡ−４１ ｍＡｂ）が、対応のマウスｍＡｂ ＰＡ−４１と比較して、ＣＨＯ−Ｋ１でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢの毒性を効果的に中和することを示す。２つのキメラＰＡ−４１ ｍＡｂを生成した。一方は、ＶＬ領域で糖鎖付加部位を除去してｃＰＡ−４１（ＮＧ）と表示し、他方は糖鎖付加部位を除去せずに図中でｃＰＡ−４１（Ｇ）と表示した。ｃＰＡ−４１（ＮＧ）およびｃＰＡ−４１（Ｇ）はいずれも、ＣＨＯ−Ｋ１細胞上でトキシンＢ（２ｐｇ／ｍＬ、ＴｅｃｈＬａｂ）に対して同様の中和レベルを示し、どちらのキメラｍＡｂもトキシンＢを親マウスｍＡｂ（ｍＰＡ−４１）と同様のレベルで中和した。

【図27】キメラＰＡ−３９（ｃＰＡ−３９） ｍＡｂが、親マウスＰＡ−３９（ｍＰＡ−３９） ｍＡｂと比較して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ（１μｇ／ｍＬ、Ｌｉｓｔｌａｂ）の毒性を効果的に中和することを示す。

【図28】キメラＰＡ−５０（ｃＰＡ−５０） ｍＡｂが、親マウスＰＡ−５０（ｍＰＡ−５０） ｍＡｂと比較して、Ｔ−８４細胞でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ（６０ｎｇ／ｍＬ、ＴｅｃｈＬａｂ）の毒性を効果的に中和することを示す。

【図29】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢに対するマウスＰＡ−４１（ｍＰＡ−４１）およびヒト化ＰＡ−４１（ｈＰＡ−４１）ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性を示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｂｌｕｅを使用して、対照と比較した場合の細胞生存率のパーセンテージを測定した。ｈＰＡ−４１ ｍＡｂは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でトキシンＢ（２ｐｇ／ｍＬ、Ｔｅｃｈｌａｂ）の毒性を効果的に中和し、ＥＣ_５０が６ｐＭで、親のマウスモノクローナル抗体（ｍＰＡ−４１）と実質的に等力であった。

【図30】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡに対するマウスＰＡ−３９（ｍＰＡ−３９）およびヒト化ＰＡ−３９（ｈＰＡ−３９）ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性を示す。ｈＰＡ−３９ ｍＡｂは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でトキシンＡ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＴｅｃｈＬａｂ）の毒素を効果的に中和し、ＥＣ_５０が５０ｐＭで、親のマウスモノクローナル抗体（ｍＰＡ−３９）と実質的に等力であった。

【図31A】標記のｍＡｂを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性および作用機序（ＭＯＡ）研究の結果を示す。実施例１、３、７で説明するようにして、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＴ−８４細胞を用いる細胞ベースのアッセイを実施した。図３１Ａは、ヒト化ＰＡ−５０（ｈＰＡ−５０） ｍＡｂが、親のマウスＰＡ−５０ ｍＡｂ（ｍＰＡ−５０）と比較してＴ−８４細胞でトキシンＡ（６０ｎｇ／ｍＬ、ＴｅｃｈＬａｂ）の毒性を効果的に中和することを示す。

【図31B-D】標記のｍＡｂを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性および作用機序（ＭＯＡ）研究の結果を示す。実施例１、３、７で説明するようにして、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＴ−８４細胞を用いる細胞ベースのアッセイを実施した。対照の抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＡ−１の中和活性と比較した抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−５０の中和活性を示す。ＥＣ_５０および最大阻害率値は、実施例７Ｃの表Ａに示すとおりである。

【図31E-F】標記のｍＡｂを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性および作用機序（ＭＯＡ）研究の結果を示す。実施例１、３、７で説明するようにして、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＴ−８４細胞を用いる細胞ベースのアッセイを実施した。対照の抗トキシンＢ ｍＡｂ ＣＤＢ−１の中和活性と比較した抗トキシンＢ ｍＡｂ ＰＡ−４１の中和活性を示す。ＥＣ_５０および最大阻害率値は、実施例７Ｃの表Ｂに示すとおりである。

【図31G-H】標記のｍＡｂを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性および作用機序（ＭＯＡ）研究の結果を示す。実施例１、３、７で説明するようにして、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＴ−８４細胞を用いる細胞ベースのアッセイを実施した。細胞へのトキシンＡの内部移行をブロックする抗トキシンＡ ｍＡｂの機能を評価し、ポリクローナルヤギ抗トキシンＡ抗体対照および抗体対照なしの場合に対するトキシンＡの内部移行を防止する上でのこれらのｍＡｂの活性を見極めるためのＥＬＩＳＡ法とその結果を示す。

【図32A-B】ヒト化ＰＡ−３９（ｈＰＡ−３９）ＶＨ領域のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。アミノ酸残基を一文字コードで示してある。配列の上にある数字は、Ｋａｂａｔらによる位置を示す。ＣＤＲの位置に下線を付しておく。

【図33A-B】ヒト化ＰＡ−３９（ｈＰＡ−３９）ＶＬ領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。アミノ酸残基を一文字コードで示してある。配列の上にある数字は、Ｋａｂａｔらによる位置を示す。ＣＤＲの位置に下線を付しておく。

【図34A-B】ヒト化ＰＡ−５０（ｈＰＡ−５０）ＶＨ領域のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。アミノ酸残基を一文字コードで示してある。配列の上にある数字は、Ｋａｂａｔらによる位置を示す。ＣＤＲの位置に下線を付しておく。

【図35】ヒト化ＰＡ−５０のＶＬ領域（配列番号７）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸残基を一文字コードで示してある。配列の上にある数字は、Ｋａｂａｔらによる位置を示す。ＣＤＲの位置に下線を付しておく。

【図36A-B】ヒト化ＰＡ−４１（ｈＰＡ−４１）のＶＨ領域のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。アミノ酸残基を一文字コードで示してある。配列の上にある数字は、Ｋａｂａｔらによる位置を示す。ＣＤＲの位置に下線を付しておく。

【図37】ヒト化ＰＡ−４１のＶＬ領域のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。アミノ酸残基を一文字コードで示してある。配列の上にある数字は、Ｋａｂａｔらによる位置を示す。ＣＤＲの位置に下線を付しておく。

【図38A】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図３８Ａは、配列番号１７に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号１６で示すヒト化抗トキシンＡモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。

【図38B-1】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図３８Ｂは、配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号１４で示すヒト化モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。

【図38B-2】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図３８Ｂは、配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号１４で示すヒト化モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。

【図39A】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図３９Ａは、配列番号２１に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号２０で示すヒト化抗トキシンＡモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。

【図39B-1】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図３９Ｂは、配列番号１９に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号１８で示すヒト化抗トキシンＡモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。

【図39B-2】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図３９Ｂは、配列番号１９に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号１８で示すヒト化抗トキシンＡモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。

【図40A】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図４０Ａは、配列番号２５に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号２４で示すヒト化抗トキシンＢモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。

【図40B-1】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図４０Ｂは、配列番号２３に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号２２で示すヒト化抗トキシンＢモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。

【図40B-2】ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢモノクローナル抗体の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図４０Ｂは、配列番号２３に記載の核酸配列によってコードされる、配列番号２２で示すヒト化抗トキシンＢモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。

【図41A-C】対応する完全抗体の効力と比較した、マウスｍＡｂのＦａｂ断片のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡまたはトキシンＢに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性を示す。（図４１Ａ）：ＣＨＯ−Ｋ１細胞でのマウスｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−３９Ｆａｂ中和活性；トキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ、６０ｎｇ／ｍｌ）。（図４１Ｂ）：ＣＨＯ−Ｋ１細胞でのマウスｍＡｂ ＰＡ−４１およびＰＡ−４１Ｆａｂ中和活性；トキシンＢ（Ｔｅｃｈｌａｂ、２ｐｇ／ｍｌ）。（図４１Ｃ）：Ｔ−８４細胞でのマウスｍＡｂ ＰＡ−５０およびＰＡ−５０Ｆａｂ中和活性；トキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ、６０ｎｇ／ｍｌ）。

【図42A】本明細書の実施例１３で説明する薬物動態（ＰＫ）の研究で得られた抗体濃度プロファイルを示す。図４２Ａは、単一用量の精製ヒト化抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−５０を０日目に１ｍｇ／ｋｇ（▲）または５ｍｇ／ｋｇ（■）の濃度で与えた動物での２９日間におけるＰＫについての結果（μｇ／ｍＬ単位での血清抗体濃度）を示す。

【図42B】本明細書の実施例１３で説明する薬物動態（ＰＫ）の研究で得られた抗体濃度プロファイルを示す。図４２Ｂは、単一用量の精製ヒト化抗トキシンＢ ｍＡｂ ＰＡ−４１を０日目に１ｍｇ／ｋｇ（▲）または５ｍｇ／ｋｇ（■）の濃度で与えた動物での２９日間におけるＰＫについての結果（μｇ／ｍＬ単位での血清抗体濃度）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の病原作用をブロックする抗生物質によらない療法・治療を提供し、好ましくは、結腸が治癒するおよび／または結腸、腸、腸管などの消化管の正常な細菌叢が再建されるだけの時間を提供する、抗体およびその抗原結合性断片を包含する。本明細書で説明するようなモノクローナル抗体、その抗原結合性断片（そのヒト化抗体またはキメラ抗体など）は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症およびＣＤＡＤに罹患した患者が、別の疾患または一層重度の疾患または症候の再発なく疾患から回復できるよう、活動性疾患を治療し、再発性の疾患を予防する両方の目的で、抗生物質によらない治療剤および医薬剤を提供するものである。一実施形態では、本発明の抗体は、被検体がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染することで引き起こされる、あるいはこれに関連している、活動性疾患に対する治療活性を有する。一実施形態では、本発明の抗体は、被検体がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染することで引き起こされる、あるいはこれに関連している、活動性疾患から回復させる。一実施形態では、本発明の抗体は、被検体がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染することで引き起こされる、あるいはこれに関連している、活動性疾患の期間を短縮および／または重症度を低減する治療効果を有する。一実施形態では、本発明の抗体またはその一部またはその断片を、抗生剤の治療剤と併用して提供することが可能である。

【0064】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびＢに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、本明細書で説明するようにして作製した。抗トキシンｍＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイと、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のｉｎ ｖｉｖｏでの前臨床動物モデルの両方で強力な活性を呈する。特に本発明のｍＡｂは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の関連のストリンジェントなハムスターモデルで死亡率からハムスターを強力かつ永続的に保護する。

【0065】

抗体は、ＣＤＡＤを治療するための抗生物質によらない手法を提供するものであり、抗生剤の中断を可能にし、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンの病原作用をブロックすることで、結腸が治癒するおよび／または正常な腸内細菌叢が再建されるだけの時間を提供できるものである。本明細書で説明するようなｍＡｂは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンを中和する機能がゆえに、治療上の利点を提供可能であり、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の多発性再発のある患者を治療する受動的または能動的な戦略で利用できる。特に、感染の再発防止、疾患の重度かつ活動性の形態の治療、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の多発性再発のある患者の治療にｍＡｂを利用してもよい。本明細書で説明するようなｍＡｂは、感染の再発および／または疾患の重度かつ活動性の形態および多発性再発を防止、ブロックまたは阻害するためのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびＢを中和する効果的な手段となり得る。

【0066】

本明細書で使用する場合、「トキシンＡ」および「トキシンＢ」とは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）微生物によって産生される細胞傷害性のエンテロトキシンを示す。トキシンＡおよびＢは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の主な病原性決定基であり、トキシン陰性株は非病原性である。トキシンＡおよびＢは、トキシン遺伝子ｔｃｄＡ（トキシンＡ）およびｔｃｄＢ（トキシンＢ）と、３つの調節遺伝子とを含む病原性遺伝子座から転写され、この３つの調節遺伝子のうちの１つ（ｔｃｄＣ）がトキシン転写の推定上の陰性調節因子をコードする。ＴｃｄＣタンパク質は、細菌のライフサイクルにおける初期と対数期にトキシンの転写を阻害するように見える。トキシンＢでは、ロイシン_５４３とグリシン_５４４との間の自己触媒的な切断部位が説明されている。切断は、宿主の細胞質イノシトールリン酸によってアスパルチルプロテアーゼドメインが活性化され、活性なグルコシルトランスフェラーゼドメインが放出された結果として起こるものである。

【0067】

本明細書で提供されるのは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性断片、このような抗体またはその抗原結合性断片のうちの１種類以上を含有する組成物、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸配列を含有するベクター、抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、抗体またはその抗原結合性断片を、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療または予防に使用する方法である。

【0068】

本発明およびそのさまざまな態様および実施形態を説明するにあたって「抗体」または「免疫グロブリン」という用語を本明細書で使用する場合、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語を使うたびに関連する言い回しである「抗原結合性断片」を必要以上に繰り返すのを避けるために、この用語は通常、そのような抗体または免疫グロブリンの抗原結合性断片も包含することを想定していることを理解されたい。よって、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢ向けの抗体すなわち、トキシンＡおよびトキシンＢ抗原だけでなく、本明細書でさらに説明するようなクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢ抗原に結合するこのような抗体の断片も包含する。実施形態では、このような抗原結合性断片は、トキシンＡおよび／またはトキシンＢの毒性を、元のままの抗体と同様に中和できる。

【0069】

本発明に包含される抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡを特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する特異的な結合を競合的に阻害または交差競合する、単離された抗体を含む。この抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡを特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのエピトープを特異的に結合する単離された抗体も含む。いくつかの実施形態では、エピトープがｔｃｄＡのＣ末端受容体結合ドメインにある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、ｔｃｄＡに対するＰＡ−５０の結合を競合的に阻害または交差競合する。他の実施形態では、エピトープがｔｃｄＡのトランスロケーションドメインにある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、ｔｃｄＡに対するＰＡ−３９の結合を競合的に阻害または交差競合する。このような単離された抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、その抗原結合断片または一部を含むものであってもよい。

【0070】

本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢモノクローナル抗体の特異性を評価するためのトキシンＢの酵素的（カスパーゼ１）タンパク質分解を用いる実験を、実施例６で説明するようにして実施した。ｍＡｂ ＰＡ−３９が認識して結合するトキシンＡのエピトープは、トキシンＡの受容体結合ドメインとは区別される領域内すなわち、トキシンＡ受容体結合ドメインの外にあり、Ｃ末端トキシンＡの受容体結合ドメインに結合することが報告されているヒト抗トキシンＡ抗体が結合するエピトープとも区別される（７）。本明細書の実施例６および７で説明し、図２２および図３１に示すように、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイは、ＰＡ−３９に対するトキシンＡの単一の結合部位をサポートする。酵素消化したトキシンＡのウェスタンブロット検出によって、ＰＡ−３９が、ＰＡ−５０およびＣＤＡ−１対照ｍＡｂが結合する領域とは別のトキシンＡの領域に結合することがわかる。トキシン効力アッセイにおけるＰＡ−３９のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は、培養に対するトキシンＡの添加量が増えるにつれて、ＥＣ_５０および最大阻害率の両方がシフトすることを示しており、ＰＡ−３９阻害の混合−競合的機序が認められる。１００倍過剰なＰＡ−３９で保護した後のトキシンＡのＥＬＩＳＡ検出によって、ＰＡ−３９によるトキシンの阻害が、トキシンの内部移行と有害な細胞毒（ｃｙｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｎ）作用、たとえば、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）を防いで起こることが確認された。

【0071】

また、本明細書の実施例６および７で説明し、図２２および図３１に示すように、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイは、ＰＡ−５０に対するトキシンＡの少なくとも２つの結合部位をサポートする。酵素消化したトキシンＡのウェスタンブロット検出によって、ＰＡ−５０が、トキシンＡの対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１が結合する領域と同様の領域に結合することがわかる。トキシン効力アッセイにおけるＰＡ−５０のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は、培養に対するトキシンＡの添加量が増えるにつれてＥＣ５０がシフトすることを示しており、ＰＡ−５０阻害の競合的機序が認められる。１００倍過剰なＰＡ−５０で保護した後のトキシンＡのＥＬＩＳＡ検出によって、ＰＡ−５０によるトキシンの阻害が、トキシンの内部移行と以後の細胞毒性を防いで起こることが確認された。

【0072】

また、本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する特異的な結合を競合的に阻害または交差競合する、単離された抗体も含む。この抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢを特異的に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのエピトープを特異的に結合する、単離された抗体も含む。いくつかの実施形態では、エピトープが、ｔｃｄＢのＮ末端酵素ドメインにある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、ｔｃｄＢに対するＰＡ−４１の結合を競合的に阻害または交差競合する。他の実施形態では、エピトープが、ｔｃｄＢのトランスロケーションドメイン、たとえば、アミノ酸８５０〜１３３０にある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、ｔｃｄＢに対するＰＡ−３９の結合を競合的に阻害または交差競合する。

【0073】

本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体の特異性を評価するためのトキシンＡの酵素的（エンテロキナーゼ）タンパク質分解を用いる実験を、実施例６で説明するようにして実施した。ｍＡｂ ＰＡ−４１（ＰＴＡ−９６９３）は、トキシンＢのＮ末端酵素ドメインに由来する約１０３ｋＤａと６３ｋＤａの断片を認識することが明らかになった。主要な消化断片のＮ末端配列分析によって、この分析結果を確認した。ｍＡｂ ＰＡ−４１は、ヒト抗トキシンＢ抗体が結合するトキシンＢのＣ末端受容体結合ドメインとは区別されるトキシンＢのＮ末端酵素ドメイン内のユニークなエピトープに結合することが明らかになった（７）。本明細書の実施例６および７で説明し、図１９および図３１Ｅおよび図３１Ｆに示すように、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイは、ＰＡ−４１に対するトキシンＢの単一の結合部位をサポートする。酵素消化したトキシンＢのウェスタンブロット検出によって、ＰＡ−４１が、対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１が結合する領域とは異なる別のトキシンＢの領域に結合することがわかる。トキシン効力アッセイにおけるＰＡ−４１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は、培養に対するトキシンＢの添加量が増えるにつれて、ＥＣ_５０および最大阻害率の両方がシフトすることを示しており、ＰＡ−４１阻害の混合−競合的機序が認められる。

【0074】

本明細書で得られる抗体は、寄託され、以下の特許寄託の表示がなされたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を含む。ＰＴＡ−９６９２（ＰＡ−３９）、ＰＴＡ−９６９３（ＰＡ−４１）、ＰＴＡ−９６９４（ＰＡ−５０）、ＰＴＡ−９８８８（ＰＡ−３８）。これらのハイブリドーマは、２００９年１月６日（ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９３、ＰＴＡ−９６９４）および２００９年３月２４日（ＰＴＡ−９８８８）に、国際寄託機関としてのＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）、Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５４９， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１０８ ＵＳＡに従って、その要件を満たす形で寄託され、上述した特許寄託の表示がなされた。本明細書で使用する場合、寄託されたハイブリドーマと、このハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の両方を、同一のＡＴＣＣ寄託の表示またはＡＴＣＣ寄託の表示に含まれる数字で示すこともある。たとえば、ＰＴＡ−９８８８または９８８８を、寄託されたハイブリドーマまたはこのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を示すのに、使用することがある。したがって、本明細書に記載のモノクローナル抗体の名称は、それを産生するハイブリドーマの名称と同義に用いられる。ある名称が、どの部分で抗体またはその抗体を産生するハイブリドーマを示すことを意図しているかは、当業者には明らかであろう。本明細書に記載の抗原結合性断片は、上述した寄託抗体の抗原結合性断片を含む。

【0075】

本発明の抗体は、多数の有益な特徴を呈する。たとえば、抗トキシンＡ抗体は、トキシンＡの毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で中和または阻害する。ＩＭＲ−９０細胞、ヒト化ＰＡ−３９およびヒト化ＰＡ−４１を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和研究では、細胞のトキシンＡに対する４６ｐＭの中和力（すなわちＥＣ_５０値）と、これらの細胞のトキシンＢに対する５ｐＭを示した。ヒト抗トキシンＡモノクローナル抗体および抗トキシンＢモノクローナル抗体による中和について文献に報告されている値（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書；Ｂａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ２００６）（７）と比較すると、ｈＰＡ−３９の４６ｐＭのＥＣ_５０中和値のほうが、ヒト抗トキシンＡ ｍＡｂで報告されている値よりも高いように見え、ｈＰＡ−４１の５ｐＭのＥＣ_５０中和値もヒト抗トキシンＢ ｍＡｂで報告されている値よりも高いように見えた。したがって、本明細書に記載した研究では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡモノクローナル抗体および抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢモノクローナル抗体、特に、これらのモノクローナル抗体のヒト化形態は、すでに報告のある他の抗トキシン抗体の場合と比較して、抗トキシン中和特性が高かったことがわかる。

【0076】

一実施形態では、本発明の抗トキシンＡ抗体は、有効用量で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡの毒性をｉｎ ｖｉｖｏにて中和または阻害する。もうひとつの実施形態では、抗トキシンＢ抗体が、トキシンＢの毒性をｉｎ ｖｉｖｏで中和または阻害する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に有効用量の１種類以上の本発明の抗トキシンＡ抗体を提供する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に、有効用量の１種類以上の本発明の抗トキシンＢ抗体との組み合わせで、有効用量の１種類以上の本発明の抗トキシンＡ抗体を提供する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に、有効用量として、本発明の抗トキシンＢ抗体との１：１の組み合わせでの本発明の抗トキシンＡ抗体を提供する。一実施形態では、有効用量の本発明の抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体が、たとえば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症被検体に提供される複数の抗体の１／２：１、１：１、２：１、３：１、４：１などの組み合わせであってもよい。一実施形態では、抗体がヒト化されている。一実施形態では、抗体が組成物に含まれる。実例として、有効用量の抗トキシンＡ抗体および／または抗トキシンＢ抗体は、０．１μｇ〜１０００ミリグラム（ｍｇ）の範囲であってもよい。抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片を、たとえば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇの量、０．５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇの量、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの量、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの量、２ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの量、２ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの量、５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの量、５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの量、１０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの量、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの量、１０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの量または１５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの量で被検体に投与すればよい。一実施形態では、上述した量が、組み合わせで提供されるさまざまな比の抗トキシンＡ抗体と抗トキシンＢ抗体を含むものであってもよい。

【0077】

本明細書で使用する場合、「中和する」とは、抗体が特異的に結合するトキシンの有害作用の低減、阻害、ブロック、緩和または排除を示す。トキシンの有害作用の中和としては、１）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症または疾患の発症または進行を遅延、低減、阻害または防止すること、２）抗体での治療をしておらず、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のある被検体の生存中央値と比較して被検体の生存期間を延ばすこと、３）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症または疾患に関連する１つ以上の症候または有害作用を排除または１つ以上の症候または有害作用の重症度を低減すること、４）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染するまたは感染している被検体の正常な消化管の再増殖を可能にすること、５）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患に悩んでいる被検体でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の再発を防止すること、６）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のある被検体での治癒率を少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％にすることおよび／または７）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に関連したＣＤＡＤまたは他の有害イベントによる死を防ぐことがあげられる。

【0078】

本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢ抗体を使用して、人間（ヒト）および他の非ヒト（哺乳類）動物を含む多数の種の被検体を治療できる。本発明によって治療可能な被検体としては、人間、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマなどがあげられる。ヒト被検体については、本明細書では患者または個体とも呼ぶ。特に、被検体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のあるヒトの患者を含む。このようなヒト患者には、高齢者や免疫無防備状態の人を含む。

【0079】

本発明によれば、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ抗体およびトキシンＢ抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患を回復させ、被検体の生存期間を延ばすことができる。一実施形態では、１種類以上の抗トキシンＡ抗体および／または１種類以上の抗トキシンＢ抗体を、被検体に投与すると、抗体で治療しておらず、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のある被検体の生存中央値と比較して、被検体の生存が改善される。

【0080】

いくつかの実施形態では、１種類以上の抗トキシンＡ抗体または抗トキシンＢ抗体の用量または量が、たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏでのマウスの研究などに基づいて、０．２μｇ〜２５０μｇの範囲または２μｇ〜５０μｇの範囲または５μｇ〜５０μｇの範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、１種類以上の抗トキシンＡ抗体または抗トキシンＢ抗体、特に抗トキシンＡ抗体と抗トキシンＢ抗体との組み合わせの用量または量が、たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏでのハムスターの研究などに基づいて、２ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。

【0081】

もうひとつの例として、本発明の抗体は、治癒率または生存率を、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％にすることが可能なものである。もうひとつの例として、この抗体は、治癒率または生存率を１００％にすることが可能なものである。一実施形態では、１種類以上の抗トキシンＡ抗体は、被検体に投与すると、１種類以上の抗トキシンＢ抗体との組み合わせで、治癒率または生存率を５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％にすることができる。本明細書で使用する場合、「治癒率」とは、本発明の１種類以上の抗体またはその１種類以上の組成物を投与した、感染または疾患のあった被検体集団のうち、感染または疾患がなくなったと臨床医が判断した被検体の割合を示す。「生存率」とは、本明細書で使用する場合、本発明の１種類以上の抗体またはその１種類以上の組成物を投与した被検体集団のうち、所望の期間にわたって生存する被検体の割合を示す。このような所望の期間の例については、本明細書の別の部分であげておく。

【0082】

本発明によって得られる抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染した被検体で、正常な腸細菌叢の回復を可能にするものである。このようにして、このような抗体は、治療中の患者を疾患から回復させることができる。また、本発明の抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体は、有益なｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態も呈する。本発明の抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染した被検体に、長期にわたってまたは持続する療法を提供できるものでもある。本明細書で使用する場合、「持続性」とは、治療中断後に、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のない状態を１か月以上保てる療法を示す。好ましくは、この療法は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のない状態を２か月以上保つ。いくつかの実施形態では、本発明のｍＡｂを用いる療法で、活性なクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症が治療または抑制され、感染の頑健性が低減または減少される。他の実施形態では、本発明によって得られる療法は、被検体で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のない状態を、１、２、３、４、５または６か月保つ。他の実施形態では、本発明によって得られる療法が、被検体で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のない状態を、６か月よりも長い期間保つ。本発明の抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の再発を予防することが可能である。

【0083】

ＣＤＡＤの再発性は、新たな抗生剤であるレボフロキサシンおよびモキシフロキサシンという２種類に対して耐性であることが明らかになった高病原性ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株の出現によって、結局は悪くなっている。このような株は、米国、カナダ、西ヨーロッパ中で頻度が増す流行のきっかけとなった。高病原性株には、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄタイプ１（ＮＡＰ１）、制限酵素分析タイプ「ＢＩ」、ＰＣＲリボタイプ０２７（総称としてＢＩ／ＮＡＰ１／０２７で知られる）としてキャラクタライズされた、密接に関連した分離株の群を含む（５）。ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株の高病原性は、少なくとも一部は、ＣＤＡＤの２つの病原因子であるトキシンＡおよびＢの産生量が増えることによるものである（６）。ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７分離株は、他の株よりも１６〜２３倍高いレベルのトキシンＡおよびＢを産生する（６）。これらの株が明らかに適合していくと、他の疾患に対する抗生剤での治療の可能性を危うくする世界的な広まりをみせるおそれがあり、ＣＤＡＤの再発率と重症度が高まるおそれもある。ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニン、フィダキソマイシンなど、ＣＤＡＤの治療用に開発中の抗生剤もあるが、リファキシミンに耐性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の臨床分離株が報告されている。最近では、完全なフェーズ３の臨床試験（９１）で、フィダキソマイシンがバンコマイシンよりも全体としてのＣＤＡＤ再発率を有意に低減させたが、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株には効かなかった。高病原性ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株が広まったことで、入院期間が長くなり、治療が失敗し、再発頻度が上がり、死亡率も上がっている（３）。新規に開発され、本明細書にて説明するｍＡｂは、ＣＤＡＤの出現率と重症度の上昇にはどめをかけるための新たな治療法となるものである。

