特許 5965846 近縁のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の血清型を検出するためのアッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5965846

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月10日

(54)【発明の名称】近縁のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の血清型を検出するためのアッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160728BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160728BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

【請求項の数】11

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2012-553988(P2012-553988)

(86)(22)【出願日】2011年2月16日

(65)【公表番号】特表2013-519395(P2013-519395A)

(43)【公表日】2013年5月30日

(86)【国際出願番号】US2011025046

(87)【国際公開番号】WO2011103159

(87)【国際公開日】20110825

【審査請求日】2014年2月14日

(31)【優先権主張番号】61/304,941

(32)【優先日】2010年2月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】595117091

【氏名又は名称】ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110001243

【氏名又は名称】特許業務法人 谷・阿部特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェン チー

(72)【発明者】

【氏名】ヒュー ジェイ．ペック

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ポーター

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー エー．リチャート

(72)【発明者】

【氏名】レイ エー．マクミリアン

【審査官】 長部 喜幸

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５００８５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０５７９９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５００９５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０１９９７９１４（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 Agnetha JOSEFSSON，Journal of Clinical Microbiology，１９９９年，Vol.37, No.3，Pages 490-496

【文献】 Nathalie YLITALO，Journal of Clinical Microbiology，１９９５年，Vol.33, No.7，Pages 1822-1828

【文献】 Francesco BROCCOLO，Journal of Virological Methods，２００８年，Vol.148，Pages 48-57

【文献】 Martin MOBERG，Journal of Clinical Microbiology，２００３年，Vol.41, No.7，Pages 3221-3228

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的試料におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の複数の血清型の存在または非存在を検出するマルチプレックスアッセイであって、
前記マルチプレックスアッセイは、存在する検出のためのチャネルより多くの血清型を検出し、
前記マルチプレックスアッセイが、
生物学的試料を用意するステップと；
前記生物学的試料を少なくとも第１、第２及び第３の３つのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのセットと接触させるステップであって、
そのセットの各々が、
検出可能な形で標識され、ヌクレオチド配列の長さが１０から２６である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、
それらの各々のヌクレオチド配列の長さが１０から２５である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーと、を備え、
前記接触が、プローブおよびプライマーが標的配列にアニーリングするような条件下で行われ、
各プライマー／プローブのセットは、生物の特定の血清型に対して少なくとも優先的であり、
前記第１のプライマー／プローブのセット及び第２のプライマー／プローブのセットは、互いに対して縮重しており、
前記縮重プローブは各々、同じチャネルにおいて検出可能なシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記他の２つのプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、前記縮重プライマー／プローブのセットが優先的にアニーリングする血清型ではない第３の血清型を識別し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記縮重プローブのシグナル部分により発せられる波長と同じまたは異なる波長のシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記縮重プライマー／プローブのセットの前記標的は、配列番号３６〜３８からなる群から選択される、ステップと；
存在する場合は、前記標的配列を増幅するステップと；
前記プローブセットの前記標的配列に対するハイブリダイゼーションの指標としての標識を検出のためにモニタリングし、これにより、ＨＰＶの血清型のうちの少なくとも１つの存在または非存在を示すステップと、
を含むことを特徴とするマルチプレックスアッセイ。

【請求項2】

請求項１に記載のマルチプレックスアッセイであって、
ａ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセット及び第２のプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択されるマルチプレックスアッセイ、
または、
ｂ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセット及び第２のプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３および１５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４および１６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択されるマルチプレックスアッセイ、
または
ｃ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセット及び第２のプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２および２３と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択されるマルチプレックスアッセイ。

【請求項3】

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の複数の血清型を検出するためのプローブセットであって、
該プローブセットが、少なくとも第１、第２及び第３の３つのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのセットを備え、
そのセットの各々が、
検出可能な形で標識され、ヌクレオチド配列の長さが１０から２６である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、各々のヌクレオチド配列の長さが１０から２５である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーとを備え、
各プライマー／プローブのセットは、前記ＨＰＶ生物の特定の血清型に対して少なくとも優先的であり、
前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットは、互いに対して縮重しており、前記縮重プローブは各々、同じチャネルにおいて検出可能なシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、前記縮重プライマー／プローブのセットが優先的にアニーリングする血清型ではない第３の血清型を識別し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットにおけるプローブの波長と同じかまたは異なる波長のシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６〜３８からなる群から選択される、ことを特徴とするプローブセット。

【請求項4】

請求項３に記載のプローブセットであって、
ａ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセット及び第２のプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択されるプローブセット、
または、
ｂ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセット及び第２のプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３、および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３、および１５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４および１６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択されるプローブセット、
または、
ｃ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセット及び第２のプライマー／プローブのセットのいずれに対しても縮重しておらず、前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２、および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２、および２３と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択されるプローブセット。

【請求項5】

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の複数の血清型を検出するためのキットであって、
該キットが、少なくとも第１、第２及び第３の３つのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのセットを備え、
そのセットの各々が、
前記ＨＰＶ生物の特定の血清型のための、検出可能な形で標識された、ヌクレオチド配列の長さが１０から２６である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、各々のヌクレオチド配列の長さが１０から２５である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーとを備え、
前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットは、互いに対して縮重しており、前記縮重プローブは各々、同じチャネルにおいて検出可能なシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記他の２つのプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、前記縮重プライマー／プローブのセットが優先的にアニーリングする血清型ではない第３の血清型を識別し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記縮重プライマー／プローブにおけるプローブのシグナル部分により発せられる波長と同じかまたは異なる波長のシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットおよび第２の縮重プライマー／プローブのセットについての、前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６〜３８からなる群から選択される、ことを特徴とするキット。

【請求項6】

請求項５に記載のキットであって、
ａ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号１と、３と、および５とを含み、
前記第２の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号２と、４と、および６とを含むキット、
または、
ｂ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号７と、配列番号１５と、ならびに配列番号９、１１、および１３のうちの１つとを含み、
前記第２の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号８と、配列番号１５と、ならびに配列番号１０、１２、および１４のうちの１つとを含むキット、
または、
ｃ）
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号１７と、１９と、および２１とを含み、
前記第２の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号１８と、配列番号２０と、ならびに配列番号２２および２３のうちの１つとを含むキット。

【請求項7】

前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２６、配列番号２７〜２９、配列番号３０〜３２、および配列番号３３〜３５からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のキット。

【請求項8】

前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別し、配列番号２４〜２６および配列番号２７〜２９からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のキット。

【請求項9】

前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別し、配列番号３０〜３２および配列番号３３〜３５からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のキット。

【請求項10】

前記第３のプライマー／プローブのセットの検出プローブの前記シグナル部分は、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび前記第２のプライマー／プローブのセットの検出プローブにより発せられる波長と同じ波長を発することを特徴とする請求項５に記載のキット。

【請求項11】

前記第３のプライマー／プローブのセットの検出プローブの前記シグナル部分は、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび前記第２のプライマー／プローブのセットの検出プローブにより発せられる波長と異なる波長を発することを特徴とする請求項５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年２月１６日に出願された、米国特許仮出願第６１／３０４，９４１号明細書の出願日の利益を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳウェブを介して提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１１年１月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ＨＰＶの類縁血清型を検出するための配列表」と名付けられ、サイズは７．５５キロバイトである。

【背景技術】

【0003】

８０種を超えるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が同定されている。ＨＰＶの異なる型は、良性の増殖性疣贅から悪性腫瘍に至る多様な生物学的表現型を引き起こす（総説として、非特許文献１を参照されたい）。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１が、良性の疣贅と関連することがきわめて一般的であるのに対し、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、悪性病変と最も高頻度で関連する、危険性の高い型である。したがって、臨床試料における特定のＨＰＶ型を決定することは、ＨＰＶ関連疾患を発症する危険性を予測するのにきわめて重要である。

【0004】

ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザンブロット解析、ハイブリッドキャプチャー、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるウイルス核酸の検出など、複数の核酸ベースの方法が、臨床試料における特定のＨＰＶ型を同定および定量化するのに用いられている。Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）アッセイは、抗体の捕捉および非放射性シグナルの検出を用いるが、所与のＨＰＶ型のセットのうちの単一の標的を検出するに過ぎない（例えば、非特許文献２を参照されたい）。加えて、Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）ＩＩアッセイは、ＲＮＡプローブのカクテル（プローブカクテルは、危険性の高いＨＰＶ型に対しても、危険性の低いＨＰＶ型に対しても使用可能である）を用いるため、試料において検出される特定のＨＰＶ型についての情報をもたらさず、危険性の高いＨＰＶまたは危険性の低いＨＰＶの存在についての陽性または陰性を示すに過ぎない。同様に、多くのＰＣＲベースの方法も、単一の特定のＨＰＶ標的配列を増幅した後に、結果として得られるアンプリコンを膜に転写し、放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブによりプローブするステップを伴うことが多い。

