特許 5969982 炭酸脱水酵素に対する新規抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5969982

(24)【登録日】2016年7月15日

(45)【発行日】2016年8月17日

(54)【発明の名称】炭酸脱水酵素に対する新規抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/40 20060101AFI20160804BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160804BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160804BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 9/02 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160804BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20160804BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/40ZNA

   C12N15/00 A

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 P

   A61P7/06

   A61P27/02

   A61P27/06

   A61P9/10

   A61P9/00

   A61P9/02

   A61P35/00

   G01N33/53 D

【請求項の数】14

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2013-508456(P2013-508456)

(86)(22)【出願日】2011年5月2日

(65)【公表番号】特表2013-534407(P2013-534407A)

(43)【公表日】2013年9月5日

(86)【国際出願番号】EP2011056964

(87)【国際公開番号】WO2011138279

(87)【国際公開日】20111110

【審査請求日】2014年4月10日

(31)【優先権主張番号】10004646.5

(32)【優先日】2010年5月3日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】398061245

【氏名又は名称】ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）

【氏名又は名称原語表記】Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ）

(73)【特許権者】

【識別番号】512284930

【氏名又は名称】ツァイドラー ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ツァイドラー ラインハルト

(72)【発明者】

【氏名】バットケ クリシュティーナ

(72)【発明者】

【氏名】クレンメル エリザベート

(72)【発明者】

【氏名】フラットレイ アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】スプラン クラウディウ

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) Vol.97, No.5, pp.2220-2224

【文献】 Mol. Hum. Reprod. (2000) Vol.6, No.1, pp.68-74

【文献】 Nature Reviews. Drug Discovery (2008) Vol.7, pp.168-181

【文献】 Current Pharmaceutical Design (2008) Vol.14, pp.685-698

【文献】 Advances in Enzyme Regulation (2010) Vol.50, pp.20-33

【文献】 Current Oncology Reports (2005) Vol.7, No.2, pp.109-115

【文献】 関根進，抗体医薬の現状と課題，科学技術動向，科学技術・学術政策研究所，２００９年，２００９年１０月号，平成２７年４月２２日検索，ＵＲＬ，http://www.nistep.go.jp/achiev/ftx/jpn/stfc/stt103j/0910_03_featurearticles/0910fa01/200910_fa01.html#author_rep01.html

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト炭酸脱水酵素ＸＩＩに結合する抗体であって、
（ａ）Ｖ_H領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）、並びにＶ_L領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）；
を含む、抗体。

【請求項2】

配列番号７のアミノ酸配列によって決定されるＶ_H領域、及び配列番号８のアミノ酸配列によって決定されるＶ_L領域を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

（ａ）標識基、
（ｂ）毒素、又は
（ｃ）抗腫瘍薬
に結合している、請求項１から３の何れか１項に記載の抗体。

【請求項5】

請求項１から４の何れか１項に記載の抗体をコードする、核酸分子。

【請求項6】

請求項５に記載の核酸分子を発現可能な形態で含む、ベクター。

【請求項7】

請求項６に記載のベクターを含む、非ヒト宿主。

【請求項8】

請求項１から４の何れか１項に記載の抗体を産生するための方法であって、以下を含む、方法：
（ａ）上記抗体の合成を可能にする条件下で、請求項７に記載の宿主を培養すること；並びに
（ｂ）当該培養物から上記抗体を回収すること。

【請求項9】

請求項１から４の何れか１項に記載の抗体を含む、診断組成物。

【請求項10】

請求項１から４の何れか１項に記載の抗体を含む、医薬組成物。

【請求項11】

低酸素症、固形腫瘍、又は眼疾患を治療又は阻害するのに用いるための、請求項１から４の何れか１項に記載の抗体。

【請求項12】

上記低酸素症が、腫瘍低酸素症、ニューロン低酸素症、脳低酸素症、狭窄、及び虚血から選択される、請求項１１に記載の抗体。

【請求項13】

上記固形腫瘍が、肉腫、神経膠腫、癌腫、中皮腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、子宮頸部腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝臓腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、及び頭頸部腫瘍から選択される、請求項１１に記載の抗体。

