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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5967448
(24)【登録日】2016年7月15日
(45)【発行日】2016年8月10日
(54)【発明の名称】２型ＴＮＦ受容体の発現を誘導する合成ペプチド及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20160728BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20160728BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20160728BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20160728BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20160728BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
C12N5/079
A61P9/10 103
A61P9/14ZNA
A61K37/02
【請求項の数】4
【全頁数】20
(21)【出願番号】特願2013-513074(P2013-513074)
(86)(22)【出願日】2012年4月17日
(86)【国際出願番号】JP2012060369
(87)【国際公開番号】WO2012150676
(87)【国際公開日】20121108
【審査請求日】2015年2月13日
(31)【優先権主張番号】特願2011-103282(P2011-103282)
(32)【優先日】2011年5月2日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003034
【氏名又は名称】東亞合成株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100117606
【弁理士】
【氏名又は名称】安部 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100136423
【弁理士】
【氏名又は名称】大井 道子
(72)【発明者】
【氏名】小林 菜穂子
(72)【発明者】
【氏名】吉田 徹彦
(72)【発明者】
【氏名】丹羽 幹夫
【審査官】
太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００８／０８１８１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第０９／０９３６９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
ABU-AMER, Y., et al.，Tumor Necrosis Factor Receptors Types 1 and 2 Differentially Regulate Osteoclastogenesis，The Journal of Biological Chemistry，２０００年 ９月 １日，Vol. 275, No. 35，pp. 27307-27310
【文献】
菅野洋，他，合成ペプチドの細胞内導入による幹細胞の効率的な神経分化とその再生医療への応用，横浜医学，２００９年 ５月３０日，第６０巻第１・２号，第１１１−１１５頁
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
ＣｉＮｉｉ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１）及び２型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）のうち２型ＴＮＦ受容体を選択的に発現した細胞を作製する方法であって、
少なくとも１種の免疫系細胞又は神経系細胞において２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞を培養する工程と、
配列番号１〜５１のうちのいずれかの配列番号で示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを前記細胞に供給することによって、該細胞における２型ＴＮＦ受容体発現量を増大させる工程と、
を包含する、作製方法。
少なくとも１種の免疫系細胞又は神経系細胞において２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞を培養する工程と、
配列番号１〜５１のうちのいずれかの配列番号で示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを前記細胞に供給することによって、該細胞における２型ＴＮＦ受容体発現量を増大させる工程と、
を包含する、作製方法。
【請求項2】
前記免疫系細胞が胸腺細胞である、請求項１に記載の作製方法。
【請求項3】
前記神経系細胞が神経芽細胞である、請求項１に記載の作製方法。
【請求項4】
少なくとも１種の２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞に供給して該細胞における２型ＴＮＦ受容体発現量を増大させるための組成物であって、
配列番号１〜５１のうちのいずれかの配列番号で示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、
薬学的に許容可能な担体と、
を含む、２型ＴＮＦ受容体発現誘導用組成物。
配列番号１〜５１のうちのいずれかの配列番号で示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、
薬学的に許容可能な担体と、
を含む、２型ＴＮＦ受容体発現誘導用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、所定の細胞に対して２型ＴＮＦ受容体を選択的に発現させ得る合成ペプチドとその利用に関する。特に該ペプチドを有効成分とする２型ＴＮＦ受容体発現誘導用組成物、ならびに該ペプチドを使用して２型ＴＮＦ受容体を選択的に発現した細胞を作製する方法に関する。なお、本出願は２０１１年５月２日に出願された日本国特許出願２０１１−１０３２８２号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【0002】