【0005】

他の方法は、試料中に存在する多くのＨＰＶ型をＰＣＲ増幅することが可能な市販のコンセンサスプライマーを用いることにより、特定の異なる型のＨＰＶ遺伝子間における高度の相同性を利用する。次いで、型特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、特定のＨＰＶ型の存在を同定する。例えば、非特許文献３、非特許文献４を参照されたい。同様に、縮重のＰＣＲプライマーを用いるアッセイも、ＨＰＶ型間の相同性を利用し、特定のプライマーセットを用いる方法より多数のＨＰＶ型の検出を可能とする。例えば、非特許文献５を参照されたい。このようなアッセイもまた、特定のＨＰＶ型を同定するのに、さらなる実験を必要とする。

【0006】

上記で説明したＰＣＲ法は、複数の問題と関連しうる。例えば、ＨＰＶ型における反応効率の差異は、結果として、一部の型の増幅を、他の型の増幅と比べて不均衡とする可能性がある。加えて、増幅についての平衡は、試料中に高コピー数で存在する型の方に偏り、この型によりＰＣＲ反応の成分が消費されるため、少数のＨＰＶ型がより増幅されにくくなる。

【0007】

当技術分野ではまた、リアルタイムのＰＣＲ産物の検出を可能とし、放射性物質の必要を排除する、５’エキソヌクレアーゼによる蛍光性のＰＣＲベースのアッセイ（Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲ）も説明されている。例えば、特許文献１、非特許文献６を参照されたい。この方法は、ＰＣＲプライマー間の標的ＤＮＡとハイブリダイズする、蛍光レポーター（フルオロフォア）およびクエンチャーを含む標識されたプローブを用いる。フルオロフォアの励起は、結果として、フルオロフォアによる蛍光シグナルの放出をもたらし、この蛍光シグナルは、クエンチャーにより消光される。ＰＣＲプライマーが伸長するときに遭遇する二本鎖ＤＮＡを分解し、これにより、プローブからフルオロフォアを放出する、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により、アンプリコンを検出することができる。その後、蛍光シグナルが消光されることはなく、標的ＤＮＡの量と正に相関する蛍光シグナルの蓄積を、自動式の蛍光測定器によりリアルタイムで検出することができる。

【0008】

Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲアッセイは、ＨＰＶ型の検出用に適合されている。非特許文献７は、Ｌ１遺伝子の一部を増幅する型特異的なＨＰＶプライマーを、型特異的なプローブと共に用いる、蛍光プローブアッセイについて開示している。Swanらのアッセイは、リアルタイムではなく、一定数のＰＣＲサイクルの終点で蛍光シグナルを測定する（終点測定）。

【0009】

非特許文献８は、異なる蛍光色素により標識された型特異的なプローブと共に、Ｅ１遺伝子の高度に保存的な部分を標的とするＴａｑ−Ｍａｎアッセイについて報告している。特異的プライマーと縮重プライマーとの混合物を用いることにより、多数のＨＰＶ型が増幅された。Josefssonらは、１つのアッセイ当たり最大で３つの型特異的なプローブを用い、これは、異なるＨＰＶ型に由来するＥ１遺伝子の部分を検出するように設計されていた。Swanらによるアッセイとは異なり、Josefssonらは、蛍光の蓄積をリアルタイムで測定した。

【0010】

非特許文献９は、Ｅ６／Ｅ７接合部にわたる保存領域を標的とするアッセイについて説明している。Josefssonによるアッセイと同様に、Tuckerらも、リアルタイムの検出、および型特異的な蛍光プローブを用いた。Tuckerらはまた、マルチプレックスＰＣＲを用いて、同じ反応チューブ内で、ＨＰＶ標的配列、および細胞内のアクチンの遺伝子座またはグロビンの遺伝子座を同時に検出した。

【0011】

ＨＰＶの検出に関する特定の難題のうちの１つは、臨床的な対象となるＨＰＶ型が多く存在するという事実である。ＨＰＶを検出するためのマルチプレックスアッセイが知られているが、これらのマルチプレックスアッセイは、検出のための比色チャネルの数により制限されている。これらのチャネルは、様々な光の波長（または波長の範囲もしくは帯域）である。各チャネルは、特定のチャネルの波長の光を発するシグナル部分により発せられるシグナルを検出する。したがって、検出されるＨＰＶ型の数は、アッセイにおいて明確に検出可能な、異なるシグナル部分の数により制限される。

【0012】

上記で説明したＨＰＶアッセイの開発にもかかわらず、感度および再現度が高く、当技術分野において開示されている方法と比較して必要とされる人的時間が低減されたマルチプレックスアッセイを開発することは有利であろう。ＨＰＶ型が多いことを踏まえるなら、存在するアッセイの検出チャネルより多くのＨＰＶ型を検出することが有用であろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】米国特許第５，５３８，８４８号明細書

【特許文献2】欧州特許出願公開第０６２４６４３号明細書

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】McMurray et al., Int. J. Exp, Pathol. 82(1): 15-33 (2001)

【非特許文献2】Clavel et al., British J. Cancer 80(9): 1306-11 (1999)

【非特許文献3】Kleter et al., Journal of Clinical Microbiology 37(8): 2508-2517 (1999)

【非特許文献4】Gravitt et al., Journal of Clinical Microbiology 38 (1): 357-361 (2000)

【非特許文献5】Harwood et al., Journal of Clinical Microbiology 37(11): 3545-3555 (1999)

【非特許文献6】Holland et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991)

【非特許文献7】Swan et al., Journal of Clinical Microbiology 35(4): 886-891 (1997)

【非特許文献8】Josefsson et al., Journal of Clinical Microbiology 37(3): 490-96 (1999)

【非特許文献9】Tucker et al., Molecular Diagnosis 6(1): 39-47 (2001)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は、Ｔａｑ−Ｍａｎ化学反応を活用して、存在する検出のためのチャネルより多くのＨＰＶ型を同時に検出する、リアルタイムのＰＣＲ増幅を対象とする。言い換えれば、Ｎ個のチャネルを伴うアッセイにおいて、検出されるＨＰＶ型の数は、少なくともＮ＋１個である。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本アッセイは、アッセイが検出するように構成されている各ＨＰＶ型を検出するためのプライマー／プローブのセットを活用する。本アッセイによる検出に対して感受性である多様な血清型には、例えば、ＨＰＶの３３型、３９型、５１型、５６型、５８型、５９型、６６型、および６８型が含まれる。当業者は、本明細書で説明されるプライマー／プローブのセットを、他のＨＰＶ型（例えば、１６型、１８型、および４５型）に対する他のプライマー／プローブのセットと組み合わせうることを理解するであろう。単一のプライマー／プローブセットを用いて、少なくとも１つの型を検出する。Ｔａｑ−Ｍａｎアッセイを用いるＰＣＲ増幅の状況では、プライマー／プローブのセットは、少なくとも、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブである。互いに対して縮重しているオリゴヌクレオチド配列を伴うプライマー／プローブ対のセットにより、少なくとも２つの型を選択する。本明細書で用いられる「縮重配列」とは、近縁の異なる型の同じ遺伝子の同じ遺伝子座と相補的であり、それらを２つの型に識別させるような、互いに対するわずかな配列のばらつきを有する、２つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブである。

【0017】

本発明の一実施形態では、縮重プライマー／プローブのセットが、ＨＰＶの３９型および６８型を検出するためのセットである。このプライマー／プローブのセットは、両方の型のＥ６遺伝子における同じ遺伝子座を標的とする。この標的の長さは９１ヌクレオチドであり、これを図１に示す。この標的は、Ｅ６遺伝子全体のうちの一セグメントであるに過ぎない。ＨＰＶの３９型および６８型の縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６である。好ましい実施形態では、両方のプローブのシグナル部分が、ＣＹ５として市販されているシアニン色素標識である。

【0018】

この実施形態では、縮重していないプライマー／プローブのセットが、ＨＰＶの５１型を識別する。５１型に対するプライマー／プローブのセットもまた、異なる遺伝子座においてであるが、Ｅ６遺伝子を標的とする。好ましい実施形態では、このプライマー／プローブのセットにおけるこのプローブのシグナル部分がＦＡＭであり、これについては以下で具体的に確認する。

【0019】

本発明の第２の実施形態では、縮重プライマー／プローブのセットが、ＨＰＶの３３型および５８型を検出するためのセットである。このプライマー／プローブのセットは、両方の型のＥ６遺伝子における同じ遺伝子座を標的とする。この標的の長さは１３８ヌクレオチドであり、これを図２に示す。この標的は、Ｅ６遺伝子全体のうちの一セグメントであるに過ぎない。ＨＰＶの３３型および５８型の縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７である。好ましい実施形態では、両方のプローブのシグナル部分が、ＦＡＭである。

【0020】

この実施形態では、縮重していないプライマー／プローブのセットが、ＨＰＶの５９型を識別する。５９型に対するプライマー／プローブのセットもまた、Ｅ６遺伝子を標的とするが、必ずしも同じ遺伝子座ではない。好ましい実施形態では、このプライマー／プローブのセットにおけるこのプローブのシグナル部分がＣＹ５であり、これについては以下で具体的に確認する。

【0021】

本発明の第３の実施形態では、縮重プライマー／プローブのセットが、ＨＰＶの５６型および６６型を検出するためのセットである。このプライマー／プローブのセットは、両方の型のＥ６遺伝子における同じ遺伝子座を標的とする。この標的の長さは７９ヌクレオチドであり、これを図３に示す。この標的は、Ｅ６遺伝子全体のうちの一セグメントであるに過ぎない。ＨＰＶの５６型および６６型の縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８である。好ましい実施形態では、両方のプローブのシグナル部分が、ＣＹ５である。

【0022】

この実施形態では、縮重していないプライマー／プローブのセットが、ＨＰＶの５９型を識別する。５９型に対するプライマー／プローブのセットは、Ｅ６遺伝子を標的とする。好ましい実施形態では、このプライマー／プローブのセットにおけるこのプローブのシグナル部分がＣＹ５であり、これについては以下で具体的に確認する。この実施形態では、ＨＰＶの５９型に用いられるシグナル部分と同じシグナル部分を、ＨＰＶの５６型＿６６型にもまた用いる。この実施形態では、同じ色素を同じチャネルに割り当てるので、ＨＰＶの５９型と、５６型＿６６型とは光学的に識別されることがない。

【0023】

この実施形態は、さらに別のＨＰＶ血清型に対するさらに別のプライマー／プローブのセット（縮重の場合もあり、識別性の場合もある）（例えば、ＨＰＶの３３血清型および５８血清型に対する縮重プライマー／プローブのセット）を活用するマルチプレックスアッセイを意図する。このＨＰＶの他の血清型に対するシグナル部分は、ＣＹ５ではなく、Ｃｙ５の発光波長とは検出可能な形で異なる波長で発光する（例えば、ＦＡＭ）。

【0024】

他の実施形態では、ＨＰＶの５９型に対するシグナル部分がＦＡＭであり、これは、ＨＰＶの５６血清型および６６血清型に対する縮重プライマー／プローブのセットに対するＣＹ５によるシグナル部分と光学的に識別されうる。

【0025】

代替的実施形態は、本明細書で説明されるプライマー／プローブのセットおよび縮重プライマー／プローブのセットによる任意の組合せおよびすべての組合せを伴うアッセイまたはプローブセットまたはキットを意図する。具体的に述べると、ＨＰＶ血清型であるＨＰＶ５１またはＨＰＶ５９に対するプライマー／プローブのセットのうちの任意のセットを、ＨＰＶ血清型であるＨＰＶ３９＿６８、ＨＰＶ３３＿５８、およびＨＰＶ５６＿６６に対する縮重プライマー／プローブのセットのうちの任意のセットと組み合わせることができる。具体的に述べると、ＨＰＶ５１に対するプライマー／プローブのセットを、ＨＰＶ３９＿６８、ＨＰＶ３３＿５８、およびＨＰＶ５６＿６６のうちの１または複数による縮重プライマー／プローブのセットと組み合わせるアッセイまたはプローブセットまたはキットを意図する。ＨＰＶ５９に対するプライマー／プローブのセットを、ＨＰＶ３９＿６８、ＨＰＶ３３＿５８、およびＨＰＶ５６＿６６のうちの１または複数による縮重プライマー／プローブのセットと組み合わせるアッセイまたはプローブセットまたはキットである。プローブのシグナル部分が同じ色素かまたは異なる色素である実施形態を意図する。マルチプレックスアッセイを意図するので、プライマー／プローブのセットを、ＨＰＶの他の血清型の存在または非存在を検出するように構成された他のプライマー／プローブのセットと組み合わせることができる。縮重プライマー／プローブのセットにおける検出プローブのシグナル部分が、ＨＰＶの５１血清型または５９血清型に対するプライマー／プローブのセットのシグナル部分と同じである実施形態では、マルチプレックスアッセイが、ＨＰＶの第４の血清型（例えば、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ４５など）に対する第４のプライマー／プローブのセットを包含し、この第４のプライマー／プローブのセットが、縮重プライマー／プローブのセットおよびＨＰＶ５１またはＨＰＶ５９のプライマー／プローブのセットの検出プローブのシグナル部分と異なるシグナル部分を有することを意図する。本明細書ではまた、１つのアッセイにおいて２つの縮重プライマー／プローブのセットを組み合わせるマルチプレックスアッセイも意図する。例えば、１つのマイクロウェルにおいて、ＨＰＶの３３血清型および５８血清型の存在を検出するための、第１の縮重プライマー／プローブのセットを、ＨＰＶの５６血清型および６６血清型の存在または非存在を検出するための、第２の縮重プライマー／プローブのセットと組み合わせることができる。これらの実施形態では、第１の縮重プライマー／プローブのセットのプローブが、第２の縮重プライマー／プローブのセットのシグナル部分の発光波長とは検出可能な形で異なる波長で発光するシグナル部分を有する。この例では、ＨＰＶの３３血清型および５８血清型に対するプローブのシグナル部分がＦＡＭであり、ＨＰＶの５６血清型および６６血清型に対するプローブのシグナル部分がＣＹ５となる。

【0026】

上記で説明したシグナル発生部分に加えて、プローブはまた、非蛍光性のダーククエンチャーも有する。適切なダーククエンチャーの一例は、ＢＨＱ（商標）１（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、これは、ＦＡＭフルオロフォアと共に用いるのに適する。適切なクエンチャーの別の例は、ＢＨＱ（商標）２（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、これは、ＣＹ５フルオロフォアと共に用いるのに適する。シグナル発生部分の他の例は当業者によく知られており、本明細書では詳述しない。

【0027】

本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的であるプライマーの伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれたとき、相補鎖に沿った合成の始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。このような条件は、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子であるか、またはイオン強度、ｐＨなどに影響を及ぼす成分を包含する）中で、適切な温度における、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合化誘導剤の存在を包含する。本明細書で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、精製された制限消化産物の場合のように、天然の場合もあり、または合成により作製される場合もある。増幅における効率を最大とするには、プライマーが一本鎖であることが好ましい。

【0028】

本明細書で用いられる「プライマー対」とは、ＰＣＲによるアンプリコンを生成させる核酸ポリメラーゼの存在下において、核酸のセグメントのＰＣＲ増幅に関与することが可能な、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの２つのプライマーを指す。プライマー対を含むプライマーは、同じＨＰＶ遺伝子に特異的であり、その結果として、単一のＨＰＶ遺伝子に由来するヌクレオチド配列からなるアンプリコンを生成させることが可能である。代替的に、プライマー対を含むプライマーは、ＨＰＶゲノム内で互いに対して近接する範囲内に位置する、異なるＨＰＶ遺伝子に特異的であり、これにより、複数の遺伝子に由来するヌクレオチド配列からなるアンプリコンを生成させることも可能である。

【0029】

本発明のフルオロフォアについて本明細書で用いられる「異なるイメージングスペクトル」とは、各フルオロフォアが、特定のアッセイで用いられる他のすべてのフルオロフォアと比べて異なる発光極大値においてエネルギーを発することを意味する。固有の発光極大値を伴うフルオロフォアを用いることにより、特定のアッセイにおいて用いられる複数のフルオロフォアの各々により発せられる蛍光エネルギーを同時に検出することが可能となる。

【0030】

本明細書で用いられる、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブについて使用される「識別性」という用語は、前記プライマーおよびプローブが、単一のＨＰＶ型に特異的であることを意味する。これは、単一のＨＰＶ型に特異的であるが、他のＨＰＶ型とある程度の相同性も共有するＨＰＶプライマーおよびＨＰＶプローブを包含する。本発明の「識別性」のプライマーおよびプローブは、少なくとも１ヌクレオチド以上において、他のＨＰＶ型との３’側における相同性を欠くオリゴヌクレオチドを包含する。特定の位置において特定のＨＰＶ型に固有であり、アライメントにおいてこのＨＰＶ型を他のＨＰＶ型から識別するように作用するこのような残基を、「識別性塩基」と称する。オリゴヌクレオチドについての「識別性」という用語は、複数のＨＰＶ型に特異的であるプライマーおよびプローブ、すなわち、複数のＨＰＶ型との完全な相同性を共有するプライマーおよびプローブを包含しない。この点において、本明細書で開示される縮重プライマー／プローブのセットは、それに対してこれらの縮重プライマー／プローブのセットが構成されるＨＰＶ型を識別しない。例えば、ＨＰＶの３９型および６８型を標的とする縮重プライマー／プローブのセットについて述べると、ＨＰＶの３９型に対するプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶの３９型をＨＰＶの６８型よりも優先するが、ＨＰＶの３９型をＨＰＶの６８型に対して識別するわけではない。縮重プライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ型を識別するわけではないため、プローブは、同じシグナル部分を有することが好ましい。アッセイは、凝集物におけるこれらのＨＰＶ型の存在または非存在を決定するように構成されているので、この目的で２つの光学的チャネルを用いる必要はない。さらに、マルチプレックスアッセイのための単一のマイクロウェルにおいて、縮重プライマー／プローブのセットを、他のプライマー／プローブのセットと混合する場合、他のプライマー／プローブのセット（識別性の場合もあり識別性でない場合もある）に対するシグナル部分は、同じ場合もあり、異なる場合もある。アッセイのシグナル部分は、大部分、設計の選択の問題である。当業者は、特定のＨＰＶ型が存在するかどうかを知る必要がある場合、同じマイクロウェルにおいて、プライマー／プローブのセットにおいて同じシグナル部分を用いるであろう。これらの型のうちの１つだけが存在するかどうかを知れば十分である場合は、異なるＨＰＶ血清型に対するプライマー／プローブのセットにおいて同じシグナル部分を用いることができる。

【0031】

本明細書で用いられる「アンプリコン」とは、核酸ポリメラーゼおよび特定のプライマー対の存在下において、核酸を含む試料をＰＣＲ増幅することにより生成させる、特定のＰＣＲ反応産物を指す。アンプリコンは、単一のＨＰＶ型の単一の遺伝子に由来するヌクレオチド配列からなる場合もあり、アンプリコンは、単一のＨＰＶ型の複数の遺伝子に由来するヌクレオチド配列からなる場合もある。

【0032】

本明細書で用いられる「プライマー／プローブのセット」とは、単一のＨＰＶ型の特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの対およびオリゴヌクレオチドプローブの組み分けを指す。前記オリゴヌクレオチドのセットは、（ａ）ＨＰＶ型の核酸配列の第１の位置とハイブリダイズする識別性のフォワードプライマー；（ｂ）第１の位置の下流にある、ＨＰＶ型の核酸配列の第２の位置とハイブリダイズする識別性のリバースプライマー；および（ｃ）これらのプライマー間に位置するＨＰＶ型の核酸配列とハイブリダイズする、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識された蛍光プローブからなる。言い換えれば、オリゴヌクレオチドのセットは、単一のＨＰＶ型に特異的なアンプリコンの合成を開始させることが可能な、特定のＰＣＲプライマーのセットと、このアンプリコンとハイブリダイズする蛍光プローブとからなる。

【0033】

本明細書で用いられる「複数」とは、２つ以上を意味する。

【0034】

オリゴヌクレオチドのセット、オリゴヌクレオチドプライマー、またはオリゴヌクレオチドプローブについて本明細書で用いられる「特異的にハイブリダイズする」とは、前記オリゴヌクレオチドのセット、オリゴヌクレオチドプライマー、またはオリゴヌクレオチドプローブが、単一のＨＰＶ型の核酸配列とハイブリダイズすることを意味する。

【0035】

本明細書で用いられる「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の生成に関与する核酸のセグメントを意味する。遺伝子は、翻訳配列（コード領域）、ならびに５’側の非翻訳配列および３’側の非翻訳配列（非コード領域）のほか、個別のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）も包含する。本発明の実施形態を説明する目的では、ＨＰＶゲノムが、複数の遺伝子：例えば、Ｌ１遺伝子、Ｌ２遺伝子、およびＥ１遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ４〜Ｅ７遺伝子を有する。

【0036】

本明細書で用いられる「遺伝子座」とは、形質に対応する遺伝子が存在する染色体上の位置を指す。遺伝子座という用語は、特定の遺伝子の対立遺伝子のうちのいずれか１つを包含する。遺伝子座はまた、異なるＨＰＶ型に由来する相同遺伝子も包含する。例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ６におけるＬ１遺伝子を検出するＰＣＲアッセイは、異なるＨＰＶ型に由来する配列を検出するにも関わらず、単一の遺伝子座についてのアッセイである。これに対し、例えば、単一のＨＰＶ型のＬ１遺伝子およびＥ１遺伝子を検出するアッセイは、単一のＨＰＶ型を検出するアッセイではあるが、多重遺伝子座アッセイである。

【0037】

本明細書で用いられる「ＨＰＶ」とは、ヒトパピローマウイルスを意味する。「ＨＰＶ」とは、現在知られているものであれ、以下で説明されるものであれ、任意の種類のＨＰＶを指すのに用いられる一般的な用語である。

【0038】

本明細書で用いられる「フルオロフォア」とは、レーザー、タングステン灯、水銀灯、もしくはキセノン灯、または発光ダイオードで励起されると、確定したスペクトルを有する光の形態でエネルギーを放出する蛍光レポーター分子を指す。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）過程において、フルオロフォアから発せられる光は、その励起スペクトルが、このフルオロフォアの発光スペクトルと重複する第２の分子を励起させうる。フルオロフォアの発光エネルギーが別の分子へと移動することにより、フルオロフォアの発光を消光させる。この第２の分子は、クエンチャー分子として知られている。本明細書では、「フルオロフォア」という用語が、「蛍光レポーター」という用語と互換的に用いられる。

【0039】

本明細書で用いられる「クエンチャー」または「クエンチャー分子」とは、フルオロフォアを含む蛍光プローブと連結されると、フルオロフォアにより発せられるエネルギーを受け取り、これにより、フルオロフォアの発光を消光させることが可能な分子を指す。クエンチャーは、蛍光性で、受け取ったエネルギーを光として放出する場合もあり、非蛍光性で、受け取ったエネルギーを熱として放出する場合もあり、プローブの長さに沿った任意の位置に結合させることができる。

【0040】

本明細書で用いられる「ダーククエンチャー」とは、非蛍光性クエンチャーを指す。

【0041】

本明細書で用いられる「プローブ」とは、該プローブのうちの少なくとも１つの配列による、標的領域内の配列または検出される領域内の配列との相補性のために、標的核酸内の配列と共に二重鎖構造を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。「プローブ」という用語は、フルオロフォアおよび結合させたクエンチャー分子を伴うかまたは伴わない、上記で説明したオリゴヌクレオチドを包含する。「蛍光プローブ」という用語は、フルオロフォアおよびクエンチャー分子を含むプローブを指す。

【0042】

本明細書で用いられる「ＦＡＭ」とは、フルオロフォアである、６−カルボキシフルオレセインを指す。

【0043】

本発明の他の実施形態は、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子領域に結合する、異なるオリゴヌクレオチド配列を用いる。本明細書で説明されるオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列（およびその相補鎖）に結合することが可能な配列を有する。本明細書で説明されるオリゴヌクレオチドはまた、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子の核酸配列を増幅することによる検出を容易とするように、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。一実施形態では、遺伝子の標的部分において、Ｔａｑ−Ｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを実施するようにプローブを設計する。Ｔａｑ−Ｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイに用いられる３つの縮重プローブのセット（それらのオリゴヌクレオチド配列との関係で説明される）の例については、以下で説明する。

【0044】

具体的に述べると、第１の縮重プライマー／プローブのセットがＨＰＶの３９型および６８型に対するセットである第１の実施形態では、ＨＰＶの３９型を優先するプライマー／プローブのセットが、配列番号１、３および５である。ＨＰＶの６８型を優先するプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６である。配列番号１および２はいずれも、Ｔａｑ−Ｍａｎのフォワードプライマーであり、互いに対して縮重している。配列番号３および４はいずれも、Ｔａｑ−Ｍａｎのリバースプライマーであり、互いに対して縮重している。配列番号５および６はいずれも、Ｔａｑ−Ｍａｎのプローブであり、互いに対して縮重している。ＨＰＶの３３型および５８型に対する縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号７〜１６であり、これには、２つの代替的なリバースプライマーの配列が含まれるが、配列番号１３および１４が好ましい。ＨＰＶの５６型および６６型に対する縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号１７〜２３である。ＨＰＶの５１血清型を選択するかまたは識別するプライマー／プローブの配列は、配列番号２４〜２９である。ＨＰＶの５９型を選択するかまたは識別するプライマー／プローブの配列は、配列番号３０〜３５である。上記で言及したすべての配列を、以下の表１に列挙する。以下の表では、「Ｄ」を検出物質とし、「ＦＰ」をフォワードプライマーとし、「ＲＰ」をリバースプライマーとする。