【0084】

一実施形態では、本発明のｍＡｂを、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のさまざまな株によって生じる感染の治療に用いる。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株は、極めて感染性が高く、そのトキシンを本発明のｍＡｂで中和する。一実施形態では、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７をはじめとする、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株のトキシンを、本発明のｍＡｂで中和する。一実施形態では、本発明のｍＡｂは、外来患者分離株由来の株を含む、広範囲にわたる毒素産生性臨床分離株からのトキシンを中和するにあたって治療効果を提供するものである。好ましくは、ｍＡｂは、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７などの高病原性分離株のトキシンを中和し、少なくとも９０％以上のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の他の臨床的に関連する分離株のトキシンを中和する。特に、本明細書の実施例８で示すように、本発明のｍＡｂは、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７および他の高病原性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、たとえば、ＣＣＬ６７６、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ４５、ＣＤ１９６、ｍｏｎｔｒｅａｌ ５、ｍｏｎｔｒｅａｌ ７．１をはじめとして、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の１９種類の臨床分離株の毒性／活性を有意に中和することが明らかになっている。本発明によれば、たとえば限定なく、抗トキシンＡ ｍＡｂの場合でＥＣ_５０値が７．７^−１２Ｍ〜４．８^−８Ｍの範囲、抗トキシンＢ ｍＡｂの場合でＥＣ_５０値が１．１^−１１Ｍ〜６．５^−１０Ｍの範囲になることから判断すると、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株のトキシンＡおよびトキシンＢを中和する抗体が得られる。また、本発明のｍＡｂは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症およびこれに関連する疾患の治療の際に、病院由来の分離株および病院以外のところに由来する分離株を含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性株の中和に用いるよう提供される。

【0085】

他の実施形態において、かつ、非限定的な例によって、本発明のｍＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで利用する細胞ベースのアッセイに応じて、トキシンＡを中和する場合のＥＣ_５０中和値が９３ｐＭ〜３０ｎＭの範囲またはＥＣ_５０４６ｐＭであり、トキシンＢを中和する場合のＥＣ_５０値が４ｐＭ〜９．５ｐＭの範囲またはＥＣ_５５ｐＭである。本明細書の実施例３で説明するように、８μｇ／ｍｌのトキシンＡを用いる、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含むアッセイでは、本発明の抗トキシンＡ ｍＡｂのＥＣ_５０値が９３ｐＭであった。８ｐｇ／ｍｌのトキシンＢを用いるＣＨＯ−Ｋ１細胞を含むアッセイでは、本発明の抗トキシンＢ ｍＡｂは、ＥＣ_５０値が９．２ｐＭであった。２４０ｎｇ／ｍｌのトキシンＡを用いるＴ−８４細胞を含むアッセイでは、本発明の抗トキシンＡ ｍＡｂのＥＣ_５０値は、１４６ｐＭおよび１７５ｐＭであった。Ｃａｃｏ−２細胞ベースのアッセイでは、本発明の抗トキシンＡ ｍＡｂが、ＥＣ_５０レベル１９６ｐＭおよび４８５ｐＭでトキシンＡの毒性を中和した。８μｇ／ｍｌのトキシンＡを用いる赤血球の血球凝集アッセイでは、ＲＢＣ血球凝集を防止するための本発明の抗トキシンＡ ｍＡｂのＥＣ_５０中和値が、１．８ｎＭおよび３０ｎＭであった。

【0086】

本発明の抗体は、上述した特徴のうち任意の１つ、これらの組み合わせまたはそのすべてを含み得るものである。

【0087】

本明細書の実施例で説明するように、本発明のｍＡｂは、ＣＤＡＤの最も入手可能な前臨床モデルで、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で優れたトキシン中和効力を示す。また、本発明のｍＡｂは、多数のＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株から得られるトキシンに対して独特の広くて強力な中和を示す。さらに、このようなｍＡｂは、ＣＤＡＤの高度にストリンジェントなハムスターモデルで死亡率からの完全かつ持続性の保護を示した。これらの結果は、本発明のｍＡｂが、結腸が治癒し、正常な腸内細菌叢が再建され、ＣＤＡＤ疾患および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症から回復させられるような方法で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンの病原作用を効率的かつ効果的にブロックする能力を裏付ける。

【0088】

一実施形態では、トキシンＡに対する抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する抗体を含む。好ましいトキシンＢに対する抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する抗体を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する。すべての実施形態が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４、ＰＴＡ−９８８８またはＰＴＡ−９６９３で、上述した抗体のヒト化形態をさらに含む。

【0089】

結合の競合的阻害または交差競合を判断するには、当業者に知られた多岐にわたるアッセイを用いることが可能である。たとえば、交差競合アッセイを使用して、抗体が、もうひとつの抗体によってトキシンＡおよび／またはトキシンＢへの結合を競合的に阻害するか否かを判断することが可能である。このような方法は、フローサイトメトリーまたは固相結合分析を用いる細胞ベースの方法であってもよい。抗体が固相または溶液相においてトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する結合と交差競合する機能を評価する他のアッセイも使用可能である。本発明に包含される抗体またはその抗原結合性断片の例としては、特異的な結合を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％競合的に阻害するものがあげられる。さまざまなモル比または質量比で、阻害を評価することが可能である。たとえば、２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍またはそれを超えるモル過剰の第１の抗体と第２の抗体で、競合的結合実験を実施することが可能である。

【0090】

本発明に包含される他の抗体としては、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体による結合によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのエピトープに特異的に結合するものがあげられる。本発明に包含されるさらに他の抗体または抗原結合性断片としては、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのエピトープに特異的に結合するものがあげられる。本発明に包含されるさらに他の抗体または抗原結合性断片としては、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２、ＰＴＡ−９６９４またはＰＴＡ−９８８８で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡのエピトープに特異的に結合し、かつ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３またはＰＴＡ−９６９２で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢのエピトープに特異的に結合するものがあげられる。

【0091】

エピトープを判断するには、従来技術において知られた標準的なエピトープマッピング法を用いることが可能である。たとえば、抗体に結合するトキシン（好ましくは合成ペプチド）の断片（ペプチド）を使用して、候補抗体またはその抗原結合性断片が同一のエピトープに結合するか否かを判断することが可能である。線形エピトープの場合、規定の長さ（たとえば、８アミノ酸以上など）のオーバーラップするペプチドを合成する。トキシン配列の８アミノ酸断片ずつカバーする一連のペプチドがが調製されるように、このペプチドは、好ましくは１アミノ酸分だけずれている。たとえば、２または３アミノ酸などのもっと大きなオフセットを使って、これよりも少ないペプチドを調製することも可能である。また、これよりも長いペプチド（たとえば、９マー、１０マーまたは１１マー）を合成することも可能である。表面プラズモン共鳴（たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ）およびＥＬＩＳＡアッセイをはじめとする標準的な方法を用いて、抗体に対するペプチドの結合を求めることが可能である。本明細書で得られる抗体が、いくつかの実施形態で結合できる立体エピトープを調べるために、さらに大きなペプチド断片を使用することが可能である。質量分析を使って立体エピトープを規定する他の方法が文献に記載され、これを利用することが可能である（たとえば、Ｂａｅｒｇａ−Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１：１３００〜１３０８， ２００２およびそこに引用された参考文献を参照のこと）。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓのユニット６．８（「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」）およびユニット９．８（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」）など、エピトープを判断するためのさらに他の方法が、標準的な実験室でのリファレンスワークに提供されている。１つ以上の点変異または欠失を既知のエピトープに導入した後、１種類以上の抗体との結合を試験して、どの変異が抗体との結合を減らすか判断すれば、エピトープを確認することが可能である。

【0092】

本発明によって得られる抗体または抗原結合性断片は、ナノモル以下の親和性でトキシンＡおよび／またはトキシンＢに特異的に結合するものであってもよい。抗体または抗原結合性断片は、結合親和性が約１×１０^−９Ｍ以下、約１×１０^−１０Ｍ以下または約１×１０^−１１Ｍ以下のものであってもよい。特定の実施形態では、結合親和性が約５×１０^−１０Ｍ未満である。

【0093】

抗体または抗原結合性断片のトキシンＡまたはトキシンＢに対する結合速度定数（Ｋｏｎ）が、表面プラズモン共鳴で測定した場合の少なくとも１０^２Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^３Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１；少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１；または少なくとも１０^７Ｍ^−１ｓ^−１であってもよい。抗体または抗原結合性断片のトキシンＡまたはトキシンＢに対する解離速度定数（Ｋｏｆｆ）が、表面プラズモン共鳴で測定した場合の最大で１０^−３ｓ^−１；最大で１０^−４ｓ^−１；最大で１０^−５ｓ^−１；または最大で１０^−６ｓ^−１であってもよい。抗体または抗原結合性断片のトキシンＡまたはトキシンＢに対する解離定数（Ｋ_Ｄ）が、最大で１０^−７Ｍ；最大で１０^−８Ｍ；最大で１０^−９Ｍ；最大で１０^−１０Ｍ；最大で１０^−１１Ｍ；最大で１０^−１２Ｍ；または最大で１０^−１３Ｍであってもよい。

【0094】

本明細書で使用する場合、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、ジスルフィド結合で相互に連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチドと２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドとを含む、糖タンパク質を含む。重鎖は各々、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略す）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインすなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３からなる。軽鎖は各々、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略す）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣ_Ｌからなる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変性の領域と、そのあいだのところどころに介在する一層保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域とにわけることができる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの可変領域は、抗原と相互作用する／抗原に結合する結合ドメインを含むまたは形成する。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（たとえば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または宿主因子への、免疫グロブリンの結合を媒介できる。

【0095】

本発明は、本明細書でさらに説明するような、単鎖抗体、組換え的に作製された抗体、二重特異性、異種特異的または多量体抗体、二特異性抗体など、他の形態の抗体をさらに提供するものである。

【0096】

抗体の「抗原結合性断片」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原（トキシンＡ、トキシンＢ、トキシンＡおよびトキシンＢ、など）または抗原のエピトープ領域に特異的に結合する能力を持つ、抗体の１つ以上の部分を意味する。抗体の抗原結合作用は、全長抗体の断片により実現できることが示されている。一実施形態では、モノクローナル抗体の断片が、元のままの対応するモノクローナル抗体と同様に機能する。一実施形態では、モノクローナル抗体の断片が、元のままの対応するモノクローナル抗体と交差反応する。一実施形態では、モノクローナル抗体の断片を、元のままの対応するモノクローナル抗体と同義に用いることが可能である。抗体の「抗原結合性断片」という用語に含まれる結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片（Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、Ｃ_Ｌドメイン、Ｃ_Ｈ１ドメインからなる一価の断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片（ヒンジ領域においてジスルフィド結合で結合される２つのＦａｂ断片を含む二価の断片）；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶ_ＬドメインとＶ_ＨドメインとからなるＦｖ断片；（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶ_ＬおよびＶ_Ｈは、離れた遺伝子でコードされるが、組換え方法を利用して、これらをＶ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域の組が一価の分子を形成する１本のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；たとえば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６； ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３を参照のこと）にさせることのできる合成リンカーによって、これらのドメインを連結することが可能である。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性断片」という用語に含むことを想定している。これらの抗体断片は、本明細書に援用するＪ． Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ ９８〜１１８ （Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８３に記載されているようなタンパク分解断片化手順ならびに当業者らに知られた他の技術などの従来の手順を用いて得られるものである。これらの断片を、元のままの抗体と同じようにして活性または有用性についてスクリーニングする。

【0097】

一実施形態では、本明細書の実施例１０で説明するようにして、本発明のｍＡｂのＦａｂ断片を生成し、細胞ベースのアッセイで中和活性を試験した。よって、本発明のｍＡｂのＦａｂ断片などの抗体断片を利用して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢを結合および中和してもよい。

【0098】

本明細書で使用する場合、「単離された抗体」、異なる抗原特性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことを想定している（トキシンＡに特異的に結合する単離された抗体は、トキシンＡ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まないなど）。しかしながら、トキシンＡまたはトキシンＢのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は通常、他のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株などに由来する他の関連抗原に対する交差反応性を有する。また、トキシンＡのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、トキシンＢにも特異的に結合でき、トキシンＢのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、トキシンＡにも特異的に結合できる。しかしながら、いくつかの実施形態では、トキシンＡのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントを特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片は、トキシンＢに特異的に結合しない。さらに他の実施形態では、トキシンＢのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片は、トキシンＡにも特異的に結合しない。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。異なる抗原特性を有する他の抗体または他の材料および／または化学物質および／またはタンパク質を実質的に含まない抗体が、単離および／または精製された抗体であってもよい。抗体については、親和性クロマトグラフィ、タンパク質Ａクロマトグラフィなどの当業者らが一般に実施している方法で精製すればよい。本明細書で使用する場合、「特異的な結合」とは、あらかじめ定められた抗原または同族抗原に対する抗体結合を示す。一般に、抗体は、あらかじめ定められた抗原または近縁抗原以外の非特異抗原（ＢＳＡ、カゼインなど）への結合親和性より、少なくとも２倍強い親和性をもって結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、トキシンＡおよび／またはトキシンＢなどの標的抗原のリニアエピトープに結合するものであってもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、トキシンＡおよび／またはトキシンＢなどの標的抗原の立体エピトープに結合するものであってもよい。

【0099】

本発明の単離された抗体は、重鎖クラスまたはアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびそのサブタイプ、たとえば、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ；軽鎖アイソタイプκおよびλおよびそのサブタイプなどのさまざまな抗体（免疫グロブリン）重鎖および軽鎖アイソタイプを含む。一実施形態では、単離された抗体は、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ１κのアイソタイプである。本明細書で使用する場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子および軽鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（ＩｇＭまたはＩｇＧ１またはλ１など）を示す。抗体またはその抗原結合性断片は、全長であってもよいし、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの抗体定常ドメインおよび／または可変ドメインなどの抗原結合性断片のみを含み得るか、あるいはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片で構成可能なものである。

【0100】

本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との混合物であり得る。抗体は、当該技術分野で周知の多岐にわたる技術で作製可能なものである。ポリクローナル抗体を作製する手順は周知である。非限定的な例としてポリクローナル抗体は、まずは免疫前血清を得るために採血したニュージーランド白ウサギに、トキシンＡおよび／またはトキシンＢタンパク質を皮下的に投与することによって作製される。トキシンＡおよび／またはトキシンＢを、一般には１種類以上のアジュバントｓを、異なる６ヶ所へ１ヶ所あたり総量１００μｌ、典型的には１つ以上の調整剤と共に投与し得る。それからウサギを、最初の注射から２週間後に採血し、６週間ごとに３回、同じ抗原を定期的に追加投与する。血清のサンプルは、それぞれの追加投与から１０日後に採取する。好ましくはトキシンＡおよび／またはトキシンＢを使用したアフィニティクロマトグラフィで抗体を捕捉して、ポリクローナル抗体を、血清から回収する。このポリクローナル抗体を作製する手順と他の手順は、Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．， Ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８８）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（本明細書中に援用する）に開示される。

【0101】

モノクローナル抗体の作製を、この分野で周知の技術によって実施してもよい。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体は、ある抗原または免疫原の特定のエピトープに対し、単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体を作製する過程は、抗体産生の可能性のある免疫体細胞（特にＢリンパ球）を得る工程を伴う。この細胞は、かつてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの一方または利用法で目的の抗原で免疫されており、Ｂ細胞骨髄腫株との融合に適している。後述するように、モノクローナル抗体は、ヒトの免疫系を持つよう遺伝子的に操作したマウス株で、マウス、ヒトの細胞および細胞系統などの異なる種から、あるいは例えば免疫細胞および骨髄腫細胞を使用して、同じようにさらに生産することができる。

【0102】

トキシンＡおよびトキシンＢ用のモノクローナル抗体は一般に、トキソイド（トキシンＡおよびトキシンＢの不活性な形態）および／またはこれらのトキシンの不活性な断片で動物を免疫することにより作製されたが、本発明のｍＡｂは、新しい免疫化戦略を、使用することによって作製されている。本発明によれば、本明細書で説明して寄託するｍＡｂは、動物をトキソイドで免疫した後、トキシンＡおよび／またはトキシンＢ（実施例１参照）の活性（非トキソイド）形態でブーストすることで作製されている。トキシンＡまたはトキシンＢの活性形態でブーストすると、新規な免疫化スキームによるユニークに保護された抗体を開発した、免疫になった動物を同定するよう機能している。理論に拘泥されるわけではないが、活性トキシンＡおよび／またはトキシンＢブースト計画は、レシピエント動物で一層高度に免疫原性であった。これらの活性トキシンＡまたはトキシンＢのブースト用量を増やしたこと（一般には未感作の動物には致死的である）に対して耐性となった動物は、非常に効果的な中和抗体を産生し、活性トキシンが入ってきたにもかかわらず、これがゆえに動物を保護して生存に寄与した。トキシンＡまたはトキシンＢに対する効果的な免疫応答を持つ動物からのハイブリドーマの作製によって、非常に強力な抗トキシンＡおよび抗トキシンＢモノクローナル抗体が得られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ハイレベルの保護が得られる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含む抗体を作製する際に、アジュバントを使用してもよい。使用するのに好適なアジュバントの非限定的な例として、不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、Ｒｉｂｉ（すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸、ミコバクテリウム細胞壁骨格、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、２％のスクアレンと）、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａまたはミョウバンがあげられる。トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリンなど、脂質にトキシン（あるいはその断片、不活性な誘導体あるいは類似物）をコンジュゲートすることにより、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答をプライムすることができる。

【0103】

他の実施形態では、トキシンＡおよび／またはトキシンＢ向けのモノクローナル抗体の作製に別の免疫化方法を利用することができる。たとえば、動物（マウスなど）のｉｎ ｖｉｖｏでの免疫化を、所望のタイプと量のタンパク質またはポリペプチド（トキソイド、トキシンなど）で実行することができる。そのような免疫化は、抗体の十分な力価を得られる数週間までの間隔で必要に応じて繰り返される。いちど免疫化すれば、その動物を、抗体を産生するリンパ球の起源として使用することができる。最後の抗原ブースト後、動物を屠殺し、脾臓細胞を除去する。マウスのリンパ球は、本明細書に記載のマウス骨髄腫系統と高い割合で安定した融合をする。これらのうち、ＢＡＬＢ／ｃマウス株が適している。しかしながら、他のマウス株、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、カエルを、抗体産生細胞作製用の宿主として使用してもよい。Ｇｏｄｉｎｇ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ２ｄ ｅｄ．， ｐｐ．６０〜６１， Ｏｒｌａｎｄｏ， Ｆｌａ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）を参照のこと。特に、ヒト免疫グロブリン遺伝子がゲノムに挿入され（マウスの免疫グロブリンを産生できない）マウス株を使用できる。一例として、Ｍｅｄａｒｅｘ（現Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）／ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって作製されたＨｕｍＡｂマウス株や、Ａｂｇｅｎｉｘによって作製されたＸｅｎｏマウス株があげられる。このようなマウスは、免疫に応答して完全にヒトの免疫グロブリン分子を産生する。

【0104】

分割する形質芽細胞にある抗体産生細胞は優先的に融合する。抗原でプライムした動物のリンパ節、脾臓、末梢血から体細胞を得てもよく、選択するリンパ細胞は、特定の融合系での経験的な有用性に大きく左右される。その後、抗体を分泌するリンパ球を（マウス）Ｂ細胞骨髄腫細胞またはトランスフォームされた細胞（細胞培養中で無制限に複製できる）と融合して、免疫グロブリン分泌細胞株を作製する。得られる融合細胞またはハイブリドーマを培養し、こうして得られるコロニーを、所望のモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングする。このような抗体を産生するコロニーを、ｉｎ ｖｉｖｏ（腹水として）またはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでクローニング、サブクローニング、増殖させ、大量の抗体を得る。ハイブリドーマ法と技術の説明は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５）またはＨａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．， Ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８８）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（本明細書に援用する）に見られる。

【0105】

あるいは、抗体を産生し得るヒト体細胞、特にＢリンパ球は、骨髄腫細胞株との融合に適している。個体から生検で得た脾臓材料、扁桃材料またはリンパ節材料由来のＢリンパ球を使用してもよいが、一層容易に入手可能な末梢血Ｂリンパ球（ＰＢＬ）が好ましい。また、ヒトＢ細胞は、エプスタイン・バーウイルス（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７〜９６）によって直接に不死化されたものであってもよい。体細胞ハイブリダイゼーションの手順が好ましいが、原則的には、Ｂリンパ球のウイルス形質転換または癌化などのモノクローナル抗体を作製するための他の技術を利用できる。

【0106】

ハイブリドーマ産生融合手順で使用するのに適した骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生性であり、融合効率が高く、所望のハイブリドーマの増殖を支える特定の選択培地における増殖を不能にする酵素欠損を有する。融合細胞株の作製に使用できる、このような骨髄腫細胞株の例としては、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４．１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、Ｓ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌ（マウス由来）；Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０（ラット由来）；Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６（ヒト由来）（Ｇｏｄｉｎｇ， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ２ｄ ｅｄ．， ｐｐ． ６５〜６６， Ｏｒｌａｎｄｏ， Ｆｌａ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １３， Ｂｕｒｄｅｎ ａｎｄ Ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ， ｅｄｓ． ｐｐ． ７５〜８３， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｅｌｓｅｖｉｅｗ， １９８４）があげられる。

【0107】

細胞培養で無限に複製可能な哺乳類骨髄腫細胞または他の融合相手との融合は、たとえばポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または他の融合剤を使用するなど、標準的かつ周知の技術によってなされるものである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１ （１９７６）を参照のこと。これを本明細書に援用する）。

【0108】

他の実施形態では、抗体は、組換え抗体であっても構わない。「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、別の種の免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックである動物（マウスなど）から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体または免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を含むことを意図する。

【0109】

さらに他の実施形態では、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）の可変領域または超可変領域と、ヒトＩｇの定常領域または定常および可変フレームワーク領域とを結合する抗体を示す。いくつかの実施形態では、キメラ抗体が、本明細書に示すいずれかの寄託抗体の可変領域と、ヒト定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト定常領域が、ヒトＩｇＧ１定常領域などのヒトＩｇＧ定常領域である。キメラ抗体は、実施例で後述する方法または当業者間で周知の任意の方法で作製可能なものである。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、実質的にマウスモノクローナル抗体などの親抗体由来の抗原結合ＣＤＲだけをヒトフレームワーク領域とともに保有する抗体を示す（Ｗａｌｄｍａｎｎ， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５７を参照のこと）。マウス抗体の結合特異性を持つが、ヒトＩｇ定常／フレームワーク領域を有するこのようなキメラ抗体またはヒト化抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与すると、免疫原性が低減されることが期待される。したがって、キメラおよびヒト化抗体は、好ましくは、提供されるモノクローナル抗体のトキシン中和活性を保持し、繰り返し投与に適している（たとえば、ヒトでなど）。当業者であれば、周知の方法（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイ）を使用して、ヒト化抗体の活性を本明細書にて提供する寄託されたモノクローナル抗体と比較したり、ヒト化抗体が確立されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の再発を治療および／または予防するかどうか判断したりすることが可能である。また、当業者であれば、後述するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のハムスターモデルを含む本明細書に記載の方法を使用することが可能である。

【0110】

ヒト化ｍＡｂの配列を、以下の一例としての非限定的な方法で設計することが可能である。まず、ＣＤＲ構造にとって重要なフレームワークのアミノ酸残基を同定する。平行して、マウスのＶ_ＨおよびＶ_Ｌに対して高い相同性を持つヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を、既知のヒト免疫グロブリン（生殖細胞系）配列から選択する。マウスｍＡｂ由来のＣＤＲ配列を、ＣＤＲの構造を維持する上で重要なフレームワークのアミノ酸残基と一緒に、選択されたヒトフレームワーク配列にグラフトする。また、得られるヒト化ｍＡｂの潜在的な免疫原性を低減するために、対応するＶ領域サブグループで異型であることがわかるヒトのヒトフレームワークアミノ酸残基残基を一般的な残基と置換する。これらのヒト化Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域を発現ベクター、たとえば、ｐＣＯＮγ１およびｐＣＯＮκ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ， ＵＫ）にそれぞれクローニングする。これらのベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域をコードする。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ系（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を使用して、２９３Ｔ細胞を一過的にこれらの発現ベクターでトランスフェクトする。分泌されたキメラｍＡｂを含有する細胞上清を、たとえば３日後などトランスフェクション後に回収可能であり、プロテインＡクロマトグラフィで精製可能である。当業者らが理解するように、他の発現ベクターおよび宿主細胞を使用して、標記の抗体を組換え的に作製してもよい。

【0111】

抗体または抗原結合性断片をヒト化する他の方法が従来技術において周知であり、たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第６，１８０，３７０号に記載されている方法を含む。これらの特許に記載のヒト化のための方法を、全体として本明細書に援用する。これらの特許に記載の方法によってヒト化した抗体または抗原結合性断片も、本明細書に提供される。

【0112】

一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂ（ｈｍＡｂ）は、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。このようなヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、本発明のｈＰＡ−３９ ｍＡｂを包含する。

【0113】

一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。このようなヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、本発明のｈＰＡ−５０ ｍＡｂを包含する。

【0114】

一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ ｍＡｂは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ ｍＡｂは、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、（ｉ）２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド（各Ｈ鎖が配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ領域とヒトＣＨ領域、たとえば、ＩｇＧ１ Ｃ領域を含む）および（ｉｉ）２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチド（各Ｌ鎖が配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ領域とヒトＣＬ領域、たとえば、κ鎖Ｃ領域を含む）からなる。このようなヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ ｍＡｂは、本発明のｈＰＡ−４１ ｍＡｂを包含する。

【0115】

上述したヒト化本発明の抗体のＬ鎖およびＨ鎖のＣ領域は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＷ＿００１８３８７８５およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＭＷ＿００１８３８１２１に含まれる配列を有する、ヒトκのＬ鎖のＣ領域（Ｃ_Ｌ）およびヒトＩｇＧ１のＨ鎖のＣ領域（Ｃ_Ｈ）を含むものであってもよい。他の実施形態では、ヒト化抗体が、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプから選択されるヒトＨ鎖のＣ領域を含む。

【0116】

一例としての実施形態では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片を包含する。配列番号１４で示される重鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１５に示す（図３８Ｂ）。配列番号１６で示される軽鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１７に示す（図３８Ａ）。

【0117】

一例としての実施形態では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片を包含する。配列番号１８で示される重鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１９に示す（図３９Ｂ）。配列番号２０で示される軽鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２１に示す（図３９Ａ）。

【0118】

一例としての実施形態では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片を包含する。配列番号２２で示される重鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２３に示す（図４０Ｂ）。配列番号２４で示される軽鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２５に示す（図４０Ａ）。

【0119】

本発明に包含されるのは、上述した抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよび抗トキシンＢヒト化抗体の一部または断片である。このような一部または断片は、従来から当業者らが判断できるように、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、Ｆｄ断片などのＨ鎖とＬ鎖ポリペプチドのＶ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一実施形態では、Ｖ領域を含むヒト化抗体の一部または断片またはその機能的部分が、それぞれのトキシンと最適に結合し、トキシンの活性を中和する。一実施形態では、ヒト化抗体のこのような機能的な一部または断片が、完全なヒト化抗体よりも良いというわけではないにしても、これと同様のレベルでトキシン活性を最適に中和する。

【0120】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡまたはＢ用の本発明による分子クローニングしたヒト化ｍＡｂが得られる。このようなヒト化ｍＡｂは、実施例９のセクションＤおよびＥで説明するようにして単離され、キャラクタライズされる。一実施形態では、各ヒト化抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）がカッパ（κ）クラスのものである。一実施形態では、各ヒト化抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）が、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の実施形態では、ヒト化抗体のＣＨ領域が、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＭアイソタイプのものである。ユニークな可変（Ｖ）領域を含むヒト化ｍＡｂが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡまたはトキシンＢに結合してその活性を中和することが明らかになった。ヒト化ｍＡｂのＶＬおよびＶＨ領域は、完全な免疫グロブリン（Ｉｇ）または抗体分子の一部を形成するものであってもよいし、抗体の一部または断片、特に、結合および／または中和活性を有する一部または断片として使用してもよい。抗体断片の非限定的な例として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびＦ（ａｂ’）、またはＦ（ａｂ’）_２断片があげられる。本発明の実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する活性を有する抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡヒト化ｍＡｂまたはその断片に関するものであり、Ｌ鎖のＶ領域が、配列番号３、配列番号４、配列番号７のうちの１つ以上から選択される。一実施形態では、本発明は、標記の抗体のＶＨおよびＶＬ領域におけるＣＤＲすなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に関するものである。本発明の実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する活性を有する、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢヒト化ｍＡｂまたはその断片に関し、Ｌ鎖のＶ領域を、配列番号１０に示す。本発明の実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに対する活性を有する、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡヒト化ｍＡｂまたはその断片に関し、Ｈ鎖のＶ領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６のうちの１つ以上から選択される。本発明の実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに対する活性を有する、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢヒト化ｍＡｂまたはその断片に関し、Ｈ鎖のＶ領域が、配列番号８または配列番号９のうちの１つ以上から選択される。一実施形態では、本発明は、標記の抗体のＶＨおよびＶＬ領域におけるＣＤＲすなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に関する。