一般にＴＮＦ（典型的にはＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（ＬＴ−α）、ＬＴ−βの３種）と呼称される腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor）は、主として免疫系細胞において産生されるサイトカインである。その代表的存在であるＴＮＦ−αは、主としてマクロファージにおいて産生され、微小な血栓の形成やアポトーシスの誘導等、種々の生理作用を示す。また、ＴＮＦ−αの産生量（発現）が過剰になると関節リウマチ等の疾病を招くことも知られている。これらに限られず、ＴＮＦ−αの生理的作用は生体の恒常性維持に深く関わっている。従って、ＴＮＦ−α産生量の向上若しくは抑制は、生体に種々の影響を与え得る。例えばＴＮＦ−αは、インターロイキン１（ＩＬ−１）やインターフェロンγ（ＩＦＮγ）と同じく、それ単独でインスリンの分泌を抑制し得ることに加えて、これら生理活性物質の組み合わせにより膵β細胞に傷害性を示すことが知られており、１型糖尿病におけるβ細胞破壊に関与すると考えられている。また、ＴＮＦ−αの高産生と関連づけられるＴＮＦ遺伝子多型が１型糖尿病に関与しているとの報告もある。また、２型糖尿病（インスリン抵抗性糖尿病）の発生にもＴＮＦ−αの関与が考えられている。例えば、肥満細胞におけるＴＮＦ−αの発現とインスリン抵抗性との関係が論じられている（非特許文献５）。また、抗ＴＮＦ抗体を投与してＴＮＦ−αを中和することによりインスリン抵抗性を改善させ得ることや、ＴＮＦ受容体欠損肥満マウスやＴＮＦ欠損肥満マウスではインスリン抵抗性の程度が軽度であったこと等も報告されており、ＴＮＦ（典型的にはＴＮＦ−α）がインスリン抵抗性の発現やその程度に重要な役割の一部を担っていると考えられる。
【0003】
ところで、ＴＮＦ−αが結合する受容体として、分子量が約５５ｋＤａの１型ＴＮＦ受容体（Tumor Necrosis Factor Receptor 1、以下「ＴＮＦＲ１」ともいう。）、及び、分子量が約７５ｋＤａの２型ＴＮＦ受容体（Tumor Necrosis Factor Receptor 2、以下「ＴＮＦＲ２」ともいう。）が知られている（例えば非特許文献１）。これらのうち、デスドメイン（death domain）と呼ばれる領域が存在するＴＮＦＲ１は生体を構成する各種の細胞において遍在的に発現しているのに対し、デスドメインを有しないＴＮＦＲ２は何らかの刺激によって主として免疫系細胞において著しい発現がみられる誘導性の受容体である（例えば非特許文献２）。上記２種の受容体のいずれに結合するかによってＴＮＦ−αが誘起する生理作用が異なることが知られている。例えばＴＮＦ−αのＴＮＦＲ１への結合は、カスパーゼの活性化を起こし、複数のカスパーゼが関与するシグナル伝達経路を介しての細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（The American Journal of Pathology）、１６９巻（５号）、２００６年、ｐｐ．１８８６−１８９８
【非特許文献2】ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー(Nature Reviews Drug Discovery)、９巻、２０１０年、ｐｐ．４８２−４９３
【非特許文献3】アルテリオスクレロシス・トロンボシス・バスキュラー・バイオロジー(Arteriosclerosis,Thrombosis, and Vascular Biology)、３０巻、２０１０年、ｐｐ．１３０７−１３１４
【非特許文献4】ジャーナル・オブ・セルバイオロジー(The Journal of Cell Biology)、１７８巻（５号）、２００７年、ｐｐ．８２９−８４１
【非特許文献5】ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション(The Journal of Clinical Investigation)、９５巻、１９９５年、ｐｐ．２４０９−２４１５
【非特許文献6】ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucleic Acids Research)、３８巻（２１号）、２０１０年、ｐｐ．７３８８−７３９９
【非特許文献7】ＥＭＢＯレポート(EMBO reports)、１０巻（３号）、２００９年、ｐｐ．２３１−２３８
【非特許文献8】プロスワン(PLoS ONE)、[online]、６巻（１１号）、２０１１年１１月、ｅ２７６２１、〈http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0027621〉
【発明の概要】
【0005】
ところで、ＴＮＦ（主としてＴＮＦ−α）がＴＮＦＲ１に結合した場合のシグナル伝達経路ならびに誘起される生理作用の解明に比べ、ＴＮＦがＴＮＦＲ２に結合した場合のシグナル伝達経路ならびに誘起される生理作用の解明は遅れていた。近年、この種の研究が活発になり、ＴＮＦが誘起する各種の生理作用に及ぼすＴＮＦＲ２の役割や機能が徐々に明らかになってきている。【0006】
例えば上記非特許文献３及び上述した非特許文献１には、内皮細胞にＴＮＦＲ２を高度かつ特異的に発現させることによって、血管新生（Angiogenesis）や動脈形成（血管拡張：Arteriogenesis）が促進されることが記載されている。即ち、ＴＮＦＲ２を所定の組織（又は細胞）において特異的に発現させたり或いは活性化させたりすることが、血管疾患（血管障害）〜例えば冠動脈疾患（障害）や末梢血管疾患（障害）〜の治療に有効であることを示している。また、上記非特許文献４には、ＴＮＦＲ１の遺伝子を欠失させたトランスジェニックマウスを用いた実験において、アミロイドβの生成が阻害され、脳中でのアミロイドβのプラーク形成が減少したことが記載されている。このことは、ＴＮＦＲ１の発現量を直接的に制御することと同様、所定の組織（又は細胞）においてＴＮＦＲ２の発現を特異的に増大させることにより、ＴＮＦ（主としてＴＮＦ−α）のＴＮＦＲ１への結合を競合的に阻むことができることを示すものであり、アルツハイマー病の治療や改善に貢献することが期待される。また、ＴＮＦ（主としてＴＮＦ−α）のＴＮＦＲ１への結合を競合的に阻むことにより、インスリン抵抗性の改善も期待される。
さらに、非特許文献８には、ヒトのドーパミン作動性神経細胞を用いた実験において、ＴＮＦＲ２を選択的に発現させることによって、毒物暴露後に細胞死から分化した神経細胞を回復させ得ることが示されている。即ち、ＴＮＦＲ２の選択的な活性化は、例えばパーキンソン病のような神経変性疾患（neurodegenerative diseases）の治療や改善に役立つことが期待される。
【0007】
