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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5968458
(24)【登録日】2016年7月15日
(45)【発行日】2016年8月10日
(54)【発明の名称】幹細胞を若くするための培地組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20160728BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
【請求項の数】3
【全頁数】13
(21)【出願番号】特願2014-544678(P2014-544678)
(86)(22)【出願日】2012年12月3日
(65)【公表番号】特表2015-500018(P2015-500018A)
(43)【公表日】2015年1月5日
(86)【国際出願番号】KR2012010380
(87)【国際公開番号】WO2013081436
(87)【国際公開日】20130606
【審査請求日】2014年8月1日
(31)【優先権主張番号】10-2011-0127885
(32)【優先日】2011年12月1日
(33)【優先権主張国】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】508033465
【氏名又は名称】アール バイオ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｒ ＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 憲一
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100185915
【弁理士】
【氏名又は名称】長山 弘典
(74)【代理人】
【識別番号】100194973
【弁理士】
【氏名又は名称】尾崎 祐朗
(72)【発明者】
【氏名】カン ソングン
(72)【発明者】
【氏名】ラ ジョンチャン
(72)【発明者】
【氏名】パク ヒョングン
(72)【発明者】
【氏名】イ ハンヨン
【審査官】
鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１０／００８２１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００９−５２７２２１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＢＳ（fetal bovine serum）、セレン、サイトカインとしてのＥＧＦまたはｂＦＧＦ、およびＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）を含有することを特徴とする培地で、６０〜１２０歳の高齢者由来の間葉系幹細胞を培養することを特徴とする、６０〜１２０歳の高齢者由来の間葉系幹細胞を２０〜３０代の若者由来の幹細胞様に転換する方法。
【請求項2】
前記培地は、インスリンまたはインスリン様因子を追加で含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記培地は、ヒドロコルチゾンを追加で含有することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高齢者由来の幹細胞を若い幹細胞にするための培地組成物に関し、更に詳しくは、高齢者から採取した幹細胞を、若者の幹細胞と類似する形質を持つように転換するための幹細胞培養用培地組成物および前記培地組成物で高齢者由来の幹細胞を培養することを含む幹細胞を若い幹細胞にする方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells）は、骨髄、臍帯血、胎盤（または、胎盤組織の細胞）、脂肪（または、脂肪組織の細胞）などの様々な体細胞から由来する多分化性（pluripotent）を有する幹細胞である。例えば、骨髄（bone marrow）由来の間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨／軟骨組織、筋肉組織に分化することができる多分化性によって細胞治療剤としての開発のために様々な研究が進められている。
【0003】
近年、間葉系幹細胞を用いた細胞治療技術が、脚光を浴び始めながら、人体から分離された間葉系幹細胞を治療に適合するように活性化させる技術の開発が求められており、特に、細胞治療の対象となる患者の場合には、高齢者が多く、高齢者の組織から採取された間葉系幹細胞の場合、増殖能と分化能が落ちて、治療効率が低い傾向があり、高齢者由来の間葉系幹細胞を若者由来の間葉系幹細胞のように、活性化させる技術が求められている。
【0004】