【0121】

他の実施形態では、本発明は、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよび／または本発明の抗トキシンＢ抗体の抗原結合部分、ＣＤＲまたは可変（Ｖ）領域をコードする核酸を包含する。さまざまな実施形態では、部分、ＣＤＲまたはＶ領域が、本明細書で説明するような、ＰＡ−３８、ＰＡ−３９、ＰＡ−４１またはＰＡ−５０、またはそのヒト化バージョン由来である。別の実施形態では、本発明は、それぞれの核酸にコードされる抗原結合部分、ＣＤＲまたはＶ領域のアミノ酸配列を包含する。

【0122】

もうひとつの実施形態によれば、本発明のモノクローナル抗体を、二重特異性抗体、二官能性抗体、多重特異性抗体または異種機能性抗体の形になるように修飾可能である。二重特異性および異種特異性抗体およびこのような抗体の作製方法の非限定的な例が、多数の例示的な刊行物にみられ、たとえば、ＵＡ２００９００６０９１０号明細書、国際公開第２００９／０５８３８３号パンフレット、国際公開第２００９／０３０７３４号パンフレット、国際公開第２００７／０９３６３０号パンフレット、ＵＳＰ６，０７１，５１７号明細書、国際公開第２００８／０２４１８８号パンフレット、ＵＡ２００７００７１６７５号明細書、ＵＳＰ ７，４４２，７７８号、ＵＳＰ ７，２３５，６４１号明細書、ＵＳＰ ５，９３２，４４８号明細書およびＵＳＰ ５，２９２，６６８号明細書に記載されている。「二重特異性抗体」という用語は、２つの異なる結合特異性を持ち、（ａ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび（ｂ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに結合またはこれと相互作用する、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を含むことを意図する。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＡ−３９またはＰＡ−５０またはその抗原結合性断片およびＰＡ−４１、またはその抗原結合性断片を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＡ−３９またはＰＡ−５０のキメラ形態またはヒト化形態、またはその抗原結合性断片およびＰＡ−４１、またはその抗原結合性断片を含む。したがって、ＰＡ−３９およびＰＡ−４１、またはそのキメラ形態またはヒト化形態、またはその抗原結合性断片を含む二重特異性抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの両方に結合する。同様に、ＰＡ−５０およびＰＡ−４１、またはそのキメラ形態またはヒト化形態、またはその抗原結合性断片を含む二重特異性抗体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの両方に結合する。「多重特異性抗体」という用語は、３つ以上の異なる結合特異性を持ち、（ａ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび（ｂ）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ、（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合またはこれと相互作用する、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体などのあらゆる因子を含むことを意図する。したがって、本発明は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、多重特異性抗体を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体の抗体または抗原結合性断片がヒト化されている。

【0123】

「二重特異性抗体」という用語はさらに、二特異性抗体を含む。二特異性抗体は、二特異性を有し、単一分子で複数の異なるエピトープを標的できる治療抗体を提供する。二特異性抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖で発現するが、同じ鎖上で２つのドメインの間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用し、それによってそのドメインを他の鎖の相補ドメインと対にさせ、２つの抗原結合部位を作る、二価の二重特異性抗体である（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８； Ｐｏｉｊａｋ， Ｒ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１〜１１２３を参照のこと）。二重特異性抗体の２つの抗原結合領域は、化学的にリンクしているか遺伝的に操作された細胞によって発現され、二重特異性抗体を産生する（概要については、Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ＆ Ｐｅｒｓｐｅｃ． ８（３）：１３３〜１３７を参照のこと）。一実施形態では、有効量の二重特異性抗体を、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のある被検体に投与することが可能であり、二重特異性抗体がトキシンＡおよびトキシンＢの毒性を被検体で中和する。

【0124】

特定の実施形態では、抗体はヒト抗体であってもよい。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常Ｉｇ領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基を含み得る（たとえば、ランダムなもしくは部位特異的なｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏの体細胞変異によって誘導された変異）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳類の種の生殖細胞系由来であるＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体（本明細書では「ヒト化抗体」と呼ぶ）を含むことを意図しない。トキシンＡおよび／またはトキシンＢ向けのヒト抗体は、マウスの系よりもヒト免疫系の部分を発現するよう遺伝的に修飾して育種したトランスジェニックマウスを使用して産生可能である。

【0125】

完全なヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックのマウスを免疫することによって、調製可能である。たとえば、米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５９８，３６９号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５４５，８０７号、同第６，１５０，５８４号、これらの中で引用された参考文献（その内容を本明細書に援用する）を参照のこと。これらの動物は、内因性の（たとえばマウスの）抗体の産生において機能的な欠失が存在するように、遺伝的に修飾されている。動物は、これらの動物の免疫化が目的の抗原に対する完全なヒト抗体の産生を生じるようなヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むように、さらに修飾される。これらのマウス（たとえば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕｍＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化に続き、モノクローナル抗体を、標準的ハイブリドーマ技術に従って調製する。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するため、ヒトに投与した場合に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を起こさない。

【0126】

本明細書で提供されるのは、標記の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸およびポリヌクレオチドでもあることは、当業者であれば理解できよう。また、本明細書で提供されるのは、抗体またはその抗原結合性断片をコードする配列を含む核酸およびポリヌクレオチドである。よって、抗体コード核酸およびポリヌクレオチドを含むおよび／または発現するよう操作されたベクターおよびプラスミドも、本発明によって得られる。本明細書で使用する場合、「コード領域」は、ポリペプチド配列をコードする塩基配列領域を示す。コード領域は、シグナルペプチドなどの後に開裂するタンパク質の一部分をコードする領域を含み得る。場合によっては、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、シグナルペプチドをコードするまたはシグナルペプチドである配列を含むこともある。本発明は、シグナルペプチドをコードするまたはシグナルペプチドである配列の一部を含むまたは含まない状態で、これらの配列各々を包含する。

【0127】

以下の方法ならびに、当業者間で知られた他の方法を用いて、本明細書で提供される抗体をクローニングすることが可能である。非限定的な例として、ハイブリドーマコールから全ＲＮＡを生成し、オリゴ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを逆転写する。ＲＮａｓｅ Ｈを使用して、ＲＮＡを除去し、１本鎖ｃＤＮＡを得る。スピンカラム精製を用いて、遊離ヌクレオチドを除去する。次に、末端トランスフェラーゼで３’ポリ−ｄＧ尾を加えることが可能である。定常領域に対し、オリゴ−ｄＣプライマーと、縮重プライマーとを用いて、ＰＣＲ増幅を実施することが可能である。しっかりとした重鎖増幅のために約４０サイクルを実施することが可能である。その後、ＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングを実施可能である。

【0128】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、上述の核酸分子に対し高度に相同である核酸分子にコードされる。相同の核酸分子は、本明細書で提供される塩基配列と少なくとも約９０％等しい塩基配列を含み得る。相同の核酸分子は、本明細書で提供される塩基配列と少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一または少なくとも約９９％同一の塩基配列を含み得る。さまざまな公的入手可能で当業者に周知のソフトウェアツールを使用して、相同性を計算することが可能である。代表的なツールとしては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手し得るＢＬＡＳＴシステムが挙げられる。

【0129】

高度に相同な塩基配列を同定するひとつの方法に、核酸ハイブリダイゼーションによるものがある。本明細書で提供されるのは、トキシンＡおよび／またはトキシンＢ結合特性と、本明細書に記載の他の機能的特性を有する抗体であって、高ストリンジェンシー条件下で、本発明の抗体をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。関連配列の同定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連核酸配列のクローニングに適した他の増幅技術を使用しても達成され得る。このような技術では、ＰＣＲプライマーは一般に、ＣＤＲなど、目的の核酸配列の一部を増幅するために選択される。

【0130】

本明細書で使用する場合、「高ストリンジェンシー条件」という用語は、よく知られた技術のパラメータを意味する。核酸ハイブリダイゼーションパラメータは、このような方法をまとめた参考文献（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において見出される。高ストリンジェンシー条件の非限定的な一例は、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）における６５℃のハイブリダイゼーションである。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり；ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーションの後、核酸を移した膜を、たとえば、２×ＳＳＣにおいて室温で、そしてそれから０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＳＣにおいて６８℃までの温度で、洗浄する。

【0131】

本明細書で提供されるのは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現に必要な、標記の核酸分子を、ＯＲＩ、プロモーター、エンハンサー、終結配列など他の核酸配列に加えて含む、ベクター（発現ベクター発現）またはプラスミドである。ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片の結合特異性および／または特徴を有する抗体またはその抗原結合性断片を作製することが可能である。一実施形態では、ベクターが、得られる抗体および抗原結合性断片の重鎖またはその一部をコードする単離された核酸分子を含み得る。もうひとつの実施形態では、ベクターが、軽鎖またはその一部をコードする核酸配列を含み得る。別の実施形態では、本発明のベクターが、重鎖またはその一部の配列、軽鎖またはその一部の配列を含み得る。別の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片を産生するプラスミドが得られる。

【0132】

本発明の抗体の修飾バージョンも得られる。抗体またはその抗原結合性断片に対する修飾は、一般に、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸に対してなされ、欠失、点変異、切断、アミノ酸置換、アミノ酸または非アミノ酸部分の追加を含み得る。あるいは、修飾を、ポリペプチドに対して直接実施してもよい（切断、リンカー分子の追加、ビオチンなどの検出部分の追加、脂肪酸の追加などによる）。修飾は、抗体または抗原結合性断片アミノ酸配列の全部またはその一部を含む融合タンパク質も、含む。

【0133】

修飾されたポリペプチドは、生理学的活性とは関係のないポリペプチドの特徴を変えるよう特異的に修飾されたポリペプチドを含む。たとえば、システイン残基を置換または欠失させて、不要なジスルフィド結合を防ぐことも可能である。同様に、特定のアミノ酸を変更し、発現系でのプロテアーゼによるタンパク質分解をなくすことで、ポリペプチドの発現を高めることも可能である（たとえば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基）。また、２００６年７月６日に発行された国際公開第２００６／０７１８７７号パンフレットなどに記載されているように、１つ以上のアミノ酸を特にＩｇ定常領域で変更して特定の投与経路、たとえば、経口投与に続いて、酵素による抗体のタンパク質分解性の消化を防止することも可能である。

【0134】

修飾は、ポリペプチドをコードする核酸分子を変えることにより、都合良くなされる。ポリペプチドをコードする核酸の修飾は、好ましくは、コード配列のアミノ酸の読み枠を保存し、かつ好ましくは、ハイブリダイズして二次構造（ヘアピンまたはループなど、修飾ポリペプチドの発現に有害な構造）を形成しやすい領域を、核酸において作製しないものである。

【0135】

修飾は、アミノ酸置換の選択、あるいはポリペプチドをコードする核酸における選択された部位のランダム変異誘発によって、どの抗体またはその抗原結合性断片に対しても実施可能である。その上で、修飾ポリペプチドを発現させ、１つ以上の活性を試験して、どの変異が望ましい特性を有する修飾ポリペプチドを提供するかを判断することが可能である。ポリペプチドのアミノ酸配列としては活性を示さないが、特定の宿主において好ましい翻訳のコドンを提供する、修飾ポリペプチド（または非修飾ポリペプチド）をさらに修飾することも可能である。たとえば大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）における核酸の翻訳に好ましいコドンは、当業者に周知である。また、配列またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して他の変異をつくり、ポリペプチドの発現を増大させることも可能である。修飾ポリペプチドをコードする遺伝子を、発現ベクターにクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、修飾ポリペプチドを発現させ、本明細書に開示したポリペプチドの機能的能力を試験することにより、修飾ポリペプチドの活性を試験することが可能である。上述の手順は、当業者に周知である。

【0136】

また、保存的アミノ酸置換をポリペプチドで作り、ポリペプチドとの機能的な等価物を提供してもよいことを、当業者であれば理解できよう。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の、相対的な電荷や大きさの特性を変えないアミノ酸置換を示す。修飾ポリペプチドは、ポリペプチド配列を変えることのできる、当業者に知られた方法（このような技術をまとめる参考文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ。． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋなど）において見いだせる）に従って、調製可能なものである。アミノ酸の保存的置換は、以下の群の範囲内のアミノ酸の間に作られる置換を含む：（ａ） Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ） Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ） Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ） Ａ、Ｇ；（ｅ） Ｓ、Ｔ；（ｆ） Ｑ、Ｎ；および（ｇ） Ｅ、Ｄ。

【0137】

ポリペプチドにおける保存的アミノ酸置換は一般に、ポリペプチドをコードする核酸の変化により作られる。このような置換は、当業者にしられた多岐にわたる方法で作られる。たとえば、アミノ酸置換はＰＣＲ特異的変異、部位特異的変異誘発またはポリペプチドをコードする遺伝子の化学的合成によって作られる。アミノ酸置換がポリペプチドの小さな断片に合わせて作られた場合、置換はペプチドの直接合成によって作られる。変えられたポリペプチドをコードする遺伝子を細菌発現ベクターまたは哺乳類発現ベクターにクローニングし、そのベクターを適切な宿主細胞に導入し、変更されたポリペプチドを発現させて本明細書に開示するポリペプチドの機能的能力を試験することによって、ポリペプチドの機能的等価物の活性を試験することが可能である。

【0138】

本発明の抗トキシン抗体または抗原結合部分を、誘導体化または別のペプチドまたはタンパク質などの別の機能的分子に結合することが可能である。また、たとえば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合などによって、抗体または抗体部分を、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなどの別の分子との結合を媒介できる別の抗体、検出可能な因子、細胞傷害性因子、治療剤、薬剤および／またはタンパク質またはペプチドなどの１つ以上の他の分子部分に機能的に結合することも可能である。

【0139】

誘導体化したタンパク質または抗体作製するには、同一または異なるタイプの２種類以上のタンパク質または抗体を架橋またはカップリングすればよい。好適な架橋剤またはカップリング剤として、適切なスペーサ（たとえば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒロドキシスクシンイミドエステル）で分離された２つの異なる反応基を有するヘテロ二官能性のものあるいは、ホモ二官能性（たとえば、ジスクシンイミジルスベラート）、市販のもの（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）があげられる。本発明の抗トキシン抗体またはその抗原結合性断片を、標識などの別の分子部分に結合してもよい。タンパク質を誘導体化または標識するのに用いられる検出可能な因子または標識としては、蛍光化合物、酵素、補欠分子族（たとえば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）、化学発光材料、生物発光材料、化学部分および放射性材料があげられる。検出可能な蛍光化合物としては、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、フィコエリトリンがあげられる。タンパク質または抗体も、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化可能である。このような酵素的に誘導体化したタンパク質または抗体は、検出可能な反応産物が得られるように酵素の特定の基質を追加すると検出可能になる。ビオチンなどの補欠分子族で誘導体化したタンパク質については、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な測定によって検出可能である。

【0140】

親和性クロマトグラフィまたは免疫沈降などの標準的な技術を使用して、診断および／または実験因子または試薬として標識したタンパク質および抗体を使用して、既知の抗原またはあらかじめ定められた抗原を単離してもよいし、特定の治療計画の有効性を監視するための臨床試験手順の一部として組織でのタンパク質レベルを判断するために既知の抗原またはあらかじめ定められた抗原を検出してもよい。一実施形態では、検出対象となる抗原が、細胞可溶化液または患者試料におけるトキシンであってもよい。

【0141】

特定の実施形態では、本発明の複数の抗体または抗原結合性断片を、たとえば、２種類以上の異なる抗体またはその抗原結合性断片（たとえば、１種類以上がトキシンＡ向け、１種類以上がトキシンＢ向け、２種類以上がトキシンＡ向け、２種類以上がトキシンＢ向けなど）を含む製剤組成物として併用する。抗体またはその抗原結合性断片の組み合わせを、単一の治療法と組み合わせて（すなわち同時投与）、所望の治療効果を得ることも可能である。あるいは、抗体またはその抗原結合性断片を、別々に（すなわち異なる時点で）投与することが可能である。したがって、抗体またはその抗原結合性断片を一緒にまたは別々に保管することが可能である。抗体またはその抗原結合性断片を、水性媒質に入れて保管してもよいし、使用前に再構成可能な凍結乾燥形態で保管してもよい。

【0142】

もうひとつの実施形態では、１種類以上の単離された抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物が得られる。また、提供されるのは、上述した抗体またはその抗原結合性断片の１つ以上の組み合わせを含む組成物である。また、提供されるのは、各々が上述した抗体またはその抗原結合性断片の１つ以上を含む組成物であって、組み合わせで用いることを想定した組成物である。このような組成物は、生理学的にまたは薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤を含むものであってもよい。生理学的にまたは薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤を、単離された抗体またはその抗原結合性断片と混合することも可能である。一実施形態では、組成物が、複数（たとえば、２以上）の単離された抗体またはその抗原結合性断片の組み合わせを含む。一実施形態では、組成物の抗体またはその抗原結合性断片の１つ以上が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合し、その毒性作用を中和するのに対し、抗体またはその抗原結合性断片の１つ以上が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合し、その毒性作用を中和する。一実施形態では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡに特異的に結合してその毒性作用を中和するする抗体またはその抗原結合性断片の１つ以上と、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢに特異的に結合してその毒性作用を中和する１つ以上が、ヒト化されている。

【0143】

特定の実施形態では、組成物は、本明細書で説明するような１種類の抗トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片と、本明細書で説明するような１種類の抗トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせを含む。このような組成物では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体が、等しい量または１：１などの等しい割合で存在してもよい。あるいは、このような組成物では、抗トキシンＡ抗体および抗トキシンＢ抗体が異なる量あるいは、１／２：１；２：１；３：１；４：１などの異なる割合で存在してもよい。一実施形態では、組成物の抗体がヒト化されている。一実施形態では、組成物が、ｍＡｂ ＰＴＡ−９８８８、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、ｍＡｂ ９６９３、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態との組み合わせを含む。一実施形態では、組成物が、ｍＡｂ ＰＴＡ−９６９４、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、ｍＡｂ ９６９３、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態との組み合わせを含む。一実施形態では、組成物が、Ｍａｂ ＰＴＡ−９６９２、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態およびｍＡｂ ９６９３、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態；またはｍＡｂ ＰＴＡ−９８８８、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態およびｍＡｂ ９６９２、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態；またはｍＡｂ ＰＴＡ−９６９４、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態およびｍＡｂ ９６９２、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態のうちの１つ同士の組み合わせを含む。

【0144】

また、製剤組成物は、併用療法において投与可能すなわち、他の治療薬と組み合わせることが可能なものである。たとえば、併用療法は、本明細書で提供されるような１種類以上の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と、少なくとも１つの他の従来の療法との組み合わせを含み得る。このような追加の治療剤には、抗生剤の治療剤および抗生物質によらない治療剤がある。追加の治療剤として、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドワクチン、アンピシリン／アモキシシリン、バンコマイシン、メトロニダゾール、フィダキソマイシン、リネゾリド、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニン、ディフィミシン（ＰＡＲ−１０１またはＯＰＴ−８０とも呼ばれる）、クリンダマイシン、セファロスポリン（第二世代および第三世代セファロスポリンなど）、フルオロキノロン（ガチフロキサシンまたはモキシフロキサシン）、マクロライド（たとえば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン）、ペニシリン、アミノ配糖体、トリメトプリム・スルファメトキサゾール配合剤、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、イミペネムおよびメロペネムがあげられる。また、追加の治療剤として、抗生剤、抗菌剤、殺菌剤または静菌剤もある。一実施形態では、追加の治療剤が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および／またはそのトキシンを標的する小分子または低分子量の化合物であってもよい。一実施形態では、追加の治療剤がＯＰＴ−８０である。抗生物質によらない治療剤としては、ｔｏｌｅｖａｍｅｒ、非特異的な荷電機序でトキシンＡおよびＢに結合する高分子量アニオンポリマーがあげられる。

【0145】

別の例として、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を他の抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせで用いることも企図される。他の追加の治療剤としては、通常のプールされた免疫グロブリン、静脈内免疫グロブリンまたは血清中のポリクローナル抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ免疫グロブリンがあげられる。他の抗体として、刊行物（たとえば、国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）に記載され、報告されているようなクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡまたはトキシンＢ用のヒトｍＡｂがあげられる。

【0146】

また、本明細書に包含されるのは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を用いて、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その病理または発症または進行を治療または予防する、すなわち治療し、回復させ、緩和し、根絶し、予防し、または遅延させる方法である。ＣＤＡＤは一般に、クリンダマイシン、セファロスポリン、フルオロキノロンなどの抗生剤の使用によって結腸細菌叢が破壊されることで惹起される。このような結腸微小環境の混乱が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子への曝露とあいまって、罹患個体でのコロニー形成につながる。コロニー形成が起こった全患者の約３分の１でＣＤＡＤが発症し、これが重症の下痢症、結腸穿孔、結腸切除、死を引き起こし得る。したがって、この方法は、本発明の抗体または本明細書で説明するような組成物を被検体に投与して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはＣＤＡＤを治療することで提供される。

【0147】

本明細書で使用する場合、「治療」とは、本明細書で提供される抗体または組成物または組成物の組み合わせの投与によって得られる、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のある被検体にとっての利益を示す。たとえば、限定されるものではなく、このような利点は、感染または疾患に起因する１つ以上の症候または有害作用の排除あるいは１つ以上の症候または有害作用の重症度の低減または緩和；遅延、停止あるいは感染症または疾患の進行の逆転；再コロニー形成、消化管、結腸、腸などの正常で自然な細菌叢の再増殖あるいは、感染症または疾患の治癒（臨床医が被検体を評価し、感染または疾患がなくなったと判断した状態）を含み得る。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に関連した症候または有害作用としては、結腸の破裂や死につながりかねない脱水症、下痢症、痙攣、腎不全、腸穿孔、中毒性巨大結腸がある。提供される組成物を使用して、本明細書で提供される症候または有害作用のすべてまたはいずれかを低減、減少、緩和または排除することが可能である。

【0148】

本明細書で使用する場合、「クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症」とは、前には存在しなかった腸内細菌叢にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が存在するか、１つ以上の他の細菌に対して腸内細菌叢でのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の存在に変化が生じること（クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の総量の増加など）に起因して、腸管または消化管をなす他の臓器および組織で有害作用を引き起こすまたは引き起こし得るおよび／またはトキシンＡおよび／またはＢのレベル増加につながる感染症を示す。一般に、ＣＤＡＤは、腸がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染してこれが増殖した後に生じる。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、トキシンＡおよびトキシンＢが、疾患を引き起こす可能性のある相乗効果を持つ異なる病理学的プロファイルを示す。ウサギおよびマウスでは、たとえば、トキシンＡが下痢症を誘発するエンテロトキシンで、トキシンＢがこの種では流体の反応を引き起こさない。しかしながら、トキシンＢは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで一層強力かつ細胞傷害性である。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡ陰性、トキシンＢ陽性（Ａ−Ｂ＋）株の報告数が増加している。Ａ−／Ｂ＋株は、ｔｃｄＡ遺伝子の繰り返しドメインの欠失がゆえにトキシンＡを産生できないが、それでも臨床疾患を引き起こすことはできる。対照的に、今日まで、トキシンＡ陽性、トキシンＢ陰性（Ａ＋／Ｂ−）株はヒトでは報告されていない。

【0149】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症は一般に、軽度から中度の下痢症として現れ、ときおり腹部の痙攣が生じる。腸管粘膜での接着性のクリーム色がかったプラークである偽膜が観察されることもときおりある。希な症例として、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の患者が、結腸の正常な細菌叢が破壊、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のコロニー形成、粘膜の炎症および損傷を引き起こすトキシンの放出に起因する可能性がある、生命を危うくする急性かつ劇症性の腹部の大腸炎を持つ場合がある。結腸の細菌叢を変化させるカギになる因子のひとつに抗生剤療法がある。正常な腸細菌叢は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のコロニー形成および異常増殖に対する耐性があるが、抗生剤を使用すると、正常な細菌叢が抑制され、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌が増殖できる。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、健康な成人の２〜３％に存在し、健康な乳幼児では７０％と多い。その態様のひとつにおいて、無症状であるが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症にかかりやすいか罹患するリスクがある被検体や、その関連の疾患に悩んでいる被検体の治療に、本発明のｍＡｂを使用する。このような被検体は、入院していてもよいし、院外の被検体であってもよい。

【0150】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の主なリスク要因に、抗生剤への事前曝露がある。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）大腸炎と関連のある最も一般的な抗生剤には、セファロスポリン（特に第二世代および第三世代）、アンピシリン／アモキシシリン、クリンダマイシンがある。これよりは一般的に関連しているわけではない抗生剤としては、マクロライド（すなわちエリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン）および他のペニシリンがある。この疾患を引き起こすことがときどき報告されている化合物または他の因子には、アミノ配糖体、フルオロキノロン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、イミペネム、メロペネムがある。特に正常な腸内細菌叢が悪影響を受けているか死滅した場合に、１種類の抗生剤に軽く接しただけでも、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）大腸炎が生じることがある。抗生剤の使用期間が長くなる、あるいは２種類以上の抗生剤を用いていると、疾患のリスクが高くなる。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）大腸炎の治療に従来から用いられている抗生剤は、疾患を引き起こすことがわかっている。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染に関連した他の危険因子として、高齢（＞６５歳）；免疫系が弱い；最近の入院（特に感染者と病室が同じ、集中治療室にとどまる、入院が長引く場合）；養護施設、ホスピスあるいは他の長期療養所での生活；腹部手術；慢性結腸疾患（炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または結腸直腸がんなど）；腹痛を抑えてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を一層容易に腸管に通してしまうことがある処方薬または市販の制酸薬の服用；過去のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症があげられる。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患に関連した、別の要因には、抗腫瘍薬、主にメトトレキセート、溶血尿毒症症候群、悪性腫瘍、腸管虚血、腎不全、壊死性小腸大腸炎、ヒルシュスプルング病、ＩＢＤ、経鼻胃管を含む外科以外の胃腸管に対する術式がある。本明細書で提供される組成物を投与可能な被検体は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のリスクがあるとして説明した被検体を含む。

【0151】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）大腸炎のほとんどの患者は特別な治療法を使わなくても回復するが、症候が長引いたり衰弱したりすることもある。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症は、虚弱な高齢患者では死亡率が最大２５％の重症となり得る。一層重篤な疾病の患者に焦点をあてた報告では、死亡率が１０〜３０％と示されている。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症は、高齢の人々の間のほうが一般的で、高齢であると、コロニー形成および疾患に対する感受性が増すことがある。乳幼児や幼い子どもはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびそのトキシンを持つことが多いが、臨床感染は一般的ではない。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の交差感染は新生児室では一般的であるが、新生児ではクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症が発症しないように見える。

【0152】

本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるヒト化本発明の抗体および／または組成物を用いる多数の方法である。たとえば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症または疾患のある被検体、本明細書で提供される症候または有害作用を呈する被検体、あるいは本明細書で提供される疾患のいずれかに羅患した被検体を治療するための方法が得られる。一実施形態では、この方法は、被検体でのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に関連した疾患またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の重症度を低減、減少または緩和する。もうひとつの例として、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症に悩んでいる被検体を治療する方法が得られる。

【0153】

提供されるのは、被検体においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢを中和する方法である。一例として、全身性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの重感染を中和する方法が得られる。一実施形態では、ヒト化抗トキシンＡ抗体またはその抗原結合性断片とヒト化抗トキシンＢ抗体またはその抗原結合性断片の両方あるいは、これらの抗体を含む組成物を投与することで、全身性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢ重感染を中和する。もうひとつの態様では、トキシンＡおよびトキシンＢと特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片あるいは、これらの抗体（たとえば、ヒト化形態）を含む組成物を投与して、全身性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢ重感染を中和する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または組成物を、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を標的する別の治療剤と併用で投与する。

【0154】

もうひとつの実施形態として、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染した被検体で正常な胃腸管細菌叢を回復させることで、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および／またはそのトキシンによって引き起こされる効果的に治療する方法も、得られる。さらにもうひとつの実施形態として、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患に対する被検体の感受性を低減する方法も得られる。もうひとつの実施形態として、被検体においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患を予防する方法も得られる。

