特許 5968229 肺炎球菌感染症の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5968229

(24)【登録日】2016年7月15日

(45)【発行日】2016年8月10日

(54)【発明の名称】肺炎球菌感染症の治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/09 20060101AFI20160728BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20160728BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20160728BHJP

   C07K 14/315 20060101ALN20160728BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160728BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/09

   A61P31/04

   A61P11/00

   !C07K14/315ZNA

   !C12N15/00 A

【請求項の数】14

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2012-556494(P2012-556494)

(86)(22)【出願日】2011年3月8日

(65)【公表番号】特表2013-521322(P2013-521322A)

(43)【公表日】2013年6月10日

(86)【国際出願番号】EP2011053485

(87)【国際公開番号】WO2011110570

(87)【国際公開日】20110915

【審査請求日】2014年3月5日

(31)【優先権主張番号】1003920.4

(32)【優先日】2010年3月9日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】305060279

【氏名又は名称】グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】ドノエル，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ヘルマント，フィリップ ヴィンセント

(72)【発明者】

【氏名】ラベ，スティーブ

(72)【発明者】

【氏名】プールマン，ジャン

(72)【発明者】

【氏名】リウー，ステファン

【審査官】 小森 潔

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５３３１２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５３２５６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／０５４００７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５０１６１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０１２５８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１年，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．２，ｐ９４９−９５８

【文献】 ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００９年，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐ７３１−７３８

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

肺炎連鎖球菌感染症の治療又は予防において使用するための、薬学的に有効な量の単離ＰｈｔＤタンパク質及びアジュバントを含んでなる免疫原性組成物であって、前記肺炎連鎖球菌感染症が肺炎であり、かつＺｎ^２＋の遊離濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＤタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者の血液、肺、耳の区画又は髄膜に生じるものであり、ヒト患者は肺炎連鎖球菌の感染経験によりＺｎ^２＋が欠乏している、上記免疫原性組成物。

【請求項2】

前記肺炎連鎖球菌感染症が血液中で生じ、血液中のＺｎ^２＋の遊離濃度が、血清から測定したとき１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、又は１０ｐＭ未満である、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

前記肺炎連鎖球菌感染症が肺で生じ、前記治療又は予防が、肺における細菌量を低減する、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記肺炎連鎖球菌感染症が肺で生じ、肺中のＺｎ^２＋の濃度が、気管支洗浄から測定したとき３００、２００、１００、５０、又は１０μｇ／ｋｇ未満である、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

前記肺炎連鎖球菌感染症が中耳で生じ、中耳中のＺｎ^２＋の濃度が、３００、２００、１５０、１００、５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２又は０．１μＭ未満である、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記肺炎連鎖球菌感染症が髄膜で生じ、脳脊髄液中のＺｎ^２＋の濃度が、１．５、１、０．７５、０．５、０．２５、若しくは０．１μＭ未満、又は１００、７５、５０、２５、又は１０μｇ／Ｌ未満である、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

気管支洗浄及び／又は血液試験により測定したとき、前記ヒト患者が低下したレベルのＺｎ^２＋を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防するための薬剤の製造における薬学的に有効な量の単離ＰｈｔＤタンパク質の使用であって、前記肺炎連鎖球菌感染症が肺炎であり、かつＺｎ^２＋の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＤタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者の血液中、肺、耳の区画または髄膜に生じるものであり、ヒト患者は肺炎連鎖球菌の感染経験によりＺｎ^２＋が欠乏している、上記使用。

【請求項9】

前記肺炎連鎖球菌感染症が血液中で生じ、血液中のＺｎ^２＋の遊離濃度が、血清から測定したとき１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、又は１０ｐＭ未満である、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

前記肺炎連鎖球菌感染症が肺で生じ、前記治療又は予防が、肺における細菌量を低減する、請求項８に記載の使用。

【請求項11】

前記肺炎連鎖球菌感染症が肺で生じ、肺中のＺｎ^２＋の濃度が、気管支洗浄から測定したとき３００、２００、１００、５０、又は１０μｇ／ｋｇ未満である、請求項８に記載の使用。

【請求項12】

前記肺炎連鎖球菌感染症が中耳で生じ、中耳中のＺｎ^２＋濃度が、３００、２００、１５０、１００、５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２又は０．１μＭ未満である、請求項８に記載の使用。

【請求項13】

前記肺炎連鎖球菌感染症が髄膜で生じ、脳脊髄液中のＺｎ^２＋の濃度が、１．５、１、０．７５、０．５、０．２５、若しくは０．１μＭ未満、又は１００、７５、５０、２５、若しくは１０μｇ／Ｌ未満である、請求項８に記載の使用。

【請求項14】

気管支洗浄及び／又は血液試験により測定したとき、前記ヒト患者が低下したレベルのＺｎ^２＋を有する、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、連鎖球菌性疾患から保護するワクチン及び免疫原性組成物、特に、タンパク質のポリヒスチジントライアドファミリーのタンパク質を含有するワクチンを用いて肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）性疾患を治療する方法、特に、これらワクチン及び免疫原性組成物を用いる治療方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肺炎連鎖球菌は、中耳炎、肺炎、菌血症及び髄膜炎等の広範囲にわたる感染症に関与している、全世界における感染性病的状態及び死亡の主な原因のうちの１つである（Ｈａｕｓｄｏｒｆｆ ２００５、ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ ２００１）。この微生物の抗生物質耐性株の出現により、有効な予防的ワクチン接種を提供することが更に強く必要とされている（Ｌｙｎｃｈ，ＩＩＩ ２００５、Ｂｒｉｄｙ−Ｐａｐｐａｓ ２００５）。

【0003】

現在のワクチンは、キャリアタンパク質にコンジュゲートしているか又はしていない肺炎球菌の莢膜多糖を疫学的に優勢な血清型に基づいて選択したものから構成される（Ｄａｇａｎ ２００４、Ｆｅｄｓｏｎ ２００４、Ｍｂｅｌｌｅ １９９９、Ｓｍａｒｔ １９８７）。しかし、ワクチン製剤は、この微生物の全ての血清型を網羅する訳ではなく、特に、様々な優勢血清型を有する球の特定の領域に関連している場合がある（Ｄａｇａｎ １９９２）。更に、血清型特異的なワクチンの使用により、非ワクチン血清型のポジティブ選択が可能になると予測することができる（Ｎｕｎｅｓ ２００８、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ２００７）。

【0004】

別のアプローチは、共通の肺炎球菌抗原を標的とするワクチンの開発を含む。複数の候補の中でも、連鎖球菌属に限定されているＰｈｔタンパク質ファミリーは、肺炎球菌の種全体によく保存されており（Ｈａｍｅｌ ２００４、Ｚｈａｎｇ ２００１）、感染した個体における抗体標的であり、且つ免疫されたマウスにおける抗原投与時に保護的である（Ｂｅｇｈｅｔｔｏ ２００６）有望な候補を含む。元々、このタンパク質ファミリーは、３つのグループにより別々に報告され、３つの別々の名称が使用されていた：Ｐｈｔ（肺炎球菌ヒスチジントライアド）（Ａｄａｍｏｕ ２００１）、Ｐｈｐ（肺炎球菌ヒスチジンタンパク質）（Ｚｈａｎｇ ２００１）及びＢＶＨ（Ｈａｍｅｌ ２００４）。これらタンパク質は、アミノ酸配列において５〜６回繰り返されるヒスチジントライアドモチーフＨｘｘＨｘＨを特徴とする。このファミリーの４つのメンバーが報告されている：８１％以下の配列同一性を共有しているＰｈｔＡ（ＢＶＨ−１１−３）、ＰｈｔＢ（ＰｈｐＡ／ＢＶＨ−１１）及びＰｈｔＤ（ＢＶＨ−１１−２）と、他の３つのタンパク質から分岐しており、それらとは３５％以下の同一性しか示さないＰｈｔＥ（ＢＶＨ−３）である。これはより長いタンパク質であり、唯一ヒスチジントライアドモチーフが６回繰り返されている。マウスの免疫化研究では、Ｐｈｔファミリーのメンバーは全て、後に多くの異なる株／血清型の肺炎球菌感染症に対して高水準の保護を提供することが示されている（Ａｄａｍｏｕ ２００１、Ｈａｍｅｌ ２００４、Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ２００７、Ｗｉｚｅｍａｎｎ ２００１、Ｚｈａｎｇ ２００１）。

【0005】

肺炎連鎖球菌に対するワクチン接種における潜在的重要性にもかかわらず、これらタンパク質の生物学的機能は未だ決定されていない。抗体の標識及びフローサイトメトリー実験から得られた結果は、Ｐｈｔタンパク質が被包性細菌の表面上に露出していることを示し（Ｈａｍｅｌ ２００４）、これは、ワクチンの標的としての適合性を満たしている。シグネチャータグ付突然変異誘発により、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ及びＰｈｔＤが肺特異的毒性に関与していることが示唆されたが（Ｈａｖａ ２００２）、その生物学的機能に関する更なる情報は得られていない。その推定上の役割の中でも、補体因子Ｃ３ｂの中和が提唱されており（Ｈｏｓｔｅｔｔｅｒ １９９９、Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ２００９）、これは、Ｃ３ｂが食作用に干渉するであろうということを示唆する。これに加えて、接着における役割も疑われる。実際、ｐｈｔＤとｌｍｂとの間の遺伝子の連鎖が報告されており、後者は、推定上のラミニン接着タンパク質をコードしている（Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ １９９９、Ｐａｎｉｎａ ２００３）。最後に、ヒスチジントライアドに多くのヒスチジン残基が存在することから、Ｐｈｔタンパク質がＤＮＡ及び／又は金属の結合に関与する可能性があることが示唆されている（Ａｄａｍｏｕ ２００１）。より具体的には、いくつかの研究では、Ｐｈｔファミリーと亜鉛との間の関連が強調されている。実際、ｐｈｔ遺伝子の上流領域にＡｄｃＲ結合部位が見出されており、ＡｄｃＲは、亜鉛の取込みを調節する転写因子であると報告されている（Ｐａｎｉｎａ ２００３）。更に、ＰｈｔＡの一部の結晶構造から、ヒスチジントライアドドメインに結合している亜鉛イオンの存在が明らかになった（Ｒｉｂｏｌｄｉ−Ｔｕｎｎｉｃｌｉｆｆｅ ２００５）。しかし、亜鉛の捕捉又は輸送がこれらタンパク質の機能であるかどうか、又は亜鉛が立体構造的若しくは機能的な役割を果たしているかどうかは明らかではない。

【0006】

ワクチン候補について取り組む必要のある重要な局面は、発現レベル及び関連する調節、出現頻度、並びに配列変動性である。したがって、本発明者らは、Ｐｈｔタンパク質に関してこれら様々な局面に取り組んだ。

【0007】

肺炎連鎖球菌は、肺炎球菌の集団が拡大する部位に応じて異なる病状を示す異なる疾患状態を誘発する。肺炎連鎖球菌が血流に入った場合には敗血症が生じ、一方、肺炎連鎖球菌が肺において増加した場合には肺炎が生じる。また、肺炎連鎖球菌は、中耳炎感染症における重要な病原体である。また、肺炎連鎖球菌は、脳脊髄液に入って髄膜炎を引起す場合もある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

特定の肺炎球菌性疾患を標的とすることができ、且つ肺炎球菌性疾患の特定の形態に対する最適な保護を提供することができるより優れた肺炎球菌ワクチンを開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

したがって、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法であって、薬学的に有効な量のＰｈｔＸタンパク質をヒト患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。

【0010】

本発明の第２の態様では、肺炎連鎖球菌感染症の治療又は予防において使用するための、薬学的に有効な量の単離ＰｈｔＸタンパク質を含んでなる免疫原性組成物であって、前記肺炎連鎖球菌感染症が、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者に生じる免疫原性組成物を提供する。

【0011】

本発明の第３の態様では、肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防するための薬剤の製造における薬学的に有効な量の単離ＰｈｔＸタンパク質の使用であって、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境でヒト患者に生じる使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】肺炎連鎖球菌血清型４株ＴＩＧＲ４におけるｐｈｔ遺伝子の構成

【図2】ｐｈｔ遺伝子のプロモーター含有上流領域。（ａ）ｐｈｔＥ遺伝子、（ｂ）ｐｈｔＡ遺伝子、（ｃ）ｐｈｔＢ遺伝子、（ｄ）ｌｍｂ遺伝子、（ｅ）ｙｆｎＡ遺伝子。２つの下線部は−３５及び−１０領域であり、太字及び記号（＋１）は転写開始部位を示し、下線部は推定上のリボソーム結合部位（ｒｂｓ）であり、一連の太字上の転写の方向を示す矢印によりオープンリーディングフレームを表す。左側の数はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５６９９７９（ａ、ｄ及びｅ）及びＡＹ５６９９８０（ｂ及びｃ）中の配列位置に対応する。

【図3】ｐｈｔ及びｐｔｓＩ遺伝子のＲｈｏ非依存性転写ターミネータ配列。（ａ）ｐｈｔＥ、（ｂ）ｐｈｔＢ、（ｃ）ｐｈｔＤ、（ｄ）ｐｈｔＡ及び（ｅ）ｐｓｔＩ遺伝子。太下線部は終止コドンであり、下線部はターミネーター領域であり、不連続下線を引いた配列は、ターミネーターのヘアピン領域を示す。一連の太字上の転写の方向を示す矢印によりオープンリーディングフレームを表す。（ａ）では、イタリック体の領域（ｐｈｔＦ遺伝子；二重下線部は推定上の開始コドンである）は、ｐｈｔＥ遺伝子の最初の４８１ｂｐと７８％の同一性を表す。しかし、下線を引いた終止コドンが遺伝子翻訳を著しく妨げる。数字は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５６９９７９（ａ及びｃ）及びＡＹ５６９９８０（ｂ、ｄ及びｅ）の配列位置に対応する。

【図4】ｐｈｔ転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析。（ａ）対数増殖期の中間まで増殖させた細胞からのテンプレートＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ生成物を示す１％のアガロースゲル。レーン１〜８は、（ｂ）の概略図における領域１〜８に対応する。スキームに示された対応する領域に隣接するプライマー対を使用して、レーン１〜８に示すＲＴ−ＰＣＲ生成物を生成した。各々の予測されるＲＴ−ＰＣＲ生成物の長さを括弧内に示す。

【図5】細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロッティング。抗ＰｈｔＤ抗体を用いて、ＰｈｔＡＢＤＥ⁻四重突然変異体（Ａ）、ＰｈｔＥ⁻突然変異体（Ｂ）、ＰｈｔＤ⁻突然変異体（Ｃ）、ＰｈｔＢ⁻突然変異体（Ｄ）、ＰｈｔＡ⁻突然変異体（Ｅ）及び野生型（Ｆ）株からの抽出物を探索した。右側に様々なＰｈｔバンドの位置を示し、図の左側に分子量マーカを示す。

【図6】ＭＳ培地（ａ）における、４／ＣＤＣ野生型株及びＰｈｔ欠損突然変異体の増殖曲線。また、Ｚｎ^２＋２００μＭ（ｂ）、Ｍｎ^２＋２００μＭ（ｃ）、又はＦｅ^２＋２００μＭ（ｄ）を含む又は含まないＭＳにおいて野生型、ＰｈｔＤ欠損、及びＰｈｔ四重突然変異体の増殖曲線を求めた。各図は、３つの実験のうちの代表的な１つの結果を示す。

【図7】ＷＵ２細菌細胞を、亜鉛キレート剤であるＴＰＥＮ ３０μＭ有り又は無しで培養した。次に、抗ＰｈｔＢ／Ｄ（ａ）、抗ＰｈｔＥ（ｂ）、抗ＰｈｔＤ／Ｅ（ｃ）、又は抗３型多糖（ｄ）抗体、次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体で細胞を探索した後、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、第２のコンジュゲート抗体と共に細胞をインキュベートした。様々な条件の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。

【図8】ウエスタンブロット解析。全細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでイムノブロッティングに供した。ポリクローナル抗ＰｈｔＤ（ａ）で９つの異なる株を探索し、ポリクローナル抗ＰｈｔＥ（ｂ）で８つを探索した。分子量マーカを示す。