【請求項14】

上記眼疾患が、高眼圧症、緑内障、黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、ブドウ膜炎、網膜炎、Ｘ連鎖性網膜分離症、及び高血圧性網膜症から選択される、請求項１１に記載の抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、炭酸脱水酵素に結合する抗体であって、（ａ）Ｖ_H領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）、並びに／又は、Ｖ_L領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）；又は（ｂ）(ａ）のアミノ酸配列であって、配列番号１から６のアミノ酸配列の何れか１つにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換されている、アミノ酸配列を含む、抗体に関する。

【0002】

本明細書において、特許出願及び製造者のマニュアルを含む多数の文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連があるとは考えられてはいないが、その全体が本明細書に援用される。さらに詳細には、参照される全文書は、個々の文書が、特異的かつ個別に、本明細書に援用されているものと示されるように、同程度に、本明細書に援用される。

【背景技術】

【0003】

炭酸脱水酵素は、炭酸水素塩及びプロトンへの、炭酸の可逆的水和を触媒し、このようにして体内におけるｐＨホメオスタシスの維持に関与する酵素ファミリーである[バジャー（Badger）及びプライス（Price）（１９９４）、アニュアル・レビュー・オブ・プラント・フィシオロジー・アンド・プラント・モレキュラー・バイオロジー(Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bio．)、45：369‐392]。触媒が存在しない場合、この反応はかなり緩慢に生じる。大部分の炭酸脱水酵素は、活性部位に亜鉛イオンを含有するため、これらは金属酵素と分類される。

【0004】

炭酸脱水酵素のファミリーは、幾つかのメンバーを有する。少なくとも５つの特異なＣＡサブファミリーがある（α、β、γ、δ及びε）。これらのサブファミリーは、有意なアミノ酸配列の類似性を有しておらず、大部分の場合、収束進化の例であると考えられている。α−炭酸脱水酵素（ＣＡ）は、哺乳動物において見られる。このサブファミリーのメンバーは、そのカイネティクス、組織発現、及び細胞内局在に関し、区別され得る（キベラ（Kivela）ら、2005）。

【0005】

α−ＣＡ酵素は、４つの広いサブグループ、即ち、細胞質基質ＣＡ（ＣＡ−Ｉ、ＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＩＩ、ＣＡ−ＶＩＩ及びＣＡ−ＸＩＩＩ）、ミトコンドリアＣＡ（ＣＡ−ＶＡ及びＣＡ−ＶＢ）、分泌ＣＡ（ＣＡ−ＶＩ）、並びに膜結合型ＣＡ（ＣＡ−ＩＶ、ＣＡ−ＩＸ、ＣＡ−ＸＩＩ、ＣＡ−ＸＩＶ及びＣＡ−ＸＶ）に分類される[ブレトン（Ｂｒｅｔｏｎ）ら（２００１）、ＪＯＰ ２（４ Ｓｕｐｐｌ）：１５９−６４]。さらに、機能が依然として不明である、３つの「触媒性」ＣＡアイソフォーム（ＣＡ−ＶＩＩＩ、ＣＡ−Ｘ、及びＣＡ−ＸＩ）がある。全てのこれらのＣＡには、さらに幾つかのアイソフォームが存在する。