そこで、本発明は、ＴＮＦＲ２の発現量（若しくは活性化）を制御（若しくは調節）することによって上述したような血管疾患やアルツハイマー病、パーキンソン病の治療若しくは改善に資する材料及び／又は手法、或いはまた、そのような疾病（障害）を改善させることを目標とした研究開発分野において利用可能な材料（典型的には試薬類）及び／又は手法を提供することを目的として創出された発明である。【0008】
上記の目的を実現するべく、本発明によると以下の構成の組成物が提供される。すなわち、ここで開示される組成物は、少なくとも１種の２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞に供給して該細胞における２型ＴＮＦ受容体の発現を増大させるための組成物であって、核局在シグナル配列（ＮＬＳ）若しくは核小体局在シグナル配列（ＮｏＬＳ）からなる合成ペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む、２型ＴＮＦ受容体発現誘導用組成物（以下「ＴＮＦＲ２発現誘導用組成物」ともいう。）である。ここで「２型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）を発現可能な細胞」とは、生体内（インビボ）若しくは生体外（インビトロ）において定常的若しくは一時的にＴＮＦＲ２の発現が確認される細胞をいう。例えば、ヒトその他の哺乳動物の免疫系細胞は、ここでいう２型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）、即ち上記デスドメインを有しないことによってＴＮＦＲ１とは明確に区別される約７５ｋＤａのＴＮＦ受容体を発現可能な細胞の典型例である。
【0009】
本発明者は、細胞内で生合成された後に核に輸送される種々のタンパク質が有している核移行のためのシグナル配列、即ち「核局在シグナル（Nuclear Localization Signal：ＮＬＳ）」、或いはさらに核内の核小体にタンパク質を移行（局在）させるためのシグナル配列、即ち「核小体局在シグナル（Nucleolar Localization Signal：ＮｏＬＳ）」を構成するアミノ酸配列からなる比較的鎖長の短い合成ペプチドを、潜在的にＴＮＦＲ２を発現可能な細胞（以下「ＴＮＦＲ２発現対象細胞」ともいう。）に供給することによって、当該細胞において飛躍的に２型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）の発現量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。【0010】
即ち、ここで開示される組成物の主成分である「ＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド」、具体的にはＮＬＳからなる合成ペプチド（以下、単に「ＮＬＳ合成ペプチド」ともいう。）若しくはＮｏＬＳからなる合成ペプチド（以下、単に「ＮｏＬＳ合成ペプチド」ともいう。）を、所定のＴＮＦＲ２発現対象細胞に供給する（例えば所定のＴＮＦＲ２発現対象細胞を培養中の培養液に本発明に係る組成物或いはペプチドを添加する。）ことによって、当該合成ペプチドが供給されたＴＮＦＲ２発現対象細胞においてＴＮＦＲ２の発現を促進させる或いはその発現量を増大させることができる。【0011】
従って、ここで開示される細胞作製方法によると、ＴＮＦＲ２の発現ならびに該受容体へのＴＮＦの結合が関与する種々の疾病や傷害（例えば、種々の血管疾患やアルツハイマー病、パーキンソン病）の治療若しくは改善に資することができる。また、ここで開示される細胞作製方法は、そのような疾病（障害）を改善させることを目標とした研究開発分野（例えば医学、薬学、遺伝学、生化学、生物学に関連する分野。以下同じ。）において好適に実施することができる。【0012】
ここで開示される組成物の好ましい一態様では、上記合成ペプチドとして、配列番号１〜５１のうちのいずれかの配列番号で示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを含む。配列番号１〜５１に示す各アミノ酸配列は、配列既知のＮＬＳ或いはＮｏＬＳ（但しＮｏＬＳとして機能する配列は典型的にはＮＬＳとしても機能し得る。）であり（例えば上記非特許文献６及び７参照）、ここで開示される組成物のＮＬＳ合成ペプチド或いはＮｏＬＳ合成ペプチドを構成するものとして好ましい。なお、上記いずれかの配列番号で示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドには、当該配列番号に記載されたとおりのアミノ酸配列（改変前配列）により構成される合成ペプチドの他、当該アミノ酸配列に部分的な改変が施された改変アミノ酸配列からなる合成ペプチドであって改変前配列と同様にＴＮＦＲ２発現誘導性を有する合成ペプチドが包含される。
【0013】
また、本発明は、上記の目的を実現するべく、１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１）及び２型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）のうち２型ＴＮＦ受容体を選択的に（即ち優先的に若しくは特異的に）発現した細胞を作製する方法を提供する。即ち、この方法は、少なくとも１種の２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞を培養する工程と、核局在シグナル配列（ＮＬＳ）若しくは核小体局在シグナル配列（ＮｏＬＳ）からなる合成ペプチドを上記細胞に供給することによって、該細胞における２型ＴＮＦ受容体発現量を増大させる工程と、を包含することを特徴とする。
【0014】
上記構成の細胞作製方法によると、培養中の目的とするＴＮＦＲ２発現対象細胞にＮＬＳ合成ペプチド或いはＮｏＬＳ合成ペプチドを供給するという簡易な処理によって当該細胞のＴＮＦＲ２発現量を選択的に（即ちＴＮＦＲ１と比較して優先的に若しくは特異的に）増大させることができる。従って、ここで開示される細胞作製方法によると、ＴＮＦＲ２ならびに該受容体へのＴＮＦの結合が関与する種々の疾病や傷害（例えば、種々の血管疾患やアルツハイマー病、パーキンソン病）の治療若しくは改善に資することができる。また、そのような疾病（障害）を改善させることを目標とした研究開発分野において利用可能な材料を提供することができる。【0015】
ここで開示される細胞作製方法の好ましい一態様では、上記２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞（ＴＮＦＲ２発現対象細胞）として、少なくとも１種の免疫系細胞を培養することを特徴とする。ＴＮＦＲ２が高発現している免疫系細胞（例えば胸腺細胞、即ち種々のリンパ球）を提供することにより、ＴＮＦ（典型的にはＴＮＦ−α）のＴＮＦＲ１への結合を一つのシグナルとする免疫疾患（例えば関節リウマチ等の自己免疫疾患）の治療や改善に資することができる。また、そのような免疫疾患（免疫障害）を改善させることを目標とした研究開発分野において利用可能な材料を提供することができる。