【0155】

上述した方法では、被検体に、本明細書で提供される抗体または組成物（たとえば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡ用のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢ用のモノクローナル抗体または抗原結合性断片を含む組成物）を１つ以上投与する。この組成物については、同時にまたは異なる時点で被検体に投与することが可能である。組成物を、薬学的に許容されるキャリア、溶媒または賦形剤と、任意に、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および／またはそのエンテロトキシンに有効な別の抗生剤、非抗生剤、医薬品または治療剤とを含む組成物中の混合物として被検体に投与する。

【0156】

ヒト化抗トキシンＡモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片および／またはヒト化抗トキシンＢモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片あるいは、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片を含む薬学的に許容される組成物を、本発明による標記の方法のいずれにおいても別々にまたは一緒に使用することが可能である。

【0157】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」または「生理学的に許容可能なキャリア」としては、任意および全ての塩、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤または吸収遅延剤などがあげられ、これらは、生理学的に適合性である。好ましくは、このキャリアは、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄または表皮の投与（注射または輸液による）に適する。投与経路次第で、活性化合物すなわち抗体をコーティングして、化合物を不活性化しかねない酸や他の自然条件の作用から化合物を保護するようにしてもよい。

【0158】

投与すると、本発明の製剤は、薬学的に許容される量および薬学的に許容される組成物において、「薬学的に許容される」という言い回しは、活性成分の生物学的活性の効果に干渉しない、非毒性で生理学的に許容される物質を意味する。このような製剤は、常法では、塩、緩衝液、保存剤、適合性のキャリア、さらにはアジュバント、ケモカイン、サイトカインを含む補充免疫増強剤などの任意の他の治療剤を含むものであってもよい。医薬品で使用する場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩も、その薬学的に許容される塩の調製に適宜使用可能であり、本発明の範囲から除外されるものではない。

【0159】

塩は、親化合物の所望の生物学的活性を保ち、望ましくない毒物学的作用を生じない（たとえば、Ｂｅｒｇｅ， Ｓ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６６： １〜１９を参照のこと）。このような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩があげられる。酸付加塩としては、非毒性無機酸（塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など）由来の塩ならびに、非毒性有機酸（脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸など）由来の塩があげられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）由来の塩ならびに、非毒性有機アミン（Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、酢酸エチレンジアミン（ＥＤＴＡ）（対イオン（ナトリウムまたはカルシウム）ありまたはなし）、プロカインなど）由来の塩があげられる。

【0160】

本発明の組成物を、必要に応じて、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせてもよい。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、ヒトに投与するのに適した、適合性の固体または液体のフィラー、希釈剤またはカプセル化物質を示す。「キャリア」という用語は、活性成分を組み合わせて投与を容易にする、天然のまたは合成の有機成分または無機成分を示す。製剤組成物の成分も、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用のないような形で、ここで提供する組成物の分子、あるいは互いに、混合できるものである。

【0161】

製剤組成物は、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、塩でのリン酸をはじめとする、好適な緩衝剤を含むものであってもよい。

【0162】

製剤組成物は、任意に、好適な保存剤（塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンなども含むものであってもよい。

【0163】

製剤組成物は、単回剤形に都合よく存在し得るものであり、薬学分野で周知の任意の方法で調製できるものである。すべての方法が、１種類以上の付帯成分をなす活性剤を、キャリアと連係させるステップを含む。一般に、この組成物は、活性化合物を、液体キャリア、微細粉状態の固体キャリアまたはその両方と、均一かつ密に連係させ、必要な場合は生成物を成形することによって調製される。

【0164】

抗トキシンＡおよび本発明の抗トキシンＢ抗体またはその一部を、個々の被検体で治療反応または予防反応などの最適な所望の反応を得られるように調節できる投与計画に沿って提供可能である。一例として、個々の治療状況での指示内容に応じて、単回ボーラス投与でもよいし、複数の分割用量を時間をかけて投与してもよく、用量を比例的に増減してもよい。非経口組成物は、投与しやすくして投与量を揃えるために、単位剤形で包装または調製されたものであってもよい。単位剤形とは、治療対象となる被検体に単位投与量として提供される物理的に離れた単位を示し、各単位が、必要な製剤キャリア、溶媒、賦形剤または希釈剤との関連で所望の治療効果が得られるように算出された予め定められた量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の具体的な内容については、（ａ）活性化合物の独特な特性と達成したい特定の治療効果、（ｂ）個体の感受性に対する治療用の活性化合物などの配合分野での固有の制約に影響され、これに直接左右される。

【0165】

非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張の滅菌された水性または非水性の調製物を適宜含む。この調製物は、好適な分散剤や湿潤剤、懸濁剤を用いて周知の方法で配合できるものである。滅菌注射調製物も、１，３−ブタンジオール溶液など、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）の滅菌注射溶液または懸濁液であればよい。使用できる、許容範囲内の溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）および溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）として、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液があげられる。また、滅菌の固定油が、従来から溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）または懸濁媒質として用いられている。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドをはじめとして、どのブランドの固定油を用いてもよい。また、注射剤の調製時にオレイン酸などの脂肪酸を使用してもよい。経口、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内などの投与に適したキャリア配合物を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡに見出すことができる。

【0166】

活性成分は、急速な放出から成分を保護するキャリアと一緒に調製可能なものである（インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む徐放製剤など）。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することも可能である。このような処方物を調製するための多くの方法が、特許化されているか、当業者に公知である。たとえば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照のこと。

【0167】

治療剤としての本発明の抗体および組成物は、従来の任意の経路で投与可能であり、一例として、注射または時間をかける点滴があげられる。投与経路は、非限定的な例として、経口、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内、腔内、後眼窩、経膣、直腸、吸入、吸引、経皮であってもよいし、坐薬または経皮吸収を利用したものであってもよい。

【0168】

本発明の抗体および組成物は、有効量または有効用量で投与される。「有効量」とは、本明細書で提供されるような抗体またはその抗原結合性断片または組成物が、単独または別の用量または他の治療剤との組み合わせで、被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、下痢症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患を治療し、緩和し、根絶させ、回復させ、あるいは予防するといった所望の反応を生じる量のことである。これは、長期間にわたって、たとえば、１週間を超えて、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月あるいは３か月を超えて、感染、下痢症、または疾患の進行を遅くするだけのことを含み得る。しかしながら、このような有効量は、感染、下痢症または疾患を、永久的に、最適に治療またはその進行を止める。これは、常法で監視可能である。疾患または症状の治療に対する所望の反応も、感染または疾患の発症を遅らせたり、予防することすらあり得る。

【0169】

もちろん、有効量は、医療従事者の知識と経験の範囲内にある治療対象となる特定の感染または疾患、感染または疾患の重症度、個々の患者のパラメータ（年齢、健康状態、体格、体重を含む）、治療期間、併用療法（用いる場合）の性質、具体的な投与経路などの要因に左右される。これらの要因は当業者間で周知であり、常法の試験または実験だけで対処可能である。通常、合理的な医療判断に応じて、個々の成分またはその組み合わせを最大用量で用いる、すなわち、安全な最高用量で用いるのが好ましい。しかしながら、医療上の理由、心理的な理由または実質的に他のあらゆる理由で、患者がそれより少ない用量や許容可能な用量を求めることもあることは、当業者であれば理解できよう。

【0170】

上述の方法で用いられる製剤組成物は、好ましくは、滅菌状態で、患者に投与するのに適した重量または容量単位で、所望の反応を得るために本明細書で提供される１種類以上の抗体または抗原結合性断片を有効量で含む。この反応は、たとえば、疾患の症候の低減などの組成物の生理学的作用を判断することによって測定可能である。当業者には他のアッセイも知られており、反応のレベルを測定するのに利用可能である。

【0171】

被検体に投与される組成物の用量あるいは量は、特に使用する投与のモードと被検体の状態という、異なるパラメータに応じて選択可能である。他の要因として、所望の治療期間があげられる。被検体の反応が初回に適用した用量では不十分な場合、患者の耐容能が許すかぎりもっと高い用量を用いてもよい（あるいは別の一層局所的な送達経路で効果的に高用量にする）。

【0172】

通常、用量または量は、約１μｇ／ｋｇ〜約１００，０００μｇ／ｋｇの範囲であればよい。本発明の抗体、抗体部分または組成物の治療的または予防的に有効な量をなす用量範囲の非限定的な例として、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ；０．１ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ；０．５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ；０．５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ；０．７５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ；または１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇがあげられる。特定の個体、患者または被検体では、具体的な用量および経時的な投与計画を、個体の需要と、抗体および／または組成物を投与するか投与を監督する熟練した医師の専門的な判断に応じて調節しなければならない旨は理解できよう。このような用量の範囲は例示にすぎず、本発明の範囲または実用を制限することを意図したものではない。組成物に応じて、一用量分を連続ポンプなどで連続的に送達してもよいし、一定間隔で送達する形でも構わない。当業者であれば、個々の組成物についての複数回投与量の場合の所望の間隔を、過度に実験をすることなく判断可能である。組成物を投与するための他のプロトコールが当業者間で周知であろうし、この用量の量、投与スケジュール、投与部位、投与モードなどは、上記とは異なるものとなる。

【0173】

ヒト以外の哺乳類への組成物の投与、たとえば、試験目的または獣医の治療目的なども、上述したものと実質的に同一の条件で実施される。

【0174】

また、本明細書で提供されるのは、本発明の抗体あるいは本発明の抗体を含む組成物と、取扱説明書とを含むキットである。このキットはさらに、追加の治療剤などの少なくとも１種類の別の試薬あるいは、本明細書で提供されるような１種類以上の別の抗体または抗原結合性断片を含み得る（キットの第１の抗体またはその抗原結合性断片がトキシンＢに対する抗体またはその抗原結合性断片の場合は、トキシンＡに対する抗体またはその抗原結合性断片、あるいはその逆など）。

【0175】

キットの構成要素を、水性媒質中または凍結形態で包装することが可能である。キットでコンジュゲートの形の抗体またはその抗原結合性断片を用いる場合（二重特異性抗体コンジュゲートなど）、このようなコンジュゲートの成分を完全にコンジュゲートされた形態、中間体の形態または利用者がコンジュゲーする別の部分として、あるいは添付の取扱説明書に従うキットで提供可能である。

【0176】

キットは、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどの１つ以上の容器手段または一連の容器手段を詰め込んで収容できるように、区画されたキャリアを含むものであってもよい。第１の容器手段または一連の容器手段は、１種類以上の抗体またはその抗原結合性断片を含むものであってもよい。第２の容器手段または一連の容器手段が、１種類以上の抗体またはその抗原結合性断片を含む（抗体またはその抗原結合性断片が、第１の容器手段とは異なる）ものであってもよく、他の追加の治療剤を含むものであってもよい。本明細書で提供されるキットはさらに、第１および第２の容器に収容された抗体または抗原結合性断片と結合させる分子を含む第３の容器を含む。

【0177】

ポリペプチド、タンパク質またはそれらの断片に関して本明細書で使用する場合、「単離された」は、その本来の環境から引き離され、同定または使用に充分な量で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドについて「単離された」とは、たとえば、（ｉ）発現クローニングにより選択的に産生された、または（ｉｉ）クロマトグラフィまたは電気泳動により精製されたことを示す。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であり得るが、純粋である必要はない。「実質的に純粋」という言い回しは、タンパク質またはポリペプチドが、自然界またはｉｎ ｖｉｖｏ系で見い出され得る他の物質を、その意図した用途で実用的かつ適切な範囲で、基本的に含有しないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野において周知の技術で作製される。単離されたタンパク質は、製剤中で薬学的に許容されるキャリアと混合してもよいものであり、タンパク質は、調製物の重量に対してわずかな割合のこともある。それでもなお、タンパク質は、生きている系で本来であれば関連している物質すなわち他の天然に産するタンパク質から分離され、単離される。

【0178】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の治療における有効性の候補因子を評価するための方法も提供される。このような方法は、被検体においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のリスクを高める因子のある被検体を治療し、被検体にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を接種し、被検体を候補因子で治療し、候補因子での治療の有効性を評価するステップを含むものであってもよい。本明細書で使用する場合、「クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患のリスクを高める因子」とは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の発症または進行を促進すると思われる因子である。このような因子は、抗生剤または抗生物質によらない因子であっても構わない。たとえば、因子が、本明細書に記載の抗生剤であってもよい。実例として、このような抗生剤が、クリンダマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド_、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせであってもよい。

【0179】

これらの方法では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）接種の前または後に候補因子を被検体に投与することが可能である。候補因子は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患を治療または予防する可能性があると思われる因子であり得る。抗生剤または非抗生剤であってもよい候補因子は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに特異的に結合した抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0180】

これらの方法は、以下の実施例に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法およびｉｎ ｖｉｖｏの方法を含む。

【0181】

ＣＤＡＤ治療の究極的な目標は、 抗生剤をやめて、正常な腸内細菌叢を回復させることである。本発明によれば、本明細書に記載の抗トキシンＡおよびＢ ｍＡｂは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンの病原作用をブロックし、抗生剤を中断できるようにして、結腸が治癒するおよび／または正常な腸内細菌叢が再建されるだけの時間を与えるように設計された抗生物質によらない療法を提供するものである。本発明のモノクローナル抗体は、ＣＤＡＤのストリンジェントなハムスターモデルで完全かつ永続的（＞３７日間）な保護が得られるものである。その例外的な特徴および特性に基づいて、本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢ ｍＡｂは、疾患の最も重篤な症例に悩む個体など、既存の治療法があまりきかない患者に新たな治療の選択肢と医薬剤を提供するものである。

【0182】

本発明はさらに、モノクローナル抗体ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２）、ＰＡ−３９のヒト化形態、モノクローナル抗体ＰＡ−５０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４）、ＰＡ−５０のヒト化形態、モノクローナル抗体ＰＡ−４１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３）、ＰＡ−４１のヒト化形態、モノクローナル抗体ＰＡ−３９トキシンＡへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態の、モノクローナル抗体ＰＡ−５０のトキシンＡ への結合と競合する抗体またはそのヒト化形態、またはモノクローナル抗体ＰＡ−４１のトキシンＢへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態のうちの１つ以上に認識および／または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢの部分、断片またはペプチドを含むワクチンまたは免疫原を包含する。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原が、モノクローナル抗体ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２）、ＰＡ−３９のヒト化形態、またはモノクローナル抗体ＰＡ−３９のトキシンＡおよびトキシンＢへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態の１つ以上に認識および／または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの一部、断片またはペプチドを含む。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンＡおよび／またはトキシンＢのエピトープ含有部分、断片またはペプチドが、タンパク質分解性の切断によって、トキシンＡまたはトキシンＢのタンパク質から得られる。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンＡの断片、一部またはペプチドが、エンテロキナーゼによるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンＢの断片、一部またはペプチドが、カスパーゼ（カスパーゼ１）によるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のエピトープ含有部分または断片が、トキシンＡまたはトキシンＢのタンパク質の化学的または組換え的に合成されたペプチドである。一実施形態では、抗体によって認識および結合される、トキシンＡおよび／またはトキシンＢの１つ以上のエピトープ領域を含有するワクチンまたは免疫原の断片、一部またはペプチドが、トキシンＡのアミノ末端；トキシンＢのアミノ末端；トキシンＡのカルボキシ末端；トキシンＢのカルボキシ末端；トキシンＡの受容体結合ドメイン；トキシンＡの受容体結合ドメイン外の領域；トキシンＢのＮ末端酵素領域；トキシンＡのグルコシルトランスフェラーゼドメイン；トキシンＢのグルコシルトランスフェラーゼドメイン；トキシンＡのタンパク質分解ドメイン；トキシンＢのタンパク質分解ドメイン；トキシンＡの疎水性のポア形成ドメイン；またはトキシンＢの疎水性のポア形成ドメインの１つ以上に由来する。

【0183】

いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＡのアミノ末端またはトキシンＢ由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＡのカルボキシ末端またはトキシンＢ由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインまたはトキシンＢ由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＡのタンパク質分解ドメインまたはトキシンＢ由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＡの疎水性のポア形成ドメインまたはトキシンＢ由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＡの受容体結合ドメイン由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＢの受容体結合ドメイン由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＡの受容体結合ドメイン外の領域由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される１つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンＢのＮ末端酵素領域由来である。一実施形態では、トキシンＡのエピトープ含有断片または部分および／またはトキシンＢの大きさが、＜３００ｋＤａである。他の実施形態では、トキシンＡのエピトープ含有断片または部分および／またはトキシンＢの大きさが、約１５８〜１６０ｋＤａ、約１００〜１０５ｋＤａ、たとえば、１０３ｋＤａ、約９０〜９５ｋＤａ、たとえば、９１ｋＤａおよび／または約６３〜６８ｋＤａ、たとえば、６３ｋＤａまたは６８ｋＤａである。他の実施形態では、トキシンＡのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約１５８〜１６０ｋＤａ；約９０〜９５ｋＤａ、たとえば、９１ｋＤａおよび／または約６３〜６８ｋＤａ、たとえば、６８ｋＤａである。他の実施形態では、トキシンＢのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約１００〜１０５ｋＤａ、たとえば、１０３ｋＤａおよび／または約６３〜６８ｋＤａ、たとえば、６３ｋＤａである。

【0184】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染した被検体またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患に悩む被検体に対するワクチンまたは免疫原の形で投与すると、トキシンのこのような一部、断片またはペプチドは、被検体に液性反応を誘発すなわち、トキシンＡおよび／またはトキシンＢに特異性を有する抗体を誘発（それによって被検体はトキシンに対する免疫反応を得る）するとともに、被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、感染またはＣＤＡＤを中和、ブロック、低減、緩和、治療（ｃｕｒｅ）または治療（ｔｒｅａｔ）させる。したがって、もうひとつの実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症またはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患の中和、ブロック、低減、緩和、治療（ｃｕｒｅ）または治療（ｔｒｅａｔ）を必要とする被検体において、これをする方法であって、上述したワクチンまたは免疫原を有効量で被検体に投与することを含む。一実施形態では、被検体が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する液性反応を誘発し、被検体におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、感染、またはＣＤＡＤが中和、ブロック、低減、緩和、治療（ｃｕｒｅ）または治療（ｔｒｅａｔ）される。もうひとつの実施形態では、被検体が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する細胞免疫反応を誘発する。もうひとつの実施形態では、被検体が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する液性反応と細胞免疫反応の両方を誘発する。

【0185】

もうひとつの実施形態では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に感受性である細胞で、あるいは細胞に対して、トキシンＡおよび／またはトキシンＢの活性を中和、阻害またはブロックする方法であって、細胞を、本発明による抗体またはその抗原結合性断片と接触させることを含み、抗体またはその抗原結合性断片が、競合的作用機序または混合競合的作用機序で細胞で、あるいは細胞に対して、トキシンＡおよび／またはトキシンＢの活性を中和、阻害またはブロックする方法を包含する。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体の１つ以上である。一実施形態では、細胞が被検体にあり、抗体またはその抗原結合性断片を被検体に有効量で投与する。一実施形態では、細胞が、被検体の消化管内にあり、たとえば、被検体の腸上皮細胞である。一実施形態では、トキシンがトキシンＡである。一実施形態では、トキシンがトキシンＢである。一実施形態では、トキシンがトキシンＡであり、抗体の作用機序が競合的阻害作用機序である。一実施形態では、トキシンがトキシンＡであり、抗体またはその抗原結合断片が、ＰＡ−５０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９４）、そのヒト化形態であるか、ＰＡ−５０のトキシンＡ活性の中和と競合する抗体またはその断片である。一実施形態では、トキシンがトキシンＡであり、抗体の作用機序が混合−競合的阻害作用機序である。一実施形態では、トキシンがトキシンＡであり、抗体またはその抗原結合断片が、ＰＡ−３９（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９２）、そのヒト化形態であるか、ＰＡ−３９のトキシンＡ活性の中和と競合する抗体またはその断片である。一実施形態では、トキシンがトキシンＢであり、抗体の作用機序が混合競合的阻害作用機序である。一実施形態では、トキシンがトキシンＢであり、抗体またはその抗原結合断片が、ＰＡ−４１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６９３）、そのヒト化形態であるか、トキシンＢ活性の中和でとＰＡ−４１と競合する抗体またはその断片である。

【0186】

本明細書で使用する場合、トキシンの「競合的阻害因子」は、培養でトキシンの濃度が増しても最大中和率が変化することなく中和曲線でＥＣ_５０が右側にシフトするトキシン中和阻害因子、たとえば、抗体、作用剤または小分子または化学的実体を示す。よって、競合的な阻害因子は一般に、さらに多くの阻害因子を加えることで、トキシンの細胞傷害作用に抗することができる。トキシンの「非競合的阻害因子」という用語は、培養でのトキシン濃度が増すと最大半量反応（ＥＣ_５０）が得られる、濃度が変化せずに最大中和率が減少するトキシン中和阻害因子を示す。よって、非競合的阻害因子は一般に、阻害因子をさらに加えてもトキシンの細胞傷害作用に対して完全には抗することができない。トキシンの「混合−競合的阻害因子」という用語は、培養でのトキシン濃度が増すと競合的阻害と非競合的阻害の両方が若干ずつ認められるトキシン中和阻害因子を示す。たとえば、トキシンの混合−競合的阻害因子は、トキシンに結合し、細胞に対するトキシンの結合をブロックならびにトキシンの他の細胞傷害作用をブロックすることで、その作用を発揮させ、混合−競合的作用機序を発揮する。

【実施例】

【0187】

実施例１
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する中和用モノクローナル抗体の作製
Ａ．免疫原の調製
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよび／またはトキシンＢ用の中和用モノクローナル抗体を、マウスをクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡトキソイド（不活性形態のトキシン）および活性形態のトキシンＡおよび／またはトキシンＢで免疫して、作製した。また、動物をトキソイドＡで免疫した後、活性形態のトキシンＡおよび／またはトキシンＢで免役して、マウスｍＡｂ（ＰＡ−３８：抗トキシンＡ ｍＡｂ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−９８８８；ＰＡ−３９：抗トキシンＡおよびＢ ｍＡｂ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−９６９２；ＰＡ−４１：抗トキシンＢ ｍＡｂ ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−９６９３；およびＰＡ−５０：抗トキシンＡ ｍＡｂ、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−９６９４）を作製した。トキシンＡトキソイド、トキシンＡ、トキシンＢ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｃａｍｐｂｅｌｌ， ＣＡ）およびトキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ Ｉｎｃ．， Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）を、使用するまで４℃で保管した。トキシンおよびトキソイドには、一般に用いられているクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の参考株である株ＶＰＩ１０４６３由来のものを用いた。必要な容量のトキソイドまたはトキシンにＱｕｉｌ Ａアジュバント（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を加え、混合した。混合物を６０分間の免疫で調製し、免疫の準備ができるまで氷上で保管した。融合前の最終ブーストのために、必要なトキシンをＰＢＳで希釈し、免疫に使用するまで氷上で保管した。

【0188】

Ｂ．免疫および融合
３０匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）に、３週間間隔で活性トキシンＡまたは活性トキシンＢの用量を増してブースト免疫する前に、３週間間隔で、２免疫用量（ＰＡ−５０の場合）または３免疫用量（ＰＡ−３８、ＰＡ−３９、ＰＡ−４１の場合）のトキシンＡトキソイド（１０μｇ）を皮下注射した。ＰＡ−３８では、１匹のマウスを３週間ごとにブースト免疫し、トキシンＡ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を合計で３回ブーストした。このとき、ブーストするたびに用量を５００ｎｇから２μｇに増し、トキシンＡ（８μｇ）の最終ブーストは脾摘出の３日前とした。ＰＡ−３９およびＰＡ−４１では、２匹のマウスをトキシンＢで３週間ごとに３回または５回ブースト免疫し、ブーストするたびに用量を２μｇから１２．５μｇに増し、トキシンＢ（２０μｇ）の最終ブーストは脾摘出の３日前とした。ＰＡ−５０では、１匹のマウスをトキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ Ｉｎｃ．）で３週間ごとにブースト免疫し、合計で４回ブーストした。このとき、ブーストするたびに用量を２０ｎｇから２．５μｇに増し、トキシンＡ（１０μｇ）の最終ブーストは脾摘出の３日前とした。免疫およびブースト用量のトキソイドおよびトキシンを、Ｑｕｉｌ Ａ（１０μｇ）などのアジュバントと一緒に投与した。活性形態のトキシンＡまたはトキシンＢでのブーストによって、保護抗体ができたであろう動物を同定した。免疫した動物からの血清を段階希釈し、後述するようにしてＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するトキシンＡ細胞傷害作用の中和を試験した。中和抗体の力価が最も高かった動物を融合用に選択し、アジュバントなしでトキシンでブーストした。

【0189】

ブースト後、動物を屠殺し、単離した脾細胞を、標準的な方法でＳｐ２／０細胞株と融合した。ハイブリドーマを、選択培地ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、１０％ ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ−Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）およびβメルカプトエタノール（ＰＡ−３８およびＰＡ−３９の場合）またはハイブリドーマ−ＳＦＭおよび１０％ＦＢＳ（ＰＡ−４１およびＰＡ−５０の場合）（１００μＭのヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌのアザセリンおよび１６μＭのチミジンを含む）に選択目的で懸濁させた。ハイブリドーマを９６ウェルの平底組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）に播種した。プレートを３７℃で３日間インキュベートした後、ＨＴ成長培地（アザセリンなしの選択培地）を加えた。インキュベーションをさらに４〜７日間継続した後、ハイブリドーマ上清を中和活性についてスクリーニングした。

【0190】

ＰＡ−３８の一次スクリーニングで、６０８のハイブリドーマ上清を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１、Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）に対するトキシンＡ（Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の細胞傷害作用の中和能について試験した。ＰＡ−３９およびＰＡ−４１の一次スクリーニングでは、２４１６のハイブリドーマ上清を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するトキシンＢ（Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の細胞傷害作用の中和能について試験した。ＰＡ−５０の一次スクリーニングでは、１４４０のハイブリドーマ上清を、Ｔ−８４細胞に対するトキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ Ｉｎｃ．）の細胞傷害作用の中和能について試験した。２回目のアッセイで、ウサギ赤血球のトキシンによる凝集の阻害について検討した。スクリーニング手順から、ＰＡ−３８（抗トキシンＡ）、ＰＡ−３９（抗トキシンＡ／Ｂ）、ＰＡ−５０（抗トキシンＡ）、ＰＡ−４１（抗トキシンＢ）で示し、スクリーニングアッセイでクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンを効果的に阻害または中和する４種類のｍＡｂを、単離した。これらのｍＡｂを産生したハイブリドーマ細胞株を限界希釈によって２回クローニングし、クローン細胞株を作製した。ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を用いて、ＰＡ−３８、ＰＡ−３９、ＰＡ−４１、ＰＡ−５０ ｍＡｂを、それぞれアイソタイプＩｇＧ２ａ，κ、ＩｇＧ１，κ、ＩｇＧ１，κ、ＩｇＧＩ，κと判断した。ｍＡｂ産生ハイブリドーマ細胞株を、それが産生するｍＡｂと同じ名称で示す。

【0191】

Ｃ．スクリーニング：細胞に対するトキシンＡまたはＢ細胞傷害作用の中和
ハイブリドーマ上清を、細胞に対するトキシンＡまたはトキシンＢの細胞傷害作用の中和能についてスクリーニングした。高スループットの方法を開発し、数千のハイブリドーマ上清を同時に処理した。細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）アッセイでは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＰＡ−３８、ＰＡ−３９、ＰＡ−４１の場合）またはＴ−８４細胞（ＰＡ−５０の場合）のいずれかを使用した。Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸロボットシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｂｒｅａ， ＣＡ）を用いて、細胞をアッセイプレート（９６ウェル、乳白色の壁、透明な平底のプレート；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に加えた。アッセイプレートを３７℃で４時間インキュベートし、細胞をウェルに付着させた。Ｔ−８４のアッセイでは、トキシンＡを２４０ｎｇ／ｍｌまで希釈した。ＣＨＯ−Ｋ１アッセイでは、トキシンＡを２μｇ／ｍｌまで希釈するか、トキシンＢを６ｎｇ／ｍｌまで希釈した。希釈後のトキシンを、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｃａｂｉｎｅｔ（ＢＳＣ）で試薬希釈プレート（９６ウェルの丸底プレート；ＢＤ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）に手作業で加えた。ハイブリドーマ上清を手作業で回収し、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸシステムを用いて試薬希釈プレートのウェルに加えた。上清とトキシンの混合物を３７℃で１時間インキュベートし、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸシステムを用いて細胞の入ったアッセイプレートに加えた。３７℃で７２時間インキュベートした後、２０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を各ウェルに加えた。プレートをさらに４時間インキュベートした後、励起波長５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて読み取った。未処理培養とトキシン処理培養で細胞生存率を比較した。細胞生存率（％）を濃度に対してプロットした。