【図9】ＰｈｔＸファミリーのメンバーのシグナル配列比較。網かけ部分は、少なくとも２／３のＰｈｔＸファミリーにおいて保存されているアミノ酸を同定する。

【図10】致死性肺炎連鎖球菌を鼻腔内に抗原投与した際のマウスの生存率。ＡＳ０２をアジュバントとして添加したＰｈｔＤ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ又はＡＳ０２のみ（対照）でマウス（ｎ＝２０／群）を免疫した後、３／４３型肺炎球菌株を抗原投与した。ログランク検定で統計分析を行い、対照と比較した：ＰｈｔＤ、ｐ＝０．０１２６；ＰｈｔＡ、ｐ＝０．０１０３；ＰｈｔＢ、ｐ＝０．００３８；ＰｈｔＥ、ｐ＝０．００３３。

【図11】免疫後の抗体値。Ａ）ＡＳ０２をアジュバントとして添加したＣｂｐＡ、ＰｓｐＡ又はＰｈｔＤでマウスを全身免疫した。Ｂ）ＬＴをアジュバントとして添加したＣｂｐＡ、ＰｓｐＡ又はＰｈｔＤでマウスを鼻腔内免疫した。いずれの場合も、４２日目に血液を採取し、特異的抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。

【図12】致死性肺炎連鎖球菌を鼻腔内に抗原投与した際のマウスの生存率。ＡＳ０２をアジュバントとして添加したＣｂｐＡ、ＰｓｐＡ、ＰｈｔＤ又はＡＳ０２のみ（対照）でマウスを免疫した後、２／Ｄ３９型（Ａ）、３／４３型（Ｂ）、又は４／ＣＤＣ型（Ｃ）の肺炎球菌株を抗原投与した。ログランク検定で統計分析を行い、対照と比較した：（Ａ）ＣｂｐＡ、ｐ＝０．０００２；ＰｓｐＡ、ｐ＝０．０００１；ＰｈｔＤ、ｐ＝０．０００９。（Ｂ）ＣｂｐＡ、ｐ＝０．８８５；ＰｓｐＡ、ｐ＝０．１８４；ＰｈｔＤ、ｐ＝０．０２７。（Ｃ）ＣｂｐＡ、ｐ＝０．８２５；ＰｓｐＡ、ｐ＝０．５３８；ＰｈｔＤ、ｐ＜０．０００１。

【図13】肺炎連鎖球菌の鼻咽腔コロニー形成モデルにおけるワクチンの有効性。ＰｈｔＤ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ又はＬＴのみ（対照）でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した後、２／Ｄ３９肺炎球菌株を鼻腔内に抗原投与した。抗原投与後２日目及び６日目に鼻の洗液中の細菌コロニーをカウントし、ｌｏｇ１０平均ｃｆｕとして表した。各ドットはマウスを表す。黒い水平バーは幾何平均である。破線は、検出限界（０．８４）を示す。分散分析で１日毎に統計分析を行った。対照と比較した有意差を全て示す。^＊ｐ＜０．０５；ｎｓ：有意ではない。

【図14】肺炎連鎖球菌の鼻咽腔コロニー形成モデルにおけるワクチンの有効性。ＣｂｐＡ、ＰｓｐＡ、ＰｈｔＤ、ＰｓａＡ又はＬＴのみ（対照）のいずれかでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した後、２／Ｄ３９（Ａ）、４／ＣＤＣ（Ｂ）又は６Ｂ／ＣＤＣ（Ｃ）肺炎球菌株を鼻腔内に抗原投与した。抗原投与後２日目及び６日目に鼻の洗液中の細菌コロニーをカウントし、ｌｏｇ１０平均ｃｆｕとして表した。各ドットはマウスを表す。破線は、検出限界（０．８４）を示す。黒い水平バーは幾何平均である。分散分析で１日毎に統計分析を行った。対照と比較した有意差を全て示す。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない。

【図15】肺炎連鎖球菌の肺コロニー形成モデルにおけるワクチンの有効性。ＡＳ０２をアジュバントとして添加したＰｈｔＤ、又はＡＳ０２のみ（対照）でＣＢＡ／Ｊマウスを免疫した後、中程度に有毒な１９Ｆ／２７３７肺炎球菌株を抗原投与した。抗原投与後３、４、又は５日目に肺を摘出し、コロニー計数法によりは細菌数を評価した（ｃｆｕ）。各ドットはマウスを表す。破線は、検出限界（２）を示す。黒い水平バーは幾何平均である。３日間にわたって二元配置分散分析、次いで、Ｔｕｃｋｅｙ−ＨＳＤで群を比較した：ｐ＜０．０００１。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋の濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法であって；薬学的に有効な量のＰｈｔＸタンパク質をヒト患者に投与する工程を含んでなる方法を提供する。

【0014】

Ｚｎ^２＋及びＭｎ^２＋は、遊離又は結合の両方でヒトの体内に存在する。結合Ｚｎ^２＋又はＭｎ^２＋は、アルブミン等のタンパク質に結合しており、これらイオンの大部分を占める。他方、少量の遊離Ｚｎ^２＋又はＭｎ^２＋は、血液、リンパ、間質液又は脳脊髄液等の体液中に存在する。用語「結合」とは、アルブミン等のタンパク質に密接に会合しているイオンに関する。用語「遊離」とは、アルブミン等のタンパク質に密接に会合していないイオンに関する。このような遊離イオンの方が、肺炎連鎖球菌による取込みに利用されやすい。１つの実施形態では、本発明の方法は、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋の遊離濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明の方法は、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋の結合及び／又は遊離濃度が肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い環境において生じる肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防する方法を提供する。

【0015】

本発明の目的のための用語「少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現を上方制御するのに十分低い」とは、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋（結合及び／又は遊離）のレベルが、
ａ）ヒトの体内の等価な位置で通常みられるよりも低く、その結果、体内に存在する肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現レベルが、正常条件下における（すなわち、平均的なＺｎ^２＋又はＭｎ^２＋レベルを有する個体における）体内の等価な区画でみられる肺炎連鎖球菌におけるＰｈｔＸの発現レベルよりも高いか；あるいは
ｂ）体内のＺｎ^２＋利用可能性の高い領域でみられるよりも低く、その結果、その箇所に存在する肺炎連鎖球菌における少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質の発現レベルが、同じ個体の体内のＺｎ^２＋利用可能性の高い領域でみられる肺炎連鎖球菌におけるＰｈｔＸの発現レベルよりも高いことを意味する。

【0016】

１つの実施形態では、Ｚｎ^２＋の結合レベルが低下している。１つの実施形態では、Ｚｎ^２＋の遊離レベルが低下している。

【0017】

状況ａ）は、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋の全体的なレベルの減少を通じて実現し得るが、一方、状況ｂ）は、比較的低レベルのＺｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋を有する部位で生じる肺炎連鎖球菌感染症により実現し得る。

【0018】

ＰｈｔＸタンパク質は、タンパク質のヒスチジントライアドファミリーのメンバーである。ＰｈｔＸタンパク質は、場合により完全長タンパク質であるが、タンパク質の断片又は少なくとも１つの断片若しくは完全長のＰｈｔＸタンパク質を含む融合タンパク質であってもよい。肺炎連鎖球菌において発現するＰｈｔＸタンパク質は完全長タンパク質になるが、ヒト患者に投与されるＰｈｔＸタンパク質は、任意で、完全長ＰｈｔＸタンパク質、ＰｈｔＸタンパク質の断片、又は少なくとも１つのＰｈｔＸタンパク質若しくはその断片を含む融合タンパク質である。

【0019】

１つの実施形態では、ＰｈｔＸタンパク質は、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ及びＰｈｔＥからなる群より選択される。１つの実施形態では、ＰｈｔＸタンパク質はＰｈｔＤである。

【0020】

本発明は、ポリヒスチジントライアドファミリー（Ｐｈｔ）タンパク質のメンバー、その断片、又はその融合タンパク質に関する。ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ又はＰｈｔＥタンパク質は、国際公開第００／３７１０５号パンフレット又は国際公開第００／３９２９９号パンフレットに開示されている配列（例えば、ＰｈｔＤについては、国際公開第００／３７１０５号の配列番号４のアミノ酸配列１〜８３８又は２１〜８３８）と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を共有するアミノ酸配列を有し得る。

【0021】

Ｐｈｔ（ポリヒスチジントライアド）ファミリーは、タンパク質ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ及びＰｈｔＥを含む。前記ファミリーは、脂質化配列、恐らく金属若しくはヌクレオシド結合又は酵素活性に関与している、プロリンリッチ領域及び幾つかのヒスチジントライアドにより分離されている２つのドメイン、（３〜５つの）コイルドコイル領域、保存されているＮ末端、及び不均一なＣ末端を特徴とする。これは試験した肺炎球菌の全ての株に存在する。また、他の連鎖球菌及びナイセリア属でも相同なタンパク質が見出されている。しかし、用語ＰｈｔＡ、Ｂ、Ｄ及びＥは、上記又は下記引用に開示される配列を有するタンパク質に加えて、参照されるタンパク質と少なくとも９０％同一である配列相同性を有するその天然に存在する（及び人工の）変異体を指すと理解される。任意で、それは少なくとも９５％同一であるか、又は少なくとも９７％同一である。

【0022】

ＰｈｔＸタンパク質に関して、ＰｈｔＡは、国際公開第９８／１８９３０号パンフレットに開示されており、Ｓｐ３６とも称されている。上述のように、それはポリヒスチジントライアドファミリーのタンパク質であり、ＬＸＸＣのＩＩ型シグナルモチーフを有する。ＰｈｔＤは、国際公開第００／３７１０５号パンフレットに開示されており、Ｓｐ０３６Ｄとも称されている。上述のように、それもポリヒスチジントライアドファミリーのタンパク質であり、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。ＰｈｔＢは、国際公開第００／３７１０５号パンフレットに開示されており、Ｓｐ０３６Ｂとも称されている。ＰｈｔＢファミリーの別のメンバーは、国際公開第００／１７３７０号パンフレットに開示されているようなＣ３−分解ポリペプチドである。このタンパク質もポリヒスチジントライアドファミリーであり、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。例えば、免疫学的に機能的な等価物は、国際公開第９８／１８９３０号パンフレットに開示されているタンパク質Ｓｐ４２である。ＰｈｔＢ切頭物（約７９ｋＤ）は、国際公開第９９／１５６７５号パンフレットに開示されており、これもＰｈｔＸファミリーのメンバーであると考えられる。ＰｈｔＥは、国際公開第００／３０２９９号パンフレットに開示されており、ＢＶＨ−３と称されている。任意のＰｈｔタンパク質が本明細書において言及される場合、Ｐｈｔタンパク質の免疫原性断片又はその融合物を使用することができることを意味する。例えば、ＰｈｔＸへの言及は、任意のＰｈｔタンパク質に由来する免疫原性断片又はその融合物を含む。ＰｈｔＤ又はＰｈｔＢへの言及は、例えば、国際公開第０１９８３３４号パンフレットにみられる通り、ＰｈｔＤＥ又はＰｈｔＢＥの融合物への言及でもある。

【0023】

本発明の治療法又は使用法は、完全長ＰｈｔＸタンパク質、ＰｈｔＸタンパク質の断片、又はＰｈｔＸタンパク質の少なくとも１つ若しくは２つの断片を含有している融合タンパク質の投与を含み得る。（別々に又は融合タンパク質の一部として）Ｐｈｔタンパク質の断片を使用する場合、各断片は、任意で、このようなポリペプチドの１以上のヒスチジントライアドモチーフ及び／又はコイルドコイル領域を含有する。ヒスチジントライアドモチーフは、配列ＨｘｘＨｘＨ（式中、Ｈはヒスチジンであり、ｘはヒスチジン以外のアミノ酸である）を有するポリペプチドの部分である。コイルドコイル領域は、「Ｃｏｉｌｓ」アルゴリズムにより予測される領域である。Ｌｕｐｕｓ，Ａら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２；１１６２−１１６４。１つの実施形態では、断片又は各断片は、少なくとも１つのコイルドコイル領域に加えて１以上のヒスチジントライアドモチーフも含む。１つの実施形態では、断片又は各断片は、正確に又は少なくとも２、３、４又は５つのヒスチジントライアドモチーフを含有する（任意で、２以上のトライアド間にネイティブなＰｈｔ配列を含むか、又はネイティブな肺炎球菌のトライアド内Ｐｈｔ配列、例えば、ＰｈｔＤについては国際公開第００／３７１０５号パンフレットの配列番号４に示されているトライアド内配列と５０、６０、７０、８０、９０％超又は１００％同一であるトライアド内配列を含む）。１つの実施形態では、断片又は各断片は、正確に又は少なくとも２、３又は４つのコイルドコイル領域を含有する。１つの実施形態では、本明細書に開示するＰｈｔタンパク質は、シグナル配列が結合している完全長タンパク質、シグナルペプチド（例えばＮ末端の２０アミノ酸）が除去されている成熟した完全長タンパク質、Ｐｈｔタンパク質の天然に存在する変異体、及びＰｈｔタンパク質の免疫原性断片（例えば、上記断片、あるいは国際公開第００／３７１０５号パンフレット（配列番号４、６、８又は１０）又は国際公開第００／３９２９９号パンフレット（配列番号２、４、６、８、１０又は１４）中のアミノ酸配列に由来する少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００の隣接するアミノ酸を含むポリペプチドであって、国際公開第００／３７１０５号パンフレット又は国際公開第００／３９２９９号パンフレットにおける前記アミノ酸配列に特異的な免疫反応を誘発することができるポリペプチド）を含む。１つの実施形態では、ＰｈｔＸタンパク質は、国際公開第０９／１２５８８号パンフレットに記載されている断片、例えば、配列番号２、３、又は４の配列を含むかこれらからなる断片である。

【0024】

特に、本発明で使用する用語「ＰｈｔＤ」は、シグナル配列が結合している完全長タンパク質、シグナルペプチド（例えばＮ末端の２０アミノ酸）が除去されている成熟した完全長タンパク質、天然に存在するＰｈｔＤの変異体、及びＰｈｔＤの免疫原性断片（例えば、上記断片、あるいは国際公開第００／３７１０５号パンフレット又は国際公開第００／３９２９９号パンフレット中のＰｈｔＤアミノ酸配列に由来する少なくとも１５又は２０の隣接するアミノ酸を含むポリペプチドであって、国際公開第００／３７１０５号パンフレット又は国際公開第００／３９２９９号パンフレットにおける前記ＰｈｔＤアミノ酸配列に特異的な免疫反応を誘発することができるポリペプチド（例えば、ＰｈｔＤについては、国際公開第００／３７１０５号パンフレットの配列番号４又は国際公開第００／３９２９９号パンフレットの配列番号１４）を含む。上述のＰｈｔＤの全ての形態を本発明で用いることができる。

【0025】

本発明の１つの実施形態では、治療又は予防の方法は、例えば、敗血症又は菌血症の治療又は予防については、患者の血液において増殖する肺炎連鎖球菌を対象とする。１つの実施形態では、血液中のＺｎ^２＋の遊離濃度は、血清から測定したとき、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、７００ｐＭ、５００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、７０ｐＭ、５０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、又は１０ｐＭ未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、黒鉛炉吸光度分光光度計（ＧＦ−ＡＡＳ）を使用してサンプルを分析することにより、又は原子吸光分析を使用することにより、例えばＶｉｓｔａ ＡＸ−ＣＣＤ同時ＩＣＰ−ＡＥＳ分光計を使用することにより、Ｚｎ^２＋のレベルを測定することができる。

【0026】

本発明の１つの実施形態では、血液中のＺｎ^２＋の結合及び遊離濃度は、血清から測定したとき、５、３、２、１、０．５、０．３、０．２又は０．１ｍｇ／Ｌ未満、あるいは２０、１８、１５、１２、１０、８、５、３、２、１、０．５又は０．１μＭ未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、黒鉛炉吸光度分光光度計（ＧＦ−ＡＡＳ）を使用してサンプルを分析することにより、又は原子吸光分析を使用することにより、例えばＶｉｓｔａ ＡＸ−ＣＣＤ同時ＩＣＰ−ＡＥＳ分光計を使用することにより、Ｚｎ^２＋のレベルを測定することができる。

【0027】

本発明の１つの実施形態では、血液中のＭｎ^２＋の遊離濃度は、血清から測定したとき、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、７００ｐＭ、５００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、７０ｐＭ、５０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、又は１０ｐＭ未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、原子吸光分析を使用してサンプルを分析することにより、例えばＶｉｓｔａ ＡＸ−ＣＣＤ同時ＩＣＰ−ＡＥＳ分光計を使用することにより、Ｍｎ^２＋のレベルを測定することができる。

【0028】

本発明の１つの実施形態では、血液中のＭｎ^２＋の結合及び遊離濃度は、血清から測定したとき、５、３、２、１、０．５、０．３、０．２又は０．１ｍｇ／Ｌ未満、あるいは２０、１８、１５、１２、１０、８、５、３、２、１、０．５、０．２又は０．１μＭ未満である。標準手順を使用して血液サンプルから血清サンプルを調製し、原子吸光分析を使用してサンプルを分析することにより、例えばＶｉｓｔａ ＡＸ−ＣＣＤ同時ＩＣＰ−ＡＥＳ分光計を使用することにより、Ｍｎ^２＋のレベルを測定することができる。

【0029】

本発明の１つの実施形態では、治療又は予防の方法は、例えば、肺炎の治療又は予防については、患者の肺において増殖する肺炎連鎖球菌を対象とする。１つの実施形態では、肺中のＺｎ^２＋の遊離濃度は、気管支洗浄から測定したとき、３００、２００、１００、８０、５０、２０、１０、５、３又は１μｇ／ｋｇ未満である。１つの実施形態では、肺中のＭｎ^２＋の遊離濃度は、気管支洗浄から測定したとき、３００、２００、１００、８０、５０、２０、１０、５、３又は１μｇ／ｋｇ未満である。任意で、Ｚｎ^２＋又はＭｎ^２＋のレベルは、肺組織から測定するとき、肺組織中のＺｎ^２＋（又はＭｎ^２＋）の濃度が、２０、１５、１０、５、２又は１μｇ／ｇ、あるいは３００、２００、１５０、１００、５０、２０、１０、５、２、１、０．５又は０．１μＭ未満である組織サンプルから測定される。同様に、組織サンプル中のイオンのレベルは、原子吸光分析により、例えばＶｉｓｔａ ＡＸ−ＣＣＤ同時ＩＣＰ−ＡＥＳ分光計を使用することにより測定することができる。

【0030】

１つの実施形態では、肺炎連鎖球菌感染症は、耳、例えば中耳の区画において、例えば中耳炎感染症として生じる。１つの実施形態では、中耳におけるＺｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋のレベルは、３００、２００、１５０、１００、５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２又は０．１μＭ未満である。

【0031】

１つの実施形態では、肺炎連鎖球菌感染症は、髄膜において、例えば髄膜炎感染症として生じる。１つの実施形態では、脳脊髄液におけるＺｎ^２＋の濃度は、１．５、１、０．７５、０．５、０．２５又は０．１μＭ未満、あるいは１００、７５、５０、４０、２５又は１０μｇ／Ｌ未満である。１つの実施形態では、脳脊髄液におけるＭｎ^２＋の濃度は、２．５、２、１．５、１又は０．５μｇ／Ｌ未満、あるいは５０、２５、１０又は５ｎＭ未満である。

【0032】

本発明の１つの実施形態では、ヒト患者は、気管支洗浄及び／又は血液検査によって測定したとき、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋のレベルが低下していた。

【0033】

「レベルが低下している」とは、気管支洗浄又は血液検査によって測定したときのＺｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋のレベルが平均的なヒトのレベル未満であることを意味する。

【0034】

本発明の１つの実施形態では、ＰｈｔＸで治療されるヒト患者は、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋が欠乏している。すなわち、Ｚｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋のレベルが、体液、例えば、血清、脳脊髄液、間質液、気管支洗浄における通常のレベルの９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５又は１％未満である。

【0035】

１つの実施形態では、ヒト患者はストレスを受けている。ストレスを受けた患者は、体内、例えば、血液、間質液、脳脊髄液及び／又はリンパにおけるＺｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋のレベルがより低下している。

【0036】

１つの実施形態では、ヒト患者は、菌株、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、及び／又はカタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の株の感染経験により、体内のＺｎ^２＋及び／又はＭｎ^２＋レベルがより低下している。感染経験は、任意で慢性細菌感染である。

【0037】

１つの実施形態では、ＰｈｔＸ、例えば、ＰｈｔＤの投与は、敗血症、菌血症、髄膜炎、中耳炎又は肺炎の形態の肺炎連鎖球菌感染症を治療又は予防するためである。

【0038】

また、ＰｈｔＸタンパク質は、本発明の方法又は使用において更なる抗原と有益に組合せてもよい。組合せるとは、キャリアタンパク質、又は遊離タンパク質、又は２つの混合物のいずれかとして、以下の組合せの中からタンパク質の全てを含む免疫原性組成物を意味する。例えば、下記のような２つのタンパク質の組合せでは、両方のタンパク質をキャリアタンパク質として使用してもよく、両方のタンパク質が遊離タンパク質として存在してもよく、両方がキャリア及び遊離タンパク質として存在してもよく、一方がキャリア及び遊離タンパク質として存在し、他方がキャリアタンパク質のみ又は遊離タンパク質のみとして存在してもよく、一方がキャリアタンパク質として存在し、他方が遊離キャリアタンパク質として存在してもよい。３つのタンパク質を組合せる場合、類似の可能性が存在する。組合せとしては、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端のキメラ又は融合タンパク質、ＰｈｔＤ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＤ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＤ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＤ＋ＰｓｐＡ、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端のキメラ又は融合タンパク質、ＰｈｔＡ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＡ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＡ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＡ＋ＰｓｐＡ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＡが挙げられるが、これらに限定されない。任意で、ＮＲ１ｘＲ２（又はＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡ又はＰｓｐＣに由来する。任意で、それはＣｂｐＡに由来する。他の組合せとしては、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２＋Ｐｌｙ及びＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤ等の３つのタンパク質の組合せが挙げられる。１つの実施形態では、ワクチン組成物は、キャリアタンパク質として解毒されたニューモリシン及びＰｈｔＤ又はＰｈｔＤＥを含む。更なる実施形態では、ワクチン組成物は、遊離タンパク質として解毒されたニューモリシン及びＰｈｔＤ又はＰｈｔＤＥを含む。１つの実施形態では、タンパク質の組合せは、ＰｈｔＤ及びニューモリシン又はＰｈｔＤ及び解毒されたニューモリシンを含む。１つの実施形態では、本発明の方法又は使用は、ＰｈｔＤ、解毒されたニューモリシン、及び少なくとも１つの肺炎連鎖球菌の莢膜糖の組合せを使用し、好ましくはキャリアタンパク質にコンジュゲートしている。

【0039】

１つの態様では、本発明は、ＰｈｔＸタンパク質と、異なる肺炎連鎖球菌の血清型に由来する糖類を含有する少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、又は２０の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートとを含む免疫原性組成物を提供する。このような実施形態では、少なくとも１つの糖は、ＰｈｔＤ等のＰｈｔＸタンパク質又はその融合タンパク質にコンジュゲートしており、免疫原性組成物は、ＰｈｔＸ、例えばＰｈｔＤに対する有効な免疫反応を誘発することができる。本発明の更なる態様では、免疫原性組成物は、異なる肺炎連鎖球菌の血清型に由来する糖類を含有する少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、又は２０の肺炎連鎖球菌の莢膜糖コンジュゲートと、遊離又はコンジュゲートしていないタンパク質としてＰｈｔＸタンパク質、例えばＰｈｔＤとを含む。

【0040】

１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ニューモリシンを含む。ニューモリシンは、例えば化学処理、又は少なくとも１つのアミノ酸の突然変異によって解毒されることが好ましい。

【0041】

本発明は、更に、薬学的に許容しうる賦形剤及び／又はアジュバントを含有する免疫原性組成物を提供する。

【0042】

本発明の免疫原性組成物は、特に高齢者集団における使用だけではなく幼児集団における使用を意図するとき、アジュバントを添加してもよい。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル又はリン酸アルミニウム又はアラム等のアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄又は亜鉛等の他の金属塩であってもよい。

【0043】

アジュバントは、任意で、ＴＨ１型の応答の優先的な誘導因子であるように選択される。このような高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞媒介性免疫反応を誘導する傾向があるが、高レベルのＴｈ２型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫反応を誘導する傾向がある。

【0044】

Ｔｈ１型免疫反応とＴｈ２型免疫反応との区別は絶対的ではない。実際には、個体は、主にＴｈ１又は主にＴｈ２であると説明される免疫反応を支持する。しかし、Ｍｏｓｍａｎｎ及びＣｏｆｆｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．及びＣｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．（１９８９年）ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７，ｐ１４５−１７３）によってマウスＣＤ４＋ｖｅ Ｔ細胞クローンに記載されている観点からはサイトカインのファミリーを考慮することが多くの場合便利である。従来より、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの産生に関係している。Ｔｈ１型免疫反応の誘導に直接関連していることが多い他のサイトカインは、ＩＬ−１２等のＴ細胞によって産生されるものではない。対照的に、Ｔｈ２型応答は、Ｉｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌に関係している。主にＴｈ１応答を促進する好適なアジュバント系としては以下が挙げられる：モノホスホリルリピドＡ又はその誘導体（又は一般的には解毒されたリピドＡ、例えば国際公開第２００５１０７７９８号パンフレットを参照されたい）、特に３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（調製については、英国特許出願公開第２２２０２１１ Ａ明細書を参照されたい）；及びモノホスホリルリピドＡ、任意で３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム）又は水中油型エマルションのいずれかとの組合せ。このような組合せでは、抗原及び３Ｄ−ＭＰＬが同じ微粒子構造に含有されているので、抗原性及び免疫賦活性シグナルをより効率的に送達することが可能になる。３Ｄ−ＭＰＬがアラム吸着抗原の免疫原性を更に増強できることが研究により示されている［Ｔｈｏｅｌｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８年）１６：７０８−１４；欧州特許第６８９４５４−Ｂ１号明細書］。

【0045】

増強された系は、モノホスホリルリピドＡ及びサポニン誘導体の組合せ、特に国際公開第９４／００１５３号パンフレットに開示されているＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又は国際公開第９６／３３７３９号に開示されているＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応性の低い組成物を含む。水中油型エマルション中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤が、国際公開第９５／１７２１０号パンフレットに記載されている。１つの実施形態では、免疫原性組成物は、更にサポニンを含み、それはＱＳ２１であってよい。また、前記製剤は、水中油型エマルション及びトコフェロールを含んでもよい（国際公開第９５／１７２１０号パンフレット）。また、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（国際公開第９６／０２５５５号パンフレット）及び他の免疫調節性オリゴヌクレオチド（国際公開第０２２６７５７号パンフレット及び国際公開第０３５０７８２２号パンフレット）も、ＴＨ１応答の優先的な誘導因子であり、本発明で使用するのに好適である。

【0046】

水中油型エマルションアジュバントは、それ自体、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（欧州特許第０ ３９９ ８４３Ｂ号明細書）、また水中油型エマルション及び他の活性剤の組合せは、ワクチン用のアジュバントとして記載されている（国際公開第９５／１７２１０号パンフレット；国際公開第９８／５６４１４号パンフレット；国際公開第９９／１２５６５号パンフレット；国際公開第９９／１１２４１号パンフレット）。油中水型エマルション（米国特許第５，４２２，１０９号明細書；欧州特許第０ ４８０ ９８２ Ｂ２号明細書）及び水中油中水型エマルション（米国特許第５，４２４，０６７号明細書；欧州特許第０ ４８０ ９８１ Ｂ号明細書）等の他のオイルエマルションアジュバントが記載されている。これらは全て、本発明のアジュバント及び組成物を形成するためにオイルエマルション系（特にトコールを組込む場合）を形成する。

【0047】

１つの実施形態では、オイルエマルション（例えば、水中油型エマルション）は、ＴＷＥＥＮ８０等の乳化剤及び／又はコレステロール等のステロールを更に含む。

【0048】

１つの実施形態では、オイルエマルション（場合により、水中油型エマルション）は、スクアラン、スクアレン又はαトコフェロール等のトコフェロール等の代謝可能な非毒性油（及び任意でスクアレン及びαトコフェロールの両方）、及び任意でＴｗｅｅｎ８０等の乳化剤（又は界面活性剤）を含む。また、ステロール（例えばコレステロール）を含んでいてもよい。

【0049】

水中油型エマルションを製造する方法は、当業者に周知である。一般に、方法は、トコール含有油相をＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（商標）溶液等の界面活性剤と混合し、次いで、ホモジナイザーを使用して均質化することを含む。混合物を注射針に２回通すことを含む方法が、少量の液体を均質化するのに好適であることが当業者には明らかであろう。同様に、６ｂａｒの最大圧力入力（約８５０ｂａｒの出力圧力）で２分間、最大５０パス、マイクロ流体装置（Ｍ１１０Ｓマイクロ流体装置）における乳化プロセスを、より少量又はより大量のエマルションを製造するために当業者が適合させることができる。この適合は、必要とされる直径の油滴の調製物が得られるまで、得られたエマルションを測定することを含むルーチンな実験により行うことができる。

【0050】

水中油型エマルションでは、油及び乳化剤は水性担体中に存在すべきである。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってよい。

【0051】

安定な水中油型エマルション中にみられる油滴の大きさは、光子相関分光法によって測定したとき、任意で１ミクロン未満であり、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲であってよく、任意で実質的に直径約３０〜５００ｎｍであり、任意で実質的に直径１５０〜５００ｎｍであり、特に直径約１５０ｎｍである。この点では、油滴の数の８０％が上記範囲内でなければならず、任意で油滴の数の９０％超、任意で９５％超が、規定の大きさの範囲内である。本発明のオイルエマルション中に存在する成分の量は、従来、（総投与体積の）０．５〜２０％又は２％〜１０％のスクアレン等の油；及び存在する場合、２〜１０％のαトコフェロール；並びに０．３〜３％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の界面活性剤である。任意で、油（例えばスクアレン）：トコール（例えばα−トコフェロール）の比率は１以下であるが、その理由は、これがより安定なエマルションを提供するためである。また、Ｔｗｅｅｎ８０又はＳｐａｎ８５等の乳化剤が、約１％のレベルで存在してもよい。場合によって、本発明のワクチンは安定剤を更に含有することが有利である場合もある。

【0052】

エマルション系の例は、国際公開第９５／１７２１０号パンフレット、国際公開第９９／１１２４１号パンフレット、及び国際公開第９９／１２５６５号パンフレットに記載されており、これらは、任意で免疫賦活剤ＱＳ２１及び／又は３Ｄ−ＭＰＬと共に製剤化される、スクアレン、α−トコフェロール、及びＴＷＥＥＮ８０に基づくエマルションアジュバントについて開示している。

【0053】

したがって、本発明の１つの実施形態では、本発明のアジュバントは、ＬＰＳ若しくはその誘導体及び／又はサポニン等の更なる免疫賦活剤を更に含んでもよい。更なる免疫賦活剤の例は、本明細書及び「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９９５年，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第６巻，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．及びＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘに記載されている。

【0054】

全身又は粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することにより、本発明の免疫原性組成物を含有するワクチン調製物を用いて、感染症に罹患しやすい哺乳類を保護するか治療することができる。これら投与は、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）の経路を介して；あるいは粘膜投与を介して、口道／消化管、呼吸管、尿生殖器管に注入することを含み得る。肺炎又は中耳炎を治療するためのワクチンの鼻腔内（ＩＮ）投与も可能である（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより有効に予防することができるので、最も早い段階で感染症が緩和されるため）。本発明のワクチンは、単回用量として投与してもよく、またその成分を同時に又は異なる時点で共投与してもよい（例えば、肺炎球菌の糖コンジュゲートは、別々に、同時に、又は互いに対する免疫反応を最適に協調させるためにワクチンの任意の細菌タンパク質成分を投与した１〜２週間後に投与してよい）。共投与の場合、任意のＴｈ１アジュバントは、異なる投与のいずれか又は全てに存在し得る。１つの投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を使用してもよい。例えば、糖類又は糖類コンジュゲートは、ＩＭ（又はＩＤ）投与してもよく、また、細菌タンパク質は、ＩＮ（又はＩＤ）投与してもよい。更に、本発明のワクチンは、初回抗原投与はＩＮ投与し、追加抗原投与はＩＭ投与してもよい。

【0055】

ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は、典型的に、１〜１００μｇ、任意で５〜５０μｇの範囲、例えば、５〜２５μｇの範囲である。初回ワクチン接種に続いて、被験体に１回又は適切な間隔で数回の追加免疫を行ってもよい。

【0056】

ワクチン調製物は、一般に、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ．Ｆ．＆ Ｎｅｗｍａｎ Ｍ．Ｊ．編）（１９９５年）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。リポソームへのカプセル化については、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎにより米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。

【0057】

本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、溶液で保存してもよく、凍結乾燥させてもよい。１つの実施形態では、スクロース、トレハロース、グルコース、マンノース、麦芽糖又はラクトース等の非晶質の凍結保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として作用する糖の存在下で溶液を凍結乾燥させる。１つの実施形態では、非晶質の凍結保護剤として作用する糖、及びグリシン又はマンニトール等のケーキ構造を改善する増量剤の存在下で溶液を凍結乾燥させる。結晶質増量剤の存在により、高塩濃度の存在下で凍結乾燥周期を短くすることができる。本発明の免疫原性組成物又はワクチンの凍結乾燥で使用されるこのような混合物の例としては、スクロース／グリシン、トレハロース／グリシン、グルコース／グリシン、マンノース／グリシン、マルトース／グリシン、スクロース／マンニトール／トレハロース／マンニトール、グルコース／マンニトール、マンノース／マンニトール及びマルトース／マンニトールが挙げられる。典型的に、２つの成分のモル比は、任意で１：１、１：２、１：３、１：４、１：５又は１：６である。本発明の免疫原性組成物は、任意で、上記凍結乾燥試薬を含む。

【0058】

上記安定剤及び安定剤の混合物は、ポリ（ビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルデンプン又はデキストラン等の製剤のガラス転移温度（Ｔｇ’）を上昇させることができるポリマー、又は、例えば１５００〜６０００の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びデキストラン等の結晶質増量剤として作用するポリマーを更に含んでもよい。

【0059】

本発明の免疫原性組成物は任意の経路で投与することができるが、記載されているワクチンの皮膚への投与（ＩＤ）が、本発明の１つの実施形態を形成する。ヒトの皮膚は、表皮を覆う角質層と呼ばれる外部の「角質」クチクラを含む。この表皮の真下に、真皮と呼ばれる層があり、それは、次に皮下組織を覆う。研究者らは、皮膚、特に真皮へのワクチン注入が免疫反応を刺激することを示し、これも多くの更なる利点に関係している可能性がある。本明細書に記載するワクチンの皮内接種は、本発明の任意の特徴を形成する。

【0060】

皮内注射の従来の技術である「ｍａｎｔｏｕｘ手順」は、皮膚を清浄にし、次いで、一方の手で伸ばし、ゲージの小さな針（２６〜３１ゲージ）の斜面を針の上方に向けた状態で１０〜１５°の角度で針を挿入する工程を含む。一旦針の斜面を挿入すると、針の注射外筒を下げ、僅かに加圧しながら更に進めて、それを皮膚の下で上昇させる。次いで、液体を非常にゆっくりと注入し、それによって、皮膚表面に水疱又は隆起が形成され、次いで、針をゆっくりと引き抜く。

【0061】

より近年では、皮膚に又は皮膚を貫通して液剤を投与するために特別に設計された装置が報告されており、例えば、国際公開第９９／３４８５０号パンフレット及び欧州特許第１０９２４４４号明細書に記載されている装置、また国際公開第０１／１３９７７号パンフレット；米国特許第５，４８０，３８１号明細書、米国特許第５，５９９，３０２号明細書、米国特許第５，３３４，１４４号明細書、米国特許第５，９９３，４１２号明細書、米国特許第５，６４９，９１２号明細書、米国特許第５，５６９，１８９号明細書、米国特許第５，７０４，９１１号明細書、米国特許第５，３８３，８５１号明細書、米国特許第５，８９３，３９７号明細書、米国特許第５，４６６，２２０号明細書、米国特許第５，３３９，１６３号明細書、米国特許第５，３１２，３３５号明細書、米国特許第５，５０３，６２７号明細書、米国特許第５，０６４，４１３号明細書、米国特許第５，５２０，６３９号明細書、米国特許第４，５９６，５５６号明細書、米国特許第４，７９０，８２４号明細書、米国特許第４，９４１，８８０号明細書、米国特許第４，９４０，４６０号明細書、国際公開第９７／３７７０５号パンフレット及び国際公開第９７／１３５３７号パンフレットに記載されているジェット式注射装置である。ワクチン調製物の皮内投与の代替方法としては、従来の注射器及び針、又は固体ワクチンを弾道的に送達するために設計された装置（国際公開第９９／２７９６１号パンフレット）、又は経皮的貼付剤（国際公開第９７／４８４４０号パンフレット；国際公開第９８／２８０３７号パンフレット）；又は皮膚表面への塗布（経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）又は経皮膚的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、国際公開第９８／２０７３４号パンフレット；国際公開第９８／２８０３７号パンフレット）を挙げることができる。

【0062】

本発明における用語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）は、いかなる場合においても、用語「なる」（「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」、「ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ」、及び「ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ」）と任意で置換可能であることを本発明者らは意図している。

【0063】

本発明の「ワクチン組成物」に関する本発明の実施形態は、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、逆も同様である。

【0064】

本明細書に引用する全ての参考文献又は特許出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0065】

より深く本発明を理解することができるように、以下の実施例を記載する。これら実施例は、例示のみを目的とし、いかなる方法であっても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0066】

方法
動物
この研究において使用したＯＦ１及びＣＢＡ／Ｊの雌マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Ｈａｒｌａｎ（Ｈｏｒｓｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。全ての実験及びアッセイは、Ｂｅｌｇｉａｎ ｎａｔｉｏｎａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎに従ってＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＧＳＫ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で行った。

【0067】

細菌の株及び培養条件
株２／Ｄ３９は、ＪＣ Ｐａｔｏｎ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から供与頂いた。株４／ＣＤＣ及び６Ｂ／ＣＤＣは、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）から入手し、１９Ｆ／２７３７株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。株３／４３は、Ｅ Ｙｏｕｒａｓｓｏｗｓｋｉ氏（Ｂｒｕｇｍａｎｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から供与頂いた。

【0068】

肺炎連鎖球菌株ＴＩＧＲ４｛Ｔｅｔｔｅｌｉｎ ２００１年｝は、Ａｎｄｒｅｗ Ｃａｍｉｌｌｉ氏（Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から供与頂いた。ＷＵ２株は、Ｄａｖｉｄ Ｅ Ｂｒｉｌｅｓ氏（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）から供与頂いた。４型株は、ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）から入手した。

【0069】

肺炎球菌は、慣例的に、３７℃／８％のＣＯ_２で０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物を含むＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ、Ｄｉｆｃｏ）中で増殖させた。適切な場合、それぞれ０．２及び２５０μｇ／ｍＬの濃度のエリスロマイシン及び／又はスペクチノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｏｒｎｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加した。

【0070】

大腸菌ＤＨ５α及びＪＭ１０９株（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、３７℃で１６時間、１．５％（ｗ／ｖ）のＢａｃｔｏ−ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を含む又は含まないＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢＴ、Ｄｉｆｃｏ）中で増殖させた。適切な場合、１００μｇ／ｍＬの濃度のエリスロマイシン又はスペクチノマイシンを添加した。

【0071】

Ｐｈｔの発生率に関する研究については、２３のインハウス及びｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｎｅｔｗｏｒｋ（ＰＭＥＮ）の株に加えて、３４の分離菌をＴＪ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ氏（Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から、６つの分離菌をＲＥ Ｇｅｒｔｚ氏（ＵＳＡ）から、２つの分離菌をＡＢ Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ（ＵＫ）から供与頂き、９つの分離菌をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。

【0072】

抗原
ＣｂｐＡ（又はＰｓｐＣ）は、Ｂｒｏｏｋｅｓ−ＷａｌｔｅｒらＪ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．６７；６５３３−６５４２（１９９９年）に記載の通り切頭型組換え型タンパク質であり、ＪＣ Ｐａｔｏｎ氏から供与頂いた。このタンパク質は、Ｄ３９株の配列から構築されており、したがって、クレードＡ．ＰｓｐＡ（クレード２）に属しており、ＰｓａＡは、２／Ｄ３９株に由来する組換えタンパク質である。ＯｇｕｎｎｉｙｉらＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８；３０２８−３０３３（２０００年）。両方とも、ＪＣ Ｐａｔｏｎ氏から供与頂いた。

【0073】

ＤＮＡ処理及び分析
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ又はＭｉｎｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｂｅｎｅｌｕｘ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、大腸菌プラスミドＤＮＡを得た。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＰＣＲ生成物を精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル上でＤＮＡ分解産物を精製した。制限酵素及びライゲーション酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ，Ｌｅｕｓｄｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手した。これら研究の各ＰＣＲ反応にはＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。全ての市販商品は、供給元により推奨されている条件下で用いた。

【0074】

ＤＮＡの配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシーケンサ（モデル３１００）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）においてＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて実施した。配列解析は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｖ６．５ソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ）又はＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ７．１ソフトウェア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ）を用いて実施し、入手可能な肺炎連鎖球菌のＴＩＧＲ４ゲノム配列（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）と配列を比較した｛Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ２００１年｝。

【0075】

肺炎連鎖球菌のゲノムＤＮＡ抽出
１又は２つの高濃度に（ｈｅａｖｉｌｙ）接種した血液寒天培地からコンフルエントになるまで一晩増殖させたものを１ｍＬのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；５ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）に収集することにより、各株から染色体ＤＮＡを得た。微量遠心機において最高速度で５分間細菌懸濁液を遠心分離し、ペレットを７５μＬのＴＥに再懸濁させた。リゾチーム（１００ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ及びプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを順次添加し、３７℃で４５分間インキュベートすることにより細胞溶解物を得た。次いで、５００μＬの溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；０．１４ＭのＮａＣｌ；０．１Ｍのクエン酸ナトリウム；１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；０．１％（ｗ／ｖ）のデオキシコール酸ナトリウム）を添加し、室温で１０分間インキュベートした。このインキュベート期間の最後に、酢酸アンモニウム（７．５ｍＭ、ｐＨ７．７）２５０μＬを粗溶解物に添加し、氷上で１０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミル（２５：２４：１）で粘着性のＤＮＡを２度抽出し、イソプロピルアルコール中で沈殿させた。得られたＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、０．６μＬのＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有する５０μＬのＴＥに再懸濁させた。ＤＮＡ懸濁液を４℃で保存した。

【0076】

ＲＮＡの単離
ＴＨＹにおける６００ｎｍの光学密度（ＯＤ_６００）０．０１から異なるＯＤ_６００まで増殖させた肺炎連鎖球菌から全ＲＮＡを単離し、様々な増殖期（初期対数期、ＯＤ_６００＝０．３；後期対数期、ＯＤ_６００＝０．９；静止期、ＯＤ_６００＝１．２）における遺伝子発現を評価した。細胞を遠心分離し、６ｍｇのリゾチームｍＬ^−１及び１ｍｇのデオキシコール酸ナトリウムｍＬ^−１を含有するＲＮＡａｓｅ不含Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、製造業者の指示に従って、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてＲＮＡ単離を行った。３７Ｃで１時間、ＲＮＡ１μｇ当たり１ユニットのＤＮａｓｅと共にＲＮＡサンプルをインキュベートし、次いで、６５℃で１０分間２．５ｍＭのＥＤＴＡでＤＮａｓｅを不活化することによりゲノミックＤＮＡの混入を除いた。製造業者の指示に従って、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して全ＲＮＡを定量した。

【0077】

ｃＤＮＡ末端の５’−迅速増幅（ＲＡＣＥ）
転写開始点を同定するために使用した方法は、Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ＆Ｈｏｂｂｓの改良法であった｛Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ １９９８年｝。簡潔に述べると、ｐｈｔＥ遺伝子の３’末端に特異的なプライマーを用いて、製造業者の指示に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で全ＲＮＡから第１鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。次いで、室温で１時間かけてＲＮＡａｓｅＡを添加し、ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにおいて３’平滑末端を作製した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ＥｃｏＲＶで切断されたｐＫＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に前記ハイブリッドを挿入した（一晩１６℃でインキュベート）。別の３’末端に特異的なｐｈｔＥリバースプライマー及びｐＫＳに特異的なＴ７プロモータプライマーを使用して、５’末端を増幅させるためのＰＣＲ反応を設定した。ｐＫＳ−ｃＤＮＡ接合物の配列を決定して、＋１塩基を同定した。

【0078】

転写ターミネーターの同定
Ｂｒｅｎｄｅｌ＆Ｔｒｉｆｏｎｏｖの方法に基づいてＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を用いてターミネータの同定を行った｛Ｂｒｅｎｄｅｌ １９８４年｝。

【0079】

ＲＴ−ＰＣＲ
以下の通りＲＴ−ＰＣＲ研究を行った。まず、全体積１０μＬの、３’−末端の遺伝子に特異的なリバースプライマー１０μＭ及びＲＮａｓｅＯｕｔ２０ユニットを含有する混合物中にて、６５℃で５分間ＲＮＡ（２μｇ）を変性させた。次いで、５ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのｄＮＴＰ、１５ユニットのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ｃＤＮＡ合成バッファ、及び体積が２０μＬになるまでリボヌクレアーゼ不含滅菌水を添加することにより、逆転写反応を行った。１時間５６〜５８℃で逆転写混合物をインキュベートし、次いで、８５℃で５分間逆転写酵素を変性させた。１ユニットのＲＮａｓｅＨと共に２０分間３７℃で逆転写溶液をインキュベートすることにより、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッド上のＲＮＡ鎖を分解した。逆転写反応に用いるための様々な５’遺伝子に特異的なフォワードプライマー及び３’遺伝子に特異的なリバースプライマー（最終濃度０．５μＭ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファ、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び体積が５０μＬになるまで滅菌水を用いて、２μＬのｃＤＮＡに対してＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲサイクルは、９４℃で５分間の初期変性と、次いで、９４℃で１５〜３０秒間の変性、５５℃（ｐｈｔＥ、ｐｈｔＤ）又は６３℃（ｐｈｔＢ、Ｄ、Ａ）で１５〜３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長の２５〜３０サイクルとからなり、そして、７２℃で５〜７分間の最後の伸長工程で完了する。ＲＮＡ調製物におけるＤＮＡの混入を除くために、逆転写反応していないＲＮＡで構成されるネガティブコントコールも実施した。１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ生成物を分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

【0080】

Ｐｈｔ突然変異体の調製
肺炎連鎖球菌ではなく大腸菌において複製するｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からミューテーターベクターを構築した。それらは、抗生物質耐性遺伝子の周囲に、除去されＰＣＲにより増幅されるｐｈｔ遺伝子の上流及び下流の領域に相当する組換え領域を含有する（必要に応じて、ミューテーターベクターを構築するために用いられるプライマー及び制限酵素部位を備えてもよい）。Ｐｈｔ欠損四倍変異株を調製するためには、２つの異なる遺伝子座（遺伝子座ｐｈｔＤ／ｐｈｔＥ、及び遺伝子座ｐｈｔＡ／ｐｈｔＢ）における欠損を組合せるために、２つの異なる抗生物質耐性遺伝子を使用しなければならなかった。ｐｈｔＤ／ｐｈｔＥ遺伝子座については、ｐＪＤＣ９ベクターの誘導体から増幅されるエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＢ）を選択した。ｐｈｔＡ／ｐｈｔＢ遺伝子座については、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄ（９）遺伝子））をｐＲ３５０プラスミド（Ｊ Ｐａｔｏｎ氏から供与頂いた）から精製した。

【0081】

様々な構築されたプラスミドを用いてＤＨ５α又はＪＭ１０９大腸菌株でクローニングを実施し、それぞれの抗生物質を含むＬＢ寒天にプレーティングした。ＣａＣｌ_２で処理した細胞を用いる標準的な方法により、プラスミドＤＮＡで大腸菌を形質転換した。｛Ｈａｎａｈａｎ １９８５年｝
２つの連続する培養工程により、形質転換用の４／ＣＤＣ肺炎連鎖球菌株を調製した後、ＣＴＭ培地（１０ｇ／Ｌのカザミノ酸；５ｇ／Ｌのトリプトン；５ｇ／ＬのＮａＣＬ；１０ｇ／Ｌの酵母抽出物；０．４ＭのＫ_２ＨＰＯ_４；２０％のグルコース；３０ｍｇ／ｍＬのグルタミン；１％のＢＳＡ、０．１ＭのＣａＣＬ_２；ｐＨ７．８）に再懸濁させ、分注し、１５％グリセロール中で凍結させた。これらアリコートを形質転換に使用した。融解させた後、ＣＳＰ−１又はＣＳＰ−２（ＣＴＭ培地中１００ｎｇ／ｍＬ）を添加して受容能を誘導し、３７℃で細菌をインキュベートした。様々な時間をかけて（５、１０、１５、及び２０分）、受容能を最適化させた。１μｇのミューテーターベクターを添加した後、振盪させながら３２℃で３０分間細胞をインキュベートし、次いで５％ＣＯ_２下で３７℃にて２〜４時間インキュベートした。最後に、適切な抗生物質を含む血液寒天に細菌をプレーティングした。四重突然変異体については、上記と同じプロトコールを用いることによりＰｈｔＡ、Ｂを欠損させるプラスミドでＰｈｔＤ、Ｅ−ＫＯ株を形質転換した。

【0082】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析
５つの高濃度に接種した血液寒天プレートからコンフルエントになるまで一晩増殖させたものを滅菌ＰＢＳ１ｍＬ（０．１４ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．２）に収集し、５６℃で４５分間のインキュベート工程を行うことにより、加熱殺菌された細菌懸濁液を得た。次いで、前記加熱殺菌された懸濁液にサンプルバッファ（６０ｍＭのＴｒｉｚｍａ塩基、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー、２％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール）を添加した。５分間調製物を沸騰させて、２分間微量遠心機において最高速度で遠心分離し、Ｌａｅｍｍｌｉ｛Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０年｝によって記載されている通り、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。｛Ｔｏｗｂｉｎ １９７９年｝に記載されている通り、アクリルアミドゲルからタンパク質を電気泳動でニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）上に転写した。ｐｈｔＤに対して増加するマウスポリクローナル抗体をプローブとして膜を探索し、次いで、アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ．）にコンジュゲートしているヤギ抗マウスＩｇＧで探索した。酵素で標識したバンドをＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質系で可視化した。

【0083】

イオン欠損培地における培養物の増殖
野生型の４／ＣＤＣ株、及び対応するＰｈｔＤ−及びＰｈｔ−欠損四重突然変異体株を、化学的に定義される合成培地（ＭＳ）における様々なイオン枯渇又は補充条件下で培養した｛ＳＩＣＡＲＤ１９６４年｝。あるいは、Ｍｎ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｃｕ^２＋、又はＺｎ^２＋の濃度を上昇させることによりＭＳ培地に補充した。対数増殖期の間及び静止期に６００ｎｍにおける光学密度をモニタした。結果を野生型のものと比較した。

【0084】

野生型のＷＵ２株を、Ｚｎ特異的キレート剤であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）と共に又は無しで培養して、（ＲＴ−ＰＣＲにより）ＲＮＡ及び（フローサイトメトリーにより）タンパク質レベルでＰｈｔ発現に対する亜鉛枯渇の効果を観察した。

【0085】

フローサイトメトリー
対数増殖期まで、３７℃、８％ＣＯ_２でＴＨＢ＋０．５％の酵母抽出物中でＷＵ２細菌を増殖させた。あるいは、培地にＴＰＥＮ３０μＭ（亜鉛キレート剤）を添加した。遠心分離後に、対照として抗ＰｈｔＥ、抗ＰｈｔＢ／Ｄ、抗ＰｈｔＤ／Ｅ又は抗３型多糖モノクローナル抗体を含有する溶液中に細菌のペレットを再懸濁させた。４℃で２時間後；溶液を遠心分離し、細菌のペレットをＰＢＳ−ＢＳＡ２％で洗浄した後、ＰＢＳ−ＢＳＡ２％中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）にコンジュゲートしているヤギ抗マウス二次抗体中で室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ−ホルムアルデヒド０．２５％で細胞を固定し、ＦＡＣＳ分析を行った。表面の蛍光のメジアンを記録した。

【0086】

定量逆転写酵素ＰＣＲ
Ｏ．Ｄ．が約０．５（対数増殖期の中間）まで増殖させたＤ３９株の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（商標）Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量した。３７℃で３０分間、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１．５μＬでサンプル（１μｇ）を２度処理した。１μＬのＤＮａｓｅ ＳＴＯＰを添加し、次いで、６５℃で１０分間インキュベートすることにより反応を停止させた。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び組換え型ＲＮａｓｉｎ（商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて第１鎖のｃＤＮＡを生成した。製造業者が記載の通り、ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、反応体積５０μＬでリアルタイムＰＣＲを実施した。以下のプライマー及びプローブを用いた：ｇｙｒＢ、ＧＧＧＡＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＧ（フォワード）、ＧＧＡＡＴＣＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＡＣ（リバース）及びＴＴＡＣＣＡＡＴＣＧＣＣＴＣＴＴＣ（プローブ）；ｐｈｔＤ、ＣＣＣＡＴＧＣＧＧＡＣＡＡＴＡＴＴＣＧ（フォワード）、ＴＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧ（リバース）、ＣＧＴＴＴＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＴ（プローブ）。

【0087】

全てのアッセイをデュープリケートで行い（培養からｑ−ＰＣＲまで）、キャリブレータとしてＴＨＢのみ中で増殖させたｇｙｒＢを内部対照として用いて２^{−ΔΔＣＴ}法（Ｌｉｖａｋ＆Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１年）により相対的な遺伝子転写を分析した。

【0088】

Ｐｈｔ出現率の測定
肺炎連鎖球菌の代表的な株を選択するために、ＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉ−Ｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｅ；ｗｗｗ．ｍｌｓｔ．ｎｅｔ）によって決定したときの株の遺伝子型に従って母集団構造を分析した。ＭＬＳＴ分離配列型（ＳＴ）に基いて、主なクローンの系統を決定した。各群について、出現率を分析するための代表的な株を選択した。これは、抗ＰｈｔＤポリクローナル抗体（Ａ、Ｂ及びＤと交差反応し得る）又は抗ＰｈｔＥを用いて全細菌抽出物に対してウェスタンブロッティングを行うにより、及びＰｈｔＡ、Ｂ、Ｄ又はＥに特異的なプライマーを用いて肺炎球菌のゲノミックＤＮＡに対してＰＣＲを行うことにより実施した。

【0089】

ＰｈｔＤ保存分析のためのＤＮＡの配列決定
ＰｈｔＤに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１０７のＭＬＳＴで選択された株のＤＮＡをＰＣＲ増幅した。１０７の配列をＣｌｕｓｔａｌＸプログラムによって整列させ、Ｓｕｐｅｒｎｅｅｄｌｅプログラムにより同一性を計算した（同一性の割合は１００×（同一数／最短配列の長さ）である。

【0090】

実施例１
ｐｈｔ遺伝子の特性評価
ｐｈｔ遺伝子のゲノムの構成
先行研究において、肺炎連鎖球菌ＳＰ６４株のゲノミックライブラリーに由来する重複クローンのＤＮＡ配列決定｛Ｈａｍｅｌ ２００４年｝及びＰＣＲ分析により、この種の６Ｂ株におけるｐｈｔ遺伝子及びその近傍の遺伝子のゲノムの構成を推定することができた。ＰｈｔＤ及びＰｈｔＥ遺伝子に加えてｐｈｔＡ及びｐｈｔＢの遺伝子も対として構成されていた。ＴＩＧＲウェブサイト（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）におけるＢＬＡＳＴ分析｛Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ２００１年｝は、２つの遺伝子タンデムが肺炎連鎖球菌ＴＩＧＲ４ゲノム中に１６１ｋｂｐ離れて位置していること、及びゲノムの構成がＳＰ６４株でみられるものと同一であることを示した（図１）。また、後者ではｐｈｔＡが欠けていることを除いて４／ＣＤＣ株及びＷＵ２株にも同じｐｈｔ遺伝子構成がみられた（データは示さない）。ＴＩＧＲ４株ＤＮＡにおけるｐｈｔ遺伝子の周囲を配列決定することにより、後者の所見が確認された（データは示さない）。更なる分析により、ＴＩＧＲ４株においてｐｈｔＡ及びｐｈｔＢは１５７ｂｐが離れているが、一方ｐｈｔＤ及びｐｈｔＥは２０９ｂｐ離れていることが示され、これを更なる研究のために選択した。

【0091】

ｐｈｔＤ−ｐｈｔＥのタンデム側では、ラミニン結合タンパク質をコードするＡ群及びＢ群の連鎖球菌ｌｍｂ遺伝子（それぞれ、アクセッション番号ＡＡＫ３４６８９｛Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ２００１年｝及びＡＡＤ１３７９６｛Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ １９９９年｝）に対して７２％の類似性を示す遺伝子が、ＰｈｔＤ遺伝子の７ｂｐ上流に位置していた（図１）。また、この遺伝子産物は、最近、ＡｄｃＡＩＩと命名され、ＡＢＣ輸送体様亜鉛結合タンパク質であると説明された｛Ｌｏｉｓｅｌ ２００８年｝。ｌｍｂ遺伝子ホモログの１４２ｂｐ上流に位置する１３９２ｂｐのＯＲＦは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）代謝産物輸送体ＹｆｎＡタンパク質（アクセッション番号Ｄ６９８１４）と６４％の配列類似性を表し、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（アクセッション番号ＡＡＫ３３１５７）の推定アミノ酸透過酵素と８１％の類似性を表すタンパク質をコードしている｛Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ２００１年、Ｋｕｎｓｔ １９９７年｝。ｐｈｔＥの最初の４８１ｂｐと７９％の同一性を示す配列（ｐｈｔＦと提案）が、ｐｈｔＥの終止コドンの２２６ｂｐ後にみられた（図１）。また、この配列は、ｐｈｔＡ、Ｂ及びＤ遺伝子と７２％の同一性を示す。

【0092】

ｐｈｔＡ−ｐｈｔＢのタンデム側では、唾液連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のｐｔｓＩ遺伝子（アクセッション番号Ｐ３０２９９）｛Ｇａｇｎｏｎ １９９２年｝と７３％の配列相同性を表す１３３２ｂｐのＯＲＦが、ｐｈｔＡ遺伝子の２５３ｂｐ上流に位置していた（図１）。この遺伝子は、全ゲノム配列（アクセッション番号ＡＡＫ７５２８５）で見出されたｐｔｓＩ遺伝子と比較して、本発明者らが配列決定したＴＩＧＲ４株におけるフレームシフトを示した。両方の遺伝子対の直下流には機能的なＯＲＦは位置していなかった。

【0093】

実施例２
ｐｈｔ遺伝子の転写機構
ｐｈｔ遺伝子のゲノムの構成は、タンデムな遺伝子が協調して転写される可能性があることを示唆していた。したがって、この仮説について考察するために更なる研究を行った。まず、ｐｈｔ遺伝子の推定上のプロモーター及びリボソーム結合部位を同定した。ｐｈｔＥ遺伝子における５’−ＲＡＣＥにより、その転写開始点を同定することができ、それからプロモーター領域を推定した。転写開始部位（＋１）は、ＰｈｔＥ翻訳開始部位の９６塩基上流、典型的な肺炎連鎖球菌の−１０〜−３５ＲＮＡポリメラーゼ結合部位の下流｛Ｍｏｒｒｉｓｏｎ １９９０年｝、及びリボソーム結合部位の上流に位置することが見出された（図２ａ）。類似した配列構成は、ｐｈｔＡ、ｐｈｔＢ及びｙｆｎＡ遺伝子の上流にもみられ、これは推定上のプロモーターの存在を示す（図２ｂ、ｃ及びｅ）。しかし、ｌｍｂ遺伝子に極近接しているため（７ｂｐ）、ｐｈｔＤ遺伝子についてはプロモーター配列が同定されなかった。他方、他のｐｈｔ遺伝子の−３５配列と同一の配列は、ｌｍｂ遺伝子の上流に位置していた（図２ｄ）。リボソーム結合部位は、全ての開始コドンの５〜７ｂｐ上流に観察された。

【0094】

また、ｐｈｔ及び隣接する遺伝子の転写終結部位を同定した。予測されるｍＲＮＡ二次構造のコンピューター分析により、遺伝子の３’末端にステムループターミネーター様構造の存在が示唆された。ヘアピン構造を形成することができ、計算された自由エネルギーの解離（ΔＧ）は、Ｔｕｒｎｅｒら（１９８８年）の方法｛Ｔｕｒｎｅｒ １９８８年｝により測定したとき、それぞれ、ｐｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ｐｈｔＡ、及びＰｔｓＩについて−９．４、−２７．０、−１６．８、及び−２１．６ｋｃａｌ ｍｏｌ^−１であった。実際、ｐｈｔＤ遺伝子について同定されたターミネーターは、ＯＲＦ ＳＰ１００３についてはＴＩＧＲウェブサイトによって報告されたものと同一であり、ｐｈｔＤ遺伝子のホモログに一致していた（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）。他のｐｈｔ又は周囲の遺伝子については、ＴＩＧＲのグループでは転写ターミネーターが同定されなかったが、これは恐らく両方の研究によって使用されるアルゴリズム差が反映されている。ほとんどのヘアピンは、原核生物の転写ターミネーターで典型的にみられるＴ残基の伸張で終端しており｛Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ １９７９年｝、終止コドンの７０ｂｐ下流に位置していた（図３）。興味深いことに、ｐｈｔＥターミネーター配列（ΔＧは−４．７ｋｃａｌ ｍｏｌ^−１である）は、その終止コドン及びｐｈｔＦ遺伝子の１８６７ｂｐ下流に位置しており、後者のＯＲＦは、インフレームの終止コドンを含有しており、翻訳が妨げられていた（図３ａ）。ｙｆｎＡ及びｌｍｂの遺伝子の下流にターミネーター配列は同定されなかった。

【0095】

ゲノムの構成は、ｐｈｔＥがｙｆｎＡ、ｌｍｂ、ｐｈｔＤ、ｐｈｔＥ及びｐｈｔＦ遺伝子から構成されるオペロンの一部である可能性があることを示唆した。しかしながら、５’−ＲＡＣＥ（図２ａ）及びターミネーター同定（図３ａ）は、ｐｈｔＥが、ｐｈｔＥ及びｐｈｔＦの遺伝子から構成されているバイシストロニックなメッセージにおいて転写される最初の遺伝子であることを示し、これは、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。ｐｈｔＥ〜ｐｈｔＦの領域はＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたが（図４ａ、レーン４及び６）、一方、遺伝子ｐｈｔＤとｐｈｔＥとの間の領域に特異的なプライマー対を用いても増幅産物は得られなかった（図４ａ、レーン５）。これは、ｐｈｔＤの下流で転写が終結することを示す（図３ｃ）。

【0096】

図４ａ（レーン１〜３）において示されるように、ＲＴ−ＰＣＲによりｙｆｎＡ〜ｐｈｔＤの領域が増幅された。更に、Ｌｏｉｓｅｌら｛Ｌｏｉｓｅｌ ２００８年｝は、このｐｈｔＤ転写物が、ｙｆｎＡ、ｌｍｂ及びｐｈｔＤに加えて、ｙｆｎＡの上流の２つの遺伝子もコードすることを示した（シトクロムｃの生物発生に関与するｃｃｄＡ及びチオレドキシンと類似性を示すｓｐｒ０９０４）。興味深いことに、ｌｍｂ遺伝子の上流の推定上のプロモーターの同定（図２ｄ）は、ｐｈｔＤ及びｌｍｂの遺伝子の転写カップリングを示唆した。

【0097】

ｐｈｔＢ及びｐｈｔＡの遺伝子について得られた結果は、プロモーター（図２ｂ及びｃ）及びターミネーター部位同定（図３ｂ及びｄ）によって示唆される通り、これらがモノシストロニックなｍＲＮＡとして転写されることを示した。ＲＴ−ＰＣＲによるｐｈｔＡ及びｐｈｔＢの転写機構の分析は、ｐｈｔＢに特異的なプライマーを用いてｐｈｔＢに特異的なアンプリコンを明らかにした（図４ａ、レーン７）。ｐｈｔＡとｐｈｔＢとの間の領域を増幅するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲでは増幅産物は得られなかった（図４ａ、レーン８）。これは、ｐｈｔＡ及びｐｈｔＢの遺伝子のモノシストロニックな構成を示す。ターミネーター部位同定（図３ｅ）は、ｐｔｓＩがモノシストロニックなメッセージとして転写されることを示し、これはまた、ｐｈｔＡがポリシストロニックな転写物の一部ではないことを確認した。

【0098】

実施例３
Ｐｈｔ突然変異体の構築及び使用
突然変異体の特性評価
突然変異体ＰｈｔＡ⁻、ＰｈｔＢ⁻、ＰｈｔＤ⁻、ＰｈｔＥ⁻及び四重突然変異体ＰｈｔＡＢＤＥ⁻を構築した。組換えの正確さを評価するために、突然変異株のゲノミックＤＮＡを精製し、組み換え領域の配列を決定した（データは示さない）。更に、マウスのポリクローナル抗ＰｈｔＤ抗体を使用して、突然変異体の表現型をイムノブロッティングにより特性評価した（図５）。この抗体は４つのＰｈｔアイソタイプを全て認識した。しかし、ＰｈｔＥバンドはより弱く、他の３つからのこのＰｈｔが最も離れていることが確認された。

【0099】

細菌増殖に対する様々なイオンの影響
Ｐｈｔの四重突然変異体の増殖は、野性型株及び様々なＰｈｔ単一突然変異体と比べて、ＭＳの培地において劇的に減少した（図６ａ）。２００μＭ以下のＦｅ^２＋、Ｚｎ^２＋又はＭｎ^２＋を培地に添加した場合、野生型及びＰｈｔＤ欠損突然変異体の増殖は僅かに改善された（ＭＳのみに対する増殖率：９６〜１３０％）。対照的に、四重突然変異体の挙動は著しかった。ＭＳに対して２００μＭのＦｅ^２＋を添加した場合、増殖は２５．３％しか増加しなかったが（図６ｄ）、同濃度のＺｎ^２＋又はＭｎ^２＋は、四重突然変異体の増殖能を回復させた（図６ｂ、ｃ）。これは、ＭＳのみにおいて得られたものと比較して、増殖速度が最大９２．３％増加したことを表す。しかし、この増殖速度の回復は遅く、培養の最初の数時間以内には改善がみられず、一晩インキュベートした後にしかみられなかった。Ｚｎ^２＋又はＭｎ^２＋が増殖を回復させたように、Ｍｇ^２＋の添加は２００μＭでは完全に増殖を回復させられなかったが、１ｍｇ／ｍＬのＭｇ^２＋をＭＳに添加したときには、類似する増殖速度の増加がみられた（データは示さない）。高濃度のＣｕ^２＋の添加は、野生型及び突然変異株に対して有毒であった（データは示さない）。

【0100】

実施例４
ｐｈｔ発現に対する亜鉛枯渇の効果
培養培地に亜鉛キレート剤ＴＰＥＮを添加した場合、フローサイトメトリー実験によって測定したとき、Ｐｈｔタンパク質の発現レベルが増加した（図７ａ、ｂ、ｃ）。対照として、同じ亜鉛枯渇条件下における抗３型多糖抗体では平均蛍光の変化がみられなかった（図７ｄ）。ＲＮＡレベルでは、亜鉛枯渇条件でｐｈｔＥ転写レベルが最大２５倍増加することをＲＴ−ＰＣＲにより測定することができた（データは示さない）。

【0101】

更に、ＴＨＢ又はＴＨＢ＋２５μＭのＴＰＥＮのいずれか中で増殖させた肺炎球菌分離菌（Ｄ３９株）から精製したｍＲＮＡを用いて、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。培地に添加したキレート剤の濃度は、予備実験で求められた通り、最適以下であった。これは、ＴＰＥＮが、（ＴＰＥＮ濃度が、培地中の全てのイオンをキレート化するのに十分高いときにみられる通り）増殖を妨げはしないが、増殖を遅らせる（データは示さない）ことを意味する。培地にＴＰＥＮを添加することにより、ｐｈｔＤのｍＲＮＡ発現レベルが４．８４倍増加した。２５μＭのＺｎＳＯ_４でＴＨＢ＋ＴＰＥＮを補償することにより、ｐｈｔＤのｍＲＮＡの発現は、培地のみでみられたレベルと同様のレベルにまで回復した。これは、ＴＰＥＮによりキレート化され得る全てのイオン（Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｃａ）の中でも、ＺｎがｐｈｔＤの発現レベルに対して大きさ影響を有することを示唆する。

【0102】

実施例５
肺炎球菌におけるＰｈｔ出現率
合計７４株（２３のＰＭＥＮ及びインハウス株を含む）について調査した。この代表的な株のセットでは、１８のクローンの系統が示され、２７の異なるＳＴを備えた４６株（６１％）が３つの主なクローン群（１、１１及び２３）に属し、５６の異なるＳＴが存在し、その中で更に説明されるのは８１、９０、１２４、１５６、１６２及び１９９（２２株）であり、２７の異なる血清型が存在し、更に説明されるのは１９Ｆ、６Ｂ、３及び２３Ｆ（全ての株の４７％）であった。

【0103】

ゲノミックＤＮＡに対するＰＣＲによって、それぞれ株の１００％、９７％、８１％及び６２％にＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｈｔＢ及びＰｈｔＡの遺伝子が見出された。株の５４パーセントは、そのゲノムに４つのｐｈｔ遺伝子を有することが見出された。ＰｈｔＤに対して増加するポリクローナル抗体を用いたイムノブロットにおいて、全ての株でＰｈｔＤを検出することができた。同様に、他のＰｈｔは、それぞれの遺伝子を有する全ての株においてイムノブロッティングによって見出された。特に、遺伝的に最も分化しているので、ＰｈｔＥは、それに対して特異的に増加するポリクローナル抗体でよりよく検出された（図８）。６つの分離菌でより小さなサイズ（１０ｋＤａ小さい）、及び８つの株で更により小さなサイズ（２０ｋＤａ小さい）のＰｈｔＥ等の幾つかの特殊なＰｈｔが見出された。同様に、４株は、切頭型ＰｈｔＡを生成することが見出され（図８）、この遺伝子はＰＣＲにより検出されなかった。興味深いことに、これらの４つの株は、２０ｋＤａ切頭されたＰｈｔＥも発現した。少なくとも、ｐｈｔＢ陰性株のｐｈｔＡ／Ｂ遺伝子座の配列決定により、この遺伝子座の中に存在する唯一の遺伝子がｐｈｔＡ及びｐｈｔＢ、又はｐｈｔＡ及びｐｈｔＤ遺伝子のいずれかのハイブリッドであったことが明らかになった。

【0104】

興味深いことに、配列分析により、ｐｈｔ遺伝子によってコードされるシグナル配列が各Ｐｈｔファミリーのメンバーにとって特異的であったことが実証された。実際、Ｐｈｔファミリーのメンバーに特異的なシグナル配列は、別のＰｈｔファミリーのメンバーのシグナル配列と少なくとも１つの位置において異なる（表１を参照されたい）。

【0105】

次に、Ｐｈｔ発現プロファイルと分離物の遺伝子型／血清型との間を関連づけられるかどうか判定することを試みた。分析した株において、血清型２、４、１４、６Ｂ及び７Ｆの分離菌は全て４つのＰｈｔを有しており、血清型３、９、１９Ｆ及び２２Ｆの分離菌は全て、ＰｈｔＡが欠けているか又はより小さなＰｈｔＡを有していた。

【0106】

ＭＬＳＴ遺伝子型とＰｈｔ発現プロファイルとの間の潜在的な関連に関して、以下の特徴を求めることができた：１０ｋＤａ切頭されたＰｈｔＥは、主に遺伝子型ＳＴ１９９群で見出された。これら株の血清型は１９Ｆ、１９Ａ、１５Ａ、１及び６Ａである。全て同じクローン系統（群１）に属するが、異なる血清型（９、１９Ａ、１９Ｆ、１４）を有する８つの分離菌において２０ｋＤａ切頭されたＰｈｔＥが観察された。最後に、異なるクローンの系統においてＰｈｔＡを欠く株が観察された。したがって、ＰｈｔＡの欠損と遺伝子型との間の主な関連は同定されなかった。

【0107】

実施例６
ＰｈｔＤの保存
Ｐｈｔの出現率に関する研究では、ＰｈｔＤは試験された全ての肺炎球菌株中に存在することが見出された。このことは、ＰｈｔＤがＰｈｔファミリーの中で最良のワクチン候補であることを示す。この点で、肺炎球菌株中の配列保存のレベルを決定することが必須であることが分かった。そのために、ＤＮＡの配列決定を実行した。

【0108】

１０７の株（ＭＬＳＴ分類に基いた）の分析から、ＰｈｔＤの長さが８３１〜８５３アミノ酸で変動し、分子量は約１００ｋＤａであると求められた。ＰｈｔＤは、試験された１０７の株の間で高度に保存されており、１つの配列だけが、切頭型タンパク質（株４／７５）のため停止を示した。プロリンの多い領域は、全ての株について１３〜１５のプロリンを含有していた（７つの株では、プロリンは１１〜１３のみであった）。４未満のアミノ酸が変異している制限された伸長が、ＰｈｔＤの配列で見出された。

【0109】

考察
Ｐｈｔタンパク質は、肺炎球菌感染症に対するワクチンに配合するのに有望な候補である。その点では、肺炎球菌の病因におけるその役割をより明確に定義するために、これらタンパク質の発現をいかに調節するかを調べることが重要であると考えられる。

【0110】

ゲノム分析は、４つの遺伝子ホモログがタンデムに配置されていることを示した。ｐｈｔＥ遺伝子の下流に（切頭されてはいるが）ｐｈｔ遺伝子ファミリー５番目のメンバーが存在することも証明され、従来の研究における所見が確認された｛Ａｄａｍｏｕ ２００１年｝。同じ構成が肺炎連鎖球菌のＲ６株ゲノム（アクセッション番号ＡＡＫ９９７１４）でもみられるので、この切頭は保存されていると考えられる。｛Ｈｏｓｋｉｎｓ ２００１年｝
ｐｈｔ遺伝子のタンデムな構成がｐｈｔのバイシストロニックな転写とは相関していないことが本研究で示された。試験した条件下では、これら遺伝子はいずれもこれらと関連するｐｈｔ近傍とは共転写されなかった。プロモーター及びターミネーターの分析は、従来のＲＴ−ＰＣＲ研究とよく相関していた。ｐｈｔＢ、ｐｈｔＡ及びｐｈｔＥ遺伝子は、全て個々の推定上のプロモーターを有しており、且つ対応する終止コドンの直後でｍＲＮＡ転写が恐らく終結することが本研究で実証された。他方、ｐｈｔＤ遺伝子の特色を観察した。実際、ｐｈｔＤについてインシリコで同定されたプロモーターは存在しなかった。その代り、ｐｈｔＤの上流に位置する２つの遺伝子であるｌｍｂ及びｙｆｎＡ遺伝子についてプロモータは同定されたが、転写ターミネーターは同定されず、これは、これら遺伝子がオペロン系で構成されることを示す傾向があった。これは、上流の４つの遺伝子と共に大規模なオペロン系でｐｈｔＤが発現し得るという最近の所見に確証を与える｛Ｌｏｉｓｅｌ ２００８年｝。しかし、ｙｆｎＡ及びｌｍｂについてプロモーターが同定されたという事実は、これらの位置で転写が開始され得ることを示し、これは、異なる長さのｐｈｔＤ含有転写物が生成され得ることを意味する。更に、ｌｍｂ遺伝子の上流にａｄｃＲ結合部位が同定され｛Ｌｏｉｓｅｌ ２００８年、Ｐａｎｉｎａ ２００３年｝、これはｌｍｂ及びｐｈｔＤを含む亜鉛で調節されるバイシストロニックな転写物も存在し得ることを示す傾向があり、これは、他の研究者によっても示唆されている。Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇらによる研究｛Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ １９９９年｝は、生成物がｐｈｔ遺伝子産物（アクセッション番号ＡＦ０６２５３３）の最初の２２５（ｐｈｔＥ）及び最初の２２８（ｐｈｔＡ、ｐｈｔＤ及びｐｈｔＢ）アミノ酸と６７％の配列相同性を示す遺伝子と、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）のｌｍｂ遺伝子とが共転写されることを示した。また、Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）のゲノムにおいて同等のゲノム配置が観察された｛Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ２００１年｝。更に、ｌｍｂ及びｐｈｔＤの共転写は、機能的な関連を示す可能性があると提唱されており、後者の遺伝子産物は肺炎球菌の接着及び侵入に関与している｛Ｐａｎｉｎａ ２００３年｝。

【0111】

それぞれ輸送及び特異的結合活性に関与している可能性がある他の２つの遺伝子ｙｆｎＡ及びｌｍｂを含むポリシストロニックなメッセージとしてｐｈｔＤ遺伝子が転写され得ることに留意することは興味深い。実際、肺炎連鎖球菌におけるＹｆｎＡ｛Ｈｏｓｋｉｎｓ ２００１年｝、ならびに枯草菌｛Ｙａｍａｍｏｔｏ １９９７年｝、化膿性連鎖球菌｛Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ２００１年｝及びミュータンス菌｛Ａｊｄｉｃ ２００２年｝における相同タンパク質は、透過酵素のスーパーファミリーのメンバーであるアミノ酸輸送体であると考えられる。Ｌｍｂタンパク質に関して、それは、ＡＢＣ輸送体様亜鉛結合タンパク質｛Ｌｏｉｓｅｌ ２００８年｝及び推定上のラミニン結合タンパク質｛Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ １９９９年｝として記載されている。実際、このタンパク質は、口内連鎖球菌において最初に見出されたが｛Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ １９９４年｝、その後他の連鎖球菌及び属でも発見された｛Ｃｏｃｋａｙｎｅ １９９８年｝ＬｒａＩとして知られているアドへリンファミリーと類似性を示す。ＬｒａＩ様タンパク質は、連鎖球菌によるヒト上皮のコロニー形成及びその後の血流への侵入に関与していることが示唆された｛Ｅｌｓｎｅｒ ２００２年｝。オペロン系においてｙｆｎＡ、ｌｍｂ及びｐｈｔＤが会合している理由は明らかではない。妥当性のある１つの仮説は、これら３つのタンパク質が、例えばそれらの機能において必ずしも関連する訳ではなく、侵入又は増殖のために細菌サイクルの同時点で必要であるということである。しかし、Ｐｈｔタンパク質の役割を決定するｋとは、このゲノム上の会合について幾つかの糸口を与える可能性がある。種内のＰｈｔタンパク質間の類似性が交換可能な役割を示すと推測することができる。また、タンパク質がその相同領域を通して類似の機能を共有すると同時に、細菌の異なる発生段階でさえも異なる活性を発揮する可能性もある。本発明者らが生成した様々なＰｈｔ欠損突然変異体からのタンパク質抽出物を用いたイムノブロッティングにおいて得られた結果は、残りのＰｈｔ遺伝子産物の発現レベルを高めても遺伝子の喪失は補償されないことを示す傾向がある。また、この特徴は、ＲＴ−ＰＣＲの使用により、ＲＮＡレベルにおいても最近報告されている｛Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ２００９年｝。

【0112】

上述の通り、Ｐｈｔタンパク質は全て、金属結合に関与していると考えられるヒスチジントライアドモチーフを共有している｛Ａｄａｍｏｕ ２００１年、Ｈａｍｅｌ ２００４年、Ｚｈａｎｇ ２００１年｝。興味深いことに、これらのモチーフは、特に立体構造的に機能的なＰｈｔタンパク質を生成するための亜鉛結合に関与している可能性があると推測されている｛Ｐａｎｉｎａ ２００３年｝。また、同じ著者らは、亜鉛を制限した環境がＰｈｔタンパク質の発現並びに好ましい連鎖球菌属のコロニー形成及び侵入を誘導することができると仮定した。この状況において、本発明者らは、野生型及びＰｈｔ欠損株を様々なイオン枯渇及び補充条件下で培養する実験を実行した。最小合成培地では、野生型及びＰｈｔＤ欠損株は、濃縮ＬＢ培地中よりも増殖速度が遅かったが、Ｐｈｔ四重欠損突然変異体は最小培地においてほとんど増殖しなかった。特に、Ｚｎ^２＋又はＭｎ^２＋を添加した場合、これは２０〜２００μＭの範囲の濃度で特に顕著であり、四重突然変異体の増殖は野性型まで回復した。しかし、本発明者らの結果は、野生型と比較して、四重突然変異体の増殖が遅かったことを示した。

【0113】

これら所見は、細菌増殖に対するＺｎ^２＋及びＭｎ^２＋の必要性の確認に加えて、Ｚｎ^２＋及びＭｎ^２＋の取り込みにおけるＰｈｔファミリーの重要な役割を主張する。実際、本発明者らが観察した通り、Ｚｎ^２＋の喪失がＰｈｔファミリーのタンパク質のデノボ合成を誘導することは、ＰｈｔとＺｎ^２＋との間の緊密な関係を支持するための更なる論拠である。この調節は、肺炎連鎖球菌における亜鉛の取込みを調節するＡｄｃＲタンパク質によって生じる可能性が高い。実際、ＡｄｃＲタンパク質用の推定上の結合部位は、ｐｈｔＡ、ｐｈｔＢ及びｐｈｔＥ遺伝子、並びにｌｍｂ−ｐｈｔＤオペロンの上流に見出されている｛Ｐａｎｉｎａ ２００３年｝。高Ｚｎ^２＋濃度条件で誘導されるＡｄｃＲの結合は、その依存下で遺伝子の転写を阻害する。直接又は間接的な亜鉛飢餓条件下では、この金属の細胞内濃度が低下するので、ＡｄｃＲによる抑制が軽減される｛Ｂｒｅｎｏｔ ２００７年、Ｃｌａｖｅｒｙｓ ２００１年｝。この結果及び本研究で観察されたものとは対照的に、培養培地に亜鉛を添加すると、Ｐｈｔ産生が誘発されることが最近報告された｛Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ２００９年｝。しかし、本研究では亜鉛の多い培地から亜鉛を除去したが、Ｏｇｕｎｎｉｙｉらは亜鉛の少ない培地に亜鉛を添加したという意味で、用いられた２つの方法は異なっていた。所与の範囲内の亜鉛濃度において、Ｐｈｔの産生は釣鐘状に調節されると推測することが合理的である。また、Ｏｇｕｎｎｉｙｉらにより観察された高亜鉛濃度のＰｈｔ発現の増加を導く効果は、ヒトホストにおいて利用可能な遊離亜鉛濃度が非常に低いので、インビボではほとんど関係しない可能性がある｛Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ２００９年｝。

【0114】

１９９７年に、Ｄｉｎｔｉｌｈａｃらは｛Ｄｉｎｔｉｌｈａｃ １９９７年ａ｝、彼らの研究において、ＡＢＣ型Ｍｎ^２＋透過酵素として記載されているＰｓａ及びＡＢＣ型Ｚｎ^２＋透過酵素であるＡｄｃに加えて、Ｚｎ^２＋及びＭｎ^２＋の両方を輸送することができる第３の輸送体が存在するはずであると結論付けた。Ｐｈｔタンパク質又はラミニン結合タンパク質が、この機能を果たすための候補であると考えられる。本発明者らの結果は、Ｐｈｔについて異なる役割を示す。実際、Ｚｎ^２＋及びＭｎ^２＋の非存在下において、最小培地中にて野生型及びＰｈｔＤ欠損株が増殖することができるという事実は興味深い。更に、最小培地にＺｎ^２＋又はＭｎ^２＋を添加したとき、四重突然変異体の増殖が遅れて回復したという所見も興味深い。Ｐｈｔタンパク質が、これら２価カチオンを格納し濃縮する機能を有するＺｎ^２＋及びＭｎ^２＋スカベンジャーとして作用すると考えれば、これらの所見を説明することができる。野生型及びＰｈｔＤ欠損突然変異株を最小培地に入れた場合、より濃度の高い培地中に細菌が存在するときはＰｈｔタンパク質内に既に格納されているイオンのために直ちに増殖を開始することができた。対照的に、Ｐｈｔ四重突然変異体は、好ましい条件下に置いたときにこれらイオンを格納することができず、次いで、濃度の低い培地に入れたときに増殖できなかった。Ｚｎ^２＋又はＭｎ^２＋を最小培地に過剰に添加したとき、特定の金属透過酵素がイオンを捕捉することができるようになる前にある程度の時間が必要であった、その理由は、Ｐｈｔタンパク質の助けなしに培養培地中でランダムにイオンを見つけなければならなかったためである。これは、Ｐｈｔ四重突然変異体がこのような条件で増殖し始めるのが遅れたことを説明できる。更に、Ｐｈｔタンパク質がスカベンジャーの役割を果たす可能性は、５〜６つの陽イオン結合ドメインが存在することと矛盾しない。

【0115】

確認された場合、この格納についての考察的な機序が、細菌が亜鉛及び恐らくマンガンホメオスタシスを調節する手段と考えることができる。亜鉛及びマンガンのような金属イオンは必須微量元素である。しかし、過剰に存在する場合、細菌に有害である可能性があるが、その理由は、幾つかの重要な酵素について補助因子としての他の元素と競合する場合があるためである。したがって、細菌が金属ホメオスタシスを調節することが必須であり、本発明者らは、これがＰｈｔファミリーの主な役割であると示唆する。このような調節系は、イオンが制限された環境に直面した場合、例えば、ヒトの鼻咽腔におけるコロニー形成過程の初期段階中に肺炎連鎖球菌を生存させることができる｛Ｂｕｎｋｅｒ １９８４年、Ｈａｒｌｙｋ １９９７年｝。

【0116】

ＰｈｔＤによるポリシストロニックな転写物の存在は、機能を発揮するためにＬｍｂ、ＬｒａＩファミリーのメンバー、及びＹｆｎＡがＺｎ^２＋又はＭｎ^２＋を必要とすることにより説明することができる。部分的にこの状況を支持するために、毒性のための重大な特徴であるタンパク質のＬｒａＩファミリーを通して付着するためにＭｎ^２＋が必要であることが示唆されている｛Ｄｉｎｔｉｌｈａｃ １９９７年ｂ、Ｐａｐｐ−Ｗａｌｌａｃｅ ２００６年｝。更に、他の状況では、ラミニンがＺｎ^２＋に結合して、ラミニンとラミニン結合タンパク質との間の高親和性結合を促進することが実証されている｛Ａｎｃｓｉｎ １９９６年、Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ２００２年｝。したがって、本発明者らは、ラミニンにＬｍｂが遭遇したとき、Ｚｎ^２＋の存在を確実にするためにＬｍｂがＰｈｔＤを必要とすると仮定することができ、これはホスト組織への結合を強化する。また、Ｐｈｔによる亜鉛ホメオスタシスの調節は、これらタンパク質がＣ３ｂの阻害に関係している理由を説明することができる（Ｈｏｓｔｅｔｔｅｒ，１９９９年４１／同上；Ｏｇｕｎｎｉｙｉ，２００９年９８／同上）。実際、Ｈ因子の存在下におけるＩ因子によるＣ３ｂの切断は、亜鉛に調節されている｛Ｂｌｏｍ ２００３年｝。したがって、細菌環境における亜鉛濃度を制御することによって、Ｐｈｔはいくつかの状況におけるＣ３ｂ阻害の一因となり得る。これについては更に調査する必要がある。

【0117】

したがって、Ｐｈｔタンパク質ファミリーを標的とすることによって、免疫系は、細菌がイオンを格納し使用する能力を妨害する可能性があり、これは浸潤過程にとって重大であると考えられる。結果的に、本発明の結果は、Ｐｈｔタンパク質が肺炎球菌感染に対する真のワクチン候補であることを確認する。Ｐｈｔファミリーの様々なメンバーは、肺炎球菌ワクチン抗原として使用される可能性について既に評価されている｛Ａｄａｍｏｕ ２００１年、Ｈａｍｅｌ ２００４年、Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ２００７年、Ｚｈａｎｇ ２００１年｝。これらの発見後、肺炎球菌の分離菌のサブセットからマウスを保護するＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ及びＰｈｔＤの能力について検討された｛Ａｄａｍｏｕ ２００１年｝。ＰｈｔＤは、最も広い保護を提供するＰｈｔタンパク質であることが見出されているが、ＰｈｔＡによる免疫は、より少ない数の試験株に対して有効であった。これは、ＰｈｔＡは肺炎球菌株の６２％で発現するが、ＰｈｔＤは１００％に存在することを示した本研究の結果と一致している。２つの研究において成功裡に使用されたが、ＰｈｔＢが交差防御能を誘発する可能性は知られていない。その理由は、１つの株に対してしか評価されていないためである｛Ａｄａｍｏｕ ２００１年、Ｚｈａｎｇ ２００１年｝。しかし、本発明者らは株の８１％にＰｈｔＢを見出したので、その株間適用範囲は最適ではない可能性があると予測することができる。ＰｈｔＥに関しては、このタンパク質は株の９７％で見出されており、これは、広い交差防御能を示している可能性がある。しかし、このＰｈｔは、３つの他のＰｈｔとわずか３２％の同一性しか共有しておらず、最も免疫原性が強く且つ保存されているそのＣ末端部分は、ＰｈｔＥに特異的である。他方のＰｈｔと共通のＰｈｔＥの領域は抗体に接近できない｛Ａｄａｍｏｕ ２００１年、Ｈａｍｅｌ ２００４年｝。したがって、肺炎球菌の中でも高度に保存されているアミノ酸配列を有し、またＰｈｔＡ及びＰｈｔＢと交差反応性を示す試験株全てに存在するＰｈｔＤが、より優れた選択肢である。

【0118】

実施例７
Ｐｈｔタンパク質による免疫化は、マウス肺炎球菌致死性鼻腔内抗原投与モデルにおいて保護をもたらす
マウスの肺炎球菌鼻腔内抗原投与においてＰｈｔファミリーのメンバーによって付与される保護を評価するために、ＯＦ１雌マウス（４週齢；ｎ＝２０／群）を、３−Ｏ−デアシル−４’−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）及びＱＳ２１を添加した水中油型エマルションからなるＡＳ０２アジュバント系と共に製剤化された１μｇのＰｈｔＤ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、又はＰｈｔＥで０日目及び１４日目に筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫した（ＧａｒｃｏｎらＥｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６；７２３−７３９（２００７年）。対照動物にはＡＳ０２のみを注入した。２８日目に、３／４３型肺炎球菌株（５０μＬ中１０^５ｃｆｕ）でマウスに鼻腔内抗原投与した。抗原投与後１０日間死亡率を記録した。

【0119】

他の実験では、１μｇのＰｈｔＤのワクチン接種を１０μｇのＰｓｐＡ及び１０μｇのＣｂｐＡと比較した。全ての抗原を、アルミニウム塩とＭＰＬとからなるアジュバント系ＡＳ０４と共に製剤化した（ＧａｒｃｏｎらＥｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６；７２３−７３９（２００７年）。０、１４及び２８日目にｉ．ｍ．免疫を行った。対照動物にはアジュバントのみを接種した。４２日目に、５０μＬ中肺炎連鎖球菌４／ＣＤＣ型（５×１０^６ｃｆｕ）２／Ｄ３９型（２×１０^５ｃｆｕ）、又は３／４３型（１０^５ｃｆｕ）でマウスに鼻腔内抗原投与した。抗原投与後１０日間死亡率を記録した。ログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）で生存率のデータを分析した。

【0120】

結果は、Ｐｈｔタンパク質のいずれかをワクチン接種することにより、マウスの約６０％が生存することができたが、対照群ではわずか２０％の動物しか生存しなかったことを示す（図１０）。

【0121】

後の実験では、他の群の動物に、３つの異なる肺炎球菌抗原ＰｓｐＡ、ＣｂｐＡ、及びＰｈｔファミリーのうちの１つのタンパク質、すなわちＰｈｔＤをワクチン接種した。体液性応答の程度を評価し、最後の免疫化の２週間後に３つの異なる肺炎球菌株を動物に抗原投与した。全ての抗原／株の組合せについてマウスの生存率を記録した。

【0122】

得られた抗体のレベルは抗原依存性であった（図１１Ａ）。１μｇのＰｈｔＤのワクチン接種は、１０μｇのＣｂｐＡ又はＰｓｐＡのワクチン接種よりも高い抗体価を誘発した。しかし、ＣｂｐＡ及びＰｓｐＡが由来する２／Ｄ３９株の鼻腔内致死性抗原投与に対する保護のレベルは、３つの抗原とも類似しており、生存率は約７０％であった（図１２Ａ）。他の株を使用したときの抗原間の違いを証明した。実際、ＰｈｔＤのワクチン接種により、それぞれ３／４３及び４／ＣＤＣ株を抗原投与したマウスの６０％及び８０％が生存することができた。対照的に、ＣｂｐＡ及びＰｓｐＡは、３型及び４型の抗原投与に対して全く保護をもたらさなかったか又は非常に弱い保護しかもたらさなかった。したがって、ＰｈｔＤは、３つの株に対して保護をもたらすことができる唯一の抗原であった。

【0123】

実施例８
Ｐｈｔタンパク質による免疫は、肺炎連鎖球菌の鼻咽頭コロニー形成からマウスを保護する
ＰｈｔＤに対する免疫が中耳炎を防ぐ能力を評価するために鼻咽頭コロニー形成アッセイを使用した。幾つかの研究によって、鼻咽頭コロニー形成と中耳炎との間の関連が示されている。ＢｏｇａｅｒｔらＬａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４（３）；１４４−１５４（２００４年）は、呼吸器感染症及び中耳炎の期間中に、コロニー形成率がより高い傾向があることを示した。実際、肺炎球菌性疾患は、同種の株による進行性及び／又は同時の鼻咽頭コロニー形成無しに生じることはない（ＧｒｅｙらＪ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４２；９２３−９３３（１９８０年），ＳｙｒｊａｎｅａらＰａｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．２４；８０１−８０６（２００５年）。

【0124】

（最後の免疫を除いて）アジュバントとして大腸菌の不安定毒素（ＬＴ）０．２μｇを添加したＰｈｔＤ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ又はＰｈｔＥ５μｇで、鼻腔内経路により０、１４、及び２８日目にＢａｌｂ／ｃマウス（４週齢；ｎ＝１０／群）を免疫した。同じプロトコール（スケジュール及び投薬量）を用いた別の実験は、ＰｈｔＤをＣｂｐＡ、ＰｓａＡ及びＰｓｐＡと比較することからなっていた。対照マウスにはＬＴのみを注入した。４２日目に、７×１０^４ｃｆｕの６Ｂ／ＣＤＣ型株、４／ＣＤＣ型、又は２／Ｄ３９型をマウスに鼻腔内抗原投与した。少量の細菌接種材料（１０μＬ）を使用して、抗原投与を行った。抗原投与の２及び６日後に収集した鼻の洗液中の細菌コロニーを計数した。麻酔をかけたマウスの鼻腔の内部を５００μＬのＰＢＳで洗い流すことにより、鼻の洗液を得た。次に、細菌コロニーを計数するために、Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔブロスで鼻の洗液１００μＬを１０倍希釈した。これから、脱繊維滅菌ヒツジ血液及びゲンタマイシン（３μｇ／ｍＬ）を添加したＤｉｆｃｏ（商標）血液寒天基礎培地に１０μＬをプレーティングした。サンプルを広げるためにペトリ皿を傾け、３７℃で一晩インキュベートした後コロニーを数えた。全てのコロニー計数データを、正規化した後、分散分析で比較し、次いで、分散分析で有意差がみられなかった場合ダネット事後検定を行った。