【0006】

ＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＸ、及びＣＡ−ＸＩＩは腫瘍過程と関連付けられており、これらは、多様な腫瘍についての、潜在的な、組織学的かつ予後的バイオマーカーである[ノードフォース（Nordfors）ら（2010）、ビー・エム・シー・キャンサー(BMC cancer)；10:148]。ＣＡ−ＩＩは、最も広範囲に発現されている、α−ＣＡ遺伝子ファミリーのメンバーであり、何れのヒト組織及び臓器でも実質的に存在する。ＣＡ−ＩＩは、知られている中で触媒的に最も効率の良い酵素の１つである。ＣＡ−ＩＩは、ある程度、悪性細胞に存在し、そして興味深いことに、近年、腫瘍新生血管の内皮細胞で異所的に発現していることが示されている。膜貫通酵素であるＣＡ−ＩＸは、数種のヒト癌腫、及び正常胃腸組織において発現する、新規腫瘍関連抗原として最初に認知された。ＣＡ−ＩＸは、細胞接着、分化、増殖及び発癌プロセスに機能的に関連付けられており、その酵素活性は、ＣＡ−ＩＩに匹敵する。別の膜貫通ＣＡアイソザイムであるＣＡ−ＸＩＩは、正常腎臓組織及び腎細胞癌腫において最初に発見された。さらなる研究によって、ＣＡ−ＸＩＩは、その他幾つかの腫瘍[ウルマソブ（Ｕｌｍａｓｏｖ）ら（２０００）]において、しかし、結腸及び子宮等の幾つかの正常臓器においても発現していることが示された。ヒトＣＡ−ＸＩＩのＸ線結晶構造によって、ＣＡ−ＸＩＩが、バイトピック（ｂｉｔｏｐｉｃ）二量体タンパク質であり、活性部位ドメインの向きが細胞外空間に向くように、当該タンパク質の短い細胞内Ｃ末端が活性部位ドメインの反対側に存在することが明らかになっている。

【0007】

特に低酸素条件下において、腫瘍ではＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＸ及びＣＡ−ＸＩＩが高発現していることから、これらの酵素が、細胞外空間の酸性化によって促進される浸潤プロセスに機能的に関与する可能性があることがさらに示唆されている。この仮説を支持するように、インビトロにおいて、ＣＡ阻害剤が、癌細胞の浸潤能及び増殖を減少させ得ることが示されている[マノカラン（Manokaran）ら（2008）、ジャーナル・オブ・バイオメディカル・ナノテクノロジー(J Biomed Nanotechnol．)、4（4）：491‐498）]。特に、ＣＡ−ＩＸ及びＣＡ−ＸＩＩは、これらアイソザイムの転写が、低酸素誘導性因子−１アルファ（hypoxia inducible factor-1 alpha;HIF‐1α）媒介経路を介して、低酸素条件下で、腫瘍において誘導される[シシュ（Chiche）ら（2009）]ことから、類似の機構によって制御されているようである。加えて、ＣＡ−ＸＩＩの発現は、乳房腫瘍において、エストロゲン受容体アルファ（estrogen receptor aplpha;ERα）と高い相関があることが示されている[バーネット（Barnett）ら（2008）、キャンサー・リサーチ（Cancer Res）68：3505−3515]。癌進行におけるＣＡの重要性をより詳細に説明すると、急速に増殖する腫瘍細胞は、急速に過成長し、最も近い血管（１００から１５０μｍ）からの酸素拡散が損なわれる。その結果、腫瘍細胞は低レベルの酸素しか受け取らず、局所的低酸素中心及び組織壊死が引き起こされる。低酸素症は、細胞がストレス条件に順応することにおいて選択圧を生じ、その結果、ｐＨホメオスタシスに関与する酵素を含む、およそ５０個のさらなるタンパク質の発現を生じる[ポッター（Potter）ら（2004）、セル・サイクル（Cell Cycle）、3：164−167]。上記に説明したように、後者は、少なくとも部分的に、選択される炭酸脱水酵素（ＣＡ）アイソザイム、特にＣＡ−ＩＩ、ＣＡ−ＩＸ及びＣＡ−ＸＩＩの間の複雑な協調によって達成される。ＣＡ−ＸＩＩと癌との間の直接の関連性が、プレショルド（Proescholdt）ら（2005）、ニューロ・オンコロジー(Neuro Onco) 7：465−475によって証明されている。本明細書においては、ＣＡ−ＸＩＩ発現が、正常脳組織と比較して、内因性脳腫瘍及び転移性脳腫瘍において上方制御されていることが証明されている。さらに、イリエ（Ilie）ら（2011）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(In J Cancer)、128（7）：1614−23、及びヒュンニネン（Hynninen）ら（2006）、ヒストパソロジー(Histopathology)、49：594−602では、切除可能な非小細胞肺癌及び卵巣癌それぞれに由来の組織において、ＣＡ−ＸＩＩの過剰発現が示された。シェ（Hsieh）ら（2010）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(Eur J Cell Biol)、89：598−606では、ＣＡ−ＸＩＩが、インビボ及びインビトロで、腫瘍細胞株の浸潤及び転移に関連していることが明らかにされた。