【0016】
ここで開示される細胞作製方法の好ましい一態様では、上記２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞（ＴＮＦＲ２発現対象細胞）として、少なくとも１種の神経系細胞を培養することを特徴とする。ＴＮＦＲ２が高発現している神経系細胞（例えば神経芽細胞）を提供することにより、ＴＮＦ（典型的にはＴＮＦ−α）のＴＮＦＲ１への結合を一つのシグナルとする神経疾患（例えばパーキンソン病等の神経変性疾患）の治療や改善に資することができる。また、そのような神経疾患（神経障害）を改善させることを目標とした研究開発分野において利用可能な材料を提供することができる。
【0017】
また、ここで開示される細胞作製方法の好ましい他の一態様では、上記合成ペプチドとして、配列番号１〜５１のうちのいずれかの配列番号で示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを使用することを特徴とする。配列番号１〜５１に示すＮＬＳ及びＮｏＬＳのアミノ酸配列は比較的少ない数のアミノ酸残基で構成されており、化学合成が容易であるため使用に好適である。なお、上記いずれかの配列番号に記載されたとおりのアミノ酸配列（改変前配列）により構成される合成ペプチドの他、当該アミノ酸配列に部分的な改変が施された改変アミノ酸配列からなる合成ペプチドもまた改変前配列と同様にＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドに包含される。【0018】
また、本発明は、ここで開示されるいずれかのＴＮＦＲ２誘導合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に設計されたポリヌクレオチド（例えばそれら配列により実質的に構成されるポリヌクレオチド）を提供する。好ましいポリヌクレオチドとして、配列番号１〜５１のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えばそれら配列により実質的に構成されるポリヌクレオチド）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、胸腺細胞を対象として、抗ＴＮＦＲ１ポリクローナル抗体（一次抗体）と蛍光色素標識二次抗体とを用いて行った蛍光抗体法に基づくコントロール区ならびに各サンプル添加区の培養細胞のＴＮＦＲ１発現の程度（コントロール区の蛍光強度を１としたときの相対値）を調べた結果を示すグラフである。
【図2】図２は、胸腺細胞を対象として、抗ＴＮＦＲ２ポリクローナル抗体（一次抗体）と蛍光色素標識二次抗体とを用いて行った蛍光抗体法に基づくコントロール区ならびに各サンプル添加区の培養細胞のＴＮＦＲ２発現の程度（コントロール区の蛍光強度を１としたときの相対値）を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示されるＴＮＦＲ２誘導合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【0021】
本明細書において「合成ペプチド」とは、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えば２型ＴＮＦ受容体発現誘導用組成物）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね５０以下（例えば３０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
【0022】
また、本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「部分的な改変が施された改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（典型的にはＴＮＦＲ２発現誘導機能）を損なうことなく、１個又は数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドには、以下で説明する各配列番号のアミノ酸配列（即ち表１及び表２中に列挙した各アミノ酸配列）と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失若しくは付加したアミノ酸配列であって、同様にＴＮＦＲ２発現誘導性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。
【0023】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導用組成物は、本発明者によって初めて所定の細胞においてＴＮＦＲ２の発現を誘導し得る（或いはＴＮＦＲ２の発現を活性化し得る）という作用が見出されたＮＬＳ若しくはＮｏＬＳからなるペプチドを有効成分として含有する組成物である。上述のとおり、ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドは、ＮＬＳ又はＮｏＬＳ（典型的にはＮｏＬＳはＮＬＳとして機能する。換言すればＮＬＳの一部はＮｏＬＳでもある。）であるアミノ酸配列若しくはその改変配列単独で構成されるという点において自然界には存在しない合成ペプチドといえる。
【0024】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドを構成するアミノ酸配列の好適例を表１及び表２ならびに配列表に示す。これら列挙したアミノ酸配列はいずれもＮＬＳ若しくはＮｏＬＳとして知られており、その情報は例えばＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）が提供するタンパク質のアミノ酸配列データベースから得ることができる。【0025】
【表1】
【0026】
【表2】
