特許 5965964 選択的ＮＧＦ経路インヒビターとしてのヒト抗ＮＧＦ中和抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5965964

(24)【登録日】2016年7月8日

(45)【発行日】2016年8月10日

(54)【発明の名称】選択的ＮＧＦ経路インヒビターとしてのヒト抗ＮＧＦ中和抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160728BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20160728BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20160728BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160728BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160728BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160728BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 25/32 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 25/06 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 13/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 11/08 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 1/14 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20160728BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160728BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20160728BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/22

   G01N33/53 D

   C12N5/10

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   A61P29/00

   A61P1/02

   A61P17/02

   A61P25/00

   A61P35/00

   A61P25/32

   A61P9/00

   A61P3/10

   A61P31/18

   A61P39/02

   A61P25/06

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   A61P17/00

   A61P21/00

   A61P1/04

   A61P27/02

   A61P13/10

   A61P17/06

   A61P17/16

   A61P11/06

   A61P11/00

   A61P13/00

   A61P15/00

   A61P37/08

   A61P11/02

   A61P11/08

   A61P15/08

   A61P1/14

   A61P1/18

   A61P17/04

   A61P25/04

   A61K39/395 N

   A61K37/02

【請求項の数】22

【全頁数】90

(21)【出願番号】特願2014-222225(P2014-222225)

(22)【出願日】2014年10月31日

(62)【分割の表示】特願2012-183471(P2012-183471)の分割

【原出願日】2004年7月15日

(65)【公開番号】特開2015-42670(P2015-42670A)

(43)【公開日】2015年3月5日

【審査請求日】2014年10月31日

(31)【優先権主張番号】60/487,431

(32)【優先日】2003年7月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500203709

【氏名又は名称】アムジェン インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】513142091

【氏名又は名称】メダレックス エル．エル．シー．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ケニース ディー． ワイルド

(72)【発明者】

【氏名】ジェームス ジェイ． エス． トレナー

(72)【発明者】

【氏名】ハイチュン ファン

(72)【発明者】

【氏名】ヘザー イノウエ

(72)【発明者】

【氏名】ティエ ジェイ． チャン

(72)【発明者】

【氏名】フランク マーティン

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０２／０９６４５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０１／００９１８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９６／０３３７３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Bio Industry, (2003), 20, [7], p.43-51

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／２２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで：
（ａ）該重鎖が、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
（ｂ）該重鎖が、配列番号８１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、または
（ｃ）該重鎖が、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号８８〜９１もしくは配列番号１３１のいずれかのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
単離されたヒト抗体。

【請求項2】

ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は、重鎖および軽鎖を含み、ここで：
（ａ）該重鎖が、配列番号９２に示すＣＤＲ１、配列番号９３に示すＣＤＲ２および配列番号９４に示すＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号９５に示すＣＤＲ１、配列番号９６に示すＣＤＲ２および配列番号９７に示すＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号７９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖可変領域が、配列番号８０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｂ）該重鎖が、配列番号９８に示すＣＤＲ１、配列番号９９に示すＣＤＲ２および配列番号１００に示すＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号１０１に示すＣＤＲ１、配列番号１０２に示すＣＤＲ２および配列番号１０３に示すＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号８１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖可変領域が、配列番号８２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｃ）該重鎖が、配列番号１１６に示すＣＤＲ１、配列番号１１７に示すＣＤＲ２および配列番号１１８に示すＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号１１９に示すＣＤＲ１、配列番号１２０に示すＣＤＲ２および配列番号１２１に示すＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号８７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖可変領域が、配列番号８８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｄ）該重鎖が、配列番号１１６に示すＣＤＲ１、配列番号１１７に示すＣＤＲ２および配列番号１１８に示すＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号１２２に示すＣＤＲ１、配列番号１２３に示すＣＤＲ２および配列番号１２４に示すＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号８７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖可変領域が、配列番号８９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｅ）該重鎖が、配列番号１１６に示すＣＤＲ１、配列番号１１７に示すＣＤＲ２および配列番号１１８に示すＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号１２５に示すＣＤＲ１、配列番号１２６に示すＣＤＲ２および配列番号１２７に示すＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号８７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖可変領域が、配列番号９０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；
（ｆ）該重鎖が、配列番号１１６に示すＣＤＲ１、配列番号１１７に示すＣＤＲ２および配列番号１１８に示すＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号１２８に示すＣＤＲ１、配列番号１２９に示すＣＤＲ２および配列番号１３０に示すＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号８７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖可変領域が、配列番号９１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか；または
（ｇ）該重鎖が、配列番号１１６に示すＣＤＲ１、配列番号１１７に示すＣＤＲ２および配列番号１１８に示すＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ該軽鎖が、配列番号１３２に示すＣＤＲ１、配列番号１３３に示すＣＤＲ２および配列番号１３４に示すＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域が、配列番号８７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、該軽鎖可変領域が、配列番号１３１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ここで、該抗体は、標準的なインビトロアッセイにおいて、０．２８〜０．４１×１０^−９ＭのＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、
単離されたヒト抗体。

【請求項3】

前記重鎖および軽鎖がフレキシブルなリンカーによって接続されて単鎖抗体を形成する、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項4】

単鎖Ｆｖ抗体である、請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

前記抗体が、
（ａ）Ｆａｂ抗体；
（ｂ）Ｆａｂ’抗体；または
（ｃ）（Ｆａｂ’）_２抗体
である、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項6】

完全ヒト抗体である、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項7】

ＮＧＦシグナル伝達を阻害する、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項8】

薬学的に受容可能なキャリアと、治療有効量の請求項７に記載の抗体を含む、薬学的組成物。

【請求項9】

生物学的サンプル中の神経成長因子（ＮＧＦ）を検出するための方法であって：
（ａ）該サンプルと請求項１または２に記載の抗体とを、ＮＧＦへの該抗体の結合を可能にする条件下で接触させる工程；および
（ｂ）該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程
を包含する、方法。

【請求項10】

請求項１または２に記載の抗体をコードする、核酸分子。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。

【請求項12】

真核生物細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。

【請求項13】

ＣＨＯ細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。

【請求項14】

請求項１または２に記載の抗体を産生する、単離された細胞株。

【請求項15】

ＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大と関連する障害または状態を治療するのに適した医薬の製造のための、請求項７に記載の抗体の薬学的に有効な量の使用。

【請求項16】

前記抗体が１×１０^−９〜１×１０^−１１ＭのＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、０．２８〜０．４１×１０^−９ＭのＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

前記抗体が１×１０^−１０〜１×１０^−１１ＭのＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、１×１０^−８〜１×１０^−９ＭのＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、請求項１５に記載の使用。

【請求項18】

前記障害または状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経的に維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系領域、尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または臓器痛である、請求項１５に記載の使用。

【請求項19】

前記障害または状態が、癌から生じる疼痛である、請求項１８に記載の使用。

【請求項20】

前記障害または状態が、変形性関節症である、請求項１８に記載の使用。

【請求項21】

前記障害または状態が、糖尿病性神経障害性疼痛である、請求項１８に記載の使用。

【請求項22】

前記障害または状態が、神経因性疼痛である、請求項１８に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、その開示が本明細書に参照として援用される、２００３年７月１５日出願、米国仮出願第６０／４８７，４３１号に関しており、それに対する優先権を主張する。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するヒトモノクローナル抗体に関する。疼痛および疼痛関連障害を処置するための組成物および方法も記載される。

【背景技術】

【0003】

（発明の背景）
毎日、米国では２００万を超える人々が慢性疼痛に苛まれている（ＪｅｓｓｅｌｌおよびＫｅｌｌｙ，１９９１「Ｐａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ」ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＮＥＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ，第３版，（Ｋａｎｄｅｌ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，およびＪｅｓｓｅｌｌ（編）），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（非特許文献１））。不幸にも、疼痛の現行の治療は、部分的にしか有効ではなく、多くのこれらの治療自体が衰弱または有害な副作用を引き起こす。例えば、非ステロイド系抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤｓ」）、例えばアスピリン、イブプロフェンおよびインドメタシンは、炎症性疼痛に対してほどほどに有効であるが、それらはまた腎毒性でもあり、高用量では胃腸の刺激作用、潰瘍、出血および精神の錯乱を引き起こす傾向がある。オピオイドで治療された患者はまた、高頻度に錯乱を経験し、そして長期のオピオイドの使用は、耐性および依存性を伴う。リドカインおよびメキシレチンのような局所麻酔薬は、同時に、疼痛を阻害して正常な感覚の喪失を引き起こす。

【0004】

疼痛は、環境から受けたシグナルに基づく知覚であり、そして神経系によって伝達および解釈される（概説に関しては、Ｍｉｌｌａｎ，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５７：１〜１６４（非特許文献２）を参照のこと）。熱および触覚のような侵害刺激によって、皮膚の専門的な感覚受容体が中枢神経系（「ＣＮＳ」）にシグナルを送るようになる。このプロセスは痛覚と呼ばれ、それを媒介する末梢感覚神経は侵害受容器である。侵害受容器（単数または複数）からのシグナルの強度、ならびにＣＮＳによるそのシグナルの抽象作用および同化作用に依存して、侵害性刺激は人にとって疼痛と受け取られることもそうでないこともあり得る。ある人による疼痛の知覚が刺激の強度まで適切に校正された場合、疼痛はその意図どおりの防御機能を果たす。しかし、特定のタイプの組織障害は、その人の痛覚閾値が低下しているため、比較的非侵害性の刺激が強度に疼痛性として知覚される、痛覚過敏または痛覚亢進（ｐｒｏｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）として公知の現象を生じる。炎症および神経障害の両方が痛覚過敏を誘発し得る。炎症性状態、例えば、日焼け、変形性関節症、大腸炎、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病（関節リウマチおよび狼瘡を含む）などに罹患している人は、多くの場合、疼痛が増強された感覚を経験する。同様に、外傷、外科手術、切断、膿瘍、カウザルギー、膠原血管病、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、ヘルペス感染、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、および化学療法は、過剰な疼痛を生じる神経の損傷をもたらす。

【0005】

侵害受容器が、正常な状態および痛覚過敏の状態のもとで外部シグナルを変換する機構はさらによく理解されてきているので、痛覚過敏に関与するプロセスは、疼痛閾値の低下を阻害して、それによって受け取る疼痛の量を減少することを目標とされ得る。

【0006】

神経栄養因子は、生理学的疼痛および病理学的疼痛の伝達において重大な役割を果たすことが示されている。神経成長因子（ＮＧＦ）は、特に重要であると考えられる（概説については、ＭｃＭａｈｏｎ，１９９６、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．３５１：４３１〜４０（非特許文献３）；およびＡｐｆｅｌ，２０００，Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ １６：Ｓ７−Ｓ１１（非特許文献４）を参照のこと）。ＮＧＦの局所的投与および全身的投与の両方が、痛覚過敏および異痛症を誘発することが示されている（Ｌｅｗｉｎら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１９０３〜１９１２（非特許文献５））。ヒトでのＮＧＦの静脈内注入は、全身の筋肉痛を生じるが、局所投与は、全身的な効果に加えて、注射部位の痛覚過敏および異痛症を誘発する（Ａｐｆｅｌら，１９９８，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：６９５〜７０２（非特許文献６））。疼痛が顕著な特徴である状態では内因性のＮＧＦに関与するかなりの一連の証拠がやはり存在する。例えば、ＮＧＦは、末梢神経の損傷後少なくとも２ヶ月間、後根神経節（ＤＲＧ）シュワン細胞において上方制御され、そして種々の関節炎モデルを罹患している動物の関節でレベルの増大が報告されている（例えば、Ａｌｏｅら，１９９３，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９：１４９〜１５５（非特許文献７））。ヒトでは、ＮＧＦレベルは、関節リウマチまたは他のタイプの関節炎を有する患者由来の滑液中で上昇している（例えば、Ａｌｏｅら，１９９２、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３５：３５１〜３５５（非特許文献８））。さらに、ＮＧＦ機能の拮抗によって、神経障害性疼痛および慢性炎症性疼痛のモデルにおける痛覚過敏および異痛症が防止されることが実証されている。例えば、神経障害性疼痛の動物モデルでは（例えば、神経幹または脊髄神経の結紮）、ＮＧＦに対する中和抗体の全身注射は、異痛症および痛覚過敏の両方を防止する（Ｒａｍｅｒら，１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７〜８４６（非特許文献９）；およびＲｏら，１９９９，Ｐａｉｎ ７９：２６５〜２７４（非特許文献１０））。当該分野で公知の抗ＮＧＦ抗体の例としては、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７８６９８（特許文献１）、ＷＯ０１／６４２４７（特許文献２）、ＷＯ０２／０９６４５８（特許文献３）およびＷＯ２００４／０３２８７０（特許文献４）；米国特許第５，８４４，０９２号（特許文献５）、同第５，８７７，０１６号（特許文献６）および同第６，１５３，１８９号（特許文献７）；Ｈｏｎｇｏら，２０００，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５〜２２７（非特許文献１１）；Ｈｏｎｇｏら，１９９３、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９〜５６８（非特許文献１２）；およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８またはＬ１７０７７が挙げられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７８６９８

【特許文献2】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６４２４７

【特許文献3】ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９６４５８

【特許文献4】ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０３２８７０

【特許文献5】米国特許第５，８４４，０９２号

【特許文献6】米国特許第５，８７７，０１６号

【特許文献7】米国特許第６，１５３，１８９号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】ＪｅｓｓｅｌｌおよびＫｅｌｌｙ，１９９１「Ｐａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ」ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＮＥＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ，第３版，（Ｋａｎｄｅｌ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，およびＪｅｓｓｅｌｌ（編）），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ

【非特許文献2】Ｍｉｌｌａｎ，１９９９，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５７：１〜１６４

【非特許文献3】ＭｃＭａｈｏｎ，１９９６、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．３５１：４３１〜４０

【非特許文献4】Ａｐｆｅｌ，２０００，Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ １６：Ｓ７−Ｓ１１

【非特許文献5】Ｌｅｗｉｎら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１９０３〜１９１２

【非特許文献6】Ａｐｆｅｌら，１９９８，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：６９５〜７０２

【非特許文献7】Ａｌｏｅら，１９９３，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９：１４９〜１５５

【非特許文献8】Ａｌｏｅら，１９９２、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３５：３５１〜３５５

【非特許文献9】Ｒａｍｅｒら，１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７〜８４６

【非特許文献10】Ｒｏら，１９９９，Ｐａｉｎ ７９：２６５〜２７４

【非特許文献11】Ｈｏｎｇｏら，２０００，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５〜２２７

【非特許文献12】Ｈｏｎｇｏら，１９９３、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９〜５６８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