【0045】

【表1】

【0046】

【表2】

【0047】

【表3】

【0048】

上記の表に記載したプライマー／プローブのセットの標的領域の位置を、以下の表１Ａに記載する。

【0049】

【表4】

【0050】

縮重プライマー／プローブのセットの標的領域間には配列の相同性が存在するが、これらの領域の座標は、遺伝子型に依存する。

【0051】

さらなる実施形態では、本方法は、異なるが近縁の２つのＨＰＶ型を選択するための少なくとも１つの縮重プライマー／プローブのセットと、第３のＨＰＶ型を識別するプライマー／プローブのセットとを用いて試料を処理する工程を含む。この場合、縮重プローブのシグナル部分は同じ波長のシグナルを発し、好ましくは、２つの縮重プローブでシグナル発生部分は同じである。第３のＨＰＶ型を識別するプライマー／プローブのセットのシグナル発生部分は、縮重プローブのシグナル発生部分により発せられる波長とは異なり、したがって、個別に検出可能である波長のシグナルを発する。これらのプライマー／プローブのセットは、増幅された核酸産物の存在または非存在を検出するための核酸増幅反応において用いられる。

【0052】

別の実施形態では、ＨＰＶを検出するためのキットが提供される。該キットは、異なるが近縁の２つのＨＰＶ型を選択する少なくとも１つの縮重プライマー／プローブのセットと、第３のＨＰV型を識別するプライマー／プローブのセットとを包含する。この場合、縮重プローブのシグナル部分は、同じ波長のシグナルを発し、好ましくは、２つの縮重プローブでシグナル発生部分は同じである。第３のＨＰＶ型を識別するプライマー／プローブのセットのシグナル発生部分は、縮重プローブのシグナル発生部分により発せられる波長とは異なり、したがって、個別に検出可能である波長のシグナルを発する。プライマー／プローブのセットは、その生物を検出するのに用いることができる標的配列を増幅することが可能である。キットには、増幅アッセイを実施するためのオリゴヌクレオチドのうちの１または複数、および緩衝剤試薬が備えられている。

【0053】

キットのさらに別の態様では、Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲを目的とするオリゴヌクレオチドおよび試薬を提供することができる。この態様では、３つのオリゴヌクレオチドが提供される。３つのオリゴヌクレオチドのうちの２つは、増幅プライマーであり、第３のオリゴヌクレオチドは、検出物質として構成されている。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】ＨＰＶの６８型のＥ６遺伝子の標的領域を示し、この標的配列の、ＨＰＶの６８型の各種の突然変異、ＨＰＶの３９型及びＨＰＶの３９型の突然変異における縮重を、ＨＰＶの３９型および６８型に対する縮重プライマー／プローブのセットと共に概略的に示す図である。

【図2A】ＨＰＶの３３型のＥ６遺伝子の標的領域を示し、この標的配列の、ＨＰＶの３３型の各種の突然変異、ＨＰＶの５８型及びＨＰＶの３３型の突然変異における縮重を、ＨＰＶの３３型および５８型に対する縮重プライマー／プローブのセットと共に概略的に示す図である。

【図2B】ＨＰＶの３３型のＥ６遺伝子の標的領域を示し、この標的配列の、ＨＰＶの３３型の各種の突然変異、ＨＰＶの５８型及びＨＰＶの３３型の突然変異における縮重を、ＨＰＶの３３型および５８型に対する縮重プライマー／プローブのセットと共に概略的に示す図である。

【図3】ＨＰＶの６６型のＥ７遺伝子の標的領域を示し、この標的配列の、ＨＰＶの６６型の各種の突然変異、ＨＰＶの５６型及びＨＰＶの５６型の突然変異における縮重を、ＨＰＶの５６型および６６型に対する縮重プライマー／プローブのセットと共に概略的に示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

本明細書で説明されるオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブのセットは、とりわけ、ＨＰＶ型を選択または識別する目的で設計される。具体的に述べると、近縁の２つのＨＰＶ型のうちの１つを何らかの形で選択する縮重プライマー／プローブのセットを、前記近縁のＨＰＶ型とは異なる、第３のさらなるＨＰＶ型を識別する、少なくとも１つの他のプライマー／プローブのセットと組み合わせる。

【0056】

試料中に特定のＨＰＶ型が存在する場合は、プライマー／プローブのセットが、検出可能なシグナルをもたらす。

【0057】

好ましい実施形態では、他の方法（例えば、ＴＭＡ法およびＬＣＲ法）もまた意図されるが、ＰＣＲ（例えば、Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲ）である検出法が用いられる。さらに、存在する検出のためのチャネルより多くのＨＰＶ型を検出するためのキットも開示される。

【0058】

図１に言及すると、ＨＰＶ型に特異的な縮重プライマー／プローブのセットが、図示されるＥ６遺伝子の標的領域とのアライメントとの関連で記載されている。図１は、フォワードプライマー領域１０、Ｔａｑ−Ｍａｎ検出領域２０、およびリバースプライマー領域３０を示す。図１はまた、縮重フォワードプライマー１１、１２、縮重リバースプライマー３１、３２、ならびに縮重プローブ２１および２２も、標的配列４０におけるそれらの対応する領域との関連で示す。ボックス６０、７０、および８０には、標的配列４０における、フォワードプライマー領域、リバースプライマー領域、および検出プローブ領域に対する変化だけを示す。これらの領域間における配列の縮重に注目すると、このことから、これらの領域では配列の変化が増大するために、これらの領域はそれほど望ましくないことを観察することができる。

【0059】

例えば、ボックス６０では、ボックス６０により枠囲いされた標的配列４０の部分と、ＨＰＶの３９型標的の同じＥ６部分との間に一塩基多型（Ｔ、Ｃ）が見られることに注目されたい。ボックス６０、７０、および８０は、ＨＰＶの６８型および３９型の異なる株の標的に対する塩基多型を示す。これらの異なる株、ならびに塩基多型（標的に対する）の数および位置を、表２で報告する。

【0060】

【表5】

【0061】

ＨＰＶ３９のフォワードプライマー１１は、ＨＰＶ６８のフォワードプライマー１２に対して一塩基多型を有し、したがってこれに対して縮重している。フォワードプライマー１１を配列番号１とし、フォワードプライマー１２を配列番号２とする。２つの配列間における縮重が容易に観察される。
ＣＣＡＣＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＡＴＣ
ＣＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＣＡＡＴＣ
下線を付すことにより各縮重を示す。

【0062】

縮重は、フォワードプライマーには、ＨＰＶの３９型に結合することを優先させ、フォワードプライマー１２には、ＨＰＶの６８型に結合することを優先させる。縮重プライマー／プローブのセットは、１つのＨＰＶ型の標的に結合することを、他の型の標的に結合することより優先するが、識別するわけではない。図について述べると、プライマー／プローブのセットは、標的との関連で記載されている。ボックス６０、７０、および８０は、ボックス６０、７０、および８０により枠囲いされる標的領域４０との関連で、ＨＰＶの３９型および６８型における縮重についての情報を含有する。これは、位置の指示であり、ハイブリダイゼーションの指示ではない。具体的に述べると、リバースプライマー３１および３２（配列番号３および４）は、標的４０のそれらの対応する位置において、これらの配列の逆相補体である配列を有する。同様に、検出プローブ２１および２２（配列番号５および６）は、標的４０のそれらの対応する位置において、これらの配列の逆相補体である。フォワードプライマー１１および１２（配列番号１および２）は、標的４０のそれらの対応する位置における配列に対して相同である。

【0063】

図２Ａ〜Ｂは、図１と同様であるが、ＨＰＶの３３型および５８型を選択する縮重プライマー／プローブのセットについての図である。ボックス１６０、１７０、および１８０は、ＨＰＶの３３型および５８型の異なる株の標的に対する塩基多型を示す。これらの異なる株、ならびに塩基多型（標的に対する）の数および位置を、表３で報告する。多型の位置は、図２に示す。

【0064】

【表6】

【0065】

図２Ａ〜Ｂは、フォワードプライマー領域１１０、Ｔａｑ−Ｍａｎ検出領域１２０、およびリバースプライマー領域１３０を示す。図２Ａ〜Ｂはまた、縮重フォワードプライマー１１１、１１２、縮重リバースプライマー１３１、１３２、ならびに縮重プローブ１２１および１２２も、標的配列１４０におけるそれらの対応する領域との関連で示す。ボックス１６０（図２Ａ）、ボックス１７０および１８０（図２Ｂ）には、標的配列１４０における、フォワードプライマー領域、リバースプライマー領域、および検出プローブ領域に対する変化だけを示す。