【0027】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成る核小体局在シグナル（Nucleolar localization sequence）に対応する。配列番号２のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の１種（ＡｐＬＬＰ）由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるＧＧＮＮＶα由来の合計９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号４のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号５のアミノ酸配列は、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス タイプ１）のタンパク質（γ（１）３４．５）由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号６のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってｐ５３腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するＭＤＭ２由来の合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号７のアミノ酸配列は、ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号８のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計１５アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号９のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるｐ１２０由来の合計１８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１０のアミノ酸配列は、ＨＩＣ（human I-mfa domain-containing protein）のｐ４０タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１１のアミノ酸配列は、ＭＤＶ（Ｍａｒｅｋ病ウイルス）のＭＥＱタンパク質由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１２のアミノ酸配列は、ＨＶＳ（ヘルペスウイルスsaimiri）のＯＲＦ５７タンパク質由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１３のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計１７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１４のアミノ酸配列は、腫瘍抑制タンパク質の一種であるｐ１４ＡＲＦ由来の合計１１アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１５〜１７のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト又はラット内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIMK2）由来の合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１８のアミノ酸配列は、癌抑制遺伝子ＩＮＧファミリーの産物ＩＮＧ１ｂ由来の合計１７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１９のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計１２アミノ酸配列から成るＮＬＳに対応する。
配列番号２０及び２１のアミノ酸配列は、ＦＧＦ３（線維芽細胞増殖因子−３）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２２のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子−２）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
その他、表２に示す配列番号２３〜５１の各アミノ酸配列（ＮＬＳ及び／又はＮｏＬＳ）の起源（生物種）等の情報についてはＮＣＢＩが提供しているＲｅｆＳｅｑ等を参照されたい。
【0028】
好ましくは、ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。本発明者は、各配列番号で示されるアミノ酸配列のようなＮＬＳ若しくはＮｏＬＳとして知られるアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、培養中のＴＮＦＲ２発現対象細胞（例えば胸腺細胞）に添加したところ、当該合成ペプチドが高効率に対象細胞の細胞膜を通過し得ること、さらには高効率に核膜を通過し得ることを見出すとともに、ＴＮＦＲ２を選択的（特異的）に発現し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0029】
使用する合成ペプチドとしては、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数は５０以下が適当であり、３０以下が望ましく、例えば６以上２５以下が好ましい。一般的なＮＬＳやＮｏＬＳのアミノ酸残基数はこのような範囲に収まる。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易にＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）でＴＮＦＲ２発現誘導能を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、ＴＮＦＲ２発現誘導用組成物に適用するＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には３０以下（特に２５以下）のアミノ酸残基数）のものが好適である。
なお、ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、ＴＮＦＲ２発現誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【0030】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【0031】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいてＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望するＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、精製することによって、目的のＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、精製することによって、目的のＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【0032】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計したＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、本発明のＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドを製造することができる。