特に、ＮＧＦのような、疼痛の低分子のメディエーター（媒介因子）または悪化因子（ｅｘａｃｅｒｂａｔｏｒ）を標的にすることによる、疼痛の新規な安全かつ有効な治療の必要性が、明らかに存在する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は、重鎖可変領域を有する重鎖および軽鎖可変領域を有する軽鎖を含み、該重鎖可変領域は配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、単離されたヒト抗体。
（項目２）
前記軽鎖可変領域が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記軽鎖が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを有するヒト軽鎖ＣＤＲ１を含む、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記軽鎖が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを有するヒト軽鎖ＣＤＲ３を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
前記重鎖が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記重鎖が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを有するヒト重鎖ＣＤＲ２を含む、項目１に記載の抗体。
（項目７）
項目１に記載の抗体であって、
ａ．配列番号１０に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｂ．配列番号１４に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｃ．配列番号１８に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；または
ｄ．配列番号２２に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む抗体。
（項目８）
前記重鎖が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを有する重鎖可変領域を含み、そして前記軽鎖が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを有する軽鎖可変領域を含む、項目１に記載の抗体。
（項目９）
前記重鎖が可変領域および定常領域を含み、該可変領域が配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫原性フラグメントを含む、項目１に記載の抗体。
（項目１０）
前記重鎖が、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫原性フラグメントを含む、項目９に記載の抗体。
（項目１１）
前記軽鎖が可変領域および定常領域を含み、該可変領域が配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫原性フラグメントを含む、項目１に記載の抗体。
（項目１２）
前記軽鎖が配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫原性フラグメントを含む、項目１１に記載の抗体。
（項目１３）
項目１に記載の抗体であって、該抗体は、
ａ．ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；
ｂ．ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域；
を含み、該ヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１４に示される重鎖ＣＤＲ３領域であり、該ヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１６に示される軽鎖ＣＤＲ３領域である、抗体。
（項目１４）
前記ヒト重鎖ＣＤＲ２領域が配列番号１８に示される重鎖ＣＤＲ２領域であり、かつ前記ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域が配列番号２０に示される軽鎖ＣＤＲ２領域である、項目１３に記載の単離されたヒト抗体。
（項目１５）
前記ヒト重鎖ＣＤＲ１領域が配列番号２２に示されるＮＧＦの重鎖ＣＤＲ１領域であり、かつ前記ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域が配列番号２４に示される軽鎖ＣＤＲ１領域である、項目１３に記載の単離されたヒト抗体。
（項目１６）
前記抗体が約１×１０^−９以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目１３に記載の抗体。
（項目１７）
前記抗体が約１×１０^−１０以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目１６に記載の抗体。
（項目１８）
前記抗体が約１×１０^−１１以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約０．２×１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目１７に記載の抗体。
（項目１９）
前記重鎖および軽鎖がフレキシブルなリンカーによって接続されて単鎖抗体を形成する、項目１に記載の抗体。
（項目２０）
単鎖Ｆｖ抗体である、項目１９に記載の抗体。
（項目２１）
Ｆａｂ抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２２）
Ｆａｂ’抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２３）
（Ｆａｂ’）_２抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２４）
前記抗体が完全ヒト抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目２５）
前記抗体がＮＧＦシグナル伝達を阻害する、項目１に記載の抗体。
（項目２６）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされる状態を処置する方法であって、項目２５に記載の抗体の薬学的に有効な量を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目２７）
前記状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経的に維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系領域、尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または臓器痛である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量の項目２５に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
（項目２９）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされる状態を処置する方法であって、項目２８に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目３０）
生物学的サンプル中のＮＧＦを検出するための方法であって、
ａ．該サンプルと項目１に記載の抗体とを、ＮＧＦへの該抗体の結合を可能にする条件下で接触させる工程と；
ｂ．該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目３１）
神経成長因子に特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号１０、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５もしくは配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む、抗体。
（項目３２）
前記重鎖が、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７もしくは配列番号７９のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む、項目３１に記載の抗体。
（項目３３）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖が、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１もしくは配列番号１３１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
（項目３４）
前記軽鎖が、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６もしくは配列番号１３１のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む、項目３３に記載の単離された抗体。
（項目３５）
項目３３に記載の抗体であって、前記軽鎖が軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が：
ａ．配列番号８０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８９％もしくは９４％同一であるか；
ｂ．配列番号８８に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも９１％もしくは９４％同一であるか；
ｃ．配列番号８９に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％もしくは８７％同一であるか；
ｄ．配列番号９０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８７％、９１％もしくは９４％同一であるか；
ｅ．配列番号９１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、９４％、９６％もしくは９９％同一であるか；
ｆ．配列番号８２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも９１％、９５％、もしくは９６％同一であるか；
ｇ．配列番号８４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるか；
ｈ．配列番号８６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるか；または
ｉ．配列番号１３１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８６％、８９％、９１％、もしくは９６％同一である；
アミノ酸配列を含む、抗体。
（項目３６）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１６、配列番号１１７もしくは配列番号１１８に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、抗体。
（項目３７）
項目３６に記載の単離されたヒト抗体であって、前記重鎖が、ヒト重鎖ＣＤＲ２を含み、該重鎖ＣＤＲ２が、配列番号９９、配列番号１０６、配列番号１１７、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列である、抗体。
（項目３８）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖が、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、もしくは配列番号１１９〜１３４のいずれか、に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む、抗体。
（項目３９）
項目３８に記載の単離されたヒト抗体であって、該抗体はヒト軽鎖ＣＤＲ１を含み、該ＣＤＲ１が、配列番号１０１、配列番号９５、配列番号１１９、配列番号１２２、配列番号１２５、配列番号１０７、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列である、抗体。
（項目４０）
項目３８に記載の単離されたヒト抗体であって、該抗体はヒト軽鎖ＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ３が、配列番号１０３、配列番号９７、配列番号１２１、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１０９、配列番号１１５、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列である、抗体。
（項目４１）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、ＣＤＲ３を含む重鎖または重鎖のフラグメントを含み、該ＣＤＲ３が、配列番号１４、配列番号１６、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３４からなる配列の群から選択されるアミノ酸配列、およびその改変体を含み、該改変体が、１つ以下のアミノ酸置換、挿入または欠失を含む、抗体。
（項目４２）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる配列の群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、ならびにその改変体を含み、該改変体は、１つ以下のアミノ酸置換、挿入または欠失を含む、抗体。
（項目４３）
項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体であって、前記重鎖および軽鎖がフレキシブルなリンカーによって接続されて単鎖抗体を形成する、抗体。
（項目４４）
単鎖Ｆｖ抗体である、項目４３に記載の抗体。
（項目４５）
Ｆａｂ抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体。
（項目４６）
Ｆａｂ’抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体。
（項目４７）
（Ｆａｂ’）_２抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体。
（項目４８）
前記抗体が完全ヒト抗体である、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体。
（項目４９）
前記抗体が、ＮＧＦシグナル伝達を阻害する、項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体。
（項目５０）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされる状態を処置する方法であって、項目４９に記載の抗体の薬学的に有効な量を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目５１）
前記状態が急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、灼熱痛、交感神経的に維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系領域、尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または臓器痛である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量の項目４９に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
（項目５３）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされる状態を処置する方法であって、項目５２に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目５４）
生物学的サンプル中のＮＧＦを検出するための方法であって、該方法は、
ａ．該サンプルと項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体とを、ＮＧＦへの該抗体の結合を可能にする条件下で接触させる工程と；
ｂ．該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目５５）
項目３１、３３、３６、３８、４１または４２に記載の抗体をコードする、核酸分子。
（項目５６）
項目５５に記載の核酸を含む、宿主細胞。
（項目５７）
項目３１、３３、３６、３８、４１または４２のいずれかに記載の抗体を産生する、単離された細胞株。
（項目５８）
配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号７９〜１３０のいずれか、から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むＮＧＦ特異的結合因子であって、該結合因子はＮＧＦに結合し得る、ＮＧＦ特異的結合因子。
（項目５９）
薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量の項目５８に記載の結合因子を含む、薬学的組成物。
（項目６０）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされる状態を処置する方法であって、項目５８に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目６１）
タンパク質である、項目５８に記載の結合因子。
（項目６２）
項目６１に記載の結合因子をコードする、核酸分子。
（項目６３）
項目６２に記載の核酸を含む、宿主細胞。
（項目６４）
項目６３の結合因子を産生する、単離された細胞株。
（項目６５）
患者においてＮＧＦの発現の増大またはＮＧＦに対する感度の増大によって引き起こされる状態を処置する方法であって、項目５８に記載の結合因子の薬学的に有効な量を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目６６）
前記状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、灼熱痛、交感神経的に維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系領域、尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または臓器痛である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
生物学的サンプル中のＮＧＦを検出するための方法であって、該方法は、
ａ．該サンプルと項目５８に記載の結合因子とを、ＮＧＦへの該結合因子の結合を可能にする条件下で接触させる工程と；
ｂ．該サンプル中の結合した抗体のレベルを測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目６８）
単離された核酸分子であって、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４のいずれか、または配列番号７９〜１３４のいずれか、に示されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（項目６９）
ＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであって、該抗体またはフラグメントは、重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、
ａ．式：
ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５
のアミノ酸配列であって、
ａ^１が極性親水性アミノ酸残基であり；
ａ^２が芳香族アミノ酸残基であり；
ａ^３が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基であり；
ａ^４が中性の疎水性アミノ酸残基または脂肪族アミノ酸残基であり；そして
ａ^５が脂肪族アミノ酸残基または極性親水性アミノ酸残基である；
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ．式：
ｂ^１ｂ^２ｂ^３ｂ^４ｂ^５ｂ^６ｂ^７ｂ^８ｂ^９ｂ^１０ｂ^１１ｂ^１２ｂ^１３ｂ^１４ｂ^１５ｂ^１６ｂ^１７
のアミノ酸配列であって、
ｂ^１が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ^２が脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；
ｂ^３が極性親水性アミノ酸残基、または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ^４が極性親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ^５−ｂ^９が独立して極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｂ^１０が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｂ^１１が芳香族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^１２が脂肪族の疎水性アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^１３が脂肪族アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、または極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^１４およびｂ^１６が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；
ｂ^１５が脂肪族アミノ酸残基または芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；そして
ｂ^１７が脂肪族酸性のアミノ酸残基である
アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ．式：
ｃ^１ｃ^２ｃ^３ｃ^４ｃ^５ｃ^６ｃ^７ｃ^８ｃ^９ｃ^１０ｃ^１１ｃ^１２ｃ^１３ｃ^１４ｃ^１５ｃ^１６ｃ^１７
のアミノ酸配列であって、
ｃ^１が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；
ｃ^２が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^３およびｃ^４が独立して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ^５が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族アミノ酸残基であり；
ｃ^６が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ^７が極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ^８が極性の親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残基であり；
ｃ^９が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１０が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１１−ｃ^１３が独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１４が脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１５が極性の親水性アミノ酸残基もしくは中性の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１６が存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であり；そして
ｃ^１７が芳香族の疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基である
アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域と；
を含み、該抗体またはフラグメントは、約１×１０^−９以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、
抗体またはフラグメント。
（項目７０）
項目６９に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ^１が極性親水性アミノ酸残基であり；
ａ^２が芳香族疎水性アミノ酸残基であり；
ａ^３が脂肪族疎水性アミノ酸残基であり；
ａ^４が中性の疎水性アミノ酸残基であり；
ａ^５が極性親水性アミノ酸残基であり；
ｂ^１が脂肪族または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ^２がＩｌｅであり；
ｂ^３が極性親水性アミノ酸残基であり；
ｂ^４が極性親水性アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基であり；
ｂ^５−ｂ^９が独立して極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｂ^１０が脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｂ^１１がＴｙｒであり；
ｂ^１２が脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｂ^１３が脂肪族アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^１４およびｂ^１６が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；そして
ｂ^１５が脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｂ^１７が脂肪族酸性のアミノ酸残基であり；
ｃ^１が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；
ｃ^２が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^３およびｃ^４が独立して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ^５が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基であり；
ｃ^６が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ^７が極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；
ｃ^８が極性の親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残基であり；
ｃ^９が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１０が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１１−ｃ^１３が独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１４が脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１５が極性の親水性アミノ酸残基もしくは中性の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^１６が存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であり；そして
ｃ^１７が芳香族の疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基である、
抗体またはフラグメント。
（項目７１）
項目６９に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ^１がＳｅｒ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ａ^２がＴｙｒであり；ａ^３がＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＧｌｙであり；ａ^４がＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ^５がＨｉｓ、ＧｌｙまたはＡｓｎであり；ｂ^１がＴｙｒ，Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｓｐであり；ｂ^２がＩｌｅであり；ｂ^３がＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり；ｂ^４がＴｒｐ、ＡｒｇまたはＰｒｏであり；ｂ^５がＳｅｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙであり；ｂ^６がＳｅｒ、Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、ｂ^７がＳｅｒ、ＨｉｓまたはＧｌｙであり；ｂ^８がＳｅｒ、Ｉｌｅ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ｂ^９がＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ^１０がＧｌｙ、ＬｙｓまたはＰｈｅであり；ｂ^１１がＴｙｒであり；ｂ^１２がＡｌａまたはＳｅｒであり；ｂ^１３がＡｓｐ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；ｂ^１４がＳｅｒであり；ｂ^１５がＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ^１６がＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ^１７がＧｌｙであり；ｃ^１が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ^２が存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ^３およびｃ^４が独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＧｌｕであり；ｃ^５が存在しないか、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｒｐであり；ｃ^６が存在しないかまたはＳｅｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｕもしくはＬｅｕであり；ｃ^７がＧｌｙ、ＡｒｇまたはＡｓｐであり；ｃ^８がＴｒｐ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ^９がＨｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり；ｃ^１０がＶａｌ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；ｃ^１１−ｃ^１３が独立して、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；ｃ^１４がＰｈｅ、ＶａｌまたはＧｌｙであり；ｃ^１５がＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ^１６が存在しないかＡｓｐまたはＡｓｎであり；そしてｃ^１７がＴｙｒまたはＶａｌである、
抗体またはフラグメント。
（項目７２）
項目６９に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ^１がＳｅｒまたはＡｓｐであり；ａ^２がＴｙｒであり；ａ^３がＡｌａまたはＳｅｒであり；ａ^４がＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ^５がＨｉｓまたはＡｓｎであり；ｂ^１がＴｙｒまたはＧｌｙであり；ｂ^２がＩｌｅであり；ｂ^３がＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり；ｂ^４がＴｒｐ、ＡｒｇまたはＰｒｏであり；ｂ^５がＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ^６がＳｅｒまたはＡｒｇであり、ｂ^７がＨｉｓまたはＧｌｙであり；ｂ^８がＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ^９がＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ^１０がＧｌｙまたはＰｈｅであり；ｂ^１１がＴｙｒであり；ｂ^１２がＡｌａまたはＳｅｒであり；ｂ^１３がＡｓｐまたはＧｌｙであり；ｂ^１４がＳｅｒであり；ｂ^１５がＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ^１６がＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ^１７がＧｌｙであり；ｃ^１が存在しないか、またはＧｌｙであり；ｃ^２が存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ^３およびｃ^４が独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＶａｌであり；ｃ^５が存在しないかまたはＳｅｒであり；ｃ^６がＳｅｒまたはＧｌｙであり；ｃ^７がＧｌｙまたはＡｒｇであり；ｃ^８がＴｒｐまたはＰｒｏであり；ｃ^９がＨｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり；ｃ^１０がＶａｌまたはＴｙｒであり；ｃ^１１−ｃ^１３が独立して、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＡｓｐであり；ｃ^１４がＰｈｅまたはＶａｌであり；ｃ^１５がＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ^１６が存在しないかまたはＡｓｐであり；そしてｃ^１７がＴｙｒまたはＶａｌである、
抗体またはフラグメント。
（項目７３）
項目６９に記載の抗体であって：
ａ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｂ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号９３に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号９４に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｃ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号９８に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号９９に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号１００に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｄ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号１０４に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号１０６に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｅ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有するか；または
ｆ）前記重鎖ＣＤＲ１が配列番号１１６に示されるアミノ酸配列を有し、前記重鎖ＣＤＲ２が配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号１１８に示されるアミノ酸配列を有する、
抗体。
（項目７４）
ＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであって、該抗体またはフラグメントが軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は、
ａ．式：
ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２
のアミノ酸配列であって、
ａ^１が極性親水性アミノ酸残基であり；
ａ^２、ａ^１１およびａ^１２が独立して脂肪族アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基であり；
ａ^３、ａ^５、ａ^７およびａ^８が独立して脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；
ａ^４が極性の親水性アミノ酸残基であり；
ａ^６が脂肪族または疎水性のアミノ酸残基であり；
ａ^９が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水性アミノ酸残基であり；そして
ａ^１０が脂肪族アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基である；
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ．式：
ｂ^１ｂ^２ｂ^３ｂ^４ｂ^５ｂ^６ｂ^７
のアミノ酸配列であって、
ｂ^１が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^２が脂肪族アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^３およびｂ^４が独立して極性親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^５が極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^６が極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；そして
ｂ^７が極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ．式：
ｃ^１ｃ^２ｃ^３ｃ^４ｃ^５ｃ^６ｃ^７ｃ^８ｃ^９ｃ^１０ｃ^１１ｃ^１２ｃ^１３ｃ^１４ｃ^１５ｃ^１６ｃ^１７
のアミノ酸配列であって、
ｃ^１およびｃ^２が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；
ｃ^３が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ^４、ｃ^５およびｃ^６が独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残基、もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ^７が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ^８が極性の親水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；そして
ｃ^９が極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域と；
を含み、
該抗体またはフラグメントは約１×１０^−９以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、
抗体またはフラグメント。
（項目７５）
項目７４に記載の抗体またはフラグメントであって：
ａ^１、ａ^３、ａ^４、ａ^７およびａ^８が独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；
ａ^２、ａ^６、ａ^１１およびａ^１２が独立して脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；
ａ^５が極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；
ａ^９が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水性アミノ酸残基であり；
ａ^１０が脂肪族アミノ酸残基または芳香族のアミノ酸残基であり；
ｂ^１が脂肪族アミノ酸残基、極性の疎水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^２が脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^３、ｂ^４、およびｂ^７が独立して、極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｂ^５およびｂ^６が独立して極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ^１およびｃ^２が独立して極性の親水性のアミノ酸残基であり；
ｃ^３が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ^４、ｃ^５、およびｃ^６が独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性のアミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ^７が存在しないかまたは脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；
ｃ^８が疎水性のアミノ酸残基であり；そして
ｃ^９が極性の親水性アミノ酸残基である、
抗体またはフラグメント。
（項目７６）
項目７５に記載の抗体またはフラグメントであって、
ａ^１、ａ^３、ａ^４およびａ^７がそれぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｎおよびＳｅｒであり；
ａ^２がＡｌａであり；
ａ^５がＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ａ^８がＳｅｒまたはＩｌｅであり；
ａ^９が存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；
ａ^１０がＡｌａ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
ｂ^１がＡｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＶａｌであり；
ｂ^２およびｂ^３がそれぞれＡｌａおよびＳｅｒであり；
ｂ^４がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｂ^５がＬｅｕまたはＡｒｇであり；
ｂ^６がＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；
ｂ^７がＳｅｒまたはＴｈｒであり；
ｃ^１およびｃ^２がＧｌｎであり；
ｃ^３がＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；
ｃ^４がＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ｃ^５がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｃ^６がＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
ｃ^７が存在しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり；
ｃ^８がＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；そして
ｃ^９がＴｈｒである、
抗体またはフラグメント。
（項目７７）
項目７５に記載の抗体またはフラグメントであって、
ａ^１、ａ^３、ａ^４およびａ^７がそれぞれ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｎおよびＳｅｒであり；
ａ^５がＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ａ^８がＳｅｒまたはＩｌｅであり；
ａ^９が存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；
ａ^１０がＡｌａまたはＴｙｒであり；
ｂ^１がＡｓｐまたはＧｌｙであり；
ｂ^２およびｂ^３がそれぞれＡｌａおよびＳｅｒであり；
ｂ^４がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｂ^５がＬｅｕまたはＡｒｇであり；
ｂ^６がＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；
ｂ^７がＳｅｒまたはＴｈｒであり；
ｃ^１およびｃ^２がＧｌｎであり；
ｃ^３がＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；
ｃ^４がＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；
ｃ^５がＳｅｒまたはＡｓｎであり；
ｃ^６がＴｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；
ｃ^７が存在しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり；
ｃ^８がＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；そして
ｃ^９がＴｈｒである、
抗体またはフラグメント。
（項目７８）
項目７４に記載の抗体であって、
ａ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｂ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号９５に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号９６に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号９７に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｃ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｄ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｅ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１１５に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｆ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｇ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２２に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１２３に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１２４に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｈ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２５に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１２６に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１２７に示されるアミノ酸配列を有するか；
ｉ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１２８に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１２９に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１３０に示されるアミノ酸配列を有するか；または
ｊ）前記軽鎖ＣＤＲ１が配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２が配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を有する、
抗体。
（項目７９）
項目６９〜７８のいずれかに記載の抗体またはフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
（項目８０）
項目７９に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（項目８１）
項目８０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
（項目８２）
前記細胞が真核生物細胞である、項目８１に記載の宿主細胞。
（項目８３）
前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目８２に記載の宿主細胞。
（項目８４）
ＮＧＦの発現増大またはＮＧＦに対する感度の増大と関連する疼痛性の障害または状態を処置するための医薬であって、該医薬は、薬学的に有効な量のモノクローナル抗体もしくはその免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント、または該モノクローナル抗体もしくは該フラグメントの薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含み、該モノクローナル抗体は、項目１に記載のモノクローナル抗体のうちの少なくとも１つである、医薬。
（項目８５）
項目８４に記載の医薬であって、前記モノクローナル抗体が、
ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｂ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
ｃ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；あるいは
ｄ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、その抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む医薬。
（項目８６）
ＮＧＦの発現増大またはＮＧＦに対する感度の増大に関連する疼痛性の障害または状態を治療するための医薬であって、該医薬は、薬学的に有効な量のモノクローナル抗体もしくはその免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含み、該抗体もしくは該フラグメントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、医薬。
（項目８７）
前記モノクローナル抗体が約１×１０^−９以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目８６に記載の医薬。
（項目８８）
前記抗体が約１×１０^−１０以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目８６に記載の医薬。
（項目８９）
前記抗体が約１×１０^−１１以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約０．２×１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目８６に記載の医薬。
（項目９０）
ＮＧＦの発現増大またはＮＧＦに対する感度の増大に関連する疼痛性の障害または状態を処置するために適切な医薬の製造のための、薬学的に有効な量の項目１に記載の抗体の使用。
（項目９１）
前記モノクローナル抗体が約１×１０^−９以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目９０に記載の使用。
（項目９２）
前記抗体が約１×１０^−１０以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目９０に記載の使用。
（項目９３）
前記抗体が約１×１０^−１１以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約０．２×１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する、項目９０に記載の使用。
（項目９４）
前記疼痛性障害または状態が、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素、化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群または非脈管性症候群、緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、線維筋痛症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏もしくは異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経的に維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系領域、尿生殖器領域、胃腸系領域もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、または臓器痛である、状態からなる群より選択される、項目９３に記載の使用。
（項目９５）
ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体であって、該抗体は、
（ａ）配列番号７９に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
（ｂ）配列番号８１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
（ｃ）配列番号８３に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；あるいは（ｄ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む、抗体。

【0011】

（発明の要旨）
本発明は、疼痛を管理するために治療上有用である新規なヒトモノクローナル抗体を提供する。詳細には、本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するモノクローナル抗体を提供する。好ましくはこのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり、ＮＧＦの生物学的活性を中和して、ＮＧＦ媒介性疼痛応答の影響を緩和するのに有用である。また本発明によって、本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞、最も好ましくは本発明のモノクローナル抗体を細胞培養培地中に分泌する細胞も提供される。疼痛を処置および管理するためのその使用に加えて、本発明の抗体は、神経障害性のおよび炎症性の疼痛関連応答を処置するために有用である。

【0012】

本発明はさらに、ある抗体のＦｃ領域の配列ならびに配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２および配列番号７９〜１３０として特定される１つ以上の配列を含む融合タンパク質を提供する。このような分子は、例えば、参照として援用される、国際特許出願公開番号ＷＯ００／２４７８２に記載されるような方法を用いて調製され得る。このような分子は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）において、または細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）において発現され得る。

【0013】

特定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を提供し、この重鎖は、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そして重鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。好ましくは、この重鎖は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

【0014】

特定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む、抗体、好ましくはヒト抗体、そしてさらに好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体を提供し、この重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ重鎖定常領域からなる群より選択される重鎖定常領域、またはその任意の対立遺伝子改変体を含み（参照によって本明細書に援用される、Ｋａｂａｔら，１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２に考察されるとおり）、そしてこの重鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号４に示されるＩｇＧ２重鎖定常領域のアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。

【0015】

特定の態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む、抗体、好ましくはヒト抗体、そしてさらに好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体を提供し、この軽鎖は、配列番号８に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてこの軽鎖の可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。

【0016】

特定の態様では、本発明の抗体は重鎖および軽鎖を含み、この重鎖の可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。他の態様では、この軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。さらなる態様では、上記重鎖は、配列番号１４、配列番号１８または配列番号２０のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。なおさらなる態様では、上記軽鎖は、配列番号１６、２０、２４のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。

【0017】

本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を提供するが、この重鎖は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む可変領域を含み、そしてこの軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む可変領域を含む。

【0018】

本発明はさらに、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体を提供するが、この抗体は：
（ａ）配列番号７９に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８０に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖か；
（ｂ）配列番号８１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８２に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖か；
（ｃ）配列番号８３に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖か；あるいは
（ｄ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を有する重鎖、および配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を有する軽鎖；
を含む。

【0019】

特定の態様では、本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含む抗体を提供するが、ここで、この重鎖は重鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％そして最も好ましくは約９９％同一である配列を含み、そしてこの軽鎖は、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％そして最も好ましくは約９９％同一である配列を含み、そしてこの抗体は、ＮＧＦに特異的に結合する。

【0020】

本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を提供するが、ここで、この重鎖は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含み、そしてこの軽鎖は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む。

【0021】

特定の態様では、本発明は、重鎖と軽鎖とを含む抗体を提供するが、ここで、この重鎖は重鎖可変領域を含み、この重鎖可変領域は、配列番号１４、配列番号１８または配列番号２２のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％そして最も好ましくは約９９％同一である配列を含み、そしてこの軽鎖は、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％そして最も好ましくは約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、そしてこの抗体は、ＮＧＦに特異的に結合する。

【0022】

本発明はまた、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆ（ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ）’抗体および（Ｆａｂ’）_２抗体を提供する。

【0023】

特定の態様では、本発明は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖を提供する。

【0024】

さらに、本発明は、配列番号１４、配列番号１８もしくは配列番号２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖を提供する。

【0025】

本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体に関するが、ここでこの抗体は、（ａ）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域；ならびに（ｂ）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域を含む。特定の態様では、このヒト重鎖ＣＤＲ１領域は、配列番号２２に示されるような４Ｄ４と命名されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖ＣＤＲ１領域であってもよく、そしてこのヒト軽鎖ＣＤＲ１領域は、配列番号２４に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１領域であってもよい。他の態様では、このヒト重鎖ＣＤＲ２領域は、配列番号１８に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２領域であってもよく、そしてこのヒト軽鎖ＣＤＲ２領域は、配列番号２０に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２領域であってもよい。さらに他の態様では、このヒト重鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１４に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３領域であり、そしてこのヒト軽鎖ＣＤＲ３領域は、配列番号１６に示されるようなｍＡｂ ４Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３領域である。

【0026】

本発明はまた、重鎖と軽鎖とを含む、神経成長因子に特異的に結合する単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの重鎖は、配列番号１０、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５または配列番号８７に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む重鎖可変領域を含む。

【0027】

本発明はさらに、重鎖と軽鎖とを含む、ＮＧＦに特異的に結合する単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの軽鎖は、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１もしくは配列番号１３１に示されるアミノ酸配列、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む軽鎖可変領域を含む。

【0028】

本発明の抗体は、ＮＧＦポリペプチドに関連する少なくとも１つのインビトロおよび／またはインビボの活性をアンタゴナイズする能力によって特徴付けられる。好ましくは、本発明は、ＮＧＦポリペプチドに対して高親和性の結合を有する単離された抗ヒトＮＧＦヒト抗体を提供するが、ここでこの抗体は、ヒトＮＧＦポリペプチドに結合して、ＫｉｎＥｘＡを用いて決定される場合、約５０×１０^−１２Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＮＧＦポリペプチドから解離するか、またはインビトロ中和アッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する。

【0029】

好ましい実施形態では、本発明は、以下の特徴を有する単離された抗ヒトＮＧＦヒト抗体を提供する：
ａ）インビトロ中和アッセイにおいて約１×１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０でＮＧＦ誘導性生存を阻害する；
ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有する；そして
ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。

【0030】

本発明はまた、高い親和性でＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを提供するが、ここでこの抗体またはフラグメントは、約１×１０^−９以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和し、そしてこの抗体またはフラグメントは、以下を含む重鎖可変領域を含む：
ａ）式：
ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５
のアミノ酸配列であって、
ａ^１が極性親水性アミノ酸残基であり；ａ^２が芳香族アミノ酸残基であり；ａ^３が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基であり；ａ^４が中性の疎水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；そしてａ^５が脂肪族アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ）式：
ｂ^１ｂ^２ｂ^３ｂ^４ｂ^５ｂ^６ｂ^７ｂ^８ｂ^９ｂ^１０ｂ^１１ｂ^１２ｂ^１３ｂ^１４ｂ^１５ｂ^１６ｂ^１７
のアミノ酸配列であって、
ｂ^１が脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ^２が脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｂ^３が極性の親水性アミノ酸残基、または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ^４が極性親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ^５−ｂ^９が独立して、極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ^１０が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ^１１が芳香族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ^１２が脂肪族の疎水性アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基であり；ｂ^１３が脂肪族アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基、または極性の親水性のアミノ酸残基であり；ｂ^１４およびｂ^１６が独立して、極性の親水性アミノ酸残基であり；ｂ^１５が脂肪族アミノ酸残基または芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；そしてｂ^１７が脂肪族の酸性アミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ）式：
ｃ^１ｃ^２ｃ^３ｃ^４ｃ^５ｃ^６ｃ^７ｃ^８ｃ^９ｃ^１０ｃ^１１ｃ^１２ｃ^１３ｃ^１４ｃ^１５ｃ^１６ｃ^１７
のアミノ酸配列であって、
ｃ^１が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ^２が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^３およびｃ^４が独立して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性のアミノ酸残基、もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ^５が存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族アミノ酸残基であり；ｃ^６が存在しないか、または極性の親水性もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ^７が極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ^８が極性の親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残基であり；ｃ^９が極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１０が極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１１−ｃ^１３が独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１４が脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１５が極性の親水性アミノ酸残基もしくは中性の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１６が存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であり；そしてｃ^１７が芳香族の疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域。

【0031】

１態様では、ａ^１は極性の親水性アミノ酸残基であり；ａ^２は芳香族疎水性のアミノ酸残基であり；ａ^３は脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ａ^４は中性の疎水性アミノ酸残基であり；ａ^５は極性親水性のアミノ酸残基であり；ｂ^１は脂肪族アミノ酸残基または芳香族のアミノ酸残基であり；ｂ^２はＩｌｅであり；ｂ^３は極性の親水性アミノ酸残基であり；ｂ^４は極性の親水性アミノ酸残基アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基であり；ｂ^５−ｂ^９が独立して、極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ^１０は脂肪族のアミノ酸残基であり；ｂ^１１はＴｙｒであり；ｂ^１２は脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｂ^１３は脂肪族アミノ酸残基または極性の親水性のアミノ酸残基であり；ｂ^１４およびｂ^１６は独立して、極性の親水性アミノ酸残基であり；そしてｂ^１５は脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｂ^１７が脂肪族の酸性のアミノ酸残基であり；ｃ^１は存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ^２は存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^３およびｃ^４は独立して、存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基、芳香族疎水性のアミノ酸残基、もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ^５は存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基であり；ｃ^６は存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ^７は極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族のアミノ酸残基であり；ｃ^８は極性の親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基もしくは芳香族のアミノ酸残基であり；ｃ^９は極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１０は極性の親水性アミノ酸残基、芳香族の疎水性アミノ酸残基、もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１１−ｃ^１３は独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１４は脂肪族アミノ酸残基もしくは芳香族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１５は極性の親水性もしくは中性の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^１６は存在しないかまたは極性の親水性アミノ酸残基であり；そしてｃ^１７は芳香族の疎水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基である。