【0125】

鼻咽頭保菌に対するワクチン接種の保護活性を評価するために、様々なＰｈｔタンパク質でＢａｌｂ／ｃマウスを鼻腔内免疫した後、２／Ｄ３９株を同じ経路を介して抗原投与した。図１３から分かる通り、ＰｈｔＤ又はＰｈｔＥのワクチン接種のみが２型株の抗原投与に対して有意な保護をもたらしたが、Ｐｈｔファミリーの全てのメンバーが、ワクチン接種された動物の鼻咽腔における細菌量を低減することができた。このモデルにおけるＰｈｔＤの性能がより優れていたので、ＰｈｔＤを他の肺炎球菌タンパク質と比較することからなる更なる実験のためにＰｈｔファミリーのこのメンバーを選択した。したがって、ＰｈｔＤを含む様々な肺炎球菌の抗原でマウスを免疫し、次いで、２型、４型、又は６Ｂ型株を抗原投与した。

【0126】

全身免疫後に観察されたように、鼻腔内免疫後に誘発された体液性応答は抗原依存性であった（図１１Ｂ）。特に、ＣｂｐＡはＰｓｐＡ及びＰｈｔＤよりも低い抗体価しか誘発しなかった。しかし、クレード相同２／Ｄ３９株に対してＣｂｐＡによってもたらされる保護のレベルは、ＰｓｐＡ及びＰｈｔＤに類似していた（図１４Ａ）。

【0127】

４／ＣＤＣ型を抗原投与に使用したとき、ＰｈｔＤによる免疫のみが、鼻咽腔コロニー形成に対して動物を保護することができ、一方、ＣｂｐＡ、ＰｓａＡ又はＰｓｐＡによる免疫は、ＬＴ対照と統計的に区別できなかった（図１４Ｂ）。最後に、６Ｂ／ＣＤＣ型による抗原投与は、動物がＣｂｐＡ、ＰｓｐＡ又はＰｈｔＤのいずれで免疫されたかによって、抗原投与の２日後における保護にいかなる差も証明されなかった（図１４Ｃ）。ＰｓａＡだけがその点において効率が低いと思われた。抗原投与の６日後では、全ての群間に統計的な差は存在しなかった。しかし、ＰｈｔＤについての結果を注意深く検討することにより、鼻咽頭コロニー形成から大多数の動物が保護され、不都合な統計的結論は恐らく２つの外れ値の存在にのみ起因することが明らかになった。結論として、ＰｈｔＤは、この鼻咽頭コロニー形成のモデルにおいて、３つの株に対してある程度の保護を提供することができる唯一の抗原であった。

【0128】

実施例９
ＰｈｔＤによる免疫は、肺炎連鎖球菌の肺コロニー形成からマウスを保護する
このモデルは、ＢｒｉｌｅｓらＪ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８；３３９−３４８（２００３年）の改良法であった。ＣＢＡ／Ｊの雌マウス（４週齢；３０／群）にＡＳ０２をアジュバントとして添加したＰｈｔＤ３μｇを０、１４、及び２８日目にｉ．ｍ．免疫した。４２日目に、２×１０^７ｃｆｕ／５０μＬの肺炎連鎖球菌１９Ｆ／２７３７をマウスに鼻腔内抗原投与した。対照マウスにはアジュバントのみを注入した。抗原投与の３、４、及び５日後に収集した肺におけるコロニーを計数することにより、細菌量を測定した。全てのコロニー計数データを、正規化した後、分散分析で比較し、分散分析で有意差がみられなかった場合ダネット事後検定を行った。

【0129】

肺炎球菌感染症に罹患しやすい系統であるＣＢＡ／ＪマウスにＰｈｔＤをワクチン接種した後、中程度に有毒な１９Ｆ菌株を抗原投与した。このようなプロトコールは、全身化した敗血症を伴わない気管支肺炎を誘導させる。抗原投与後、３、４及び５日目に肺における生菌数を評価した。

【0130】

プラセボと比較して、ＰｈｔＤのワクチン接種が、肺における細菌量を大幅に（９５％超）低減したことが示された（図１５ａ）。ＰｈｔＤワクチン接種の有効性は、コロニー形成されていないマウスの数を分析したとき特に明白であった、その理由は、対照群の１０％に比べて、ワクチン接種されたマウスのうちの最大８０％が５日目に無細菌のままであったためである（図１５ｂ）。

【0131】

参考文献
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１０ Ｂｕｎｋｅｒ ＶＷ，Ｈｉｎｋｓ ＬＪ，Ｌａｗｓｏｎ ＭＳ，Ｃｌａｙｔｏｎ ＢＥ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｚｉｎｃ ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐｅｏｐｌｅ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂａｌａｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４０（５），１０９６−１１０２（１９８４年）．
１１ Ｃｌａｖｅｒｙｓ Ｊ−Ｐ．Ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＡＢＣ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ａｎｄ ｚｉｎｃ ｐｅｒｍｅａｓｅｓ．Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２（３−４），２３１−２４３（２００１年）．
１２ Ｃｏｃｋａｙｎｅ Ａ，Ｈｉｌｌ ＰＪ，Ｐｏｗｅｌｌ ＮＢＬ，Ｂｉｓｈｏｐ Ｋ，Ｓｉｍｓ Ｃ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｐ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ３２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６（８），３７６７−３７７４（１９９８年）．
１３ Ｄａｇａｎ Ｒ，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ｄ，Ｐｉｃｃａｒｄ Ｅ，Ｅｎｇｌｅｈａｒｄ Ｄ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｓｒａｅｌ．Ｔｈｅ Ｉｓｒａｅｌｉ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ａｎｄ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ Ｇｒｏｕｐ．ＪＡＭＡ ２６８（２３），３３２８−３３３２（１９９２年）．
１４ Ｄａｇａｎ Ｒ，Ｋａｅｙｈｔｙ Ｈ，Ｗｕｏｒｉｍａａ Ｔら．Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ｅｌｅｖｅｎ ｖａｌｅｎｔ ｍｉｘｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｏｉｄ ｏｒ ｔｅｔａｎｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｆｉｎｎｉｓｈ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌｉ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．２３（２），９１−９８（２００４年）．
１５ Ｄｉｎｔｉｌｈａｃ Ａ，Ａｌｌｏｉｎｇ Ｇ，Ｇｒａｎａｄｅｌ Ｃ，Ｃｌａｖｅｒｙｓ Ｊ−Ｐ．Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ： Ａｄｃ ａｎｄ ＰｓａＡ ｍｕｔａｎｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ａ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｚｎ ａｎｄ Ｍｎ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ＡＢＣ ｍｅｔａｌ ｐｅｒｍｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５（４），７２７−７３９（１９９７年ａ）．
１６ Ｄｉｎｔｉｌｈａｃ Ａ，Ｃｌａｖｅｒｙｓ Ｊ−Ｐ．Ｔｈｅ ａｄｃ ｌｏｃｕｓ，ｗｈｉｃｈ ａｆｆｅｃｔｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｅｎｃｏｄｅｓ ａｎ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ．Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（２），１１９−１３１（１９９７年ｂ）．
１７ Ｅｌｓｎｅｒ Ａ，Ｋｒｅｉｋｅｍｅｙｅｒ Ｂ，Ｂｒａｕｎ−Ｋｉｅｗｎｉｃｋ Ａ，Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ Ｂ，Ｂｕｔｔａｒｏ ＢＡ，Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉ Ａ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｓｐ，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＬｒａＩ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ，ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０（９），４８５９−４８６９（２００２年）．
１８ Ｆｅｄｓｏｎ ＤＣ及びＭｕｓｈｅｒ ＤＭ．Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｎ： Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｐｌｏｔｋｉｎ ＳＡ及びＯｒｅｎｓｔｅｉｎ ＷＡ編，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｉｎｃ，２００４年，ｐ．５２９−５８８．
１９ Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ＪＪ，ＭｃＳｈａｎ ＷＭ，Ａｊｄｉｃ Ｄら．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ｍ１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９８（８），４６５８−４６６３（２００１年）．
２０ Ｇａｇｎｏｎ Ｇ，Ｖａｄｅｂｏｎｃｏｅｕｒ Ｃ，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ ＲＣ，Ｆｒｅｎｅｔｔｅ Ｍ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ｔｈｅ ｐｔｓＩ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｉ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ：ｓｕｇａｒ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ．Ｇｅｎｅ １２１（１），７１−７８（１９９２年）．
２１ Ｈａｍｅｌ Ｊ，Ｃｈａｒｌａｎｄ Ｎ，Ｐｉｎｅａｕ Ｉら．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２（５），２６５９−２６７０（２００４年）．
２２ Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．Ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｍａｎｉｓ．Ｉｎ： ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｌｏｖｅｒ ＤＭ，Ｌｏｎｄｏｎ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５年，ｐ．１０９−１３５．
２３ Ｈａｒｌｙｋ Ｃ，Ｍｃｃｏｕｒｔ Ｊ，Ｂｏｒｄｉｎ Ｇ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＡＲ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｅｃｋｈｏｕｔ Ａ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ，ｚｉｎｃ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｉｎ ｂｒｏｎｃｈｏ−ａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅｓ ｂｙ ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊ．Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１１（３），１３７−１４２（１９９７年）．
２４ Ｈａｕｓｄｏｒｆｆ ＷＰ，Ｆｅｉｋｉｎ ＤＲ，Ｋｌｕｇｍａｎ ＫＰ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５（２），８３−９３（２００５年）．
２５ Ｈａｖａ ＤＬ，Ｃａｍｉｌｌｉ Ａ．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（５），１３８９−１４０５（２００２年）．
２６ Ｈｏｓｋｉｎｓ Ｊ，Ａｌｂｏｒｎ ＷＥ，Ｊｒ．，Ａｒｎｏｌｄ Ｊら．Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒ６．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（１９），５７０９−５７１７（２００１年）．
２７ Ｈｏｓｔｅｔｔｅｒ ＭＫ．Ｏｐｓｏｎｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｏｐｓｏｎｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃ３ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．５（２），８５−８９（１９９９年）．
２８ Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ ＨＦ．Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｏｒａｌ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２１（２），１３３−１４０（１９９４年）．
２９ Ｋｕｎｓｔ Ｆ，Ｏｇａｓａｗａｒａ Ｎ，Ｍｏｓｚｅｒ Ｉら．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３９０（６６５７），２４９−２５６（１９９７年）．
３０ Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ ２２７（５２５９），６８０−６８５（１９７０年）．
３１ Ｌｏｉｓｅｌ Ｅ，Ｊａｃｑｕａｍｅｔ Ｌ，Ｓｅｒｒｅ Ｌら．ＡｄｃＡＩＩ，ａ ｎｅｗ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｚｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｗｉｔｈ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ： ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８１（３），５９４−６０６（２００８年）．
３２ Ｌｙｎｃｈ ＪＰ，ＩＩＩ，Ｚｈａｎｅｌ ＧＧ．Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｍｏｎｇ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｅｍｉｎ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２６（６），５７５−６１６（２００５年）．
３３ Ｍｂｅｌｌｅ Ｎ，Ｈｕｅｂｎｅｒ ＲＥ，Ｗａｓａｓ ＡＤ，Ｋｉｍｕｒａ Ａ，Ｃｈａｎｇ Ｉ，Ｋｌｕｇｍａｎ ＫＰ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｒｉａｇｅ ｏｆ ａ ｎｏｎａｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０（４），１１７１−１１７６（１９９９年）．
３４ ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ ＪＡ，Ｔｕｏｍａｎｅｎ ＥＩ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．６，Ｄ８７７−Ｄ８８９（２００１年）．
３５ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＤＡ，Ｊａｕｒｉｎ Ｂ．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ｓｉｇｍａ ７０） ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４（７），１１４３−１１５２（１９９０年）．
３６ Ｎｕｎｅｓ Ｓ，Ｓａｅ−Ｌｅａｅｏ Ｒ，Ｐｅｒｅｉｒａ ＬＣ，ｄｅ Ｌｅｎｃａｓｔｒｅ Ｈ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｌｏｎｉｓｉｎｇ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ Ｐｏｒｔｕｇａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ−ｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｅｒａ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．１４（１），８２−８４（２００８年）．
３７ Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ＡＤ，Ｇｒａｂｏｗｉｃｚ Ｍ，Ｂｒｉｌｅｓ ＤＥ，Ｃｏｏｋ Ｊ，Ｐａｔｏｎ ＪＣ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７５（１），３５０−３５７（２００７年）．
３８ Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ＡＤ，Ｇｒａｂｏｗｉｃｚ Ｍ，Ｍａｈｄｉ ＬＫら．Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉａｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｚｎ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ＡｄｃＲ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２３（３），７３１−７３８（２００９年）．
３９ Ｐａｎｉｎａ ＥＭ，Ｍｉｒｏｎｏｖ ＡＡ，Ｇｅｌｆａｎｄ ＭＳ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｚｉｎｃ ｒｅｇｕｌｏｎｓ： ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １００（１７），９９１２−９９１７（２００３年）．
４０ Ｐａｐｐ−Ｗａｌｌａｃｅ ＫＭ，Ｍａｇｕｉｒｅ ＭＥ．Ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０，１８７−２０９（２００６年）．
４１ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＪＤ，Ｕｍａｙａｍ ＬＡ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｔ，Ｈｉｃｋｅｙ ＥＫ，Ｗｈｉｔｅ Ｏ．Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１），１２３−１２５（２００１年）．
４２ Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ Ｃ，Ｈｏｂｂｓ ＡＡ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ５’ ｅｎｄｓ ｏｆ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ−ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ｔｏ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｉｐｓ Ｏｎｌｉｎｅ ３（１），１２８−１３２（１９９８年）．
４３ Ｒｉｂｏｌｄｉ−Ｔｕｎｎｉｃｌｉｆｆｅ Ａ，Ｉｓａａｃｓ ＮＷ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＴＪ．１．２ Å ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＰｈｔＡ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉａｄ ｄｏｍａｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｏｌｄ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５７９（２４），５３５３−５３６０（２００５年）．
４４ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｃｏｕｒｔ Ｄ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３，３１９−３５３（１９７９年）．
４５ ＳＩＣＡＲＤ ＡＭ．Ａ ｎｅｗ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ａｍｉＡ ｌｏｃｕｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５０，３１−４４（１９６４年）．
４６ Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ＲＪ，Ｈｅｎｎｅｓｓｙ ＴＷ，Ｂｕｌｋｏｗ ＬＲら．Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｎｏｎｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ａｍｏｎｇ ａｌａｓｋａ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ７−ｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ．ＪＡＭＡ ２９７（１６），１７８４−１７９２（２００７年）．
４７ Ｓｍａｒｔ ＬＥ，Ｄｏｕｇａｌｌ ＡＪ，Ｇｉｒｄｗｏｏｄ ＲＷＡ．Ｎｅｗ ２３−ｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｎｏｎ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．１４（３），２０９−２１５（１９８７年）．
４８ Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ Ｂ，Ｒｏｚｄｚｉｎｓｋｉ Ｅ，Ｍａｒｔｉｎ Ｓら．Ｌｍｂ，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ＬｒａＩ ａｄｈｅｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｌａｍｉｎｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７（２），８７１−８７８（１９９９年）．
４９ Ｔｅｔｔｅｌｉｎ Ｈ，Ｎｅｌｓｏｎ ＫＥ，Ｐａｕｌｓｅｎ ＩＴら．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３（５５２９），４９８−５０６（２００１年）．
５０ Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ，Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ Ｔ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｈｅｅｔｓ： ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ７６（９），４３５０−４３５４（１９７９年）．
５１ Ｔｕｒｎｅｒ ＤＨ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ，Ｆｒｅｉｅｒ ＳＭ．ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１７，１６７−１９２（１９８８年）．
５２ Ｗｉｚｅｍａｎｎ ＴＭ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ ＪＨ，Ａｄａｍｏｕ ＪＥら．Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｖａｃｃｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｆｆｏｒｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９（３），１５９３−１５９８（２００１年）．
５３ Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ，Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｓ，Ｎｕｇｒｏｈｏ ＦＡ，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｊ．Ａ ２３．４ ｋｂ ｓｅｇｍｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ６９°−７０° ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｅｎｏｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３（Ｐｔ ４），１３１７−１３２０（１９９７年）．
５４ Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｍａｓｉ ＡＷ，Ｂａｒｎｉａｋ Ｖ，Ｍｏｕｎｔｚｏｕｒｏｓ Ｋ，Ｈｏｓｔｅｔｔｅｒ ＭＫ，Ｇｒｅｅｎ ＢＡ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＰｈｐＡ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｕｎｉｑｕｅ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９（６），３８２７−３８３６（２００１年）．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]