特許 5965392 脳へのレンチウイルスベクターの送達

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5965392

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月3日

(54)【発明の名称】脳へのレンチウイルスベクターの送達

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20160721BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/06 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20160721BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20160721BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160721BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/76ZMD

   A61K48/00

   A61P25/00

   A61P25/04

   A61P25/06

   A61P25/08

   A61P25/14

   A61P25/16

   A61P25/18

   A61P25/28

   C12N15/00 A

【請求項の数】17

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2013-511744(P2013-511744)

(86)(22)【出願日】2011年5月27日

(65)【公表番号】特表2013-530152(P2013-530152A)

(43)【公表日】2013年7月25日

(86)【国際出願番号】GB2011051009

(87)【国際公開番号】WO2011148194

(87)【国際公開日】20111201

【審査請求日】2014年3月4日

(31)【優先権主張番号】1107184.2

(32)【優先日】2011年4月28日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1100502.2

(32)【優先日】2011年1月12日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1009052.0

(32)【優先日】2010年5月28日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】511143379

【氏名又は名称】オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(72)【発明者】

【氏名】ウィドウソン， ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ラルフ， スコット

(72)【発明者】

【氏名】ミトロファノス， キリアコス

【審査官】 中尾 忍

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００７／００３７７６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 J. Neurosci.，２００４年 ７月，Vol.24，No.29，p.6437-6445

【文献】 Exp. Neurol.，１９９９年１１月，Vol.160，No.1，p.1-16

【文献】 J. Neurosci.，２００４年 ７月，Vol.24，No.29，P.6437-6445

【文献】 Exp. Neurol.，１９９８年 ３月，Vol.150，No.1，P.136-142

【文献】 JARRAYA BECHIR，DOPAMINE GENE THERAPY FOR PARKINSON'S DISEASE IN A NONHUMAN PRIMATE WITHOUT ASSOCIATED DYSKINESIA，SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE，２００９年１０月１４日，Vol.1，No.2，P.1-11

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／７６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経学的状態の処置において使用するための、脳に送達するためのレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター組成物であって、ここで、該レンチウイルスベクター組成物は、カニューレを用いた連続注入によって脳に直接送達され、ここで、経路あたり１０μＬ〜６００μＬの該レンチウイルスベクター組成物は、少なくとも２μＬ／分の流速で送達される、レンチウイルスベクター組成物。

【請求項2】

前記神経学的状態が神経変性疾患である、請求項１に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項3】

前記神経学的状態が、パーキンソン病；筋委縮性側索硬化症（運動ニューロン疾患）；ハンチントン病、およびフリードライヒ運動失調、小脳失調症、ジストニア（ｄｉｓｔｏｎｉａｓ）、反復運動障害、不穏下肢症候群、振せんおよびミオクローヌスのような運動の異常；アルツハイマー病およびピック病；脳卒中；焦点性および全身または特発性てんかん；知覚異常、背部痛、および糖尿病性神経学的障害を含む慢性疼痛；脳腫瘍；慢性疲労症候群；クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）およびバリアントＣＪＤ；テイ・サックス病およびウィルソン病を含む白質ジストロフィー；頭蓋内圧への変化；群発性頭痛および偏頭痛；多発性硬化症；プラダー・ウィリー障害を含む慢性摂食障害；統合失調症；情動性障害；躁病および睡眠時無呼吸を含む睡眠障害からなる群より選択される、請求項１に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項4】

一定の流速が、前記レンチウイルスベクター組成物の注入中に維持される、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項5】

前記流速が、前記レンチウイルスベクター組成物の注入中に増大させられる、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項6】

前記レンチウイルスベクターがウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクターである、請求項１から５のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項7】

前記ＥＩＡＶベクターが、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩおよび芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項8】

半球あたり単一の経路によって送達される、請求項１から７のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項9】

前記注入が、５０μＬの容積を有する、請求項８に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物であって、該レンチウイルスベクター組成物が送達される流速が、２〜４μＬ／分である、レンチウイルスベクター組成物。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物であって、該レンチウイルスベクター組成物が送達される流速が、３μＬ／分である、レンチウイルスベクター組成物。

【請求項12】

２８ゲージと同等であるか、または２８ゲージよりも狭い口径を有するカニューレを用いて送達されるものである、請求項１から１１のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項13】

パーキンソン病を処置するためのものである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項14】

前記レンチウイルスベクター組成物が被殻に送達される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の使用のためのレンチウイルスベクター組成物。

【請求項15】

被験体の脳に、請求項１から１４のいずれかにおいて定義されたレンチウイルスベクター組成物を直接送達するためのキットであって、１本またはそれより多いカニューレを含む、キット。

【請求項16】

前記カニューレが、１０μＬ〜６００μＬの容積の前記レンチウイルスベクター組成物で予め充填されている、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

前記レンチウイルスベクター組成物の送達のための１本またはそれより多いカニューレを含む、請求項１５または１６に記載のキットであって、該カニューレが、２８ゲージまたはより狭いゲージのカニューレである、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経学的状態の処置に使用するための、脳へ送達するためのレンチウイルスベクターに関連する。そのレンチウイルスベクターを、従来の方法と比較して少ない数の投入ポイントを有する狭口径送達デバイスを用いた連続注入によって脳へ直接送達する。

【背景技術】

【0002】

ウイルスに基づくアプローチは、ニューロンおよび／または支持細胞に形質導入するための治療的遺伝子の導入によって、様々な神経疾患を処置することが公知である。例えば、多重シストロンレンチウイルスベクター製品、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）は、パーキンソン病を処置するために開発された。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）は、非ドパミン細胞への、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＧＴＰシクロヒドロラーゼＩの遺伝子の形質導入によって、線条体内ドパミン産生を媒介する（非特許文献１）。

【0003】

レンチウイルスベクター送達の従来の方法は、広い領域にわたる標的細胞の十分な形質導入を保証するために、非連続的な遅い流速における、複数回の少量投入によって、脳内の特異的な領域にベクターを導入した（非特許文献１）。例えば、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を、段階的な送達方法を用いて複数の（半球あたり５つまで）経路を用いて投与し、それは、各経路にそったベクターの複数回の投入を含む（非特許文献２）。

【0004】

そのようなアプローチは、カニューレ経路の位置を決定するための複雑な手術前の計画、および時間のかかる手術を必要とし、ベクターを導入するために複数のカニューレ経路を使用することに関連する出血および他の手術合併症のリスクが増大する。

【0005】

従って、そのようなレンチウイルスベクターの改善された送達方法に対するニーズが存在する。

【0006】

マグヘマイトナノ粒子、リポソームおよびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）のような小さいウイルスベクターを含む、治療薬を脳へ送達する有効な方法として、対流増強送達（ＣＥＤ）を使用する報告が存在する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８および非特許文献９）。加圧注入液を用いることで、血管周囲腔を通じた粒子および高分子の分布は、拡散単独によって達成されるものよりも増強されることが報告された（非特許文献１０およびＨａｄａｃｚｅｋら（２００９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：２２９〜２３７）。

【0007】

ＣＥＤは注入カテーテルの先端における確立された圧力勾配を使用し、それは最初に大きな流れを作り、この流れが、治療薬を「押して」脳細胞間のスペースを通す。

【0008】

小さいＡＡＶを送達するためにＣＥＤの使用が成功したという報告があるが（非特許文献４；非特許文献５；およびＨａｄａｃｚｅｋら（２００９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：２２９〜２３７）、脳における細胞内スペースは、３８から６４ｎｍであると計算されており（ＴｈｏｒｎｅおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ（２００６）ＰＮＡＳ １０４；５５６７〜５５７２）、一方レンチウイルスの典型的な直径は約１００ｎｍであり、典型的にはＡＡＶベクターよりもほぼ４倍大きいので（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第５版（２００７）ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、これらの発見は、レンチウイルスベクターの送達に対してほとんど影響を有さない。ＡＡＶベクターは、約１８〜２６ｎｍの直径を有する無エンベロープのウイルスであり、そして計算された細胞内スペースよりもかなり小さい。

【0009】

ニューロンまたは他の細胞標的は、ベクターを加速した様式で送達した場合に有意に損なわれ得るので、細胞指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）の検討（Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９７巻、３４２８〜３４３２頁；非特許文献１およびＥｓｃｈｅｍａｃｈｅｒら（２００４）Ｅｘｐ Ｍｅｄ ９０：６１〜６９）は、ベクター送達を変える場合には重要な因子である。さらに、特定の脳領域に対する外科的投与の方法を修飾する場合に、中枢ベクター投与に対する相対的な免疫反応も変化し得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ａｚｚｏｕｚら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００２）２２：１０３０２〜１０３１２

【非特許文献2】Ｊａｒｒａｙａら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ（２００９）１４：１（２）２〜４

【非特許文献3】Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．（１９８５）８２：１０２１〜１０２９

【非特許文献4】Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）１６４：２〜１４

【非特許文献5】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２０００）９：５８５〜５９４

【非特許文献6】Ｎｇｕｙｅｎら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ（２００１）１２：１９６１〜１９６４

【非特許文献7】Ｍａｍｏｔら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．（２００４）６８：１〜９

【非特許文献8】Ｈａｄａｃｚｅｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２００６）１７：２９１〜３０２

【非特許文献9】Ｐｅｒｌｓｔｅｉｎら、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ（２００８）１０：１５３〜１６１

【非特許文献10】Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．（２００４）１０１：３１４〜３２２

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者は、驚くべきことに、細胞外スペースと比較したレンチウイルスベクターのサイズにもかかわらず、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）に関して記載された多経路非連続的送達方法を修飾し、経路当たりの送達される容積およびレンチウイルスベクターを注入する流速を増大させ、それにより、より大きな容積のベクターが脳内に広がるようにすることが可能であることを見出した。

【0012】

レポーター遺伝子βガラクトシダーゼを発現する、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に基づくレンチウイルスベクター（ＥＩＡＶ−ＬａｃＺ）を用いた、遺伝的に修飾されたレンチウイルスベクターの単一連続注入によって、カニクイザルの被殻内で有効に分布することが示された。被殻の体軸方向に広がったベクターは、以前に記載された複数回５本針経路アプローチ（手でベクター分布を広げる）を用いるよりもわずかに少なかったが、連続単一注入パラダイムによる内外方向および背腹方向軸のベクター分布は、５本経路複数回投入アプローチよりも良かった。さらに、脳におけるベクター分布の全体積は、５本経路複数回投入方法と比較して、単一連続注入を用いると、約２倍大きかった。

【0013】

投与の増大した容積および増大した流速にもかかわらず、連続注入システムは、ベクターが広がった領域に明白なニューロンの損傷を起こさず、そして血液−脳関門への損傷の証拠はなかった。動物は重大な毒性または明白な炎症性反応の任意の徴候を示さず、そして異常な臨床徴候または運動障害は観察されなかった。これは、レンチウイルスベクターの比較的大きなサイズを考えると驚くべきことである。それに加えて、５本経路アプローチを用いた２３ゲージ針によって以前に観察された、注入カニューレの外側表面に沿った逆流の証拠も少なかった。

【0014】

これは、大きなサイズを考慮した予測とは対照的に、少ない容積の遅い、断続的な注入（複数回投入）を必要とせず、大きな容積のレンチウイルスベクターを、組織損傷の明らかな徴候を引き起こすことなく、流体対流を用いて細胞間のニューロンマトリックス中に「押す」ことができ、そして標的領域内のより良いベクター分布を引き起こすことを示す。

【0015】

これは、所定の容積の注入液を送達するために必要な経路の数の抑制を引き起こす。従って、流速の増大および送達し得る容積の増大は、多くのカニューレ部位を配置することに関連する手術時間およびリスクの両方を減少させ、そしてより高い用量のレンチウイルスベクターの送達を可能にする。

【0016】

狭いゲージのカニューレは、大口径のカニューレより良いベクター分布体積を生じることも見出された。これは、狭いゲージのカニューレでは逆流が少ないため、ならびに、より狭いカニューレからの圧力の増大がベクター分布を増強するためであると考えられる。逆流が起こる場合、有意な量のベクターがカニューレ経路の上方へと失われ得、標的領域への送達に利用可能ではなく、このため、逆流は圧力下で治療薬を送達する場合、重要な問題であり得る。

【0017】

従って、最初の局面において、本発明は、神経学的状態の処置に使用するための、脳内へ送達するレンチウイルスベクターを提供し、ここで、そのレンチウイルスベクターを含む組成物を、カニューレを用いて連続注入によって脳に直接送達し、ここで経路あたり１０〜６００μＬのベクター組成物を、少なくとも２μＬ／分の流速で送達する。

【0018】

そのカニューレは、ベクター組成物の実質的な逆流を防止するために十分狭い口径であり得る。

【0019】

その流速はレンチウイルスベクターの注入の間一定であり得、または増大し得る。

【0020】

そのベクターは、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、例えばチロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩおよび芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＥＩＡＶベクターであり得る。

【0021】

そのレンチウイルスベクターを、半球あたり単一のカニューレ経路によって送達し得る。

【0022】

その注入は約５０μＬの容積を有し得る。

【0023】

ベクターを送達する流速は、２〜６μＬ／分、例えば約３μＬ／分であり得る。

【0024】

そのレンチウイルスベクターを、２８ゲージと同じか、またはより狭い口径のカニューレを用いて送達し得る。

【0025】

そのレンチウイルスベクターは、パーキンソン病を処置するためのものであり得る。

【0026】

２番目の局面において、本発明は、患者において神経学的障害を処置するための方法を提供し、それは任意の先行の主張において定義されたようなレンチウイルスベクターを患者に投与する工程を含み、その方法において、レンチウイルスベクターを含む組成物を、カニューレを用いた連続注入によって脳に直接送達し、そしてここで経路あたり１０〜６００μＬのベクター組成物を、少なくとも２μＬ／分の流速で送達する。

【0027】

３番目の局面において、カニューレを用いた連続注入によって、患者の脳に直接投与する場合に、被殻におけるレンチウイルスベクターの分布体積を改善するための方法が提供され、ここで経路あたり１０〜６００μＬのベクター組成物を、少なくとも２μＬ／分の流速で送達する。

【0028】

４番目の局面において、本発明の最初の局面によるレンチウイルスベクターを、患者の脳に直接送達するためのキットが提供され、それは１本またはそれ以上のカニューレを含む。

【0029】

そのカニューレは、１０から６００μＬの容積のレンチウイルスベクター組成物を予め充填してある場合がある。

【0030】

そのキットは、ベクターの送達のための１本またはそれ以上のカニューレを含み得、ここでそのカニューレは２８ゲージまたはより狭いカニューレである。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
神経学的状態の処置において使用するための、脳に送達するためのレンチウイルスベクターであって、ここで、該レンチウイルスベクターを含む組成物は、カニューレを用いた連続注入によって脳に直接送達され、ここで、経路あたり１０μＬ〜６００μＬの該ベクター組成物は、少なくとも２μＬ／分の流速で送達される、レンチウイルスベクター。
（項目２）
前記カニューレが、前記ベクター組成物の実質的な逆流を防止するために十分狭い口径のカニューレである、項目１に記載のレンチウイルスベクター。
（項目３）
一定の流速が、前記レンチウイルスベクターの注入中に維持される、項目１または２に記載のレンチウイルスベクター。
（項目４）
前記流速が、前記レンチウイルスベクターの注入中に増大させられる、項目１または２に記載のレンチウイルスベクター。
（項目５）
ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクターである、前述の項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
（項目６）
チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩおよび芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、項目５に記載のＥＩＡＶベクター。
（項目７）
半球あたり単一の経路によって送達される、前述の項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
（項目８）
前記注入が、約５０μＬの容積を有する、項目７に記載のレンチウイルスベクター。
（項目９）
前述の項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクターであって、該ベクターが送達される流速が、２〜４μＬ／分である、レンチウイルスベクター。
（項目１０）
前述の項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクターであって、該ベクターが送達される流速が、約３μＬ／分である、レンチウイルスベクター。
（項目１１）
２８ゲージと同等であるか、または２８ゲージよりも狭い口径を有するカニューレを用いて送達されるものである、前述の項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
（項目１２）
パーキンソン病を処置するためのものである、前述の項目のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
（項目１３）
被験体における神経学的障害を処置するための方法であって、前述の項目のいずれかにおいて定義されたレンチウイルスベクターを、該被験体に投与する工程を含み、ここで、該方法において、該レンチウイルスベクターを含む組成物は、カニューレを用いた連続注入によって脳に直接送達され、ここで、経路あたり１０μＬ〜６００μＬの該ベクター組成物は、少なくとも２μＬ／分の流速で送達される、方法。
（項目１４）
被験体の脳に直接投与される場合の、被殻におけるレンチウイルスベクターの分布体積を改善するための方法であって、該方法は、カニューレを用いたベクターを含む組成物の連続注入を含み、ここで、経路あたり１０μＬ〜６００μＬの該ベクター組成物は、少なくとも２μＬ／分の流速で送達される、方法。
（項目１５）
被験体の脳に、項目１から１２のいずれかにおいて定義されたレンチウイルスベクターを直接送達するためのキットであって、１本またはそれより多いカニューレを含む、キット。
（項目１６）
前記カニューレが、１０μＬ〜６００μＬの容積の前記レンチウイルスベクターで予め充填されている、項目１５に記載のキット。
（項目１７）
前記ベクターの送達のための１本またはそれより多いカニューレを含む、項目１５または１６に記載のキットであって、該カニューレが、２８ゲージまたはより狭いゲージのカニューレである、キット。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１は、（Ａ）２３ゲージＨａｍｉｌｔｏｎステンレススチール針による、それぞれ１０μＬを送達する５本の針経路（３点で）、（Ｂ）２８ゲージの石英ガラスカニューレによる３μＬ／分における単一注入、または（Ｃ）２８ゲージの石英ガラスカニューレによる１μＬ／分における５０μＬのＴＳＳＭ処方緩衝液のみの注入を用いた、５０μＬのＥＩＡＶ−ＬａｃＺベクター懸濁物の投与後の、非ヒト霊長類被殻における抗βガラクトシダーゼの染色を示す。この図は、５本針経路（Ａ）の確立された方法（ベクターが注射経路の近位により制限される）と比較した、単一注入（Ｂ）を用いた投与後の被殻におけるＥＩＡＶベクターの内外および背腹方向の優れた広がりを示す。高拡大イメージは、ＥＩＡＶ形質導入細胞のニューロンの形態を示し、それは両方の送達方法で同様である。ＴＳＳＭ緩衝液の注射は、組織学的染色のためのネガティブコントロールを提供する。

【図2】図２は、立体学的方法を用いた、様々な送達方法を用いた５０μＬのＥＩＡＶ−ＬａｃＺベクター懸濁物の投与後の、非ヒト霊長類被殻におけるベクター分布の体積の推定を示す。

【0032】

そのデータは、２８ゲージの石英ガラスカニューレによる、１または３μＬ／分の一定の流速における単一注入を用いたベクターの投与は、２３ゲージの針およびシリンジを用いた５経路送達方法と比較して、被殻におけるベクターの改善された分布を媒介することを示す。３μＬ／分のより速い流速は、より遅い流速よりも、単一注入によってより大きな体積のベクター分布を示した。２３ゲージの針およびシリンジによる単一注入を用いたベクター送達は、上記で記載した方法のどちらよりも低い体積のベクター分布を生じ、このことは、脳において改善されたベクターの分布を達成するために、針のゲージが重要であることを示す。

【図3】図３は、（Ａ）２３ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎステンレススチール針による５本針経路、または（Ｂ）２８ゲージの石英ガラスカニューレによる単一注入を用いて、５０μＬのＥＩＡＶ−ＬａｃＺベクター懸濁物を投与した切片における、活性化ミクログリアのＣＤ６８陽性染色を示す低拡大顕微鏡写真である。この図は、両方の送達方法に関して、免疫反応は局所的であり、そして針経路の領域に限られていることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

詳細な説明
本発明は、脳へ送達するためのレンチウイルスベクターに関連する。

【0034】

レンチウイルスベクター
本発明によるレンチウイルスベクターは、任意の適当なレンチウイルス由来であり得、またはそれらから誘導可能であり得る。組換えレンチウイルス粒子は、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を標的細胞に形質導入し得る。一旦細胞内に入ったら、ベクター粒子由来のＲＮＡゲノムはＤＮＡに逆転写され、そして標的細胞のゲノムに組込まれる。

【0035】

レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターの大きなグループの一部である。レンチウイルスの詳細なリストを、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ編、７５８〜７６３頁において見出し得る。簡単には、レンチウイルスを、霊長類および非霊長類のグループに分けることができる。霊長類レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含むがこれに限らない。非霊長類レンチウイルスグループは、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに、関連するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、および最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含む。

【0036】

レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有するという点で、レトロウイルス科の他のメンバーとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３〜３０５８、ならびにＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０〜５１６）。対照的に、ＭＬＶのような他のレトロウイルスは、例えば筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成するもののような、非分裂細胞またはゆっくりと分裂する細胞には感染できない。

【0037】

本明細書中で使用されるようなレンチウイルスベクターは、少なくとも１つのレンチウイルス由来の構成部分を含むベクターである。好ましくは、その構成部分は、生物学的メカニズム（そのベクターが細胞に感染するメカニズム、遺伝子を発現するメカニズム、または複製メカニズム）に関与する。

【0038】

レトロウイルスおよびレンチウイルスゲノムの基本的な構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、その間またはその内部に位置する、ゲノムをパッケージングし得るパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位、パッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子−これらはウイルス粒子のアッセンブリに必要なポリペプチドである−のような、多くの共通の特徴を有する。レンチウイルスは、ＨＩＶのｒｅｖおよびＲＲＥ配列のような、さらなる特徴を有し、それは組込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物の、感染標的細胞の核から細胞質への効率的な輸送を可能にする。

【0039】

プロウイルスにおいて、ウイルス遺伝子の両端には、長末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が位置している。ＬＴＲは、プロウイルスの組込み、および転写に関与する。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列として作用し、ウイルス遺伝子の発現をコントロールし得る。

【0040】

ＬＴＲ自体は、３つの要素に分けられ得る同一の配列であり、それらはＵ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有な配列由来である。Ｒは、ＲＮＡの両端で反復される配列由来であり、そしてＵ５はＲＮＡの５’末端に特有な配列由来である。３つの要素のサイズは、異なるウイルスの間で大きく異なり得る。

【0041】

欠損レンチウイルスベクターゲノムにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを欠く場合も、これらが機能的ではない場合もある。ＲＮＡの両端のＲ領域は反復配列である。Ｕ５およびＵ３は、それぞれＲＮＡゲノムの５’および３’末端における特有な配列を示す。

【0042】

本発明の典型的なレンチウイルスベクターにおいて、複製に必須の１つまたはそれ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部を、ウイルスから除去し得る。これにより、ウイルスベクターを複製欠損にする。さらに、標的非分裂宿主細胞に形質導入し得るか、および／またはゲノムを宿主ゲノムへ組込み得る、ＮＯＩを含むベクターを産生するために、ウイルスゲノムの一部を、ＮＯＩで置換し得る。

【0043】

１つの実施態様において、そのレンチウイルスベクターは、ＷＯ２００７／０７１９９４において記載されたような非組込みベクターである。

【0044】

さらなる実施態様において、そのベクターは、ウイルスＲＮＡが全く無いかまたは欠けている配列を送達する能力を有する。さらなる実施態様において、送達されるＲＮＡ上に位置する異種の結合ドメイン（ｇａｇに対して異種）、およびｇａｇまたはｐｏｌ上の関連結合ドメインを使用して、送達されるＲＮＡのパッケージングを保証し得る。これらのベクターはどちらも、ＷＯ２００７／０７２０５６において記載されている。

【0045】

レンチウイルスベクターは、「非霊長類」ベクターであり得る。すなわち、主に霊長類、特にヒトに感染しないウイルス由来であり得る。

【0046】

非霊長類レンチウイルスの例は、自然には霊長類に感染しない、レンチウイルス亜科の任意のメンバーであり得、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含み得る。

【0047】

特に好ましい実施態様において、そのウイルスベクターはＥＩＡＶ由来である。ＥＩＡＶは、レンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、そして本発明における使用のために特に好ましい。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子に加えて、ＥＩＡＶは、３つの他の遺伝子：ｔａｔ、ｒｅｖ、およびＳ２をコードする。Ｔａｔは、ウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（ＤｅｒｓｅおよびＮｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０〜５３６およびＭａｕｒｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２〜６４２）、そしてＲｅｖはｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節および調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２〜３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用メカニズムは、霊長類ウイルスにおける類似のメカニズムと広く同様であると考えられる（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２〜３１１１）。Ｓ２の機能は未知である。それに加えて、ＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍが同定された。これは、膜貫通タンパク質の開始においてｅｎｖコーディング配列にスプライスされる、ｔａｔの最初のエキソンによってコードされる。

【0048】

本発明の好ましいベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。

【0049】

「組換えレンチウイルスベクター」という用語は、標的細胞へ感染し得るウイルス粒子への、パッケージング構成成分の存在下でのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするために、十分なレンチウイルス遺伝情報を有するベクターを指す。標的細胞の感染は、逆転写および標的細胞ゲノムへの組込みを含み得る。組換えレンチウイルスベクターは、非ウイルス性コーディング配列を有し、それらはベクターによって標的細胞へ送達される。組換えレンチウイルスベクターは、最終的な標的細胞において、感染性レンチウイルス粒子を産生するための独立した複製ができない。通常、その組換えレンチウイルスベクターは、機能的なｇａｇ−ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ遺伝子および／または複製に必須の他の遺伝子を欠く。本発明のベクターを、スプリットイントロンベクターとして構成し得る。スプリットイントロンベクターは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／１５６８３において記載されている。

【0050】

好ましくは、本発明の組換えレンチウイルスベクターは、最低限のウイルスゲノムを有する。

【0051】

本明細書中で使用する場合、「最低限のウイルスゲノム」という用語は、感染、形質導入、および目的のヌクレオチド配列の標的宿主細胞への送達に必要な機能を提供するように、必須ではない要素を除去し、そして必須の要素を保持するように操作したウイルスベクターを意味する。この戦略のさらなる詳細を、発明者らのＷＯ９８／１７８１５において見出し得る。

【0052】

本発明の１つの実施態様において、そのベクターは自己不活性型ベクターである。

【0053】

例として、転写エンハンサーまたは３’ＬＴＲのＵ３領域のエンハンサーおよびプロモーターを欠失させることによって、自己不活性型レトロウイルスベクターを構築した。１回のベクターの逆転写および組込みの後、これらの変化は５’および３’ＬＴＲの両方にコピーされ、転写不活性のプロウイルスを産生する（Ｙｕら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：３１９４〜３１９８；ＤｏｕｇｈｅｒｔｙおよびＴｅｍｉｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１１９７〜１２０１；Ｈａｗｌｅｙ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２４０６〜２４１０、ならびにＹｅｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５６４〜９５６８）。しかし、そのようなベクターのＬＴＲの内側の任意のプロモーターは、依然として転写活性である。この戦略は、内側に位置する遺伝子からの転写に対する、ウイルスＬＴＲのエンハンサーおよびプロモーターの影響を排除するために採用された。そのような影響は、転写の増大（Ｊｏｌｌｙら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１８５５〜１８７２）、または転写の抑制（ＥｍｅｒｍａｎおよびＴｅｍｉｎ（１９８４）Ｃｅｌｌ ３９：４４９〜４６７）を含む。この戦略をまた、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡへの下流の転写を排除するために使用し得る（ＨｅｒｍａｎおよびＣｏｆｆｉｎ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８４５〜８４８）。内因性がん遺伝子の偶発的な活性化を防止することが決定的に重要であるヒト遺伝子治療において、これは特に重要である。

【0054】

しかし、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために使用するプラスミドベクターはまた、宿主細胞／パッケージング細胞においてゲノムの転写を指示するための、レンチウイルスゲノムに作動可能に連結した転写調節コントロール配列を含む。これらの調節配列は、転写されるレンチウイルス配列に関連する天然の配列、すなわち５’Ｕ３領域であり得、または、それらは別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターのような、異種のプロモーターであり得る。いくつかのレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス産生のためにさらなる配列を必要とする。例えば、ＨＩＶの場合、好ましくはｒｅｖおよびＲＲＥ配列が含まれる。しかし、ｒｅｖおよびＲＲＥの必要性は、コドンの最適化によって低下または排除され得る。この戦略のさらなる詳細を、ＷＯ０１／７９５１８において見出し得る。ｒｅｖ／ＲＲＥシステムと同じ機能を果たす代替配列も公知である。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥシステムの機能的アナログが、Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒサルウイルスにおいて見出されている。これは構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）として公知であり、ゲノム中にＲＲＥ型の配列を含み、感染細胞中の因子と相互作用すると考えられている。その細胞因子は、ｒｅｖアナログと考え得る。従って、ＣＴＥをｒｅｖ／ＲＲＥシステムの代替として使用し得る。公知であるか、または利用可能である、あらゆる他の機能的同等物が、本発明に関連し得る。例えば、ＨＴＬＶ−ＩのＲｅｘタンパク質が、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質を機能的に置換し得ることも公知である。ＲｅｖおよびＲｅｘが、ＩＲＥ−ＢＰと類似の影響を有することも公知である。

【0055】

特に好ましい実施態様において、本発明によるレンチウイルスベクターは、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）由来の、自己不活性型最小レンチウイルスベクターからなり、好ましくはドパミン合成パスウェイに関与する３つの酵素をコードする。そのようなベクターによってコードされるタンパク質は、ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ^＊）遺伝子の短縮形式（ＴＨのフィードバック調節に関与するＮ末端の１６０アミノ酸を欠く）、ヒト芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、およびヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＴＰ−ＣＨ１）遺伝子を含み得る。そのベクターを、（１）組換えＥＩＡＶ ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ ｐｌｃ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ）ベクターゲノム（ｐＯＮＹＫ１−ＯＲＴ、ＷＯ０２／２９０６５およびＦａｒｌｅｙら（２００７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｅｄ．９：３４５〜３５６）；（２）合成ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクター（ｐＥＳＧＰＫ、ＷＯ０１／７９５１８およびＷＯ０５／２９０６５）および（３）ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現ベクター（ｐＨＧＫ）をコードする３つのプラスミドによる、細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）の一過的トランスフェクションによって産生し得る。

【0056】

パッケージング配列
本発明の状況において使用する場合、「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」と交換可能に呼ばれる「パッケージングシグナル」という用語は、ウイルス粒子形成中のレンチウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成のために必要な、非コーディング、シス作用性配列を指して使用される。ＨＩＶ−１において、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から、少なくともｇａｇ開始コドンまで伸びる遺伝子座にマッピングされた。

【0057】

本明細書中で使用される場合、「延長パッケージングシグナル」または「延長パッケージング配列」という用語は、ｇａｇ遺伝子までさらに延長した、ｐｓｉ配列周辺の配列を使用することを指す。これらのさらなるパッケージング配列を含むことは、ベクターＲＮＡのウイルス粒子への挿入の効率を高め得る。

【0058】

偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）
好ましくは、本発明によるレンチウイルスベクターは、偽型化されている。この点について、偽型化は、１つまたはそれ以上の利点を与え得る。例えば、レンチウイルスベクターに関して、ＨＩＶに基づくベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、そのベクターを、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞にのみ感染するよう制限する。しかし、これらのベクターのｅｎｖ遺伝子を、他のＲＮＡウイルス由来のｅｎｖ配列で置換した場合、それらはより広い感染スペクトルを有し得る（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９〜２４２）。例として、Ｍｉｌｌｅｒらは、ＭｏＭＬＶベクターを、両栄養性レトロウイルス４０７０Ａ由来のエンベロープで偽型化し（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．５：４３１〜４３７）、他の研究者はＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターを、ＶＳＶ由来の糖タンパク質で偽型化した（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）２３９〜２４２）。

【0059】

別の選択肢において、そのＥｎｖタンパク質は、変異または遺伝子操作したＥｎｖタンパク質のような、修飾Ｅｎｖタンパク質であり得る。標的化能力を導入するために、または毒性を抑制するために、または別の目的のために、修飾を行うことも、選択することもできる（Ｍａｒｉｎら（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０（５）：２９５７〜２９６２；Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０〜２８６；およびＦｉｅｌｄｉｎｇら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２〜１８０９およびそこで引用された参考文献）。

【0060】

そのベクターを、例えば狂犬病Ｇタンパク質またはＶＳＶ−Ｇタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子で偽型化し得る。

【0061】

ＶＳＶ−Ｇ
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、レンチウイルスを含むあるレトロウイルスを偽型化し得ることが示されたエンベロープタンパク質である。

【0062】

任意のレトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下で、ＭｏＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターを偽型化するその能力は、最初にＥｍｉら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１２０２〜１２０７）によって示された。ＷＯ９４／２９４４４０は、レトロウイルスベクターを、ＶＳＶ−Ｇによってうまく偽型化し得ることを教示する。これらの偽型化ＶＳＶ−Ｇベクターを使用して、広い範囲の哺乳動物細胞に形質導入し得る。より最近には、Ａｂｅら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２（８）：６３５６〜６３６１が、非感染性レトロウイルス粒子を、ＶＳＶ−Ｇの追加によって感染性にし得ることを教示する。

【0063】

Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３〜８０３７は、レトロウイルスＭＬＶを、ＶＳＶ−Ｇでうまく偽型化し、そしてこれは、その天然形式のＭＬＶと比較して変化した宿主範囲を有するベクターを生じた。ＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクターは、哺乳動物細胞だけでなく、魚類、爬虫類、および昆虫由来の細胞系統にも感染することが示された（Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３〜８０３７）。それらはまた、様々な細胞系統に関して、従来の両栄養性エンベロープより効率的であることが示された（Ｙｅｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５６４〜９５６８およびＥｍｉら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１２０２〜１２０７）。ＶＳＶ−Ｇタンパク質の細胞質テイルは、レトロウイルスのコアと相互作用し得るので、ＶＳＶ−Ｇタンパク質をまた、あるレンチウイルスおよびレトロウイルスを偽型化するために使用し得る。

【0064】

ＶＳＶ−Ｇタンパク質のような非レンチウイルス偽型化エンベロープの提供は、ベクター粒子を感染性の喪失なく高力価に濃縮し得るという利点を提供する（Ａｋｋｉｎａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１〜２５８５）。レンチウイルスおよびレトロウイルスのエンベロープタンパク質は、おそらくそれらは２つの非共有結合的に連結したサブユニットからなるので、明らかに超遠心分離中のせん断力に耐えられない。そのサブユニット間の相互作用は、遠心分離によって破壊され得る。比較すると、ＶＳＶ糖タンパク質は、単一のユニットからなる。従って、ＶＳＶ−Ｇタンパク質偽型化は、潜在的な利点を提供し得る。

【0065】

ＷＯ００／５２１８８は、安定な産生細胞系統からの、膜関連ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルス−Ｇタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を有する、偽型化レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの産生を記載し、そしてＶＳＶ−Ｇタンパク質の遺伝子配列を提供する。

【0066】

ロスリバーウイルス
ロスリバーウイルスのエンベロープを、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）の偽型化のために使用し、続く全身性投与は、主に肝臓に形質導入した（Ｋａｎｇら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６（１８）：９３７８〜９３８８）。効率は、ＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクターで得られたものより２０倍高かったと報告され、そして肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定されるような細胞毒性は、より低かった。

【0067】

ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）は、蚊によって広まるアルファウイルスであり、それはオーストラリアの熱帯および温暖な領域において風土性および流行性である。温暖な沿岸地域における正常集団の抗体率は、低い傾向があるが（６％から１５％）、Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ水系の平野における血清有病率は、２７から３７％に達する。１９７９年から１９８０年において、ロスリバーウイルスは、太平洋諸島で流行した。その疾患は、ヒトの間では伝染性ではなく、致死的ではなく、最初の症状は、約半分の患者において疲労および嗜眠を伴う関節痛である（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第５版（２００７）、ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。

【0068】

バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床的および商業的適用のために必要な、高力価のウイルスの大規模生産において使用されるウイルスベクターに関して、ＶＳＶ−Ｇの魅力的な代替物であることが示された（Ｋｕｍａｒ Ｍ、Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ、Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７〜７７）。ＶＳＶ−Ｇで偽型化したベクターと比較して、ＧＰ６４で偽型化したベクターは、同様の広い指向性および同様の天然力価を有する。ＧＰ６４の発現は細胞を殺さないので、ＧＰ６４を構成的に発現する２９３Ｔに基づく細胞系統を産生し得る。

【0069】

狂犬病Ｇ
本発明において、そのベクターを、狂犬病Ｇタンパク質、またはその変異体、バリアント、ホモログもしくは断片の少なくとも一部で偽型化し得る。

【0070】

狂犬病Ｇタンパク質、およびその変異体についての教示は、

【0071】

【化1】

【0072】

において見出し得る。狂犬病Ｇタンパク質はまた、ＥＰ０４４５６２５において記載されている。

【0073】

代替のエンベロープ
レンチウイルスベクターを偽型化するために使用し得る他のエンベロープは、Ｍｏｋｏｌａ、Ｅｂｏｌａ、４０７０ＡおよびＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）を含む。

【0074】

レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを、インビボにおける、目的の１つまたはそれ以上の部位への目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）の輸送のための送達システムとして提案した。

【0075】

ＮＯＩによってコードされる発現産物は、細胞から分泌されるタンパク質であり得る。あるいは、ＮＯＩ発現産物は分泌されず、細胞内で活性である。

【0076】

その、またはそれぞれのＮＯＩは、予防的、治療的、および／または診断的に神経学的障害と関連し得る。適当なＮＯＩは、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、遺伝子操作した免疫グロブリン様分子、１本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、標的タンパク質のトランスドメインネガティブ変異体、毒素、条件付き毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質、および増殖因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、およびその誘導体（例えば、関連するリポーターグループを伴う）をコードする配列を含むがこれに限らない。そのＮＯＩはまた、プロドラッグ活性化酵素をコードし得る。

【0077】

本発明において、そのＮＯＩは、例えば合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち組換えＤＮＡ技術の使用によって調製された）、ｃＤＮＡ配列または部分的ゲノムＤＮＡ配列であり得る。

【0078】

そのＮＯＩは、神経変性性障害、例えばパーキンソン病の処置において有用であり得る。

【0079】

そのＮＯＩは、ドパミンの合成または保存に関与する酵素、または複数の酵素をコードし得る。例えば、その酵素は、以下のものの１つまたはそれ以上であり得る：チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰ−ＣＨ１）および／または芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）。３つの遺伝子全ての配列が利用可能である：それぞれアクセッション番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３およびＭ７６１８０である。

【0080】

あるいは、そのＮＯＩは、小胞モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２、アクセッション番号Ｌ２３２０５．１）をコードし得る。そのウイルスゲノムは、ＡＡＤＣをコードするＮＯＩ、およびＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含み得る。そのようなゲノムを、特にＬ−ＤＯＰＡの末梢投与と組み合わせて、パーキンソン病の処置に使用し得る。

【0081】

あるいは、そのＮＯＩは、黒質線条体システムにおいて変性をブロックまたは阻害し得るか、またはＴＨ陽性ニューロンの死滅を防止するか、または再生および機能的な回復を刺激する増殖因子をコードし得る。例えば、そのＮＯＩは、グリア細胞系統由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、パーセフィン成長因子、アルテミン成長因子、またはニュールツリン成長因子、毛様体（ｃｉｌｌｉａｒｙ）神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、汎親和性（ｐａｎｔｒｏｐｉｃ）ニューロトロフィン、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インスリン成長因子−２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂのヘテロおよびホモダイマー、ならびに他の関連するかまたは関連しない神経栄養因子をコードし得る。そのレンチウイルスベクターは、神経栄養因子をコードするこれらのＮＯＩの１つまたはそれ以上を含み得る。

【0082】

そのＮＯＩはまた、アンギオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、レスチン（ｒｅｓｔｉｎ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン誘導可能タンパク質、ｇｒｏ−ｂｅｔａおよびｔｕｂｅｄｏｗｎ−１、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−１２、レチノイン酸、抗ＶＥＧＦ抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴ、ｓｉＲＮＡ、トロンボスポンジン、ＵＳ５，９５２、１９９およびＵＳ６，１００，０７１において記載されたもののようなＶＥＧＦ受容体タンパク質、および抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなるグループから選択される、抗血管新生タンパク質または複数の抗血管新生タンパク質をコードし得る。

【0083】

そのＮＯＩは、目的のタンパク質（「ＰＯＩ」）、またはその変異体、ホモログ、もしくはバリアントの全てまたは一部をコードし得る。例えば、そのＮＯＩは、野生型タンパク質と類似した方式でインビボで機能し得る、ＰＯＩの断片をコードし得る。

【0084】

ＮＯＩの１つは、調節性ドメインを欠く、ＴＨ遺伝子の短縮形式を含み得る。そのようなＮＯＩは、全長酵素の発現を制限し得る、ドパミンによるフィードバック阻害を回避する。

【0085】

「変異体」という用語は、野生型配列からの１つまたはそれ以上のアミノ酸の変動を含むＰＯＩを含む。例えば、変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸付加、欠失、または置換を含み得る。変異体は、天然に生じることがあり、または人工的に作製することもできる（例えば部位特異的変異生成によって）。

【0086】

ここで、「ホモログ」という用語は、ＮＯＩと一定の相同性を有する存在、またはＰＯＩとある程度の相同性を有するタンパク質をコードする存在を意味する。ここで「相同性」という用語は、「同一性」と同じであり得る。

【0087】

本状況において、相同的配列は、アミノ酸またはヌクレオチドレベルで、対象配列と少なくとも７５、８５、もしくは９０％同一、または少なくとも９５もしくは９８％同一であり得る。典型的には、そのホモログは、対象配列と同じ活性部位等を含むか、またはコードする。

【0088】

多くのＮＯＩを、組み合わせて使用し得る。そのレンチウイルスベクターが２つまたはそれ以上のＮＯＩを含む場合、両方のＮＯＩを発現するように、各ＮＯＩに関して１つ、ベクターゲノム内に２つまたはそれ以上の転写ユニットが存在し得る。しかし、レトロウイルスベクターは、遺伝的な単純さを保つ場合に、最も高い力価および最も強力な遺伝子発現性質を達成することが文献から明らかであるので、ポリシストロニックなメッセージにおいて２番目の（およびその後の）コーディング配列の翻訳を開始するために、１つまたはそれ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を用いることが好ましい（Ａｄａｍら、１９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４９８５）。そのようなベクターの例が、ＷＯ０２／２９６０５において記載されている。

【0089】

医薬品組成物
本発明のレンチウイルスベクターを、医薬品組成物の形式で提供し得る。その医薬品組成物を、遺伝子治療によって個人を処置するために使用し得、ここでその組成物は、治療的に有効な量のレンチウイルスベクターを含む。

【0090】

ウイルス調製物を、超遠心分離によって濃縮し得る。ＷＯ２００９／１５３５６３は、レンチウイルスベクターの下流の処理の方法を記載している。結果として生じた医薬品組成物は、少なくとも１０^７Ｔ．Ｕ．／ｍＬ、例えば１０^７から１０^９Ｔ．Ｕ．／ｍＬ、または少なくとも１０^９Ｔ．Ｕ．／ｍＬを有し得る（力価は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系統の標準的なＤ１７に対して力価測定した、１ｍＬあたりの形質導入単位（Ｔ．Ｕ．／ｍＬ）で表される）。

【0091】

その医薬品組成物を、ヒトまたは動物、例えば霊長類動物被験体またはペット動物被験体を処置するために使用し得る。

【0092】

その組成物は、任意で、薬剤学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含み得る。薬剤学的なキャリア、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図する投与経路、および標準的な薬学的実施に関して選択し得る。その医薬品組成物は、キャリア、賦形剤、または希釈剤として（またはそれに加えて）、あらゆる適当な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、およびウイルスの標的部位への侵入を助け得るかまたは増大させ得る他のキャリア薬剤（例えば脂質送達システムのような）を含み得る。

【0093】

疾患
本発明で使用されるレンチウイルスベクターを、神経学的状態を処置するために使用する。例えば、そのベクターは、神経変性性疾患の処置および／または予防に有用であり得る。

【0094】

処置し得る疾患は、パーキンソン病；筋委縮性側索硬化症（運動ニューロン疾患）；ハンチントン病、およびフリードライヒ運動失調、小脳失調症、ジストニア（ｄｉｓｔｏｎｉａｓ）、反復運動障害、不穏下肢症候群、振せんおよびミオクローヌスのような運動の異常；アルツハイマー病およびピック病；脳卒中；焦点性および全身または特発性てんかん；知覚異常、背部痛、および糖尿病性神経学的障害を含む慢性疼痛；脳腫瘍；慢性疲労症候群；クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）およびバリアントＣＪＤ；テイ・サックス病およびウィルソン病を含む白質ジストロフィー；頭蓋内圧への変化；群発性頭痛および偏頭痛；多発性硬化症；プラダー・ウィリー障害を含む慢性摂食障害；統合失調症；情動性障害；躁病および睡眠時無呼吸を含む睡眠障害を含むがこれに限らない。

【0095】

特に、本発明はパーキンソン病の処置および／または予防に有用である。

【0096】

例えば、ＴＨ、ＧＴＰ−ＣＨ１、ならびに任意でＡＡＤＣまたはＡＡＤＣおよびＶＭＡＴ２を送達し得るベクターを用いた遺伝子治療による処置は、おそらく、後期のＰＤ患者（Ｌ−ドーパ処置に有意に反応しない）に特に有用である。末梢に投与されるＬ−ドーパと組み合わせたＡＡＤＣまたはＡＡＤＣおよびＶＭＡＴ２を用いた処置も、後期のＰＤ患者に有用であり得る。

【0097】

投与
本発明で使用するレンチウイルスベクターを、例えば尾状核被殻への注射によって、脳に投与する。

【0098】

そのベクターを、半球あたり１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の経路で投与し得る。

【0099】

本明細書中で使用されるカニューレという用語は、カニューレ、カテーテル、針または治療薬を脳へ直接送達するために適当なあらゆる他のデバイスを含むものとする。ＷＯ２００８／１００９３０、ＷＯ２００８／１４４５８５およびＷＯ２００９／１０１３９７は、使用し得るそのようなカニューレを記載している。

【0100】

レンチウイルスベクターの以前に記載された投与システムにおいて（Ｊａｒｒａｙａら（２００９）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １４：１（２）２〜４）、そのベクター組成物を、経路の底部において、アリコート（４μＬ）を投与し、針を少し引き、次いで２番目のアリコート（３μＬ）を投与し、そして針をさらに少し引き（２回目）、次いで３番目のアリコート（３μＬ）を投与することによって、断続的な、または「点状の」様式で投与した；従って、アリコートを各針経路にそって３点で投入し、全部で１０μＬを送達した。

【0101】

このシステムに伴う不利な点は、非常に遅く、そして労働集約的であること、そして半球あたり５本の針経路、経路あたり３つの投与部位が存在するので、各半球において１５個の潜在的な組織損傷および炎症の部位が存在するという事実を含む。このために、手術時間を有意に増大させるので、このベクターの送達方法を用いて各半球に投与するベクターの用量を増大させることは不可能である。

【0102】

本発明の方法において、そのベクターを各経路について１つの投入点で送達し得、そして各経路によってより大きな容積を送達し得る。本発明の方法において、そのベクター組成物を、連続的に注入する。単一の点における連続投与は、以前のシステムに関連して上記で述べた不利な点を克服する。この方法を用いて、より高い用量のベクターを、実際的な手術時間内に、各半球に投与し得る。

【0103】

「連続注入」という用語は、送達の間ベクター組成物の注入を止めず、そして針を動かさないことを意味する。所定のカニューレに関して、送達する全容積のベクター組成物を、単一の投入点で、そして１回の「プッシュ（ｐｕｓｈ）」で投与する。

【0104】

連続注入の間、ベクター組成物の流速は、実質的に一定であっても、徐々に増大しても、段階的な方式で増大してもよい。

【0105】

「脳に直接」送達することは、レンチウイルスベクターを、注射のような侵襲的な手順を用いて脳組織に直接投与することを意味する。レンチウイルスベクターを、被殻、例えば運動被殻に送達し得る。

【0106】

送達の間、各カニューレ経路によって送達されるレンチウイルスベクターの容積は、１０〜６００μＬであり得、または経路あたり約４０〜２００μＬを送達し得る。各半球に１から６本の経路を使用し得る。

【0107】

そのベクターを、ベクター組成物の実質的な逆流を防ぐために、十分狭い口径のカニューレを用いて送達し得る。例えばそのカニューレは、ベクター組成物の２０％、１５％、１０％、または５％未満が、送達の間またはその後に針を逆流するような口径であり得る。

【0108】

そのベクターを、２３ゲージ針と同等であるか、またはそれより狭い直径の出口を有するカニューレを用いて送達し得る。その出口は約２８ゲージであり得る。そのデバイスは、２３ゲージ未満および３３ゲージ超の出口を有し得る。

【0109】

カニューレの内径は、０．３５、０．３、０．３５、０．２、または０．１５ｍｍ未満であり得る。

【0110】

本発明はまた、各カニューレ経路について、連続注入を用いてレンチウイルスベクターを送達することによって、被験体の脳に直接投与した場合に、被殻の内外方向および背腹方向軸のレンチウイルスベクターの分布を改善する方法を提供する。

【0111】

被殻の内外方向および背腹方向軸のレンチウイルスベクターの分布を改善するための、および用量の増加を可能にするための、既存の方法の適合は、以下のもののいずれかまたは全てを含み得る：
（ｉ）経路当たりの投入点の数の抑制；
（ｉｉ）レンチウイルスベクター組成物の連続注入を用いる；
（ｉｉｉ）間質性の注入中に圧力勾配を生じさせる、および／または維持する；
（ｉｖ）より速い流速を用いる；ならびに／あるいは
（ｖ）より大きな容積を送達する。

【0112】

典型的には、レンチウイルスベクターを、選択した患者において脳組織へ挿入するカニューレまたは他の注射デバイスを用いて送達する。パーキンソン病の処置のためにＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を送達する場合、線条体が標的とするために適当な脳の領域である。他の領域が、他の神経学的障害の処置のために適当である。当業者は、ＣＮＳのどの一般的な領域が適当な標的であるのかを、容易に決定し得る。定位的マップおよび配置デバイスが利用可能である。配置をまた、患者の脳のＣＴおよび／またはＭＲイメージングによって得られた解剖学的マップを用いることによって行い、選択した標的領域への注射デバイスのガイドを補助をすることができる。

【0113】

流体対流
レンチウイルスベクターに関して以前に記載された投与システムにおいて（上記のＪａｒｒａｙａら（２００９））、そのベクター組成物は、拡散によって脳実質へ浸透した。拡散は、薬剤の拡散率にそった自由濃度勾配に依存する。拡散による分散は、特にレンチウイルスベクターのような高分子量の薬剤に関して、低い浸透を引き起こし得る。

【0114】

細胞外スペース内の治療薬の拡散は、そのような治療薬が、ニューロンおよびグリア細胞のような標的組織に近づくことが可能になるのに必要とされる。ＴｈｏｒｎｅおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ（ＴｈｏｒｎｅおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ（２００６）ＰＮＡＳ １０４；５５６７〜５５７２）は、正常な細胞外スペースは３８から６４ｎｍであることを決定した。彼らは、１００ｎｍより大きなナノ粒子送達システムは、通常の細胞外スペースを通過するには大きすぎることを示唆する。上記で述べたように、レンチウイルスベクターは直径約１００ｎｍのウイルスに基づくナノ粒子送達システムである。

【0115】

本発明の方法において、そのレンチウイルスベクター溶液を、流体対流によって分散させる。速い流速を用いて間質性注入を行い、発明者らはそれがレンチウイルスベクターの分布を非常に増強することを示した。

【0116】

その流速を、ベクターの連続注入の間、一様の状態で維持してもよく、または対流圧を維持するために、増大させてもよい（下記を参照のこと）。圧力勾配の増大は、例えば、一様の増大であり得、または連続注入の間の流速のいくつかの小さな段階的増大によって特徴付けられる傾斜を有する手順に従い得る。

【0117】

当業者に公知のプログラム可能な浸透ポンプ、注入ポンプ、または他のポンプのような、当該分野において公知のシステムを用いて、送達の間、流体圧力を維持してもよく、徐々に増大させてもよく、または傾斜させてもよい。

【0118】

注入プロセス全体の間、速い流速を維持し、ベクターの全容積を送達する（例えば１０から６００μＬ）。

【0119】

注入圧は、流速、レンチウイルスベクター調製物の粘度、およびカニューレサイズの関数である。レンチウイルスベクターの分布を増強するために十分であるが、ａ）投与部位周囲の組織に有意な損傷を引き起こす；および／またはｂ）「逆流」およびカニューレ経路からの溶液の漏れを引き起こすには不十分である圧力勾配を提供するように、その注入圧を選択するべきである。

【0120】

本発明の方法において、そのレンチウイルスベクターを、少なくとも１．０μＬ／分、１．５μＬ／分、または２μＬ／分、または１〜２μＬ／分、１〜３μＬ／分、２〜６μＬ／分、２〜４μＬ／分、または２．５〜３．５μＬ／分の流速で脳内に注入し得る。そのレンチウイルスベクターを、約３μＬ／分の流速で脳内に注入し得る。

【0121】

注入の間、対流圧（それは注入圧と頭蓋内圧との間の差である）は、送達された全容積が増大するにつれて減少し得る。対流圧を維持するために、投与の間流速を一様に増大させ得る。そのようなシステムを採用する場合、前の段落において述べた流速は、開始流速を示し得る。

【0122】

キット
本発明はまた、患者の脳に直接レンチウイルスベクターを送達するためのキットを提供し、それは１本から１２本のカニューレを含む。カニューレは、各患者に関して複数の経路について再利用し得、または各経路について新しいカニューレを使用し得る。

【0123】

そのベクターを、例えばカニューレまたはカテーテルまたは針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ針のような）を用いて送達し得る。本明細書中で使用されるカニューレという用語は、カニューレ、カテーテル、針、または治療薬を脳へ直接送達するために適当なあらゆる他のデバイスを含むものとする。ＷＯ２００８／１００９３０、ＷＯ２００８／１４４５８５およびＷＯ２００９／１０１３９７は、使用し得るそのようなカニューレを記載している。

【0124】

そのカニューレに、レンチウイルスベクター組成物を予め充填してある場合がある。脳内での配置の前に、そのカニューレを満たし得る（ｐｒｉｍｅ）。

【0125】

その送達デバイスは、例えばステンレススチール２８ゲージＨａｍｉｌｔｏｎシリンジまたは石英ガラス２８ゲージ注入カニューレであり得る。

【0126】

そのキットが、半球あたり単一の送達経路を採用する方法において使用するためのものである場合、そのカニューレは、例えば約４０μＬ、１００μＬ、１５０μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、または６００μＬの間のレンチウイルスベクターを送達し得る。そのキットが、半球あたり２本の送達経路を採用する方法において使用するためのものである場合、そのキットは、４本のカニューレを含み得る。あるいは、１本のカニューレを、各経路に関して再利用してもよく、または各半球へベクターを送達するために１本のカニューレを使用し得、その場合、それはレンチウイルスベクター組成物で満たされており、そして標的領域への各挿入の前に満たす。

【0127】

また、そのカニューレを、上記で記載したポンプのような注入デバイスと、前もって連結してもよく、または連結ために適合させてもよい。あるいは、そのカニューレを、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって供給されるもののようなマイクロポンプ、または微量注入システム（Ｋｏｐｆ、ＵＳＡ）によってコントロールされるシリンジのような、ベクター投与のための公知のシステムに結合し得る。そのような送達システムは、定位的フレームを用いて使用するために適当であり得る。

【0128】

本発明のさらなる局面において、本発明の方法と関連して使用される狭口径送達デバイスを、実質的に少なくとも数時間から数日またはそれ以上にわたる期間の間、保持されるように、被験体に埋め込むことができ、従ってベクターの注入を、手術室の外で行うことを可能にする。そのようなデバイスは、十分に弾力的であり、カニューレ注入システムを損なうことなく、標的から離れる動きを防止するために固定デバイスによって固定し得ることが望ましい場合もある。脳内での位置を確認するために、およびカテーテルが任意の点において標的から動かなかったことを保証するために、そのようなデバイスをイメージングできることも望ましい。

【0129】

本発明において使用するために適当な狭口径送達デバイスは、局所の組織外傷を最小限にするために、遠位注入末端において、十分小さい直径を有し得、非常に小さいデッドスペースを有し、破損を防止しかつ固定を可能にするための大きなカテーテルの強さを有し、そしてイメージングによってカテーテルを可視化するための能力を有する。

【0130】

当業者に公知であるように、本発明において使用するために適当であり得る、多くの狭口径送達デバイスが存在する（例えば、ＷＯ２００７／０４４０２３において記載された送達デバイスを参照のこと）。

【0131】

本発明の狭口径注入デバイスを、任意で被験体の頭に取り付ける。考えられる固定方法は、チタンプレートのような金属プレートによる、穿頭孔近くの頭蓋骨への固定、穿頭孔内に置いたプラスチックキャッピングシステムによる固定、または頭皮を通じた外在化およびガイドカテーテルの頭皮への縫合を含むがこれに限らない。

【0132】

そのキットはまた、保存および／または使用のための説明書を含み得る。

【0133】

本発明を、実施例によって、ここでさらに説明する。それは本発明の実施において当業者を助けるために役立つことを意味し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

【実施例】

【0134】

実施例１−ａ）従来の送達、およびｂ）単一部位および速い流速を用いた送達の後の、被殻におけるレンチウイルスベクターの分布の比較
以前に記載された技術（５０μＬの全容積のベクターを、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび２３ゲージの針を用いて５本の針経路によって被殻に投与し、経路あたりそれぞれ１０μＬを３回の投入によって送達する）を用いた、ＥＩＡＶ−ＬａｃＺベクター懸濁物の投与は、被殻の背腹方向軸において中程度のベクターの広がりを提供し、それはこの脳構造の深さの４０〜５０％に達した（図１）。

【0135】

内外方向軸におけるベクターの広がりは、背腹方向軸より非常に少なく、ベクターは最も高い点で約１〜２ｍｍ広がっただけであった。しかし、被殻の軸に沿った５本の針経路の配置のために、体軸方向軸に沿ったベクターの広がりは、このパラダイムによってベクターを投与した２つの半球の両方において約７．８ｍｍであった。

【0136】

対照的に、本発明の方法（５０μＬのベクター懸濁物全部を、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを有する２３ゲージ針によって、または２８ゲージの石英ガラスカニューレを用いて、１または３μＬ／分のいずれかで、被殻の１つの部位に注入する）を用いることは、５経路レジメと比較して、内外方向および背腹方向軸のベクターの広がりを改善し、最も高い程度の広がりは、１または３μＬ／分の流速で２８ゲージのカニューレによって観察された。

【0137】

２８ゲージカニューレデバイスによる単一の送達経路を用いた５０μＬのベクターのベクター送達は、両方の流速で、５経路パラダイムと類似の体軸方向の広がりを生じた（２８ゲージのカニューレに関して６．２〜８．６ｍｍの広がり、および５経路および断続的な流速で７．８ｍｍの広がり）。２３ゲージ針およびＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いた単一注入によって、より低い体軸方向の広がりが観察された（５．０〜６．２ｍｍの広がり）。

【0138】

ベクター分布の全体積を比較した場合、驚くべきことに、２３ゲージ送達デバイスを用いた５０μＬのベクターの単一投与は、５経路送達方法より少ないことが見出された。さらにより驚くべきことに、２８ゲージの送達デバイスは、５経路方法よりも、大きな体積のベクター分布を生じた−速い流速を用いて、２倍超の体積であった。この体積の増大は、少なくとも部分的には、この狭口径送達デバイスを用いた針経路にそったベクターの逆流の減少の結果であると考えられた。

【0139】

全体的に、これらの観察は、２８ゲージのカニューレで単一の注入を行う場合、デバイスの先端から均等に広がるベクターと一致する。逆に、５経路送達アプローチでは（２３ゲージ針およびシリンジを用いた単一注入ではより低い程度まで）、ベクターの分布は針経路のすぐ周囲の領域により限られていた。全てのグループにおいて、注入の結果としての、周囲のニューロン組織への損傷、または血液脳関門の破裂の証拠は存在しなかった。３３ゲージのプラスチックカニューレも評価したが、日常的な手術に使用するには柔軟過ぎ、潜在的に外科医がカニューレを被殻内の正確な部位に置くことに失敗する一因となると判断した。２８ゲージの石英ガラスカニューレは、両方の流速（１または３μＬ／分）を用いて、同様のベクターの広がりを生じた。より細いゲージの２８ゲージカニューレは、２３ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎ針よりも少ない瘢痕を生じた。送達のパラダイムに関係なく、同様の数の細胞（＞９０％）が、β−ガラクトシダーゼおよびＮｅｕＮに関して二重に染色され、全ての場合においてベクターのニューロン標的化を確認した。

【0140】

ＥＩＡＶ−ＬａｃＺベクターの注入に対する局所炎症性反応を、炎症性マーカーＣＤ４およびＣＤ８（Ｔ細胞）、およびＣＤ６８（活性化ミクログリア）の組織学的評価によって、この研究において評価した。マーカーそれぞれについての陽性の染色が、全ての送達方法および注射デバイスに関して針経路の近傍で観察されたが、ベクターに関連する炎症性反応は非常に少なく、そして投与方法の間で差は観察されなかった。この結果は、より速い流速における単一注入を用いたベクター送達に関連する、炎症性反応の増大は存在しないことを示す。

【0141】

ベクター投与に対する明白な毒性または異常な臨床徴候は、実験動物のいずれにおいても観察されなかった。動物は、任意の異常な運動活性または行動を示さず、そして正常に餌を食べることが観察された。

【0142】

【表1】

【0143】

【表2】

【0144】

結論
以前に、少量のレンチウイルスベクターを、遅い流速を用いて、各カニューレ経路における複数回投入によって脳内に送達した。そのような方法は厄介であり、そして用量増大試験ができなかった。より速い流速での、より大きな容積のベクターの投与を可能にする、単純化した連続注入パラダイムは、様々な神経学的状態の処置における外科的利用に、より適用可能であると考えられた。

【0145】

レンチウイルスのように大きなベクターは、以前に霊長類の脳で調査したＡＡＶ粒子よりかなり大きいので、これらのベクターが単一注入のパラダイムによって脳へ効率的に分布し得るかどうかは未知であった（Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら（２０００）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６４：２〜１４；Ｈａｄａｃｚｅｋら（２００６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １７：２９１〜３０２およびＨａｄａｃｚｅｋら（２００９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：２２９〜２３７）。レンチウイルスベクターの直径（約１００ｎｍ）は、細胞外スペース（３８〜６４ｎｍ）より大きいので、レンチウイルスベクター粒子が、細胞外スペースを効率的に通れない可能性があり、それはレンチウイルスベクターのように大きな粒子に関して禁制的であり得る。しかし、ＥＩＡＶベクターのようなレンチウイルスベクターが、連続注入方法を用いて被殻領域を効率的に通り得ることが明らかであり、それは容易にコントロールでき、そして複数のカニューレ設置を用いて標的領域周辺にベクターをスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）するよりも良い形質導入量を提供する。

【0146】

げっ歯類における以前の研究は、低い流速において、ＣＥＤプロセスの間、ベクターは、おそらく脳毛細血管ネットワークによる血流の拍動性作用によって動かされ、血管周囲スペースを通って広がり得ることを報告した（Ｈａｄａｃｚｅｋら（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：４６９〜７９）。しかし、発明者らは、流速を高いレベルに維持した場合、この現象の証拠をほとんど見出さなかった。この血管周囲の輸送を制限することは、非標的領域へのベクター分布を抑制し得る。

【0147】

いくつかのウイルスベクターは、中枢の炎症のリスクをもたらすという懸念、および単一の流速で、またはＣＥＤのプロセスによってベクターを注入することは、炎症性反応を増悪し得るという懸念が存在した。治療的遺伝子のキャリアとして調査したＡＡＶ血清型１ベクターは、霊長類の線条体および皮質に投与した場合に、堅調な体液性および細胞性反応を生じたことが、最近示された（Ｈａｄａｃｚｅｋら（２００９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：２２９〜２３７）。１〜３μＬ／分の投与流速による、２８ゲージのカニューレを用いた、ＥＩＡＶに基づくベクターの単一注入によって、局所炎症性反応の増大に関する証拠は観察されなかった。

【0148】

結論として、これらの研究は、様々な神経学的状態の処置を目的とする治療的遺伝子を、ＥＩＡＶベクターによって、単純な注入パラダイムを用いて、標的脳領域へ安全に投与し得ること、および大量の標的細胞を、効率的に形質導入し得ることを示す。

【0149】

方法および材料
動物
６匹の雄性および６匹の雌性カニクイザルを、ベクター投与の前に、その順化期間の間、一定の温度（２２±２℃）および湿度（４５％〜６５％）で、１２時間の明／暗サイクル（７：３０に点灯）で、単一の性別で一致したグループで収容した。次いで動物を、標準的な寸法の１．１０ｍ^２の床面×１ｍの高さの、個々のステンレススチールの箱に、ベクターの外科的投与の後、１匹ずつ収容した。動物室の空気を、１時間あたり約１０回交換した。動物に、Ｏｌｄ Ｗｏｒｌｄサルペレット（ＳＤＳ ＤＩＥＴＥＸ♯８０８００４）を与え、そして自由に水道水へアクセスさせた。動物の使用およびケアを、Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ８６／６０９／ＥＥＣ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓおよびｔｈｅ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）Ａｃｔ ８６ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍによって管理した。

【0150】

ベクター投与
動物を手術前に絶食させ、そして約６時間水へのアクセスを止めた。動物に、硫酸アトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）、ケタミンＨＣｌ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）およびブプレノルフィン（０．０１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）を投与し、そして次いで１０分後にプロポフォール（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で麻酔した。手術の２４時間前に、および次いで手術後１週間まで４８時間ごとに、動物にアモキシシリン（３０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）も注射した。動物に挿管し、そして量制御（ｖｏｌｕｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）レスピレータによって送達されるイソフルラン吸入麻酔薬で麻酔を維持した。ＥＣＧ、Ｏ_２飽和、および心拍数をモニターおよび記録した。直腸内温度計を用いて、手術の間中、体温をモニターした。動物を、定位的フレーム（Ｕｎｉｍ’ｅｃａｎｉｑｕｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に置き、そして７１０Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｂｏｎａｄｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に結合した、６．５ｍｍ長の２３ゲージステンレススチールＨａｍｉｌｔｏｎ針を用いて、被殻において単一少量投入としてベクターを投与するための微量注入システム（Ｋｏｐｆ、ＵＳＡ）を用いて、ベクターを被殻に投与した。単一被殻注入のために、６．５ｍｍ長の２３ゲージステンレススチールＨａｍｉｌｔｏｎ針およびシリンジ、６．５ｍｍ長の２８ゲージステンレススチールＨａｍｉｌｔｏｎ針およびシリンジ、またはデッドボリュームを最小限にするために、短いプラスチックチューブ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ−１、Ｒｏａｎｏｋｅ、ＶＡ、ＵＳＡ）によってＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに連結した６．５ｍｍ長の石英ガラス注射カニューレのいずれかを用いて、ベクター懸濁物を注入した。硬膜を損傷することなく頭蓋骨に穴をあけた後、ガラスシリンジに装着した脳室造影カニューレを、側脳室の前角に導入し、そして造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ、Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｎｏｒｗａｙ）を注射した。頭蓋骨への挿入の前に、正確な調整のために定位的地図を用いた（ＭａｒｔｉｎおよびＢｏｗｄｅｎ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ ４（２）：１１９〜１５０）。前交連（ＡＣ）の正確な位置を、脳室造影から推測し、それを次いで左被殻および右被殻の両方の位置決定のために使用した。注入カニューレの設置のための座標は、ＡＣ−１ｍｍ（被殻の運動領域のまさに中心）であった。各被殻における複数回投入のために、ベクターを３つの深さで注射し、最も深い投入で４ｍＬを送達し、そして次いでさらに３ｍＬを２回投入し、それぞれその１ｍｍ上に送達して、針経路あたり１０ｍＬを送達した。５本のＨａｍｉｌｔｏｎ針経路のうちの最初のものは、前交連（ＡＣ）のレベル、すなわちＡＣ０ｍｍに、２番目の注射：ＡＣの２ｍｍ尾側（ＡＣ−２ｍｍ）、３番目の注射：ＡＣの３ｍｍ尾側（ＡＣ−３ｍｍ）、４番目の注射：ＡＣの５ｍｍ尾側（ＡＣ−５ｍｍ）、および５番目の注射：ＡＣの６ｍｍ尾側（ＡＣ−６ｍｍ）にあり、被殻の体軸方向の長さにそってベクターを分布した。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび注入カテーテルを、除去する前に、各注射／注入の後、さらに２分間、その部位に残した。