或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ちＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文 (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文 (Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000)) が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
【0033】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、ＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
【0034】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドは、少なくとも１種のＴＮＦＲ２発現対象細胞（典型的には免疫系細胞や神経系細胞、例えば胸腺細胞や神経芽細胞）に作用して選択的にＴＮＦＲ２を発現させる若しくは当該細胞におけるＴＮＦＲ２の発現量を増大させることができる。このため、ＴＮＦＲ２発現誘導用組成物（薬学的組成物）の有効成分として好適に使用し得る。なお、ＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドは、ＴＮＦＲ２発現誘導活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、ＴＮＦＲ２発現誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。【0035】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導用組成物は、有効成分であるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドのＴＮＦＲ２発現誘導能が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。ここで開示される組成物（即ちＴＮＦＲ２発現誘導剤）の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、ＴＮＦＲ２発現誘導用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。ＴＮＦＲ２発現誘導用組成物（ＴＮＦＲ２発現誘導剤）の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、ＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の組成物（薬剤）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990) が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【0036】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導用組成物（ＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド）の適用対象細胞は、潜在的に２型ＴＮＦ受容体を発現可能な細胞であれば特に制限されず、例えばかかる細胞への分化誘導が可能な未分化細胞に対しても適用可能である。また、種々の生物種から分離した初代培養細胞であってもよく、腫瘍化または不死化した株化細胞であってもよい。適用対象としては種々の生物種（典型的にはヒト又はヒト以外の哺乳動物）が挙げられる。医学上の見地から、特に免疫系の細胞や組織を対象とすることが好ましい。この種の細胞として、マクロファージ、単球、種々のタイプの胸腺細胞（リンパ球）、例えばナチュラルキラー細胞やキラーＴ細胞、或いはＢ細胞、樹状細胞、造血幹細胞、等が挙げられる。その他、脂肪組織、筋肉組織（心臓を含む）、或いは神経系を構成する細胞もＴＮＦＲ２発現対象細胞として好適である。神経系の細胞としては、神経細胞（ニューロン）や神経膠細胞（グリア細胞）等の中枢神経細胞、例えばＮｅｕｒｏ２ａ、Ｎ１Ｅ−１１５等の神経芽細胞腫が好適として挙げられるが、これに限定されず、神経伝達能を有する種々の細胞を用いることができる。なお、神経伝達能を有するか否かは、例えばパッチクランプ法によって確認することができる。また、疾病や障害の治療という観点から、幹細胞も適用対象として好適である。この種の細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞、神経幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、等が挙げられる。特に、未分化状態の幹細胞（即ち分化誘導処理が行われていない状態の幹細胞）に好ましく適用することができる。
【0037】
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導用組成物は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、生体外（インビトロ）で培養している細胞（細胞塊）、組織、器官に対し、ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導用組成物の適当量（即ちＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドの適当量）を、対象とする培養細胞（組織）の培地に添加するとよい。
添加量及び添加回数は、培養細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されないが、哺乳動物細胞を培養する場合、培地中のＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ〜２０μＭ（例えば１μＭ〜１０μＭ）の範囲内となるように、１〜複数回添加することが好ましい。
ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導用組成物（ＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド）をインビトロ培養系に添加することにより、目的とするＴＮＦＲ２を選択的（特異的或いは優先的）に発現する細胞を効率よく作製することができる。