【0008】

さらに、ＣＡ−阻害剤、特にＣＡ−ＩＩ及びＣＡ−ＸＩＩの阻害剤は、眼内圧を減少させ、従って高眼圧症を治療するために用いられる[アル−バラッグ（Al‐Barrag）ら（2009）、クリニカル・オフタロモロジー(Clinical Ophthalomology)3：357−362]。また、ＣＡ阻害剤は、緑内障の治療においても有用であることが示された[ハーパサロ（Haapasalo）ら（2008）、ニューロ・オンコロジー(Neuro Oncology)3：357‐362、及びブロ（Vullo）ら、2005]。

【0009】

従って、ＣＡ、そして特にＣＡ−ＸＩＩは、低酸素症、癌及び眼疾患に関与することが知られており、従って、療法的治療又は診断のための重要なターゲットである[サーリー（Thiry）ら、2008、ブロ(Vulo)ら、2005、及びハーパサロ(Haapasalo)ら（2008）、ニューロ・オンコロジー（Neuro Oncology）、3：357‐362]。全身炭酸脱水酵素阻害剤が当該技術分野において知られているが、これらは、酸塩基平衡異常、過敏症反応、及び致死性再生不良性貧血等の有害な副作用と関連付けられている[グロス（Gross）ら（1988）、アメリカン・ジャーナル・オブ・オフタルモロジー(Am J Opthamol．)、ネイサー（Naeser）ら（1986）、アクタ・オフタルモロジカ(Acta Opthalmol．)、64：330−337、マストロパスクア（Mastropasqua）ら（1998）、212：318−321；及びパスプ（Passp）ら、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・オフタルモロジー(Br J Opthalmol．)1985；69：572−575]。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従って、上述の疾患に対するさらなる治療手段及び診断手段を開発するのに利用し得るさらなる手段及び方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0011】

この必要性は、請求項において特徴付けられる実施態様を提供することによって対処される。

【0012】

従って、本発明は、第一の実施態様において、炭酸脱水酵素に結合する抗体であって、（ａ）Ｖ_H領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）、並びに／又はＶ_L領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）；又は（ｂ）(ａ）のアミノ酸配列であって、配列番号１から６のアミノ酸配列の何れか１つにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換されている、アミノ酸配列を含む、抗体に関する。

【0013】

「抗体」と言う用語は、本発明によれば、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びに、結合特異性を依然として保持するその誘導体又は断片を含む。抗体を産生するための手法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ハーロウ（Harlow）及びレーン（Lane）「抗体、実験室マニュアル（Antibodies, A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８８、並びにハーロウ（Harlow）及びレーン（Lane）「抗体を用いて：実験室マニュアル（Using Antibodies： A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９９９に記載されている。「抗体」と言う用語は、本発明によれば、また、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体、並びに；特にＦａｂ断片のような抗体断片；Ｅｐｈ受容体、エフリン又はホスファターゼ細胞外ドメインとＦｃとからなる融合タンパク質も含まれる。抗体断片又は抗体誘導体は、さらに、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ断片又はｓｃＦｖも含む（例えば、ハーロウ(Harlow)及びレーン(Lane)、（1988）及び（1999）、上記を参照されたい。）。様々な方法が当該技術分野において知られており、それらが、このような抗体及び／又は断片の産生に用いられ得る。従って、（抗体）誘導体は、ペプチド模倣体によって産生し得る。さらに、一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。）を、本発明のポリペプチド（単数又は複数）に特異的な一本鎖抗体及び融合タンパク質を産生するのに適応させることも出来る。また、トランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドに特異的なヒト化抗体及び融合タンパク質を発現させることも可能である。最も好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の調製のためには、連続細胞株培養によって産生される抗体を提供する任意の手法を用いることが出来る。こうした手法の例としては、さらに当該技術分野によって発展されるような元来のハイブリドーマ技術[ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、（１９７５）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５）、トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法[コズボー（Ｋｏｚｂｏｒ）（１９８３）、イミュノロジー・トