特許 5967492 免疫賦活剤及び免疫抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5967492

(24)【登録日】2016年7月15日

(45)【発行日】2016年8月10日

(54)【発明の名称】免疫賦活剤及び免疫抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20160728BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20160728BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 UZNA

   A61K37/02

   A61P37/04

【請求項の数】4

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2014-236726(P2014-236726)

(22)【出願日】2014年11月21日

(62)【分割の表示】特願2013-61588(P2013-61588)の分割

【原出願日】2005年10月20日

(65)【公開番号】特開2015-44853(P2015-44853A)

(43)【公開日】2015年3月12日

【審査請求日】2014年12月19日

(31)【優先権主張番号】特願2004-307331(P2004-307331)

(32)【優先日】2004年10月21日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000185983

【氏名又は名称】小野薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100081086

【弁理士】

【氏名又は名称】大家 邦久

(74)【代理人】

【識別番号】100121050

【弁理士】

【氏名又は名称】林 篤史

(72)【発明者】

【氏名】小谷 知之

(72)【発明者】

【氏名】多田 秀明

(72)【発明者】

【氏名】諸江 君保

【審査官】 吉田 佳代子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０００／０５０４４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９９／０３３８７３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）配列番号１〜６のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対する単離モノクローナル抗体、または
（２）配列番号１〜６のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質の細胞外領域内の任意の領域からなる単離ポリペプチドを有効成分として含む免疫賦活剤。

【請求項2】

請求項１記載の単離モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である請求項１記載の剤。

【請求項3】

請求項１記載の単離ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃドメインと融合したポリペプチドである請求項１記載の剤。

【請求項4】

請求項１記載の単離モノクローナル抗体が、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖ断片である請求項１記載の剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、本発明に係る免疫抑制受容体のアンタゴニストの用途に関する。さらに詳しく言えば、そのアンタゴニストを含有する免疫賦活剤およびそのアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫抑制受容体として機能する分子として、ＣＴＬＡ−４(N. Engl. J. Med. 338(25):1813-21 (1998))、ＰＤ−１(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98(24):13866-71 (2001))およびＦｃγＲＩＩＢ(Science. 290(5489):84-9 (2000))などが知られている。
本発明に係る蛋白質（以下、B cell immunoglobulin receptor 1(BIR1)と呼ぶことがある。）のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列が国際公開第９９／３３８７３号パンフレットに報告されている。しかしながら、本発明に係る蛋白質の機能は十分解明されていないし、ましてやそのアンタゴニストおよびアゴニストの用途については全く知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開第９９／３３８７３号パンフレット

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】N. Engl. J. Med. 338(25):1813-21 (1998)

【非特許文献2】Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98(24):13866-71 (2001)

【非特許文献3】Science. 290(5489):84-9 (2000)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の課題は、本発明に係る受容体の機能を解明し、そのアンタゴニストあるいはアゴニストの用途を見出すことにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、その課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、本発明に係る受容体が免疫抑制受容体として機能することを初めて解明し、そのアンタゴニストおよびアゴニストのそれぞれの用途を見出すとともに、そのアンタゴニストおよびアゴニストのスクリーニング方法を見出して、本発明を完成させた。

【0007】

すなわち、本発明は、
（１） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストを含有してなる免疫賦活剤、
（２） アンタゴニストが、細胞内シグナル伝達に対する前記（１）記載の蛋白質による抑制を減弱ないし阻害する物質である前記（１）記載の免疫賦活剤、
（３） 前記（２）記載の物質が、前記（１）記載の蛋白質のリガンド結合を阻害する物質である前記（２）記載の免疫賦活剤、
（４） 前記（２）記載の物質が、前記（１）記載の蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼの結合を阻害する物質である前記（２）記載の免疫賦活剤、
（５） 前記（２）記載の物質が、ホスファターゼ活性を阻害する物質である前記（２）記載の免疫賦活剤、
（６） リガンド結合を阻害する物質が、前記（１）記載の蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドまたはそれらに対する抗体である前記（３）記載の剤、
（７） 前記（６）記載の蛋白質またはポリペプチドが、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３７、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜４２および配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはポリペプチドである前記（６）記載の免疫賦活剤、
（８） ホスファターゼが、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１および／またはＳＨＩＰ−２である前記（４）または前記（５）記載の免疫賦活剤、
（９） 癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予防および／または治療剤である前記（１）記載の免疫賦活剤、
（１０） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
（i）被験化合物の存在下で、その細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドを接触させる工程、
（ii）その細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドの結合によって変動するシグナルを検出する工程、および
（iii）被験化合物の存在下と非存在下での工程（ii）のシグナル強度を比較することによって、その結合を阻害する化合物をスクリーニングする工程からなる方法、
（１１） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
（i）被験化合物の存在下で、その細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼを接触させる工程、
（ii）その細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼの結合によって変動するシグナルを検出する工程、および
（iii）被験化合物の存在下と非存在下での工程（ii）のシグナル強度を比較することによって、その結合を阻害する化合物をスクリーニングする工程からなる方法、
（１２） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
（i）被験化合物の存在下で、配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する細胞またはその細胞外領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドとリガンドを発現する細胞もしくはリガンドを接触させる工程、
（ii）工程（ii）における接触によって変動するシグナルを検出する工程および
（iii）被験化合物の存在下と非存在下での工程（ii）のシグナル強度を比較する工程からなる方法、
（１３） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする免疫賦活方法、
（１４） 免疫賦活剤を製造するための、配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの使用、
（１５） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予防および／または治療方法、
（１６） 癌、免疫不全症および感染症から選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニストの使用、
（１７） 配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチド、
（１８） 配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド
（１９） 配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体、
（２０） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアゴニストを含有してなる免疫抑制剤、
（２１） アゴニストが、細胞内シグナル伝達に対する前記（２０）記載の蛋白質による抑制を保持ないし増強する物質である前記（２０）記載の剤、
（２２） 前記（２１）記載の物質が、前記（２０）の蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容体を架橋する物質である前記（２１）記載の剤、
（２３） 前記（２１）記載の物質が、前記（２０）の蛋白質に対するアゴニスト抗体である前記（２１）記載の剤、
（２４） 自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤である前記（２０）記載の剤、
（２５） 自己免疫疾患が、ループス抗凝固因子が高値な疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症または高安動脈炎である前記（２４）記載の剤、
（２６） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアゴニストの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする免疫抑制方法、
（２７） 免疫抑制剤を製造するための、配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアゴニストの使用、
（２８） 配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアゴニストの有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療方法、および
（２９） 自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアゴニストの使用に関する。

【発明の効果】

【0008】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストは、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療に効果が期待できる。また、本発明に係る蛋白質のアゴニストは、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の予防および／または治療に効果が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ヒト正常組織、血液細胞および細胞株におけるＢＩＲ１のｍＲＮＡ発現量を示す。

【図2】各種炎症刺激によるヒトＢＩＲ１の発現変動を示す。

【図3】自己免疫疾患患者由来の単球およびＢ細胞におけるＢＩＲ１の発現変動解析の結果を示す（ＮＤ：正常ドナー、ｖＷＤ：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ病、ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス、ＲＡ：関節リウマチ、ＭＳ：多発性硬化症、ＬＡ：ループス抗凝固因子が高値な疾患、ＴＡ：高安動脈炎、ＩＴＰ：特発性血小板減少性紫斑病）。＊；ｐ＜０．０５， ＊＊；ｐ＜０．０１，＊＊＊；ｐ＜０．００５。

【図4】ＦｃＲ−ｈＢＩＲ１（ｗｔ）、ＦｃＲ−ｈＢＩＲ１（ＹＷＦ）およびＦｃＲ−ｈＫＩＲ２ＤＬ３安定発現細胞におけるＦｃＲキメラ蛋白の発現量を示す。

【図5】ヒトＢＩＲ１によるＢＣＲを介した細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇の抑制を示す。

【図6】抑制性シグナル伝達におけるヒトＢＩＲ１の細胞内チロシン残基のリン酸化およびリクルートされるホスファターゼを示す（Ｕ：Ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ、Ｆ：Ｆ（ａｂ’）₂、Ｉ：Ｉｎｔａｃｔ）。

【図7】ヒトＢＩＲ１によるＢＣＲを介したＥｒｋ２のリン酸化の抑制を示す。

【図8】ヒトＢＩＲ１によるＢＣＲを介したＩＬ−２産生の抑制を示す。

【図9】ヒトＢＩＲ１のＩＴＩＭドメインおよび結合するホスファターゼの同定を示す。

【図10】ヒトＢＩＲ１モノクローナル抗体の抗原結合反応を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明明細書において、「配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」における「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」とは、配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同じ機能を有する蛋白質であって、配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸の一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が付加または挿入されたもの、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有する蛋白質を意味する。ここで、上記アミノ酸の欠失、置換または付加あるいは挿入の位置は特に限定されない。以下、本発明明細書において、「配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」を「本発明に係る蛋白質」と呼ぶことがある。

【0011】

ここで、本発明に係る蛋白質として、好ましくは、配列番号１〜４および配列番号６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、より好ましくは、配列番号１〜４で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、さらに好ましくは、配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、さらに好ましくは、配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質である。

【0012】

本発明明細書において、「配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアンタゴニスト」とは、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を減弱ないし阻害する物質を示す。そのような物質として、例えば、
（i）本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害し、本発明に係る蛋白質にアゴニスト活性を有しない物質、
（ii）本発明に係る蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼの結合を阻害する物質、
（iii）当該ホスファターゼの活性を阻害する物質、および
（iv）本発明に係る蛋白質の細胞内領域に結合したホスファターゼの活性を阻害する物質などが挙げられる。

【0013】

ここで、「細胞内シグナル」とは、例えば、Ｂ細胞受容体(B cell receptor(BCR))もしくはＢ細胞受容体複合体(ＢＣＲ、ＣＤ７９Ａ(EMBO J. 7 (11): 3457-3464 (1988))およびＣＤ７９Ｂ(Eur.J.Immunol. 22 (6): 1621-1625 (1992)))、活性化Ｆｃ受容体(例えば、ＦｃγＲＩ(J. Biol. Chem. 266 (20): 13449-13455 (1991)))、ＣＤ１４／ＴＬＲ４複合体(Nature 406: 780-785 (2000))、ＦｃεＲＩ(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 85: 1907-1911 (1988))などから生じる細胞内シグナルが挙げられる。また、「細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制」としては、例えば、本発明に係る蛋白質の細胞内領域に結合したホスファターゼによる細胞内シグナル伝達を担う分子の脱リン酸化が挙げられる。

【0014】

ここで、「本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害し、本発明に係る蛋白質にアゴニスト活性を有しない物質」としては、例えば、蛋白質、ポリペプチドもしくはペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、有機合成化合物または天然物（例えば、発酵生産物、細胞抽出物、植物抽出物、および動物組織抽出物など）などが挙げられる。
そのような物質として好ましくは、蛋白質、ポリペプチドまたは抗体であり、具体的には、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドおよびそれらに対する抗体などが挙げられる。

【0015】

「本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチド」とは、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含み、いわゆる、細胞膜貫通領域および細胞内領域を含まない蛋白質またはポリペプチドである。具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７の領域から任意に選択される領域、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７の領域から任意に選択される領域、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域から任意に選択される領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３７の領域から任意に選択される領域、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜４２の領域から任意に選択される領域または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域から任意に選択される領域を含み、細胞膜貫通領域および細胞内領域を含まない蛋白質またはポリペプチドである。ここで、「細胞膜貫通領域」とは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２２８〜２５０の領域、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２２８〜２５０の領域、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１３３〜１５５の領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１３８〜１６０の領域、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸４３〜６５の領域または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１３３〜１５５の領域であり、「細胞内領域」とは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２５１〜３４３の領域、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２５１〜３４３の領域、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１５６〜２４８の領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１６１〜２５３の領域、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸６６〜１５８の領域または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１５６〜１７６の領域である。