【0066】

例えば、ボックス１６０では、ボックス６０により枠囲いされた標的配列１４０の部分と、ＨＰＶの３３型標的の同じＥ６部分との間に一塩基多型（Ｔ、Ｇ、Ｇ）が見られることに注目されたい。しかし、ＨＰＶ５８のフォワードプライマー１１２は、ＨＰＶ３３のフォワードプライマー１１１に対して３つの一塩基多型を有し、したがってこれに対して縮重している。フォワードプライマー１１１を配列番号７とし、フォワードプライマー１１２を配列番号８とする。２つの配列間における縮重が容易に観察される。
ＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡ
ＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＧＡＣＡ
下線を付すことにより各縮重を示す。

【0067】

縮重は、フォワードプライマー１１１には、ＨＰＶの３３型に結合することを優先させ、フォワードプライマー１１２には、ＨＰＶの５８型に結合することを優先させる。縮重プライマー／プローブのセットは、１つのＨＰＶ型の標的に結合することを、他の型の標的に結合することより優先するが、識別するわけではない。図について述べると、プライマー／プローブのセットは、標的との関連で記載されている。ボックス１６０、１７０、および１８０は、ボックス１６０、１７０、および１８０により枠囲いされる標的領域１４０との関連で、ＨＰＶの３３型および５８型間における縮重についての情報を含有する。これは、位置の指示であり、ハイブリダイゼーションの指示ではない。具体的に述べると、リバースプライマー１３１および１３２（配列番号１３および１４）は、標的１４０のそれらの対応する位置において、これらの配列の逆相補体である配列を有する。同様に、検出プローブ１２１および１２２（配列番号１５および１６）は、標的１４０のそれらの対応する位置において、これらの配列の逆相補体である。フォワードプライマー１１１および１１２（配列番号７および８）は、標的１４０のそれらの対応する位置における配列に対して相同である。

【0068】

図３は、図１および２と同様であるが、ＨＰＶの５６型および６６型を選択する縮重プライマー／プローブのセットについての図である。図３は、フォワードプライマー領域２１０、Ｔａｑ−Ｍａｎ検出領域２２０、およびリバースプライマー領域２３０を示す。ボックス２６０、２７０、および２８０は、ＨＰＶの６６型および５６型の異なる株の標的に対する塩基多型を示す。これらの異なる株、ならびに塩基多型（標的に対する）の数および位置を、表２で報告する。

【0069】

【表7】

【0070】

図３はまた、縮重フォワードプライマー２１１、２１２、縮重リバースプライマー２３１、２３２、ならびに縮重プローブ２２１および２２２も、標的配列２４０におけるそれらの対応する領域との関連で示す。ボックス２６０、２７０、および２８０には、標的配列２４０における、フォワードプライマー領域、リバースプライマー領域、および検出プローブ領域に対する変化だけを示す。

【0071】

例えば、ボックス２６０では、ボックス２６０により枠囲いされた標的配列２４０の部分と、ＨＰＶ６６標的およびＨＰＶ５６標的との間に２つの一塩基多型（Ｔ、Ｃ）が見られることに注目されたい。しかし、ＨＰＶ５６のフォワードプライマー２１１２は、ＨＰＶ６６のフォワードプライマー２１１に対して一塩基多型を有し、したがってこれに対して縮重している。フォワードプライマー２１１を配列番号１７とし、フォワードプライマー２１２を配列番号１８とする。２つの配列間における縮重が容易に観察される。
ＡＣＣＴＡＡＴＡＣＡＣＧＴＡＣＣＴＴＧＴＴ
ＡＣＣＴＡＡＴＴＣＡＣＧＴＡＣＣＴＴＧＴＴ
下線を付すことにより各縮重を示す。

【0072】

縮重は、フォワードプライマー２１１には、ＨＰＶの５６型に結合することを優先させ、フォワードプライマー２１２には、ＨＰＶの６６型に結合することを優先させる。縮重プライマー／プローブのセットは、１つのＨＰＶ型の標的に結合することを、他の型の標的に結合することより優先するが、識別するわけではない。図について述べると、プライマー／プローブのセットは、標的との関連で記載されている。ボックス２６０、２７０、および２８０は、ボックス２６０、２７０、および２８０により枠囲いされる標的領域２４０との関連で、ＨＰＶの５６型および６６型における縮重についての情報を含有する。これは、位置の指示であり、ハイブリダイゼーションの指示ではない。具体的に述べると、リバースプライマー２３１および２３２（配列番号１９および２０）は、標的２４０のそれらの対応する位置において、これらの配列の逆相補体である配列を有する。同様に、検出プローブ２２１および２２２（配列番号２２および２３）は、標的２４０のそれらの対応する位置において、これらの配列の逆相補体である。フォワードプライマー２１１および２１２（配列番号１７および１８）は、標的２４０のそれらの対応する位置における配列に対して相同である。具体的には論じないが、縮重プライマー／プローブのセットにおけるリバースプライマー間の縮重およびプローブ間の縮重も容易に観察される。

【0073】

本明細書で説明される縮重プライマー／プローブのセットの例に加えて、当業者は、本明細書における説明および添付図に基づいて、縮重プライマー／プローブのセットを設計しうる、近縁の血清型の他の標的領域も同定することができるであろう。図により容易に観察される通り、所望の標的領域は、個別の血清型の間に数個の多型を有するであろう。存在する多型には、本明細書で説明される形と一致する縮重プライマー／プローブのセットを設計する中で対処することができる。

【0074】

以下で説明される通り、プライマーおよびプローブは、標的配列の領域との相補性が１００％未満であるが、これらの領域に結合しうる。必須の相補性の程度は、結合条件の厳密性を含めた多様な因子に依存する。用いられる厳密性の条件に応じて、プライマーおよびプローブを、それらの配列内に異なる塩基を包含し、なおも標的の核酸領域に結合するのに十分な程度に相補的であるように改変することができる。本明細書で用いられる十分な程度の相補性には、７０％以上の相補性が含まれる。好ましい実施形態では、プライマー／プローブの標的配列に対する相補性は、これらのプライマー／プローブの結合部分の全長の少なくとも８０％である。プライマーおよびプローブの標的配列に対する相補性は、９０％以上であることがより好ましい。

【0075】

言い換えれば、本発明は、本明細書において配列番号により具体的に同定されるプライマーおよびプローブと少なくとも７０％の相同性を有するプライマーおよびプローブを意図する。好ましい実施形態では、本明細書において配列番号により具体的に同定されるプライマーおよびプローブと少なくとも８０％の相同性を有するプライマー／プローブが意図される。より好ましくは、本明細書において配列番号により具体的に同定されるプライマーおよびプローブと少なくとも９０％の相同性を有するプライマーおよびプローブが意図される。

【0076】

本明細書で説明されるオリゴヌクレオチドは、それらが識別するＨＰＶ標的のそれぞれの部分に結合するのに十分な程度に相補的でなければならないが、ある時点において、オリゴヌクレオチドの配列の標的に対する相補性が低下し、他の核酸配列に結合する可能性もあることが認識される。したがって、オリゴヌクレオチドプローブが、標的遺伝子のそれぞれの部分との十分な相補性を維持し、それぞれの標的結合部位に対する選択性を失わないことが望ましい。

【0077】

オリゴヌクレオチドによる増幅プライマー内の標的結合配列は一般に、その３’端に位置する。標的結合配列は、約１０〜２５ヌクレオチドの長さであることが可能であり、増幅プライマーとのハイブリダイゼーションの特異性を有することが可能である。したがって、当業者は、標的結合配列を変化させて、増幅プライマーのハイブリダイゼーションの特異性を効果的に変化させ、代替的な配列とハイブリダイゼーションさせることができることが理解される。

【0078】

当業者には、増幅アッセイにおいて用いられるオリゴヌクレオチドが、有用性または標的配列への特異性を失わずに、ある程度改変しうることが理解される。例えば、当技術分野で知られている通り、ハイブリダイゼーションの条件を、厳密性を増大または減少させるように調整することにより（すなわち、ハイブリダイゼーションの温度または緩衝液の塩含量を調整することにより）、相補的な核酸配列および部分的に相補的な核酸配列のハイブリダイゼーションを得ることができる。開示される配列に対するこのようなわずかな改変、およびハイブリダイゼーションの条件に対する任意の必要な調整により標的特異性を維持するのに要求されるのは、常法に従う実験だけであり、当技術分野の範囲内にある。

【0079】

プライマーとして有用なオリゴヌクレオチドを設計するときの一般的な指針として述べると、配列の相同性を１％低下させるごとに、Ｔ_ｍを約１℃〜１．５℃低下させる。温度範囲は、約６０℃と約７０℃との間で変化させうるが、プライマーは、６０℃±４℃で最適であるように設計する場合があり、プローブは、７０℃±４℃で最適であるように設計するのが場合がある。増幅プライマーを設計する場合のさらなる考慮点は、グアニンおよびシトシンの含量でありうる。一般に、プライマーのＧＣ含量は、約６０〜７０％でありうるが、またこれ未満とすることも可能であり、当業者により適切に調整されうる。アニーリングの条件を、厳密性を増大または減少させるように調整することにより（すなわち、アニーリングの温度または緩衝液の塩含量を調整することにより）、相補的な核酸配列および部分的に相補的な核酸配列のアニーリングを得ることができる。開示される配列に対するこのような改変、およびアニーリングの条件に対する任意の必要な調整により標的特異性を維持するのに要求されるのは、常法に従う実験だけであり、当技術分野の範囲内にある。

【0080】

Walkerら、上記により教示されている通り、本明細書で説明されるプライマーを用いる増幅反応は、チミンを組み込むことも可能であり、例えば、特許文献２において教示されている通り、後続の増幅反応による交差汚染を低減するのに、反応において、ＴＴＰを、２’−デオキシウリジン５’−三リン酸で完全にまたは部分的に置換することも可能である。ｄＵ（ウリジン）を増幅産物に組み込み、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理することによりこれを切除することができる。これらの無塩基部位により、この増幅産物は、後続の増幅反応において増幅不可能となる。後続の増幅を実施する前に、ＵＤＧを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）により不活化して、新たに形成された増幅産物におけるｄＵの切除を防止することができる。

【0081】

本発明で用いるのに意図されるＰＣＲ ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｇ、またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製のＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ_Ｒ（商標）（エクソ）ＤＮＡが用いられる）。プローブは、ＰＣＲ増幅プライマーの下流において、標的とハイブリダイズする。下流におけるエンドヌクレアーゼによる合成がプライマーから進行するにつれて、プライマー間に配置されるプローブが置換される。熱サイクリングが、ＰＣＲによる増幅の特徴であるので、増幅のエンドポイントにおいて検出するには、プライマーのアニーリングおよび伸長の最終サイクルの後の低温において、制限エンドヌクレアーゼを添加することが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温のフェーズを経ても活性を維持する、好熱性の制限エンドヌクレアーゼを増幅において存在させ、リアルタイムアッセイをもたらすことも可能であろう。二次構造が直鎖化され、色素対が分離されれば、蛍光の消光が低減されるので、強度などの蛍光パラメータの変化が、標的増幅の指標として用いられる。

【0082】

検出プローブのオリゴヌクレオチドの変性または直鎖化から生じる蛍光の変化は、反応内の選択されるエンドポイントにおいて検出することができる。しかし、二次構造の直鎖化は、ハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長と同時にもたらされるため、蛍光の変化もまた、反応が生じるのにつれて、すなわち、「リアルタイム」でモニタリングすることができる。この均一でリアルタイムのアッセイフォーマットを用いて、存在する標的の初期量について、半定量的情報または定量的情報をもたらすことができる。標的配列の初期コピーがより多く存在すれば、ドナーの蛍光は、選択した閾値に、より迅速に到達する（すなわち、陽性までの時間が短縮される）。アクセプターの蛍光が低減される場合も同様に、選択した最小値に到達するのに必要とされる時間として検出される、陽性までの時間が短縮される。加えて、反応経過における蛍光パラメータの変化速度も、含有する標的の初期量が低量である試料におけるより、含有する標的の初期量が多量である試料においてより迅速となる（すなわち、蛍光曲線の傾きが増大する）。当技術分野において知られるこれらの測定または他の測定は、標的の存在の指標として、または標的の増幅の指標として行うことができる。標的の初期量は、実験結果を、標的の既知量についての結果と比較することにより決定することが典型的である。

【0083】

本発明の方法による、選択された標的配列の存在についてのアッセイは、溶液中で実施することもでき、固相上で実施することもできる。検出プローブのオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能するリアルタイムの均一アッセイまたはエンドポイントにおける均一アッセイは、溶液中で実施することが典型的である。本発明の検出プローブオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションアッセイはまた、溶液中でも実施しうる（例えば、均一なリアルタイムアッセイとして）が、また、リアルタイムで標的を検出するかまたはエンドポイントで標的を検出するための固相アッセイにも特に好適である。固相アッセイでは、当技術分野で知られる方法を用いる内部標識または末端標識を介して、検出プローブのオリゴヌクレオチドを、固相（例えば、ビーズ、膜、または反応容器）上に固定化することができる。例えば、ビオチンで標識化した検出プローブのオリゴヌクレオチドを、アビジンで修飾した固相上に固定化することができ、この固相において、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的に曝露すると、この検出プローブのオリゴヌクレオチドは、蛍光の変化をもたらす。このようにして標的を捕捉することにより、試料から標的を分離することが容易となり、シグナルの検出またはアッセイの他の側面に干渉しうる、試料中の物質の除去が可能となる。

【0084】

製品化の便宜のため、ＨＰＶの核酸を特異的に検出および同定するのに有用なオリゴヌクレオチドを、キットの形態でパッケージ化することができる。このようなキットは、本明細書で説明される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含有することが典型的である。また、核酸増幅反応を実施するための試薬も、ＨＰＶ特異的なオリゴヌクレオチドと共に含めることができる。例えば、緩衝液、他のオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド三リン酸、酵素なども含めることができる。キットの構成要素は、共通の容器内に併せてパッケージ化することができる。場合によって、本発明の方法の具体的な実施形態を実施するための１つの実施形態の記載を例示する指示書も含めることができる。また、他の任意選択の構成要素、例えば、アッセイプローブとして用いるのに適する標識をタグ付したオリゴヌクレオチド、および／またはこの標識を検出するための試薬もしくは手段も、キット内に含めることができる。

【0085】

さらに、キットは、オリゴヌクレオチドおよび試薬を、乾燥形式で包含する場合もあり、液体形式で包含する場合もある。乾燥形式とすれば、キットの構成要素を、より安定的なものとすることができ、容易に操作することができる。キットの乾燥させた構成要素を、マイクロ滴定プレート、マイクロアレイ、または他の適切な容器などの固相に対して添加または前処理することもでき、この場合、試料および緩衝液を添加しさえすればよい。この形式は、複数の試料を同時にアッセイすることを容易とし、ハイスループット法において有用である。ＢＤによるＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）装置およびＶｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ装置を用いることができる。

【0086】

以下の実施例は、本明細書で説明される本発明の具体的な実施形態を例示する。当業者には明らかである通り、各種の変化および改変が可能であり、これらは、説明される本発明の範囲内にあることが意図されている。

【実施例】

【0087】

表１のプライマー／プローブのセットを用いる、「ＨＰＶを検出するためのＴａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲシステム」を、以下で実施例としてさらに説明する。上記の表１に記載したプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶの３９型、および６８型、および５１型に対して、Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲを実施するために設計した。具体的に述べると、第１の縮重プライマー／プローブのセットがＨＰＶの３９型および６８型に対するセットである第１の実施形態では、ＨＰＶの３９型を優先するプライマー／プローブのセットが、配列番号１、３および５である。ＨＰＶの６８型を優先するプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６である。

【0088】

Ｔａｑ−ＭａｎリアルタイムＰＣＲは、定量的ＰＣＲの一種である。Ｔａｑ−Ｍａｎでは、２０〜２６ヌクレオチドの一本鎖のオリゴヌクレオチドであり、２つのＰＣＲプライマーの間にあるＤＮＡ配列だけに結合するように設計されている、蛍光性プローブを用いる。Ｔａｑ−Ｍａｎでは、レポーター色素およびクエンチャー色素を、プローブに結合させている。温度を交互に変化させてＤＮＡを変性させ、再アニーリングさせることにより、プローブをＤＮＡにアニーリングさせる。Ｔａｑポリメラーゼにより、ヌクレオチドが標的ＤＮＡに付加され、これにより、鋳型のＤＮＡからＴａｑ−Ｍａｎプローブが除去される。レポーター色素が、クエンチャー色素から分離されると、レポーター色素は、検出可能であるエネルギーを発する。このエネルギーは、コンピュータにより定量化され、これにより、標的が検出されたことを示すシグナルがもたらされる。Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲにおいて蛍光シグナルを発生させうるのは、特異的なＰＣＲ産物だけである。

【0089】

本明細書の例では、熱サイクリングが意図される。９５℃で１５分間にわたる最初の変性ステップの後、標的の存在または非存在を検出するための、プライマー／プローブのセットと試料とのＰＣＲ混合物を、４０サイクルにわたり、５５℃で１分間の後、９５℃で３０秒間の熱サイクルにかける。

【0090】

Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲを実施するには、好ましい産物サイズを５０〜１５０塩基対とする２つのＰＣＲプライマーと、蛍光レポーターまたはフルオロフォア（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ））、ならびにその５’端および３’端に共有結合により結合させた、テトラメチルロダミン（ＴＡＭＲＡ）などのクエンチャー、または既に説明したようなダーククエンチャーを伴うプローブとを用いる。適切な蛍光レポーターおよびフルオロフォアはよく知られており、本明細書では詳述しない。