【0038】
或いはまた、生体内（インビボ）において所定のＴＮＦＲ２発現対象細胞（例えば所定の部位に移植した組織片若しくは細胞塊）にＴＮＦＲ２を選択的に発現させる場合（若しくはその発現量を増大させる場合）は、ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導用組成物（即ちＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチド）の適当量を液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者（即ち生体内）に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを直接所定の組織（即ち該組織を構成している細胞）に投与することができる。なお、添加量及び添加回数は、ＴＮＦＲ２を高発現させたい細胞の種類、存在部位、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。【0039】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。【0040】
＜実施例１：ペプチド合成＞表１に示す配列番号１〜１９の各アミノ酸配列からなる計１９種類の合成ペプチドを後述するペプチド合成機を用いて製造した。なお、以下の説明では、合成した計１９種類のペプチドを、配列番号１〜１９に対応させてサンプル１〜１９と呼称する。
各サンプルは、表１（ならびに配列表）に示すいずれかのＮｏＬＳ若しくはＮＬＳのアミノ酸配列を有するように構成されており、全体が２０以下（具体的には７〜１９）のアミノ酸残基から成る直鎖状の化学合成ペプチドである。なお、サンプル１５及び１６のペプチドについては、一部のアミノ酸残基（トレオニン残基）がリン酸化されている。また、いずれのサンプルも、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている。いずれのペプチドも、市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
合成した各サンプルは、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶かし、ペプチド濃度が１ｍＭのストック液を調製した。
【0041】
＜実施例２：胸腺細胞を対象とした各合成ペプチドのＴＮＦＲ２発現誘導活性評価試験＞上記実施例１において得られた各サンプルのＴＮＦＲ２発現誘導活性を、胸腺細胞を対象にして調べた。コントロール区としてペプチド無添加区を設けた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
クリーンベンチ内において予め入手しておいたラットの胸腺を火炎滅菌済みの２枚のスライドガラスを用いてすり潰した。すり潰した細胞塊（即ち胸腺細胞を主体とする細胞集合物）を市販のＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、適当なピペッティングにより、細胞をバラバラに分散させた。次いで、この懸濁液を遠心分離し、バラバラに培地中に分散していた胸腺細胞（リンパ球）を沈澱させ回収した。
各試験においては、２４ウェル（穴）平底細胞培養プレートの各ウェルに上記培地を１．８ｃｍ３ずつ添加するとともに６×１０６cells／ウェルとなるように上記胸腺細胞を加えた。そして、ウェル中のペプチド濃度が２μＭとなるように、各ウェルの細胞含有培養液中に上記いずれかのサンプルのストック液を添加し、各サンプル添加区とした。また、いずれのサンプルも添加しない上記細胞含有培養液のみのウェルをコントロール区として設けた。
【0042】
上記のようにしてサンプル（合成ペプチド）を添加した後、当該細胞培養プレートを、３７℃、５％ＣＯ２条件下のＣＯ２インキュベータ内に静置した。そして当該インキュベータ内にて１時間インキュベートした後、細胞染色試験を行った。具体的には、各サンプル添加区ならびにコントロール区のウェル中の培養細胞について、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。合わせて、同じサンプルに対して抗ＴＮＦＲ１ポリクローナル抗体と抗ＴＮＦＲ２ポリクローナル抗体を用いてＴＮＦＲ１ならびにＴＮＦＲ２の発現・誘導に関する評価を行った。即ち、培養細胞が発現したＴＮＦＲ１（分子量が約５５ｋｄの１型ＴＮＦ受容体）に特異的に結合する抗ＴＮＦＲ１ポリクローナル抗体として、Santa Cruz Biotechnology, Inc.社製の抗ＴＮＦＲ１ウサギポリクローナル抗体（商品名：Ｈ−２７１、ヒト由来ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインであるアミノ酸残基３０位〜３０１位の領域に結合する。）を使用した。また、培養細胞が発現したＴＮＦＲ２（分子量が約７５ｋＤａの２型ＴＮＦ受容体）に特異的に結合する抗ＴＮＦＲ２ポリクローナル抗体として、Santa Cruz Biotechnology, Inc.社製の抗ＴＮＦＲ２ヤギポリクローナル抗体（商品名：Ｌ−２０、マウス由来ＴＮＦＲ２のＣ末端領域に結合する。）を使用した。そして、これら二種の一次抗体にそれぞれ結合する二次抗体として蛍光色素で標識された抗ウサギＩｇＧ抗体及び抗ヤギＩｇＧ抗体を用いた蛍光抗体法によって各ウェル中の培養細胞のＴＮＦＲ１ならびにＴＮＦＲ２の発現量の程度について確認した。
【0043】
結果を図１及び図２に示す。図１は、抗ＴＮＦＲ１ポリクローナル抗体（一次抗体）と蛍光色素標識二次抗体とを用いて行った蛍光抗体法に基づくコントロール区ならびに各サンプル添加区の培養細胞のＴＮＦＲ１発現の程度を調べた結果を示すグラフである。コントロール区におけるＴＮＦＲ１の発現の程度（即ち蛍光強度）を１とした相対値で示している。他方、図２は、抗ＴＮＦＲ２ポリクローナル抗体（一次抗体）と蛍光色素標識二次抗体とを用いて行った蛍光抗体法に基づくコントロール区ならびに各サンプル添加区の培養細胞のＴＮＦＲ２の発現の程度を調べた結果を示すグラフである。コントロール区におけるＴＮＦＲ２の発現の程度（即ち蛍光強度）を１とした相対値で示している。また、図３〜図５はコントロール区の培養細胞を示す蛍光顕微鏡写真であり、図３はＤＡＰＩによる核染色結果を示し、図４は抗ＴＮＦＲ１抗体を使用した蛍光抗体法に基づく結果を示し、図５は抗ＴＮＦＲ２抗体を使用した蛍光抗体法に基づく結果を示す。