【0016】

本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドには、他の蛋白質またはポリペプチドと融合されたものも含まれる。例えば、蛋白質またはポリペプチドの可溶化のために、免疫グロブリンのＦｃドメインと融合されたものなどが挙げられ、それらは公知の方法により製造することができる。
「本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチド」における「任意の領域」とは、本発明に係る蛋白質に対してアンタゴニスト活性を有するものであれば、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中のいずれの領域ものであってもよい。

【0017】

それら蛋白質またはポリペプチドには、例えば、そのアンタゴニスト活性の維持ないし向上、蛋白質またはポリペプチドの安定化もしくは抗原性の低減のために、その蛋白質またはポリペプチドの一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するものをも含む。
本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドは、公知のタンパク質発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。

【0018】

「本発明に係る蛋白質のリガンド結合」における「リガンド」とは、本発明に係る蛋白質の細胞外領域に結合し、本発明に係る蛋白質の機能を誘導する活性を有する生体内物質である。そのようなリガンドとして好ましくはタンパク質である。ここで、「本発明に係る蛋白質の細胞外領域」とは、いわゆる、イムノグロブリンあるいはイムノグロブリン様ドメインといわれるドメインを含む領域であって、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７の領域、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７の領域、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３７の領域、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜４２の領域または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域である。
「本発明に係る蛋白質にアゴニスト活性を有しない」とは、本発明に係る蛋白質の機能を刺激する活性を持たないことを意味する。

【0019】

「本発明に係る蛋白質の細胞内領域」とは、具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２５１〜３４３の領域、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２５１〜３４３の領域、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１５６〜２４８の領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１６１〜２５３の領域、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸６６〜１５８の領域または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１５６〜１７６の領域である。本発明に係る蛋白質の細胞内領域には、いわゆる、ＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）様ドメインが存在し、具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸３１１〜３１６および／または３３６〜３４１、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸３１１〜３１６および／または３３６〜３４１、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２１６〜２２１および／または２４１〜２４６、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２２１〜２２６および／または２４６〜２５１、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１２６〜１３１および／または１５１〜１５６または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１６９〜１７４に存在する。

【0020】

「本発明に係る蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼの結合を阻害する物質」、「そのホスファターゼの活性を阻害する物質」、または「本発明に係る蛋白質の細胞内領域に結合したホスファターゼの活性を阻害する物質」における「ホスファターゼ」としては、例えば、ＳＨＰ−１(Nature 352 (6337): 736-739 (1991)）、ＳＨＰ−２ (Proc. Nat. Acad. Sci. 90: 2197-2201 (1993))、ＳＨＩＰ−１ (Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 1689-1693 (1996))、ＳＨＩＰ−２(Biochem Biophys Res Commun. 239(3):697-700 (1997))と呼ばれるホスファターゼなどが挙げられる。

【0021】

「本発明に係る蛋白質の細胞内領域へのホスファターゼの結合を阻害する物質」における「細胞内領域へのホスファターゼの結合」とは、ＩＴＩＭ様ドメインにホスファターゼが結合することであり、その結合にはＩＴＩＭ様ドメインに含まれるチロシン残基がリン酸化されることを必要とする。そのようなチロシン残基は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸３１３番目および３３８番目のチロシン残基、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸３１３番目および３３８番目のチロシン残基、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２１８番目および２４３番目のチロシン残基、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸２２３番目および２４８番目のチロシン残基、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１２８番目および１５３番目のチロシン残基または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１７１番目のチロシン残基である。

【0022】

「当該ホスファターゼの活性を阻害する物質」または「本発明に係る蛋白質の細胞内領域に結合したホスファターゼの活性を阻害する物質」におけるホスファターゼにより脱リン酸化される標的として、例えば、細胞内シグナル伝達分子であるキナーゼ、イノシトールリン酸などが挙げられる。そのようなキナーゼとしては、例えば、セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、Ｃａ²⁺／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、ＭＡＰキナーゼおよびＭｏｓ／Ｒａｆキナーゼなど）およびチロシンキナーゼ（例えば、受容体型チロシンキナーゼおよび非受容体型チロシンキナーゼなど）などが挙げられる。イノシトールリン酸としては、例えば、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三りん酸(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate)などが挙げられる。

【0023】

当該ホスファターゼの標的であるキナーゼとしては、例えば、ＥＲＫ２(Biochem. Biophys. Res. Commun. 182: 1416-1422 (1992))、ＢＴＫ(Nature 361 (6409), 226-233 (1993))およびＳＹＫ(J. Biol. Chem. 266: 15790-15796 (1991))、ＪＡＫ１(Molec. Cell. Biol. 11: 2057-2065 (1991))、ＪＡＫ２(Biochem. Biophys. Res. Commun. 246: 627-633 (1998))、ＪＡＫ３(Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 6374-6378 (1994))、ＺＡＰ７０(Cell 71: 649-662 (1992))、ＢＬＮＫ(Immunity 9: 93-103 (1998))、ＦＹＮ(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (15): 5459-5463 (1986))、ＬＣＫ(Biochim. Biophys. Acta 888 (3): 286-295 (1986))などが挙げられ、より好ましくはＥＲＫ２である。

【0024】

「本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドに対する抗体」とは、本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害し、本発明に係る蛋白質にアゴニスト活性を有しない抗体であれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ニワトリ由来抗体、ウサギ由来抗体またはヤギ由来抗体のいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、完全型もしくは短縮型（例えば、F(ab')₂、Fab'、FabおよびFv断片など）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。そのような抗体は、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドを抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法あるいは実施例に記載の方法に従って製造することができる。本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドは、公知のタンパク質発現および精製法あるいは実施例に記載の方法によって調製することができる。

【0025】

以上のような、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を減弱ないし阻害する物質は、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療薬として有用である。

【0026】

本発明明細書において、「配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質のアゴニスト」とは、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強する物質を示す。そのような物質として、例えば、
（i）本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容体を架橋する物質、
（ii）本発明に係る蛋白質に対するアゴニスト抗体および
（iii）本発明に係る蛋白質に対するリガンドなどが挙げられる。
ここで、「細胞内シグナル」とは、例えば、Ｂ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体複合体、活性化Ｆｃ受容体、ＣＤ１４／ＴＬＲ４複合体、ＦｃεＲＩなどから生じる細胞内シグナルが挙げられる。また、「細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強する」こととしては、例えば、本発明に係る蛋白質の細胞内領域に結合したホスファターゼによる細胞内シグナル伝達を担う分子の脱リン酸化状態の持続あるいは頻度の増加などが挙げられる。

【0027】

ここで、「本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容体を架橋する物質」における「受容体」としては、例えば、Ｂ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体複合体、活性化Ｆｃ受容体、ＣＤ１４／ＴＬＲ４複合体、ＦｃεＲＩなどが挙げられる。
細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強する物質としての「本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容体を架橋する物質」としては、例えば、蛋白質、ポリペプチドおよび抗体などが挙げられる。そのような物質として好ましくは、本発明に係る蛋白質とその蛋白質が発現する細胞に発現する受容体をともに認識する抗体が挙げられる。

【0028】

細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強する物質としての「本発明に係る蛋白質に対するアゴニスト抗体」とは、本発明に係る蛋白質を活性化させる抗体であれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ニワトリ由来抗体、ウサギ由来抗体またはヤギ由来抗体のいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、完全型もしくは短縮型（例えば、F(ab')₂、Fab'、FabおよびFv断片など）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。そのような抗体は、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドを抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法あるいは実施例に記載の方法に従って製造することができる。本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドは、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。

【0029】

細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強する物質としての「本発明に係る蛋白質に対するリガンド」とは、本発明に係る蛋白質の細胞外領域に結合し、本発明に係る蛋白質の機能を誘導する活性を有する生体内物質であり、そのような物質が蛋白質である場合には、その部分ペプチドを有するポリペプチドをも含む。
以上のように、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質による抑制を保持ないし増強する物質は、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患または炎症性疾患の予防および／または治療薬として有用である。

【0030】

［本発明のスクリーニング方法］
本発明明細書において、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストをスクリーニングする方法（以下、本発明のスクリーニング方法と呼ぶこともある。）としては、例えば、蛍光偏光ホモジニアスアッセイ、時間分解蛍光アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ、化学増幅型ルミネッセンス プロキシミティーホモジニアスアッセイ、ＲＩアッセイ、バイオルミネッセンス共鳴エネルギー転移アッセイ、Ｔｗｏ−ハイブリッドレポータージーンアッセイ、細胞内Ｃａ²⁺濃度測定アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなどを用いて実施することができる。

【0031】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストをスクリーニングする方法における「本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチド」とは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７の領域から任意に選択される領域、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２２７の領域から任意に選択される領域、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域から任意に選択される領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３７の領域から任意に選択される領域、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜４２の領域から任意に選択される領域また配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域から任意に選択される領域を含むポリペプチドである。ここで、「任意に選択される領域」とは、本発明に係る蛋白質のリガンドに対する結合活性を維持するのに必要とされる領域を意味する。

【0032】

「本発明に係る蛋白質の細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチド」とは、上記ＩＴＩＭ様ドメインの領域を含む蛋白質またはポリペプチドである。ここで、ＩＴＩＭ様ドメインに含まれるチロシン残基はリン酸化されていてもよい。
これらポリペプチドには、任意に、酵素、蛍光物質、蛍光蛋白質、発光物質または放射性同位元素などの検出ラベルが付加されたものが使用できる。これら検出ラベルの付加は、本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドの結合の後あるいは前に、これらを認識する物質あるいは抗体を介して付加されてもよい。具体的には、本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドあるいはリガンドをビオチン標識し、一方にアビジン標識された上記検出ラベルを添加することによって付加することができる。本発明に係る蛋白質の細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼの結合においても同様である。

【0033】

検出ラベルとしての酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。検出ラベルとしての蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ(Fluorescein isothiocianate)、ＰＩ(propidium iodide)、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ、ＡＰＣ(Allophycocyanin)、Ｒ−ＰＥ(R-phycoerythrin)、蛍光ランタニドキレート（例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム、ディスプロシウムなど）などが挙げられる。検出ラベルとしての蛍光蛋白質としては、例えば、ＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＲＣＦＰ(Reef Coral Fluorescent Protein)、ＤｓＲｅｄ、ＡｃＧＦＰ１、ＨｃＲｅｄ１、ＣｏｐＧＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＥＹＦＰ、ＫＦＰ−Ｒｅｄなど挙げられる。検出ラベルとしての放射性同位元素としては、例えば、〔³²Ｐ〕、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔³⁵Ｓ〕および〔¹⁴Ｃ〕が挙げられる。検出ラベルとしての発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。

【0034】

本発明明細書において、本発明のスクリーニング方法の「それらの細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドを接触させる工程」における「リガンド」とは、本発明に係る蛋白質の細胞外領域に結合し、本発明に係る蛋白質の機能を誘導する活性を有する生体内物質である。そのようなリガンドとして好ましくは蛋白質である。
「本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドとリガンドの結合によって変動するシグナル」あるいは「本発明に係る蛋白質の細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドとホスファターゼの結合によって変動するシグナル」とは、上記検出ラベルとしての蛍光物質または蛍光蛋白質より発せられる蛍光、あるいは放射性同位元素からの放射線などが挙げられる。また、上記検出ラベルとしての酵素と発色基質との反応による発色も挙げられる。上記酵素、蛍光物質、蛍光蛋白質、発光物質、放射性同位元素および発色基質は、市販のものを使用することができる。

【0035】

「配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する細胞」とは、本発明に係る蛋白質を発現する細胞であればよいが、好ましくは、本発明に係る蛋白質を発現する発現ベクターによって、一過的ないし定常的に形質転換された細胞である。そのような発現ベクターとしては、一般に市販されているものを用いることができる。また、形質転換される細胞として、サルＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｕ９３７細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｋ５６２細胞、マウスＬ細胞などが挙げられる。

【0036】

「リガンドを発現する細胞」とは、リガンドを発現する細胞であればいずれの細胞であってもよいが、好ましくは、リガンドを発現する発現ベクターによって、一過的ないし定常的に形質転換された細胞である。そのような発現ベクターとしては、一般に市販されているものを用いることができ、形質転換される細胞としては、前記した細胞が挙げられる。
「配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する細胞とリガンドを発現する細胞もしくはリガンドの接触によって変動するシグナル」としては、例えば、それら細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度、細胞内Ｃａ²⁺濃度、ＩＰ₃濃度、細胞内シグナル伝達分子（例えば、Ｅｒｋ２など）のリン酸化あるいは脱リン酸化、本発明に係る蛋白質へのホスファターゼの結合、産生サイトカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）など）量などに対応するシグナル（例えば、発色、蛍光、発光、放射線など）などが挙げられる。

【0037】

本発明のスクリーニング方法として、具体的には、以下の方法により行うことができる。すなわち、本発明に係る蛋白質と共発現する活性化受容体（例えば、ＢＣＲ）に対する抗体、本発明に係る蛋白質に対する抗体または本発明に係る蛋白質のリガンドをアガロースビーズなどの担体あるいは培養プレートに一緒に固定する。本発明に係る蛋白質を発現している細胞（ＢＩＲ１強制発現細胞、ＢＣＲとＢＩＲ１が共発現しているＢ細胞株、Ｂ細胞、単球、末梢血単核球など）を上記固定化担体あるいはプレートに添加して刺激する際に、被験化合物（低分子化合物、ペプチド、可溶化蛋白質、抗体など）を同時に添加する。一定時間培養後、培養上清中に分泌されるインターロイキン２（ＩＬ−２）量、細胞内Ｃａ²⁺濃度、本発明に係る蛋白質の細胞内チロシン残基のリン酸化、本発明に係る蛋白質へのホスファターゼの結合、またはＥｒｋ２などの細胞内シグナル伝達分子のリン酸化を指標に、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。

【0038】

また、本発明に係る蛋白質のＩＴＩＭ様ドメインの領域を含むリン酸化ペプチドをビオチン化し、抗ビオチン抗体を固定したアガロースビーズなどの担体あるいは培養プレートに結合させ、被験化合物（例えば、低分子化合物、ペプチド、可溶化蛋白質、抗体など）とＡ２０ＩＩＡ１．６細胞の溶解液を添加し、一定時間保温する。ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１またはＳＨＩＰ−２に対する一次抗体を反応させた後、二次抗体を用いてリン酸化ペプチドに結合したホスファターゼ量を測定する。結合ホスファターゼ量を減少させる化合物を、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストとしてスクリーニングすることができる。

【0039】

本発明に係る蛋白質の発現量を減少または増加させる化合物をスクリーニングする方法として、例えば、以下の方法により行うことができる。すなわち、細胞（例えば、ＢＩＲ１強制発現細胞、ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１細胞、Ｕ９３７細胞、ヒト末梢血から単離したＣＤ１４陽性細胞（単球）、ＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）など）を培養プレートに撒き、炎症刺激剤（例えば、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｒ）、ＴＮＦ−αなど）の存在下あるいは非存在下で被験化合物（例えば、低分子化合物、ペプチド、可溶化蛋白質、抗体など）と共に一定時間培養する。細胞からＲＮＡを抽出し、本発明に係る蛋白質に特異的なプライマーを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡレベルでの発現量を測定する。あるいは、培養後の細胞に抗ヒトＢＩＲ１モノクローナル抗体を添加し、次にＦＩＴＣ標識した二次抗体を添加し、細胞表面に発現しているＢＩＲ１をフローサイトメーターにより定量する。あるいは、培養後に細胞溶解液を調製し、本発明に係る蛋白質に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより蛋白質レベルでの発現量を測定する。

【0040】

さらに、以下の方法によっても行うことができる。具体的には、ＢＩＲ１遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックスなど）、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域を含むＤＮＡとレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β―ガラクトシダーゼ遺伝子など）を連結した組み換えベクターを作製し、適当な細胞に導入する。被験化合物の存在下および非存在下で、ＢＩＲ１遺伝子が転写される環境のもとで該細胞を培養し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することによって被験化合物の転写促進活性または転写抑制活性を確認する。ＢＩＲ１遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域および翻訳開始部位近傍領域は公知の方法により取得可能である。

【0041】

［本発明の蛋白質］
本発明明細書において、「配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質もしくはその部分ペプチド」における「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」とは、配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列を有する蛋白質の機能と同じ機能を有する蛋白質であって、その配列番号３〜６から選択されるアミノ酸配列中の一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するものも含まれる。ここで、上記アミノ酸の欠失、置換または付加あるいは挿入の位置は特に限定されない。以下、「配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」を「本発明の蛋白質」と呼ぶこともある。

【0042】

さらに、本発明の蛋白質には、少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上、さらに好ましくは全領域において、配列番号３〜６から選択されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれる。

【0043】

本発明明細書における蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である
本発明の蛋白質には、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここで、エステルにおけるＲとしては、例えば、Ｃ１〜６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなど）、Ｃ３〜８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）、Ｃ６〜１２アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチルなど）、フェニル−Ｃ１〜２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチルなど）、α−ナフチル−Ｃ１〜２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチルなど）、Ｃ７〜１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。

【0044】

本発明の蛋白質がＣ末端以外にカルボキシル基を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例えば、メチオニン残基など）のアミノ基が保護基（例えば、Ｃ１〜６アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基など）など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、Ｃ１〜６アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基など）など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。

【0045】

本発明の蛋白質として好ましくは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号５で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、または配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質であり、より好ましくは配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質である。

【0046】

本発明明細書において、「配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチド」における「部分ペプチド」（以下、本発明の部分ペプチドと呼ぶこともある。）としては、例えば、本発明の蛋白質の細胞外領域中の任意の領域（例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域から任意に選択される領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３７の領域から任意に選択される領域、配列番号５で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜４２の領域から任意に選択される領域または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１３２の領域から任意に選択される領域を含むポリペプチド）および、本発明の蛋白質の細胞内領域中の任意の領域（例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１５６〜２４８の領域から任意に選択される領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１６１〜２５３の領域から任意に選択される領域、配列番号４で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸６６〜１５８の領域から任意に選択される領域または配列番号６で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸１５６〜１７６の領域から任意に選択される領域など）などが挙げられる。ここで、「任意に選択される領域」とは、例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは２０個以上、より好ましくは５０個以上、最も好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有する領域などが挙げられる。

【0047】

また、本発明の部分ペプチドには、そのアミノ酸配列中の一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が欠失したもの、その一部のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が他のアミノ酸と置換したもの、そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜２個）が付加または挿入されたもの、およびそれらを組み合わせたアミノ酸配列を有するものも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が欠失、置換、付加または挿入されている場合、その位置は特に限定されない。
本発明の部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここで、エステルにおけるＲとしては、本発明の蛋白質について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。

【0048】

本発明の部分ペプチドには、上記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。

【0049】

本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、酸付加塩として、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられ、塩基付加塩として、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物（例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムおよび水酸化マンガン）との塩が用いられる。とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。

【0050】

本発明の蛋白質の部分ペプチドは、本発明に係る蛋白質へのリガンド結合を阻害する物質として、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療薬あるいは診断用および／または検査用試薬として有用である。さらに、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドは抗原として用いることにより、本発明の蛋白質または部分ペプチドに対する抗体の作製にも使用できる。

【0051】

［本発明のポリヌクレオチド］
本発明明細書において、「配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド」としては、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードする塩基配列を有するものであればいかなるものであってもよい。一つのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類知られており、例えば、ＰｈｅにはＴＴＴまたはＴＴＣ、ＬｅｕにはＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡまたはＣＴＧ、ＩｌｅにはＡＴＴ、ＡＴＣまたはＡＴＡ、ＭｅｔにはＡＴＧ、ＶａｌにはＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡまたはＧＴＧ、ＳｅｒにはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡまたはＴＣＧ、ＰｒｏにはＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡまたはＣＣＧ、ＴｈｒにはＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡまたはＡＣＧ、ＡｌａにはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧ、ＴｙｒにはＴＡＴまたはＴＡＣ、ＨｉｓにはＣＡＴまたはＣＡＣ、ＧｌｎにはＣＡＡまたはＣＡＧ、ＡｓｎにはＡＡＴまたはＡＡＣ、ＬｙｓにはＡＡＡまたはＡＡＧ、ＡｓｐにはＧＡＴまたはＧＡＣ、ＧｌｕにはＧＡＡまたはＧＡＧ、ＣｙｓにはＴＧＴまたはＴＧＣ、ＴｒｐにはＴＧＧ、ＡｒｇにはＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡまたはＣＧＧ、ＳｅｒにはＡＧＴまたはＡＧＣ、ＡｒｇにはＡＧＡまたはＡＧＧ、およびＧｌｙにはＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡまたはＧＧＧがそれぞれ対応しているので、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドには、各アミノ酸に対応する各コドンが任意に組み合わされたポリヌクレオチドが含まれる。以下、配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを「本発明のポリヌクレオチド」と呼ぶこともある。
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのいずれでもよい。

【0052】

本発明明細書において、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号９〜１２で表わされる塩基配列から選択される一つの塩基配列を有するＤＮＡ以外に、該ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の蛋白質と実質的に同じ性質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法（Molecular Cloning (Sambrook,J., Fritsch,E.F., Maniatis,T., Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)、Gene 10: 63 (1980)など）に従って行うことができる。ハイブリダイゼーション条件は温度、イオン強度、プライマー長などを適宜選択することによって決定できるが、通常、温度が高いほど、またイオン強度が低いほどストリンジェンシーが高まる。高ストリンジェントな条件としては、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ₄，７％ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液による６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。

【0053】

そのようなポリヌクレオチドとしては、少なくとも２０塩基、好ましくは５０塩基、より好ましくは１００塩基、さらに好ましくは全領域において、配列番号９〜１２で表わされる塩基配列から選択される一つの塩基配列を有するＤＮＡと、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡなどが挙げられる。

【0054】

本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡまたはその部分配列を有するＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡであり、さらに好ましくは配列番号９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡである。

【0055】

本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡまたはその部分配列を有するＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡであり、さらに好ましくは配列番号１０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡである。

【0056】

本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号５で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡまたはその部分配列を有するＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡであり、さらに好ましくは配列番号１１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡである。

【0057】

本発明のポリヌクレオチドのうち、配列番号６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとして好ましくは、配列番号１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡまたはその部分配列を有するＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号１２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡであり、さらに好ましくは配列番号１２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡである。

【0058】

本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを生産するための鋳型として使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のスクリーニングにも使用できる。
本発明のポリヌクレオチドは、公知の方法に従って、トランスジェニック動物、ノックアウト動物または本発明の蛋白質もしくは本発明に係る蛋白質の発現が低下した動物を作製するために使用することができる。

【0059】

本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドは、例えば、プライマーあるいはプローブとして使用することにより、本発明の蛋白質のｍＲＮＡを検出することができるので、免疫不全症、癌もしくは感染症あるいは自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の診断用および／または検査用のプライマーあるいはプローブとして用いることができる。このようなプライマーあるいはプローブは、それらを公知の方法に従い、酵素、蛍光物質、発光物質あるいは放射性同位元素などで標識することができる。

【0060】

本発明のポリヌクレオチドあるいは本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを生体内の細胞に導入し、癌、免疫不全症もしくは感染症あるいは自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患を予防および／または治療するための遺伝子治療にも使用できる。

【0061】

本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドには、いわゆる、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ(small interfering RNA)、リボザイムなどが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンスＤＮＡは、本発明のポリヌクレオチドの一部（好ましくはＤＮＡ）を上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することにより製造することができる。

【0062】

本発明のポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡは、本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、公知の方法(Nature 411: 494-498 (2001))に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。

【0063】

リボザイムは、公知の方法(TRENDS in Molecular Medicine 7: 221 (2001))に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。このようなアンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはリボザイムは、細胞中の本発明の蛋白質のレベルを下げることができるので、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療薬として有用である。