間葉系幹細胞は、他のヒト初代培養細胞と同様に、体外（in vitro）培養時にテロメア短縮（telomere shortening）とは無関係な老化（senescence）機序によって細胞の分裂が急激に減少することが知られている（Shibata, K.R. et al. Stem cells, 25; 2371-2382, 2007）。これらの老化現象は、その機序はまだ明らかになったわけではないが、長期間の体外培養による環境的ストレスの蓄積にＣｄｋ阻害タンパク質であるｐ１６（ＩＮＫ４ａ）が発現されて蓄積され、細胞の成長を担うＣｄｋタンパク質の活性が抑制される現象が主な原因と指摘されている。間葉系幹細胞は、Ｂｍｉ−１と呼ばれる腫瘍遺伝子を発現させてｐ１６の発現を阻害した際に、細胞の老化が抑制されることが確認され（Zhang, X. et al. Biochemical and biophysical research communications 351; 853-859, 2006）、また、培養中にＦＧＦ−２を処理して、ｐ２１（Ｃｉｐ１）、ｐ５３、およびｐ１６（ＩＮＫ４ａ）のｍＲＮＡ発現を抑制した際に、Ｇ１期における間葉系幹細胞の成長停止が抑えられることが報告されている（Ito, T. et al., Biochemical and biophysical research communications, 359; 108-114, 2007）。また、大韓民国公開特許第１０−２００９−０１０８１４１号では、Ｗｉｐ１タンパク質をコードする遺伝子を間葉系幹細胞に形質転換させ、間葉系幹細胞の老化を抑制させる方法を提示した。
【0005】
しかし、高齢者の組織から採取した老化した間葉系幹細胞を若々しく復帰させる方法についての技術は報告されたことがないのが現状である。
【0006】
そこで、本発明者等は、高齢の患者から分離した脂肪組織から間葉系幹細胞を採取し、抗酸化剤および成長因子が含有された培地で培養した結果、若者由来の間葉系幹細胞と同様の活性を有する間葉系幹細胞が製造できることを確認して、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、高齢者由来の間葉系幹細胞を若くするための培地組成物を提供することにある。
【0008】
本発明の他の目的は、前記培地組成物を利用して、高齢者由来の間葉系幹細胞を培養することを特徴とする間葉系幹細胞を若くする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
前記目的を達成するために、本発明は、ＦＢＳ（fetal bovine serum）、抗酸化剤、サイトカインおよびＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）を含有することを特徴とする高齢者由来の間葉系幹細胞を若い幹細胞に転換するための培地組成物を提供する。
【0010】
本発明はまた、前記高齢者由来の間葉系幹細胞を若い幹細胞に転換するための培地組成物で高齢者由来間葉系幹細胞を培養することを含む高齢者由来の間葉系幹細胞を若い幹細胞に転換する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】２０代と３０代由来の脂肪幹細胞を前記各々の培地で第４代まで継代した後、顕微鏡で形態を確認した写真である。
【図2】７０代と８０代由来の脂肪幹細胞を前記各々の培地で第４代まで継代した後、顕微鏡で形態を確認した写真である。
【図3】１０種の培地で培養した若者（２０代と３０代）と高齢者（７０代と８０代）の年齢別ＣＰＤＬ（cell population doubling level）を示したグラフである。
【図4】１０種の培地で培養した若者（２０代と３０代）と高齢者（７０代と８０代）の培地別ＣＰＤＬを示したグラフである。
【図5】５種の培地で培養した脂肪幹細胞の年齢別、培地別のテロメラーゼ活性を示したグラフである。
【図6】２種の培地（１番、９番培地）で培養した２０代、３０代、７０代、及び８０代由来の脂肪幹細胞のテロメラーゼ活性を示したグラフである。
【図7】１番、９番の培地を用いて、Ｐ４およびＰ６継代で培養した後、継代培養数に応じたテロメラーゼ活性の変化を測定したグラフである。
【図8】１番、９番培地で培養した脂肪幹細胞から多能性確認のマーカーであるｏｃｔ４、ｎａｎｏｇおよびＲｅｘ１の発現をＰ３で確認した結果を示したものである。
【図9】１番、９番培地で培養した脂肪幹細胞から多能性確認のマーカーであるｏｃｔ４、ｎａｎｏｇおよびＲｅｘ１の発現をＰ４で確認した結果を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
一観点において、本発明は、ＦＢＳ（fetal bovine serum）、抗酸化剤、サイトカインおよびＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）を含有することを特徴とする高齢者由来の間葉系幹細胞を若い幹細胞に転換するための培地組成物に関する。
【0013】
本発明で用いる用語「幹細胞（stem cell）」とは、自己複製能力を有すると共に、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。「成体幹細胞」は、発生過程が進んで胚芽の各臓器が形成される工程或いは成体工程に現れる幹細胞を意味する。
【0014】
本発明で用いる用語「間葉系幹細胞」とは、ヒトまたは哺乳動物の組織から分離した未分化の幹細胞であって、様々な組織から由来することができる。特に、臍帯由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、筋肉由来間葉系幹細胞、神経由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞および胎盤由来間葉系幹細胞であってもよく、各組織から幹細胞を分離する技術は、当該業界に既に公知となっている。
【0015】
本発明で用いる用語「脂肪由来幹細胞」とは、脂肪組織から分離した未分化幹細胞であり、その分離方法は、例えば、次のようになる。つまり、脂肪吸引から得られる生理食塩水に浮遊した脂肪含有懸濁（suspension）を培養した後、フラスコなどの培養容器に付着した幹細胞の層をトリプシンで処理してから、回収するか、スクレーパーで掻いて、少量の生理食塩水に浮遊しているものを直接回収する方法などによって、脂肪由来間葉系幹細胞を分離することができる。
【0016】
本発明において、「幹細胞を若くすること」とは、高齢者の組織由来間葉系幹細胞の表現型を若者組織由来幹細胞の表現型と類似した状態にすることを意味し、前記表現型とは、細胞の形態、細胞の増殖速度、テロメラーゼ活性、幹細胞マーカー（Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−１、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ １−８１、Ｎａｎｏｇなど）の発現および幹細胞の分化能などを含む。本発明では、高齢者組織由来間葉系幹細胞は、６０〜１２０歳のヒトから分離されることが好ましい。
【0017】
本発明において、前記「高齢者組織由来間葉系幹細胞の表現型を若者組織由来幹細胞の表現型と類似した状態」に変化することは、高齢者組織由来間葉系幹細胞が分離された最初の継代よりも前記表現型が若者組織由来幹細胞と類似するようになる状態、または本発明の培養用培地以外の培地で培養された間葉系幹細胞と比較して、若者組織由来の幹細胞と類似するようになる状態を意味する。
【0018】
本発明において、前記培地組成物は、インスリンまたはインスリン様因子およびヒドロコルチゾンを追加で含有してもよく、前記サイトカインは、ＥＧＦ（epidermal growth factor）および／またはｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）であってもよい。
【0019】
本発明の培地組成物に用いられる前記抗酸化剤は、セレン（selenium）、ビタミンＥ、アスコルビン酸、カテキン、リコピン、ベータカロチン、コエンザイムＱ−１０、ＥＰＡ（eicosapentaenoic acid）、ＤＨＡ（docosahexanoic acid）などを用いることができ、好ましくは、セレンを用いることができる。
【0020】
したがって、本発明では、ＦＢＳ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦは、年齢に関係なく、脂肪幹細胞培養には欠かせない因子であることを確認し、全体的に若い年齢で多能性（pluripotency）や分化率、テロメラーゼ活性の程度が老齢群に比べて高く、培地別にはＦＢＳ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦが欠如した培地で培養された細胞が、成長率、分化率、及びテロメラーゼ活性が低下し、これらの成分は、細胞が育って活性を持つのに必須な要素であることを確認した。
【0021】
更に、本発明は、セレンを含まない培地とコントロールであるセレンを含む培地との間で、若い群及び老齢群のそれぞれに由来する幹細胞の細胞分化率が同様であることが分かった。しかしながら、２種の培地間のテロメラーゼ活性分析の結果が示すところによれば、テロメラーゼ活性は、セレンを含まない培地で培養した老齢群の方が若い群よりも低かった。このことが示しているのは、高齢者からの細胞にテロメラーゼ活性を提供するためには、培養培地中にセレンを培地に必須的に含ませるべきであるということである。
【0022】
他の観点において、本発明は、ＦＢＳ（fetal bovine serum）、抗酸化剤、サイトカインおよびＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）を含有することを特徴とする高齢者由来の間葉系幹細胞を若い幹細胞に転換するための培地組成物で高齢者由来間葉系幹細胞を培養することを含む高齢者由来の間葉系幹細胞を若い幹細胞に転換する方法に関する。前記間葉系幹細胞の培養に用いられる基本培地としては、当業界で幹細胞培養に適していると知られている通常の培地、例えばＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｋ−ＳＦＭ培地などが用いられるが、好ましくは、無血清培地が用いられ、最も好ましくはＫ−ＳＦＭ（Keratinocyte-SFM；Keratinocyte serum free medium）培地が用いられる。