【0032】

特定の態様では、ａ^１はＳｅｒ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ａ^２はＴｙｒであり；ａ^３はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＧｌｙであり；ａ^４はＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ^５はＨｉｓ、ＧｌｙまたはＡｓｎであり；ｂ^１はＴｙｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＡｓｐであり；ｂ^２はＩｌｅであり；ｂ^３はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり；ｂ^４はＴｒｐ、ＡｒｇまたはＰｒｏであり；ｂ^５はＳｅｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙであり；ｂ^６はＳｅｒ、Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、ｂ^７はＳｅｒ、ＨｉｓまたはＧｌｙであり；ｂ^８はＳｅｒ、Ｉｌｅ、ＡｓｐまたはＴｈｒであり；ｂ^９はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ^１０はＧｌｙ、ＬｙｓまたはＰｈｅであり；ｂ^１１はＴｙｒであり；ｂ^１２はＡｌａまたはＳｅｒであり；ｂ^１３はＡｓｐ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；ｂ^１４はＳｅｒであり；ｂ^１５はＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ^１６はＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ^１７はＧｌｙであり；ｃ^１は存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基であり；ｃ^２は存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ^３およびｃ^４は独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＧｌｕであり；ｃ^５は存在しないか、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり；ｃ^６は存在しないか、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＬｅｕであり；ｃ^７はＧｌｙ、ＡｒｇまたはＡｓｐであり；ｃ^８はＴｒｐ、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ^９はＨｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり、ｃ^１０はＶａｌ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；ｃ^１１−ｃ^１３は独立して、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；ｃ^１４はＰｈｅ、ＶａｌまたはＧｌｙであり；ｃ^１５はＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ^１６は存在しないか、ＡｓｐであるかまたはＡｓｎであり；そしてｃ^１７はＴｙｒまたはＶａｌである。

【0033】

別の特定の態様では、ａ^１はＳｅｒまたはＡｓｐであり；ａ^２はＴｙｒであり；ａ^３はＡｌａまたはＳｅｒであり；ａ^４はＭｅｔまたはＩｌｅであり；ａ^５はＨｉｓまたはＡｓｎであり；ｂ^１はＴｙｒまたはＧｌｙであり；ｂ^２はＩｌｅであり；ｂ^３はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎであり；ｂ^４はＴｒｐ、ＡｒｇまたはＰｒｏであり；ｂ^５はＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ^６はＳｅｒまたはＡｒｇであり；ｂ^７はＨｉｓまたはＧｌｙであり；ｂ^８はＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ^９はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒであり；ｂ^１０はＧｌｙまたはＰｈｅであり；ｂ^１１はＴｙｒであり；ｂ^１２はＡｌａまたはＳｅｒであり；ｂ^１３はＡｓｐまたはＧｌｙであり；ｂ^１４はＳｅｒであり；ｂ^１５はＶａｌまたはＰｈｅであり；ｂ^１６はＬｙｓまたはＧｌｎであり；ｂ^１７はＧｌｙであり；ｃ^１は存在しないか、またはＧｌｙであり；ｃ^２は存在しないか、またはＴｙｒであり；ｃ^３およびｃ^４は独立して、存在しないか、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＶａｌであり；ｃ^５は存在しないかまたはＳｅｒであり；ｃ^６はＳｅｒまたはＧｌｙであり；ｃ^７はＧｌｙまたはＡｒｇであり；ｃ^８はＴｒｐまたはＰｒｏであり；ｃ^９はＨｉｓ、ＧｌｙまたはＴｙｒであり；ｃ^１０はＶａｌまたはＴｙｒであり；ｃ^１１−ｃ^１３は独立して、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＡｓｐであり；ｃ^１４はＰｈｅまたはＶａｌであり；ｃ^１５はＭｅｔまたはＡｓｐであり；ｃ^１６は存在しないかまたはＡｓｐであり；そしてｃ^１７はＴｙｒまたはＶａｌである。

【0034】

他の特定の態様では：
ａ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号９２に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号９３に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号９４に示されるアミノ酸配列を有し；
ｃ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号９８に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号９９に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１００に示されるアミノ酸配列を有し；
ｄ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号１０４に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１０６に示されるアミノ酸配列を有し；
ｅ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号１１０に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号１１１に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１１２に示されるアミノ酸配列を有し；そして
ｆ）上記重鎖ＣＤＲ１は配列番号１１６に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を有し、そして重鎖ＣＤＲ３は配列番号１１８に示されるアミノ酸配列を有する。

【0035】

本発明はまた、ＮＧＦに特異的に結合する、単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを提供するが、ここでこの抗体またはフラグメントは、軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域は、以下：
ａ）式：
ａ^１ａ^２ａ^３ａ^４ａ^５ａ^６ａ^７ａ^８ａ^９ａ^１０ａ^１１ａ^１２
のアミノ酸配列であって、
ａ^１が極性親水性アミノ酸残基であり；ａ^２、ａ^１１およびａ^１２が独立して、脂肪族アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基であり；ａ^３、ａ^５、ａ^７およびａ^８が独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；ａ^４が極性の親水性アミノ酸残基であり；ａ^６が脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；ａ^９が存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水性アミノ酸残基であり；そしてａ^１０が脂肪族アミノ酸残基、芳香族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域と；
ｂ）式：
ｂ^１ｂ^２ｂ^３ｂ^４ｂ^５ｂ^６ｂ^７
のアミノ酸配列であって、
ｂ^１は脂肪族アミノ酸残基、極性疎水性アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ^２は脂肪族アミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ^３およびｂ^４は独立して、極性親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ^５は極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ^６は極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；そしてｂ^７は極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域と；
ｃ）式： ｃ^１ｃ^２ｃ^３ｃ^４ｃ^５ｃ^６ｃ^７ｃ^８ｃ^９ｃ^１０ｃ^１１ｃ^１２ｃ^１３ｃ^１４ｃ^１５ｃ^１６ｃ^１７
のアミノ酸配列であって、
ｃ^１およびｃ^２は独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；ｃ^３は極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ^４、ｃ^５およびｃ^６は独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性アミノ酸残基、もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ^７は存在しないか、または極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ｃ^８は極性の親水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；そしてｃ^９は極性の親水性のアミノ酸残基である、
アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域と；
を含み、
この抗体またはフラグメントは約１×１０^−９以下のＫ_ＤでヒトＮＧＦポリペプチドから解離して、標準的なインビトロアッセイにおいて、約１×１０^−８Ｍ以下のＩＣ_５０でヒトＮＧＦ生物活性を中和する。

【0036】

１態様では、ａ^１、ａ^３、ａ^４、ａ^７およびａ^８は独立して極性の親水性アミノ酸残基であり；ａ^２、ａ^６、ａ^１１およびａ^１２は独立して脂肪族の疎水性アミノ酸残基であり；ａ^５は極性の親水性アミノ酸残基または脂肪族のアミノ酸残基であり；ａ^９は存在しないか、または脂肪族アミノ酸残基もしくは極性の親水性アミノ酸残基であり；ａ^１０は脂肪族アミノ酸残基または芳香族のアミノ酸残基であり；ｂ^１は脂肪族アミノ酸残基、極性の疎水性アミノ酸残基もしくは疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ^２は脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；ｂ^３、ｂ^４、およびｂ^７は独立して、極性の親水性のアミノ酸残基であり；ｂ^５およびｂ^６は独立して、極性の親水性アミノ酸残基もしくは脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ^１およびｃ^２は独立して極性の親水性のアミノ酸残基であり；ｃ^３は極性の親水性アミノ酸残基、脂肪族アミノ酸残基または疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ^４、ｃ^５、およびｃ^６は独立して、脂肪族アミノ酸残基、極性の親水性のアミノ酸残基、または疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ^７は存在しないかまたは脂肪族の疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ^８は疎水性のアミノ酸残基であり；ｃ^９は極性の親水性アミノ酸残基である。

【0037】

特定の態様では、ａ^１、ａ^３、ａ^４およびａ^７はそれぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｎおよびＳｅｒであり；ａ^２はＡｌａであり；ａ^５はＧｌｙまたはＳｅｒであり；ａ^８はＳｅｒまたはＩｌｅであり；ａ^９は存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；ａ^１０はＡｌａ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；ｂ^１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＶａｌであり；ｂ^２およびｂ^３はそれぞれＡｌａおよびＳｅｒであり；ｂ^４はＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ^５はＬｅｕまたはＡｒｇであり；ｂ^６はＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；ｂ^７はＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ^１およびｃ^２はＧｌｎであり；ｃ^３はＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；ｃ^４はＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；ｃ^５はＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｃ^６はＴｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；ｃ^７は存在しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり；ｃ^８はＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；そしてｃ^９はＴｈｒである。

【0038】

別の特定の態様では、ａ^１、ａ^２、ａ^３、ａ^４およびａ^７はそれぞれ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｎおよびＳｅｒであり；ａ^５はＧｌｙまたはＳｅｒであり；ａ^８はＳｅｒまたはＩｌｅであり；ａ^９は存在しないか、ＳｅｒまたはＧｌｙであり；ａ^１０はＡｌａまたはＴｙｒであり；ｂ^１はＡｓｐまたはＧｌｙであり；ｂ^２およびｂ^３はそれぞれＡｌａおよびＳｅｒであり；ｂ^４はＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｂ^５はＬｅｕまたはＡｒｇであり；ｂ^６はＧｌｕ、ＡｌａまたはＧｌｎであり；ｂ^７はＳｅｒまたはＴｈｒであり；ｃ^１およびｃ^２はＧｌｎであり；ｃ^３はＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；ｃ^４はＡｓｎ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり；ｃ^５はＳｅｒまたはＡｓｎであり；ｃ^６はＴｙｒ、Ｓｅｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅであり；ｃ^７は存在しないか、ＰｒｏまたはＨｉｓであり；ｃ^８はＬｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＡｒｇであり；そしてｃ^９はＴｈｒである。

【0039】

別の特定の態様では：
ａ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号９５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号９６に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号９７に示されるアミノ酸配列を有し；
ｃ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を有し；
ｄ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１０７に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を有し；
ｅ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１１３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１１５に示されるアミノ酸配列を有し；
ｆ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１２１に示されるアミノ酸配列を有し；
ｇ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１２２に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１２３に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１２４に示されるアミノ酸配列を有し；
ｈ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１２５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１２６に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１２７に示されるアミノ酸配列を有し；
ｉ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１２８に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１２９に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１３０に示されるアミノ酸配列を有し；そして
ｊ）上記軽鎖ＣＤＲ１は配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１３３に示されるアミノ酸配列を有し、そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１３４に示されるアミノ酸配列を有する。

【0040】

また本発明の一部は、新規な抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチド配列、抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、抗ヒトＮＧＦヒト抗体をコードするポリヌクレオチドを組み込むベクターで形質転換された宿主細胞、抗ヒトＮＧＦヒト抗体を含む処方物、ならびにこれらを作製および用いる方法である。

【0041】

本発明はまた、生物学的サンプル中のＮＧＦのレベルを検出するための方法であって、このサンプルと本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させる工程を包含する方法を提供する。本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦの検出および定量について、任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接的なサンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において使用され得る（Ｓｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４７〜１５８頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。この抗体は、使用されているアッセイ方法に適切である親和性でＮＧＦに結合し得る。

【0042】

さらに、本発明は、ＮＧＦの産生増大またはＮＧＦに対する感度の増大を伴う疾患を処置するための方法を提供するが、ここでこの方法は、本発明の少なくとも１つの抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを含む薬学的組成物の薬学的に有効な量を、そのような処置を必要としている個体に投与する工程を包含する。

【0043】

本発明の特定の好ましい実施形態は、以下の特定の好ましい実施形態のさらに詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】図１は、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおける、ハイブリドーマ馴化培地から精製された４Ｄ４モノクローナル抗体による、ＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示す。

【図2】図２は、ヒトＮＧＦ活性によって刺激されたＶＲ１発現、およびＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおける、ハイブリドーマ馴化培地から精製された抗ＮＧＦモノクローナル抗体（４Ｄ４）による、ＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示す。

【図3】図３は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２のいずれかとして発現され、そして細胞中でローラーボトル培養（Ｒ）中またはスピナーフラスコ（Ｓ）のいずれかで増殖された場合の、一過性に発現された組み換え抗ＮＧＦ ４Ｄ４モノクローナル抗体による、ＤＲＧニューロンベースの中和バイオアッセイにおける、ＮＧＦ活性の中和を実証するグラフを示す。

【図4】図４は、ニューロトロフィンの配列のアラインメントを示す。この配列の上のナンバリングおよび二次構造エレメントは、成熟ヒトＮＧＦを指す。保存された残基には星でマークをつけており、低い配列相同性の領域は影付きにしている。ＮＧＦヒトは、配列番号１３５であり；ＮＧＦマウスは配列番号１３６であり；ＢＤＮＦは配列番号１３７であり；ＮＴ３は配列番号１３８である。

【図5】図５は、１４Ｄ１０（配列番号９８）、６Ｈ９（配列番号１０４）、７Ｈ２（配列番号１１０）、４Ｇ６（配列番号１１６）、１４Ｄ１１（配列番号９２）および４Ｄ４（配列番号２２）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ１重鎖のアラインメント、ならびに同一性パーセントを示す。

【図6】図６は、１４Ｄ１０（配列番号９９）、６Ｈ９（配列番号１０５）、７Ｈ２（配列番号１１１）、４Ｇ６（配列番号１１７）、１４Ｄ１１（配列番号９３）および４Ｄ４（配列番号１８）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ２重鎖のアラインメント、ならびに同一性パーセントを示す。

【図7】図７は、１４Ｄ１０（配列番号１００）、６Ｈ９（配列番号１０６）、７Ｈ２（配列番号１１２）、４Ｇ６（配列番号１１８）、１４Ｄ１１（配列番号９４）および４Ｄ４（配列番号１４）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ３重鎖のアラインメント、ならびに同一性パーセントを示す。

【図8】図８は、１４Ｄ１０（配列番号９５）、６Ｈ９（配列番号１０７）、７Ｈ２（配列番号１１３）、４Ｇ６ａ（配列番号１１９）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２２）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２５）、４Ｇ６ｄ（配列番号１２８）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３２）、１４Ｄ１１（配列番号９５）および４Ｄ４（配列番号２４）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ１軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。

【図9】図９は、１４Ｄ１０（配列番号９６）、６Ｈ９（配列番号１０８）、７Ｈ２（配列番号１１４）、４Ｇ６ａ（配列番号１２０）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２３）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２６）、４Ｇ６ｄ（配列番号１２９）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３３）、１４Ｄ１１（配列番号９６）および４Ｄ４（配列番号２０）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ２軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。

【図10】図１０は、１４Ｄ１０（配列番号９７）、６Ｈ９（配列番号１０９）、７Ｈ２（配列番号１１５）、４Ｇ６ａ（配列番号１２１）、４Ｇ６ｂ（配列番号１２４）、４Ｇ６ｃ（配列番号１２７）、４Ｇ６ｄ（配列番号１３０）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３４）、１４Ｄ１１（配列番号９７）および４Ｄ４（配列番号１６）の抗体についての抗ＮＧＦ ＣＤＲ３軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。

【図11】図１１は、１４Ｄ１０（配列番号８２）、６Ｈ９（配列番号８４）、７Ｈ２（配列番号８６）、４Ｇ６ａ（配列番号８８）、４Ｇ６ｂ（配列番号８９）、４Ｇ６ｃ（配列番号９０）、４Ｇ６ｄ（配列番号９１）、４Ｇ６ｅ（配列番号１３１）、１４Ｄ１１（配列番号８０）および４Ｄ４（配列番号１２）の抗体についての抗ＮＧＦ軽鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す（４Ｇ６ａは、種々の図では２００３１０２８３４０として示される；４Ｇ６ｂは、種々の図では２００３１０２８３５１として示される；４Ｇ６ｃは、種々の図では２００３１０７１５２６として示される；４Ｇ６ｄは、種々の図では２００３１０２８３４４として示される；４Ｇ６ｅは、種々の図では２００３１０００５２８として示される）。

【図12】図１２は、４Ｄ４（配列番号１０）、４Ｇ６（配列番号８７）、１４Ｄ１０（配列番号８１）、１４Ｄ１１（配列番号７９）、７Ｈ２（配列番号８５）、および６Ｈ９（配列番号８３）の抗体についての抗ＮＧＦの重鎖のアラインメントおよび同一性パーセントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0045】

（特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書に用いられるセクション見出しは、組織化の目的のためのみであり、記載される主題に限定されると解釈されるべきではない。本出願に引用される全ての引用文献は、任意の目的のために本明細書において参照として明白に援用される。

【0046】

（定義）
従来の技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために用いてもよい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該分野で通常達成されるように、もしくは本明細書に記載されるように、行うことができる。前述の技術および手順は一般に、当該分野で周知の方法に従って、ならびに本明細書全体にわたって引用かつ考察されている種々の一般的引用文献およびさらに詳細な引用文献に記載されるような方法に従って、行うことができる。例えば、いずれかの目的で参照として本明細書に援用されている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，を参照のこと。特に規定しない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学の化学と関連して利用される命名法、そしてその実験室手順および技術は、当該分野で周知でありかつ一般的に用いられるものである。同様に、従来の技術が、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方および送達、ならびに患者の処置のために用いられ得る。

【0047】

本開示に従って利用される場合、以下の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：本発明の抗体に関して、「生物学的特性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」、「生物学的特徴（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）」という句、および「活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ、これらには、限定はしないが、エピトープ親和性および特異性（例えば、ヒトＮＧＦに結合する抗ヒトＮＧＦヒト抗体）、標的のポリペプチドの活性（例えば、ＮＧＦ活性）をアンタゴナイズする能力、この抗体のインビボ安定性、およびこの抗体の免疫原性特性が挙げられる。当該分野で理解される抗体の他の特定可能な生物学的特性または特徴としては、例えば、交差反応性（すなわち、一般的には、標的されたポリペプチドの非ヒトホモログとの交差反応性、または他のタンパク質もしくは組織との交差反応性）、および哺乳動物細胞においてタンパク質の高い発現レベルを保存する能力が挙げられる。前述の特性または特徴は、当該分野で認識される技術を用いて観察または測定され得、これらの技術としては、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分析、インビトロおよびインビボの中和アッセイ（例えば、実施例２）、およびヒト、霊長類または必要に応じて任意の他の供給源を含む種々の供給源由来の組織切片での免疫組織化学が挙げられる。抗ヒトＮＧＦヒト抗体の特定の活性および生物学的特性は、以下の実施例にさらに詳細に記載される。

【0048】

本明細書において用いる場合、「単離されたポリヌクレオチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、ゲノムのポリヌクレオチド、ｃＤＮＡのポリヌクレオチドまたは合成由来のポリヌクレオチドもしくはそれらのいくつかの組み合わせを意味しており、その起源によって、この単離されたポリヌクレオチドは、（１）その単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの、全てまたは一部を伴わないか、（２）天然には連結されないポリヌクレオチドと連結されるか、または（３）より大きい配列の一部として天然には存在しない。

【0049】

本明細書において言及される、「単離されたタンパク質（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、該当のタンパク質が、（１）通常見出される少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、（２）同じ供給源由来、例えば同じ種由来の他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、（４）天然において会合している、少なくとも約５０％のポリヌクレオチド、脂質、炭水化物もしくは他の物質から分離されているか、（５）この「単離されたタンパク質」が天然には会合しているタンパク質の一部と（共有的な相互作用によっても、または非共有的な相互作用によっても）会合していないか、（６）天然には会合していないポリペプチドと作動可能に会合している（共有的な相互作用または非共有的な相互作用によって）か、または（７）天然には存在しない、ということを意味する。このような単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは合成に由来する他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせによってコードされてもよい。好ましくは、この単離されたタンパク質は、その用途（治療上用途、診断上用途、予測用途、研究用途など）を妨げる、天然の環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物を実質的に含まない。

【0050】

「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」抗体とは、同定されて、その天然の環境の成分から分離され、そして／または回収されているものである。その天然の環境の混入成分とは、この抗体の診断または治療的な使用を妨害する物質であり、そしてこれには、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を挙げることができる。好ましい実施形態では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合、抗体の９５重量％を超えるまで、そして最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニング・カップ・シークエネーターの使用によって、Ｎ末端アミノ酸配列もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマーシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）もしくは好ましくは銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一にまで、精製される。単離された抗体としては、組み換え細胞内のインサイチュの抗体が挙げられる。なぜなら、この抗体の天然の環境のうちの少なくとも１つの成分が存在しないからである。

【0051】

「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」または「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、天然のタンパク質、すなわち、天然に存在する細胞および特異的には非組み換え細胞によって産生されるタンパク質、または遺伝子操作された細胞もしくは組み換え細胞によって産生されるタンパク質の配列を有する分子を意味し、そしてこの天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはこの天然の配列からの１つ以上のアミノ酸の欠失、この天然の配列への１つ以上のアミノ酸の付加および／もしくはこの天然の配列の１つ以上のアミノ酸の置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に抗ＮＧＦ抗体、または抗ＮＧＦ抗体からの１つ以上のアミノ酸の欠失、抗ＮＧＦ抗体への１つ以上のアミノ酸の付加および／または抗ＮＧＦ抗体の１つ以上のアミノ酸の置換を有する配列を包含する。

【0052】

「ポリペプチドフラグメント（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語は、アミノ末端欠失、カルボキシ末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドをいう。特定の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５〜約５００アミノ酸長である。特定の実施形態では、フラグメントは少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００または少なくとも４５０アミノ酸長であると理解される。特に有用なポリペプチドフラグメントとしては、結合ドメインを含む機能的なドメインが挙げられる。抗ＮＧＦ抗体の場合、有用なフラグメントとしては、限定はしないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部または２つのＣＤＲを含むちょうどその可変領域、などが挙げられる。

【0053】

「特異的結合因子（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」という用語は、標的に特異的に結合する天然または非天然の分子を指す。特異的な結合因子の例としては、限定はしないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および脂質が挙げられる。特定の実施形態では、特異的な結合因子は抗体である。

【0054】

「ＮＧＦに対する特異的な結合因子（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｔｏ ＮＧＦ）」という用語は、ＮＧＦの任意の部分に特異的に結合する特異的な結合因子をいう。特定の実施形態では、ＮＧＦに対する特異的な結合因子とは、ＮＧＦに特異的に結合する抗体である。

【0055】

本明細書において用いる場合「免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメント（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ」という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の少なくともＣＤＲを含むポリペプチドフラグメントをいう。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、抗原に結合し得る。好ましい実施形態では、この抗原はレセプターに特異的に結合するリガンドである。これらの実施形態では、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントの結合は、そのレセプターへのリガンドの結合を防止し、このレセプターへのリガンドの結合から生じる生物学的応答を遮断する。好ましくは、本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、ＮＧＦに特異的に結合する。最も好ましくは、このフラグメントはヒトＮＧＦに特異的に結合する。

【0056】

「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、本明細書において使用されて物体に対して適用する場合、その物体が天然に見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離可能であり、人によって意図的に改変されていない、有機体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、天然に存在する。

【0057】

「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、その用語をあてはめられる成分が、適切な条件下でその固有の機能を行うことを可能にする関係であることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列の転写活性に適合する条件下でこのタンパク質コード配列の発現が達成されるように、そこに連結されている。

【0058】

「制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、本明細書において用いられる場合、それらが連結されるコード配列の発現、プロセシングまたは細胞内局在化を達成し得るポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列としては、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終止配列を挙げることができる。他の特定の実施形態では、真核生物の転写制御としては、転写因子の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終止配列およびポリアデニル化配列を挙げることができる。特定の実施形態では、「制御配列」とは、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含んでもよい。

【0059】

「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、本明細書において言及する場合、少なくとも１０ヌクレオチド長の一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型であってもよい。このような改変型としては、ブロムウリジンのような塩基改変型、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースのようなリボース改変型、、ならびにヌクレオチド間連結改変型、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデートおよびホスホロアミデートが挙げられる。「ポリヌクレオチド」という用語は詳細には、ＤＮＡの一本鎖型および二本鎖型を包含する。

【0060】

本明細書で言及する「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、天然に存在するか、および／または天然には存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、一般的に一本鎖であり、かつ２００ヌクレオチド以下の長さを有するメンバーを含むポリヌクレオチドサブセットである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築での使用のために、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、タンパク質コード配列に関連してセンスオリゴヌクレオチドであってもアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。

【0061】

「天然に存在するヌクレオチド（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。「改変されたヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを包含する。「オリゴヌクレオチド連結（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語は、オリゴヌクレオチド連鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデートなどを包含する。例えば、それらの開示は任意の目的のために参考として本明細書に援用される、ＬａＰｌａｎｃｈｅら，１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：９０８１；Ｓｔｅｃら，１９８４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎら，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９；Ｚｏｎら，１９９１，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９；Ｚｏｎら，１９９１，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）；Ｓｔｅｃら，米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能にする検出可能な標識を含んでもよい。

【0062】

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、その核酸分子が連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を包含する。ベクターの１タイプは「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここではさらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自律性に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによってその宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書においては「組み換え発現ベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」（または単に、「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」）と呼ばれる。一般には、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられ得る。なぜなら、プラスミドは、ベクターの最も一般的に用いられる形態であるからである。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、このような他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むものとする。

【0063】

「組み換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」（または単に、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」）という句は、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を包含する。このような用語は、特定の該当の細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことを意図することが当業者に理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変が後継世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞に対して同一でないかもしれないが、本明細書に用いられる「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として包含される。広範な種々の宿主発現系（細菌、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む）が、本発明の抗体を発現するために用いられ得る。適切な細菌発現ベクターの例はｐＵＣ１９である。抗体を組み換え的に発現するためには、宿主細胞は、その抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを担持する１つ以上の組み換え発現ベクターでトランスフェクトされ、その結果、その軽鎖および重鎖はこの宿主細胞中で発現され、好ましくはこの宿主細胞が培養される培地中に分泌されて、この抗体はこの培地から回収され得る。標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて、抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子を得て、これらの遺伝子を組み換え発現ベクター中に組み込み、そしてこのベクターを宿主細胞、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）およびＢｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７号記載されたような宿主細胞中に導入する。

【0064】

「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」という用語を用いて、核酸配列で形質転換された細胞、または核酸配列で形質転換され得、その後、目的の選択された遺伝子を発現することが可能である細胞を指す。この用語は、この選択された遺伝子が存在する限り、この子孫が、形態学的に、またはもとの親に対する遺伝的作製において、同一であるか否かにかわらず、親細胞の子孫を包含する。

【0065】

「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語を用いて、一般にはファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移入をいう。「形質導入」とはまた、レトロウイルスによる、真核生物細胞配列の獲得および移入を指す。

【0066】

「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語を用いて、細胞による外因性または内因性のＤＮＡの取り込みをいい、細胞は、外因性のＤＮＡがその細胞膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」されている。多数のトランスフェクション技術が当該分野で周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら，１９８６，ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために用いることができる。

【0067】

「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、細胞が新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、その細胞は形質転換されている。例えば、細胞はその天然の状態から遺伝的に改変されている場合、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の後、この形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体への物理的な組みこみによって細胞のＤＮＡと組み換えられてもよいし、または複製されることなしにエピソームエレメントとして一時的に維持されてもよいし、またはプラスミドとして独立して複製されてもよい。細胞の分裂とともにＤＮＡが複製される場合、細胞は安定に形質転換されていると考えられる。

【0068】

「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」または「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質に関連して用いられる場合、天然に見出され、かつ人によって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｉｎｇ）」または「非天然の（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）」とは、本明細書において用いる場合、天然に見出されない物質、または人によって構造的に改変されているかもしくは合成されている物質をいう。

【0069】

「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、選択的な結合因子、例えば抗体によって結合され得、そしてさらに動物において用いられ得てその抗原のエピトープに結合できる抗体を産生することができる、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有してもよい。

【0070】

「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、当該分野で公知であるとおり、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列の間の関係であって、これらの分子の配列を比較することによって決定される関係をいう。当該分野では、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とはまた、核酸分子の間またはポリペプチドの間の配列の関連性の程度を意味し、場合によっては、２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列のストリングスの間の一致によって決定されてもよい。「同一性」とは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」）によってアドレスされるギャップアラインメント（もしあれば）と２つ以上の配列のうちより小さい配列の間での同一性の一致の割合を測定する。

【0071】

「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」という用語は、関連の概念に関して当該分野で用いられるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一性の一致および保存的置換の一致の両方を包含する、関連性の指標をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、アミノ酸２０個のうち１０個の同一アミノ酸を有し、この残りが全て非保存的置換であれば、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％である。同じ例で、保存的置換がさらに５つの位置にあれば、同一性パーセントは、５０％のままであるが、ただし類似性パーセントは、７５％である（１５／２０）。従って、保存的置換がある場合、２つのポリペプチドの間の類似性パーセントは、これらの２つのポリペプチドの間の同一性パーセントよりも高い。

【0072】

関連の核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に算出できる。このような方法としては、限定はしないが、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（編）），１９８８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．（編）），１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ，Ｐａｒｔ １，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．（編）），１９９４，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥＲ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，（編）），１９９１，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃａｒｉｌｌｏら，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３；ならびにＤｕｒｂｉｎら，１９９８，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載される方法が挙げられる。

【0073】

同一性を決定するために好ましい方法は、試験された配列の間で最大の一致を得るように設計される。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記載される。２つの配列の間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０）が挙げられるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０（前出））から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するのに用いることができる。

【0074】

２つのアミノ酸配列をアライメントするための特定のアラインメントスキームでは、２つの配列の短い領域のマッチングを得ることしか可能ではなく、そしてこの短い整列された領域は、２つの全長配列の間も有意な関係がなくても極めて高い配列同一性を有し得る。従って、特定の実施形態では、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）によって、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続アミノ酸にまたがるアラインメントが得られる。

【0075】

例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントを決定すべき２つのポリペプチドを、そのそれぞれのアミノ酸の最適マッチングについてアライメントする（アルゴリズムによって決定される場合「マッチしたスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。特定の実施形態において、ギャップオープニングペナルティ（これは、３回の平均対角として算出される；「平均対角（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、用いられる比較行列の対角の平均であり；「対角（ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、特定の比較行列により各々の完全アミノ酸マッチに対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの十分の一）、ならびに比較マトリックス、例えば、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２を、このアルゴリズムと組み合わせて用いる。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆら，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５〜３５２を参照のこと；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５〜１０９１９；を参照のこと）も、アルゴリズムによって用いられる。

【0076】

特定の実施形態では、ポリペプチド配列比較についてのパラメーターとしては以下が挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２、前出より、ＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
類似性閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメーターとともに用いられ得る。特定の実施形態では、前述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（エンドギャップについてのペナルティを伴わない）のためのデフォルトパラメーターである。

【0077】

「相同性（ホモロジー、ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、タンパク質または核酸の配列の間の類似性の程度を指す。相同性情報は、特定のタンパク質または核酸種の遺伝的関連性を理解するために有用である。相同性は、配列を整列（アラインメント）させることおよび比較することによって決定され得る。代表的には、アミノ酸相同性を決定するためには、タンパク質配列を、公知のタンパク質配列のデータベースと比較する。相同な配列は、その配列にそってどこかで共通の機能的同一性を共有する。高い程度の類似性または同一性が一般に相同性の指標であるが、低い程度の類似性または同一性は、必ずしも相同性の欠如を示すわけではない。

【0078】

一方の配列由来のアミノ酸をもう一方の配列のアミノ酸とを比較して相同性を決定するためには、いくつかのアプローチを用いることができる。一般には、このアプローチは、以下の２つの範疇におさまる：（１）類似性マトリックスを作成するための極性、荷電およびファン・デル・ワールス容積のような物理的特徴の比較；ならびに（２）公知の相同なタンパク質由来の多くのタンパク質配列の観察に基づき、ポイント・アクセプティッド・ミューテーション・マトリクス（Ｐｏｉｎｔ Ａｃｃｅｐｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ）（ＰＡＭ）を作成するための、任意の他のアミノ酸による、配列中のアミノ酸の適当な置換の比較。

【0079】

同一性のパーセンテージはまた、デフォルトパラメーター（例えば、ＧＡＰペナルティ５、ＧＡＰオープニングペナルティ１５、ＧＡＰ伸長ペナルティ６．６）を用い、ベクターＮＴＩスイート９．０．０ソフトウェアパッケージのモジュールとして、ニードルプログラム（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）またはストレッチャープログラム（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）またはプログラム整列Ｘを用いることによって、算出され得る。

【0080】

本明細書において用いる場合、２０個の従来のアミノ酸およびその省略形は従来の用法に従う。任意の目的のために参考として本明細書に援用される、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ−Ａ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，第２版（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ（編）），Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ，１９９１を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄアミノ酸）；非天然のアミノ酸、例えば、α−アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来とは異なるアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適切な成分であり得る。従来とは異なるアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書において用いられるポリペプチドの表記法においては、標準的な用法および慣習に従って、左手側の方向がアミノ末端方向であり、そして右手側の方向がカルボキシ末端方向である。

【0081】

天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいたクラスに分けることができる：
１）疎水性：ノルロイシン（Ｎｏｒ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
２）極性の親水性；Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ，Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；
３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
４）脂肪族の疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
５）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
８）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；そして
１０）芳香族の疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。

【0082】

保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、同じクラスの別のメンバーでの交換を包含し得る。保存的アミノ酸置換は、天然には存在しないアミノ酸残基を包含し得る。この天然には存在しないアミノ酸残基は代表的には、生物系における合成ではなく、化学的なペプチド合成によって取り込まれる。これらとしては、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の反転型または逆位型が挙げられる。

【0083】

非保存的置換としては、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーでの交換を挙げることができる。このような置換残基は、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域に導入されても、または分子の相同でない領域に導入されてもよい。

【0084】

このような変化を作製することにおいて、特定の実施形態によれば、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい。各々のアミノ酸は、その疎水性および荷電の特徴に基づく疎水性親水性指標を割り当てられている。この疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。

【0085】

タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与するのにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は当該分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３１を参照のこと）。特定のアミノ酸が、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換可能であり、そしてそれでも類似の生物学的活性を保持し得ることが、公知である。疎水性親水性指標に基づいてこのような変化を作製することにおいて、特定の実施形態では、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、そして特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±０．５以内である置換が含まれる。

【0086】

特に、生物学的に機能的なタンパク質またはそれによって作製されるペプチドが、本明細書に開示されるように免疫学的な実施形態での使用について意図される場合、同様なアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解される。特定の実施形態では、あるタンパク質の最大の局所平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の免疫原性および抗原性（すなわちそのタンパク質の生物学的特性）と、相関する。

【0087】

以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づく変化を作製するのにおいて、特定の実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、特定の実施形態では、親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、そして特定の実施形態では、親水性値が±０．５以内である置換が含まれる。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することができる。これらの領域はまた、「エピトープコア領域（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ）」とも呼ばれる。

【0088】

例示的なアミノ酸置換を表１に示す。

【0089】

【表1-1】

【0090】

【表1-2】

当業者は、周知の技術を用いて本明細書に記載のポリペプチドの適切な改変体を決定することができる。特定の実施形態では、当業者は、活性に重要であるとは考えられない領域を標的することによって活性を破壊することなく、変化され得る分子の適切な領域を同定することができる。他の実施形態では、当業者は、同様のポリペプチドの間で保存されている分子の残基および部分を同定することができる。さらなる実施形態では、生物学的活性または構造にとって重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害に影響することもなく、保存的なアミノ酸置換に供することができる。

【0091】

さらに当業者は、活性または構造に重要な類似のポリペプチドにおける残基を同定する構造−機能の研究を概説することができる。このような比較の観点では、当業者は、類似のタンパク質における活性または構造について重要なアミノ酸残基に相当する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を推測することができる。当業者は、このように推測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができる。

【0092】

当業者はまた、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似のポリペプチドにおけるその構造に関して解析することができる。このような情報の観点では、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアラインメントをその三次元構造に関して推測することができる。特定の実施形態では、当業者は、タンパク質の表面にあることが推定されるアミノ酸残基に対してラジカルな変化を作製しないように選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。さらに、当業者は、各々の所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む、試験改変体を生成することができる。次いで、この改変体を、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングしてもよい。このような改変体を用いて、適切な改変体についての情報を集めることができる。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化によって、活性の破壊、活性の所望されない減少または不適切な活性が生じるということが発見されている場合、このような変化を有する改変体は、回避され得る。言い換えれば、このような慣用的実験から収集された情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独、または他の変異と組み合わせて回避されるべきアミノ酸を、容易に決定することができる。

【0093】

二次配列の予測に対して多数の科学的刊行物がでている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２〜４２７；Ｃｈｏｕら，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２〜２４５；Ｃｈｏｕら，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１〜２２２；Ｃｈｏｕら，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５〜１４８；Ｃｈｏｕら，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１〜２７６；およびＣｈｏｕら，１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７〜３８４を参照のこと。さらに、二次構造を予測することを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１方法は、ホモロジー（相同性）モデリングに基づく。例えば、３０％より大きい配列同一性または４０％より大きい配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は多くの場合、類似の構造的トポロコーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長によって、ポリペプチドの構造またはタンパク質の構造内の潜在的な折り畳み回数を含む、二次構造の予想性の向上が得られている。Ｈｏｌｍら，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４〜２４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において折り畳み回数は限定されていること、および一旦構造の決定的な数が解明されれば、構造の予測は劇的にさらに正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９〜３７６）。

【0094】

二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７〜８７；Ｓｉｐｐｌら，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５〜１９）、「プロフィール分析（ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」（Ｂｏｗｉｅら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４〜１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６〜１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５〜４３５８）および「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，１９９９，前出；およびＢｒｅｎｎｅｒ，１９９７，前出を参照のこと）が挙げられる。

【0095】

特定の実施形態では、抗体改変体としては、グリコシル化部位の数および／またはタイプが、親のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されているグリコシル化改変体が挙げられる。特定の実施形態では、タンパク質改変体は、ネイティブのタンパク質よりも多いかまたは少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここではＸとして指定されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であってもよい。この配列を生じるアミノ酸残基の置換によって、Ｎ連結糖鎖の付加のための潜在的な新規な部位が得られる。あるいは、この配列を排除する置換によって、既存のＮ連結糖鎖が除かれる。１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（代表的には天然に存在する部位）が排除されて、１つ以上の新規なＮ連結部位が作成されている、Ｎ連結糖鎖の再配列もまた提供される。さらなる好ましい抗体改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、親のアミノ酸配列と比較して欠失されているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されているシステイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、不溶性の封入体の単離後のような生物学的に活性な高次構造に抗体が再折り畳みさせられなければならない場合、有用であり得る。システイン改変体は一般的に、ネイティブなタンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、そして代表的には、不対のシステインから生じる相互作用を最小化するために、偶数のシステイン残基を有する。

【0096】

さらなる実施形態では、抗体改変体は、改変Ｆｃフラグメントまたは改変重鎖定常領域を含む抗体を包含し得る。「結晶化するフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｅ）」を意味するＦｃフラグメント、または重鎖定常領域は、抗体に対して変化した結合特徴を付与するような変異によって改変されてもよい。例えば、ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ，１９９２、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５１：１〜８４；ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５〜９０；Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１〜６６０４；ＴｅｌｌｅｍａｎおよびＪｕｎｇｈａｎｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００：２４５〜２５１；Ｍｅｄｅｓａｎら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２〜２１００（その全てが参考として本明細書に援用される）を参照のこと。このような変異は、置換、付加、欠失またはそれらの任意の組み合わせを包含し得、そして代表的には、本明細書に記載の方法に従って、および当該分野で公知の方法に従って（例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第３版，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）１つ以上の変異原性のオリゴヌクレオチド（単数または複数）を用いて、部位指向性の変異誘発によって生成される、。

【0097】

特定の実施形態によれば、アミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下するか、（２）酸化に対する感受性を低下するか、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更するか、（４）結合親和性を変更するか、そして／または（５）このようなポリペプチドに他の物理化学的特性または機能的特性を付与するかまたは改変する、アミノ酸置換である。特定の実施形態によれば、単一または複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列において（特定の実施形態では、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）の外側のポリペプチドの一部において）作製されてもよい。好ましい実施形態では、保存的アミノ酸置換は代表的には、親の配列の構造的特徴を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は、親の配列に存在するヘリックスを破壊する傾向でも、親の配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向でもあってはならない）。当該分野で認識されるポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、各々が参考として本明細書に援用される、ＰＲＯＴＥＩＮＳ、ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，１９８４，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ（編）），１９９１，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５に記載されている。

【0098】

ペプチドアナログは一般に、鋳型のペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として製薬産業において用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と名付けられる。任意の目的のために参考として本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ、１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ ｐ．３９２；ならびにＥｖａｎｓら，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）を参照のこと。このような化合物は多くの場合、コンピュータによる分子モデリングの補助によって開発される。治療上有用なペプチドに対して構造的に類似であるペプチド模倣物を用いて、同様の治療効果または予防効果を得ることができる。一般には、ペプチド模倣物は、パラダイム（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち、生化学的な特性または生理学的な活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体に対して構造的に類似であるが、当該分野で周知の方法によって、以下から選択される連結により必要に応じて置換される１つ以上のペプチド連結を有する：−ＣＨ_２−ＮＨ−、−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ_２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−、および−ＣＨ_２ＳＯ−。同じタイプのＤアミノ酸での、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりに、Ｄ−リジン）を特定の実施形態で用いて、さらに安定なペプチドを生成することができる。さらにコンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列のバリエーションを含む拘束されたペプチドは、当該分野で公知の方法（任意の目的のために参考として本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）によって；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによって、生成することができる。

【0099】

「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体ペプチド（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｐｔｉｄｅ）（単数または複数）」とは、インタクトな抗体、または特定の結合についてそのインタクトな抗体と競合するその結合フラグメントをいう。特定の実施形態では、結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術によって生成される。さらなる実施形態では、結合フラグメントは、インタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、産生される。結合フラグメントとしては、限定はしないが、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、および単鎖抗体が挙げられる。

【0100】

「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」という用語は、ＮＧＦに対する特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを包含する。「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」という用語は、ＮＧＦに対する特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを包含する。全長重鎖は、可変領域ドメイン、Ｖ_Ｈおよび３つの定常領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。このＶ_Ｈドメインは、ポリペプチドのアミノ末端であり、Ｃ_Ｈ３ドメインは、カルボキシ末端である。「重鎖」という用語は、本明細書において用いる場合、全長重鎖およびそのフラグメントを包含する。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶ_Ｌ、および定常領域ドメインＣ_Ｌを含む。重鎖と同様、軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端である。「軽鎖」という用語は、本明細書において用いる場合、全長軽鎖およびそのフラグメントを包含する。Ｆ（ａｂ）フラグメントは、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域からなる。Ｆ（ａｂ）分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、１つの軽鎖および１つの重鎖を含み、この重鎖がＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間にさらに定常領域を含み、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）_２分子が形成され得る。このＦｖ領域は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域は欠く。単鎖抗体は、Ｆｖ分子であり、ここでは重鎖および軽鎖の可変領域がフレキシブルなリンカーによって接続されて、抗原結合領域を形成する単鎖ポリペプチド鎖を形成している。単鎖抗体は国際特許出願公開番号ＷＯ８８／０１６４９、ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号に詳細にて考察されている。

【0101】

特定の実施形態では、「多価特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」抗体または「多機能性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」抗体以外の二価抗体は、同一の抗原特異性を有する結合部位を含むことが理解される。

【0102】

本発明に従って抗体結合および抗体特異性を評価するのにおいて、抗体は、過剰の抗体がレセプターに結合するリガンドの量を（とりわけ、インビトロ競合結合アッセイを用いて測定した場合）少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％もしくはそれ以上まで低下させる場合、レセプターへのリガンドの結合を実質的に阻害する。

【0103】

「中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、それが結合する標的抗原のエフェクター機能をブロックし得るかまたは実質的に低下させ得る抗体分子を意味する。従って、「中和」抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦのレセプター結合および／または細胞応答の誘発のような、エフェクター機能をブロックし得るかまたは実質的に低下させ得る。「実質的に低下させる（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅ）」とは、標的抗原（例えば、ヒトＮＧＦ）のエフェクター機能の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の低下を意味するものとする。

【0104】

「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得る、任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を包含する。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面集団、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基を含み、そして特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な荷電特徴を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物において、その抗体がその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。好ましい実施形態では、抗体は、平衡解離定数が１０^−８Ｍ以下である場合、より好ましくは平衡解離定数が１０^−９Ｍ以下である場合、そして最も好ましくは平衡解離定数が１０^−１０Ｍ以下である場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。

【0105】

２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は、参照抗体と「本質的に同じエピトープ（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｐｉｔｏｐｅ）」に結合する。２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープに結合するか否かを決定するための、最も広範に用いられ、かつ迅速な方法は、標識された抗原または標識された抗体のいずれかを用いて、多くの異なる形式で構成され得る、競合アッセイである。通常は、抗原は基板上に固定されて、未標識の抗体が標識された抗体の結合をブロックする能力が、放射性標識または酵素標識を用いて測定される。

【0106】

「因子（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書において用いる場合、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的物質から作製された抽出物を意味する。

【0107】

本明細書において用いる場合、「標識（ｌａｂｅｌ）」または「標識された（ｌａｂｅｌｅｄ）」という用語は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の組み込み、または標識されたアビジン（例えば、光学的な方法または比色定量的な方法によって検出可能である、蛍光マーカー、化学発光マーカーまたは酵素活性などの検出可能なマーカーを好ましくは含むストレプトアビジン）によって検出可能であるビオチン部分のポリペプチドに対する結合による、検出可能なマーカーの組み込みをいう。特定の状況では、この標識はまた治療剤であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野で公知であり、かつ本明細書に開示された方法において有利に用いることができる。ポリペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネートすなわちＦＩＴＣ、ローダミン、またはランタニド蛍光物質）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ハプテン標識、例えば、ビオチニル基、および二次レポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、またはエピトープタグ）。特定の実施形態において、標識は、種々の長さのスペーサーアーム（例えば、（ＣＨ_２）_ｎ、ここでｎ＜約２０）によって結合されて、可能性のある立体障害を減らす。

【0108】

「生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、生存物または以前に生存していた物由来の任意の量の物質を包含するが、これらに限定されない。このような生存物としては、限定はしないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギおよび他の動物が挙げられる。このような物質としては、限定はしないが、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節および皮膚が挙げられる。

【0109】

「薬学的因子または薬物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ ｏｒ ｄｒｕｇ）」という用語は、本明細書において用いる場合、患者に適切に投与されたとき、所望の治療効果を誘導し得る化合物または組成物をいう。本発明の抗体の１つまたは複数を含む薬学的組成物に関して、「薬学的に有効な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という表現は、本発明によれば、考慮される患者において、外部刺激に対する感度閾値の低下を無効にし得るこの薬学的組成物の量であって、健康な被験体において観察される閾値に匹敵するレベルへの感度閾値の復元を伴う量を意味することが理解される。

【0110】

「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」とは、本発明による処置から恩恵を受ける任意の状態である。「障害」および「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、本明細書において交換可能に用いられ、そして哺乳動物を該当の障害に罹り易くさせる病理的状態を含む、慢性および急性のＮＧＦ媒介性障害、またはＮＧＦ媒介性疾患を包含する。