【0064】

本発明のポリヌクレオチドあるいは本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを、癌、免疫不全症もしくは感染症あるいは自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の予防および／または治療薬として使用する場合は、そのポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、定法に従って、ヒトや哺乳動物に投与することができる。そのようなポリヌクレオチドは、そのままであるいは細胞への導入を促進するための補助剤（例えば、リポソーム、ＨＶＪリポソームなど）などの担体とともに製剤化して用いることができる。

【0065】

本発明明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、当該分野における慣用略号に基づくものであり、例えば、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｌｙｓ（リジン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｐｒｏ（プロリン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｇｌｎ（グルタミン）などが挙げられる。また、アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

【0066】

［本発明の蛋白質に対する抗体］
本発明明細書において、配列番号３〜６で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と呼ぶことがある。）とは、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを認識する抗体であれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ニワトリ由来抗体、ウサギ由来抗体またはヤギ由来抗体のいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、完全型もしくは短縮型（例えば、F(ab')₂、Fab'、FabおよびFv断片など）抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。そのような抗体は、本発明の蛋白質の細胞外領域の部分ペプチドを抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。細胞外領域の部分ペプチドは、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。

【0067】

本発明の抗体として好ましくはモノクローナル抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体の短縮型抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体および完全ヒト型抗体であり、さらに好ましくはモノクローナル抗体の完全ヒト型抗体である。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体は、本発明の蛋白質を検出することができるので、免疫不全症、癌もしくは感染症あるいは自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の診断用および／または検査用試薬として用いることができる。

【0068】

［蛋白質またはポリペプチドの製造および精製方法］
本発明に係る蛋白質のアンタゴニストとして挙げられる当該蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチド、本発明のスクリーニング方法において使用される本発明に係る蛋白質の細胞外領域を含む蛋白質またはポリペプチドもしくはその細胞内領域を含む蛋白質またはポリペプチドならびに本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドは、公知のタンパク質発現法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって製造することができる。例えば、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチドを合成する方法、および
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法などが挙げられる。

【0069】

工業的には（３）に記載した方法が好ましいが、そのための一般的な技術として、例えばMolecular Cloning (Sambrook,J., Fritsch,E.F., Maniatis,T., Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel,F.M., John Wiley & Sons,Inc. (1989))に記載されるような標準技術を使用できる。

【0070】

遺伝子組み換え技術を用いて蛋白質またはペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟蛋白部分をコードするＤＮＡの５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株など）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とする蛋白質またはペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチドなど）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とする蛋白質またはペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとの融合蛋白質を生産することもできる。

【0071】

また、酵母で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードするＤＮＡを適当なプロモーター（例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなど）の下流に接続し、酵母で機能するベクター（例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ^-、２０Ｂ−１２、シゾサッカロミセス・ポンベＮＣＹＣ１９１３、ピッキア・パストリスＫＭ７１など）を適当な培地で培養して、目的とする蛋白質またはペプチドを得ることができる。

【0072】

また、昆虫細胞で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードするＤＮＡを適当なプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなど）の下流に接続し、昆虫細胞で機能するウイルスベクターに挿入して発現ベクターを作製する。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｆ細胞）が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（ＢｍＮ細胞）などが用いられる。Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞(ATCC CRL1711)、Ｓｆ２１細胞(In Vivo 13: 213-217 (1977))が用いられる。昆虫としては、カイコの幼虫などが用いられる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology 6: 47-55 (1988)に記載の方法に従って行うことができる。

【0073】

また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクターなど）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーターなど）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞、サルＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ＮＳ０細胞など）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、本発明の蛋白質または部分ペプチドが発現される。さらに、その他のポリペプチド、例えば、抗体の定常領域（Ｆｃ部分）をコードするｃＤＮＡ断片と連結することによって、融合蛋白質を生産することもできる。

【0074】

また、遺伝子組み換え技術を用いて蛋白質またはペプチドを生産する方法として、無細胞合成系(Sambrook J., Molecular Cloning 2ed. (1989))も利用可能である。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、公知の方法、例えば、
（i）M. Bodanszky, M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)、
（ii）Schroeder, Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)、
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)（1975）、
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 １、蛋白質の化学IV，205，(1977)、
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻，ペプチド合成，広川書店に記載された方法に従って行われる。

【0075】

以上のようにして得られた蛋白質または部分ペプチドは、一般的な生化学的方法、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点沈殿、ゲル濾過、限外濾過などによって単離精製することができる。
また、本発明の蛋白質または部分ペプチドを他の蛋白質あるいはタグ（抗体の定常領域、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ＦＬＡＧタグ、ヘキサヒスチジンタグなど）との融合蛋白質として発現させることも可能である。融合蛋白質は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製および／あるいは適当なプロテアーゼ（例えば。エンテロカイネース、トロンビンなど）による切り出しが可能であり、効率よく精製できる利点がある。

【0076】

［ポリヌクレオチドの取得または製造方法］
本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の取得ないし製造方法および精製法あるいは実施例に記載の方法によって取得ないし製造することができる。例えば、化学合成によって、または本発明の蛋白質または部分ペプチドの一部をコードする合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅することによって、あるいは本発明の蛋白質または部分ペプチドの一部をコードする合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法によって得ることができる。

【0077】

本発明の蛋白質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ法あるいはハイブリダイゼーション法によって取得するために使用するヒト組織あるいは細胞としては、脾臓、リンパ節、骨髄、白血球、単球、Ｂ細胞などが挙げられる。標準的な遺伝子組み換え技術により上記組織あるいは細胞からｍＲＮＡを取り出しｃＤＮＡライブラリーを作製する。配列番号７〜１２で表わされる塩基配列から選択される一つの塩基配列に基づき合成した特異的プローブを用いて該ライブラリーをスクリーニングし目的のｃＤＮＡを得ることができる。あるいは、配列番号７〜１２で表わされる塩基配列から選択される塩基配列に基づいて、目的とする塩基配列を増幅するためのセンスおよびアンチセンスプライマーを合成し、該ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行い、目的のｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは自動サーマルサイクラーを用いて実施するのがよく、その反応は、耐熱性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑなど）、鋳型ＤＮＡおよびプライマーの存在下、ＤＮＡの変性（例えば、９８℃，１０〜３０秒）、プライマーのアニーリング（例えば、５６℃，３０秒〜１分）、および４種類の基質（ｄＮＴＰ）の共存下での伸長反応（例えば、７２℃，３０秒〜１０分）を１サイクルとして約２５〜４０サイクル実施し、さらに７０〜７５℃で５〜１５分加熱することによって行うことができる。また、最近では、ヒトの種々の組織のｃＤＮＡライブラリーが市販されており、これらを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning (Sambrook,J., Fritsch,E.F., Maniatis,T., Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)またはGene 10: 63 (1980)に記載の方法に従って行うことができる。このようにして得られたＤＮＡは、該ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、必要量得ることができる。

【0078】

［抗体の取得または製造方法］
本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドに対する抗体または本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体は、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質もしくはポリペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドのそれぞれを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものがある。

【0079】

抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチド、本発明の蛋白質の部分ペプチドまたは本発明に係る蛋白質あるいは本発明の蛋白質を発現している細胞（例えば、強制発現細胞など）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をクローニングする。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定はされないが、細胞融合に使用する親細胞（ミエローマ細胞）との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどが使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。上記免疫細胞と融合されるミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株が使用可能である。免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、例えば、ミルスタインらの方法(Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981))などに準じて行うことができる。得られた融合細胞は、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するまで、通常数日から数週間継続される。次に、通常の限界希釈法を実施し、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を精製することによって抗体を取得することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。

【0080】

ポリクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジなど）に、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドあるいは本発明の蛋白質または部分ペプチドを感作抗原として免疫し、抗血清を回収し、精製する、通常の方法により製造することができる。精製は、一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより行うことができる。

【0081】

また、遺伝子工学的手法を用いても抗体を得ることができる。すなわち、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチド、本発明の蛋白質の部分ペプチド、または本発明に係る蛋白質あるいは本発明の蛋白質を発現している細胞（例えば、強制発現細胞など）を感作抗原として免疫した動物の脾細胞、リンパ球、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを取得し、これを鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを作製する。感作抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養上清から一般的な生化学的方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより目的とする抗体を精製することができる。抗体を医薬として用いるには、免疫原性の低いヒト化抗体あるいはヒト型抗体が好ましい。ヒト化抗体は、上記モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的手法により作製することができる(Method in Enzymology 203: 99-121(199))。ヒト型抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス(Nat.Genet. 15: 146-156 (1997))を免疫することにより取得できる。

【0082】

本発明に係る蛋白質に対するアンタゴニストであって、本発明に係る蛋白質の細胞外領域中の任意の領域を含む蛋白質またはポリペプチドに対する抗体は、以下の方法により選別することができる。すなわち、本発明に係る蛋白質と共発現する活性化受容体（例えば、ＢＣＲなど）に対する抗体または本発明に係る蛋白質のリガンドをアガロースビーズなどの担体あるいは培養プレートに一緒に固定する。本発明に係る蛋白質を発現している細胞（例えば、Ｂ細胞、単球、強制発現細胞など）を上記固定化担体あるいはプレートに添加して刺激する際に、被験抗体を同時に添加する。細胞内Ｃａ²⁺濃度、本発明に係る蛋白質の細胞内チロシン残基のリン酸化、本発明に係る蛋白質へのホスファターゼの結合、Ｅｒｋ２などのシグナル伝達分子のリン酸化、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）産生量を指標に、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質の抑制を、減弱ないし阻害するかどうかを評価する。

【0083】

本発明に係る蛋白質に対するアゴニスト抗体は以下の方法により選別することができる。すなわち、被験抗体をアガロースビーズなどの担体あるいは培養プレートに一緒に固定する。本発明の蛋白質を発現している細胞（例えば、Ｂ細胞、単球、強制発現細胞など）を上記固定化担体あるいはプレートに添加し、細胞内Ｃａ²⁺濃度、本発明の蛋白質の細胞内チロシン残基のリン酸化、本発明に係る蛋白質へのホスファターゼの結合、Ｅｒｋ２などのシグナル伝達分子のリン酸化、またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）産生量を指標に、細胞内シグナル伝達に対する本発明に係る蛋白質の抑制を、保持ないし増強するかどうかを評価する。

【0084】

［医薬品への適用］
本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物は、免疫賦活活性を有することから、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療に用いることができる。

【0085】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により、その予防および／または治療が期待できる癌または腫瘍として、例えば、舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫（メラノーマ）、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌、原発性肺癌、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド、睾丸腫瘍、前立腺癌、乳癌（例えば、乳頭腺癌、面疱癌、粘液癌、髄様癌、小葉癌、硬癌肉腫、転移腫瘍）、乳房ペーシジェット病、乳房肉腫、骨腫瘍、甲状腺癌、胃癌、肝癌、急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫（例えば、リンパ肉腫、細網肉腫、ホジキン病など)、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症、小児性白血病、食道癌、胃癌、胃・大腸平滑筋肉腫、胃・腸悪性リンパ腫、膵・胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、原発性肝癌（例えば、肝細胞癌、胆管細胞癌など）、肝芽腫、子宮上皮内癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮腺癌、子宮腺扁平上皮癌、子宮体部腺類癌、子宮肉腫、子宮癌肉腫、子宮破壊性奇胎、子宮悪性絨毛上皮腫、子宮悪性黒色腫、卵巣癌、中胚葉性混合腫瘍、腎癌、腎盂移行上皮癌、尿管移行上皮癌、膀胱乳頭癌、膀胱移行上皮癌、尿道扁平上皮癌、尿道腺癌、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫、悪性中皮癌、転移性腺癌、転移性扁平上皮癌、転移性肉腫、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫など）などが挙げられる。

【0086】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により、その予防および／または治療が期待できる免疫不全疾患としては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス感染症による後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）（例えば、カンジダ食道炎、カリニ肺炎、トキソプラズマ症、結核、マイコバクテリウム‐アビウム複合体感染症、クリプトスポリジウム症、クリプトコッカス髄膜炎、サイトメガロウイルス感染症あるいは進行性多巣性白質脳症などの日和見感染症など）、重症疾患（例えば、癌、再生不良性貧血、白血病、骨髄線維症、腎不全、糖尿病、肝疾患もしくは脾疾患）に伴う免疫不全および原発性免疫不全症候群などが挙げられる。

【0087】

ウイルスは、感染宿主の免疫防御から逃れるための１つの方法として、免疫細胞の共役抑制因子を利用していると考えられている(Journal Experimental Medicine 191, 11: 1987-1997 (2000))。ウイルス感染は、このようなウイルスのエスケープ機能に一部起因しており、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与によって、免疫細胞のウイルスに対する免疫反応を高めることができると考えられる。

【0088】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により、その予防および／または治療が期待できる感染症としては、例えば、ヒト肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ａ型肝炎およびＥ型肝炎）、ヒトレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスまたはヒトＴリンパ向性ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ１およびＨＴＬＶ２）、単純ヘルペスウイルス１型もしくは２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ヒトヘルペスウイルス６など）、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、おたふくウイルス、インフルエンザウイルス、風邪ウイルス（例えば、アデノウイルス、エンテロウイルスおよびライノウイルスなど）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を発症するウイルス、エボラウイルスおよび西ナイルウイルスの感染症などが挙げられる。
その他、例えば、病原性原生動物（例えば、トリパノソーマ、マラリアおよびトキソプラズマ）、細菌（例えば、マイコバクテリウム、サルモネラおよびリステリア）および真菌（例えば、カンジダ）による感染などに対しても有効であると考えられる。

【0089】

本発明に係る蛋白質のアゴニストは、免疫抑制活性を有することから、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾患から選択される疾患の予防および／または治療に用いることができる。

【0090】

本発明に係る蛋白質のアゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により、その予防および／または治療が期待できる自己免疫疾患として、例えば、関節炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性糸球体腎炎、自己免疫性膵島炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性卵巣炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、ベーチェット病、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、過敏性血管炎、結節性動脈周囲炎、橋本病、粘液水腫、バセドウ病、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、悪性貧血、重症筋無力症、脱髄疾患、大動脈炎症群、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、膠原病（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、汎発性強皮症、全身性進行性硬化症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎およびリウマチ熱など）、ギラン・バレー症候群、多腺性自己免疫症候群II型、原発性胆汁性肝硬変、尋常性白斑および１型糖尿病などが挙げられる。さらに、ループス抗凝固因子が高値な疾患も挙げられる。ここで、ループス抗凝固因子が高値な疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、動脈血栓症（例えば、脳梗塞など）、静脈血栓症、習慣性流産、血小板減少症および抗リン脂質抗体症候群などが挙げられる。

【0091】

本発明に係る蛋白質のアゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により、その予防および／または治療が期待できる臓器移植後の拒絶反応として、例えば、腎移植、肝移植、心移植および／または肺移植後の拒絶反応、骨髄移植における拒絶反応および移植片対宿主病などが挙げられる。
本発明に係る蛋白質のアゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により、その予防および／または治療が期待できるアレルギー性疾患として、例えば、喘息、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎（例えば、花粉症など）、アレルギー性結膜炎（例えば、花粉症など）、アレルギー性胃腸炎、アナフィラキシーショック、食物アレルギーなどが挙げられる。

【0092】

本発明に係る蛋白質のアゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与により、その予防および／または治療が期待できる炎症性疾患として、例えば、皮膚炎（例えば、接触性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎など）、大腸炎（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病など）、血管炎（例えば、高安動脈炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群（アレルギー性肉芽腫性血管炎）、アレルギー性皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、過敏性血管炎、血管炎症候群、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）、結節性血管炎など）、関節炎（例えば、リウマチ関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、結核性関節炎、化膿性関節炎、乾癬性関節炎、膝内症、特発性骨壊死症および骨関節炎など）、肝炎（例えば、ウイルス性肝炎および自己免疫性肝炎など）、腎炎（例えば、急性糸球体腎炎、慢性腎炎、急速進行性腎炎症候群、溶連菌感染後急性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、メサンギウム増殖性糸球体腎炎（ＩｇＡ腎症）および間質性腎炎など）、胃炎（例えば、急性感染性胃炎およびアレルギー性胃炎、慢性胃炎など）、膵炎、腸炎、喉頭炎、神経炎などが挙げられる。

【0093】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストは、
（１）本発明の予防剤または治療剤の予防および／または治療効果の補完および／または増強、
（２）本発明の予防剤または治療剤の動態、吸収改善、投与量の低減および／または
（３）本発明の予防剤または治療剤の副作用の軽減のために他の薬剤と組み合わせて、併用剤として投与してもよい。

【0094】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストと他の薬剤の併用剤は、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与してもよく、また別々の製剤にして投与する形態をとってもよい。この別々の製剤にして投与する場合には、同時投与および時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストを先に投与し、他の薬剤を後に投与してもよいし、他の薬剤を先に投与し、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストを後に投与してもよく、それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。

【0095】

前記他の薬剤は、低分子化合物であってもよく、また高分子の蛋白、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子）、アンチセンス、デコイ、抗体であるか、またはワクチンなどであってもよい。他の薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストと他の薬剤の配合比は、投与対象の年齢、体重、投与方法、投与時間、対象疾患もしくは症状またはそれらの組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニスト１質量部に対し、他の薬剤を０．０１〜１００質量部用いればよい。他の薬剤は任意の２種以上を適宜の割合で組み合わせて投与してもよい。また、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストの予防および／または治療効果を補完および／または増強する他の薬剤には、上記したメカニズムに基づいて、現在までに見出されているものだけでなく今後見出されるものも含まれる。

【0096】

上記併用剤により、予防および／または治療効果を奏する疾患は特に限定されず、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストの予防および／または治療効果を補完および／または増強する疾患であればよい。

【0097】

癌に対する化学療法および放射線療法は、リンパ球の増殖を激しく減少させるという副作用が不可避である。本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物の投与は、減少したリンパ球細胞を刺激ないし増殖させる効果を示すと共に、通常の化学療法に付随する激烈な副作用を最小限に抑制することができる。また、放射線療法についても同様である。また、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストまたはそれを含んでなる医薬組成物との併用によって、化学療法剤の用量または照射放射線量を通常使用される用量あるいは照射量から減少させることができる。

【0098】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストは、既存の化学療法薬と併用あるいは合剤化することができる。そのような化学療法薬として、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア薬、代謝拮抗薬、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害薬、ホルモン療法薬、ホルモン拮抗薬、アロマターゼ阻害薬、Ｐ糖蛋白阻害薬、白金錯体誘導体、その他免疫療法薬およびその他の抗癌薬が挙げられる。さらに、癌治療補助薬である白血球（好中球）減少症治療薬、血小板減少症治療薬、制吐薬、癌性疼痛治療薬と併用あるいは合剤化できる。

【0099】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストは、その他の免疫賦活物質と併用あるいは合剤化することができる。そのような免疫賦活物質としては、例えば、各種サイトカインや腫瘍抗原などが挙げられる。免疫反応を刺激するサイトカインとしては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、β、γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−１２などが挙げられる。また、Ｂ７リガンド誘導体、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＴＬＡ−４抗体も免疫反応を高めることができる。

【0100】

癌抗原の投与も、癌細胞に対する免疫担当細胞の特異的免疫反応を高めることができ、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストとの併用によって、付加的あるいは相乗的な増強を与えることができる。癌抗原は、遺伝子が明らかなものについては精製タンパク質として、また不明なものについては、癌細胞自体の溶解物として調製することができる。そのような癌抗原として、例えば、悪性黒色腫のＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３由来のＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２拘束ペプチド、ＭＡＲＴ−１およびｇｐ１００が挙げられる。また、乳癌や卵巣癌のＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドや腺癌のＭＵＣ−１ペプチド、さらに、転移性癌のＮＹ−ＥＳＯ−１も挙げることができる。

【0101】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストは、抗ウイルス薬、抗生物質製剤、抗菌薬、内臓真菌症治療薬と併用あるいは合剤化することができる。
抗ウイルス薬としては、例えば、抗ＨＩＶ薬、抗インフルエンザウイルス薬、抗ヘルペスウイルス薬、インターフェロン−αもしくはβおよび各種免疫グロブリンが挙げられる。

【0102】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストは、ウイルスもしくは病原体のワクチンと併用あるいは共に製剤化することができる。そのようなワクチンとしては、例えば、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、日本脳炎ワクチン、ＢＣＧワクチン、３種混合ワクチン、おたふくワクチン、水痘ワクチン、インフルエンザワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチンおよびコレラワクチンが挙げられる。ここで、抗ＨＩＶ薬として、例えば、逆転写酵素阻害薬（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、３ＴＣおよびｄ４Ｔなど）、プロテアーゼ阻害薬（例えば、メシル酸サキナビル、リトナビル、メシル酸ネルフィナビル、アンプレナビル、メシル酸デラビルジン、サキナビルおよびロピナビル／リトナビルなど）、またはＣＣＲ５受容体拮抗薬が挙げられる。抗インフルエンザウイルス薬としては、例えば、インフルエンザワクチン、リン酸オセルタミビル、ザナミビル水和物および塩酸アマンタジンなどが挙げられる。

【0103】

本発明に係る蛋白質のアゴニストの自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の予防および／または治療効果の補完および／または増強のための他の薬剤としては、例えば、ステロイド薬、非ステロイド系抗炎症薬、免疫抑制薬、抗アレルギー薬（例えば、化学伝達物質遊離抑制薬、抗ヒスタミン薬、トロンボキサン合成酵素阻害薬、トロンボキサン拮抗薬およびＴｈ２サイトカイン阻害薬など）、ホスホジエステラーゼ阻害薬（ＰＤＥ４）およびメディエーター遊離抑制薬などが挙げられる。

【0104】

ステロイド薬のうち、外用薬としては、例えば、プロピオン酸クロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、フルオシノニド、フランカルボン酸モメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ジフルプレドナート、プデソニド、吉草酸ジフルコルトロン、アムシノニド、ハルシノニド、デキサメタゾン、プロピオン酸デキサメタゾン、吉草酸デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、プロピオン酸デプロドン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、フルオシノロンアセトニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、ピバル酸フルメタゾン、プロピオン酸アルクロメタゾン、酪酸クロベタゾン、プレドニゾロン、プロピオン酸ペクロメタゾンおよびフルドロキシコルチドなどが挙げられる。

【0105】

ステロイド薬のうち、内服薬あるいは注射剤としては、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ブチル酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酢酸ハロプレドン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメタゾン、酢酸パラメタゾンおよびベタメタゾンなどが挙げられ、吸入剤としては、例えば、プロピオン酸ベクロメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ブデソニド、フルニソリド、トリアムシノロン、ST-126P、シクレソニド、デキサメタゾンパロミチオネート、モメタゾンフランカルボネート、プラステロンスルホネート、デフラザコート、メチルプレドニゾロンスレプタネートおよびメチルプレドニゾロンナトリウムスクシネートなどが挙げられる。

【0106】

非ステロイド抗炎症薬としては、例えば、アスピリン、ロキソニン、ジクロフェナク、セレコキシブ、チアプロフェン酸、アルミノプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、ザルトプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、プラノプロフェン、フェンチアザク、ドロキシカム、イブプロフェン、アセクロフェナク、アンフェナク・ナトリウム、テノキシカム、オキサプロジン、ピロキシカム、エモルファゾン、トルフェナム酸、インドメタシンファルネシル、マレイン酸プログルメタシン、スリンダク、モフェゾラク、エトドラク、ロナゾラク・カルシウム、アンピロキシカム、メサラジン、デフラザコート、ニメスリド、エトリコキシブ、ケトロラック・トロメタモール、パレコキシブ、ロベンザリット・二ナトリウム、オーラノフィン、ロキソプロフェン・ナトリウム、ブシラミン、アクタリット、けい皮酸ピロキシカム、ナブメトン、サラゾスルファピリジン、ロルノキシカム、メロキシカム、ジアセレイン、ロフェコキシブおよびバルデコキシブなどが挙げられる。