【0151】

ベクターを、プログラム可能な小さい注入ポンプ（ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐＩＩＩ；Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ、ＵＳＡ）を用いて、０．５、１、または３μＬ／分の単一の流速で注入した。ベクターを、半球あたり５０μＬの全容積で、被殻の両側に投与し、各半球に、異なる流速またはカニューレデバイスによって送達されるベクターを投与した。１匹の動物において、ＴＳＳＭ処方緩衝液を被殻に注入し、１つの半球においては１ｍＬ／分で緩衝液を送達する２３ゲージＨａｍｉｌｔｏｎ針を用いて、および他の半球においてはベクターを２８ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎ針によって１ｍＬ／分で送達した。ＴＳＳＭ注入動物を、ウイルスベクター手術記録の非存在下での、滅菌処方緩衝液単独に対するニューロンの損傷および炎症反応についての相対的な程度を評価するために使用した。手術後、その動物をよく観察し、それらが立ち直り反射および嚥下反射を回復するまで暖かく維持し、その後、ケージへ戻した。ブプレノルフィン鎮痛薬を１日２回、３日間（０．０２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）投与し、そして手術後、１週間に１回体重を記録した。

【0152】

組織学
投与の４週間後および一晩の絶食後に、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の注射および次いでペントバルビタールナトリウム麻酔（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を用いた安楽死によって、動物を剖検した。ウイルスに対する免疫反応を評価するために血液サンプルを採取した後、その動物を失血させ（ｅｘｓａｎｇｉｎａｔｅｄ）、ヘパリン処理したリン酸緩衝化生理食塩水（約２５Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、ＵＳＰ）、続いてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中４％の緩衝化パラホルムアルデヒド溶液で灌流した。脳（硬膜を除去して）を注意深く解剖し、そして新しい４％のパラホルムアルデヒド中に５±３℃で一晩おき、そして次いで冷却した、ろ過３０％ショ糖溶液（ＰＢＳ中）に２〜４日間移した。その脳を、次いで正中線で２つの半球に二分し、そして各半球を、冷却イソペンタン（−４０から−５０℃）中で急速冷凍し、そしてクリオスタットを用いて４０ミクロン（４０μｍ）の厚さの切片にするまで、−８０℃で保存した。被殻領域を含む脳切片を、ポットに回収し、これは、脳半球の体軸にそった２００ミクロン（２００μｍ）の距離に相当する５枚の切片を含んだ。浮動性の脳切片を、抗βガラクトシダーゼモノクローナル抗体で染色した。２次および３次抗体を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ抗マウスＡＢＣキット（♯ＰＫ−６１０２）から得て、そしてその方法はキットの説明書に従った。ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット（カタログ番号ＳＫ−４１００）を用いて、ＤＡＢ可視化を達成した。次いで切片を、ガラスの顕微鏡スライドに載せた。別の脳半球切片を、１：２００の濃度で、抗ＧＦＡＰ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ♯ＭＡＢ３４０２）で染色した。選択した切片をまた、Ｈ＆Ｅを用いて染色し、そして切片を顕微鏡で分析して、細胞浸潤のレベルおよび組織形態学の変化を評価した。ベクター注入の領域において選択された切片をまた、１０％の過酸化水素、続いて０．５％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０％血清中で一晩インキュベーションして、非特異的染色を除去した後に、免疫学的マーカーＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ６８で染色した。一次抗体（ＩｇＧネガティブコントロール、１次なしのネガティブコントロール、マウス抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ６８）を、２時間だけ適用した。ＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０中で５分、３回洗浄した後、抗マウスベクターエリート ＡＢＣキットを、各工程の間の５分間、３回の洗浄を伴いながら使用した。次いで可視化のために、ＤＡＢペルオキシダーゼキットを用いた。

【0153】

ベクター分布の体積を、注射した被殻にわたる連続的な脳切片における陽性βガラクトシダーゼ染色の領域を測定し、そして標準的な立体学的方法を適用して（カヴァリエリの原理を用いて）全体積範囲を推定することによって計算した。

【0154】

実施例２−ａ）従来の送達、およびｂ）より狭いゲージのデバイスおよび速い流速による少ない数の注射部位を用いた送達を用いた、パーキンソン病患者の運動被殻への投与後の、レンチウイルスベクターのパーキンソン病に対する有効性の比較
ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）と呼ばれる、パーキンソン病に対するレンチウイルスベクターに基づく処置の安全性および有効性を評価するための、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が進行中である。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）は、ドパミン生合成パスウェイの酵素をコードする３つの遺伝子を含む、ＥＩＡＶレンチウイルスベクターである。試験の一部として、パーキンソン病の症状を癒す、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の治療的可能性を、１）従来の投与方法、および２）連続注入方法を用いて評価した。従来の方法は、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび２３ゲージの針、および１μＬ／分の投与速度を用いて、５本の針経路を通じて各被殻に投与される、１２５μＬの全容積のベクターの注射を含む。全部で２５μＬのベクターを、経路に沿って分布する５μＬのベクターの５回の投入によって、各注射経路に沿って投与した。連続的な送達方法において、同じ全容積のベクターを、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよびより狭い２８ゲージの針を用いて投与した（１２５μＬ）。各被殻に３回の注射を行い、そしてベクターの連続注入を、３μＬ／分の増大した投与速度を用いて、各注射部位で行った。送達されたベクターの容積は、３つの注射部位で４２μＬ、４２μＬ、および４３μＬであった。注入法を用いたベクター投与の手術時間は、従来の方法と比較してほぼ半分であった。

【0155】

外科的手順は、両方の投与方法で、安全であり、そして全ての患者において十分許容された。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）または２つの投与方法のいずれかに関連して、いずれの患者においても重篤な有害事象は報告されなかった。

【0156】

試験の主要な有効性エンドポイントは、ベースラインのスコアと比較した、処置の６ヶ月後における、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ（ＵＰＤＲＳ）の運動パート（パートＩＩＩ）における改善であった。今までの運動機能における改善のまとめを、表３に示す（運動機能を、患者の「ＯＦＦ」状態において、すなわちパーキンソン病の薬物療法の停止後に、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ（ＵＰＤＲＳ）によって評価する）。従来の、断続的な、５−投入／経路方法を用いてＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を投与した患者のグループにおいて、ＵＰＤＲＳパートＩＩＩスコアにおける３４％の改善が６ヶ月において観察された。興味深いことに、連続注入法を用いて同じ全容積のベクターを投与した患者は、ＵＰＤＲＳパートＩＩＩスコアのより大きな改善を示し、処置後６ヶ月で４３％の改善に達した。

【0157】

【表3-1】

【0158】

【表3-2】

【0159】

それに加えて、患者は６ヶ月においてＵＰＤＲＳパートＩＩＩ「ＯＮ」スコアの平均２６％の改善を示した。患者の日誌データは、３．２時間の、問題となるジスキネジア無しに経口Ｌ−ドーパが有効であった時間における機能的改善の増大を示し、４．１時間の、経口Ｌ−ドーパが無効であった時間における減少を示した。

【0160】

上記結果は、連続注入方法が、以前に使用された、断続的、５−投入／経路方法と比較して、パーキンソン病において増大した有効性を提供することを示す。この理由は、注射した被殻におけるＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）ベクターの改善された分布のためであり得るが、これを生きた患者で評価することは不可能である。さらに、連続注入方法を用いたベクター投与の手術時間は、従来の方法と比較してほぼ半分であった。

【0161】

方法および材料
全ての患者に、両側性定位的注射を用いて、一般的な麻酔下で、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を線条体内に注射した。頭蓋ＭＲＩスキャンを、投与の前に行って、被殻の知覚運動性被殻領域を標的化するための正確な注射座標を提供した。

【0162】

各注射に関して、長さ１３０ｍｍ、口径１．２ｍｍのガイドチューブを、ＭＲＩによる座標を用いて、被殻に入れずに、脳内の正確な位置に挿入した。従来の投与方法に関して、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を、長さ１５０ｍｍの、２３ゲージのポイント２スタイルべベルノンコアリング（ｐｏｉｎｔ ｔｗｏ ｓｔｙｌｅ ｂｅｖｅｌｌｅｄ ｎｏｎ ｃｏｒｉｎｇ）針に連結したＨａｍｉｌｔｏｎシリンジにロードした。連続注入法に関して、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を、同じ長さの２８ゲージの針に連結したＨａｍｉｌｔｏｎシリンジにロードした。その針を、ガイドチューブを通して脳内に下ろし、そして運動被殻に貫入させた。次いでＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）の注入の前に、ガイドチューブを約１０ｍｍ引いた。脳の各半球に関して、新しいガイドチューブ、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび針を使用した。

【0163】

従来の投与方法に関して、２５μＬのＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を、両方の脳半球の５本の別々の経路のそれぞれに投与した。各経路に５μＬのＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を５回投入した。最も深い投入を最初に投与し、その針を次いで１ｍｍ引き、そして５μＬの２回目の投入を投与した。５回の投入全てを行うまで、これを繰り返した。５μＬを各経路にそって５つの投入部に注射するまで、１分あたり１μＬの速度で、各注射経路において手動で投与を行った（０．５μＬを注射し、続いて次の０．５μＬを注射する前に３０秒休止する、等）。単一の経路において５回の投入全てを終了した際に、針を１分間その部位に残した。

【0164】

連続注入法に関して、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を、半球あたり３本の注射経路に投与する。４２μＬ、４２μＬ、および４３μＬの容積のＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）を、３μＬ／分の一定の送達速度で、連続注入を用いて投与した。その流速を、従来の方法に関して上記で記載された手動のシステムではなく、ポンプの使用によって制御した。

【0165】

上記の明細書で述べた全ての刊行物は、本明細書中で参考として組込まれる。記載された本発明の方法およびシステムの様々な修飾および変形が、本発明の範囲および意図から離れることなく当業者に明らかである。本発明を、特定の好ましい実施態様に関連して記載したが、特許請求される本発明を、そのような特定の実施態様に過度に限定するべきではないことが理解される。実際、分子生物学、ウイルス学、神経学、または関連する分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な修飾が、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。

【図3(A)】

【図3(B)】

【図1】

【図2】