【0023】
前記間葉系幹細胞の培養に用いられる培地は、当業界に公知である、間葉系幹細胞の未分化の表現型の増殖を促しながら分化は抑制する添加剤を補うことができる。
【0024】
また、培地は、等張液中の中性緩衝剤（例えば、リン酸塩および／または高濃度の重炭酸塩）および蛋白質栄養素（例えば、血清、例えばＦＢＳ、血清代替物、アルブミン、または必須アミノ酸と非必須アミノ酸、例えばグルタミン）を含有することができる。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬやＬＤＬ抽出物）と、この種のほとんどの保存液培地で発見された他の成分（例えば、インスリンまたはトランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化型または塩である糖源、例えば、グルコース、セレン、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾンおよび／または還元剤、例えば、β−メルカプトエタノール）を含有することができる。
【0025】
また、培地は、細胞が互いに癒着したり、容器の壁に癒着したり、大き過ぎた束の形成を防ぐ目的で、抗凝集剤（anti-clumping agent）、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから販売しているもの（Ｃａｔ＃００１００５７ＡＥ）を含むことが有益であり得る。
【0026】
その中でも、下記の１つ以上の追加の添加剤を用いることが有利であり得る：・幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｓｔｅｅｌ因子）、ｃ−ｋｉｔを二量化する他のリガンドまたは抗体、および同じシグナル伝達経路の他の活性剤
・他のチロシンキナーゼ関連受容体、例えば、血小板由来の成長因子（Platelet-Derived Growth Factor；ＰＤＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子、Ｆｌｔ−３リガンド、および血管内皮増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor；ＶＥＧＦ）の受容体のためのリガンド
・環状ＡＭＰ濃度を高める因子、例えば、フォルスコリン
・ｇｐ１３０を誘導する因子、例えばＬＩＦまたはオンコスタチンＭ
・造血成長因子、例えば、トロンボポエチン（ＴＰＯ）
・変形性成長因子、例えば、ＴＧＦβ１
・ニューロトロフィン、例えば、ＣＮＴＦ
【0027】
本発明の培養のための間葉系幹細胞は、例えば、以下のような方法で獲得することができる。
【0028】
まず、脂肪吸引法（Liposuction）などによって腹部から得られたヒト脂肪組織を分離して、ＰＢＳで洗浄した後、組織を細かく切った後、コラーゲン分解酵素を添加したＤＭＥＭ培地を用いて分解した後、ＰＢＳで洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上澄み液は除去し、底に残ったペレットはＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。１００μｍのメッシュを用いて浮遊物を除去した後、ＰＢＳで再び洗浄した。ＤＭＥＭ（１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ ＮＡＣ、０．２ｍＭ アスコルビン酸）培地で培養し、一晩経過した後、培養容器の底に付着していない細胞は、ＰＢＳで洗浄し、ＮＡＣ、アスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、ＢＰＥ、インスリンおよびヒドロコルチゾンを含有したケラチノサイト−ＳＦＭ培地を２日毎に交換しながら培養して間葉系幹細胞を分離して、そして継代培養して、間葉系幹細胞を得ることができる。この他、当業界に公知の方法で間葉系幹細胞を得ることができる。この他にも、当業界に既に公知の方法で間葉系幹細胞を得ることができる。
【0029】
本発明の一実施例では、抗酸化剤としてセレンを用いており、用いられるセレンは、０．５〜１ｎｇ／ｍＬを用いることが好ましい。この時、この含有量が０．５μｇ／Ｌ未満の場合、酸素の毒性に敏感であり、１０μｇ／Ｌを超えると、深刻な細胞毒性をもたらす。
【0030】
本発明では、インスリンに代わる成分として、インスリン様因子（insulin-like growth factor）を用いており、これは、グルコース代謝とタンパク質の代謝を向上させ、細胞の成長を促す役割を果たし、特に好ましくは、組換えＩＧＦ−１（Insulin-like growth factor-1）を用いる。インスリン様因子の好ましい含有量は、１０〜５０ｎ／ｍＬであり、この成分が１０ｎｇ／ｍＬ未満の場合には、アポトーシス（Apoptosis）をもたらし、５０μｇ／Ｌを超える場合には、細胞毒性やコストの増加の問題がある。
【0031】
また、本発明の一実施例では、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を用いており、ＥＧＦは、ｉｎ ｖｉｖｏの状態で様々な形態の細胞増殖を引き起こすことができ、好ましくは、組換え上皮細胞成長因子を用いる。上皮細胞成長因子の好ましい含有量は、１０〜５０ｎｇ／ｍＬであり、この含有量が１０ｎｇ／ｍＬ未満の場合、特別な効果がなく、５０ｎｇ／ｍＬを超えると、細胞毒性を有する。
【0032】
また、本発明では、繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が用いられ、これはｉｎ ｖｉｖｏの状態で様々な形態の細胞増殖を引き起こすことができ、好ましくは、組換え繊維芽細胞増殖因子を用いる。繊維芽細胞増殖因子の好ましい含有量は、１〜１００ｎｇ／ｍＬである。
【0033】
本発明の一態様では、ＦＢＳ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦが年齢に関係なく、脂肪間葉系幹細胞の培養には欠かせない因子であり、特に、ｂＦＧＦの欠乏が脂肪幹細胞培養に重要な影響を与える結果を確認することができた。また、低年齢の細胞であるほど、成長率も高いとの結果も確認した。
【0034】
本発明の別の態様では、脂肪幹細胞のテロメラーゼ活性において、ＦＢＳ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦが重要な因子であることを確認し、テロメラーゼ活性は、２０代で最も高く現れ、セレンがない培地の場合、テロメラーゼ活性が低下することを確認することができ、セレン含有培地で培養した場合、高齢者由来の脂肪幹細胞も若者由来の脂肪幹細胞と似ているテロメラーゼ活性を持つことができることを確認した。
【実施例】
【0035】
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。
【実施例1】
【0036】
ヒトの脂肪組織由来間葉系幹細胞の分離患者の年齢が２０代、３０代、７０代と８０代の患者からの脂肪吸引法（Liposuction）によって、腹部の脂肪から脂肪組織を各々分離し、ＰＢＳで洗浄した。洗浄された脂肪組織を細かく切った後、コラゲナーゼタイプ１（１ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃で２時間の間組織を分解させた。コラゲナーゼ処理された組織をＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去し、ペレットをＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍメッシュでフィルタリングして浮遊物を除去した後、ＰＢＳで洗浄し、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ ＮＡＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）、０．２ｍＭアスコルビン酸が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。
【0037】
一晩経った後非付着性細胞は、ＰＢＳで洗浄し、５％ ＦＢＳ、２ｍＭ ＮＡＣ、０．２ｍＭアスコルビン酸、０．０９ｍＭカルシウム、５ｎｇ／ｍＬ ｒＥＧＦ、５μｇ／ｍＬのインスリン、１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦおよび７４ｎｇ／ｍＬヒドロコルチゾンと１ｎｇ／ｍＬのセレン（selenium）を含有したケラチノサイト−ＳＦＭ培地（ＲＫＣＭ）を２日毎に交換しながら継代培養し、３継代培養した後、２０代、４０代と７０代由来の脂肪幹細胞の幹細胞の活性を分析した。
【0038】
幹細胞の活性を分析するために、顕微鏡での形態、幹細胞の分化マーカー、テロメラーゼ活性、テロメアの長さと分化能を確認した。その結果、２０代、４０代と７０代で分離された脂肪幹細胞が３継代培養後、それぞれ類似する幹細胞の活性を有することが確認された。
【実施例2】
【0039】
幹細胞を若くする培地成分の探索実施例１で用いられたＲＫＣＭ培地に添加される活性成分であるＦＢＳ、ＮＡＣ、アスコルビン酸、カルシウム、ｒＥＧＦ、５μｇ／ｍＬのインスリン、ｂＦＧＦ、ヒドロコルチゾンおよびセレン（selenium）のうちひとつずつを除去した培地を製造し、前記活性成分がそれぞれ除去された培地での２０代、３０代、７０代、及び８０代の患者由来の脂肪幹細胞の表現型を確認した。
【0040】
培地１〜１０を製造し、１番培地はＲＫＣＭ培地であり、２〜１０番はＲＫＣＭ培地で成分を欠乏させた培地を用いており、各々の欠乏成分は、表１に示した。【表1】
【0041】