【0107】

塩基性非ステロイド抗炎症薬としては、例えば、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、エピリゾール、エモルファゾンなどが挙げられる。
免疫抑制薬としては、例えば、アザチオプリン、アスコマイシン、エベロリムス、オルソクローンＯＫＴ３、コルチコステロイド、サラゾスルファピリジン、シクロスポリン、シクロフォスファミド、シロリムス、タクロリムス水和物、デオキシスパーガリン、ブシラミン、プレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル、ミゾリビン、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、レフルノミドおよび抗ヒトリンパ球グロブリンなどが挙げられる。

【0108】

抗アレルギー薬のうち、化学伝達物質遊離抑制薬としては、例えば、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラスト、アンレキサノクス、レピリナスト、イブジラスト、ペミロラストカリウム、ダザノラスト、ネドクロミル、クロモグリカートおよびイスラパファントなどが挙げられる。

【0109】

抗アレルギー薬のうち、抗ヒスタミン薬としては、例えば、ジフェンヒドラミン、塩酸ジフェニルピラリン、テオクル酸ジフェニルピラリン、フマル酸クレマスチン、ジメンヒドリナート、ｄｌ−マレイン酸クロルフェニラミン、ｄ−マレイン酸クロルフェニラミン、塩酸トリプロリジン、塩酸プロメタジン、酒石酸アリメマジン、塩酸イソチペンジル、塩酸ホモクロルシクリジン、ヒドロキシジン、塩酸シプロヘプタジン、塩酸レボカバスチン、アステミゾール、ベポタスチン、デスロラタジン、TAK-427、ZCR-2060、NIP-530、モメタゾンフロエート、ミゾラスチン、BP-294、アンドラスト、オーラノフィンおよびアクリバスチンなどが挙げられる。

【0110】

抗アレルギー薬のうち、トロンボキサン合成酵素阻害薬としては、例えば、塩酸オザグレルおよびイミトロダストナトリウムなどが挙げられ、トロンボキサン拮抗薬としては、例えば、セラトロダスト、ラマトロバン、ドミトロバンカルシウム水和物、KT-2-962などが挙げられ、Ｔｈ２サイトカイン阻害薬としては、例えば、トシル酸スプラタストソナチモド、T-614、SR-31747などが挙げられる。

【0111】

ホスホジエステラーゼ阻害薬（ＰＤＥ４）としては、例えば、シロミラスト、ロフルミラスト、アロフィリン、アチゾラム、シパムフィリン、ロリプラム、OPC-6535、ONO-6126、IC-485、AWD-12-281、CC-10004、CC-1088、KW-4490、Iirimilast、ZK-117137、YM-976、BY-61-9987、CC-7085、CDC-998、MEM-1414、ND-1251、Bay19-8004、D-4396、PD-168787、NIK-616、SCH-351591、V-11294Aなどが挙げられる。

【0112】

メディエーター遊離抑制薬としては、例えば、アンレキサノクス、イブジラスト、クロモグリク酸ナトリウム、ダザノラスト、トラニラスト、ペミロラストカリウム、レピリナストなどが挙げられる。

【0113】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストの活性成分を医薬として用いる場合、単独あるいは薬理的に許容される各種製剤補助剤と混合して、医薬組成物として投与することができる。一般的には、目的に応じて、経口投与、静脈内投与、局所投与、経皮投与など、使用に適した製剤調製物の形態で投与される。

【0114】

そのような成分の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間などにより異なるが、通常、成人一人あたり、１回につき、１ｎｇから10000ｍｇの範囲で、数日に１回、３日に１回、２日に１回、１日１回から数回経口投与されるか、または成人一人あたり、１回につき、１ｎｇから1000ｍｇの範囲で、数日に１回、３日に１回、２日に１回、１日１回から数回非経口投与（好ましくは、静脈内投与）されるか、または１日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。

【0115】

本発明に係る蛋白質のアンタゴニストあるいはアゴニストと他の薬剤の併用剤を投与する際には、経口投与のための内服用固形剤もしくは内服用液剤として、あるいは非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤もしくは吸入剤などとして用いられる。
経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤および顆粒剤などが含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。また錠剤には舌下錠、口腔内貼付錠および口腔内速崩壊錠などが含まれる。

【0116】

このような内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質はそのままか、または賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロースまたはデンプンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（例えば、繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、安定剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸など）などと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなど）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。

【0117】

舌下錠は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質に賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカまたはデンプンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウムまたは繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、膨潤剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カーボポール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キサンタンガムまたはグアーガムなど）、膨潤補助剤（例えば、グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、グリシン、グルタミン酸またはアルギニンなど）安定剤、溶解補助剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸またはアスパラギン酸など）、香味料（例えば、オレンジ、ストロベリー、ミント、レモンまたはバニラなど）などと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなど）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物を加えることもできる。口腔内貼付錠は公知の方法に準じて調製される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質に賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカまたはデンプンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウムまたは繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、付着剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カーボポール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キサンタンガムまたはグアーガムなど）、付着補助剤（例えば、グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、グリシン、グルタミン酸またはアルギニンなど）安定剤、溶解補助剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸またはアスパラギン酸など）、香味料（例えば、オレンジ、ストロベリー、ミント、レモンまたはバニラなど）などと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなど）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加物を加えることもできる。口腔内速崩壊錠は公知の方法に準じて調製される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質をそのまま、あるいは原末もしくは造粒原末粒子に適当なコーティング剤（例えば、エチルセルロース、ヒドキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはアクリル酸メタクリル酸コポリマーなど）、可塑剤（例えば、ポリエチレングリコールまたはクエン酸トリエチルなど）を用いて被覆を施した活性物質に賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、コロイダルシリカまたはデンプンなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウムまたは繊維素グリコール酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムなど）、分散補助剤（例えば、グルコース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース、トレハロース、リン酸塩、クエン酸塩、ケイ酸塩、グリシン、グルタミン酸またはアルギニンなど）安定剤、溶解補助剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルタミン酸またはアスパラギン酸など）、香味料（例えば、オレンジ、ストロベリー、ミント、レモンまたはバニラなど）などと混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなど）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。また、必要に応じて常用される防腐剤、抗酸化剤、着色剤または甘味剤などの添加物を加えることもできる。

【0118】

経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエリキシル剤などを含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤（例えば、精製水、エタノールまたはそれらの混液など）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤または緩衝剤などを含有していてもよい。

【0119】

非経口投与のための外用剤の剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾル剤、点眼剤および点鼻剤などが含まれる。これらはひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、公知の方法または通常使用されている処方により調製される。

【0120】

軟膏剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に研和、または溶融させて調製される。軟膏基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸または高級脂肪酸エステル（例えば、アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステルまたはオレイン酸エステルなど）、ロウ類（例えば、ミツロウ、鯨ロウまたはセレシンなど）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステルなど）、高級アルコール（例えば、セタノール、ステアリルアルコールまたはセトステアリルアルコールなど）、シリコン油（例えば、ジメチルポリシロキサンなど）、炭化水素類（例えば、親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリンまたは流動パラフィンなど）、グリコール類（例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールまたはマクロゴールなど）、植物油（例えば、ヒマシ油、オリーブ油、ごま油またはテレピン油など）、動物油（例えば、ミンク油、卵黄油、スクワランまたはスクワレンなど）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるものが単独でまたは２種以上を混合して用いられる。さらに、保湿剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。

【0121】

ゲル剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させて調製される。ゲル基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、低級アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロピルアルコールなど）、ゲル化剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはエチルセルロースなど）、中和剤（例えば、トリエタノールアミンまたはジイソプロパノールアミンなど）、界面活性剤（例えば、モノステアリン酸ポリエチレングリコールなど）、ガム類、水、吸収促進剤およびかぶれ防止剤から選ばれるものが単独でまたは２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。

【0122】

クリーム剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融または乳化させて製造される。クリーム基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸エステル、低級アルコール、炭化水素類、多価アルコール（例えば、プロピレングリコールまたは１，３−ブチレングリコールなど）、高級アルコール（例えば、２−ヘキシルデカノールまたはセタノールなど）、乳化剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類または脂肪酸エステル類など）、水、吸収促進剤およびかぶれ防止剤から選ばれるものが単独でまたは２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。

【0123】

湿布剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、練合物とし支持体上に展延塗布して製造される。湿布基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、増粘剤（例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、デンプン、ゼラチンまたはメチルセルロースなど）、湿潤剤（例えば、尿素、グリセリンまたはプロピレングリコールなど）、充填剤（例えば、カオリン、酸化亜鉛、タルク、カルシウムまたはマグネシウムなど）、水、溶解補助剤、粘着付与剤およびかぶれ防止剤から選ばれるものが単独でまたは２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。

【0124】

貼付剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を基剤に溶融させ、支持体上に展延塗布して製造される。貼付剤用基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高分子基剤、油脂、高級脂肪酸、粘着付与剤およびかぶれ防止剤から選ばれるものが単独でまたは２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。

【0125】

リニメント剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物を水、アルコール（例えば、エタノールまたはポリエチレングリコールなど）、高級脂肪酸、グリセリン、セッケン、乳化剤および懸濁化剤などから選ばれるもの単独または２種以上に溶解、懸濁または乳化させて製造される。さらに、保存剤、抗酸化剤または着香剤などを含んでいてもよい。

【0126】

噴霧剤、吸入剤、およびスプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば、米国特許第2,868,691号および同第3,095,355号に詳しく記載されている。
非経口投与のための注射剤としては、すべての注射剤を含み、点滴剤をも包含する。例えば、筋肉への注射剤、皮下への注射剤、皮内への注射剤、動脈内への注射剤、静脈内への注射剤、腹腔内への注射剤、脊髄腔への注射剤および静脈内への点滴剤などを含む。

【0127】

非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類などおよびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸またはポリソルベート８０（登録商標）など）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤または保存剤などを含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって調製される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
非経口投与のための点眼剤には、点眼液、懸濁型点眼液、乳濁型点眼液、用時溶解型点眼液および眼軟膏が含まれる。

【0128】

これらの点眼剤は公知の方法に準じて製造される。例えば、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。点眼剤の溶剤としては、例えば、滅菌精製水、生理食塩水、その他の水性溶剤または注射用非水性用剤（例えば、植物油など）などおよびそれらの組み合わせが用いられる。点眼剤は、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、濃グリセリンなど）、緩衝化剤（例えば、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなど）、界面活性化剤（例えば、ポリソルベート８０（商品名）、ステアリン酸ポリオキシル４０、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、安定化剤（例えば、クエン酸ナトリウムまたはエデト酸ナトリウムなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムまたはパラベンなど）などを必要に応じて適宜選択して含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか、無菌操作法によって調製される。また無菌の固形剤、例えば、凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の滅菌精製水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。

【0129】

非経口投与のための吸入剤としては、エアロゾル剤、吸入用粉末剤または吸入用液剤が含まれ、当該吸入用液剤は用時に水または他の適当な媒体に溶解または懸濁させて使用する形態であってもよい。
これらの吸入剤は公知の方法に準じて製造される。
例えば、吸入用液剤の場合には、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムまたはパラベンなど）、着色剤、緩衝化剤（例えば、リン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムなど）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウムまたは濃グリセリンなど）、増粘剤（例えば、カリボキシビニルポリマーなど）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。

【0130】

吸入用粉末剤の場合には、滑沢剤（例えば、ステアリン酸およびその塩など）、結合剤（例えば、デンプンまたはデキストリンなど）、賦形剤（例えば、乳糖またはセルロースなど）、着色剤、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウムまたはパラベンなど）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。
吸入用液剤を投与する際には通常噴霧器（例えば、アトマイザーまたはネブライザー）が使用され、吸入用粉末剤を投与する際には通常粉末薬剤用吸入投与器が使用される。
非経口投与のためその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される直腸内投与のための坐剤および腟内投与のためのペッサリーなどが含まれる。

【実施例】

【0131】

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

【0132】

実施例１：ヒトＢＩＲ１の発現プロファイル
ヒト正常組織、血液細胞および細胞株におけるＢＩＲ１のｍＲＮＡ発現を調べるために、ＢＩＲ１特異的プライマーを設計し、TaKaRa Ex Taq（TaKaRa社製）を用いてＰＣＲを行った。この時使用したプライマーの配列を以下に示す。
５’−ＧＡＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＧＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲは、最初９６℃下で１分間保持し、続いて、９８℃下で１０秒間、５６℃下で３０秒間、７２℃下で３０秒間の温度操作を３５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保持して行った。
ヒト正常組織および血液細胞の発現解析には、Human MTC Panel I、Human MTC Panel II、Human Immune System MTC Panel、Human Blood Fractions MTC Panel（BD Clontech社製）を用い、ヒト細胞株の発現解析には常法に従い全ＲＮＡから逆転写反応にて作製したｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド（Ethidium bromide）染色し、BioDoc-It System（UVP社製）にて画像データを得た。その結果を図１に示す。
ＢＩＲ１は脾臓、リンパ節などの免疫系組織およびＣＤ１４陽性細胞（単球）、ＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）で高発現していた。また、ヒト細胞株では、ＢＩＲ１は単球分化能を有するＫ５６２、ＨＬ−６０、単球系細胞株であるＵ９３７、ＴＨＰ−１、Ｂ細胞株であるＲａｊｉ、ＣＣＲＦ−ＳＢおよびＦＬＥＢ−１４−１４で発現が確認された。

【0133】

実施例２：各種炎症刺激によるヒトＢＩＲ１の発現
ヒト単球系細胞株を用い、各種炎症刺激によるＢＩＲ１の発現を検討した。ＴＨＰ−１細胞およびＵ９３７細胞を１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／２ｍＬでリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（１μｇ／ｍＬ）、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）あるいはＬＰＳ＋ＩＦＮ−γ（１μｇ／ｍＬ＋１００ｎｇ／ｍＬ）で１、３、８、２４、４８および１２０時間刺激し、全ＲＮＡを回収した。ＢＩＲ１に特異的なプライマー；５’−ＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣ−３’（配列番号１５）および５’−ＧＡＧＴＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧ−３’（配列番号１６）とQuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit（QIAGEN社製）を用いて、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems社製）によりＢＩＲ１のＲＮＡを定量した。ＰＣＲの反応は、最初５０℃下で３０分間保持し、続いて９５℃下で１５分間保持した。次に、９４℃下で１０秒間、５６℃下で３０秒間、７２℃下で１分間の温度操作を４５回繰り返して行った。その結果、図２に示すように、ＢＩＲ１の遺伝子発現はＴＨＰ−１細胞ではＴＮＦ−α以外の刺激で８〜４８時間以降に上昇し、Ｕ９３７細胞ではいずれの刺激でも２４〜４８時間以降で上昇した。

【0134】

実施例３：自己免疫疾患患者由来の血液細胞におけるＢＩＲ１の発現
Autoimmune Disease Profiling Array（BD Clontech社製）を用いて、自己免疫疾患患者由来の各種血液細胞におけるＢＩＲ１の発現を調べた。ヒトＢＩＲ１部分長ｃＤＮＡ断片を鋳型として、Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2（TaKaRa社製）を用いて［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（PerkinElmer社製）標識したＢＩＲ１特異的プローブを作製した。使用した部分長ｃＤＮＡ断片を配列番号１７に示す。
プローブ作製以降のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の操作は添付文書に従った。BAS2000（FUJIFILM社製）を用いて画像データを取得し、BAStation Ver.2.21のImage Analyzer IIにて画像データから各ドットのＰＳＬ（Photo-Stimulated Luminescence；放射線量と比例）値を求め、各サンプルにおけるＢＩＲ１の発現量を数値化した。統計解析は健常人に対してＷｉｌｃｏｘｏｎ（Mann-Whitney）ｔｅｓｔを実施した。その結果を図３に示す。
健常人と比較して、ループス抗凝固因子患者の単球、関節リウマチ、多発性硬化症および高安動脈炎患者のＢ細胞でＢＩＲ１の発現量は有意に増加していた。

【0135】

実施例４：ヒトＢＩＲ１スプライシングバリアントの同定
ヒトＣＤ１４陽性細胞（単球）およびＣＤ１９陽性細胞（Ｂ細胞）由来ｃＤＮＡ（Human Blood Fractions MTC Panel）（BD Clontech社製）を鋳型として、TaKaRa LA Taq（TaKaRa社製）を用いてＰＣＲを行った。設計したヒトＢＩＲ１に特異的なプライマーを以下に示す。
５’−ＡＴＧＴＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１８）
５’−ＴＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１９）
ＰＣＲは、最初９６℃下で１分間保持し、続いて、９８℃下で１０秒間、５６℃下で３０秒間、７２℃下で１分３０秒間の温度操作を３５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保持して行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後に単離し、Ｔ／Ａベクターにサブクローニングした。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）の添付文書に従い、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）にて各ｃＤＮＡ断片の配列を決定した。
その結果、既知のアイソフォーム（免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインが２個存在；ＢＩＲ１Ｌ）（配列番号１および２）以外に、新たにＣ末端側のＩｇドメインが欠失したアイソフォーム（ＢＩＲ１Ｓ１）（配列番号３）、Ｎ末端側のＩｇドメインが欠失したアイソフォーム（ＢＩＲ１Ｓ２）（配列番号４）、両方のＩｇドメインが欠失したアイソフォーム（ＢＩＲ１ΔＩｇ）（配列番号５）およびＢＩＲ１Ｓ１の細胞内領域の一部が欠失したアイソフォーム（ＢＩＲ１ΔＣｙｔ）（配列番号６）が同定された。Ｎ末端側のＩｇドメインは配列番号１に記載のアミノ酸配列中アミノ酸番号４１−１２２に、Ｃ末端側のＩｇドメインは配列番号１に記載のアミノ酸配列中アミノ酸番号１３８−２０３に相当する部分である。

【0136】

実施例５：マウスＦｃγＲＩＩＢ−ヒトＢＩＲ１キメラ安定発現細胞の作製
ＢＩＲ１が抑制性シグナルを伝達するか否かを検討した。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 13866-13871 (2001)やJ. Immunol. 162: 3168-3175 (1999)などで報告された方法に従い、以下の材料を作製した。マウスＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃＲ）の細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域６アミノ酸（アミノ酸番号１〜２５２）のＣ末端側にＢＩＲ１の細胞内領域（配列番号１のアミノ酸番号２５１〜３４３）を連結したＦｃＲ−ｈＢＩＲ１（ｗｔ）キメラ蛋白（配列番号２０）をコードするＤＮＡを、β−アクチンプロモーターの下流に挿入し、ＦｃＲキメラ蛋白発現ベクターを構築した。また、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製）を用いて、ＢＩＲ１の細胞内領域の６つのチロシン残基のすべてをフェニルアラニン残基に置換した変異体（ＦｃＲ−ｈＢＩＲ１（ＹＷＦ））（配列番号２１）の発現ベクターを作製した。これらのＦｃＲキメラ発現ベクターと、既知の抑制性レセプターであるヒトＫＩＲ２ＤＬ３のＦｃＲキメラ（ＦｃＲ−ｈＫＩＲ２ＤＬ３）（配列番号２２）発現ベクターをGene Pulser Xcell Electroporation System（BIO-RAD社製）を用いて、マウスＢ細胞株Ａ２０ＩＩＡ１．６（マウスＦｃγＲＩＩＢ欠損細胞株）（J.Immunol. 136: 348-356 (1986))に導入した。各導入細胞をＦＩＴＣ標識ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２）（BD Pharmingen社製）で染色後、FACSCalibur（BD Biosciences社製）にてＦｃＲキメラ蛋白の発現量を確認した。
図４に示すように、それぞれ同程度のＦｃＲキメラ蛋白を安定発現した細胞であった。

【0137】

実施例６：ヒトＢＩＲ１によるＢ細胞受容体を介した細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇の抑制
ＦｃＲキメラ安定発現細胞に２．５ｍｍｏｌ／Ｌ probenecid存在下３７℃で３０分間Ｆｕｒａ２−ＡＭ（終濃度：５μｍｏｌ／Ｌ）（和光純薬工業(株)製）を取り込ませた。Ｆｕｒａ２−ＡＭを除去後、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ probenecid含有ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ’緩衝液中に３７℃で３０分間静置した。遠心して上清を除去した後、細胞を５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍＬで２．５ｍｍｏｌ／Ｌ probenecid含有ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ’緩衝液に懸濁し、Ｃａ²⁺測定用９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。細胞外Ｃａ²⁺非存在下での実験では、Ｃａ²⁺不含Ｈａｎｋｓ’溶液にて調製した１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ／２．５ｍｍｏｌ／Ｌ probenecid含有ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ’緩衝液を用い、同様の操作を行った。室温で３０分間静置後、Spectrofluorometer FDSS-4000（浜松ホトニクス社製）を用いて３４０ｎｍ／３８０ｎｍの蛍光強度比を測定し、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動を検出した。測定開始３０秒後に、ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体のＦ（ａｂ’）₂（３３μｇ／ｍＬ）もしくはインタクト（intact）（４９．５μｇ／ｍＬ）（Zymed社製）を１０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
図５に示すように、インタクトの抗体を添加してＢＩＲ１キメラ蛋白がＢＣＲと架橋された場合に、ＢＩＲ１キメラ蛋白はＢＣＲを介した細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇を抑制することが明らかとなった。一方、ＢＩＲ１の細胞内チロシン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異体では細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇は抑制されなかった。また、ＢＩＲ１の細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇の抑制パターンは陽性対照であるＫＩＲ２ＤＬ３と異なっていた。細胞外Ｃａ²⁺非存在下でＢＩＲ１とＫＩＲ２ＤＬ３の細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇の抑制パターンを比較した結果、ＫＩＲ２ＤＬ３は細胞外Ｃａ²⁺非存在下でも細胞内Ｃａ²⁺濃度上昇を完全に抑制したのに対して、ＢＩＲ１は抑制することができなかった。ＢＩＲ１は既知の抑制性レセプターであるＦｃγＲＩＩＢと同様の結果を示した(Cell 90: 293-301 (1997))。
以上の結果から、本発明に係る蛋白質であるＢＩＲ１は、免疫抑制受容体として機能することが示された。

【0138】

実施例７：抑制性シグナル伝達におけるヒトＢＩＲ１の細胞内チロシン残基のリン酸化およびリクルートされるホスファターゼの同定
ＢＩＲ１が活性化されたときに細胞内チロシン残基がリン酸化され、ホスファターゼがリクルートされるかどうかを検討した。Ｃａ²⁺含有ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ’緩衝液に懸濁した３×１０⁷個のＦｃＲキメラ安定発現細胞をウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体のＦ（ａｂ’）₂３０μｇ／ｍＬあるいはインタクト４５μｇ／ｍＬ（Zymed社製）で、３７℃で３分間刺激した。その後、細胞をlysis buffer（１％ ＮＰ−４０，５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ₃ＶＯ₄，１ｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ，protease inhibitor cocktail tablet（Roche Diagnostics社製））で溶解した。細胞溶解液をラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２）（BD Pharmingen社製）を結合させたProtein A/G PLUS-Agarose（Santacruz社製）と４℃で５時間以上反応させた。ＦｃＲキメラ蛋白およびそれらの結合分子を免疫沈降した後、定法に従って、ウェスタンブロッティングを行った。メンブレンをphosphotyrosine(4G10)（Upstate社製）、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１に対する一次抗体（Santacruz社製）で反応後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した二次抗体（Santacruz社製）を反応させ、ＥＣＬ検出システム（Amersham Biosciences社製）にてバンドを検出した。
その結果、図６に示すように、インタクト抗体を添加してＢＩＲ１キメラ蛋白がＢＣＲと架橋された場合に、ＢＩＲ１キメラ蛋白の細胞内チロシン残基がリン酸化された。またその時、ＢＩＲ１キメラ蛋白の細胞内領域にＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１がリクルートされた。一方、ＢＩＲ１の細胞内チロシン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異体ではホスファターゼはリクルートされなかった。

【0139】

実施例８：ヒトＢＩＲ１によるＥｒｋ２のリン酸化の抑制
ＢＩＲ１がＢＣＲを介した下流のシグナル伝達分子のリン酸化を抑制するかどうかを検討した。Ｃａ²⁺含有ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ’緩衝液に懸濁した６×１０⁶個のＦｃＲキメラ安定発現細胞を、３０μｇ／ｍＬ ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体のＦ（ａｂ’）₂あるいは４５μｇ／ｍＬ インタクト（Zymed社製）で、３７℃で３分間刺激した。Lysing solution（Cell Lysis Kit;BIO-RAD社製）で細胞溶解液（５００ｎｇ／μＬ）を調製した。各シグナル伝達分子のリン酸化はBio-Plex Phospho 7-Plex Assay（BIO-RAD社製）を用いて定量した。
その結果、図７に示すように、ＫＩＲ２ＤＬ３と同様に、インタクト抗体を添加してＢＩＲ１キメラ蛋白がＢＣＲと架橋された場合に、ＢＩＲ１キメラ蛋白はＢＣＲを介したＥｒｋ２のリン酸化を抑制した。一方、ＢＩＲ１の細胞内チロシン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異体はＥｒｋ２のリン酸化を抑制しなかった。

【0140】

実施例９：ヒトＢＩＲ１によるインターロイキン２（ＩＬ−２）産生の抑制
ＢＩＲ１がＢＣＲを介したＩＬ−２産生を抑制するかどうかを検討した。１×１０⁵個のＦｃＲキメラ安定発現細胞を９６ウェルプレートに播種し、１０μｇ／ｍＬ ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体のＦ（ａｂ’）₂あるいは５μｇ／ｍＬ インタクト（Zymed社製）にて３７℃で２４時間刺激した。Quantikine Immunoassay Mouse IL-2 ELISA Kit（R & D Systems社製）を用いて、各培養上清中のＩＬ−２量を測定した。
その結果、図８に示すように、インタクト抗体を添加してＢＩＲ１キメラ蛋白がＢＣＲと架橋された場合に、ＢＩＲ１キメラ蛋白はＢＣＲを介したＩＬ−２産生を抑制した。一方、ＢＩＲ１の細胞内チロシン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異体はＩＬ−２産生を抑制しなかった。また、以前に報告された通り、ＫＩＲ２ＤＬ３もＩＬ−２産生を抑制した。

【0141】

実施例１０：ヒトＢＩＲ１のＩＴＩＭドメインおよび結合するホスファターゼの同定
ＢＩＲ１が抑制性シグナルを伝達するのに重要な配列ＩＴＩＭドメインおよび結合するホスファターゼを同定した。ＢＩＲ１（配列番号１）の細胞内チロシン残基を含むペプチド（Ｙ３：Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＳＱＥＬＱ³¹³ＹＡＴＰＶＦ（配列番号２３）、Ｙ５：Ｂｉｏｔｉｎ−ＤＳＹＫＳＧ³³⁶ＹＶＹＳＥＬ（配列番号２４）、Ｙ６：Ｂｉｏｔｉｎ−ＹＫＳＧＹＶ³³⁸ＹＳＥＬＮＦ（配列番号２５））およびそれに対応するリン酸化ペプチド（ｐＹ３：Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＳＱＥＬＱ³¹³（ｐＹ）ＡＴＰＶＦ（配列番号２６）、ｐＹ５：Ｂｉｏｔｉｎ−ＤＳＹＫＳＧ³³⁶（ｐＹ）ＶＹＳＥＬ（配列番号２７）、ｐＹ６：Ｂｉｏｔｉｎ−ＹＫＳＧＹＶ³³⁸（ｐＹ）ＳＥＬＮＦ（配列番号２８））を合成した（Sigma Genosys社に委託）。また、マウスＰＩＲ−ＢのＩＴＩＭ配列を含むペプチドおよびリン酸化ペプチド（Ｙ３：Ｂｉｏｔｉｎ−ＥＳＱＤＶＴ⁷⁹⁴ＹＡＱＬＣＳ（配列番号２９）およびｐＹ３：Ｂｉｏｔｉｎ−ＥＳＱＤＶＴ⁷⁹⁴（ｐＹ）ＡＱＬＣＳ（配列番号３０））を陽性対照として合成した。これらのペプチドを抗ビオチン抗体（Sigma社製）を介してProtein A/G PLUS-Agarose（Santacruz社製）に結合させた後、Ａ２０ＩＩＡ１．６細胞の溶解液と４℃で２時間反応させた。免疫沈降後、定法に従ってウェスタンブロッティングを行った。メンブレンをＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１（Santacruz社製）に対する一次抗体で反応後、ＨＲＰ標識した二次抗体（Santacruz社製）を反応させ、ECL plus Western Blotting Detection System（Amersham Biosciences社製）を用いてバンドを検出した。
その結果、図９に示すように、ＢＩＲ１のｐＹ３がＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２と結合し、ｐＹ６はＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰ−１と結合した。一方、ｐＹ５はいずれのホスファターゼとも結合しなかった。ＢＩＲ１の細胞内領域には従来のＩＴＩＭのコンセンサス配列（Ｉ／Ｖ／Ｌ／ＳＸＹＸＸＬ／Ｖ）と一致する配列は存在しないが、ヒトＢＩＲ１の３１３番目と３３８番目のチロシン残基が新たなＩＴＩＭとして機能することが明らかとなった。

【0142】

実施例１２：抗ヒトＢＩＲ１抗体の作製
（１）可溶化ヒトＢＩＲ１Ｌ／Ｆｃキメラ蛋白を用いた抗原感作
可溶化ヒトＢＩＲ１Ｌ／Ｆｃキメラ蛋白６０μｇをTiterMaxアジュバント（Sigma社製）と混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した。初回投与２週間後に、抗原（６０μｇ）をTiterMaxアジュバントと混合し、マウスの腹腔内に投与した。追加免疫約１０日後に、抗原（４０μｇ）をマウスの腹腔内に最終投与した。３日後に、マウスから脾臓を摘出した。
（２）抗ヒトＢＩＲ１モノクローナル抗体の作製
上記（１）で得た脾臓よりリンパ球を分離し、マウスミエローマＰ３Ｕ１と約４：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。ＲＰＭＩ１６４０／１５％ＦＣＳ／ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、可溶化ヒトＢＩＲ１Ｌ／Ｆｃキメラ蛋白を用いたＥＬＩＳＡおよびヒトＢＩＲ１Ｌ安定発現ＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーにより目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。陽性ハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、抗ヒトＢＩＲ１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得した。このようにして得たハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に接種後，２週間以降に腹水を採取した．腹水中に産生された抗体はＰｒｏｓｅｐ−Ｇカラム（ミリポア社製）などを用いて精製した。
図１０に示すように、作製された抗ヒトＢＩＲ１モノクローナル抗体はヒトＢＩＲ１を認識した（図中、Clone#170、#68、#95、#31は抗ヒトＢＩＲ１モノクローナル抗体の各クローンを表わし、2ndAbは陰性対照を、Anti-FLAG M2は陽性対照を表わす。）。
（３）抗ヒトＢＩＲ１ポリクローナル抗体の作製
可溶化ヒトＢＩＲ１Ｌ／Ｆｃキメラ蛋白（１００μｇ／０．５ｍＬ）を等量のフロイント完全アジュバント（DIFCO社製）と混合し、ウサギの背部皮下に投与した。２週間後、抗原（１００μｇ／０．５ｍＬ）を等量のフロイント不完全アジュバント（DIFCO社製）と混合し、ウサギの背部皮下に投与した。２週間後、尾静脈より試験採血し、抗体価の上昇をヒトＢＩＲ１Ｌ安定発現ＣＨＯ細胞を用いてフローサイトメトリーにて確認した。抗体価が低い場合は、さらに１〜２回の追加免疫を行い、抗血清を作製した。

【0143】

実施例１３：ヒトＢＩＲ１のシグナル伝達を変化させる化合物のスクリーニング
１０μｇ／ｍＬ ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Zymed社製）および実施例３で作製した１０μｇ／ｍＬ 抗ヒトＢＩＲ１モノクローナル抗体を、定法に従い、９６ウェルプレートに固定する。被験化合物（低分子化合物、ペプチド、抗体など）を添加し、ヒトＢＩＲ１を安定発現させたＡ２０ＩＩＡ１．６細胞を１×１０⁵個／１００μＬ／ｗｅｌｌで播種する。３７℃で２４時間培養後、Quantikine Immunoassay Mouse IL-2 ELISA Kit（R & D Systems社製）を用いて、各培養上清中のＩＬ−２量を測定する。被験化合物非添加の陰性対照と比較してＩＬ−２量を減少させる化合物または増加させる化合物をヒトＢＩＲ１のシグナル伝達を変化させる化合物として選別する。

【0144】

実施例１４：ホスファターゼの結合を制御する化合物のスクリーニング
ヒトＢＩＲ１の２箇所のＩＴＩＭ領域由来のリン酸化ペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＳＱＥＬＱ³¹³（ｐＹ）ＡＴＰＶＦ（配列番号２６）またはＢｉｏｔｉｎ−ＹＫＳＧＹＶ³³⁸（ｐＹ）ＳＥＬＮＦ（配列番号２８））を抗ビオチン抗体（Sigma社製）を固定した９６ウェルプレートに結合させる。被験化合物（低分子化合物、ペプチド、抗体など）を添加した後、Ａ２０ＩＩＡ１．６細胞の溶解液を添加し、４℃で２時間保温する。ＰＢＳで５回洗浄後、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＳＨＩＰ−１に対する一次抗体（Santacruz社製）を添加する。室温で２時間反応後、ＰＢＳで５回洗浄し、ＨＲＰ標識した二次抗体（Santacruz社製）を添加する。室温でさらに２時間反応後、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト(株)製）を用いてリン酸化ペプチドに結合したホスファターゼ量を測定する。被験化合物非添加の陰性対照と比較してホスファターゼ量を減少させる化合物または増加させる化合物を選別する。

【0145】

実施例１５：ヒトＢＩＲ１の発現量を変化させる化合物のスクリーニング
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１細胞（１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ）にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）および/またはＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で被験化合物（低分子化合物、ペプチド、抗体など）を添加し、３７℃で２４時間培養する。各細胞から全ＲＮＡを抽出し、ヒトＢＩＲ１に特異的なプライマー；５’−ＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣ−３’（配列番号１５）および５’−ＧＡＧＴＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧ−３’（配列番号１６）とQuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit（QIAGEN社製）を用いてABI PRISM 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems社製）によりＢＩＲ１のＲＮＡを定量する。ＬＰＳおよび／またはＩＦＮ−γの存在下で被験化合物非添加の陰性対照と比較してＲＮＡ量を減少させる化合物または増加させる化合物を選別する。あるいはＬＰＳおよびＩＦＮ−γの非存在下で被験化合物非添加の陰性対照と比較してＲＮＡ量を減少させる化合物または増加させる化合物を選別する。

【産業上の利用可能性】

【0146】

本発明は医薬品開発において、非常に有用である。すなわち、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストは、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療に有用である。また、本発明に係る蛋白質のアゴニストは、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患もしくは炎症性疾患の予防および／または治療に有用である。本発明のスクリーニング方法は、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストの選別に有用である。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドおよび本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体は、本発明に係る蛋白質のアンタゴニストとして、癌、免疫不全症もしくは感染症の予防および／または治療に有用である。さらに、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドは、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体の製造において、抗原として使用できる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの製造に使用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]