【0091】

【表8】

【0092】

プローブは、表に記載されるＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子内のＯＲＦ位置にアニーリングするように設計する。これについて、ＨＰＶ５９に対するプライマープローブ／セットのＯＲＦ位置を、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の両方について、以下の表に列挙する。

【0093】

【表9】

【0094】

プライマーおよびプローブに加えて、Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲは、データを解析するためのリアルタイムＰＣＲ装置のみならず、通常のＰＣＲに用いられる試薬（例えば、ポリメラーゼ、遊離ヌクレオチド）も必要とする。これらの試薬および装置は、当業者によく知られており、本明細書では詳述しない。
以下、本明細書に記載の発明につき列記する。
［１］
生物学的試料における生物の複数の血清型の存在または非存在を検出するマルチプレックスアッセイであって、
前記アッセイは、存在する検出のためのチャネルより多くの血清型を検出し、
前記マルチプレックスアッセイが、
生物学的試料を用意するステップと；
前記生物学的試料を少なくとも３つのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのセットと接触させるステップであって、
そのセットの各々が、
検出可能な形で標識されており、ヌクレオチド配列の長さが約１０から約５０である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、
それらの各々のヌクレオチド配列の長さが約１０から約１５０である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーとを備え、
前記接触が、プローブおよびプライマーが標的配列にアニーリングするような条件下で行われ、
各プライマー／プローブのセットは、生物の特定の血清型に対して少なくとも優先的であり、
前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットは、互いに対して縮重しており、
前記縮重プローブは各々、同じチャネルにおいて検出可能なシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記他の２つのプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、前記縮重プライマー／プローブのセットが優先的にアニーリングする血清型ではない第３の血清型を識別し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記縮重プローブのシグナル部分により発せられる波長と同じまたは異なる波長のシグナルを発するシグナル部分を有する、ステップと；
存在する場合は、前記標的配列を増幅するステップと；
前記プローブセットの前記標的配列に対するハイブリダイゼーションの指標としての標識を検出のためにモニタリングし、これにより、ＨＰＶの血清型のうちの少なくとも１つの存在または非存在を示すステップと、
を含むことを特徴とするマルチプレックスアッセイ。
［２］
前記生物はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であることを特徴とする［１］に記載のアッセイ。
［３］
前記縮重プライマー／プローブのセットの前記標的は、配列番号３６〜３８からなる群から選択されることを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［４］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［５］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３、および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３、および１５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４、および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４、および１６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［６］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２、および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２、および２３と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［７］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［８］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３、および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３、および１５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４、および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４、および１６と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［９］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２、および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２、および２３と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［１０］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［１１］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３、および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３、および１５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４、および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４、および１６と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［１２］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２、および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２、および２３と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［２］に記載のアッセイ。
［１３］
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の複数の血清型を検出するためのプローブセットであって、
該プローブセットが、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのセットを備え、
そのセットの各々が、検出可能な形で標識されており、ヌクレオチド配列の長さが約１０から約５０である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、各々のヌクレオチド配列の長さが約１０から約１５０である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーとを備え、
各プライマー／プローブのセットは、前記ＨＰＶ生物の特定の血清型に対して少なくとも優先的であり、
前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットは、互いに対して縮重しており、前記縮重プローブは各々、同じチャネルにおいて検出可能なシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、前記縮重プライマー／プローブのセットが優先的にアニーリングする血清型ではない第３の血清型を識別し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットにおけるプローブの波長と同じかまたは異なる波長のシグナルを発するシグナル部分を有する、
ことを特徴とするプローブセット。
［１４］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６〜３８からなる群から選択されることを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［１５］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［１６］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３、および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３、および１５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４、および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４、および１６と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［１７］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２、および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２、および２３と少なくとも７０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［１８］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［１９］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３、および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３、および１５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４、および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４、および１６と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［２０］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２、および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２、および２３と少なくとも８０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［２１］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２９、および配列番号２４〜２９と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３９を選択し、ＨＰＶ血清型６８に対してＨＰＶ血清型３９を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５、ならびに配列番号１、３および５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６８を選択し、ＨＰＶ血清型３９に対してＨＰＶ血清型６８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６、ならびに配列番号２、４および６と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［２２］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型３３を選択し、ＨＰＶ血清型５８に対してＨＰＶ血清型３３を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号７、９、１１、１３、および１５、ならびに配列番号７、９、１１、１３、および１５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５８を選択し、ＨＰＶ血清型３３に対してＨＰＶ血清型５８を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号８、１０、１２、１４、および１６、ならびに配列番号８、１０、１２、１４、および１６と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［２３］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別するように構成され、前記第１のプライマー／プローブのセットまたは第２のプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、
前記プライマー／プローブのセットは、配列番号３０〜３５、および配列番号３０〜３５と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第１のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第１のプライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１、ならびに配列番号１７、１９および２１と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択され；
前記第２のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型６６を選択し、ＨＰＶ血清型５６に対してＨＰＶ血清型６６を識別せず、
前記第２のプライマー／プローブのセットは、配列番号１８、２０、２２、および２３、ならびに配列番号１８、２０、２２、および２３と少なくとも９０％相同である配列からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つから選択される、
ことを特徴とする［１３］に記載のプローブセット。
［２４］
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の複数の血清型を検出するためのキットであって、
該キットが、少なくとも３つのオリゴヌクレオチドプライマー／プローブのセットを備え、
そのセットの各々が、前記ＨＰＶ生物の特定の血清型のための、検出可能な形で標識された、ヌクレオチド配列の長さが約１０から約５０である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、各々のヌクレオチド配列の長さが約１０から約１５０である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーとを備え、
前記第１のプライマー／プローブのセットおよび第２のプライマー／プローブのセットは、互いに対して縮重しており、前記縮重プローブは各々、同じチャネルにおいて検出可能なシグナルを発するシグナル部分を有し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記他の２つのプライマー／プローブのセットに対して縮重しておらず、前記縮重プライマー／プローブのセットが優先的にアニーリングする血清型ではない第３の血清型を識別し、
前記第３のプライマー／プローブのセットは、前記縮重プライマー／プローブにおけるプローブのシグナル部分により発せられる波長と同じかまたは異なる波長のシグナルを発するシグナル部分を有する、
ことを特徴とするキット。
［２５］
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットおよび第２の縮重プライマー／プローブのセットについての、前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６〜３８からなる群から選択されることを特徴とする［２４］に記載のキット。
［２６］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３６であり、
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号１、３および５を含み、
前記第２の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号２、４および６を含むことを特徴とする［２４］に記載のキット。
［２７］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３７であり、
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号７、配列番号１５、ならびに配列番号９、１１、および１３のうちの１つを含み、
前記第２の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号８、配列番号１５、ならびに配列番号１０、１２、および１４のうちの１つを含む、
ことを特徴とする［２４］に記載のキット。
［２８］
前記縮重プライマー／プローブのセットの標的は、配列番号３８であり、
前記第１の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号１７、１９および２１を含み、
前記第２の縮重プライマー／プローブのセットは、配列番号１８、配列番号２０、ならびに配列番号２２および２３のうちの１つを含む、
ことを特徴とする［２４］に記載のキット。
［２９］
前記第３のプライマー／プローブのセットは、配列番号２４〜２６、配列番号２７〜２９、配列番号３０〜３２、および配列番号３３〜３５からなる群から選択されることを特徴とする［２４］に記載のキット。
［３０］
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５１を識別し、配列番号２４〜２６および配列番号２７〜２９からなる群から選択されることを特徴とする［２９］に記載のキット。
［３１］
前記第３のプライマー／プローブのセットは、ＨＰＶ血清型５９を識別し、配列番号３０〜３２および配列番号３３〜３５からなる群から選択されることを特徴とする［２９］に記載のキット。
［３２］
前記第３のプライマー／プローブのセットの検出プローブの前記シグナル部分は、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび前記第２のプライマー／プローブのセットの検出プローブにより発せられる波長と同じ波長を発することを特徴とする［２９］に記載のキット。
［３３］
前記第３のプライマー／プローブのセットの検出プローブの前記シグナル部分は、前記第１のプライマー／プローブのセットおよび前記第２のプライマー／プローブのセットの検出プローブにより発せられる波長と異なる波長を発することを特徴とする［２９］に記載のキット。

【0095】

本明細書では、特定の実施形態との関係で本発明を説明してきたが、これらの実施形態は、本明細書で説明される本発明の原理および適用を例示するだけのものであることを理解されたい。したがって、これらの実施形態には、多くの改変を行うことができ、添付の特許請求の範囲により規定される、本明細書で説明される本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、他の配置も考案しうることを理解されたい。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]