（１）形態と細胞増殖速度の観察実施例１の方法で分離された２０代、３０代、７０代、及び８０代由来の脂肪幹細胞を前記各々の培地で第４代まで継代した後、顕微鏡像での形態を確認し（図１及び図２）、継代の過程で細胞の数を血球計算器を用いて測定し、細胞数をカウントして増殖速度を確認した。
【0042】
１０種の培地で培養し、若者（２０代と３０代）と高齢者（７０代と８０代）の年齢別ＣＰＤＬ（cell population doubling level）と培地別ＣＰＤＬを図３および図４にそれぞれ示した。
【0043】
１０種の様々な幹細胞活性物質を除去した培養培地で培養した若者（２０、３０代）と高齢者（７０、８０代）の脂肪間葉系幹細胞は、年齢別ＣＤＰＬは２番と１０番の培地を除いて、２０、３０、７０、８０代の順で高い成長率を見せた。培地別には、年代別に多少の違いがあるが、１、６、または７番の培地が成長率が高く、２番培地が最も低かった。３番培地も他の培地に比べて成長率が低い結果を示した。
【0044】
１０種の培地で培養した脂肪幹細胞の形態や成長率を観察した結果、培地２、３、１０番は、年齢に関係なく、脂肪間葉系幹細胞の培養には欠かせない因子であり、全く成長が進まない２番、１０番の培地群に比べて３番培地因子の欠乏は、脂肪間葉系幹細胞の培養に重要な影響を与える結果を確認することができた。また、低年齢の細胞であるほど、成長率も高いとの結果も確認した。
【0045】
（２）テロメラーゼ活性の確認実施例１の方法で分離された２０代、３０代、７０代、及び８０代由来の脂肪幹細胞を、前記５種（１、２、３、９、１０）培地で第３代まで継代した後、幹細胞のテロメラーゼ活性を確認した。
【0046】
培養培地で培養した脂肪由来幹細胞をＰＢＳで洗浄した後、添加したＤＭＥＭ培地を用いて３７℃で２時間の間消化した。ＰＢＳで洗浄後、３０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、Ｔｅｌｏ ＴＡＧＧＧ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ製）中の溶解液で細胞を溶解し、氷で３０分間反応させた。１６，０００ｘｇで２０分間遠心分離して上澄み液のみを分離して一部の上澄み液とキットに含まれている反応混合物を混合してＰＣＲ反応をさせた。ＰＣＲ反応は、イロンゲーション：２５℃、１０分、インアクティベーション：９４℃、５分、デナチュレーション：９４℃、３０秒、アニーリング：５０℃、３０秒、ポリメリゼーション：７２℃、９０秒である。増幅された試料５μＬにキットに含まれている２５μＬのデナチュレーション試薬を室温で１０分間反応させた後、２２５μＬのハイブリダイゼーション溶液を添加して混合した。このうち１００μＬのみ予めコーティングされたマイクロプレートに分株して、３７℃で２時間の間、３００ｒｐｍの速度で反応させた後、ハイブリダイゼーション溶液を除去した。洗浄溶液で数回洗浄した後、１００μＬの抗ＤＩＧ−ＰＯＤ反応溶液を添加して、室温で３００ｒｐｍの速度で３０分間反応し、その後、溶液を除去した後、洗浄溶液で数回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ基質溶液を添加し、室温で３００ｒｐｍの速度で３０分間反応した後、１００μＬの停止溶液を添加して色の変化を観察する。この時、色は中断溶液を添加すると、青から黄色に変化し、マイクロプレート（ＥＬＩＳＡ）機器で４５０ｎｍの波長で３０分以内に測定した。
【0047】
その結果、図５に示すように、５種の培地で培養した脂肪幹細胞のテロメラーゼ活性は、２０代や３０代では９番培地で培養した細胞が活性が高く、２、３、１０番培地の細胞は、ほとんど活性がなかった。老齢群では、１番培地で培養した細胞が９番培地よりわずかに高い活性を示した。老齢群においても２、３、１０番培地で培養した細胞のテロメラーゼ活性は低かった。
【0048】
２種の培地（１番、９番培地）で培養した２０代、３０代、７０代、及び８０代由来の脂肪幹細胞のテロメラーゼ活性を図６に示した。
【0049】
その結果、１番と９番培地で培養した脂肪幹細胞のテロメラーゼ活性は、２０代で最も高い活性を示し、３０代を除いて１番培地での細胞が９番培地での細胞よりもテロメラーゼ活性が高かった。
【0050】
また、１、９番培地を用いてＰ４まで継代したとき、高齢群である８０代で多能性（pluripotency）が最も高いのに対し、テロメラーゼ活性は、２０代で最も高くなった。テロメラーゼの活性結果だけで分析すると、１番に比べて９番培地内の除去された成分は、僅かではあるが幹細胞の活性を低下させる成分であることを確認することができ、老齢群で９番で削除された成分が含まれた培地で細胞を培養した場合、若い群の細胞の活性度を持てるように培養できるという点で重要な成分であることを改めて確認した。
【0051】
さらに、１、９番の培地を用いて、Ｐ４およびＰ６継代で培養した後、継代培養数に応じたテロメラーゼ活性の変化を測定した。その結果、図７に示すように、全年齢層と二つの培地ですべてＰ６よりも継代数の低いＰ４の活性度が高く示されるとの結果を確認することができた。
【0052】
（３）幹細胞マーカーの発現の確認実施例１の方法で分離された２０代、３０代、７０代、及び８０代由来の脂肪幹細胞を、前記１、９番培地で第３代まで継代した後、９０％まで育てた。このように育てた脂肪幹細胞から培地を除去し、ＰＢＳで１回以上洗浄した後、ＲＮＡ抽出のための細胞溶解バッファー（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ、Ｓｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）を入れて細胞を溶解させて、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）を利用して、ＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡ（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｉｓ ｋｉｔ）に変換した後、多能性マーカーであるｏｃｔ−４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１のプライマーを作成してからＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を電気泳動した後、イメージアナライザーを通じて定量した。
【0053】
その結果、図８に示すように、１、９番培地で培養した脂肪間葉系幹細胞の個体間の差が大きかったが、いずれも、多能性確認のマーカーであるｏｃｔ４、ｎａｎｏｇおよびＲｅｘ１を発現した。年齢別では、老齢群である８０代からのマーカーの発現率が高く、培地別では、３０代だけにおいて１番培地よりも９番培地の発現率が高く、年齢別では、ほぼ同様の発現率を示した。
【0054】
Ｐ４の状態で１、９番培地で培養した脂肪間葉系幹細胞の個体間の差が大きかったが、多能性確認のマーカーであるｏｃｔ４、ｎａｎｏｇおよびＲｅｘ１が発現した（図９）。年齢別では、老齢群である８０代からのマーカーの発現率が高く、培地別では、全年齢層で１番培地よりも９番培地の発現率が高かった。
【0055】
（４）分化能確認実施例１の方法で分離された２０代、３０代、７０代、及び８０代由来の脂肪幹細胞を５種（１、２、３、９、１０）培地で第３代まで継代した後、脂肪誘導培地であるＮＨ Ａｄｉｐｏｄｉｆｆ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃、５％のＣＯ２で２１日間培養を進めて、脂肪細胞分化培地の交換は２日間隔で行われた。
【0056】
脂肪細胞分化培地で培養を開始した後、２１日目に、オイルレッドＯ染色法を利用して、脂肪幹細胞が脂肪細胞への分化能を確認した。
【0057】
その結果、図１０に示すように、全年齢、培地内での細胞では、オイルレッドＯ染色と共に脂肪分化の特徴である脂肪滴（lipid drop）が確認された。これを定量した結果を図１１に示し、培地別では、９、１、３番培地順に分化率が高く、２と１０番の培地の結果は類似しており、年齢別では３０、２０、７０、８０代の順に分化率が高かった。
【0058】
分子的レベルでの脂肪分化のマーカーであるＰＰＡＲｒ、ＬＰＬとＦＡＢＰ４ｄの発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果、図１２に示すように、個体間の差は大きかったが、年齢別では若い群が老齢群に比べて多少発現率が高く、培地別では、全体的に似ているか２番と９番の培地がやや高い水準であった。
【0059】
前記結果から、２、３、１０番の培地内活性物質は、年齢に関係なく、脂肪間葉系幹細胞の培養には欠かせない因子であることを確認し、全体的に若い年齢から多能性（pluripotency）や分化率、テロメラーゼ活性の程度が老齢群に比べて高く、培地別では、２、３、１０番で培養した細胞の成長率、分化率、及びテロメラーゼ活性が低下し、これらの培地内の成分は、細胞が育って活性を持つのに不可欠な要素であることを示唆している。
【0060】
更に、若い群及び老齢群のそれぞれに由来する幹細胞の間で、セレンを含まない９番培地における細胞分化率が同様であることが分かった。しかし、２種の培地間のテロメラーゼ活性分析の結果が示すところによれば、テロメラーゼ活性は、セレンを含まない培地で培養した老齢群の細胞の方が、若い群の細胞よりも低かった。このことが示しているのは、高齢者からの細胞に、１番培地で培養された細胞と同様のテロメラーゼ活性を提供するためには、９番培地で欠乏しているセレンを培地に必須的に含ませるべきであるということである。
【産業上の利用可能性】
【0061】
本発明によると、６０代以上の高齢の患者から採取した間葉系幹細胞も、高分化能、テロメラーゼ活性、高い幹細胞マーカーの発現能を持つ若い間葉系幹細胞にすることができて、間葉系幹細胞を用いた細胞治療の有効性を画期的に増進させることができる。
【0062】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記術は単に望ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求範囲及びその等価物によって定義される。