【0192】

Ｄ．本発明によるマウスｍＡｂの作製
Ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製方法を利用して、単離および／または精製された本発明のｍＡｂを得た。マウスｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏでの産生には、適切なハイブリドーマ細胞株をプリスタンで予備刺激したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔に注射して、腹水液を調製した。硫酸アンモニウムでの沈殿後、プロテインＡクロマトグラフィによってｍＡｂを均一性＞９５％まで精製した。精製抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた。

【0193】

小規模の（＜１００ｍｇ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製では、培養で増殖させたハイブリドーマ上清からマウスｍＡｂを精製した。ハイブリドーマをハイブリドーマ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ＦＢＳで培養した。週に３回Ｔ−１５０フラスコに細胞株を通し、細胞濃度が２×１０^６個／ｍｌを超えないように増やした。ＰＡ−３９（ＩｇＧ１，κ）、ＰＡ−４１（ＩｇＧ１，κ）、ＰＡ−５０（ＩｇＧ１，κ）を含む上清を、２０００ｒｐｍで１０分間の遠心によって清澄化し、濾過した。清澄化材料をランニング緩衝液で最終濃度（６０ｍＭグリシン／３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５）に希釈し、ランニング緩衝液で平衡化しておいたプロテインＡカラムにロードした。カラムを洗浄後、ＰＡ−３９またはＰＡ−４１ ｍＡｂを０．１酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で溶出し、ｐＨ７．０に中和した。ＰＡ−３８（ＩｇＧ２ａ，κ）を含む上清を２０００ｒｐｍで１０分間遠心して清澄化し、濾過した。清澄化材料を２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液／１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）の最終濃度まで調節し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液／０．５ＭのＮａＣｌで平衡化しておいたプロテインＡカラムにロードした。カラムを洗浄し、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）でＰＡ−３８ ｍＡｂを溶出し、溶出抗体をｐＨ７．０に中和した。

【0194】

大量（＞１００ｍｇ）のｍＡｂをｉｎ ｖｉｔｒｏで作製するには、５％ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳを用いて、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）に、ハイブリドーマ−ＳＦＭの初期密度２×１０^５個／ｍｌでハイブリドーマを接種した。細胞数と生存度を毎日監視した。抗体の産生が変化のない状態に達するほぼ６日目または７日目までに、培養を終了した。培養を清澄化した後、接線流濾過で１０〜２０分の１に濃縮した。６０ｍＭのグリシン、３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化しておいたプロテインＡカラムに抗体をロードした。カラムを同一の緩衝液で洗浄し、抗体を５０ｍＭの酢酸（ｐＨ３．５）で溶出した。プールされた抗体を、１ＭのＴｒｉｓでｐＨ７．４まで中和し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ＰＢＳに透析濾過した。精製ｍＡｂを滅菌濾過し、−８０℃で保管した。

【0195】

実施例２
本発明の抗Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡおよび／またはトキシンＢ ｍＡｂの特異性およびトキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する親和性
Ａ．トキシンＡおよび／またはトキシンＢのｍＡｂの特異性を判断するためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５０ｎｇ／ウェルのトキシンＡ（Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または２５ｎｇ／ウェルのトキシンＢ（Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を４℃で一晩コートした。プレートをＰＢＳ−（カルシウムまたはマグネシウムなしのＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、ウェルを２００μｌのブロッキング緩衝液（カルシウムまたはマグネシウムなしのＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、２．５％無脂肪乳）で３７℃にて１時間ブロックした。洗浄ステップを繰り返し、ハイブリドーマ上清または精製ｍＡｂを３７℃で１時間加えた。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を用いて３７℃で１時間インキュベートした。ＡＢＴＳペルオキシダーゼストップ溶液（ＫＰＬ）を用いて、プレートをＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）でデベロップし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４０５ｎｍで読み取った。

【0196】

滴定データを図１Ａから図１Ｃに示す。図１Ａは、ＰＡ−３８がトキシンＡに結合し、トキシンＢに結合しないことを示す。図１Ｂは、ＰＡ−３９がトキシンＡとトキシンＢの両方に結合可能であることを示す。図１Ｃは、ＰＡ−４１がトキシンＢに結合し、トキシンＡに結合しないことを示す。

【0197】

Ｂ．ＢｉａｃｏｒｅにおけるトキシンＡおよびＢのｍＡｂの反応性
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、トキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する本発明のｍＡｂの結合特異性を判断した。ＭＡｂを、アミンカップリングの製造業者の指示に従って、約１０，０００レゾナンスユニット（ＲＵ）でＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。特異性が無関係の（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のアイソタイプマッチ抗体の参考表面を対照として用いた。ＨＥＰＥＳベースのＨＰＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃で結合実験を実施した。精製トキシンＡまたはトキシンＢ（３０ｎＭ；Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を対照フローセルと試験用フローセルに５μＬ／分の速度で通した。必要に応じて、追加のｍＡｂ（１００ｎＭ）を５μＬ／分でフローセルに通し、多価または競合的結合について検討した。

【0198】

図２Ａから図２Ｄに示すように、ｍＡｂ ＰＡ−３８（図２Ａ）およびｍＡｂ ＰＡ−５０（図２Ｃ）は、トキシンＡに特異的に結合した。ｍＡｂ ＰＡ−４１（図２Ｄ）は、トキシンＢに特異的に結合した。ｍＡｂ ＰＡ−３９（図２Ｂ）は、トキシンＡに優先的に結合したが、トキシンＢに対する結合も示した。これらのデータからの結果は、ＥＬＩＳＡのデータ（図１Ａ〜図１Ｃ）と一致し、トキシンＡおよび／またはトキシンＢに対する本発明のｍＡｂの結合特異性を示している。

【0199】

Ｃ．結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ分析も利用して、それぞれのトキシンに対する本発明のｍＡｂの結合活性を判断した。Ｂｉａｃｏｒｅのマウス抗体キャプチャーキットで準備したＣＭ５センサーチップを用いて、ｍＡｂをキャプチャーした。次に、トキシンをさまざまな濃度（０．４〜１００ｎＭ、２倍増大）でフローセルに通した。すべてのトキシン濃度を二重に試験し、測定実施後に毎回、キットに指定された条件でチップ表面を再生した。トキシンに対するｍＡｂのＫ_Ｄを算出するＢｉａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて、ＲＵの変化を記録し、分析した。結合と解離データ、フィッティングを図３Ａから図３Ｅに示す。

【0200】

トキシンＡに対するｍＡｂのＫ_ＤをＢｉａｃｏｒｅ分析で判断したところ、ＰＡ−３８で１．０ｎＭ、ＰＡ−３９で０．１６ｎＭ、ＰＡ−５０で０．１６ｎＭであった。トキシンＢに対するｍＡｂのＫ_Ｄを判断したところ、ＰＡ−３９で２．４ｎＭ、ＰＡ−４１で０．５９ｎＭであった。これらの結果から、本発明のｍＡｂが、ナノモルの親和性およびナノモル以下の親和性でトキシンＡおよび／またはトキシンＢに結合することが明らかになった。

【0201】

実施例３
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースの中和アッセイ
ＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＴ−８４細胞のいずれかを用いる細胞ベースの細胞毒性アッセイを用いて、標記の抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ ｍＡｂの中和活性を評価した。

【0202】

Ａ．ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するトキシンＡ細胞傷害作用の中和
アッセイプレート（９６ウェル、乳白色の壁、透明な平底のプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））にＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種した（５０μＬ／ウェルに細胞２，０００個）。処理の前に４時間、細胞を付着させた。等容量（３５μＬ）の２μｇ／ｍＬのトキシンＡ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と段階希釈ｍＡｂとを試薬希釈プレート（９６ウェルの丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ））で３７℃にて１時間混合した後、混合物５０μｌをプレートの各ウェルに加えた。７２時間のインキュベーション後、２０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。プレートをさらに４時間インキュベートした後、励起波長５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて読み取った。未処理培養とトキシン処理培養で細胞生存率を比較した。細胞生存率（％）をｍＡｂの濃度に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、阻害データを非線形回帰のシグモイド用量反応曲線にフィッティングし、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）を５０％中和するのに必要なｍＡｂの濃度（ＥＣ_５０）を算出した。図４に示すように、ｍＡｂ ＰＡ−３９は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でのトキシンＡの活性をＥＣ_５０が９３ｐＭで完全に中和した。

【0203】

Ｂ．ＣＨＯ−Ｋ１細胞に対するトキシンＢの細胞傷害作用の中和
ＣＨＯ−Ｋ１細胞毒性アッセイを用いて、抗トキシンＢ特異的ｍＡｂの中和活性を評価した。抗トキシンＡ ｍＡｂの評価と同様に、９６ウェルのプレートでＣＨＯ−Ｋ１（２，０００個／ウェル）に加える前に、段階希釈ｍＡｂと一緒にトキシンＢ（８ｐｇ／ｍＬ、ＴｅｃｈＬａｂ）を３７℃で１時間インキュベートした。７２時間後、２０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。プレートをさらに４時間インキュベートした後、励起波長５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて読み取った。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅを用いて細胞生存度を判断し、処理培養と未処理培養とで細胞生存率を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、阻害データを非線形回帰のシグモイド用量反応曲線にフィッティングし、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）を５０％中和するのに必要なｍＡｂの濃度（ＥＣ_５０）を算出した。図５に示すように、ＰＡ−４１は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でトキシンＢの細胞毒性を中和する際に高い度合いの活性を示した（ＥＣ_５０が９．２ｐＭ）。

【0204】

ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ分析では、ｍＡｂ ＰＡ−３９はトキシンＢに対する結合を示したが、このｍＡｂはＣＨＯ−Ｋ１および他の細胞ベースのアッセイではトキシンＢに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を持たなかった。トキシンＡおよびトキシンＢの両方に結合するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースのアッセイでのトキシンＡまたはトキシンＢの中和では機能的活性を持たない抗体が報告されている（４６、９２、９３）。本発明は、トキシンＡおよびトキシンＢの両方に結合し、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシン、すなわちトキシンＡの細胞毒性を中和する二重の機能を有する新規なｍＡｂを包含する。

【0205】

Ｃ．Ｔ−８４細胞に対するトキシンＡの細胞傷害作用の中和
Ｔ−８４細胞毒性アッセイを用いて、標記の抗トキシンＡ ｍＡｂの中和活性を評価した。アッセイプレート（９６ウェル、乳白色の壁、透明な平底のプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））にＴ−８４細胞を播種した（５０μＬ／ウェルに細胞１５，０００個）。処理の前に４時間、細胞を付着させた。等容量（３５μＬ）の２４０ｎｇ／ｍＬのトキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ）と段階希釈ｍＡｂとを試薬希釈プレート（９６ウェルの丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ））で３７℃にて１時間混合した後、混合物５０μｌをアッセイプレートの各ウェルに加えた。７２時間のインキュベーション後、２０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。プレートをさらに４時間インキュベートした後、励起波長５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて読み取った。未処理培養とトキシン処理培養で細胞生存率を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、阻害データを非線形回帰のシグモイド用量反応曲線にフィッティングし、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）を５０％中和するのに必要なｍＡｂの濃度（ＥＣ_５０）を算出した。図６に示すように、ｍＡｂ ＰＡ−３８およびＰＡ−５０は、Ｔ−８４細胞でトキシンＡの活性を完全に中和し、ＥＣ_５０はそれぞれ１７５ｐＭおよび１４６ｐＭであった。Ｔ−８４細胞アッセイで、ｍＡｂ ＰＡ−３９はトキシンＡに対して最小活性を示し、ＰＡ−４１は活性ではなかった。

【0206】

Ｄ．ウサギ赤血球（ＲＢＣ）の血球凝集
本発明のｍＡｂが、細胞受容体に対するトキシンＡの結合をブロックする機能を、血球凝集アッセイで評価した。このアッセイでは、等容量（３０μＬ／ウェル）のトキシンＡ（８μｇ／ｍＬ；ＴｅｃｈＬａｂ）と段階希釈したｍＡｂとを試薬希釈プレート（９６ウェルの丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ））で４℃にて１時間混合した。ウサギ赤血球（ＲＢＣ）（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏ．， Ｄｅｎｖｅｒ， ＣＯ）をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに懸濁させた。１％ＲＢＣ懸濁液６０μＬを、トキシンＡ−ｍＡｂ混合物の入った９６ウェルのプレートのウェルに加え、プレートを４℃で４時間インキュベートした。遊離トキシンＡがＲＢＣの血球凝集を引き起こす。したがって、トキシンＡに結合する抗トキシンＡ ｍＡｂを加えると、血球凝集が防止されると思われる。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ４００機器を用いて、血球凝集の度合いを判断した。完全血球凝集が起これば、懸濁液中のＲＢＣよりもシグナルが強くなった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ非線形回帰シグモイド用量反応曲線フィッティングを用いて、阻害データからＥＣ_５０値を算出した。図７に示すように、ｍＡｂ ＰＡ−３８（黒い正方形）およびｍＡｂ ＰＡ−５０（黒い三角形）がＲＢＣでトキシンＡ活性を完全に中和し、ＥＣ_５０はそれぞれ３０ｎＭおよび１．８ｎＭであった。ＰＡ−３８およびＰＡ−５０は、受容体に対するトキシンＡの結合をブロックすることで、トキシンＡを中和するように見える。アッセイで、ｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−４１は、不活性であることがわかった。

【0207】

Ｅ．Ｃａｃｏ−２単層アッセイ
９６ウェルのＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｃａｃｏ−２プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）の上部チャンバーでＣａｃｏ−２細胞を播種し（７５μＬ／ウェルに２５，０００個）、２５０μＬの培地を下部チャンバ−に加えた。３〜４日ごとに培地を定期的に交換しながら、細胞を１０日間成長させた。１０〜１４日間のインキュベーション後、上皮細胞抵抗測定器（モデル：ＥＶＯＭＸ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓａｒａｓｏｔａ， ＦＬ）を用いて経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定して隙間なく形成された単層の形成を確認した。単層の完全性を確立して判断した後、等容量（６０μｌ）のトキシンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）および段階希釈したｍＡｂを３７℃で１時間混合した後、アッセイプレートの上部チャンバーに加えた。プレートを１８〜２４時間インキュベートした後、抵抗測定器を用いてＴＥＥＲ値を測定した。未治療のウェルとトキシン処理したウェルで単層の完全性を比較した。図８に示すように、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて阻害データを非線形回帰シグモイド用量反応曲線にフィッティングし、５０％中和（ＥＣ_５０）に必要なｍＡｂの濃度を求めた。ｍＡｂ ＰＡ−３８およびＰＡ−５０は、トキシンＡによるＣａｃｏ−２単層の破壊を中和し、ＥＣ_５０がそれぞれ４８５ｐＭおよび１９６ｐＭであった。このアッセイで、他のｍＡｂは不活性であることがわかった。

【0208】

理論に拘泥されるものではないが、細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果から、ＰＡ−３８およびＰＡ−５０が、１つのクラスの抗トキシンＡ ｍＡｂを表し、ＰＡ−３９が別のクラスの抗トキシンＡ ｍＡｂを表すように見えることがわかる。ｍＡｂ ＰＡ−３８およびＰＡ−５０は、受容体結合に重要なトキシンＡのエピトープに結合するように見える。ｍＡｂ ＰＡ−３９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてトキシンＡの細胞傷害作用を一層直接的にブロックする形でトキシンに結合するように見える。

【0209】

実施例４
マウスにおける本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性の評価
ｉｎ ｖｉｖｏでのマウスモデルを使用して、本明細書に記載のｍＡｂが、動物で循環するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンを中和する機能を測定した。単独または組み合わせで投与したｍＡｂ ＰＡ−３８、ＰＡ−３９、ＰＡ−４１またはＰＡ−５０のｉｎ ｖｉｖｏでの中和活性を、被検動物での組み合わせでの全身クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢ（Ｔｅｃｈｌａｂ）の作用について試験した。

【0210】

実験には、雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ４〜６匹／群（週齢：研究開始時に約６〜８週；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。設備でマウスを最低４日間順化し、使用する前に動物の健康をチェックした。ＩＡＣＵＣが承認したプロトコールで動物実験を実施した。

【0211】

マウスで初期実験を実施して、トキシンＡおよびトキシンＢの毒性を判断した。動物に０、２０、１００、５００、２５００ｎｇのトキシン／匹を腹腔内（腹腔内）投与し、以後の抗体中和実験で用いる、動物にとって致死的な用量を選択した。ＰＢＳを注射した対照マウスは未感染であった。中和実験には１００ｎｇ用量のトキシンＡ（ＴｅｃｈＬａｂ）を選択した。この用量が、１００％のマウスが注射後２４時間以内に致死的になる最低用量レベルであったためである。同様に、中和実験には１００ｎｇ用量のトキシンＢ（ＴｅｃｈＬａｂ）を選択した。この用量が、１００％のマウスが注射後２４時間以内に致死的になる最低用量レベルであったためである。

【0212】

抗トキシンｍＡｂの中和活性を評価するために、０日目に各ｍＡｂを異なる用量レベルでマウス（１群あたり５匹）に単回注射して腹腔内投与した後、１日目に１００ｎｇ／２００μｌのトキシンＡまたはトキシンＢを腹腔内投与した。３日間は動物を毎日観察し、その後はトキシン投与後２１日目まで毎週観察した。動物の生存が、研究の一次エンドポイントであった。

【0213】

中和実験では、すべての用量の抗体を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＰＢＳ−、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で配合した。０日目にｍＡｂ ＰＡ−３８、ＰＡ−３９、ＰＡ−４１またはＰＡ−５０を異なる用量レベルでマウスに単回注射して腹腔内（２００μｌ／用量／動物）投与した後、１日目にトキシンを注射（抗体注射部位とは異なる腹腔内の部位）。最初の３〜４日間は動物の健康状態を毎日監視した後、トキシン投与後最大２１日目まで１週間に２回監視した。動物のケージ側の観察（猫背の姿勢、毛皮の艶がない、活発でないなど）を、生存状態と一緒に記録した。

【0214】

異なる用量レベルのＰＡ−３８（動物１匹あたり０．２μｇ〜２５０μｇ）、ＰＡ−５０（動物１匹あたり０．２μｇ〜１００μｇ）とｗ、評価した。このモデルでは、ＰＡ−３８およびＰＡ−５０が、１００ｎｇ用量のトキシンＡを中和し、図９Ａおよび図９Ｂに示すように、動物１匹あたり２μｇという低い用量レベルのｍＡｂで１００％生存させられるすることが明らかになった。対照的に、本明細書ではＣＤＡ−１対照のｍＡｂと呼ぶ対照のヒト抗トキシンＡモノクローナル抗体（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）は、動物１匹あたり５μｇで、本発明のｍＡｂのように動物をトキシン関連死から保護しなかった（図９Ｃ）。０．５μｇ〜２５０μｇというＰＡ−４１の用量を、評価し、動物１匹あたり５μｇの単一用量のｍＡｂで、図１０に示すように、動物１匹あたり１００ｎｇ用量のトキシンＢ毒性を完全に中和することが明らかになった。ＭＡｂ ＰＡ−３９（動物１匹あたり１００μｇ）は、トキシンＡまたはＢのどちらでもマウスのトキシン関連死を遅延させることが観察されなかった。

【0215】

トキシンＡ（ＰＡ−３８、ＰＡ−５０）またはトキシンＢ（ＰＡ−４１）に対する個々の抗体の中和活性がｉｎ ｖｉｖｏにて明らかになった後、同一のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルで、トキシンの合計での致死用量（トキシンＡを１００ｎｇ、トキシンＢを１００ｎｇ）に対する各ｍＡｂの用量レベル５μｇおよび５０μｇでｍＡｂ（ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１）の組み合わせを試験するための実験を実施した。また、個々のモノクローナル抗体を対照として含めた。図１１に示すように、各ｍＡｂ単独（すべての動物がトキシン投与２４時間以内に死亡した）の場合の活性と比較して、ＰＡ−３８およびＰＡ−４１ ｍＡｂの組み合わせで、５０μｇ／匹（５匹のうち４匹が生存）および５μｇ／匹（５匹のうち１匹が生存）の両方でトキシンの組み合わせから保護された。

【0216】

実施例５
Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスターにおけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）モデルにおける本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢ ｍＡｂの評価
ハムスターでのＣＤＡＤモデルが、ヒトにおけるＣＤＡＤ疾患のカギになる態様を再現する。抗生剤での治療時、正常な結腸細菌叢が根絶し、ハムスターがクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の感染に対して易感受性となった。感染によって、重症の下痢症、偽膜性大腸炎および死に至る。ハムスターのＣＤＡＤモデルを利用して、生きたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌からの攻撃に関連した動物の疾患および死を防ぐ本発明のｍＡｂの考えられる有効性を評価した。これらの実験を、ＩＡＣＵＣが承認したプロトコールで実施した。

【0217】

Ａ．薬物動態分析
生きたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）微生物に感染したハムスターを用いてハムスターのモデルで有効性の研究を実施する前に、正常な未感染のハムスターで薬物動態研究を実施した。Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスター（Ｈａｒｌａｎ）に０．２ｍｇ／匹または１ｍｇ／匹の精製ｍＡｂ ＰＡ−３８またはｍＡｂ ＰＡ−４１を腹腔内注射した。０．１２５日目、０．２５日目、１日目、２日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日間目に、後眼窩または心臓の穿刺（全血）採血技術で、血液試料を回収した。血液試料を８０００ｒｐｍで１０分間遠心処理して、血清を得た。

【0218】

ＥＬＩＳＡで血清中のｍＡｂ濃度を判断した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、トキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ）またはトキシンＢ（Ｔｅｃｈｌａｂ）を２５０ｎｇ／ウェルで４℃にて一晩コートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、２００μｌのブロッキング緩衝液（カルシウムまたはマグネシウムありのＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）、２．５％無脂肪乳）で室温にて１時間ブロックした。抗体参照標準（精製ｍＡｂ ＰＡ−３８またはｍＡｂ ＰＡ−４１）を、１％のプールした無感作ハムスター血清で希釈し、０．３〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の標準曲線を生成した。希釈した被験試料および標準を室温にて１時間、インキュベートした。

【0219】

プレートを洗浄し（上記同様）、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて室温にて１時間インキュベートした。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質系（ＫＰＬ）でプレートをデベロップし、ＡＢＴＳペルオキシダーゼストップ溶液（ＫＰＬ）で止めて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４０５ｎｍで読み取った。標準曲線を使用して、異なる時点での各ハムスターのｍＡｂ濃度を算出した。約１０％の試料で抗体力価が認められなかったが、これはおそらく注射ミスまたは吸収が起こらなかったことによるものと思われた。これらの試料はＰＫパラメータの計算には含めなかった。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ、バージョン４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を用いてノンコンパートメントの薬物動態分析を実施した。データを表１および図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。図示のとおり、Ｃｍａｘおよび曲線下の面積（ＡＵＣ）が用量依存性であった。各抗体の終末半減期が６日間を超えたが、これによって後述する有効性の研究のあいだ、抗体が確実に保持された。

【0220】

【表1】

【0221】

Ｂ． Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスターのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）モデルにおける、組み合わせでの本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢ ｍＡｂの評価
有効性実験を実施して、本発明のマウスの抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ ｍＡｂが、ハムスターのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症のｉｎ ｖｉｖｏモデルで感染動物の生存性に影響する能力を評価した。雄のＧｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスター（約９０ｇ）（Ｃｒｌ：ＬＶＧ（ＳＹＲ））（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， ＮＹ）を、単回皮下用量のクリンダマイシン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液として配合）５０ｍｇ／ｋｇで前処理し、正常な結腸細菌叢を破壊した。翌日、関連の試験群のハムスターに経口用量（０．５ｍＬを１×１０^７ＣＦＵ）のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（ＡＴＣＣ ４３５９６株）懸濁液を与えた。株４３５９６は、過去にハムスターモデルで抗体の中和に用いられていた。動物の体重を毎週計測し、健康状態と生存については毎日監視した。

【0222】

被検抗体は、本発明のマウスｍＡｂの組み合わせ、すなわち、ｍＡｂ ＰＡ−３８およびＰＡ−４１の組み合わせまたはｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−４１の組み合わせからなるものであった。ヤギ抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢポリクローナル抗体（Ｔｅｃｈｌａｂ）を、陽性対照として含めた。ｍＡｂおよび対照試薬を表２に示したようにして投与した。

【0223】

【表2】

【0224】

群１のハムスターには研究の間、何の処理もしなかった。群２〜７のハムスターは、単回皮下用量のリン酸クリンダマイシン５０ｍｇ／ｋｇ（−１日目）で前処理した。群５〜７のハムスターには、クリンダマイシン処理直後に表２に示すようなポリクローナルヤギ抗体（群５）またはｍＡｂの組み合わせ（群６および７）を腹腔内投与した。２４時間後、群３〜７の各ハムスターに、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＡＴＣＣ ４３５９６（１０^６〜１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）適切な懸濁液０．５ｍＬを経口胃管栄養で与えた（０日目）。１日目の抗体での初期処理後、１日目、３日目、５日目に、これらの群での以後の３回の治療剤を１日おきに、１日あたり１回投与した。群４の動物に、１〜５日目に１日２回、約６時間あけてバンコマイシン（２０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）を経口胃管栄養で投与した。バンコマイシン（群４の動物）の投与は、動物にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を接種した約２０〜２４時間後に開始した。

【0225】

ｍＡｂ処理群と対照群での生存結果を図１３に示す。全群でのハムスターでの死亡率の概要を表３にあげておく。処理せずにクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染したすべてのハムスター（感染対照、群３）は、研究の２日目または３日目に死亡したことがわかった。バンコマイシン処理群（群４）では、８匹のハムスターのうち７匹が１５日目から１９日目の間に死亡したことが明らかになった。このモデルで一般に観察されるように、ほとんど（８８％）のバンコマイシン処理ハムスターで、療法の中断後２週間以内にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染が再発し、死亡した。対照的に、ｍＡｂ ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１（群７）の組み合わせで処理したすべてのハムスターならびに、ｍＡｂ ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１（群６）の組み合わせで処理した８匹のハムスターのうち７匹が、研究終了時まで生存した（感染後３７日目）。また、研究終了時、ヤギポリクローナル抗体で処理した群のすべての動物（群５）が生きていた。生存したハムスターはいずれも、死後剖検時にＧＩ管が正常であった（図１５Ａ、図１５Ｃおよび図１５Ｄ参照）。

【0226】

【表3】

【0227】

これらの結果から、最初と以後の疾患の再発時の両方で、ｍＡｂ ＰＡ−３９とＰＡ−４１の組み合わせならびに、ｍＡｂ ＰＡ−３８とＰＡ−４１の組み合わせが、ハムスターを重症の疾患から効果的かつ永続的に保護したことがわかる。ｍＡｂ治療で利益が得られる期間（３７日間）は、ハムスターモデルでクリンダマイシンでの治療後にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症が確立されるウィンドウ（２週間）を有意に超えた。ポリクローナル処理群とｍＡｂ処理群、対照群での動物の体重を、図１４に示す。未感染の対照群（群１）のハムスターは、研究の過程で１３〜２９ｇから堅調に重量が増えた。感染対照動物はいずれも最初の接種後体重測定前に死亡した。バンコマイシン、ヤギポリクローナル抗体、ＰＡ−３８＋ＰＡ−４１ ｍＡｂの組み合わせ、ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１ ｍＡｂの組み合わせで処理した動物の平均体重は、感染後の最初の週に有意に低下した。その後、ｍＡｂ処理群ならびにポリクローナル抗体処理群での平均体重が、堅調に増えて、研究の終わりまでには未感染の対照と同様になったことから、毒性のイベントがないことがわかった。

【0228】

このハムスターでの研究全体として、本発明のｍＡｂの組み合わせが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の関連およびストリンジェントなハムスターモデルでハムスターを死亡率から効果的かつ永続的に保護したことが明らかになった。これらの所見は、未感染の動物と比較して、ｍＡｂ処理動物で正常な腸細菌叢の自然な発達と再増殖が可能になる長期間にわたって、ｍＡｂの組み合わせが動物をクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患から保護した機序を裏付けるものである（図１５Ａ〜図１５Ｄ）。このように、本発明のｍＡｂを用いると、感染動物に対して治療的な保護が得られ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患がなくなって、胃腸管の健康と生存が回復された。