また、図６〜図８はサンプルとして配列番号１７のペプチドを使用したサンプル１７を添加した培養細胞を示す蛍光顕微鏡写真であり、図６はＤＡＰＩによる核染色結果を示し、図７は抗ＴＮＦＲ１抗体を使用した蛍光抗体法に基づく結果を示し、図８は抗ＴＮＦＲ２抗体を使用した蛍光抗体法に基づく結果を示す。なお、サンプル１７添加区は相互に独立して試験を２回繰り返しており、ここでは２回目のサンプル１７添加区（図１及び図２中ではサンプル１７（２回目）と記載しているもの）に対して行った顕微鏡写真を示している。
【0044】
図１及び図２に示す結果、ならびに図３〜図８から明らかなように、ここで開示されるサンプル（即ちＴＮＦＲ２発現誘導ペプチド）のいずれかが添加された各サンプル添加区では、コントロール区と比較して相対蛍光強度で３以上（典型的には４以上、特に好ましくは５以上）であって６以下の高いＴＮＦＲ２の発現（誘導）が認められた。一方、ＴＮＦＲ１の発現に関しては、何れのサンプル添加区においてもコントロール区と大差なく、何れのサンプルを添加してもＴＮＦＲ１の発現は促進も増大（誘導）もされないことを示している。このことは、各サンプルとして合成した各ペプチドが、所定の細胞（即ちＴＮＦＲ２発現対象細胞）に供給されることにより当該細胞中でＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２のうちＴＮＦＲ２を選択的に発現させ得る能力を有するＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドであることを示しており、ＴＮＦＲ２発現対象細胞に対してＴＮＦＲ２を特異的に発現させるための組成物の有効成分としての有用性を示すものである。
【0045】
＜実施例３：神経芽細胞を対象とした各合成ペプチドのＴＮＦＲ２発現誘導活性評価試験＞上記実施例１において得られた各サンプルのＴＮＦＲ２発現誘導活性を、神経芽細胞を対象にして調べた。コントロール区としてペプチド無添加区を設けた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
供試細胞として、市販のマウス神経芽細胞腫より樹立された細胞株（Ｎｅｕｒｏ２ａ）を使用した。かかる細胞を予めＤＭＥＭ培地（即ち、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ：Gibco社製品）、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むダルベッコのＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地：Gibco社製品））で培養し、９６穴（ウェル）プレートの１ウェルあたりの細胞数が約５×１０３個となるように調整した。このときの培地量はウェルあたり１００μＬとした。ここに分化誘導能を有するレチノイン酸をウェルあたり２０μＭ投与し、ＣＯ２インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で約１６８時間（７日間）作用させた。これにより、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞の神経突起を伸長させ、神経様細胞に分化させた。
そして、ウェル中のペプチド濃度が５μＭとなるように各ウェルの細胞含有培養液中に上記いずれかのサンプルのストック液を添加し、各サンプル添加区とした。また、いずれのサンプルも添加しない上記細胞含有培養液のみのウェルをコントロール区として設けた。上記のようにしてサンプル（合成ペプチド）を添加して更に２日間培養を継続した後、上記実施例２と同様に蛍光抗体法によってＴＮＦＲ１ならびにＴＮＦＲ２の発現・誘導に関する評価を行った。
【0046】
結果を図９及び図１０に示す。図９は、抗ＴＮＦＲ１ポリクローナル抗体（一次抗体）と蛍光色素標識二次抗体とを用いて行った蛍光抗体法に基づくコントロール区ならびに各サンプル添加区の培養細胞のＴＮＦＲ１発現の程度を調べた結果を示すグラフである。コントロール区におけるＴＮＦＲ１の発現の程度（即ち蛍光強度）を１とした相対値で示している。他方、図１０は、抗ＴＮＦＲ２ポリクローナル抗体（一次抗体）と蛍光色素標識二次抗体とを用いて行った蛍光抗体法に基づくコントロール区ならびに各サンプル添加区の培養細胞のＴＮＦＲ２の発現の程度を調べた結果を示すグラフである。コントロール区におけるＴＮＦＲ２の発現の程度（即ち蛍光強度）を１とした相対値で示している。【0047】
図９及び図１０に示す結果から明らかなように、ここで開示されるサンプル（即ちＴＮＦＲ２発現誘導ペプチド）のいずれかが添加された各サンプル添加区では、コントロール区と比較して相対蛍光強度で１．５以上（典型的には１．６以上、特に好ましくは１．８以上）であって２．０以下の高いＴＮＦＲ２の発現（誘導）が認められた。特に、配列番号１７番のアミノ酸配列は、コントロール区と比較して１．９以上と顕著に高い蛍光強度を示した。一方、ＴＮＦＲ１の発現に関しては、何れのサンプル添加区においてもコントロール区と大差なく、何れのサンプルを添加してもＴＮＦＲ１の発現は促進も増大（誘導）もされないことを示している。このことは、各サンプルとして合成した各ペプチドが、所定の細胞（即ちＴＮＦＲ２発現対象細胞）に供給されることにより当該細胞中でＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２のうちＴＮＦＲ２を選択的に発現させ得る能力を有するＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドであることを示しており、ＴＮＦＲ２発現対象細胞に対してＴＮＦＲ２を特異的に発現させるための組成物の有効成分としての有用性を示すものである。
【0048】
＜実施例４：顆粒剤の調製＞サンプル１７のペプチド５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示される一つのＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
【産業上の利用可能性】
【0049】
上述のように、ここで開示されるＴＮＦＲ２発現誘導性ペプチドは、高いＴＮＦＲ２発現誘導性を有しているため、該ペプチドを含むＴＮＦＲ２発現誘導用組成物（薬学的組成物）は、所定の細胞に対して選択的（特異的）にＴＮＦＲ２を発現させる研究試薬又は医療上の薬剤（組成物）として利用することができる。そして、該組成物を使用することにより、ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２のうちＴＮＦＲ２を選択的に発現した細胞を作製する方法が提供される。【配列表フリーテキスト】
【0050】
配列番号１５，１６ リン酸化【配列表】
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