【0111】

「ＮＧＦ媒介性疾患（ＮＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」および「ＮＧＦ媒介性状態（ＮＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」という用語は、ＮＧＦのレベルの増大またはＮＧＦの感度の増大を伴う任意の医学的状態または障害を包含し、これには限定はしないが、急性疼痛、歯痛、外傷による疼痛、外科的疼痛、切断もしくは膿瘍から生じる疼痛、カウザルギー、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール中毒症、脳卒中、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素および化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、混合脈管性症候群および非脈管性症候群（ｍｉｘｅｄ−ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、緊張性頭痛、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、炎症性腸障害、過敏性腸症候群、炎症性眼障害、炎症性膀胱障害もしくは不安定膀胱障害、乾癬、炎症性成分による皮膚愁訴、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症性状態、炎症性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、神経因性疼痛および関連の痛覚過敏および異痛症、糖尿病性神経障害性疼痛、カウザルギー、交感神経的に維持される疼痛、求心路遮断症候群、喘息、上皮組織損傷もしくは上皮組織機能障害、単純疱疹、呼吸系、尿生殖器、胃腸系もしくは血管領域の内蔵運動障害、創傷、熱傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、白斑、一般的胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動神経性鼻炎もしくはアレルギー性鼻炎、または気管支障害、月経困難症、消化不良、胃食道逆流、膵炎、および臓器痛が挙げられる。

【0112】

本明細書において用いる場合、「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」および「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｔ）」という用語は、１つ以上の抗ヒトＮＧＦヒト抗体を含むビヒクルまたは薬学的組成物に関して用いる場合、所望の結果（すなわち、本発明のビヒクルまたは抗ヒトＮＧＦヒト抗体での治療の場合、所望の効果とは、例えば、炎症および／または疼痛の所望の低下である）を生じるのに十分な、またはＮＧＦの１つ以上の生物学的活性のレベルにおける観察可能な低下を支持するのに十分な、量または投薬量を指す。さらに詳細には、治療有効量とは、上記因子を用いてインビボで処置される被験体において、問題の状態、例えば、炎症または疼痛に関連する臨床的に規定される病理学的プロセスの１つ以上を、ある期間にわたって阻害するのに十分な、抗ヒトＮＧＦヒト抗体（単数または複数）の量である。本発明では、抗ＮＧＦ抗体の「治療有効量」は、任意の疼痛性の医学的状態に関連する疼痛の知覚を防止、停止、制御、または軽減し得る。本発明の方法では、「制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）」という用語およびその文法上の変化を用いて、望ましくない事象、例えば、疼痛の、予防、部分的もしくは完全な阻害、軽減、遅延または緩徐化をいう。有効な量は、選択される特定のビヒクルまたは抗ＮＧＦヒト抗体（単数または複数）に依存して変化し得、そしてまた、治療されるべき被験体に関連する種々の要因および状態、ならびに障害の重篤度に依存する。例えば、ビヒクルまたは抗ヒトＮＧＦヒト抗体（単数または複数）がインビボで投与される場合、とりわけ、患者の年齢、体重および健康状態のような要因、ならびに前臨床動物試験において得られた用量応答曲線および毒性データが、考慮されるものである。この因子が、インビトロで細胞と接触される場合、当業者はまた、取り込み、半減期、用量、毒性などのようなパラメーターを評価するために、種々の前臨床インビトロ研究を設計する。所定の因子についての有効な量または治療有効量の決定は、当業者の能力の十分に範囲内である。

【0113】

本明細書において用いる場合、「神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）」および「ＮＧＦ」という用語は、配列番号３０に示される、組み換えヒトＮＧＦ１−１２０を含む、全ての哺乳動物種のネイティブ配列ＮＧＦと定義される。

【0114】

本明細書において用いる場合、「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」または「実質的に精製された（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、主な種である化合物または種が存在する（すなわち、モル基準で、この組成物における任意の他の個々の種よりもそれが豊富である）ことを意味する。特定の実施形態では、実質的に精製された画分とは、存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約５０パーセント（モル基準で）をこの種が構成する組成物である。特定の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、その組成物中に存在する全ての高分子種のうち約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％より多くを、この種が構成する。特定の実施形態では、この種は、本質的に均一まで精製され（混入する種は、従来の検出法ではこの組成物中で検出できない）、ここでこの組成物は本質的に、単一の高分子種からなる。

【0115】

「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、ヒトおよび動物の被験体を包含する。

【0116】

「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔ）」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。処置の必要なものとしては、既に障害を有するもの、ならびに障害を有する傾向にあるもの、または障害が防止されるべきものが挙げられる。

【0117】

文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を包含し、そして複数形の用語は単数形を包含する。

【0118】

本発明の特定の実施形態によれば、ＮＧＦに対する抗体は、限定はしないが上記で言及したものを包含する、神経障害性の疼痛および炎症性の疼痛、ならびにＮＧＦ媒介性疾患を処置するために用いられ得る。

【0119】

本発明の１態様では、ヒトＮＧＦに対して惹起され、かつヒトＮＧＦへの結合について生物学的特異性および免疫学的特異性を有する、完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。本発明の別の態様では、重鎖免疫グロブリン分子および軽鎖免疫グロブリン分子のアミノ酸配列、特にその可変領域に相当する配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。本発明のこの態様の特定の実施形態は、本発明によって提供される重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）特にＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に相当する配列である。本発明のさらに別の態様では、免疫グロブリン分子および抗体、好ましくは本発明のモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞および細胞株が提供される。本発明はまた、生物学的におよび免疫学的に精製された抗体の調製物、好ましくはヒトＮＧＦに対して惹起されて、ヒトＮＧＦへの結合について生物学的および免疫学的特異性を有するモノクローナル抗体の調製物を提供する。

【0120】

酵母人工染色体（ＹＡＣ）におけるメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニングおよび再構築して、マウス生殖系列にそれらを導入する能力によって、極めて大きいかまたはおおまかにマッピングされた遺伝子座の機能的構成要素を解明し、そしてヒト疾患の有用なモデルを生成するために有利なアプローチが得られる。さらに、ヒトの等価な産物でのマウス遺伝子座の置換にこのような技術を利用することによって、発生の間のヒト遺伝子産物の発現および調節、他の系とのそれらの関連、ならびに疾患誘導および進行におけるその関与に対する固有の洞察が得られる。

【0121】

このようなストラテジーの重要な実際的な適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入によって、抗体のプログラムされた発現およびアセンブリの背景にある機構、ならびにＢ細胞発生におけるその役割を研究する機会が得られる。さらに、このようなストラテジーによって、完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の産生の供給源が得られる。

【0122】

「ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に相当する可変領域および定常領域を有する抗体を包含する。特定の実施形態では、ヒト抗体は、限定はしないが、マウスおよびラットのようなげっ歯類、ならびにウサギのようなウサギ目の動物を含む非ヒト哺乳動物において産生される。特定の実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞において産生される。特定の実施形態では、ヒト抗体は、組み換え的に産生される。

【0123】

抗体に関連して「組み換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離される抗体を包含する。代表的な例としては、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組み換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５（１９９２）を参照のこと）；または他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の方法によって、調製、発現、作製または単離された抗体が挙げられる。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。

【0124】

ヒト抗体は、ヒトの治療において用いるために、非ヒト抗体およびキメラ抗体を上回る少なくとも３つの利点を有する：
１）抗体のエフェクター部分がヒトであるので、ヒト抗体は、ヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用し得る（例えば、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効率的に破壊する）；
２）ヒト免疫系は、ヒト抗体を外来性としては認識しないはずであり、従ってこのような注射された抗体に対する抗体応答は、完全に外来性の非ヒト抗体または部分的に外来性のキメラ抗体に対してよりも少ないはずである；
３）注射された非ヒト抗体は、ヒト抗体の半減期よりもかなり短いヒトの循環での半減期を有することが報告されている。注射されたヒト抗体は、天然に存在するヒト抗体に対して本質的に同一の半減期を有し、より小さくかつ少ない頻度の用量で与えることが可能になる。

【0125】

従って、完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス由来ＭＡｂｓに固有の免疫原性およびアレルギー性の応答を最小化すること、そしてそれによって投与された抗体の有効性および安全性を増大することが期待される。従って、本発明の完全ヒト抗体は、慢性および再発性の疼痛の処置において用いることができ、その処置は反復性の抗体投与を必要とする。従って、本発明の抗ＮＧＦ抗体の１つの特定の利点は、この抗体が完全ヒト抗体であり、ヒト抗マウス抗体または他の以前に記載された非ヒト種由来の不完全ヒト抗体と共通に関連する有害反応を最小限にしながら、非急性の方式で患者に投与できるということである。

【0126】

当業者は、ヒトＩｇ遺伝子座の大きいフラグメントを用いてマウス抗体産生を欠損したマウス株を操作することが可能であち、その結果このようなマウスは、マウス抗体の非存在下でヒト抗体を産生する。大きいヒトＩｇフラグメントは、可変性の大きい遺伝子多様性、ならびに抗体産生および発現の適切な調節を保存し得る。抗体多様化および選択ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠失についてマウス細胞機構を利用することによって、これらのマウス株において再生されたヒト抗体レパートリーにより、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対する高親和性抗体を得る。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異性ヒトＭＡｂを生成および選択することができる。

【0127】

内因性の免疫グロブリン産生のない状況でヒト抗体の完全レパートリーを免疫の際に産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用してもよい。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入によって、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生が生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１〜２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１９９３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，７：３３（１９９３）；Ｎａｔｕｒｅ １４８：１５４７〜１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４０４：９９５〜９９９（２０００）；ならびに米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第、５，７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号および同第５，５４５，８０６号（その各々が全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーで産生することもできる（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９２）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６〜９５（１９９１））。

【0128】

組み換えヒト抗体はまた、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を用いる場合、インビボ体細胞変異）に供され得、従って、組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に関連するアミノ酸配列に由来するが、インビボではヒト抗体の生殖系列レパートリー内には天然には存在し得ない配列である。

【0129】

特定の実施形態では、当業者は、ヒト以外の種由来の定常領域をヒト可変領域（単数または複数）とともにこのようなマウスで用いてキメラ抗体を産生することができる。

【0130】

（天然に存在する抗体構築物）
天然に存在する抗体構築物単位は代表的には、四量体を含む。各々のこのような四量体は代表的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各々の対が１つの全長「軽（ｌｉｇｈｔ）」鎖（代表的には約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重（ｈｅａｖｙ）」鎖（代表的には約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。各々の軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は代表的には、代表的には抗原認識を担う、約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部分は代表的には、エフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は代表的には、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は代表的には、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、そしてそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２が挙げられるがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは同様に、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が挙げられるがこれらに限定されないサブクラスに分割される。全長の軽鎖および重鎖内では、代表的には可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、ここでこの重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｃｈ．７，第２版（Ｐａｕｌ，Ｗ．（編）），１９８９，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（全ての目的のためにその全体が参考として援用される））を参照のこと。各々の軽鎖／重鎖の対の可変領域は代表的には、抗体結合部位を形成する。

【0131】

可変領域は代表的には、相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域に連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す。各々の対の２つの鎖由来のＣＤＲは代表的には、フレームワーク領域によってアライメントされ、これが特定のエピトープに結合し得る。Ｎ末端からＣ末端において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、代表的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各々のドメインに対するアミノ酸の割り当ては代表的には、免疫学的に重要なタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（１９８７および１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８〜８８３の定義に従っている。

【0132】

（二重特異性または二機能性の抗体）
二重特異性抗体または二機能性抗体は代表的には、２つの異なる重鎖／軽鎖の対および２つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、限定はしないが、ハイブリドーマの融合またはＦ（ａｂ’）フラグメントの連結を含む種々の方法によって産生されてもよい。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０ Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。

【0133】

（抗体の調製）
本発明は、ヒトＮＧＦに結合する抗体を提供する。これらの抗体は、全長ＮＧＦまたはそのフラグメントを用いた免疫によって産生され得る。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、もしくはモノクローナル抗体であってもよく、そして／または組み換え抗体であってもよい。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物の免疫によって調製されるヒト抗体である（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９３／１２２２７を参照のこと）。

【0134】

本発明の抗ＮＧＦ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、同じ種または別の種由来のフレームワーク領域（ＦＲｓ）に接合されてもよい。特定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲｓは、コンセンサスなヒトＦＲに接合されてもよい。コンセンサスなヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖のアミノ酸配列由来のＦＲをアライメントさせて、コンセンサスなアミノ酸配列を同定する。抗ＮＧＦ抗体重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲで置換されてもよい。抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲにおけるまれなアミノ酸は代表的には、置換されないが、残りのＦＲアミノ酸は置換されてもよい。まれなアミノ酸とは、ＦＲにおいて通常はみいだされない位置にある特定のアミノ酸である。本発明の抗ＮＧＦ抗体由来の移植された可変領域は、抗ＮＧＦ抗体の定常領域とは異なる定常領域とともに用いられてもよい。あるいは、移植された可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植は、任意の目的のために参考として本明細書に援用される、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号および同第５，５３０，１０１号に記載されている。

【0135】

本発明の抗体は好ましくは、マウスの抗体産生細胞に挿入されたヒト抗体産生遺伝子座の実質的な一部を有しており、そして内因性マウス抗体を産生するのにおいて異なるようにさらに操作されている、トランスジェニックマウスを用いて調製される。このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生可能であり、そしてマウスの免疫グロブリン分子および抗体を産生しないかまたはその実質的に少ない量を産生する。この結果を達成するために利用される技術は、本明細書に開示された特許、出願および引用文献に開示されている。好ましい実施形態では、当業者は、任意の目的のために参考として本明細書に援用される、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／２４８９３に開示されるような方法を使用してもよい。任意の目的のために参考として本明細書に援用される、Ｍｅｎｄｅｚら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６も参照のこと。

【0136】

本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、種々の技術によって産生されてもよい。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則的には、モノクローナル抗体を産生するための他の技術（例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換）を使用することもできる。

【0137】

ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウスである。マウスにおけるハイブリドーマ産生はきわめてよく確立されており、そして免疫プロトコール、および融合のための免疫された脾細胞の単離のための技術は、当該分野で周知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順はまた公知である。

【0138】

好ましい実施形態では、ＮＧＦに指向するヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。これらのトランスジェニックマウスは、本明細書において「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれるが、これは、再配列されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化変異とともに含む（Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９）。従って、上記マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、そして免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラスの切り替えおよび体細胞性の変異を受けて高い親和性のヒトＩｇＧ κモノクローナル抗体を産生する（Ｌｏｎｂｅｒｇら，前出；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６〜５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、その全ての内容全体が参考として本明細書に援用されている、Ｔａｙｌｏｒら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５；Ｃｈｅｎら，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７〜６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２〜２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９〜１０１；Ｔａｙｌｏｒら，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９〜５９１；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６〜５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５〜８５１に詳細に記載されている。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号および同第５，７７０，４２９号、ならびにその全ての開示全体が参考として本明細書に援用されている、１９９３年６月２４日公開のＳｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号；１９９３年６月２４日公開、国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２７；１９９２年１２月２３日公開ＷＯ９２／２２６４６；および１９９２年３月１９日公開ＷＯ９２／０３９１８を参照のこと。あるいは、以下の実施例に記載されたＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭのトランスジェニックマウス株が、ヒト抗ＮＧＦ抗体を産生するために用いられてもよい。

【0139】

本発明は、生物活性のヒトＮＧＦポリペプチドに特異的であり、かつこれを中和するヒトモノクローナル抗体を提供する。また、ＮＧＦポリペプチドに高度に特異的であり、かつＮＧＦポリペプチドに結合したとき、これを中和する、抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列も提供される。この高い特異性によって、抗ヒトＮＧＦヒト抗体および同様の特異性を有するヒトモノクローナル抗体は、ＮＧＦ関連性疾患のための免疫療法に有効になり得る。

【0140】

１態様では、本発明は、本明細書において提供される４Ｄ４抗体と同じエピトープまたは本質的に同じエピトープに結合する、単離されたヒト抗体を提供する。

【0141】

１態様では、本発明は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および７９〜１３０に示される少なくとも１つのアミノ酸を含む単離されたヒト抗体であって、高い親和性でＮＧＦポリペプチドエピトープに結合し、かつＮＧＦポリペプチド活性をアンタゴナイズする能力を有する抗体を提供する。好ましくは、これらの抗体は、本明細書に提供される４Ｄ４抗体と同じかまたは本質的に同じエピトープに結合する。

【0142】

好ましい実施形態では、上記単離されたヒト抗体は、１×１０^−９Ｍ以下という解離定数（Ｋ_Ｄ）でＮＧＦポリペプチドに結合して、１×１０^−７Ｍ以下というＩＣ_５０でインビトロ中和アッセイにおいてＮＧＦ誘導性生存を阻害する。さらに好ましい実施形態では、この単離されたヒト抗体は、１×１０^−１０Ｍ以下という解離定数（Ｋ_Ｄ）でＮＧＦポリペプチドに結合して、１×１０^−８Ｍ以下というＩＣ_５０でインビトロ中和アッセイにおいてＮＧＦ誘導性生存を阻害する。さらにより好ましい実施形態では、この単離された抗ＮＧＦヒト抗体は、１×１０^−１１Ｍ以下という解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＮＧＦポリペプチドに結合して、１×１０^−９Ｍ以下というＩＣ_５０でインビトロ中和アッセイにおいてＮＧＦ誘導性生存を阻害する。前述の結合および中和基準を満たす抗ヒトＮＧＦヒト抗体の例は本明細書に提供される。

【0143】

本発明の最も好ましい抗ヒトＮＧＦヒト抗体は、本明細書において４Ｄ４と呼ばれ、そしてそれぞれ配列番号１２および配列番号１０に示されるようなＶＬポリペプチド配列およびＶＨポリペプチド配列を有する。４Ｄ４のＶＬおよびＶＨをコードするポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１１および配列番号９に示される。本発明の抗ヒトＮＧＦヒト抗体の特性は、実施例に詳細に開示される。特に著しいのは、ＮＧＦポリペプチドについての高い親和性、および本明細書に実証されるＮＧＦポリペプチド活性をアンタゴナイズする高い能力である。

【0144】

抗ヒトＮＧＦヒト抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）は、実施例９に一般的に記載されるような表面プラズモン共鳴によって決定され得る。一般には、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、リガンド（バイオセンサーマトリックス上に固定された組み換えＮＧＦポリペプチド）と分析物（溶液中の抗体）との間のリアルタイムの結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオセンサーマトリックス上の抗体）を固定して、リガンド（溶液中の組み換え体Ｖ）を呈することによっても行うことができる。抗ヒトＮＧＦヒト抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）はまた、ＫｉｎＥｘＡ方法論を用いることによって決定され得る。本発明の特定の実施形態では、この抗体は、約１０^−８Ｍ〜１０^−１２ＭのＫ_ＤでＮＧＦに結合する。本明細書において用いる場合「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すものとする。本発明の目的については、Ｋ_Ｄは、実施例９に示されるように決定した。

【0145】

好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプの抗体である。好ましくはこの抗体はＩｇＧ３アイソタイプの抗体である。さらに好ましくは、この抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体である。最も好ましくはこの抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体である。他の実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＭアイソタイプ、ＩｇＡアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプまたはＩｇＤアイソタイプの抗体である。本発明の好ましい実施形態では、この抗体は、ヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１重鎖、ヒトＩｇＧ２重鎖、ヒトＩｇＧ３重鎖またはヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ２重鎖定常領域を含む本発明の抗体の発現は、以下の実施例に記載されている。特定の実施形態では、この抗体の可変領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプの定常領域以外の定常領域に連結される。特定の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローニングされている。

【0146】

特定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖に対する保存的改変（そしてヌクレオチドをコードする対応する改変）は、本明細書において開示される抗ＮＧＦ抗体の特徴と類似の機能的および化学的特徴を有する抗ＮＧＦ抗体を生成する。対照的に、抗ＮＧＦ抗体の機能的および／または化学的特徴における実質的な改変は、（ａ）置換の領域における分子骨格の構造、例えばシートまたはらせん高次構造として、（ｂ）標的部位における分子の変化もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、の維持に対する効果が有意に異なる重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の置換を選択することによって、達成され得る。

【0147】

例えば、「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、その位置でのアミノ酸残基の極性または荷電に対して影響がほとんどないかまたは全くないような、天然ではない残基による天然のアミノ酸残基の置換を包含し得る。さらに、ポリペプチド中の任意の天然の残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」について以前に記載されているとおり、アラニンで置換されてもよい。

【0148】

所望のアミノ酸置換（保存的であっても、または非保存的であっても）は、このような置換が所望される時点で当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、アミノ酸置換を用いて、抗ＮＧＦ抗体の重要な残基を同定すること、または本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体の親和性を増大もしくは低下させることができる。

【0149】

周知のとおり、アミノ酸配列におけるわずかな変化、例えば、１つ、２〜３（ａ ｆｅｗ）またはさらには数個のアミノ酸の欠失、付加または置換は、実質的に同一の特性を有する、もとのタンパク質の対立遺伝子型をもたらし得る。従って、本明細書に詳細に記載される抗体に加えて、他の「実質的に相同な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」抗体は、当業者に周知の種々の組み換えＤＮＡ技術を利用して容易に設計および製造され得る。一般には、遺伝子の改変は、部位指向性変異誘発のような種々の周知の技術によって容易に達成され得る。従って、本発明は、本明細書に開示される抗ＮＧＦヒト抗体に実質的に類似の特徴を有する「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」の抗ＮＧＦヒト抗体を企図する（例えば、その全てが参考として本明細書に援用されるＷＯ００／５６７７２を参照のこと）。従って、抗ＮＧＦヒト抗体に関して「改変体」または「変異体」という用語は、任意の結合分子（分子Ｘ）を意味し、ここでは（ｉ）重鎖の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または軽鎖の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を全体としてとれば、それぞれ、配列番号１４、配列番号１８および配列番号２２、または配列番号１６、配列番号２０および配列番号２４に示される超可変領域に対して、少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、さらに好ましくは少なくとも９５％相同であり、そして（ｉｉ）この改変体または変異体は、分子Ｘのフレームワーク領域と同一のフレームワーク領域を有する参照の抗ＮＧＦヒト抗体と同じ程度まで、ヒトＮＧＦの活性を阻害し得る。

【0150】

通常は、抗ＮＧＦヒト抗体改変体は、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲであって、それを全体としてとった場合、それぞれ配列番号１４、配列番号１８および配列番号２２、ならびに／または配列番号１６、配列番号２０および配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲを有する。

【0151】

さらに好ましくは、抗ＮＧＦヒト抗体改変体は、軽鎖可変領域であって、それを全体としてとった場合、配列番号１２、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０もしくは配列番号９１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する、軽鎖可変領域、ならびに／または重鎖可変領域であって、それを全体としてとった場合、配列番号１０、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５もしくは配列番号８７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９７％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する、重鎖可変領域を有する。

【0152】

ポリヌクレオチドに関して「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、本発明のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％の核酸配列同一性を有する核酸分子を指すものとする。通常は、ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に開示される新規な核酸配列と少なくとも約７５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の核酸配列同一性、なおより好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９３％の酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９６％の核酸酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９７％の核酸酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９８％の核酸酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する。

【0153】

特定の実施形態では、本発明は、本明細書の実施例１０および図５〜１０に示されように、本発明の抗体に対してある割合の同一性を有する抗体、または本発明の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３領域に対してある割合の同一性を有する重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３領域を含む抗体を提供する。

【0154】

特定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、重鎖と軽鎖とを含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの重鎖は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８１に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％もしくは９５％相同であるアミノ酸配列；配列番号８３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％もしくは９５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８５に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号８７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％もしくは８０％同一であるアミノ酸配列；配列番号７９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも５６％同一であるアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域を含む。

【0155】

特定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、重鎖と軽鎖とを含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号８０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号８８に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７４％、９０％もしくは９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号８９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、８５％もしくは８７％同一であるアミノ酸配列；配列番号９０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％もしくは９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号９１に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；配列番号８２に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９６％同一であるアミノ酸配列；配列番号８４に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号８６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域を含む。

【0156】

特定の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト重鎖ＣＤＲ１を含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの重鎖ＣＤＲ１は、配列番号９８、配列番号１０５、配列番号１１０もしくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも４０％もしくは６０％同一であるアミノ酸配列である。

【0157】

他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト重鎖ＣＤＲ２を含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこの重鎖ＣＤＲ２は、配列番号９９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％８２％もしくは９４％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７６％同一であるアミノ酸配列；配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも５９％同一であるアミノ酸配列；配列番号１１７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１１に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、もしくは８０％同一であるアミノ酸配列である。

【0158】

さらに他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト軽鎖ＣＤＲ１を含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこのＣＤＲ１は、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８０％同一であるアミノ酸配列；配列番号９５に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％、７５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１１９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２２に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；または配列番号１２５に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列；配列番号２４に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％もしくは９０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８０％同一であるアミノ酸配列である。

【0159】

さらなる実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト軽鎖ＣＤＲ２を含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこのＣＤＲ２は、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号９６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；または配列番号１２６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号２０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０８に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１４に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列である。

【0160】

他の実施形態では、本発明は、神経成長因子に特異的に結合し、ヒト軽鎖ＣＤＲ３を含む単離されたヒト抗体を提供するが、ここでこのＣＤＲ３は、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号９７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２１に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１２７に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３０に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１６に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは７８％同一であるアミノ酸配列；配列番号１０９に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７０％もしくは８５％同一であるアミノ酸配列；配列番号１３４に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも７８％同一であるアミノ酸配列；あるいは配列番号１１５に示されるアミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列である。

【0161】

４Ｄ４抗体重鎖および軽鎖の可変領域の配列は、それぞれ配列番号１０および１２に示される。しかし、多くの潜在的なＣＤＲ接触残基は、他のアミノ酸による置換の影響を受けやすく、そしてそれでも抗体が抗原に対する実質的な親和性を保持することを可能にしている。同様に、重鎖および軽鎖におけるＣＤＲと接触していない多くのフレームワーク残基によって、ヒト抗体の親和性または非免疫原性の有意な損失なしに、ヒトコンサンサスアミノ酸での、他のヒト抗体の対応する位置からのアミノ酸の置換、または他のマウス抗体からのアミノ酸の置換が適応され得る。種々の別のアミノ酸の選択を用いて、親和性、特異性、非免疫原性、製造の容易さ、および他の所望の特性の種々の組み合わせを有する、開示された抗ＮＧＦ抗体およびそのフラグメントのバージョンを生成することができる。

【0162】

別の実施形態では、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現されてもよい。これらの実施形態では、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために特定の抗体をコードする配列を用いてもよい。これらの実施形態によれば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号および同第４，９５９，４５５号（その全てが任意の目的のために参考として本明細書に援用される）に例示されているとおり、例えばウイルスへ（またはウイルスベクターへ）ポリヌクレオチドを組み込んで、このウイルス（またはベクター）によって宿主細胞を形質導入する方法、または当該分野で公知のトランスフェクション手順による方法、などを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法を用いて、形質転換を達成することができる。一般的に、用いられる形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存し得る。哺乳動物細胞へ異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれには、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（単数または複数）の封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられるがこれらに限定されない。

【0163】

本発明のＮＧＦ抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、または軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的な連結技術を用いて適切な発現ベクター中に挿入される。好ましい実施形態では、抗ＮＧＦ抗体重鎖または軽鎖の定常領域を、適切な可変領域のＣ末端に付加して、そして発現ベクター中に連結する。このベクターは代表的には、使用される特定の宿主細胞において機能的である（すなわち、このベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように宿主細胞の機構に適切である）ように選択される。発現ベクターの概説に関しては、ＭＥＴＨ．ＥＮＺ．１８５（Ｇｏｅｄｄｅｌ（編））１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。

【0164】

代表的には、任意の宿主細胞において用いる発現ベクターは、プラスミド維持のため、ならびに内因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列は総称的に、「隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ばれ、特定の実施形態では、このような配列は代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカーエレメント。これらの配列の各々は以下に考察される。

【0165】

必要に応じて、ベクターは、「タグ（ｔａｇ）」コード配列、すなわち、抗ＮＧＦ抗体ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含んでもよい；このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または別の「タグ」、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス血球凝集素）、またはｍｙｃ（これについては、市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、そして宿主細胞からのＮＧＦ抗体のアフィニティ精製または検出のための手段として機能し得る。アフィニティ精製は、例えば、アフィニティマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、種々の手段によって、例えば、切断のために特定のペプチダーゼを用いる手段によって、精製された抗ＮＧＦ抗体ポリペプチドから引き続いて除去されてもよい。

【0166】

隣接配列は、相同（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源由来の隣接配列の組み合わせ）、合成または天然であってもよい。従って、隣接配列の供給源は、この隣接配列が機能的であり、宿主細胞の機構によって活性化され得る条件下では、任意の原核生物であっても、または真核生物であっても、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物であっても、または任意の植物であってもよい。

【0167】

本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当該分野で周知の任意のいくつかの方法によって達成され得る。代表的には、本明細書において有用な隣接配列は、マッピングによって、および／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織供給源から単離可能である。ある場合には、隣接配列の全ヌクレオチド配列が公知であり得る。ここでは、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書において記載された方法を用いて合成され得る。

【0168】

隣接配列の全てが公知であるか一部のみが公知であるかにかかわらず、これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ならびに／または適切なプローブ、例えば、同じもしくは別の種由来のオリゴヌクレオチドおよび／もしくは隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列またはさらに別の遺伝子（単数または複数）を含み得る、ＤＮＡのさらに大きい小片から単離することができる。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化を行い、その後、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）または当業者に公知の他の方法を用いて単離することによって、達成できる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。

【0169】

複製起点は代表的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は宿主細胞においてベクターの増幅を補助する。選り抜きのベクターが複製起点の部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成して、ベクターに連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはポリオーマウイルス、例えば、ＨＰＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターをも含むので、多くの場合単独で用いられる）。

【0170】

転写終結配列は代表的には、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’側に位置して、転写を集結するように機能する。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントであり、ポリＴ配列が続く。この配列はライブラリーから容易にクローニングされるかまたはベクターの一部として市販さえされているが、本明細書に記載の方法のような核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。

【0171】

選択マーカー遺伝子は、選択性の培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞については、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンに対する耐性を付与するか；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するか；あるいは（ｃ）複合培地または規定の培地から利用できない重要な栄養物を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラマイシン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物および真核生物の宿主細胞の両方における選択のために用いることができる。

【0172】

発現される遺伝子を増幅するために、他の選択遺伝子が用いられてもよい。増幅とは、増殖または細胞の生存に重要なタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組み換え細胞の連続的世代の染色体内において縦列で反復されているプロセスである。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子およびプロモーターなしのチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。ベクターに存在する選択遺伝子によって形質転換体のみが生存するように固有に適合されるという選択圧力下に、哺乳動物細胞形質転換体を置く。選択圧力は、培地中の選択因子の濃度が連続的に増大される条件下で形質転換細胞を培養することによって付与され、これによって、選択可能遺伝子と、別の遺伝子（例えばＮＧＦポリペプチドに結合する抗体）をコードするＤＮＡとの両方の増幅がもたらされる。結果として、抗ＮＧＦ抗体のようなポリペプチドの増大した量は、増幅されたＤＮＡから合成される。

【0173】

リボソーム結合部位は通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは代表的には、プロモーターの３’側および発現されるべきポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。

【0174】

真核生物の宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合のような、ある場合には、グリコシル化または収率を改善するために種々のプレ配列またはプロ配列を操作してもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更してもよいし、またはグリコシル化に影響し得るプロ配列を付加してもよい。最終タンパク質産物は、（成熟タンパク質の第一アミノ酸に対して）−１位に、発現に付随する１つ以上のさらなるアミノ酸を有してもよく、これは完全に取り除かれていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合されたペプチダーゼ切断部位に見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有してもよい。あるいは、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、いくつかの酵素切断部位の使用によって、所望のポリペプチドのわずかに短縮された形態が生じ得る。

【0175】

本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは代表的には、宿主生物によって認識され、かつ抗ＮＧＦ抗体をコードする分子に作動可能に連結されているプロモーターを含む。プロモーターは、その構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）（一般的には約１００〜１０００ｂｐ内）に位置する非転写配列である。プロモーターは以下の２つのクラスのうちの１つに慣用的に分類される：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター。誘導性プロモーターは、栄養物の有無または温度の変化のような培養条件におけるいくつかの変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡから増大したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子を均一に転写し、すなわち、遺伝子発現に対する制御はほとんどないかまたは全くない。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターは周知である。適切なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源のＤＮＡからプロモーターを除去して、そしてこのベクターに所望のプロモーター配列を挿入することによって、本発明の抗ＮＧＦ抗体を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。

【0176】

酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。哺乳動物宿主細胞とともに使用するための適切なプロモーターは周知であり、そしてウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られたプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。

【0177】

該当し得るさらなるプロモーターとしては、限定はしないが以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４〜１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８１：６５９〜６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７〜９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４〜４５）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターおよび調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９〜４２）；ならびに原核生物プロモーター、例えば、βラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７〜３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１〜２５）。また目的のものは、組織特異性を示して、トランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域である：膵臓の腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９〜４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５〜５１５）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５〜２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７〜５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３〜３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６〜４４）；精巣、乳房、リンパ系細胞および肥満細胞において活性なマウス哺乳動物腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５〜９５）；肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８〜７６）；肝臓において活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９〜４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３〜５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１〜７１）；骨髄性細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８〜４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９〜９４）；脳におけるオリゴデンドログリア（乏突起膠細胞）において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３〜１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３〜８６）；ならびに視床下部で活性な生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２〜７８）。

【0178】

エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等な真核生物によって本発明の抗ＮＧＦ抗体を含む軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増大し得る。エンハンサーは、プロモーター上で転写を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは比較的、方向および位置に依存し、転写単位の５’および３’の両方の位置で見出されている。哺乳動物遺伝子から利用可能ないくつかのエンハンサー配列は公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーを用いる。当該分野で公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクター中でコード配列の５’または３’のいずれに位置してもよいが、代表的にはプロモーターから５’部位に位置する。

【0179】

本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの開始ベクターから構築されてもよい。このようなベクターは、所望の隣接配列の全てを含んでも含まなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の１つ以上は既にはベクターに存在しないが、その隣接配列を個々に入手してベクターに連結してもよい。隣接配列の各々を得るために用いた方法は、当業者に周知である。

【0180】

ベクターが構築され、そして軽鎖、重鎖、または抗ＮＧＦ抗体を含む軽鎖および重鎖をコードする核酸分子がこのベクターの適切な部位に挿入された後、この完成したベクターを増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞中に挿入してもよい。選択された宿主細胞への抗ＮＧＦ抗体についての発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、または他の公知の技術を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部は、用いられる宿主細胞のタイプに依存する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されている。

【0181】

宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、抗ＮＧＦ抗体を合成し、この抗体は引き続いて、培養培地から（宿主細胞が培地中にこの抗体を分泌する場合）、またはこの抗体を産生する宿主細胞から直接（この抗体が分泌されない場合）、収集できる。適切な宿主細胞の選択は、種々の要因、例えば、所望の発現レベル、活性のために所望されるかまたは必要であるポリペプチド改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さに依存する。

【0182】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、そしてこれには、限定はしないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられ、これには限定はしないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター仔の腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および多数の他の細胞株が挙げられる。特定の実施形態では、どの細胞株が高い発現レベルを有し、ＮＧＦ結合特性を有する抗体を構成的に生成するかを決定することを通じて、細胞株を選択することができる。別の実施形態では、それ自体の抗体を生成しないが、異種の抗体を作製および分泌する能力を有するＢ細胞系列由来の細胞株を選択することができる。

【0183】

本発明の抗体は、生物学的サンプル中のＮＧＦを決定するため、およびＮＧＦタンパク質を産生する細胞または組織の同定のために、有用である。ＮＧＦに特異的に結合する本発明の抗体は、ＮＧＦ媒介性疾患の治療において有用であり得る。このような抗体は、ＮＧＦを検出するため、およびＮＧＦがＮＧＦレセプターとの複合体を形成することを阻害するための結合アッセイにおいて用いられ得る。ＮＧＦに結合して、他の結合化合物との相互作用をブロックするこのような抗体は、ＮＧＦ媒介性疾患を調節することにおいて治療的な用途を有し得る。好ましい実施形態では、ＮＧＦに対する抗体は、そのレセプターに対するＮＧＦ結合をブロックし得、これによってＮＧＦ誘導性シグナル伝達カスケードの破壊を生じ得る。

【0184】

本発明はまた、本明細書に開示される障害または状態のいずれか１つのような、患者における、ＮＧＦの発現増大、またはＮＧＦに対する感度の増大によって生じる疼痛性の障害または状態の処置のための薬物の製造における本発明の１つ以上の抗体の使用に関する。

【0185】

好ましい実施形態では、本発明は、薬学的組成物であって、治療有効量の１つまたは複数の本発明の抗体を、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントとともに含む薬学的組成物を提供する。好ましくは、受容可能な処方物質は、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性である。好ましい実施形態では、治療有効量の抗ＮＧＦ抗体を含む薬学的組成物が提供される。

【0186】

特定の実施形態では、受容可能な処方物質は好ましくは、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。

【0187】

特定の実施形態では、上記薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色調、等張性、臭気、無菌性、安定性、分解もしくは放出の速度、組成物の吸着もしくは浸透を、改変、維持または保存するための処方物質を含んでもよい。このような実施形態では、適切な処方物質としては、限定はしないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アルコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸）；バルク剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリンまたはヒドロキシプロピルβシクロデキストリン）；賦形剤（ｆｉｌｌｅｒ）；単糖類；二糖類；ならびに他の糖類（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味料および希釈剤；乳化剤；親水性のポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）；安定性強化剤（例えば、スクロースまたはソルビタール）；等張化剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）および／または薬学的アジュバントが挙げられる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。

【0188】

特定の実施形態では、最適の薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達様式および所望の投薬量に依存して、当業者によって決定される。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，前出を参照のこと。特定の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボでの放出の速度、およびインビボでのクリアランスの速度に影響し得る。

【0189】

特定の実施形態では、薬学的組成物における主なビヒクルまたはキャリアは、現実には水性であっても非水性であってもよい。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、非経口投与のための組成物中に共通の他の物質で補充された可能性がある、注射用水、生理学的生理食塩水または人工的な脳脊髄液であってもよい。中性の緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらに例示的なビヒクルである。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、そしてさらにソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０および／またはその適切な代替物を含んでもよい。本発明の特定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を最適の処方剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前出）とともに、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で混合することによって貯蔵のために調製され得る。さらに、特定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体産物は、スクロースのような適切な賦形剤を用いて凍結乾燥剤として処方されてもよい。

【0190】

本発明の薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、この組成物は、吸入のために、または経口のような消化管を通じた送達のために選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内である。

【0191】

処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在することが好ましい。特定の実施形態では、緩衝剤を用いて、この組成物を生理学的なｐＨで、またはわずかに低いｐＨで、代表的には約５〜約８のｐＨ範囲内で維持する。

【0192】

非経口的投与を考慮する場合、本発明における使用のための治療組成物は、所望の抗ＮＧＦ抗体を薬学的に受容可能なビヒクル中に含む、発熱物質なしの、非経口的に受容可能な水溶液の形態で提供されてもよい。非経口注射のために特に適切なビヒクルは滅菌蒸留水であり、この滅菌蒸留水中に、抗ＮＧＦ抗体が、適切に保存された無菌の等張性溶液として処方されている。特定の実施形態では、この調製物は、デポ注射を介して送達できる産物の制御放出または徐放性放出を提供し得る、ある因子、例えば、注射用マイクロスフェア、生分解性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ酪酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームとともに、所望の分子の処方物を含んでもよい。特定の実施形態では、循環中の持続期間を延長する効果を有する、ヒアルロン酸も用いることができる。特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスを用いて、所望の抗体分子を導入することができる。

【0193】

本発明の薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。これらの実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、乾燥した吸入可能な粉末として有利に処方される。好ましい実施形態では、抗ＮＧＦ抗体吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤とともに処方されてもよい。特定の実施形態では、溶液は噴霧され得る。従って、肺投与および処方の方法はさらに、参考として援用されており、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載する、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に記載されている。

【0194】

処方物は経口的に投与できることも意図される。この様式で投与される抗ＮＧＦ抗体は、錠剤およびカプセルのような固体投薬形態の配合に習慣的に用いられるキャリアと一緒に、またはそのキャリアなしで、処方され得る。特定の実施形態では、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化されて予備的な全身性の分解が最小化される場合、腸管におけるポイントでこの処方物の活性部位を遊離するように設計され得る。抗ＮＧＦ抗体の吸着を促進するためにさらなる因子が含まれてもよい。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合因子も使用され得る。

【0195】

本発明の薬学的組成物は好ましくは、１または複数の抗ＮＧＦ抗体の有効量を、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤と混合して含んで提供される。滅菌水、または別の適切なビヒクルに錠剤を溶解することによって、単位用量形態で溶液を調製し得る。適切な賦形剤としては、限定はしないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸塩、ラクトースもしくはリン酸カルシウム；または結合因子、例えばデンプン、ゼラチンもしくはアカシア；または潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくは滑石が挙げられる。

【0196】

さらなる薬学的組成物は、当業者には明白であり、これには、持続送達または徐放性送達の処方物中に抗ＮＧＦ抗体を含む処方物が挙げられる。種々の他の持続送達または徐放性送達の手段、例えば、リポソームキャリア、生分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポ注射剤を処方するための技術も当業者には公知である。例えば、参考として援用されており、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の徐放性放出を記載している、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。持続放出調製物は、成形された物質の形態で、半透過性ポリマー物質、例えばフィルムまたはマイクロカプセルを含んでもよい。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（参考として各々が援用される、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開番号ＥＰ０５８４８１に開示される）、Ｌグルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７〜５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開番号ＥＰ１３３，９８８）を含んでもよい。持続放出組成物はまた、当該分野で公知の任意のいくつかの方法によって調製され得るリポソームを含んでもよい。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８〜３６９２；参考として援用される、欧州特許出願公開番号ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６およびＥＰ１４３，９４９を参照のこと。

【0197】

インビボ投与のために用いられる薬学的組成物は代表的には、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれに行われてもよい。非経口的な投与のための組成物は、凍結乾燥形または溶液として保存されてもよい。非経口的な組成物は一般には、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって穿通可能な栓を有するバイアルに入れられる。

【0198】

一旦薬学的組成物が処方されると、この薬学的組成物は、滅菌バイアル中に、溶液、懸濁物、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として貯蔵されていてもよい。このような処方物は、レディー・ツー・ユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）の形態、または投与の前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれで貯蔵されてもよい。

【0199】

本発明はまた、単回用量投与単位を生成するためのキットを提供する。本発明のキットは各々が、所望のタンパク質を有する第一の容器、および水性処方物を有する第二の容器の両方を備え得る。本発明の特定の実施形態では、単一および複数のチャンバを有する事前充填（プレフィルド）シリンジ（例えば、液体シリンジおよびライオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットが提供される。

【0200】

治療上使用されるべき、有効な量の抗ＮＧＦ抗体を含有する薬学的組成物は、例えば、治療の状況および目的に依存する。治療のために適切な投薬レベルは部分的には、送達される分子、抗ＮＧＦ抗体が用いられている徴候、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面または器官サイズ）および／または状態（年齢および全身健康状態）に依存して変化することが当業者には理解される。特定の実施形態では、最適の治療効果を得るために、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。代表的な投薬量は、上述の要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ以上までに及んでもよい。好ましい実施形態では、投薬量は０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ；またはそれより好ましくは５μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇにおよんでもよい。

【0201】

投与頻度は、用いられる処方物中の特定の抗ＮＧＦ抗体の薬物動態的パラメーターに依存する。代表的には、所望の効果を達成する投薬量が得られるまで、臨床医はこの組成物を投与する。従って、この組成物は単回用量として、または２回以上の用量（これは同じ量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）として経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した連続注入として、投与されてもよい。適切な投薬量のさらなる工夫は当業者によって慣用的に行われ、そして当業者によって慣用的に行われる課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて得ることができる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、長期間にわたって患者に投与されてもよい。本発明の抗体の慢性投与によって、非ヒト動物においてヒト抗原に対して惹起された抗体、例えば、ヒト以外の種で産生された不完全ヒト抗体に一般に関連する有害な免疫応答またはアレルギー応答が最小化される。

【0202】

薬学的組成物の投与経路は、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、公知の方法、例えば、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって投与されても、もしくは注入によって連続的に投与されても、または移植デバイスによって投与されてもよい。

【0203】

この組成物はまた、所望の分子がその上に吸着されるかまたは封入されている、膜、スポンジまたは別の適切な物質の移植によって局所投与されてもよい。移植デバイスを用いる特定の実施形態では、デバイスは任意の適切な組織または器官に移植されてもよく、そして所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続的投与を介してもよい。

【0204】

本発明による抗ＮＧＦ抗体の薬学的組成物をエキソビボで用いることもまた所望され得る。このような場合、患者から除去されている細胞、組織または器官を、抗ＮＧＦ抗体の薬学的組成物に曝露して、その後に細胞、組織および／または器官を患者に引き続き移植して戻す。

【0205】

詳細には、抗ＮＧＦ抗体は、本明細書において記載される方法のような方法を用いて、ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作されている特定の細胞を移植することによって送達できる。特定の実施形態では、このような細胞は、動物細胞であってもまたはヒト細胞であってもよく、そして自家性、非相同性または異種性であってもよい。特定の実施形態では、細胞は不死化されてもよい。他の実施形態では、免疫学的応答の機会を低下させるために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために封入されてもよい。さらなる実施形態では、封入物質は代表的には、タンパク質産物（単数または複数）の放出を可能にするが、患者の免疫系によるか、または周囲の組織からの他の有害な要因による、細胞の破壊を妨げる生体適合性、半透性のポリマー封入物または膜である。

【実施例】

【0206】

以下の実施例は、行った実験および得られた結果を含んでいるが、これは、例示目的のためにのみ提供しており、本発明を限定すると解釈されるべきではない。

【0207】

（実施例１）
（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのヒトＮＧＦタンパク質の生成）
（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１−１２０）のクローニング）
配列番号２７および配列番号２８に示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに標準的なＰＣＲ技術を用いてｃＤＮＡからヒトＮＧＦをコードするヌクレオチド配列を増幅した。この５’プライマーは、成熟配列のコドン１（セリン）のすぐ前にＮｄｅＩ制限部位およびメチオニン開始コドンを作成する。３’プライマーは、終止コドンの直前にＢａｍＨＩ制限部位を作成する。得られたＰＣＲ産物をゲル精製して、制限エンドヌクレーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化したベクターｐＣＦＭ１６５６中に連結した。連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株６５７のコンピテントな宿主細胞に形質転換した。組み換えタンパク質産物を生成する能力および正確なヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２９）を有するプラスミドを保有する能力について、クローンをスクリーニングした。組み換えヒトＮＧＦ１−１２０のアミノ酸配列は、配列番号３０に示す。

【0208】

発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ＃６９５７６）を米国特許第４，７１０，４７３号に記載される発現ベクター系から誘導した。ｐＣＦＭ１６５６プラスミドは、（ａ）Ｔ４ポリメラーゼ酵素での末端充填その後の平滑末端ライゲーションによって２つの内因性ＮｄｅＩ制限部位を破壊して；（ｂ）ＰＬプロモーターを含むｐＣＦＭ６３６（米国特許第４，７１０，４７３号）から得られた同様のフラグメントを用いて、合成Ｐ_Ｌプロモーターを含む固有のＡａｔＩＩとＣｌａＩ制限部位との間のＤＮＡ配列を置換して、次いで（ｃ）配列番号３１および配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を有する２つのプローブのアニーリングから得られたオリゴヌクレオチドを用いて、固有のＣｌａＩ制限部位とＫｐｎＩ制限部位との間の小さいＤＮＡ配列を置換することによって、記載されたｐＣＦＭ８３６プラスミド（米国特許第４，７１０，４７３号）から誘導され得る。

【0209】

Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２宿主株（Ａｍｇｅｎ株６５７）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ（ＣＧＳＣ株６１５９）から得られた、Ｅ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５（Ｋ１２株）の誘導体である。

【0210】

（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１−１２０）の発現）
ＮＧＦ発現構築物（上記のような）を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、流加方式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｍｏｄｅ）でリッチな培地中で発酵させた。細胞は６００ｎｍでのＯＤが４９になるまで３０℃で増殖させ、次いで４２℃への温度変更によって誘導した。細胞を、誘導後４時間遠心分離することによって回収した。最終のＯＤは７５であった。発現収率は約０．１５ｇ／Ｌであることが確認された。

【0211】

（ｒＨｕ−ＮＧＦ（１−１２０）の再折り畳みおよび精製）
細胞ペーストをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ中で溶解して、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを１％のデオキシコール酸で洗浄して、上記のように遠心分離して、次いで得られたペレットを冷水で洗浄して再遠心分離した。この得られたペレット（ＷＩＢｓ−洗浄された封入体）を、変性剤（８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５（１０ｍＭ ＤＴＴ含有））中に再懸濁して、室温で１時間可溶化して、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、その上清を注意深くデカントし、次いで４℃の酸化還元対を含む水性緩衝液中に、５日間、２５倍希釈した。次いで、この得られた再折り畳みをｐＨ３．０にまで滴定して、０．４５μＭのフィルターを通して濾過した。標準的なＮａＣｌ勾配を用いるＳｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラムを用いて、この再折り畳みを精製した。陽イオン交換カラムからのプールを引き続いて濃縮して、アリコートを−８０℃で凍結させた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、このタンパク質の純度を評価し、そしてクマーシー・ブルー染色によって分析した。精製されたタンパク質は、この方法によって主要バンドが９０％を超える純度であった。

【0212】

（実施例２）
（神経成長因子ＮＧＦに対するヒトモノクローナル抗体の産生）
（トランスジェニックＨｕＭａｂおよびＫＭマウス）
ＮＧＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、各々がヒト抗体遺伝子を発現する、トランスジェニックマウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２、およびＫＭ系統を用いて調製された。これらのマウス系統の各々において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎらに記載されたとおりホモ接合性に分裂されており（１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８１１〜８２０）、そして内因性マウス重鎖遺伝子は、国際特許出願公開番号ＷＯ０１／０９１８７（参考として援用される）の実施例１に記載のようにホモ接合性に分裂されていた。これらのマウス系統の各々は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５〜８５１）に記載されているとおり、ヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を担持する。ＨＣｏ７系統は、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号および同第５，５４５，８０７号（参考として援用される）に記載のとおりＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を担持する。ＨＣｏ１２株は、国際特許出願番号ＷＯ０１／０９１８７（参考として援用される）の実施例２に記載のとおりＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を担持する。ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２系統は、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２の両方の重鎖導入遺伝子を担持し、そして各々の導入遺伝子について半接合性である。ＫＭマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１６，１３３〜１４３および２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９７，７２２−７２７）に記載されるようにＳＣ２０重鎖導入遺伝子を含む。この導入遺伝子は、マウス染色体には組み込まれないが、代わりに独立した染色体フラグメントとして増殖される。このフラグメントは、約１５ＭＢのヒト第１４染色体を含む。これは、ヒト重鎖遺伝子座全体を含み、これには全てのＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントおよび全ての重鎖定常領域アイソタイプを含む。これらの株の全てが本明細書においてＨｕＭａｂマウスと呼ばれる。

【0213】

（ＨｕＭａｂ免疫：）
ＮＧＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するため、ＨｕＭａｂマウスを、抗原としてＥ．ｃｏｌｉ細胞由来の精製組み換えヒトＮＧＦを用いて免疫した（実施例１）。ＨｕＭａｂマウスの一般的な免疫スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇらに記載されている（各々の教示が参考として援用されている、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（前出）および国際特許出願公開番号ＷＯ９８／２４８８４）。マウスは、抗原の第一回の注入の際に６〜１６週齢であった。ＮＧＦ抗原の精製組み換え調製物（２５〜１００μｇ）を用いて、ＨｕＭａｂマウスを腹腔内（ＩＰ）または皮下（Ｓｃ）で免疫した。

【0214】

ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスの免疫は、完全フロイントアジュバントおよび２つの注射物に含まれる抗原を用いて、続いて、不完全フロイントアジュバントに含まれる抗原を用いた、２〜４週のＩＰ免疫（全部で９免疫まで）によって行った。数ダースのマウスを各々の抗原について免疫した。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７＋ＨＣｏ１２およびＫＭ系統の全部で１１８匹のマウスをＮＧＦ抗原で免疫した。免疫応答を後眼窩採血によってモニターした。

【0215】

ヒトＮＧＦに結合する抗体を産生するＨｕＭａｂマウスを選択するため、免疫したマウス由来の血清をＦｉｓｈｗｉｌｄら（前出）に記載されるとおりＥＬＩＳＡによって試験した。要するに、マイクロタイタープレートを、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の精製された組み換えＮＧＦ（実施例１）をＰＢＳ中に１〜２μＬ／ｍＬで用いてコーティングして、５０μＬ／ウェルで、４℃で一晩インキュベートし、次いで５％ニワトリ血清を含むＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）の２００μＬ／ウェルを用いてブロックした。ＮＧＦ免疫したマウスからの血漿の希釈物を、各々ウェルに添加して、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄して、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬とともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、このプレートをＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，カタログ番号Ａ−１８８８，０．２２ｍｇ／ｍＬ）を用いて発色させて、４１５〜４９５ｎｍの波長で光学密度（ＯＤ）を決定することによって分光光度的に分析した。抗ＮＧＦヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを用いて下記のとおりモノクローナル抗体を産生した。

【0216】

（ＮＧＦに対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成）
抗原を用いて静脈内にブースト（追加免疫）することによるモノクローナル抗体産生のためにマウスを準備して、２日後に屠殺し、その後に脾臓を取り出した。ＨｕＭａｂマウスからマウス脾臓を単離して、標準的なプロトコールを用いてＰＥＧとともにマウス骨髄腫細胞株に融合した。代表的には、各々の抗原について１０〜２０の融合を行った。

【0217】

要するに、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，登録番号ＣＲＬ１５８０）の数の四分の一に融合した。細胞を平底マイクロタイタープレート中に約１×１０^５／ウェルでプレートして、続いて１０％ウシ胎仔血清、１０％Ｐ３８８Ｄ１−（ＡＴＣＣ，登録番号ＣＲＬ ＴＩＢ−６３）馴化培地、３〜５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）を、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，カタログ番号ＣＲＬ１００１３、高いグルコース、Ｌグルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）、ならびに５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号、ＣＲＬ Ｐ−７１８５）を含有する選択培地中での約２週間のインキュベーションを続けた。１〜２週後、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地中で細胞を培養した。

【0218】

得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。個々のウェルをＥＬＩＳＡ（上記）によって、ヒト抗ＮＧＦモノクローナルＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。一旦、過剰のハイブリドーマ増殖が生じれば、通常１０〜１４日後に培地をモニターした。抗体分泌するハイブリドーマを再度プレートして、再度スクリーニングして、依然としてヒトＩｇＧについて陽性である場合、抗ＮＧＦモノクローナル抗体を少なくとも２回、限界希釈によってサブクローニングした。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地中で少量の抗体を生成させた。

【0219】

（ＮＧＦに結合するヒトモノクローナル抗体の選択）
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＮＧＦ免疫原と正の反応性を示したハイブリドーマをスクリーニングした。ＮＧＦに対して高い結合活性で結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをサブクローニングしてさらに特徴付けた。液体窒素中に保持した５〜１０バイアルの細胞バンクを作製するために、親細胞の反応性を保持している（ＥＬＩＳＡによって決定した場合）、各々のハイブリドーマ由来の１つのクローンを選択した。

【0220】

アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡを行って、本明細書に開示されたとおり産生したモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。これらの実験では、マイクロタイタープレートウェルを、ＰＢＳ中のマウス抗ヒトκ軽鎖の溶液１μｇ／ｍＬを１ウェルあたり５０μＬで用いてコーティングして、４℃で一晩インキュベートした。５％ニワトリ血清を用いたブロッキング後、このプレートを各々の試験したモノクローナル抗体由来の上清および精製されたアイソタイプコントロールと反応させた。プレートを周囲温度で１〜２時間インキュベートした。次いで、このウェルを種々のヒトＩｇＧ特異性西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ヒトポリクローナル抗血清と反応させて、プレートを発色させ、上記のように分析した。

【0221】

ＥＬＩＳＡによって検出した場合ＮＧＦに対する有意な結合を示したハイブリドーマ上清から精製したモノクローナル抗体をさらに、下記のような種々のバイオアッセイを用いて生物学的活性について試験した。

【0222】

（実施例３）
（強力なＮＧＦ中和活性を有する抗ＮＧＦ抗体の選択およびクローニング）
ＮＧＦ活性（すなわち、ＮＧＦ「中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）」）のインヒビターとして、実施例２で最初に同定された抗体の有効性は、各々の改変されたペプチドがバニロイドレセプター−１（ＶＲ１）発現のＮＧＦ誘導をブロックする能力を測定することによって評価した。

【0223】

（後根神経節神経細胞培養）
妊娠期の終末に麻酔したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の子宮から外科的に取り出した、胚性の１９日齢（Ｅ１９）ラットの全ての脊髄セグメントから、後根神経節（ＤＲＧ）を無菌条件下で１つずつ切り取った。５％熱不活化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む氷冷Ｌ−１５培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中にＤＲＧを収集して、疎性結合組織および血管を取り除いた。Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋なしのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．４（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で、ＤＲＧを２回リンスした。次いでパパイン解離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を用いて単独の細胞懸濁液中にＤＲＧを解離させた。要するに、２０Ｕ／ｍＬのパパインをアール（Ｅａｒｌｅ）の平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）に含有する消化溶液中において３７℃で５０分間、ＤＲＧをインキュベートした。ＭＥＭ／ハムＦ１２、１：１、１ｍｇ／ｍＬオボムコイドインヒビターおよび１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン、および０．００５％デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）から構成される解離培地中で、微細研磨したパスツールピペットを通した倍散によって細胞を解離させた。

【0224】

解離された細胞を５分間２００×ｇでペレット化して、１ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンおよび０．００５％ＤＮａｓｅを含有するＥＢＳＳ中で再懸濁した。細胞懸濁液は、１０ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１０ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンを含有する勾配溶液を通じて２００×ｇで６分間遠心分離して、細胞細片を除去し、次いで８８μｍのナイロンメッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を通じて濾過して、クランプを除去した。血球計算器を用いて細胞数を決定して、細胞を、ポリ−オルニチン１００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびマウスラミニン１μｇ／ｍＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）でコーティングした９６ウェルプレート中に、完全培地中において、１０×１０^３細胞／ウェルで播種した。この完全培地は、最小基本培地（ＭＥＭ）およびハムのＦ１２、１：１、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および１０％熱不活性化ウシ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）から構成された。この培養物を、３７℃、５％ＣＯ_２および１００％の湿度で維持した。非ニューロン細胞の増殖を制御するために、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（７５μＭ）およびウリジン（１８０μＭ）を培地中に含んだ。

【0225】

（ＮＧＦおよび抗ＮＧＦでの処理）
プレートの２時間後、組み換えヒトβ―ＮＧＦ（Ａｍｇｅｎ）または組み換えラットβ−ＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を１０ｎｇ／ｍＬの濃度（０．３８ｎＭ）で用いて細胞を処理した。段階希釈した抗ＮＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む陽性コントロールを各々の培養プレートに添加した。３．１６倍の段階希釈を用いて１０の濃度で試験抗体を添加した。全てのサンプルを完全培地中で希釈して、その後に培養物に添加した。インキュベーション時間はＶＲ１発現の測定の前４０時間であった。

【0226】

（ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現の測定）
培養物をハンクスの平衡塩溶液に含まれる４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定して、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）でブロックして、０．２５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて１時間室温で透過化処理した。０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）含有ＴＢＳを用いて培養物を１回リンスして、ウサギ抗ＶＲ１ ＩｇＧを用いて、１時間半、室温でインキュベートして、続いてＥｕ標識した抗ウサギ第二抗体（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳでの洗浄を（ゆっくり振盪しながら３×５分）各々の抗体インキュベーション後に行った。強化溶液（ｅｎｈａｎｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１５０μＬ／ウェル，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）をこの培養物に添加した。次いで、蛍光シグナルを時間分解蛍光計（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）中で測定した。０〜１０００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ滴定の標準曲線と比較することによって、改変ペプチドで処理したサンプル中のＶＲ１発現を決定した。ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１発現に対するＮＧＦ効果の阻害パーセント（最大可能阻害に対して比較）は、ＮＧＦ処理されていないコントロールと比較することによって決定した。結果を表２および表５に示す。

【0227】

細胞株は、＃１１０〜＃１２９と表示した。細胞株＃１１９、＃１２４および＃１２５由来の抗体は、極度に強力なＮＧＦ中和活性を示した（図１）。＃１２４細胞株は、４Ｄ４とも呼ばれる、平行細胞株であった。＃１１９および＃１２５細胞株は、４Ｄ４の親のサブクローンであった。ハイブリドーマ＃１２４（４Ｄ４）を含むもとのウイルスからさらなるサンプルを増殖して、＃１６７（４Ｄ４）と表示した。

【0228】

ハイブリドーマ＃１６７（４Ｄ４）によって生成された抗体を、前のサンプルと同じＤＲＧニューロンベースのＮＧＦ中和アッセイに供した。抗体＃１６７（４Ｄ４）は、サンプル＃１１９、＃１２４および＃１２５の活性と一致した、０．５０ｎＭというＩＣ_５０を有する強力な抗ＮＧＦ活性を示した（図２）。４つのサンプルの活性を表２に示す。

【0229】

【表2】

（Ｎ末端配列決定および質量分析）
タンパク質配列決定およびＬＣ／ＭＳ分析のために、精製した抗ＮＧＦハイブリドーマ抗体サンプルを調製した。容積が１５ｍＬ未満になるまで、Ａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０を用いて培地を濃縮することによって、馴化培地から抗体を精製した。ｒＰｒｏＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂のバッチを、ＰＢＳを用いて４回洗浄して、最終洗浄後、ＰＢＳ中で５０％スラリーを作製した。ｒＰｒｏＡ樹脂の適切な量（樹脂１μＬあたり約５μｇの抗体、ただし少なくとも５０μＬの樹脂を用いる）を抗体サンプルに添加して、４℃で一晩インキュベートした。Ａｂ−樹脂混合物を遠心分離して、未結合の画分を収集した。０．５ｍＬ ＰＢＳを添加して０．４５μｍ Ｓｐｉｎ−Ｘ（ＣｏＳｔａｒ）チューブに移した後、サンプルを１００００ｒｐｍで３分間遠心分離した。樹脂を次に少なくとも３回、０．５ｍＬ ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）を１．５培容積の樹脂に添加して、室温で１０分間インキュベートし、続いて３分間１００００ｒｐｍでさらに遠心分離をし、上清を回収した。この溶出工程をさらに２回繰り返し、次いで合わせた上清を、１／２５倍の容積の１．０Ｍ ｔｒｉｓ（ｐＨ９．２）で中和した。

【0230】

新しいＳｐｉｎ−Ｘチューブ（０．２μｍ）を通す最終濾過後、標準としてヒトＩｇＧ、あるいは、より大きいサンプルについては２８０の吸光度を用いる、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて抗体を定量した。ゲルはまた、２μｇの各々のサンプルと並行して２μｇのヒトＩｇＧ１，ｋ（Ｓｉｇｍａ）を用いて泳動させた。質量分析のために、４μｇのサンプルを脱グリコシル化し、還元して、Ｆｉｎｉｎｇａｎ ＬＣＱ質量分析にオンライン連結したＨＰＬＣ（ＨＰ１０９０）にロードした。逆相ＨＰＬＣによって重鎖から軽鎖を分離した。軽鎖および重鎖をまた、Ｎ末端タンパク質配列決定分析のために収集した。

【0231】

抗ＮＧＦ＃１６７（４Ｄ４）抗体のサンプルの軽鎖および重鎖の両方のＮ末端配列が、抗ＮＧＦ＃１１９（４Ｄ４）抗体のサンプルの両方のＮ末端配列にマッチした。さらに、抗体の測定された質量によって、＃１６７および＃１１９ハイブリドーマからの単離された抗体が同じであったことが示された。抗ＮＧＦ＃１６７の軽鎖の測定された逆重畳質量（２３０９６）は、抗ＮＧＦ Ａｂ＃１１９の軽鎖の測定された質量（２３０９６）にマッチした。

【0232】

（抗ＮＧＦ抗体重鎖および軽鎖のクローニング）
最も強力なＮＧＦ結合モノクローナル抗体４Ｄ４．Ｄ７を発現するハイブリドーマを供給源として用い、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡを単離した。第一鎖のｃＤＮＡを、伸長アダプター（５’−ＧＧＣ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＡＮ ＮＮＮ ＮＮＴ−３’）（配列番号３３）とともにランダムプライマーを用いて合成し、そして５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）分取アッセイを、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ^ＴＭＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従って行った。完全な軽鎖コードｃＤＮＡを調製するために、フォワードプライマーは、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ^ＴＭネスト化プライマーであって、リバースプライマーは５’−ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＧＧ−３’（配列番号３４）であった。重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを調製するために、フォワードプライマーはＧｅｎｅＲａｃｅｒ^ＴＭネスト化プライマーであって、リバースプライマーは５’−ＴＧＡ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＧＡ ＣＣＡ ＣＡＣ Ｇ−３’（配列番号３５）であった。ＲＡＣＥ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、その配列を決定した。コンセンサス配列を用いて全長抗体鎖ＰＣＲ増幅のプライマーを設計した。

【0233】

抗ＮＧＦ４Ｄ４．Ｄ７κ軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、５’ＰＣＲプライマーは、シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限酵素部位、および最適化Ｋｏｚａｋ配列（５’−ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＧ−３’；配列番号３６）をコードした。３’プライマーは、カルボキシ末端および終止コドン、ならびにＳａｌＩ制限部位（５’−ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ Ｃ−３’；配列番号３７）をコードした。得られたＰＣＲ産物のフラグメントを精製して、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、次いでゲル単離して、哺乳動物発現ベクターｐＤＳＲα２０に連結した（任意の目的のために参考として本明細書に援用される国際出願公開番号ＷＯ９０／１４３６３を参照のこと）。ｐＤＳＲα２０は、部位指向性変異誘発によって、ｐＤＳＲａ１９において「Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ（グアノシン）」から「Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（アデノシン）」へヌクレオチド２５６３を変化することによって産生した。

【0234】

抗ＮＧＦ ４Ｄ４．Ｄ７重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するため、５’ＰＣＲプライマーは、シグナル配列のアミノ末端、ＸｂａＩ制限酵素部位、および最適化Ｋｏｚａｋ配列（５’−ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＣＴ ＴＧＴ Ｔ−３’；配列番号３８）をコードした。３’プライマーは、カルボキシル末端および末端コドン、ならびにＳａｌＩ制限部位（５’−ＧＣＡ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＴＴ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＧＡ Ｇ−３’；配列番号３９）をコードした。得られた産物を精製して、ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、ゲル単離して、ｐＤＳＲα２０ベクターに連結した。

【0235】

抗ＮＧＦ Ａｂ ４Ｄ４クローンの軽鎖のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を予測されるアミノ酸に翻訳すること、およびそのアミノ酸の分子量を計算することによって決定される、算出された質量（２３０９９）は、質量分析によって決定される測定された質量にマッチした。抗ＮＧＦ Ａｂ＃１６７の重鎖の測定された逆重畳質量（４９４７９）は、装置偏差内で、抗ＮＧＦ Ａｂ＃１１９の重鎖の測定された質量（４９４８４）にマッチし、そしてまた抗ＮＧＦ Ａｂ ４Ｄ４クローンの重鎖のＤＮＡ配列の理論的質量（４９４８４）にマッチした（表３）。

【0236】

Ｎ末端タンパク質配列およびＬＣ／ＭＳのデータによって、ハイブリドーマ＃１１９がハイブリドーマ＃１６７と同じ抗体を発現したことが確認された。さらに配列に基づく抗体の算出された質量によってさらにこの観察が確認された。

【0237】

【表3】

（実施例４）
（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における抗ＮＧＦ抗体の発現）
リン酸カルシウム法を用いて、４Ｄ４−重鎖／ｐＤＳＲα１９ ＩｇＧ２または４Ｄ４重鎖／ｐＤＳＲα１９ ＩｇＧ１およびＮＧＦ−κ／ｐＤＳＲα１９プラスミドを、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ−）無血清適合チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に同時トランスフェクションすることによって、４Ｄ４抗ＮＧＦ ｍＡｂの安定な発現を得た。トランスフェクトされた細胞を、透析血清を含むが、ヒポキサンチン−チミジンを含まない培地中で選択して、ＤＨＦＲ酵素を発現する細胞の増殖を確保した。トランスフェクトされたクローンをＥＬＩＳＡのようなアッセイを用いてスクリーニングして、馴化培地中で４Ｄ４抗ＮＧＦ ｍＡｂの発現を検出した。最高の発現クローンを、ＤＨＦＲ増幅のためのメトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度増大に供した。ＭＴＸ増幅したクローンをＥＬＩＳＡのようなアッセイを用いてスクリーニングして、馴化培地中で４Ｄ４抗ＮＧＦ ｍＡｂのさらに高い発現を検出した。最高の発現クローンをサブクローニングに供して、相同な集団および細胞バンクの作成を行った。

【0238】

本発明の組み換え抗ＮＧＦ抗体は、抗ＮＧＦモノクローナル抗体について上記したプロトコルと同じプロトコルを用いて、ＤＨＦＲの欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞において生成してもよい。本発明の各々の抗ＮＧＦ抗体の完全重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングする。ＣＨＯｄ−細胞を、適切な抗ＮＧＦ抗体の完全重鎖を発現できる発現ベクターおよび完全軽鎖を発現できる発現ベクターを用いて、同時トランスフェクトする。例えば、抗ＮＧＦ抗体を生成するために、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む完全重鎖を発現できるベクターおよび配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含む完全軽鎖を発現できるベクターを用いて、細胞を同時トランスフェクトする。表４は、種々のＩｇＧ重鎖定常領域を有する４Ｄ４抗体についての完全重鎖および完全軽鎖をまとめる。

【0239】

【表4】

（実施例５）
（抗ＮＧＦ ４Ｄ４抗体の活性の特徴付け）
スピナー（Ｓ）またはローラー（Ｒ）条件下で増殖した細胞で生成した、一過性に発現された抗ＮＧＦ ４Ｄ４抗体を、上記（実施例３）のように行われる、ＤＲＧニューロンベースのＮＧＦ中和バイオアッセイにおいて、それらの抗体がＮＧＦを中和する能力を確認するために試験した。

【0240】

ＮＧＦ抗体は、２９３Ｔ細胞に適合した無血清懸濁液中で一過性に発現された。トランスフェクションを５００ｍＬまたは１Ｌの培養物のいずれかとして行った。要するに、細胞接種物（５．０×１０^５細胞／ｍＬ×培養容積）を２，５００ＲＰＭで、１０分間４℃で遠心分離して、馴化培地を除いた。細胞は、無血清ＤＭＥＭ中で再懸濁して、再度２，５００ＲＰＭで、１０分間４℃で遠心分離した。洗浄溶液を吸引した後、１Ｌまたは３Ｌのスピナーフラスコ培養物において、細胞を増殖培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１）＋１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム補充＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．０１％ プルロニック Ｆ６８］中で再懸濁した。スピナーフラスコ培養物を、３７℃および５％ＣＯ_２で維持される湿潤インキュベーターに入れた１２５ＲＰＭの磁気撹拌プレート上で維持した。プラスミドＤＮＡを５０ｍＬ円錐管中のトランスフェクション試薬に複合化させた。ＤＮＡ−トランスフェクション試薬複合物を無血清のＤＭＥＭ中で最終培養容積の５％に調製した。培養物１ｍＬあたり１μｇのプラスミドＤＮＡを最初に無血清ＤＭＥＭに添加して、続いて培養物１ｍＬあたり１μＬのＸ−ＴｒｅｍｅＧｅｎｅ ＲＯ−１５３９を添加した。この複合物を室温で約３０分間インキュベートし、次いでスピナーフラスコ中の細胞に添加した。トランスフェクション／発現は、７日間で行い、その後、この馴化培地を４℃で６０分間の４，０００ＲＰＭでの遠心分離によって回収した。

【0241】

ローラーボトル一過性トランスフェクションのために、本発明者らは、２９３Ｔ接着細胞を増殖させて、５％ＦＢＳ＋１×非必須アミノ酸＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔ＋１×ピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ中で維持した。約４〜５×１０^７個の２９３Ｔ細胞を、８５０ｃｍ^２のローラーボトル中で一晩、播種した。次いで、前に播種した細胞を、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を用いて翌日トランスフェクトした。ＤＮＡ−トランスフェクション試薬混合物を、約６．７５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で適切に調製した。６７５μＬ ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬を最初に添加して、続いて１１２．５μｇのプラスミドＤＮＡを添加した。この複合物を室温で３０分間インキュベートした。次いで混合物全体をローラーボトル中に添加した。このローラーボトルを５％ＣＯ_２ガス混合物で満たし、緊密にキャップして、０．３５ＲＰＭで回転するローラーラック上の３７℃のインキュベーターにおいた。トランスフェクションを２４時間行い、その後に培地を１００ｍＬ ＤＭＥＭ＋１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム補充＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕ＋１×非必須アミノ酸＋１×ピルビン酸ナトリウムで置換した。代表的には、２つの１００ｍＬ ４８時間ハーベストを各々のローラーボトルから得た。この回収された無血清馴化培地を一緒にプールして、４，０００ＲＰＭで３０分間４℃で遠心分離した。

【0242】

４Ｄ４．ＩｇＧ１および４Ｄ４．ＩｇＧ２の両方が、ヒトＮＧＦに対して約０．１４ｎＭ〜約０．２ｎＭというＩＣ_５０値を有する強力な活性を示した（図２）。活性アッセイの結果は表５にまとめる。この抗体は、ラットＮＧＦに対してほとんど活性を示さなかった（図３）。この結果は、上記のハイブリドーマから直接試験された抗体の活性と似ている。

【0243】

【表5】

ｈＮＧＦ＝ヒトＮＧＦ、ｒＮＧＦ＝ラットＮＧＦ、Ｒ＝ローラー培養、Ｓ＝スピナー培養。

【0244】

（実施例６）
（抗ＮＧＦ抗体の産生）
ＣＨＯ細胞のクローン株における発現によって抗ＮＧＦ抗体を産生する。各々の産生を行うために、単一のバイアル由来の細胞を無血清細胞培養培地中に溶かした。この細胞をＴフラスコ中で最初に、続いてスピナーフラスコ中で増殖させて、次いで２０００Ｌのバイオリアクターまで大規模化するステンレス鋼リアクター中で増殖させた。流加培養法を用いて２０００Ｌのバイオリアクター中で産生を行い、この中に、濃縮された媒体成分を含む栄養源を加えて、細胞の増殖および培養生存度を維持する。産生は約２週間続き、この間に上記細胞によって抗ＮＧＦ抗体を構成的に産生して、細胞培養培地に分泌させた。

【0245】

産生リアクターを予め決定したｐＨ、温度および溶存酸素レベルで制御する：ｐＨは二酸化炭素ガスおよび炭酸ナトリウムの添加によって制御する；溶存酸素は、空気、窒素および酸素のガスフローによって制御する。

【0246】

産生の終わりに、細胞ブロスをディスクスタック遠心分離に供して、培養上清を細胞から分離する。さらにこの濃縮物をデプスフィルター、続いて０．２μｍのフィルターを通して清澄化する。次いで、清澄化した馴化培地を接線流の限外濾過によって濃縮する。馴化培地を１５〜３０倍に濃縮する。次いで、得られた濃縮された馴化培地を、精製によって処理するか、または後日精製するために凍結する。

【0247】

（実施例７）
（他のニューロトロフィンとの交差反応性）
ヒトＮＴ３についてのＤＲＧニューロン生存アッセイ、およびヒトＢＤＮＦについての培養されたＤＡニューロンにおけるＤＡ取り込みのアッセイを含む種々のバイオアッセイにおいて、４Ｄ４抗体を、ヒトＮＴ３またはヒトＢＤＮＦに対するその交差反応性について試験した。

【0248】

（ＮＴ３、抗ＮＴ３および抗ＮＧＦ抗体でのＤＲＧ培養物の治療）
プレートの２時間後、ＤＲＧ細胞（実施例３において上記された単離手順）を、組み換えｈＮＴ−３ １００ｎｇ／ｍＬ（３．８ｎＭ）で処理した。連続希釈した抗ｈＮＴ３抗体（Ｒ＆Ｄ）を陽性コントロールとして用いた。未知（抗ＮＧＦ Ａｂサンプル）を、１０ポイントの３．１６倍連続希釈で種々の濃度で添加した。全てのサンプルを完全培地中で希釈して、その後に培養物に添加した。

【0249】

（ＤＲＧニューロンにおけるＭＡＰ２の測定）
培養物を４％パラホルムアルデヒドを含むハンクス平衡塩溶液を用いて１５分間固定して、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて１時間ブロックし、０．２５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）を用いて１時間室温（ＲＴ）で透過化処理した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＢＳで培養物を１回リンスして、マウス抗ＭＡＰ２
ＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）とともに１．５時間室温でインキュベートし、続いてＥｕ標識した抗マウス二次抗体（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳでの洗浄（おだやかに振盪しながら３×５分）を各々の抗体インキュベーション後に行った。強化溶液（１５０ｍＬ／ウェル、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）を培養物に添加して、次いで蛍光シグナルを時間分解蛍光光度計で測定した（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）。

【0250】

（胚性中脳培養）
胚性の１９日齢（Ｅ１９）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を用いた。ドーパミン作動性ニューロンについて富化された腹側中脳組織を取り出して、Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含まない、冷却したダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）に移した。組織フラグメントは、パパイン解離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を用いて単独の細胞懸濁液中に解離させた。要するに、組織フラグメントを、アールの平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）中に２０単位／ｍＬのパパインを含有する消化溶液中において３７℃で５０分間インキュベートした。ＭＥＭ／ハムＦ１２、１：１、１ｍｇ／ｍＬオボムコイドインヒビターおよび１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン、および０．００５％デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）から構成される解離培地中で、微細研磨したパスツールピペットを通した倍散によって細胞を解離させた。解離された細胞を５分間２００×ｇでペレット化して、１ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンおよび０．００５％ＤＮａｓｅを含有するＥＢＳＳ中に再懸濁した。細胞懸濁液は、１０ｍｇ／ｍＬのオボムコイドインヒビター、１０ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンを含有する勾配溶液を通じて２００×ｇで６分間遠心分離して、細胞細片を除去し；２５μｇＮｉｔｅｘナイロンメッシュ（Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．）を通じて濾過して、クランプを除去した。この解離された細胞を、１００，０００／ｃｍ^２の密度で組織培養プレートにプレートした。このプレートは、前に記載のとおり（Ｌｏｕｉｓ ＪＣら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９２；２６２：１２７４〜１２８３）、ポリ−オルニチン１００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）およびマウスラミニン１μｇ／ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で事前にコーティングした。この培養培地は、最小基本培地（ＭＥＭ）／ハムのＦ１２、１：１、１２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬトランスフェリンおよび２．５μｇ／ｍＬのインスリン（Ｓｉｇｍａ）から構成された。この培養物を、３７℃、５％ＣＯ_２および１００％の湿度で６日間保持した。

【0251】

（ＢＤＮＦおよび抗ＢＤＮＦまたは抗ＮＧＦでの中脳培養物の治療）
プレートの２時間後、ＢＤＮＦを１０ｎｇ／ｍＬで細胞に添加し、続いて連続濃度の抗ＮＧＦ Ａｂサンプルを添加した。抗ＢＤＮＦ抗体（Ａｍｇｅｎで生成）を陽性コントロールとして用いた。

【0252】

（中脳ニューロンにおけるＤＡ取り込み）
前に記載されたとおり（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｌ．およびＭｙｔｉｌｉｎｅｏｕ，Ｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８７；７９：６５〜７２）、ドーパミン取り込みアッセイを行った。６日の時点で、５．６ｍＭグルコース、１．３ｍＭ ＥＤＴＡおよびモノアミンオキシダーゼインヒビターである０．５ｍＭパージリンを含む、予め温めたクレブス−リンゲルリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて培養物を１回洗浄した。この培養物を５０ｎＭ［^３Ｈ］ＤＡ（ＮＥＮ）を含む取り込み緩衝液中において６０分間３７℃でインキュベートした。取り込み緩衝液を除去することによって取り込みを停止させて、培養物をクレブス−リンゲルリン酸緩衝液を用いて３回洗浄した。細胞を溶解して、この培養物に直接、液体シンチレーションカクテル、オプチクファーゼ・スーパーミックス（ｏｐｔｉｃｐｈａｓｅ ｓｕｐｅｒｍｉｘ）（Ｗａｌｌａｃ）を添加することによって、［^３Ｈ］ＤＡを放出させた。次いで、この細胞溶解物を、マイクロベータ−プラス液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｉｎｃ．）中で放射活性についてカウントした。取り込み緩衝液に対して、高親和性のＤＡ取り込み部位の特異的なインヒビターである（Ｈｅｉｋｋｉｌａ ＲＥおよびＭａｚｉｎｏ Ｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９８４；１０３：２４１〜８）０．５ｍＭ ＧＢＲ１２９０９を添加することによって低親和性のＤＡ取り込みを評価して、総取り込み量から引いて高親和性ＤＡ取り込み値を得た。

【0253】

【表6】

（実施例８）
（抗ＮＧＦ抗体のエピトープの同定）
（限定タンパク質分解によるエピトープマッピング）
５マイクログラム（μｇ）のＮＧＦを４Ｄ４（１１μｇ）とともに、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５中で３０分間、４℃でインキュベートした。次いで、この複合体をプロテアーゼ（サブチリシン）１μｇを用いて３７℃で１時間および２時間消化した。４Ｄ４抗体によって保護されたペプチドを見出すために、ＨＰＬＣペプチドマップピングを互いに比較した。ＮＧＦの限定タンパク質分解によって、いくつかの主要なペプチドが最初にＮＧＦから放出されたことが示された。なかでも特に重要なペプチドＳ１８．３、Ｓ１８．５およびＳ３４．４が生成されて、タンパク質分解から抗体で保護された。他のピークは有意に形成も保護もされなかった。２つの実験由来の保護されたペプチド（１時間および２時間の消化）は、表７に示す。

【0254】

【表7】

保護のパーセンテージは、ペプチドピーク高さから算出した。Ｓ１８．５は、２つのペプチドを含んだが、１つのペプチド（ＳＳＳＨＰＩＦＨＲ；配列番号４６）だけが、４Ｄ４抗体で保護された。なぜなら他のペプチドピーク（ＨＷＮＳＹ；配列番号４７）は、２８０ｎｍの吸収で検出されるとおり、４Ｄ４抗体の添加によって変化されなかったためである。ペプチドＳ１８．３は、両方とも同じループ領域由来の、Ｓ３４．４のＣ末端部分であった。Ｎ末端および中央のループ領域もまた可能なエピトープであった。

【0255】

（消化されたペプチドのＭｉｃｒｏｃｏｎ分離）
サブチリシン消化物質（各々３μｇ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で、活性の４Ｄ４抗体および不活性なモノクローナル抗体（＃１６２）（８μｇ）とともに３０分間４℃でインキュベートした。結合／未結合のペプチドをＭｉｃｒｏｃｏｎ １０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）によって分離して、両方の画分（結合および未結合）をＨＰＬＣによって分析して、抗体に結合したペプチドを見出した。４Ｄ４抗体および＃１６２で処理した後の未結合の画分のＨＰＬＣ比較によって２つの枯渇したピークを同定して、抗体結合ペプチドを示す、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ分離物を回収した。４Ｄ４結合ペプチドは以下であった：
Ｓ１（４．４）−−−−ＳＲＫＡＶＲＲ（１１３〜１１９）（配列番号４９）、Ｃ末端；および
Ｓ２（２８．３）−−−−ＥＶＭＶＬ（３５〜３９）（配列番号５０）、ループ領域。

【0256】

ＮＧＦサンプルを、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｋ）を用いて２４時間代替的に消化した。システイン残基を変性剤を用いずに還元して、カルボキシメチル化した。サンプルをモノクローナル抗体４Ｄ４およびＡＭＧ１６２とともにインキュベートし、続いてＭｉｃｒｏｃｏｎ １００で分離した。結合および未結合の画分を逆相ＨＰＬＣによって分析した。２つのペプチドのみが、以下に示されるように抗体結合Ｋペプチドとして同定された。ペプチドの配列分析および質量分析によって決定した、ペプチドの算出された質量は一貫していた。以下に示されるとおり、ペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端領域にマッピングした。

【0257】

Ｋ１（３７．６）−−−−ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫ（配列番号５１）
算出された質量＝２８２１；観察された質量＝２８２８．２；Ｎ末端
Ｋ２（３９．５）−−−−ＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫ（配列番号５２）
算出された質量＝２４５２；観察された質量＝２４５９．５；Ｃ末端
先行するエピトープマッピング実験によって、少なくとも３つの領域が、Ｎ末端（１−９）、内部（４６−５７）およびＣ末端（９６−９８）領域を含む、４Ｄ４抗体についての可能性のあるエピトープであることが示された。さらに、Ａｓｐ消化によって、−−−ＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣ−−−（配列番号５３）から構成されるペプチドフラグメントが４Ｄ４抗体によって保護されることが明らかになり、一方、トリプシン消化によっては、−−−ＳＳＨＰＩＦＨＲ−−−（配列番号５４）から構成されるペプチドフラグメントが４Ｄ４抗体によって保護されないことが示された。このように、Ｎ末端では、ＧＥＦＳＶＣ（配列番号５５）の配列は、４Ｄ４抗体への結合について最も重要である。

【0258】

抗ＮＧＦ抗体４Ｄ４．ＩｇＧ１についてのエピトープをさらに明確に規定するために、ヒト成熟ＮＧＦ（ｈＮＧＦ）配列全体に基づき標準的な技術を用いて、全部で２３個のペプチドを合成的に生成した（表８）。このペプチドは、１０アミノ酸ずつ重複する１５アミノ酸長であって、マトリックスへの結合を可能にするようにＣ末端にシステインテールがあった。上記のヒト抗ｈＮＧＦ Ａｂ ４Ｄ４．ＩｇＧ１を、マッピング実験のために用いた。

【0259】

【表8】

ヒトＮＧＦペプチドフラグメントを、５％ＤＭＳＯ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．２３を有するＰＢＳ中で希釈した。最終ペプチド濃度は、５５μＭ（約１００μｇ／ｍＬ）の同じモル濃度に正規化した。ペプチドを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ活性化９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号１５１５０）中で、１００μＬ／ウェルで、室温で２時間インキュベートし、次いで４℃で一晩撹拌した。ヒトＮＧＦ（１００μｇ／ｍＬ）を陽性コントロールとして用いた。このプレートを、洗浄緩衝液（ＫＰＬ）で洗浄して、０．２％脱脂粉乳（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ６．２３）を用いて室温で２時間ブロックし、次いでさらに５％ ＢＳＡを用いて１時間ブロックした。次いで、プレートを、種々の濃度（０、３、１０、３０μｇ／ｍＬ）のヒト抗ＮＧＦ抗体とともにインキュベートし、その後にヤギ抗ｈＦｃ Ａｂ−ＨＲＰ（ＫＰＬ）とともに２時間インキュベートした。シグナルをＴＭＢ基質で発色させて、停止溶液（ＫＰＬ）の添加後に４５０ｎｍで読み取った。

【0260】

２３個のヒトＮＧＦペプチドにまたがって、４Ｄ４結合を示す、少なくとも４つの主なピークが観察された。これらのピークは、以下のペプチドに相当した：ペプチド番号１（配列番号５６）、ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣ（１〜１５）；ペプチド番号１０（配列番号６５）、ＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＡＲＤ（４０〜６０）；ペプチド番号１６〜１７（配列番号７１〜配列番号７２）、ＷＮＳＹＡＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬ−−−（７６〜９５）；およびペプチド番号１８〜２１（配列番号７３〜配列番号７６）、ＴＴＴＨＴ−−−ＬＳＲＫＣ（１００〜１１５）。

【0261】

４Ｄ４の４つの結合ピークは、Ｗｅｉｓｍａｎｎら（１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：１８４〜８）に記載されるとおり、Ｎ末端、Ｃ末端、内部ドメイン、ならびにＮＧＦ中のループＬ２およびＬ４にマッピングした。これらの結果を表９にまとめる。

【0262】

【表9】

Ｗｉｅｓｍａｎｎらは、ｔｒｋＡレセプターに結合したｈＮＧＦの結晶構造を解明したが、これによってＮ末端（残基２〜９）がレセプター結合に重要であったことが示される（Ｗｉｅｓｍａｎｎら，１９９９、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：１８４〜８）。ＮＧＦ中のこのセグメントの残基はまた、ｔｒｋＢレセプターまたはｔｒｋＣレセプターよりもｔｒｋＡについての親和性に重要である。抗体４Ｄ４は、最も可能性が高い理由として、ヒトＮＧＦと他のニューロトロフィンとの間のＮ末端相違の理由で、マウス／ラットＮＧＦ、ならびにＢＤＮＦおよびＮＴ−３よりもヒトＮＧＦに選択性である。

【0263】

抗体４Ｄ４は、ニューロトロフィンの間の平均の配列多様性よりも高い配列多様性を有する７つの別個の領域のうちの２つに相当する、それぞれループＬ２およびＬ４に相当する、ペプチド番号１０（配列番号６５）（ＮＳＶＦＫ−−−、４６〜６０）およびペプチド番号１７（配列番号７２）（ＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＣ、８１〜９５）に結合する。これらの７つの領域のうちのＮＧＦとＢＤＮＦとの間のスワッピング実験によって、Ｌ２およびＬ４は、ＮＧＦの生物学的活性について重要であったことが示された。さらに、ＮＧＦの残基を有するループＬ２およびＬ４における５つのＮＴ３残基の置換によって、ＮＴ３活性を維持したままで、ＮＧＦ様活性が誘導された。従って、Ｌ２およびＬ４は同様に、抗体４Ｄ４がＢＤＮＦまたはＮＴ−３に対してではなくＮＧＦに選択的に結合する領域である。

【0264】

抗体４Ｄ４はまた、ＮＧＦ結晶構造の内部ドメインにマッチする、ペプチド番号１６（配列番号７１）（ＷＮＳＹＡＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬ、７６〜９０）に結合する。この領域は、ヒトＮＧＦとマウスＮＧＦとの間で１００％相同であるが、他のニューロトロフィンとは異なる。４Ｄ４は、ラット／マウスＮＧＦに対しては、ヒトＮＧＦに対するその活性と比較した場合、かなり弱い活性を示した。従って、ＮＧＦのこの部分への結合は、種特異性については最も重要ではないようであるが、ニューロトロフィンのなかで選択性について最も重要である。

【0265】

抗体４Ｄ４はまた、他のニューロトロフィン（ＢＤＮＦおよびＮＴ３）からＮＧＦを識別するヒトＮＧＦの領域の１つである、ＮＧＦのＣ末端領域（ペプチド番号１９〜２１（配列番号７４−配列番号７６）ＴＭＤＧ−−−ＬＳＲＫＣ、９１〜１１５）に結合する。この領域への結合によって、４Ｄ４が他のニューロトロフィンに対して活性でない理由を説明することが助けられる。さらに、Ｃ末端ではヒトＮＧＦとマウスＮＧＦとの間に単独のアミノ酸の相違があり、これによって、４Ｄ４が、種相違が観察されるＮ末端と同様に、ラット／マウスＮＧＦよりもヒトＮＧＦについて選択性である理由の１つがこの単独のアミノ酸であり得ることが示唆される。

【0266】

最後に、４Ｄ４はまた、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣではなくｔｒｋＡへのＮＧＦ結合の優先性について重要な領域である、ヒトＮＧＦのペプチド番号１０（配列番号６５）（−−−ＫＡＲＤＣ、５０〜６０）によって記載される内部ドメインとも相互作用し、このことはヒトＮＧＦに対するその選択性の中和活性をさらに説明する。

【0267】

（実施例９）
（ＫｉｎＥｘＡによるモノクローナル抗体の親和性測定）
ｈｕＮＧＦ（２９７１４−９１）へのＡｂ ４Ｄ４（３８８５９−８０）の結合を、ＫｉｎＥｘＡにおいて試験した。要するに、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ ６×（Ｐｉｅｒｃｅ）をｈｕＮＧＦで事前コーティングして、ＢＳＡでブロックした。１０ｐＭおよび３０ｐのＡｂ ４Ｄ４サンプルＭを、種々の濃度のｈｕＮＧＦ（Ａｍｇｅｎ）とともに室温で８時間インキュベートして、その後にｈｕＮＧＦでコートしたビーズを通して流した。ビーズ結合した抗体の量を、蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって定量した。結合シグナルは、平衡状態で、遊離の抗体の濃度に対して比例した。解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）は、二重曲線一部位相同性結合モデル（ｄｕａｌ−ｃｕｒｖｅ ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＫｉｎＥｘ^ＴＭソフトウェア）を用いて競合曲線の非直線回帰から得られた。Ｋ_ＤはｈｕＮＧＦに対するＡｂ ４Ｄ４結合について約４ｐＭであった。

【0268】

（実施例１０）
（さらなる抗ＮＧＦ抗体の同定）
上記の実施例２および３に記載されるように生成かつ同定された、さらなる抗ＮＧＦ抗体（１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２，１４Ｆ１１および４Ｇ６と命名）をさらなる研究のために選択した。要するに、結合活性について馴化培地を試験した。培地由来の抗体を精製して配列決定した。予想される質量を、馴化培地由来の抗体の質量分析データと比較した。この抗体をクローニングした。クローンのうちの２つはＣＨＯ細胞で発現され、上記のように活性について試験した。この結果を表１０に示す。

【0269】

【表10】

次いで、これらの抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列を４Ｄ４抗体配列と比較し、そして互いと比較した（図５および６）。これらの比較から同定された重鎖可変領域の相同性パーセントを表１１に示す。軽鎖可変領域の相同性パーセントを表１２に示す。さらに、種々の抗体のＣＤＲ領域の相同性パーセントを図５〜１０に示す。

【0270】

【表11】

【0271】

【表12】

前述の開示は本発明の特定の実施例を包含すること、そしてその全ての改変または代替の等価物が、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の趣旨および範囲内であることが理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]