特許 5965875 Ｄ−アミノ酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5965875

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月10日

(54)【発明の名称】Ｄ−アミノ酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 13/04 20060101AFI20160728BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20160728BHJP

   A23L 33/17 20160101ALI20160728BHJP

   A61K 8/44 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20160728BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20160728BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20160728BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20160728BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20160728BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20160728BHJP

【ＦＩ】

   C12P13/04

   C12N1/20 A

   A23L33/17

   A61K8/44

   A61P25/28

   A61P3/10

   A61P43/00

   A61P15/08

   A61K35/74 G

   A61P9/10

   A61P17/00

   A61P3/06

   A61P17/16

   A61P37/08

   A61K31/198

   A61K35/74 A

   A61Q19/08

   A61Q19/00

【請求項の数】6

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2013-180353(P2013-180353)

(22)【出願日】2013年8月30日

(65)【公開番号】特開2015-47114(P2015-47114A)

(43)【公開日】2015年3月16日

【審査請求日】2015年7月16日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-01671

(73)【特許権者】

【識別番号】000006127

【氏名又は名称】森永乳業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】南 淳一

(72)【発明者】

【氏名】小田巻 俊孝

(72)【発明者】

【氏名】清水 金忠

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−００５８１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１１３５９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Trace Nutrients Research，２０１２年，vol.29，p.1-6

【文献】 SCIENCE，２００９年，vol.325，p.1552-1555

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １３／０４−１３／２４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＣＣ１８４８（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６７１）に属する微生物を培地で培養する工程、及び、
前記培養後の培養物中に分泌された、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、およびＤ−アラニンからなる群より選択される一または複数のＤ−アミノ酸と微生物とを分離し、かつ、当該Ｄ−アミノ酸を含む画分を培養物から回収する工程、
を含む、Ｄ−アミノ酸の製造方法。

【請求項2】

前記Ｄ−アミノ酸を含む画分の培養物からの回収を、培養物から微生物を除去した後に行う、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記Ｄ−アミノ酸を含む画分において微生物から分泌されたアミノ酸が、以下の（１）の関係式を満たすものである、請求項１または２に記載の製造方法。
［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）≧０．５ ・・・・・・（１）

【請求項4】

単離されたラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＣＣ１８４８（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６７１）。

【請求項5】

ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＣＣ１８４８（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６７１）を含有する培養物を含む、組成物。

【請求項6】

前記培養物は、Ｄ−アミノ酸を含む、請求項５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌を使用したＤ−アミノ酸の製造方法に関する。また、当該製造方法に適した新規乳酸菌に関する。当該方法により製造されるＤ−アミノ酸、又は新規乳酸菌の培養物は、医薬、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧料、飲食品、食品添加物、及び飼料等の組成物に配合して利用することができる。

【背景技術】

【0002】

アミノ酸には、Ｄ体、Ｌ体が存在するが、哺乳類の体内に存在するアミノ酸はＬ体がほとんどであると考えられてきた。しかし近年、測定技術の進歩により、いくつかのＤ―アミノ酸が人間の体内に存在することが明らかとなってきた。また、Ｄ−アミノ酸は、特徴的な生理作用を示し、当該生理作用は、Ｌ−アミノ酸とは異なること等が報告されている。

【0003】

Ｄ−アミノ酸に関する研究は、神経伝達やホルモン調節との関連といった生理学的、医学的な観点からのアプローチが主流であった。たとえば、Ｄ−セリンは、中枢神経系に偏在しており、ＮＭＤＡ受容体チャネルの分布と強い正の相関を示すことから、その作用が注目されている。ＮＭＤＡ受容体は、その機能が高まると、記憶、学習能力も高まることが知られている。そして、Ｄ−セリンまたはＤ−アラニンは、ＮＭＤＡ受容体活性を増強することが明らかとなっている（非特許文献１）。

【0004】

Ｄ−アラニンは、血糖値の制御に関与すること（非特許文献２）、及び、コラーゲン産生促進作用を有すること（特許文献１）が知られている。また、Ｄ−プロリンは紫外線傷害を軽減することから、紫外線が関与するシワの抑制のみならず、医薬として白内障等への適用も期待されている（特許文献２）。

【0005】

Ｄ−アミノ酸はヒトの皮膚（角層）に存在し、加齢とともにＤ−アスパラギン酸が減少すること、及びＤ−アスパラギン酸がＬ−アスパラギン酸より優れた美肌効果を有することが明らかとなっている（非特許文献３）。上記効果から、現在は、Ｄ−アスパラギン酸を豊富に含む製品が市販されている。
Ｄ−アミノ酸が有する皮膚に対する効能としては、他にも、Ｄ−グルタミン酸が、経口投与により、シワ形成を軽減させることが知られている（特許文献３）。

【0006】

Ｄ−アスパラギン酸は、松果体実質細胞に存在し、精巣ライディッヒ細胞のテストステロン産生の亢進などに関与することから、生殖機能の改善に関与する可能性が示唆されている（非特許文献４）。

【0007】

Ｄ−ヒスチジンは、食欲抑制による抗肥満作用を有することから、メタボリックコントロール等の体重コントロールに使用することが期待されている（非特許文献５）。

【0008】

また、人の体に働きかける作用の他にも、Ｄ−グルタミン酸は、防腐剤の防腐力低下を抑制することが知られている（特許文献４）。よって、化粧料及び食品、医薬等の組成物にＤ−グルタミン酸を配合することにより、防腐剤の量を減らすことができる。一般に、防腐剤には、皮膚刺激を起こしたり、発がん性が懸念されているものもあるため、防腐剤を減らすことは、安全性の面で有益である。さらに、Ｄ−グルタミン酸の有益な生理作用も享受することができる。

【0009】

一方、近年は、Ｄ−アミノ酸に関して、食品分野からのアプローチも始まっている。遊
離のアミノ酸の味は、Ｌ体とＤ体とでは大きく異なることが知られているが、Ｌ体と同様にＤ体も風味改良剤として使用し得る（特許文献５）。そして、チーズ、ヨーグルト、黒酢又は日本酒等の発酵食品には、Ｄ−アミノ酸が豊富に含まれており、発酵食品の旨みの一役を担っていると考えられている。

【0010】

非特許文献６は、生もと造りの日本酒は、含有されるＤ−アミノ酸濃度が高い傾向があり、それらＤ−アミノ酸は日本酒の旨味や総合評価を高めること、及び、それらＤ−アミノ酸は生もと由来の乳酸菌（Lactobacillus sakei等）が生産していることを、明らかにしている。しかし、ラクトバチルス・ヘルベティカスがＤ−アミノ酸を生産していることに関する記載はない。

【0011】

上記のように、Ｄ−アミノ酸は、生理・生化学、食品学などに関係する研究から、さまざまな用途が期待されており、食品、医薬品、化粧料などの分野における新しい機能成分として使用されると考えられている。しかし、Ｄ−アミノ酸は光学活性を有するアミノ酸であり、光学的に純度の高いＤ−アミノ酸の製造は困難であることが知られている。

【0012】

これまでに、乳酸菌等の微生物の細胞内には、多くのＤ−アミノ酸が存在することが報告されている（非特許文献７）。また、当該微生物または当該微生物が産生する酵素を用いて、Ｄ−アミノ酸を製造する方法が知られている（特許文献６、７）。しかし、微生物の体内に存在することが報告されているＤ体の種類は限られており、また、Ｌ体に対するＤ体の比率も高くないため、効率がいい方法とはいえない。さらに、Ｄ−アミノ酸は、医薬、医薬部外品、化粧料、食品、及び飼料等の材料として使用され得ることから、高純度のものが求められているところ、上記の方法では、微生物由来の不純物が少なからず混入する可能性があった。

【0013】

一方、ラクトバチルス・ヘルベティカスは、これまでに、動脈硬化予防（特許文献８）、アトピー性皮膚炎治療（特許文献９）、脂肪肝抑制（特許文献１０）、内臓脂肪蓄積抑制（特許文献１１）等の様々な用途が知られており、これらの用途に基づいて、医薬、飲食品、化粧料等の分野において使用されてきた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】国際公開第２０１１／０４０３６３号

【特許文献2】国際公開第２０１０／１１３９２５号

【特許文献3】国際公開第２０１１／０４０１６６号

【特許文献4】特開２０１１−２５６１３７号公報

【特許文献5】国際公開第２０１２／０５７０８４号

【特許文献6】特開２０１０−１５４７７４号公報

【特許文献7】特開平１１−１１３５９２号公報

【特許文献8】特開２０１２−０１２３２１号公報

【特許文献9】特表２０１０−５３１８４０号公報

【特許文献10】特開２０１１−２０１８０１号公報

【特許文献11】特開２００８−０６３２２７号公報

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】松井隆明，近畿大医誌, １９９６年，第２１巻，第１号，ｐ．１１５−１２４

【非特許文献2】Morikawa A, et al., Biochem Biophys Res Commun, 2007, 355(4):872-6

【非特許文献3】ヘルスｐｒｏニュースｆｒｏｍ日経ヘルス、“Ｄ−アミノ酸に美肌効果、資生堂が発表 角層と真皮内部で働き、水分量向上“、［online］、2010年6月25日、［平成25年2月28 日検索］、インターネット〈URL：http://nhpro.nikkeibp.co.jp/nh/pro/〉

【非特許文献4】Macchia G, et al., “DL-Aspartic acid administration improves semen quality in rabbit bucks.", Animal Reproduction Science, 2010, 118(2-4):337-343

【非特許文献5】山本祐司，「Ｄ型アミノ酸の生体内における生理機能の解析」，浦上財団研究報告書，２００７年，Ｖｏｌ．１５，ｐ．３３−４２

【非特許文献6】郷上佳孝ら，Trace Nutrients Research 29, 2012, 1-6

【非特許文献7】HANS BRUCKNER, et al., CHIRALITY, 1993, 5:385-392

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明は、乳酸菌を用いて、高効率でＤ−アミノ酸を製造する方法を提供することを課題とする。また、当該Ｄ−アミノ酸の製造方法に、特に適した新規乳酸菌株を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物が、高効率でＤ−アミノ酸を分泌することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0018】

すなわち、本発明は、以下の事項に関する。
［１］ ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する微生物を培地で培養する工程、及び、
前記培養後の培養物中に分泌されたＤ−アミノ酸と微生物とを分離し、かつ、Ｄ−アミノ酸を含む画分を培養物から回収する工程、
を含む、Ｄ−アミノ酸の製造方法。
［２］前記ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する微生物が、ＭＣＣ１８４８株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６７１）またはＪＣＭ１１２０株である、［１］に記載の方法。
［３］前記Ｄ−アミノ酸を含む画分の培養物からの回収を、培養物から微生物を除去した後に行う、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記Ｄ−アミノ酸を含む画分において微生物から分泌されたアミノ酸が、以下の（１）の関係式を満たすものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）≧０．５ ・・・・・・（１）
［５］前記（１）の関係式を満たすＤ−アミノ酸が、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、およびＤ−アラニンからなる群より選択される一または複数のＤ−アミノ酸である、［１］〜［４］のいずれか一に記載の製造方法。
［６］前記ラクトバチルス・ヘルベティカスが、ＭＣＣ１８４８株（受託番号：ＮＩＴＥ
ＢＰ−０１６７１）であり、かつ、前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、およびＤ−アラニンからなる群より選択される一または複数のＤ−アミノ酸である、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記ラクトバチルス・ヘルベティカスが、ＪＣＭ１１２０株であり、かつ、前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アスパラギンである、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法により製造されるＤ−アミノ酸を含む画分、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬。
［９］単離されたラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＣＣ１８４８株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６７１）。
［１０］［９］に記載の株を含有する培養物を含む、組成物。
［１１］前記培養物は、Ｄ−アミノ酸を含む、［１０］に記載の組成物。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を用いて、Ｄ−アミノ酸を製造することができる。
また、好ましい態様では、［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）の比率が高い株を使用することにより、高効率でＤ−アミノ酸を製造する方法が提供される。
さらに、本発明において使用されるラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物は、長い食経験のある乳酸菌である。そのため、Ｄ−アミノ酸を含む画分から乳酸菌を分離除去しなくても、食品等の組成物に配合することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】一次元目の逆相カラムにより分離されたアラニン（Ｌ体とＤ体が混合した状態）のピークを含むクロマトグラムである。縦軸は蛍光の検出強度を表しており、横軸は経過時間を表している。

【図2】二次元目の光学異性体分離カラムにより分離された、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンのピークを含むクロマトグラムである。縦軸は蛍光の検出強度を表しており、横軸は経過時間を表している。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。

【0022】

ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物は、乳酸菌と呼ばれており、ヨーグルト等の発酵乳製品においてスターター（種菌）として使用されている。乳酸菌は、発酵乳製品における腐敗細菌や病原細菌を抑える効果があり、製品の貯蔵性を高めているほか、風味を向上させたり、健康に寄与する効果を有することが知られている。
たとえば、乳酸菌は、腸内細菌の生育に大きな影響を与え、腸内環境を良好に保つ作用を有することが知られている。この乳酸菌は、人の腸内に、いわゆる善玉菌として生息し、腸内環境を維持している。腸内環境を整えることによって、免疫力が向上し、様々な病気に罹りにくくなったり、病状が改善されたりすることが期待されている。このことから、整腸作用や、免疫増強作用、及び発癌抑制作用等を有することが知られている。このため、乳酸菌は健康増進、又は疾患の予防若しくは治療を目的として、飲食品、医薬品等に広く利用されてきた。

【0023】

本発明におけるラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物としては、ヘルベティカスに属する微生物であれば、特に制限されることなく使用可能である。それらの微生物は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America）から購入することができる。
その中でも、ラクトバチルス・ヘルベティカス ＪＣＭ１１２０株（ＪＣＭ１１２０Ｔと表記されることがある。Ｔは標準株であることを表す。）又はラクトバチルス・ヘルベティカス ＭＣＣ１８４８株を使用することが好ましい。
ラクトバチルス・ヘルベティカス ＪＣＭ１１２０株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）より入手することができる。
ラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株は、２０１３年７月２９日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６７１）。

【0024】

本発明において使用する株は、製造するＤ−アミノ酸の種類によって、適宜選択することが可能である。また、Ｌ−アミノ酸の混入量を問わず、Ｄ−アミノ酸を大量に得ることを目的とする場合には、分泌するＤ−アミノ酸量が特に多い株を選択することが好ましい。

【0025】

一方、Ｌ−アミノ酸の混入を極力抑えて、Ｄ−アミノ酸のみを得ることを目的とする場合には、Ｌ体よりもＤ体の分泌量が高い株を使用することが好ましい。
たとえば、［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）の式により算出される値が、０．５以上、好ましくは０．８以上、より好ましくは１．０となる株を使用することにより、高効率にＤ−アミノ酸を製造することが可能となる。上記式に適用するアミノ酸分泌量は、式中の分母における分泌量の単位と、式中の分子における分泌量の単位とが同じであれば、どのような単位で表される値であってもよい。

【0026】

Ｄ−アミノ酸の分泌量及び分泌比率の観点から、ＪＣＭ１１２０株又はＭＣＣ１８４８株を使用することが好ましい。

【0027】

本発明において使用される培地としては、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を培養可能なものであれば制限されることなく用いることができ、公知の培地のなかから適宜選択できる。具体的には、ＭＲＳ（de Man, Rogosa Sharpe）培地、ＡＢＣＭ（anaerobic bacterial culture medium）培地、ＲＣＡ（Reinforced clostridial agar）培地、ＢＬ（Blood Liver）培地、ＴＯＳプロピオン酸培地、ＧＡＭ（Gifu Anaerobic Medium）培地、ＥＧ（Eggerth-Gagnon）培地等が挙げられる。
また、当該培地として、乳牛、水牛、羊、山羊、ラクダ、インド牛、ヤク牛、馬、ロバ、トナカイ等の各種乳および乳製品や、ぬか床、野菜類、魚介類、米類等の食品も使用可能である。

【0028】

本発明における培養工程としては、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を培養可能な公知の培養条件を採用することができる。たとえば、２５〜４５℃で培養することが可能であるが、３０〜４２℃で、特に３７〜４２℃で培養することにより、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物が良好に増殖するので好ましい。

【0029】

また、培養条件は、好気条件下、および嫌気条件下のいずれの条件で行っても良く、嫌気条件下で行うことが好ましい。なお、嫌気条件下で行う場合は、炭酸ガス等の嫌気ガスを通気しながら培養することができる。また、液体静置培養等の微好気条件下で培養することも可能である。

【0030】

培養時間は、４〜７２時間の間で増殖速度を観察しながら適宜調節可能であるが、１６〜４８時間、特に１６〜２４時間であるとき、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物の増殖が定常期に達し、Ｄ−アミノ酸の産生量が最大に達するので好ましい。

【0031】

一形態では、上記のような培養工程により、培養物中に分泌されたＤ−アミノ酸と、微生物とを分離し、かつ、Ｄ−アミノ酸を含む画分を培養物から回収する。Ｄ−アミノ酸と微生物との分離、及び培養物からのＤ−アミノ酸を含む画分の回収は、同時に行ってもよく、また、培養物から微生物を除去した後に、培養物からＤ−アミノ酸を含む画分を回収してもよい。

【0032】

培養物から微生物を分離する工程としては、例えば、膜によるろ過、遠心分離等が挙げられる。膜は、平膜及び中空糸膜（ホローファイバー）のいずれでもよい。中空糸膜（ホローファイバー）を使用してろ過を行った場合、Ｄ−アミノ酸と微生物との分離、及びＤ−アミノ酸を含む画分の培養物からの回収を、同時に行うことができる。

【0033】

また、微生物を除去した培養物からＤ−アミノ酸を含む画分を回収する工程としては、Ｌ−アミノ酸について知られている方法を採用することができ、たとえば、イオン交換、ゲルろ過、逆相等の各種クロマトグラフィー、塩析、晶析、溶媒沈殿などの方法が挙げられる。これらの方法は、目的物であるＤ−アミノ酸の種類によって、適宜選択することができる。クロマトグラフィーは、低圧であっても高圧（HPLC）であってもよい。

【0034】

Ｄ−アミノ酸を含む画分は、Ｄ−アミノ酸の効果を損なわず、かつ、微生物を含まない限り特に制限されず、培地成分を含んでいてもよく、完全に又は部分的に精製したものであってもよい。Ｄ−アミノ酸の精製は、上記のＤ−アミノ酸を含む画分を回収する方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
Ｄ−アミノ酸を含む画分の性状は特に制限されず、液体であってもよく、凍結乾燥等によって得られる粉体であってもよい。

【0035】

Ｄ−アミノ酸を含む画分は、Ｄ−アミノ酸の効果を損なわない限り、Ｌ−アミノ酸を含んでいてもよいが、公知の分離精製方法を使用して、Ｄ−アミノ酸のみを分離精製してもよい。Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の分離は、例えば、ジアステレオマー法、酵素法、またはクロマトグラフィー等を適宜選択することによって、またはそれらの方法を組み合わせることによって、行うことができる（例えば、特開２００５−００３５５８号公報、Kenji Hamase, et al., Journal of Chromatography A, 2010, Vol.1217, 1056-1062、または、浜瀬健司ら，「哺乳類体内微量Ｄ−アミノ酸の選択的分析法の開発」，分析化学，２００４年，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．７，ｐ．６７７−６９０を参照）。

【0036】

当該クロマトグラフィーとしては、光学異性体を分離するための方法として知られているものを適宜選択すればよく、たとえば、固定相に結合させた光学活性なコンポーネントとジアステレオメリック複合体を形成させることにより、目的とするエナンチオマーを分取するキラル固定相法、移動相溶媒に適当な光学活性化合物を添加することにより行うキラル移動相法、エナンチオマーに対し適当な光学活性誘導体化試薬を反応させてジアステレオマーに変換してから通常の分離系に供するキラル誘導体化法等を適宜組み合わせることによって、Ｄ−アミノ酸の分離精製を行うことができる。

【0037】

発明者らは、Ｄ−アミノ酸の製造に特に適しているラクトバチルス・ヘルベティカス株を探究した結果、自然源から新規なＭＣＣ１８４８株を発見した。ＭＣＣ１８４８株は、日本国内の自然源から得られたものである。
ＭＣＣ１８４８株は、Ｌ−アミノ酸と比較したＤ−アミノ酸の分泌比率の高さに加えて、分泌するＤ−アミノ酸の種類の豊富さの点で好ましい。

【0038】

ラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株の菌学的性質は、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 3、William B. Whitman, Aidan C. Partel 著、Williams and Wilkins Company、２００９年）にほぼ従って測定した。その結果、ＭＣＣ１８４８株は、グラム陽性の桿菌であり、ＢＬ寒天培地で培養した場合、グレーがかった円形扁平状で粗面なコロニーを形成することが分かった。

【0039】

その他の菌学的性質として、グルコースからのガス産生、糖発酵性について、表１に示す。糖発酵性については、光岡の糖発酵性用培地（１９７４年、光岡知足著「乳酸菌の細
菌学」、臨床検査１８、１１６３〜１１７２ページ）を用いて、２８種類の糖について試験を行った。ＭＣＣ１８４８株の糖発酵性は、国際的な細菌分類の大網である前記バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジーに記載されているラクトバチルス・ヘルベティカスに特徴的な糖発酵性と一致し、標準株であるＪＣＭ１１２０株の糖発酵性とも酷似している。これらのことから、ＭＣＣ１８４８株は、ヘルベティカスに属すると考えられる。参考として、標準株の糖発酵性と、バージェイズ・マニュアルの記載を一部抜粋し、表１に示す。

【0040】

【表1】

【0041】

ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を培養し、培養物中に分泌されたＤ−
アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸が有する生理作用を期待するのみならず、矯味等の様々な目的で、医薬、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧料、飲食品、食品添加剤及び飼料等の組成物に配合することができる。当該組成物に配合されるＤ−アミノ酸とは、単離精製したＤ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸を含む画分のいずれであってもよい。

【0042】

また、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物の培養物は、そのまま医薬、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧料、飲食品、食品添加剤及び飼料等の組成物に配合しても良いし、分離・精製を行っても良い。分離・精製手段としては、これまでに述べた公知の方法が利用可能である。このように、当該培養物を組成物に配合する場合においては、当該培養物には、微生物が含まれていても、含まれていなくても良い。しかし、微生物を含有する培養物を組成物に配合した場合は、当該微生物が有する生理作用も期待できる点で好ましい。

【0043】

また、当該培養物には、微生物が分泌するＤ−アミノ酸が含まれていても、含まれていなくてもよい。しかし、Ｄ−アミノ酸が含まれていると、Ｄ−アミノ酸が有する生理作用を享受できる点で好ましい。また、当該培養物には、培養培地が含まれていても、含まれていなくてもよい。

【0044】

本発明により製造されるＤ−アミノ酸、またはラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を含有する培養物は、一態様として、医薬、医薬部外品、皮膚外用剤又はそれらの有効成分として利用することができ、Ｄ−アミノ酸もしくは培養物をそのまま、又はそれらを医薬的に許容される賦形剤等と組み合わせて、経口的にまたは経皮的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。

【0045】

医薬、医薬部外品又は皮膚外用剤の製剤形態は特に限定されず、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コーティングしたものを含む）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、軟膏剤、貼付剤又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。

【0046】

製剤化にあたっては、医薬的に許容される各種賦形剤を使用できる。たとえば、担体、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、溶剤等の賦形剤を使用できる。
また、Ｄ−アミノ酸又は培養物は、他の医薬、医薬部外品又は皮膚外用剤と併用されてもよい。併用する医薬、医薬部外品又は皮膚外用剤は、Ｄ−アミノ酸または培養物を含む製剤中に、有効成分の一つとして含有させてもよいし、製剤中には含有させずに別個の製剤として組み合わせて商品化してもよい。

【0047】

上記の医薬、医薬部外品または皮膚外用剤に用いる担体としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を、結合剤としては例えば澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を、それぞれ例示することができる。

【0048】

また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を例示することができる。

【0049】

更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴー
ル等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を例示することができる。

【0050】

錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。

【0051】

上記の医薬、医薬部外品または皮膚外用剤は、Ｄ−アミノ酸またはラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物が有する生理作用に基づいて、様々な医薬に使用し得る。例えば、記憶力・学習能力改善剤、血糖値抑制剤、抗老化剤、生殖機能改善剤、動脈硬化予防剤、アトピー性皮膚炎治療剤、脂肪肝抑制剤、内臓脂肪蓄積抑制剤、皮膚保湿剤、シワ形成抑制剤、又は美肌剤等に使用可能である。

【0052】

化粧料に配合する場合は、Ｄ−アミノ酸、又はラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を含有する培養物の効果を損なわない範囲において、通常の化粧料に使用され得る添加剤等を配合し、各種の形態で調製することができる。

【0053】

本発明の化粧料とは、例えば、局所又は全身用の皮膚洗浄料、皮膚化粧料又は薬用化粧料類、浴湯に投じて使用する浴用剤、洗口剤又は含嗽剤等の口腔用剤などを意味する。その製剤形態は特に限定されず、目的、用法に応じて適宜選択できる。例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ジェル、ローション、オイル、パック、ミスト、顔面用化粧シートマスクなどの基礎化粧料、ひげ剃り用剤、洗顔料、皮膚洗浄料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料などの頭髪化粧料、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラなどのメークアップ化粧料、香水類、制汗剤、入浴剤、マウスウォッシュ、歯磨き剤、口中清涼剤等が挙げられる。

【0054】

飲食品に配合する場合は、Ｄ−アミノ酸又はラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を含有する培養物の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。また、本発明において使用されるラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物は、長い食経験のある所謂乳酸菌であるため、微生物を含んだままで配合することも可能である。

【0055】

上記のような飲食品としては、液状、ペースト状、カプセル状、ゼリー状、ゲル状固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食等のほか、例えば、パン類、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビ
スケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等のその他の市販食品等；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品）等が挙げられる。

【0056】

食品添加物として用いる場合には、Ｄ−アミノ酸、又はラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を含有する培養物の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば、形態や性状は特に制限されず、通常食品添加物に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。

【0057】

さらに、Ｄ−アミノ酸、又はラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を含有する培養物は、飼料中に含有させることも可能である。
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。

【実施例】

【0058】

以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0059】

〔試験例１〕
ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物として、ラクトバチルス・ヘルベティカスＪＣＭ１１２０株（ＪＣＭより入手）、及びラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株を、それぞれＭＲＳ（de Man Rogasa Sharpe）培地（Ｄｉｆｃｏ（登録商標）製品、日本ベクトン・ディッキンソン社より入手）3 mL で、嫌気的に37℃で一晩（16時間）培養した。培地は0.22μmフィルターにてろ過して乳酸菌を除去し、得られた培養上清を冷蔵にて保存した。

【0060】

上記培養上清中のアミノ酸は、4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiaxole(NBD-F)を用いて蛍光誘導体とし、これをHPLCにて分析した。具体的には、培養上清 1 mLを減圧下において風乾させ、得られた固形分をホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.2）20 μLに溶解した。次いで、5 μLの40 mM NBD-F/アセトニトリル溶液を加え、60℃にて2分間インキュベートし、2%トリフルオロ酢酸水溶液75 μLに溶解した反応液2 μLを、HPLCに供した。

【0061】

HPLCは、主に、逆相マイクロカラムを用いる一次元目と、光学異性体分離カラムを用いる二次元目とにより構成されるHPLCシステムにより行われた。
使用したＨＰＬＣシステム（NANOSPACE SI-2 シリーズ, 資生堂, 日本）の構成を以下に示す。
３０１０型脱気装置、
３２０１型ポンプ ２台、
３０３３型オートサンプラー、
３００４型カラムオーブン、
３０１３型蛍光検出器 ２台、
３０１２型カラム選択ユニット、マルチループユニット（9ループ、1ループは長さ 750
mm x 内径 0.5 mm、ループ当たり150 μL容量）、1入力-10出力バルブ（C5-2340 EMTD, Valco Instruments、米国）。
データ処理プログラムのEzChrom Elite Clientは、検出器の反応をモニタリングするのに使用し、カラム選択ユニットとマルチループユニットは、KSAAバルブ制御システム（資生堂）を用いて制御した。

【0062】

一次元目においては、microbore-monolithic ODSカラム（長さ 1000 mm x 内径 0.53 mm、シリカゲル充填、資生堂製）を、45℃に維持して使用した。移動相には、6％アセトニトリル、0.06％トリフルオロ酢酸を含む水溶液を、25 μL毎分の流速で用いた。

【0063】

二次元目においては、narrowbore-Sumichiral OA-2500S 光学異性体分離カラム（長さ 250 mm x 内径 1.5 mm、住化分析化学、日本）を、25℃に維持して使用した。
Asnの移動相には、5 mMクエン酸加・メタノール／アセトニトリル混合液（25：75混合液）を、流速200 μL毎分で使用した。
Glu、Aspの移動相には、2.5 mM クエン酸加・メタノール／アセトニトリル混合液（25：75混合液）を、流速200 μL毎分で使用した。
また、Alaの移動相には5 mMクエン酸加・メタノール／アセトニトリル混合液（50：50混合液）を流速200 μL毎分で使用した。

【0064】

上記誘導体化したアミノ酸を含む反応液を、一次元目における逆相マイクロカラムに供した。
そして、一次元目に設置した蛍光検出器によって、４７０ｎｍの励起波長によるＮＢＤ誘導体化アミノ酸の蛍光を５３０ｎｍにて検出し、検出したアミノ酸を含む画分（Ｄ体とＬ体の混合物の状態：クロマトグラムの一例を図１に示す）を、カラムスイッチングにより二次元目における光学異性体分離カラムへ導入して分離し、二次元目に設置した蛍光検出器によってＤ体とＬ体を定量した（クロマトグラムの一例を図２に示す）。
アミノ酸のＤ体、Ｌ体の定量結果を、それぞれ表２に示す。

【0065】

【表2】

【0066】

表２は、各々の微生物培養後における培養物中のアミノ酸含有量から、培養前のＭＲＳ培地に含まれるアミノ酸含有量を差し引くことにより算出した、アミノ酸分泌量を示す。
分泌量がマイナスの場合は、微生物が分泌したアミノ酸量よりも、微生物により消費されたアミノ酸量の方が多かったことを示す。
分泌量がプラスの場合は、微生物により消費されたアミノ酸量よりも、微生物が分泌し
たアミノ酸量が多かったことを示す。

【0067】

表２は、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物が、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニンを分泌したことを示している。

【0068】

以下の表３は、表２の結果から、各々の微生物におけるＤ−アミノ酸の分泌比率を、［Ｄ−アミノ酸分泌量］／（［Ｄ−アミノ酸分泌量］＋［Ｌ−アミノ酸分泌量］）の式で計算した結果である。但し、Ｄ−アミノ酸分泌量またはＬ−アミノ酸分泌量がマイナスの値である場合には、分泌量は０として計算を行った。

【0069】

【表3】

【0070】

ＪＣＭ１１２０株では、Ｄ−アスパラギンの分泌比率が０．５以上であり、Ｄ−アミノ酸が高効率に分泌されていることが判明した。
ＭＣＣ１８４８株では、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸及びＤ−アラニンの分泌比率が０．５以上であり、Ｄ−アミノ酸が高効率に分泌されていることが判明した。さらに、高効率に分泌するＤ−アミノ酸の種類も豊富である。

【0071】

〔実施例１：ドリンクヨーグルト〕
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳（森永乳業社製）を水に溶解して得た１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃１６時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳、ペクチン、及び蔗糖からなる原料を混合溶解して得られた、乳脂肪０．５％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分８．０％（Ｗ／Ｗ）、蔗糖５．０％（Ｗ／Ｗ）、ペクチン０．２％（Ｗ／Ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株のカルチャー５０ｍＬを接種し、３７１６時間培養して発酵乳を得た。
該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を１５ＭＰａの圧力で均質化し、２００ｍＬ容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを製造した。

【0072】

製造したドリンクヨーグルトには、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸及びＤ−アラニンの分泌比率が０．５以上で各Ｄ−アミノ酸が存在していた。
このドリンクヨーグルトは、このまま皮膚保湿用飲食品、シワ形成抑制用飲食品、及び美肌用飲食品として使用し得る。

【0073】

〔実施例２：発酵乳〕
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、３７℃１６時間培養した。
これとは別に、乳脂肪３．０％（Ｗ／Ｗ）、無脂乳固形分９．０％（Ｗ／Ｗ）からなる生乳５０Ｌを７０℃に加温し、１５ＭＰａの圧力で均質化した後、９０℃で１０分間殺菌
し、４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株のカルチャー５００ｍＬ、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー５ｍＬを接種し、５００ｍＬ容の樹脂容器に充填し、密封し、３７℃７時間培養した後、直ちに冷却して発酵乳を製造した。

【0074】

製造した発酵乳には、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸及びＤ−アラニンの分泌比率が０．５以上で各Ｄ−アミノ酸が存在していた。
この発酵乳は、このまま皮膚保湿用飲食品、シワ形成抑制用飲食品、及び美肌用飲食品として使用し得る。

【0075】

〔実施例３：粉末製剤〕
還元脱脂粉乳培地（１３重量％脱脂粉乳、０．５重量％酵母エキス含有）を９５℃で３０分間殺菌したのち、ラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株のシードカルチャーを接種し、３７℃で１６時間培養し、得られた培養物を凍結乾燥してラクトバチルス・ヘルベティカスＭＣＣ１８４８株培養物の粉末製剤を得た。

【0076】

製造した粉末製剤には、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸及びＤ−アラニンの分泌比率が０．５以上で各Ｄ−アミノ酸が存在していた。
この粉末製剤は、このまま皮膚保湿剤、シワ形成抑制剤、及び美肌剤として使用し得る。

【産業上の利用可能性】

【0077】

本発明において製造されるＤ−アミノ酸、又はラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物を含有する培養物は、Ｄ−アミノ酸又は当該微生物が有する生理作用を期待して、又は、矯味等の目的で、医薬、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧料、食品、食品添加物又は飼料等に幅広く使用可能である。
また、本発明の製造方法において、特定の株を採用することにより、高効率に及び／又は多種類のＤ−アミノ酸を製造することが可能である。

【符号の説明】

【0078】

１ Ｄ体とＬ体が混合した状態のアラニンのピークを示す。
２ Ｄ−アラニンのピークを示す。
３ Ｌ−アラニンのピークを示す。

【図1】

【図2】