【0229】

Ｃ．Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスターでのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）モデルにおける本発明の個々の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよび／またはトキシンＢ ｍＡｂの評価
ハムスターでの別の研究を実施し、組み合わせで投与したｍＡｂの場合と比較して、感染動物に投与した本発明の個々のマウス ｍＡｂの有効性を評価した。この研究での処理群を表４に示す。

【0230】

【表4】

【0231】

この研究では、群１〜７のハムスターに単回皮下用量のリン酸クリンダマイシンを５０ｍｇ／ｋｇ（１日目）で与えて前処理した。群３〜７の動物には、クリンダマイシン処理直後にｍＡｂを腹腔内投与した。２４時間後、前述のセクションＢで説明したように、群１〜７の各ハムスターにクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の懸濁液０．５ｍＬを経口胃管栄養で与えた（０日目）。１日目、３日目、５日目に、被検ｍＡｂ治療剤を、群３〜７の動物に単回用量で投与した。１〜５日目に１日２回（群２）バンコマイシンを経口胃管栄養で投与した。ハムスターの生存度を１日２回監視した。１週間に１回、体重を記録した。死亡が確認された動物または研究時に安楽死させた動物については、剖検を実施した。研究終了時（接種後４０日目）、残っていたすべてのハムスターについて最終剖検を実施した。

【0232】

ｍＡｂ処理動物群および対照動物群での生存を図１６Ａに示し、すべての群のハムスターの死亡日を表５にまとめておく。

【0233】

【表5】

【0234】

感染対照群（群１）では、７匹のハムスターすべてが２日目に死亡したことが明らかになった。これらのハムスターはいずれも、死後の検査でＧＩ管に炎症が生じていた。バンコマイシン-処理群（群２）では、７匹のハムスターがすべて研究の１２日目から１９日目の間に死亡した。これらの死亡のタイミングは、このモデルのバンコマイシン処理で前に観察されたタイミングと同様であった。死後の検査で、すべてのハムスターに、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を示すＧＩ管の炎症があることが明らかになった。

【0235】

ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１ ｍＡｂの組み合わせ処理（群３）は、この研究では感染したハムスターを保護する上で極めて効果的であった。群３の７匹のうち６匹のハムスターが研究の終わりまで生存した。１匹のハムスターが、研究１２日目に死亡したことが明らかになった。死後の検査で、このハムスターには、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に典型的なＧＩ管の炎症があることがわかった。

【0236】

単一抗体での処理（群４〜７）のうち、ｍＡｂ ＰＡ−３９単独（群６）で、処理動物でいくらか保護活性が示された。この群のハムスターは、２日目から１２日目までに死亡したことがわかった。個々のｍＡｂすなわちＰＡ−４１（群４）、ＰＡ−３８（群５）、ＰＡ−５０（群７）で処理した群では、ハムスターは２日目と３日目の間に死亡したことがわかった。最終剖検で、これらの群のすべてのハムスターにＧＩ管の炎症が認められたが、これはクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を示すものである。対照的に、生存したすべての処理ハムスターは正常なＧＩ管であった。

【0237】

この研究の結果から、ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１のｍＡｂの組み合わせで処理すると、処理中断後１か月を超える期間にわたって、疾患の発症からハムスターを保護できることを示している。これは、ＰＡ−３９＋ＰＡ−４１の組み合わせで処理した８匹のハムスターのうち８匹がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症から生存した実施例５Ｂの上述した研究で得られるものと同じである。この研究では、単一のｍＡｂ治療としてのｍＡｂ ＰＡ−３９が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患からクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症ハムスターを保護するにあたって、いくらかの活性を呈した。

【0238】

Ｄ．終末血での抗体濃度の判断ならびに、終末時ハムスター盲腸試料でのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の存在の評価
研究時に瀕死であることが明らかになった動物から血液を採取した。研究終了時、生きたままであった動物から血液を採取した。以下において特に明記しないかぎり、血液試料を処理して血清を集めた。以後に有り得る分析のために、処理済みの試料を＜−７０℃で冷凍した。

【0239】

上述したｉｎ ｖｉｖｏでの有効性ハムスター研究に続いて、研究時に動物から得た全血採血でｍＡｂの存在を調べた。実施例５Ｂで説明したｍＡｂの組み合わせ研究では、ｍＡｂ ＰＡ−３９（５０ｍｇ／ｋｇ）＋ｍＡｂ ＰＡ−４１（４０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを投与（２日ごと×４）した群７の８匹の動物を、研究３７日目に全血採血した。この全血採血から回収した血清で、３．３±３．４μｇ／ｍＬのレベルでＰＡ−３９が検出され、２．４±１．７μｇ／ｍＬのレベルでＰＡ−４１が検出された。実施例５Ｃで説明した個々のｍＡｂ研究では、ｍＡｂ ＰＡ−３９（５０ｍｇ／ｋｇ）＋ｍＡｂ ＰＡ−４１（５０ｍｇ／ｋｇ）のの組み合わせを投与（２日ごと×４）した群３の動物６匹を、研究４０日目に全血採血し、血液試料を処理して血漿を得た。この全血採血から回収した血漿で、１．８±１．４μｇ／ｍＬのレベルでＰＡ−３９が検出され、３．４±３．２μｇ／ｍＬのレベルでＰＡ−４１が検出された。これらの分析での抗体の検出限界は、１．６ｎｇ／ｍＬであった。このように、数週間の時間にわたって動物で検出可能なレベルのｍＡｂを測定した。これは、これらのｍＡｂが、治療計画の過程とｍＡｂの最終用量を投与した後にで治療上の利点を与える作用様式を裏付けるものである。

【0240】

実施例５Ｃの群３での最後の剖検で、各ハムスターの盲腸を露出させたところ、いずれも正常に見えた。炎症または赤みは観察されず、盲腸の内容物も比較的しっかりして硬かった。各盲腸の壁を滅菌した使い捨てのメスで開いた。ハムスターごとに新しいメスを使って、相互汚染を防いだ。少量の糞便を滅菌した綿棒で盲腸から取り除き、滅菌した試験管に入れた。１０μＬの播種用ループを用いて、試験管から糞便の試料を回収し、ウマ血液培地（Ｒｅｍｅｌ、ロット７３５０６５）のＣＣＦＡの入った寒天プレートに試料を画線した。これは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）用に選択したものである。プレートを無気箱に入れ、３７℃で４８時間インキュベートした。１枚のプレートに保存培養からクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＡＴＣＣ ４３５９６を画線し、コロニー比較のために糞便の画線と一緒にインキュベートした。ハムスター６匹全部からのプレート上でクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に似ているコロニーを観察した。これらの実験の結果から、本発明のｍＡｂで処理した生存動物には依然としてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）がいるが、正常な腸内微生物平衡を回復すべく正常な細菌叢が再集合して、これが全生存に寄与したことがわかる。

【0241】

Ｅ．Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスターのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）モデルにおける本発明の抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよび／またはトキシンＢヒト化ｍＡｂおよび対照の抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ ｍＡｂの評価
ハムスターでさらなる研究を実施して、本発明のヒト化抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ ｍＡｂのの組み合わせのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を、ヒト抗トキシンＡ対照のｍＡｂ、ＣＤＡ−１、ヒト抗トキシンＢ対照のｍＡｂ、ＣＤＢ−１の組み合わせでの場合と比較して、それぞれの抗体の組み合わせをクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の動物に投与した場合について評価した。この研究の処理群を、表５Ａに示す。

【0242】

【表5A】

【0243】

被検抗体は、本発明のヒト化ｍＡｂすなわち、ヒト化抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−５０とヒト化抗トキシンＢ ｍＡｂ ＰＡ−４１との組み合わせ（ｈＰＡ−４１＋ｈＰＡ−５０）またはＣＤＡ−１対照のｍＡｂと呼ぶ対照のヒト抗トキシンＡ ｍＡｂとＣＤＢ−１対照のｍＡｂと呼ぶ対照のヒト抗トキシンＢ ｍＡｂとの組み合わせ（ＣＤＡ−１＋ＣＤＢ−１）を表５Ａに示す量で用いた組み合わせからなるものであった。本明細書に記載の方法で、３Ｄ８および１２４の公開された重鎖および軽鎖領域（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）に基づいて、対照のｍＡｂを合成（ＤＮＡ２．０）し、全長ＩｇＧ１発現ベクター（ｐＣＯＮ−γおよびｐＣＯＮ−κ）にクローニングし、ＣＨＯ−ＫＳＶ１細胞で発現させ、精製した。ｍＡｂの組み合わせと対照治療剤を表５Ａに記載したようにして投与した。

【0244】

治療方法は、基本的に、この実施例のパートＢで上述したとおりである。簡単に説明すると、この実施例５Ｅの研究では、Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｔｏｎｅ Ｒｉｄｇｅ， ＮＹ、５０日齢）を用いた。対照群１のハムスターは未感染（かつ未処理）であった。群２〜７の動物は単回皮下用量のリン酸クリンダマイシン５０ｍｇ／ｋｇで前処理し、正常な結腸細菌叢を破壊した（１日目）。群４〜７の動物には、クリンダマイシン処理直後にＩＰ投与した。２４時間後、群２〜７の各動物に０．５ｍＬのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（ＡＴＣＣ ４３５９６、株５４５）懸濁液を経口胃管栄養で与えた（０日目）（すなわち経口用量）。群４〜７では、１日目、３日目、５日目に、動物に単一用量で被検治療剤をさらに投与した。群３の動物には、１〜５日目に１日２回、約６時間あけてバンコマイシンを投与した。動物の体重を毎週計測し、健康状態と生存については３９日間毎日監視した。終末に剖検を実施し、選択培地にて３７℃で４８時間の嫌気培養後にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）微生物の盲腸での力価を判断した。検出限界は、盲腸内容物１ｇあたり２０ＣＦＵであった。この研究および上述したハムスターでの研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って、Ｒｉｃｅｒｃａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｏｎｃｏｒｄ， ＯＨ）で実施した。

【0245】

ｍＡｂ処理群および対照群での生存結果を図１６Ｂ−１に示す。研究の死亡率データを以下の表５Ｂに示す。ハムスターの生存での概要を以下の表５Ｃに示す。

【0246】

【表5B】

【0247】

表５Ｂから明らかなように、未感染の対照ハムスター（群１）４匹はいずれも研究の終わりまで生存した。感染対照（群２）動物はすべて２日目と３日目に死亡した。バンコマイシン処理群（群３）では、研究動物はいずれも１３日目から２２日目の間に死亡した。ｈＰＡ−５０＋ｈＰＡ−４１（５０、５０ｍｇ／ｋｇ）群４では、１０匹の動物のうち９匹が研究の終わりまで生存した。この群の１匹のハムスターが８日目に瀕死であることがわかり、ＧＩ管が赤く変色していたのに対し、この群で残り９匹の生き残った動物はＧＩ管が正常であった。群５の１０匹のハムスターはすべて研究の終わりまで生存し、ＧＩ管も正常であった。対照のｍＡｂ群では、５０ｍｇ／ｋｇ（群６）を投与した１０匹の動物のうち９匹が、５日目から１４日目の間に死亡し、１匹の動物が研究の２８日目までに死亡した。対照のｍＡｂの組み合わせ２０ｍｇ／ｋｇで処理した１０匹のハムスター（群７）はいずれも、研究５日目から１４日目の間に死亡した。

【0248】

【表5C】

【0249】

表５Ｃから明らかなように、未感染の対照群１の動物４匹すべてが研究の終わりまで生存した（４０日間）。処理なしでクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に感染したすべてのハムスター（感染対照、群２）では、生存中央値が２日間であった。この群の動物は研究の終わりまで生存しなかった。バンコマイシン処理群（群３）では、生存中央値が２０日間で、４０日目まで生存した動物はいなかった。ｈＰＡ−５０＋ｈＰＡ−４１ ｍＡｂの組み合わせでの処理はともに、この研究では感染動物を保護する上で効果的であった（群４および５）。ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−５０＋ＰＡ−４１（２０ｍｇ／ｋｇ 各々；群５）の組み合わせで処理したすべて（１００％）のハムスターと、ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−５０＋ＰＡ−４１（各５０ｍｇ／ｋｇ；群４）の組み合わせで処理したハムスターの９０％が、研究の終わりまで生存した（感染後４０日）。すべての生存したハムスターは、死後剖検で基本的にＧＩ管が正常であった。対照的に、対照の抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ ｍＡｂの組み合わせを与えた動物の生存中央値は、対照のｍＡｂのどちらの用量でも同様であった。対照ｍＡｂの組み合わせで処理した２つの群では、すべての動物が死亡した。特に、ＣＤＡ−１＋ＣＤＢ−１（各５０ｍｇ／ｋｇ；群６）組み合わせを与えた動物では、生存中央値が１４日間だったのに対し、ＣＤＡ−１＋ＣＤＢ−１（各２０ｍｇ／ｋｇ；群７）の組み合わせを与えた動物では、生存中央値が１１日間であった。

【0250】

この研究での追加評価には、研究終了時における体重測定、肉眼での剖検、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）微生物の盲腸力価が含まれていた。バンコマイシンまたはＰＡ−５０／ＰＡ−４１の組み合わせで処理した動物の平均体重は、感染後の最初の週に減少した後、戻した（図１６Ｂ−２）。３９日目までに、ＰＡ−５０／ＰＡ−４１の組み合わせで処理した動物の平均体重は、並列に収容した健康で未感染の動物と同様になった（Ｐ＞０．０５）。ＣＤＡ１／ＣＤＢ１対照の抗体の組み合わせの組み合わせで処理した動物の平均体重は、研究の間、着実に減少した。

【0251】

３９日目、ＰＡ−５０／ＰＡ−４１の組み合わせで治療して生存した１９匹の動物の消化管は、未感染の動物と同様に見えた。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の盲腸力価は検出不能（＜１．３ｌｏｇ_１０ＣＦＵ、ｎ＝１１）または低い（４．１５±０．７６ｌｏｇ_１０ＣＦＵ、ｎ＝８）のいずれかであった。対照的に、他の処理群では、死亡時に数匹またはすべての動物で炎症の生じた消化管が観察された。４匹の未処理の動物のうち４匹と、盲腸の分析をした４匹のバンコマイシンで処理した動物のうち４匹（ＰＡ−５０／ＰＡ−４１に対して平均ＣＦＵ＝６．０１±０．９３ｌｏｇ_１０、Ｐ＜０．０１７）で、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が検出され（ＰＡ−５０／ＰＡ−４１に対して平均ＣＦＵ＝８．９６±０．５９ｌｏｇ_１０、Ｐ＜０．０００１）。ＣＤＡ１／ＣＤＢ１対照の抗体の組み合わせで処理したほとんどのハムスターで、盲腸の内容物がわずかしかないかまったくなかったが、このためクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）力価の定量的な分析ができなかった。

【0252】

この研究および上記の研究での統計分析のために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．４．０ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて中和データを４パラメータのロジスティック方程式にフィッティングした。両側ｔ検定またはｌｏｇランク検定を用いて、平均または生存データをそれぞれ比較した。

【0253】

研究の結果から、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の動物を、どちらの用量レベルのヒト化ｍＡｂ ＰＡ−５０とＰＡ−４１の組み合わせで処理しても、最初と以後の疾患の再発時のいずれも、ハムスターを重症の疾患から効果的かつ永続的に保護できることがわかる。ヒト化ｍＡｂの組み合わせ処理の利益がある期間（４０日間）は、対照としてのバンコマイシンまたは対照の抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ ｍＡｂでの処理と比較して、動物の長期生存を有意に改善した。

【0254】

ｉｎ ｖｉｖｏでの動物研究から明らかなように、ヒト化ＰＡ−５０／ＰＡ−４１ ｍＡｂの組み合わせでの組み合わせ処理は、ＣＤＩおよび療法の十分に確立されたＧｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎハムスターモデルでクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対して非常に有効であった。ＰＡ−５０／ＰＡ−４１での短い処理期間でも、処理をしなかった動物、標準的な抗生剤療法の動物または対照のｍＡｂの動物の生存が０％だったのに対し、感染後３９日目に９５％が生存した。感染後３９日目に、ＰＡ−５０／ＰＡ−４１で処理した動物は体重が正常であり、明らかな胃腸管病変は認められなかった。未処理動物と比較して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）はほとんどの動物から回収できず、＞７−ｌｏｇ_１０クリアランスを反映していた。これらの所見に対して考えられる説明のひとつとして、抗生剤の非存在下におけるトキシンのｍＡｂによる中和によって、動物の消化管で保護的な微生物細菌叢が再建できるようになったことがあげられる。

【0255】

トキシンＡまたはトキシンＢ単独では、ＣＤＩのハムスターモデルにおいて致死的な疾患を引き起こせたことが報告され、これらのトキシンに対するｍＡｂは通常、治療の有効性を最大にするのに必要とされる。上記の研究では、マウスｍＡｂ ＰＡ−５０およびＰＡ−４１を個々に５０ｍｇ／ｋｇの用量でハムスターモデルに用いた場合に生存の利点が認められず、これが組み合わせ治療の要件を明確にしている。

【0256】

このハムスターでの研究全体として、マウスｍＡｂの組み合わせを用いた上述の所見と同様に、本発明のヒト化ｍＡｂの組み合わせが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の厳しいハムスターモデルで効果的かつ永続的にハムスターを死亡率から保護したことが示された。理論に拘泥されるわけではないが、これらの所見は、ヒト化ｍＡｂの組み合わせが、ヒト化ｍＡｂ処理動物の正常な腸細菌叢の自然な発達と再増殖を可能にするだけ長い期間にわたって、動物をクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患から保護および／または動物にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症に対する反応を持たせ、よって、感染動物を治療的に保護し、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患を効果的になくし、胃腸管の健康と生存を回復させる作用機序を裏付けるものである。

【0257】

実施例６
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢの領域に対するｍＡｂの結合
本発明のｍＡｂが結合したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡおよびトキシンＢのエピトープ領域を判断するための実験を実施した。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって産生されるトキシンＡおよびトキシンＢはどちらも、約３００ｋＤａでかなりの配列と構造が相同である。どちらも、クロストリジウムの繰り返しオリゴペプチド（ＣＲＯＰ）を含有するＣ末端受容体結合ドメインと、ポア形成を引き起こし、エンドソームの膜へのトキシンの挿入を媒介すると考えられている中央の疎水性のドメインと、Ｎ末端酵素ドメインを切断するタンパク質分解ドメインと、を有するため、グルコシルトランスフェラーゼが細胞質に入ることができる。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ならびに他のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）タンパク質のトキシンをコードする核酸配列は、公開されており、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベース（すなわちｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）でアクセスできる。たとえば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ １０４６３の場合、トキシンＡおよびトキシンＢをコードするＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ受託番号ｘ９２９８２に見られる；また、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００９０８９、領域７９５８４２−８０３９７５は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０染色体完全ゲノム配列由来のトキシンＡのＤＮＡ配列を提供するものであり、かたやＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００９０８９、領域７８７３９３−７９４４９３は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０染色体配列由来のトキシンＢをコードするＤＮＡ配列を提供するものである。

【0258】

Ａ．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＢの抗体結合ドメインマッピング
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の全長トキシンＢは、３つの主要ドメインすなわち、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）活性を処理するＮ末端酵素ドメイン（６３ｋＤａ）と、推定上のトランスロケーションドメイン（１４８ｋＤａ）の片側にあるＣ末端細胞受容体結合（５９ｋＤａ）（図１７Ａおよび図１７Ｃ）からなる。酵素カスパーゼ１を用いる全長トキシンＢの酵素的な切断によって、いくつかのトキシンＢ断片を作製した（図１７Ｃ）。トキシンＢを３７℃で９６時間、カスパーゼ１（酵素／トキシン比約１Ｕ／μｇトキシン）で処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した場合に断片（１９３および１６７ｋＤａ）を含有する２つのＣ末端と断片（１０３および６３ｋＤａ）を含有する２つのＮ末端を含む４つの主要な断片を作製した（図１７Ｂ）。２６および１４ｋＤａなど、他のこれよりも小さな断片も作製されたように見えるが、３〜８％トリス酢酸ゲル分析では検出可能でなかった。

【0259】

未処理またはカスパーゼ１で処理したトキシンＢでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を実施した（図１８Ａ〜図１８Ｃ）。ｍＡｂ ＰＡ−４１は、カスパーゼ１処理トキシンＢの１０３ｋＤａと６３ｋＤａの両方の断片を認識した（図１８Ｂの右側のレーン）ことから、ＰＡ−４１がトキシンＢのＮ末端酵素ドメインに結合することがわかる。Ｎ末端シーケンシング分析で、ＰＡ−４１がトキシンＢの６３ｋＤａのＮ末端酵素ドメインに結合することを確認した。未処理トキシンＢの６３ｋＤａのバンド（左側のレーン、図１８Ｂ）がＰＡ−４１に認識されなかったのは興味深いが、これはレーンの分子量が同じ（６３ｋＤａ）２つの断片異なるタンパク質に見えたことを示唆している。

【0260】

カスパーゼ１処理トキシンＢのＭＡｂ ＰＡ−３９結合１６７ｋＤａ断片（図１８Ｃ、右側のレーン）ならびに、未処理トキシンＢ調製物の６３ｋＤａのタンパク質（図１８Ｃ、左側のレーン）は、ＰＡ−３９がトキシンＢのトランスロケーションドメインでエピトープに結合することを示唆している。よって、カスパーゼ１処理 クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析の結果に基づいて、ｍＡｂ ＰＡ−４１およびＰＡ−３９がトキシンＢとは異なる形で相互作用することが観察された。ｍＡｂ ＰＡ−４１はトキシンＢのＮ末端酵素ドメインでエピトープに結合することが明らかになったが、ｍＡｂ ＰＡ−３９は、トキシンのトランスロケーションドメインのエピトープ（アミノ酸８５０〜１３３０）に結合することが明らかになった。これらの所見は、エンテロキナーゼ消化を用いるトキシンＢ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析でも確認された。

【0261】

Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、トキシンＢに対する抗トキシンＢ ｍＡｂの競合的結合も実施した。図１９Ａから図１９Ｅにおいて示されるように、ｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−４１は、トキシンＢの異なるエピトープ領域に結合する。マウスｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−４１は、トキシンＢの単一部位またはエピトープに結合することが観察された。これらのｍＡｂは、Ｃ末端細胞受容体結合（ＣＲＢ）ドメインに結合することが見出されなかった。マウスＰＡ−４１では、結合トキシンＢの親和性が０．５９ｍＭであった。さらに、ＰＡ−４１に結合したトキシンＢ上の部位は、対照の抗トキシンＢ ｍＡｂ ＣＤＢ−１の結合をブロックしなかった（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）（図１９Ｄ）。これらの所見は、ウェスタンブロット分析の結果と一致する。図１９Ｃおよび図１９Ｅで観察されるように、対照の抗トキシンＢ ｍＡｂ ＣＤＢ−１は、ｍＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−４１のものとは異なるエピトープでトキシンＢに結合する。

【0262】

Ｂ．クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡの抗体結合ドメインマッピング
全長クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡは、分子量が３１０ｋＤａ（図２０Ａ）で、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）活性を有するＮ末端酵素処理ドメイン（約６３ｋＤａ）と、疎水性ドメイン（約１４４ｋＤａ）の片側にあるＣ末端ＣＲＢドメイン（約１０１ｋＤａ）の３つの主要ドメインを含有する。

【0263】

酵素エンテロキナーゼ（ＥＫ）を用いて、全長トキシンを酵素的に切断していくつかのトキシンＡ断片を作製した。２５℃で４８時間のエンテロキナーゼ（酵素／トキシン比：約３ｍＵ／μｇトキシン）でのトキシンＡの処理後、４つのＣ末端断片（約２２３ｋＤａ、約１５８〜１６０ｋＤａ、約９１ｋＤａ、約６８ｋＤａ）と３つのＮ末端断片（約１９５ｋＤａ、約１８１ｋＤａ、約１２７ｋＤａ）を含む９つの主要な断片を作製した。これよりも小さな断片（約５３および約４２ｋＤａ）も観察された。（図２０Ｂおよび図２０Ｃ）。

【0264】

未処理またはエンテロキナーゼで処理したトキシンＡでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を実施した（図２１Ａ〜図２１Ｃ）。全長トキシンＡおよびその断片（分子量約２２３ｋＤａ、約１５８〜１６０ｋＤａ、約９１ｋＤａ、約６８ｋＤａ）は、ｍＡｂ ＰＡ−５０に認識された（図２１Ｂ）。Ｎ末端シーケンシングによって、６８ｋＤａの断片がＣ末端受容体結合（ＣＲＢ）ドメインの一部を含むことが確認された。ｍＡｂ ＰＡ−５０の結合パターンから、ｍＡｂがトキシンＡの断片を含むＣ末端に結合することが示唆される。総合すれば、これらの結果から、ｍＡｂ ＰＡ−５０がトキシンＡのＣ末端受容体結合エピトープに結合することがわかる。ｍＡｂ ＰＡ−３９は、Ｃ末端含有断片（約２２３および約１５８〜１６０ｋＤａ）ならびに約１８１ｋＤａのＮ末端含有断片（図２１Ｃ）に結合したことから、ｍＡｂ ＰＡ−３９が、トキシンＡの受容体結合ドメイン外の領域のエピトープに結合することがわかる。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを使用して、ｍＡｂ ＰＡ−５０およびトキシンＡの相互作用研究で複数の結合部位（少なくとも２つの結合部位）を同定した（図２２Ａ−１）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いる比較研究では、固定化したマウスＰＡ−５０がトキシンＡに親和性０．１６ｎＭで特異的に結合した。また、マウスｍＡｂ ＰＡ−５０によってセンサーチップにキャプチャーされた後、トキシンＡは、さらにＰＡ−５０に結合でき、その後、対照の抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＡ−１（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号パンフレット）にも結合する（図２２Ａ−２）ことが見出された。また、Ｂｉａｃｏｒｅチップで対照の抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＡ−１にキャプチャーされたトキシンＡは、別のＣＤＡ−１およびＰＡ−５０ ｍＡｂにさらに結合したことから、対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１がトキシンＡの複数の繰り返しに結合することがわかり、これらはトキシンＡのＰＡ−５０ ｍＡｂ結合エピトープとは異なる（図２２Ｂ）。このように、これらの結果から判断すると、トキシンＡには複数のコピーでＰＡ−５０ ｍＡｂエピトープが存在し、ＣＤＡ−１のエピトープとは重ならない。さらに、ＰＡ−３９ ｍＡｂは、対照のＣＤＡ−１ ｍＡｂが結合したトキシンＡエピトープとは異なるトキシンＡのエピトープに結合した（図２２Ｃ）。ＭＡｂ ＰＡ−３９およびＰＡ−５０は、トキシンＡ上の異なるエピトープに結合することがわかった（図２２Ｄ）。ウェスタンブロット分析では、ＰＡ−３９および対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１がＥＫ処理トキシンＡとは異なる結合パターンを有するため、トキシンＡに異なる結合ドメインおよび異なるエピトープがあることが示された（図２２Ｅ）。ウェスタンブロット分析では、ＰＡ−５０および対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１がＥＫ処理トキシンＡと同一ドメイン（図２２Ｆ）であるが、異なるエピトープに（図２２Ｂ）結合することが示された。

【0265】

この実施例のＡおよびＢで説明したように、マウスｍＡｂ ＰＡ−５０およびＰＡ−４１の結合部位は、トキシンの限られたタンパク質分解に続くウェスタンブロットで、トキシンの特異的な領域に局在していた。マウスｍＡｂ ＰＡ−５０は全長トキシンＡといくつかのエンテロキナーゼ切断産物を認識したことから、大きな２２３ｋＤａの断片と、大きさが６８ｋＤａ、９１ｋＤａ、１６０ｋＤａのカルボキシ末端断片がある（図２２Ｆ）ことがわかる。Ｎ末端シーケンシングによって、６８ｋＤａの断片がトキシンＡのカルボキシ末端ドメインに対応していることを確認した。ＣＤＡ−１対照のｍＡｂによって同一の断片が認識された。マウスｍＡｂ ＰＡ−４１は、全長トキシンＢならびに、カスパーゼ１消化によって生成された６３ｋＤａと１０３ｋＤａのアミノ末端断片に結合し（図１８Ｂ）、かたやＣＤＢ−１対照のｍＡｂは、異なる組のカスパーゼ１切断産物を認識した。Ｎ末端シーケンシングによって、６３ｋＤａの断片がトキシンＢのアミノ末端ドメインに対応していることを確認した。まとめると、データは、ｍＰＡ−５０がトキシンＡの受容体結合ドメイン内の複数の部位に結合し、ｍＰＡ−４１がトキシンＢの酵素ドメイン内の単一部位に結合することを示している。

【0266】

実施例７
抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢ ｍＡｂ−作用機序の研究
Ａ．作用機序研究に用いられるＩｎ ｖｉｔｒｏでの細胞ベースのアッセイ
抗トキシンｍＡｂの作用機序を評価するために、異なる濃度のトキシンＡまたはトキシンＢを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイを実施した。これらのアッセイでは、先の実施例３で説明したようにして、ＣＨＯ−Ｋ１またはＴ−８４細胞のいずれかを用いた。

【0267】

簡単に説明すると、ＣＨＯ−Ｋ１アッセイを用いて、抗トキシンＡおよび抗トキシンＢ ｍＡｂ（ＰＡ−３９およびＰＡ−４１）の中和効力を評価した。９６ウェルのプレートにＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種した（２，０００個／ウェル）。処理の前に４時間、細胞を付着させた。異なる濃度（６０、３０、１５または６ｎｇ／ｍＬ）のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシン（株ＶＰＩ １０４６３）を段階希釈ｍＡｂと一緒にインキュベートし、９６ウェルの丸底プレートで３７℃にて１時間混合した後、混合物を細胞培養プレートに加えた。７２時間のインキュベーション後、２０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅを加えた。混合物をさらに４時間インキュベートし、対照と比較した細胞生存率（％）を測定した。

【0268】

Ｔ−８４細胞毒性アッセイも使用して、抗トキシンＡ ｍＡｂの中和効力を評価し。Ｔ−８４細胞（ヒト結腸癌種細胞株）を９６ウェルのプレートに播種した（１５，０００個／ウェル）。処理の前に４時間、細胞を付着させた。異なる濃度（２４０、１２０、６０または３０ｎｇ／ｍＬ）のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシン（株ＶＰＩ １０４６３）を段階希釈ｍＡｂと一緒にインキュベートし、９６ウェルの丸底プレートで３７℃にて１時間混合した後、混合物を細胞培養プレートに加えた。７２時間のインキュベーション後、２０μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅを加えた。混合物をさらに４時間インキュベートし、対照と比較した細胞生存率（％）を測定した。

【0269】

Ｂ．抗トキシンＡ ｍＡｂがトキシンＡの細胞への内部移行を防止することを示すＥＬＩＳＡ
抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂの作用機序をさらに評価するために設計された実験で、各被検抗体（ＰＡ−３９、ＰＡ−５０、対照の抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＡ−１および抗トキシンＡヤギポリクローナル抗体対照）を混合し、そのＥＣ_９０値の１００倍でトキシンＡの高い細胞傷害性濃度で完全な中和を保証するようＶｅｒｏ細胞に対するトキシンＡのＣＣ_９０濃度で１時間インキュベートした。次に、混合物をＶｅｒｏ細胞と一緒に３７℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、固定し、透過処理した。被検抗体との結合と競合しない抗トキシンＡホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（ＰＡ−３８）を用いて、内部移行したトキシンＡに対するプローブとし、化学発光を用いて検出した（図３１Ｇ）。このアッセイでは、結合して細胞に内部移行したトキシンＡだけがプローブによって検出されるため、ＨＲＰ化学発光反応による化学発光シグナルが得られる。化学発光検出では、可視光の生成につながる過酸化物の存在下、酵素を用いてＨＲＰ酵素とその基質との間の反応を触媒する（すなわち、過酸化物によるルミノールの触媒酸化）。酸化したルミノールは、基底状態状態まで減衰する際に光を発する。基質がＨＲＰによって触媒されたら、ルミノメーター（Ａｎａｌｙｓｔ ＧＴ）で光シグナルを定量化する。

【0270】

Ｃ．中和活性およびＭＯＡ研究の結果
抗トキシンＡ ｍＡｂ
抗トキシンＡ抗体の中和活性および作用機序の評価に用いた細胞毒性アッセイでは、この実施例のセクションＡで説明したように、濃度を増しながら細胞にトキシンＡを加えた。抗トキシンＡ ｍＡｂ ＰＡ−３９、ＰＡ−５０および対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１によるトキシンＡの中和を評価したこれらの実験の結果を、図３１Ｂ〜図３１Ｄと以下の表Ａに示す。

【0271】

【表A】

【0272】

表Ａに示すデータから明らかなように、トキシン効力アッセイでのｍＡｂ ＰＡ−３９のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性には、培養に加えるトキシンＡの量を増やすと、ＥＣ_５０と最大阻害率の両方にシフトが認められることから、ＰＡ−３９での阻害の混合−競合的機序があることがわかる。１００倍過剰のＰＡ−３９で保護後のトキシンＡのＥＬＩＳＡ検出によって、トキシンの内部移行と細胞毒（ｃｙｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｎ）の作用を防止することで、ＰＡ−３９によるトキシンの阻害が起こることが確認された。トキシン効力アッセイでのｍＡｂ ＰＡ−５０のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性には、培養に加えるトキシンＡの量を増やすと、ＥＣ_５０のシフトが認められることから、ＰＡ−５０での阻害の競合的機序があることがわかる。１００倍過剰のＰＡ−５０で保護後のトキシンＡのＥＬＩＳＡ検出によって、トキシンの内部移行を防止することで、ＰＡ−５０によるトキシンの阻害が起こることが確認された。

【0273】

抗トキシンＢ ｍＡｂ
抗トキシンＢ抗体の中和効力および作用機序の評価に用いた細胞毒性アッセイでは、この実施例のセクションＡで説明したように、濃度を増しながら細胞にトキシンＢを加えた。抗トキシンＢ ｍＡｂ ＰＡ−４１および対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１によるトキシンＢの中和を評価した効力実験の結果を、図３１Ｅおよび図３１Ｆと以下の表Ｂに示す。表のデータからわかるように、トキシン効力アッセイでのＰＡ−４１のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性には、培養に加えるトキシンＢの量を増やすと、ＥＣ５０および最大阻害率の両方にシフトが認められることから、阻害ＰＡ−４１の混合−競合的機序があることがわかる。

【0274】

【表B】

【0275】

この実施例での上述したアッセイに基づいて、単に阻害因子の濃度を増すだけで、トキシンＡまたはトキシンＢの濃度が増しても完全に中和できる阻害因子は、抗体の結合数が増えてより高い濃度のトキシンを中和する際にＥＣ_５０のシフトが生じるため、競合的阻害因子であると考えられる。トキシンの濃度が増すと毒性作用に抗せない阻害因子は、阻害因子の濃度を増しても最大効果率が低くなるが、ＥＣ_５０にシフトは認められず、非競合的阻害因子であると考えられる。さらに、トキシンの濃度が高くなって阻害因子の濃度が増えた結果として、ＥＣ_５０のシフトと最大効果率の低下の両方が起こる阻害因子は、混合−競合的阻害因子であると考えられる。いくらかは、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）アッセイでの作用機序の評価は、アッセイの反復性と、阻害因子のない対照ウェルで観察されるバックグラウンドでの細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）に伴う誤差を考慮して実施しなければならない。これは、最大阻害率の平坦域に影響する。結果として、トキシン濃度を高めると、これらの作用がゆえにＥＣ_５０値のわずかに右よりのシフトが観察されることがある。

【0276】

上記によれば、トキシンＡの中和およびＭＯＡについて、ＰＡ−３９細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）曲線（図３１Ｂ）でＥＣ_５０のシフトが観察され、平坦域が低くなることならびに、表Ａで算出した最大効果率の低下から、ＰＡ−３９ ｍＡｂを混合−競合的阻害因子とみなす。これらのデータは、高濃度のＰＡ−３９での細胞傷害作用の度合いを示すＥＬＩＳＡでの結果（図３１Ｈ）で裏付けられ、ＰＡ−３９のＭＯＡの少なくともいくらかが細胞内で起こることがわかる。ＰＡ−５０ ｍＡｂは、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）アッセイ曲線（図３１Ｃ）に見られるＥＣ_５０値の右側へのシフトから、さらには最大阻害率の最小変化を示す表Ａに示すデータによって、競合的阻害因子として観察される。これらのデータは、高濃度のＰＡ−５０でのトキシンＡ結合と内部移行の完全な阻害を示すＥＬＩＳＡでの結果（図３１Ｈ）で裏付けられる。

【0277】

図３１Ｄからわかるように、対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１は、トキシンを増やすとＥＣ_５０に最小のシフトが認められるが、最大効果率がかなり低下する。図３１Ｄに示す結果を、表Ａのデータと一緒に考慮すると、ＣＤＡ−１対照のｍＡｂは、非競合的作用機序を示す。なぜなら、その活性がすべて細胞外で観察されるからである。トキシン結合の立体障害および細胞内部移行は、図３１Ｄにおけるデータプロットを生む原因になりやすく、ＣＤＡ−１対照のｍＡｂの非競合的ＭＯＡを裏付けている。

【0278】

トキシンＢの中和およびＭＯＡについての上記に従って、ＰＡ−４１ ｍＡｂは、ＥＣ_５０値の右方向へのシフトと、図３１Ｅおよび表Ｂのデータの両方に見られる最大作用率の低下から、混合−競合的作用機序を呈するものとみなされる。

【0279】

ｍＡｂ ＰＡ−４１で観察される結果は、最大効果率が下がるがＥＣ_５０シフトの度合いの少ない対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１で観察される結果とは対照的である。この場合、トキシンＢに対する対照のｍＡｂの活性の作用機序は、特に上述した誤差を考慮するとあまりはっきりしない。

【0280】

実施例８
高病原性分離株または株を含むクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）分離株または株のパネルに対する本発明のｍＡｂの試験
本発明のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗トキシンＡおよび抗Ｂ ｍＡｂが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の広い範囲にわたる関連分離株からのトキシンを中和する機能を評価するために、高病原性ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７分離株を含む２０の毒素産生性臨床クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）分離株または株の集合に対してｍＡｂの中和活性を試験した。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、トキシンＡおよびＢをコードする遺伝子においてかなりの株間異種性を呈するため、標記のｍＡｂ、特にｍＡｂ ＰＡ−５０およびＰＡ−４１によるトキシン中和の幅を判断するためにこれらの研究を実施した。

【0281】

地理的および遺伝的な多様性を得るために、ＴｅｃｈＬａｂ（Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）に維持されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）分離株または株の国際コレクションから、毒素タイプ、リボタイプおよび制限エンドヌクレアーゼ分析から、毒素産生性の臨床クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）分離株（表６）のパネルを選択した。

【0282】

表６で分類したように、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の株は３つの参考株（ＶＰＩ １０４６３（ＡＴＣＣ ４３２５５）、６３０（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１３８２）および５４５（ＡＴＣＣ ４３５９６）、６つの病院由来のＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株（ＣＣＬ６７８、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ４５、ＣＤ１９６、５、７．１）、２つのトキシンＡ−／トキシンＢ＋（ｔｃｄＡ−ｔｃｄＢ＋）株（Ｆ１４７０、８８６４）、３つの外来患者分離株（ＭＨ５、ＣＣＬ１３８２０およびＣＣＬ１４４０２）、他の臨床上、頻繁に分離される菌株（Ｐｉｔｔ２、ＣＣＬ１４１３７、ＵＶＡ１７、ＵＶＡ３０／ＴＬ４２、Ｐｉｔｔ１０２、Ｐｉｔｔ７）を含む。また、分離株１３（ＣＣＬ１３８２０）および１９（Ｐｉｔｔ １０２）は、それぞれ表６の「外来患者分離株」と「臨床上、頻繁に分離される菌株（リボタイプ０２７以外）」に分類されるが、ｔｏｘＡ−／ｔｏｘＢ＋株でもある。これらのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンを含む培養上清をＴｅｃｈＬａｂで作製し、滅菌濾過し、４℃で保管した。培養上清におけるトキシンの存在を、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシン／抗トキシンキット（ＴｅｃｈＬａｂ）および細胞毒性アッセイを用いて確認した。

【0283】

ＣＨＯ−Ｋ１細胞（培養上清のトキシンＢ活性の判断に使用）およびＴ−８４細胞（培養上清のトキシンＡ活性の判断に使用）に対する各トキシン含有培養上清の細胞傷害活性を、滴定済みの培養上清で細胞を処理して評価した。

【0284】

【表6】

【0285】

本発明のｍＡｂの中和活性を試験するために、トキシン含有培養上清を細胞生存度の≧９５％喪失につながる最大希釈で用いた。トキシン上清をさまざまな濃度のｍＡｂと１時間予備混合した後、細胞に加えて３７℃で７２時間インキュベーションした。Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存度を測定した。処理したウェルの生存率を未処理の対照ウェルでの生存率と比較し、グラフにしてｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和活性（ＥＣ_５０）を算出した。最初の一連の実験では、図２３Ａは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いてトキシン含有上清を中和する際のｍＡｂ ＰＡ−４１の活性を示す。ＰＡ−４１は、３種類のトキシンＡ−／トキシンＢ＋株だけが例外で、あとはすべての高病原性株を含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のすべての毒素産生性株の上清を強力に（ＥＣ_５０範囲１．１^−１１Ｍから６．５^−１０Ｍ）中和する。従来のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株由来のトキシンＡ−／トキシンＢ＋の酵素ドメインには有意な配列差があることが報告されている。ＰＡ−４１はトキシンＢの酵素ドメインに結合することから、このドメインの配列の多様性で、２つのトキシンＡ−／トキシンＢ＋株由来のトキシンＢに対するＰＡ−４１の中和活性がそれほど効果的ではないことを説明できる。

【0286】

ＣＨＯ−Ｋ１細胞株におけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｉｃｌｅ）の高病原性株に対するｈＰＡ−４１および対照のヒト抗トキシンＢ ｍＡｂ ＣＤＢ−１（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）の両方の活性を評価するための実験を実施した。これらの研究では、ｈＰＡ−４１が６つのＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株すべての上清に対して有意な中和活性を示し、かたや対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１は最小の活性を示す（図２３Ｂ）ことが観察された。また、これらの研究では、ｈＰＡ−４１ ｍＡｂの中和活性が、ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株の毒性を中和するにあたって、対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１よりも＞１，０００倍高いようにみえる。２つの参考株（ＶＰＩ １０４６３およびＡＴＣＣ ４３５９６）および６つのＢＩ／０２７／０２７株（ＣＣＬ６７８、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ ４５、ＣＤ１９６、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ５．１およびＭｏｎｔｒｅａｌ ７．１）に対するｈＰＡ−４１およびＣＤＢ−１対照のｍＡｂの中和活性を、図２３Ｂに示す。これらの研究で、ｈＰＡ−４１が、トキシンＡ−／Ｂ＋である３種類のリボタイプ０１７分離株（表６）に対して不活性であるが、ｈＰＡ−４１抗トキシンＢ ｍＡｂは対照のｍＡｂよりもパネルの他の株に対して有意に高い中和活性を呈することがわかった。

【0287】

Ｔ−８４細胞を用いるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養のトキシンＡ含有上清を中和する際のｍＡｂ ＰＡ−５０の活性は、図２４Ａに示すように、２．６^−１２Ｍから７．７^−１１Ｍの範囲であった。ＰＡ−５０は、高病原性株を含めて、トキシンＡを産生する入手可能なすべての株の上清を完全に中和した。ＰＡ−５０は、４つのトキシンＡ−／トキシンＢ＋株（Ｆ１４７０、８８６４、ＣＣＬ １３８２０、ＣＣＬ １４４０２）を中和しなかった。これらの株は、トキシンＡをまったく産生しないためである。また、ｈＰＡ−５０も、パネルにおける残りの株の活性を中和する際に、有意に一層効果的であった。他の比較研究で、トキシンＡ産生クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の６つのＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株すべてに対するｈＰＡ−５０の中和活性は、対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）の場合よりも＞１００倍大きい（図２４Ｂ）ことが見出された。ｈＰＡ−５０も、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡ産生参考株ＶＰＩ １０４６３および５４５に対して対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１より高い中和活性を呈した。同様に、ｍＡｂ ＰＡ−３９は、（図２５Ａ）に示すように、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養の上清のトキシンＡを、ＥＣ_５０値７．７^−１２Ｍから４．８^−８Ｍの範囲で中和した。ｍＡｂ ＰＡ−５０からわかるように、４つのトキシンＡ−／トキシンＢ＋株は、ＰＡ−３９では中和されない。さらに、比較研究の結果は、６つのＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株すべてに対するｍＡｂ ＰＡ−３９の中和活性が、対照のヒト抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＡ−１の場合よりも＞１００倍大きく、ＰＡ−３９もパネルの残りの株に対する中和活性が有意に大きい（図２５Ｂ）ことを示していた。１つのトキシン株すなわちＣＣＬ １４４０２では、アッセイでｍＡｂ中和活性の正確な測定ができるほどＴ−８４細胞の生存度が十分には落ちなかった点に注意されたい。

【0288】

これらの研究では、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ｈＰＡ−４１が、６つのＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株すべての上清に対して高いレベルの中和活性を示し、かたや対照の ｍＡｂ ＣＤＢ−１は最小の活性を示した。ヒト化ＰＡ−４１は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の高病原性ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株を中和するにあたって、対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１よりも中和活性が＞１，０００倍高いように見えた。これらの研究における、２つの参考株（ＶＰＩ １０４６３およびＡＴＣＣ ４３５９６）および６つのＢＩ／０２７／０２７株（ＣＣＬ６７８、ＨＭＣ５５３、Ｐｉｔｔ ４５、ＣＤ１９６、Ｍｏｎｔｒｅａｌ ５．１およびＭｏｎｔｒｅａｌ ７．１）に対するｈＰＡ−４１およびＣＤＢ−１の中和活性を、図２３Ｂに示す。同様に、ｈＰＡ−４１は、これらの研究で、パネルの他の株に対して対照のｍＡｂ ＣＤＢ−１よりも有意に高い中和活性を示し、トキシンＡ−／Ｂ＋の３つのリボタイプ０１７分離株が例外であった。同様の実験を実施して、Ｔ−８４細胞でのｈＰＡ−３９および対照のヒト抗トキシンＡ ｍＡｂ ＣＤＡ−１の中和活性を評価した。結果は、ｈＰＡ−３９による６つのＢＩ／ＮＡＰ１／０２７株すべての中和が、対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１の場合よりも＞１００倍高いことを示していた（図２５Ｂ）。ヒト化ＰＡ−３９は、研究で、パネルの残りの株に対して対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１よりも有意に高い中和活性を示した。このように、ｈＰＡ−４１およびｈＰＡ−３９ ｍＡｂは、試験したすべての株に対して高いレベルの抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）高病原性株中和活性を有する。これは、これらのヒト化ｍＡｂによって認識されるエピトープが、多種多様な株で高度に保存されることを示す。

【0289】

表６と同様に、表７も上述したｉｎ ｖｉｔｒｏでのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシン中和実験の結果を示し、北米および欧州から単離された毒素産生性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株のパネルと、ヒト化抗トキシンｍＡｂおよび対照のｍＡｂ ＣＤＡ−１およびＣＤＢ−１によって生成されるＥＣ_５０値を示している。パネルは、リボタイプ００１、００２、００３、０１２、０１４、０１７、０２７、０７８を、臨床的に観察されるレートに比例する適切な比率で含み（９４、９５）、パネルに過剰に現れたリボタイプ０１７ ｔｃｄＡ⁻ｔｃｄＢ^＋株が例外である。ｔｃｄＡ⁻ｔｃｄＢ^＋株由来の上清をツールとして使用して、トキシンＢ単独で含む上清によって難治性から死亡までの細胞を同定した。これは、トキシンＡに媒介される細胞毒性を調べるのに適していた。ＶＰＩ １０４６３をパネルに含め、得られた精製トキシンと未精製のトキシンで結果を比較できるようにした。

【0290】

これらの研究で、ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−５０は、トキシンＡを株非依存的に中和した。中央ＥＣ_５０値は３２ｐＭ（範囲：２０〜１２７ｐＭ、表７）で、急唆な用量反応曲線が観察され、ヒル勾配は通常、２より大きい（図２５Ｃ）。ＰＡ−５０は、各被検分離株に対してＣＤＡ１よりも活性が高い。効力の差が最も大きいのは、高病原性０２７株で観察されており、これに対してＰＡ−５０ならびにパネルに含まれているリボタイプ０７８株は、ＣＤＡ１（Ｐ＝０．０００２）よりも約１，０００倍強かった。

【0291】

ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−４１は、ｔｃｄＡ^＋ｔｃｄＢ^＋株各々を強力に阻害し、中央値ＥＣ_５０値は２３ｐＭ（範囲：７．７〜１２９ｐＭ、表７）であり、基本的に高い濃度での完全な中和が観察される（図２５Ｄ）。ＰＡ−４１は通常、ｔｃｄＡ^＋ｔｃｄＢ^＋株に対してＣＤＢ１よりも効果的であり、高病原性０２７株に対して約５００倍強い（Ｐ＝０．００３）。ＣＤＢ１は、リボタイプ０１７ ｔｃｄＡ⁻ｔｃｄＢ^＋株からのトキシンＢを中和する際に効果的であるが、ＰＡ−４１はそうでもない。最後に、ＰＡ−４１およびＰＡ−５０は、トキシンの粗形態および精製形態で、参考株ＶＰＩ １０４６３（表７および図２５Ｃおよび２５Ｄ）から同様の活性を呈した。

【0292】

【表7】

【0293】

この実施例で示すように、ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−５０およびＰＡ−４１は、現在のＣＤＩ伝染病を代表する遺伝的に多種多様な株のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびＢに対して、高いレベルの中和活性を示した。これらのｍＡｂの活性の幅は、トキシン内の遺伝子型および表現型のばらつきに関して顕著である。特に、ＰＡ−５０およびＰＡ−４１は、ピコモル活性で高病原性の抗生剤耐性０２７株によって産生されたトキシンを中和し、かたや対照のｍＡｂは、ナノモル活性を持つことが観察された。この結果は、過去に報告があるように、０２７株のトキシンＡに対するＣＤＡ−１の結合の低減に反映されることがある（９０）。０２７株由来のトキシンＢは他のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株に比して、顕著な配列の相違を呈する。配列差はカルボキシ末端受容体結合ドメインに集中し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性の増加に関連している。しかしながら、このような配列の相違は、ＰＡ−４１の中和活性に影響しない。これは、トキシンＢのアミノ末端ドメイン内のエピトープに結合する。ＰＡ−５０およびＰＡ−４１は、ピコモル力価のパネルで、６つの０２７株すべてを中和し、これには最近０２７罹患率のリスクがあがっている株ＣＤ１９６も含む。全体としての所見から、ＰＡ−５０およびＰＡ−４１のエピトープが、０２７の結合によって広く保存されることがわかる。

【0294】

ＣＤＩは一般に、トキシンＡおよびＢの両方を産生するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の株によって引き起こされる。しかしながら、ｔｃｄＡ⁻ｔｃｄＢ^＋株も、この疾患に結び付いている。臨床的に関連したｔｃｄＡ⁻ｔｃｄＢ^＋株は、優先的にリボタイプ０１７である。リボタイプ０１７株は、ハムスターで病原性を低下させ、アミノ末端領域がＶＰＩ １０４６３からのｔｃｄＢとクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの致死的なトキシン（ｔｃｓＬ）の両方に対して７０〜８０％配列相同性である非定型のｔｃｄＢをコードすることが報告されている。表現型では、リボタイプ０１７ｔｃｄＢは、ハイブリッドの特徴を有し、一般的なｔｃｄＢおよびｔｃｓＬトキシンの受容体結合特性とグリコシル化特異性を呈する。０１７ ｔｃｄＢの非定型のアミノ末端領域は、なぜ、研究ではＰＡ−４１によってトキシンが中和されなかったのかを説明となろう。０１７の株が地域に広く流行し、ＣＤＩの局所的な流行を引き起こしたが、全体としては、ＣＤＩを治療するための調査的な治療法の最近の国際的なフェーズ３の臨床研究で遭遇した、株の＜２％を含むと判断された（９４、９５）。

【0295】

実施例９
キメラｍＡｂの生成
親マウスｍＡｂの可変領域とヒトＩｇＧ１の定常領域とを含むキメラモノクローナル抗体を作製してキャラクタライズした。正しい抗トキシン活性と結合特異性を有するマウス可変領域をクローニングし、ヒト定常領域でのマウス可変領域の構築によって各クローンｍＡｂの結合特性および中和特性が有意に変化することはないことを保証するために、キメラｍＡｂを作製した。キメラｍＡｂは一般に、親マウスｍＡｂと同一の結合活性を呈する。

【0296】

ＭＡｂ ＰＡ−３８、ＰＡ−３９、ＰＡ−４１およびＰＡ−５０はいずれも、κ軽鎖を含む。キメラｍＡｂを作製するために、重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸配列を、ｐＣＯＮγ１およびｐＣＯＮκ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ， ＵＫ）などであるがこれに限定されるものではない好適な発現ベクターに挿入した。好適なプラスミドが、ヒトκ軽鎖の定常領域またはヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域をコードする。キメラｍＡｂを作製するために、各ｍＡｂの重鎖の可変領域をｐＣＯＮγ１プラスミドにクローニングした。完全重鎖遺伝子を、軽鎖遺伝子を含むプラスミドにサブクローニングし、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をコードする単一のプラスミドを作製した。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、製造業者が提案したプロトコールで、２９３Ｆ細胞をこの発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。分泌されたキメラｍＡｂを含有する細胞上清を、トランスフェクションの７日後に回収し、プロテインＡクロマトグラフィを用いて精製した。細胞毒性および血球凝集アッセイで、キメラｍＡｂの力価および活性を、マウスｍＡｂの場合と比較した。

【0297】

上記の手順に基づいて、親のマウスＰＡ−３９およびＰＡ−４１ ｍＡｂからキメラｍＡｂ（ｃＰＡ−３９およびｃＰＡ−４１）を作製した。粗細胞上清でのこれらのキメラｍＡｂの濃度は、約２〜１１μｇ／ｍＬの範囲であった。特に、ｃＰＡ−３９を産生するトランスフェクトした２９３Ｆ細胞培養由来の粗上清には、１０．６μｇ／ｍＬのキメラｍＡｂが含まれていたのに対し、ｃＰＡ−４１を産生するいくつかのトランスフェクトした２９３Ｆ細胞培養由来の粗上清は、９．６〜１０．９μｇ／ｍＬのキメラｍＡｂを含有していた。

【0298】

上述したような（実施例３）細胞毒性アッセイ（ｃＰＡ−３９：ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ｃＰＡ−４１：ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびｃＰＡ−５０：Ｔ−８４細胞）を実施して、キメラｍＡｂを、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの中和能について、それぞれの親のマウスｍＡｂと比較した。図２６（ＰＡ−４１）、図２７（ＰＡ−３９）、図２８（ＰＡ−５０）に示すように、それぞれのマウス親ｍＡｂと比較すると、すべてのキメラｍＡｂが、等しく効果的であることがわかった。これらの結果は、キメラ化と、親のマウスｍＡｂに相当するトキシン中和力価を持つ機能的キメラｍＡｂの産生の成功を示している。

【0299】

実施例１０
マウスｍＡｂのヒト化とトキシン中和効力についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のヒト化ｍＡｂの試験
従来技術において周知の方法で、ヒト化ｍＡｂを作製した。さまざまなヒト化ｍＡｂの例と説明が、たとえば、Ｚｅｎａｐａｘ（６５，６６）、Ｓｙｎａｇｉｓ（６７〜６９）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（７０〜７２）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（７３、７４）、Ｘｏｌａｉｒ（７５〜７７）、Ｒａｐｔｉｖａ（７８〜８０）、Ａｖａｓｔｉｎ（８１、８２）、Ｔｙｓａｂｒｉ（８３）に含まれている。ヒトのｍＡｂ活性が悪影響をおよぼさないようにして、免疫原を最小限にするのに効果的なヒト化モノクローナル抗体を作製可能である（８４〜８７）。好ましくは、ヒト化ｍＡｂは、親マウスｍＡｂの２倍以内のトキシン中和活性を示す。さらに、ヒト化ｍＡｂは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症のハムスターモデルで強力な有効性を最適に示す。

【0300】

相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティングの確立された方法を使用して、本明細書で説明するようなマウス抗トキシンＡおよび／または抗トキシンＢ ｍＡｂのヒト化形態を作製した。トキシン中和活性について、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ヒト化ｍＡｂを親マウスｍＡｂと比較した。本発明によれば、ヒト化ｍＡｂは、親マウスｍＡｂの抗トキシン活性を保持でき、ヒトでの繰り返し投与に適したものとなり得る。

【0301】

Ａ．マウスｍＡｂの重鎖および軽鎖遺伝子の分子クローニング
確立された方法を使用して、抗体遺伝子をクローニングした。（８８）簡単に説明すると、１×１０^７ハイブリドーマ細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者が提案したプロトコールに従って全ＲＮＡを精製した。オリゴ−ｄＴプライマーを使うＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、５μｇの全ＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡをＲＮＡｓｅ Ｈで処理してＲＮＡテンプレートを除去し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてこれを精製して、遊離ヌクレオチドおよびプライマーを除去した。次に、製造業者が提案したプロトコールに従って、ｄＧＴＰの存在下、酵素末端トランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、グアニジンヌクレオチドの尾をｃＤＮＡの３’末端に加えた。得られた尾状のｃＤＮＡを、重鎖または軽鎖の定常領域にアニールした１つのプライマーと、ｃＤＮＡのグアノシン尾にアニールした１つのユニバーサルプライマーとを用いて、ＰＣＲ処理した。重鎖および軽鎖の両方に、ユニバーサルプライマー５’ＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ３’配列番号１１を用いた。軽鎖を増幅するために、プライマー５’ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ３’（配列番号１２）を用いた。また、重鎖についてはプライマー５’ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ（ＣＡＴ）ＧＡＴＧＧＧＧ（ＧＣ）ＴＧＴ（ＴＣ）ＧＴＴＴＴＧＧＣ３’（配列番号１３）を用いて増幅した。ここで、括弧内の配列は、塩基の縮重を示す。得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、配列決定した。ＰＣＲ反応を実施し、三重に配列決定して、約５００塩基対のＤＮＡ断片の増幅時に誤差が含まれないようにした。

【0302】

Ｂ．ｍＡｂ可変領域のヒト化
ヒト化ｍＡｂの配列を作製するために、ＣＤＲ構造に重要なフレームワークアミノ酸残基を、まず同定した。並行して、マウスＶ_ＨおよびＶ_Ｌとそれぞれ高い相同性を有するヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を既知のヒト免疫グロブリン配列から選択した。マウスｍＡｂのＣＤＲ配列を、必要であればＣＤＲの構造を維持するのに重要なフレームワークアミノ酸残基と一緒に、選択したヒトフレームワーク配列にグラフトした。また、得られるヒト化ｍＡｂの潜在的な免疫原を抑えるために、対応するＶ領域サブグループで非定型であることが見出されるヒトフレームワークアミノ酸残基を、一般的な残基で置換した。これらのヒト化Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域をｐＣＯＮγ１およびｐＣＯＮκ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ， ＵＫ）などであるが是に限定されるものではない発現ベクターに、それぞれクローニングした。これらのベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域をコードする。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅシステム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を使用して、２９３Ｆ細胞を一過的にこれらの発現ベクターでトランスフェクトした。分泌されたヒト化ｍＡｂを含む細胞上清をトランスフェクションの７日後に回収し、プロテインＡクロマトグラフィを用いて精製した。

【0303】

Ｃ．ヒト化ｍＡｂを発現している安定したクローンＣＨＯ細胞の作製
安定したＣＨＯ細胞／細胞株を作製することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞アッセイと、ゴールデンＳｙｒｉａｎハムスターのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢症（ＣＤＡＤ）モデルの両方で試験するだけの十分な量のｍＡｂを産生できるようになる。一例として、安定したトランスフェクトＣＨＯ細胞を作製するためのグルタミンシンテターゼ選択および増幅システム（ＧＳ）を用いて、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）由来のＣＨＯ Ｋ１ ＳＶ細胞を使用することが可能である。Ｌｏｎｚａ ＧＳシステムでは一般に、相当に大量のヒト化ｍＡｂを産生可能なＣＨＯ細胞株を高産生率で得られる。

【0304】

ＣＨＯ Ｋ１ ＳＶ細胞を、１×グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１×Ｈ／Ｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＣＤ ＣＨＯ細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増やした。１×１０^７個の生存可能な細胞を、２９０Ｖ、無限抵抗、９６０ｕＦでで電気穿孔し、４０μｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μｌの滅菌ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。完全ＣＤ ＣＨＯ培地５０ｍｌの入ったＴ−１５０フラスコに細胞を移し、３７℃、８．０％ＣＯ_２下、約４８時間インキュベートした。細胞を遠心処理し、１００μＭでのＭＳＸ（Ｓｉｇｍａ）の入ったＧＳ選択培地（ＣＤ ＣＨＯ＋１Ｘ ＧＳ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１Ｘ Ｈ／Ｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）に再懸濁させて最終密度を３．３×１０^５個／ｍｌとし、生存可能な細胞５０００個／ウェルで９６ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、一次細胞コロニー（トランスフェクトした細胞のクローン）が見え始めるまで約３〜４週間インキュベートした。２０μｌの上清を慎重に除去して約３００の細胞コロニー（クローン）を組換えｍＡｂ作製用にサンプリングし、９６ウェルフォーマットでＥＬＩＳＡアッセイを実施した。簡単に説明すると、９６ウェルのプレートにキャプチャー抗体（ヤギ抗−ヒト抗体）をコートした後、クローンＣＨＯトランスフェクタント（１：８００に希釈）由来の上清を加えて、プレートウェルに結合したキャプチャー抗体の結合を可能にした。洗浄後、二次抗体（アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗−ヒト抗体）をプレートに加え、試料のヒト抗体に結合させた上で、洗浄して非特異的な結合を除去した。その後、１ステップＰＮＰＰキット（Ｔｈｅｒｍｏ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いてアルカリホスファターゼ活性についてプレートをアッセイし、分泌抗体が最大量になるクローンを同定した。ｍＡｂの産生量が多いクローンを、１×グルタミンおよび１×Ｈ／Ｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを加えたＣＤ ＣＨＯ細胞培地で増やした。分泌されたヒト化ｍＡｂを含む細胞上清を回収し、プロテインＡを用いて精製した。産生率が最も高いクローンを限界希釈によってサブクローニングし、スケールアップしてグラム量の組換えヒト化モノクローナル抗体を得た。

【0305】

Ｄ．ヒト化ｍＡｂ ｈＰＡ−３９、ｈＰＡ−４１、ｈＰＡ−５０
分子クローニングしたヒト化ｍＡｂを上述したように単離し、キャラクタライズした（以下のセクションＥを参照のこと）。各ヒト化抗体の軽（Ｌ）鎖定常領域（ＣＬ）がカッパ（κ）クラスのものであり、各ヒト化抗体の重（Ｈ）鎖定常領域（ＣＨ）はＩｇＧ１アイソタイプのものである。独特の可変（Ｖ）領域を含むヒト化ｍＡｂが、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡまたはトキシンＢの活性を結合および中和することがあきらかになった。ヒト化ｍＡｂのＬ鎖およびＨ鎖のＶ領域は、一般にジスルフィド結合でリンクした２つのＨ鎖ポリペプチドと２つのＬ鎖ポリペプチドからなる完全免疫グロブリン（Ｉｇ）または抗体分子の一部をなすことがあり、あるいは、抗体の離散した一部または断片、特に、トキシンＡおよび／またはトキシンＢに結合および／またはトキシン活性を中和する抗体部分または断片のこともある。好適なＶ領域含有免疫グロブリン断片または部分の非限定的な例として、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）断片またはＦ（ａｂ’）_２断片があげられる。

【0306】

ヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡおよびトキシンＢ ｍＡｂを上述した手順で作製した。ヒト化プロセスで、トキシンＡに結合し、感受性細胞でトキシンＡ活性を中和するいくつかの抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡヒト化ｍＡｂ（ｈｍＡｂ）を作製した。このようなｈｍＡｂの例として、配列番号１で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３２Ａ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号３で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド配列（図３３Ａ）、ヒトκＣ領域を含むヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂ；配列番号２で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３２Ｂ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号３で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド配列（図３３Ａ）、ヒトκＣ領域を含む抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｈｍＡｂ；配列番号１で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３２Ａ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号４で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド（図３３Ｂ）、ヒトκＣ領域を含む抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｈｍＡｂ；および配列番号２で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３２Ｂ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号４で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド配列（図３３Ｂ）、ヒトκＣ領域を含む抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｈｍＡｂがあげられる。このようなヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、本発明のＰＡ−３９ ｈｍＡｂ（ｈＰＡ−３９）を包含する。２つのＬ鎖と２つのＨ鎖を有する完全ｈＰＡ−３９免疫グロブリンを、本発明のＶＨ領域（たとえば、配列番号１；配列番号２）と、たとえば、ＩｇＧ１アイソタイプの好適なＣＨ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＷ＿００１８３８１２１に含まれるものなど）とからなるｈＰＡ−３９ Ｈ鎖ポリペプチドと、本発明のｈＰＡ−３９ ＶＬ領域（たとえば、配列番号３；配列番号４）と、たとえば、κサブタイプの好適なＣＬ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＷ＿００１８３８７８５に含まれるものなど）とからなるｈＰＡ−３９のＬ鎖ポリペプチドとを同時発現し、分泌する宿主細胞で作製可能である。

【0307】

本発明のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂの他の例として、配列番号５で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３４Ａ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号７で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド配列（図３５）、ヒトκＣ領域を含むヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂ；および配列番号６で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３４Ｂ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号７で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド配列（図３５）、ヒトκＣ領域を含むヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂがあげられる。このようなヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｍＡｂは、本発明のヒト化ＰＡ−５０（ｈＰＡ−５０） ｍＡｂを包含する。２つのＬ鎖と２つのＨ鎖を有する完全ｈＰＡ−５０免疫グロブリンを、本発明のＶＨ領域（たとえば、配列番号５；配列番号６）と、たとえばＩｇＧ１アイソタイプの好適なＣＨ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＷ＿００１８３８１２１に含まれるものなど）とからなるｈＰＡ−５０Ｈ鎖ポリペプチドと、本発明のＶＬ領域（配列番号７）と、たとえばκサブタイプのＣＬ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＷ＿００１８３８７８５に含まれるものなど）とからなるｈＰＡ−５０のＬ鎖ポリペプチドとを同時発現して分泌する好適な宿主細胞で作製可能である。

【0308】

ヒト化プロセスでは、トキシンＢに結合し、感受性細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏにてトキシンＢ活性を中和する抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢヒト化ｍＡｂも得られた。このようなｈｍＡｂの例として、配列番号８で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３６Ａ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号１０で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド配列（図３７）、ヒトκＣ領域を含むヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ ｍＡｂ；配列番号９で示すＶＨ領域を含むＨ鎖ポリペプチド配列（図３６Ｂ）、ヒトＩｇＧ１のＣ領域、配列番号１０で示すＶＬ領域を含むＬ鎖ポリペプチド配列（図３７）、ヒトκＣ領域を含むヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ ｍＡｂがあげられる。このようなヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ ｍＡｂは、本発明のヒト化ＰＡ−４１（ｈＰＡ−４１） ｍＡｂを包含する。２つのＬ鎖と２つのＨ鎖を有する完全ｈＰＡ−４１免疫グロブリンを、本発明のｈＰＡ−４１ ＶＨ領域（たとえば、配列番号８；配列番号９）と、たとえばＩｇＧ１アイソタイプの好適なＣＨ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＷ＿００１８３８１２１で含まれるものなど）とからなるｈＰＡ−４１ Ｈ鎖ポリペプチドと、本発明のｈＰＡ−４１ ＶＬ領域（たとえば、配列番号１０）と、たとえばκサブタイプのＣＬ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＷ＿００１８３８７８５に含まれるものなど）とからなるｈＰＡ−４１のＬ鎖ポリペプチドとを同時発現して分泌する好適な宿主細胞で作製可能である。

【0309】

また、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンＡまたはトキシンＢに結合し、トキシン活性を中和するヒト化クローンｍＡｂ（ｈｍＡｂ）を作製した。抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｈｍＡｂ ＰＡ−５０が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む。配列番号１４で示すｈＰＡ−５０重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１５に示す（図３８Ｂ）。配列番号１６で示すｈＰＡ−５０軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１７に示す（図３８Ａ）。抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ ｈｍＡｂ ＰＡ−３９が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む。配列番号１８で示すｈＰＡ−３９重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号１９に示す（図３９Ｂ）。配列番号２０で示すｈＰＡ−３９軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２１に示す（図３９Ａ）。抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＢ ｈｍＡｂ ＰＡ−４１が、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、ＶＨ領域とヒトＣＨ領域とを含み、軽鎖が各々、ＶＬ領域とヒトＣＬ領域とを含む。配列番号２２で示すｈＰＡ−４１重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２３に示す（図４０Ｂ）。配列番号２４で示すｈＰＡ−４１軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列（またはｃＤＮＡ）を、配列番号２５に示す（図４０Ａ）。

【0310】

対照のｍＡｂとして使用するために、モノクローナル抗体ＣＤＡ−１およびＣＤＢ１（７、８９）を調製した。３Ｄ８および１２４（国際公開第２００６／１２１４２２号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２８７１５０号明細書）のＩｇ重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を合成し（ＤＮＡ２．０）、ベクターｐＣＯＮ−γ１およびｐＣＯＮ−κにクローニングした。全長ＩｇＧ１，κ ｍＡｂを、安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞で発現させ、上述したように精製した。ＢｉａｃｏｒｅによってトキシンＡおよびＢに対する結合親和性、トキシンによる細胞傷害作用の阻害、血球凝集について刊行物に記載のある方法（７）で試験すると、ＣＤＡ１およびＣＤＢ１調製物は想定レベルの活性を示した。

【0311】

Ｅ．ヒト化ｍＡｂのＩｎ Ｖｉｔｒｏキャラクタリゼーション
ｉｎ ｖｉｔｒｏにてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシンの中和実験を実施し、ヒト化ｍＡｂの機能的活性を親のマウスｍＡｂの機能的活性と比較した。図２９に示すように、ヒト化ＰＡ−４１（ｈＰＡ−４１）ｍＡｂは、ＥＣ_５０が９ｐＭであるマウスＰＡ−４１ ｍＡｂ（ｍＰＡ−４１）の場合と比較して、トキシンＢの細胞毒性を強力に中和した（ＥＣ_５０が６ｐＭ）。同様に、ｈＰＡ−３９には図３０、ｈＰＡ−５０には図３１に示すように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＴ−８４細胞を用いてマウス親ｍＡｂと比較すると、トキシンＡの中和にあたって、ヒト化ＰＡ−３９ ｍＡｂ（ｈＰＡ−３９）およびヒト化ＰＡ−５０ ｍＡｂ（ｈＰＡ−５０）は等しく強力であることが明らかになった。これらの結果から、親のマウスｍＡｂのヒト化に成功し、ヒト化ｍＡｂが機能的かつ効果的であることがわかる。

【0312】

これらの研究で試験した抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂのうち、ＰＡ−５０が顕著な用量反応中和曲線を示し、ヒル係数が２つより典型的に大きかったことから、協同的阻害があることがわかった。協同的相互作用は、実際には一般的であり、急唆な用量反応曲線とヒル係数＞１でキャラクタライズされることが多い。協同的活性を呈する医薬品は、ウイルス感染を治療する上での臨床活性の増大と関連していた。また、ＰＡ−５０は、必要になることが多いが協同には十分でない条件である多価的にトキシンＡに結合する。

【0313】

実施例１１
本発明のマウス抗トキシン ｍＡｂのＦａｂ断片の生成
Ａ．Ｆａｂ断片の調製物
マウスＩｇＧ１ ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）とキットに同梱されている試薬を用いて、製造業者の指示に従ってＦａｂ断片化を実施した。すべてのｍＡｂすなわちＰＡ−３９、ＰＡ−４１、ＰＡ−５０で、断片化には同一のプロトコールを用いた。簡単に説明すると、固定化したフィチンスラリー（７５０μｌ）を消化緩衝液（７５ｍＭシステイン、ｐＨ５．６）で洗浄した後、約３ｍｇのｍＡｂを加え、コンスタントに転倒回転しながら混合物を３７℃で４時間インキュベートした。消化が終わったら、スラリーを遠心処理し、消化産物を回収した。スラリーをプロテインＡ結合緩衝液で３回洗浄し、洗浄材料を加えて消化を完了させた。ＮＡｂプロテインＡカラムをプロテインＡ結合緩衝液で平衡化し、消化抗体試料を加えた。カラムおよび試料を室温にて１０分間インキュベートした。カラムを１０００ｇで１分間遠心処理し、Ｆａｂ断片を含む通過画分を回収した。カラムをプロテインＡ結合緩衝液で３回洗浄した。通過画分を回収し、緩衝液をＰＢＳに交換して、濃縮した。

【0314】

Ｂ．Ｆａｂ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｎｏｖｅｘゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで試料を分析し、特に明記しないかぎり、以下に列挙する試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。試料をＮｕＰａｇｅ試料緩衝液と混合し、ＤＴＴで還元した。還元試料と非還元試料を１００℃で１０分間インキュベートした。試料（４μｇ）を４〜１２％のＢｉｓ Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅゲルにロードした後、ＭＯＰＳランニング緩衝液を用いて１８０Ｖで６０分間、電気泳動を実施した。電気泳動後、固定液（４０％メタノール、１０％酢酸）と一緒に２０分間、ゲルをインキュベートし、水ですすぎ、コンスタントに回転しながらＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎで一晩染色した。

【0315】

Ｃ．ＦａｂのＩｎ ｖｉｔｒｏキャラクタリゼーション
Ｉｎ ｖｉｔｒｏクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のトキシン中和実験を実施して、結合部位数を基準にＦａｂ（▲）の機能的活性を完全ｍＡｂ（■）の機能的活性と比較した。ＰＡ−３９のＦａｂは、完全ＰＡ−３９よりもＣＨＯ−Ｋ１細胞でトキシンＡ細胞毒性を強く中和した（それぞれＥＣ_５０が８８０ｐＭ、ＥＣ_５０が２００ ｐＭ）（図４１Ａ）。ＰＡ−４１のＦａｂは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でのトキシンＢ活性の中和にあたって完全ＰＡ−４１と等しく強力なであることがわかった（それぞれＥＣ_５０が８８ｐＭ、ＥＣ_５０が８０ｐＭ）（図４１Ｂ）。Ｔ−８４細胞でのトキシンＡの中和にあたっての完全ＰＡ−５０ ｍＡｂのＥＣ_５０値１００ｐＭであったのに対し、ＰＡ−５０のＦａｂは、ＥＣ_５０値が１．８ｎＭであった（図４１Ｃ）。

【0316】

実施例１２
ヒト組織標本のヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂの免疫組織化学的分析
特定抗原の発現を研究する際の免疫組織化学検査（ＩＨＣ）の値は、正常な組織と腫瘍組織における微小解剖の詳細と不均一性を評価できるようにするものである。ＩＨＣは、個々の細胞タイプにタンパク質を直接局在化できるので、他の分析方法よりも好都合である。正常な組織と腫瘍組織の遺伝子発現差を検出可能であり、同時に細胞数と組成の変化も把握できる。この技術の制約には、研究対象となる分子の低レベルの発現がゆえに偽陰性の結果が出る可能性があることと、同様のエピトープまたは他の抗原が共通のエピトープへの抗体結合がゆえに偽陽性の結果（交差反応性）が出ることである。これらの制約に対処するために、本研究は、陽性のトキシン特異的注射マウス対照標本で強く特異的な染色を示した各抗体で可能な限り最も低い濃度で実施した。

【0317】

ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−４１およびＰＡ−５０をビオチン化し、副腎、膀胱、骨髄、乳房、小脳、大脳皮質、頸部、結腸、食道、目、ファロピウス管、心臓、回腸、空腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、卵巣、末梢神経、膵臓、上皮小体、脳下垂体、胎盤、前立腺、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、尿管、子宮、白血球を含む凍結ヒト組織の選択時に免疫組織化学的結合パターンを判断した。上述の３７の異なるヒト組織タイプの各々の組織１つを、各抗体で染色した。両方の抗体にウォーキング（Ｗｏｒｋｉｎｇ）ＩＨＣアッセイを開発した。無関係のヒトのＩｇＧ１，κ、アイソタイプ対照抗体を、すべての試料に含めた。

【0318】

組織調製で、ＯＣＴ化合物に埋包した凍結標本（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ埋包化合物；Ｓａｋｕｒａ， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ）を５ミクロンに切片化し、正に荷電したスライドガラスに載せた。各抗体および組織標本のＩＨＣ染色方法と条件を開発し、試験し、最適化した。新たに切り出した未固定の凍結組織切片を用いて直接的なビオチン化ＩＨＣ手順を実施した。スライドをクライオスタットから取り出し、室温で１０分間空気乾燥させ、９５％エタノールで室温にて５分間固定した後、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液（ＴＢＳＴ；Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）の３回連続浴で３分間洗浄した。以後の洗浄はいずれも同様にして実施した。室温にてすぐに使える状態のペルオキシダーゼブロックで５分間インキュベーションして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。緩衝液での洗浄後、アビジンに続いてビオチンで１５分間インキュベーションして、内因性ビオチン活性をブロックした。このとき、ステップごとに緩衝液で洗浄した。ＰＡ−４１では、スライドをＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒタンパク質ブロッキング試薬で１０分間、室温にてインキュベートし、その後の緩衝液での洗浄は実施しなかった。スライドを被検物品または負の対照試薬（ＰＡ−４１に対し１．２５ mｇ／ｍｌおよびＰＡ−５０に対し１０ mｇ／ｍｌ）と一緒に室温にて３０分間インキュベートした。ＰＡ−５０の一次抗体をＤａｋｏ希釈剤で１：３５０に希釈し、ＰＡ−４１一次抗体については、プロリン（２５０ｍＭ、０．５７６ｇ、Ｇｅｎｚｙｍｅ， ＣＡ）およびヒスチジン（１５ｍＭ、０．０４６ｇ、Ｇｅｎｚｙｍｅ， ＣＡ）を２０ｍｌの希釈剤（ｐＨ７．７）に加えてＤａｋｏ希釈剤で１：３５２０に希釈した。ＴＢＳＴでの洗浄後、両方の抗体アッセイでＡＢＣ検出試薬（ＴＢＳＴ中１：５０）を組織切片に適用し、室温にて３０分間インキュベートした後、緩衝液で洗浄した。３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）溶液で室温にて５分間インキュベートして、免疫反応を可視化した。スライドを脱イオン（ＤＩ）水で各３０〜６０秒、３回すすぎ、修飾Ｍａｙｅｒｓヘマトキシリン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で対比染色し、０．２％アンモニアで青くして、等級アルコールで脱水し、キシレンでクリアにして、カバースリップを載せた。染色スライドの解釈を顕微鏡検査で実施した。概して、抗体染色後のスライド上の組織を形態学的に検査して、適切な量の組織が存在するか否か、指定の正常な組織要素が適宜現れたか否かを判断した。上記の標準を満たさなかった試料を、研究病理学者による分析から除外した。

【0319】

スコアリングシステムには、染色強度の半定量的な分析を含む。被検物品の染色強度を、負の対照抗体で染色した隣接する切片を含む組織対照スライドの強度に比して判断した。負の試薬対照で標識した切片の染色を、「バックグラウンド」染色とみなした。「０」のスコアはバックグラウンドに対して染色なしを示し、「１＋」が弱い染色、「２＋」が中程度の染色、「３＋」が強い染色を示した。病理学での標準的なやり方で、すべての組織要素で観察された強度の最高レベルとして染色強度を報告した。

【0320】

ヒト化ＰＡ−５０およびＰＡ−４１ ｍＡｂの両方でのＩＨＣ分析の結果は、試験したどのヒト組織標本でも陽性染色（０％）が認められなかったというものである。トキシンを注射したマウスの脚筋肉対照組織（ＰＡ−５０にはトキシンＡ、ＰＡ−４１にはトキシンＢ）では、研究全体で一貫した強い染色（たとえば、３＋）が示された。ＰＡ−５０の場合、どの組織試料にも真の陽性染色が認められなかった。（すなわち１００％の細胞が染色０％だった）。ＰＡ−４１では、試験した３７のヒト組織で真の陽性染色が認められなかったが、正常な肝臓（リポクローム色素による）、正常な肺（異物のある肺マクロファージ）および正常な筋肉（アーチファクト染色の反応と一貫する）の最高染色強度で弱い（１＋）陽性染色が見られた。このようなＰＡ−４１の弱い染色値については、全対照と最小染色のばらつきからみれば、ささいであるとみなした。

【0321】

実施例１３
非ヒト霊長類におけるヒト化抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンｍＡｂの薬物動態分析
精製ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−４１またはｍＡｂ ＰＡ−５０を用いて未感作ではないカニクイザルでの薬物動態（ＰＫ）研究を実施した。この研究では、雄の未感作ではないカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に１ｍｇ／ｋｇ／匹または５ｍｇ／ｋｇ／匹の精製ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−４１またはｍＡｂ ＰＡ−５０を静脈内注射した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のポリシーと手順に沿って研究を実施した。

【0322】

表８は、各ｍＡｂ（濃度１０ｍｇ／ｋｇ）を未感作ではない動物に２用量レベルで静脈内投与したことを示すＰＫ研究フォーマットを示す。

【0323】

【表8】

【0324】

研究開始時に動物に研究抗体を１回静脈内注射した。その後、２９日間の間に１４の別々の時点で（すなわち投与前；１日目に０．５時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間（投与後）；３日目、４日目、７日目、９日目、１２日目、１５日目、２２日目、２９日目）、各動物から末梢血管の静脈穿刺によって血液試料を得た。血液試料を血清分離管に回収し、凝固するまで湿った氷上に維持した。凝固後、血液試料を１８００ｇで１５分間、４℃で遠心処理して血清を得た。血清試料を使用するまで−７０℃で保管した。

【0325】

ＥＬＩＳＡで血清中のｍＡｂ濃度を求めた。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を、１００ｎｇ／ウェルのトキシンＡ（Ｔｅｃｈｌａｂ）またはトキシンＢ（Ｔｅｃｈｌａｂ）で４℃にて一晩コートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、カルシウムまたはマグネシウムなし、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）、１％カゼイン）で室温にて１時間ブロックした。抗体参照標準（精製ｍＡｂ ＰＡ−４１またはｍＡｂ ＰＡ−５０）を１％のプールした未感作のカニクイザル血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）で希釈し、０．３〜４０００ｎｇ／ｍｌの範囲の標準曲線を作成した。希釈した被験試料および標準を三重に試験し、室温にて１時間インキュベートした。

【0326】

プレートをＰＢＳ−Ｔで６回洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ１（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ １−コンポーネントのペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）でデベロップし、１Ｎの塩酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で止めて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍにて読み取った。標準曲線を用いて、異なる時点の各サルでのｍＡｂ濃度を算出した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を用いてノンコンパートメントの薬物動態分析を実施した。ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−５０でのＰＫの結果を図４２Ａに示す。ヒト化ｍＡｂ ＰＡ−４１での結果を図４２Ｂに示す。用量１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＰＡ−５０では、平均Ｔ_１／２（日）は１４．５±０．３および１２．３±１．５であった。用量１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＰＡ−４１では、平均Ｔ_１／２（日）は８．９±１．３および９．２±３．３であった。

【0327】

参考文献
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【0328】

以上、例示目的で本発明について詳細に説明してきたが、このような詳細は単に説明目的のものにすぎず、当業者であれば以下の特許請求の範囲に規定の本発明の意図および範囲を逸脱することなく改変可能であることは、理解されたい。

【0329】

本出願で引用したすべての参考文献、特許、公開公報の内容を、本明細書に援用する。

【0330】

参考文献の一覧は、その参考文献が従来技術であることを認めるものではない。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15A-D】

【図16A】

【図16B1-2】

【図17A-C】

【図18A-C】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21A-C】

【図22A1-2】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図22E-F】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B-D】

【図31E-F】

【図31G-H】

【図32A-B】

【図33A-B】

【図34A-B】

【図35】

【図36A-B】

【図37】

【図38A】

【図38B-1】

【図38B-2】

【図39A】

【図39B-1】

【図39B-2】

【図40A】

【図40B-1】

【図40B-2】

【図41A-C】

【図42A】

【図42B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]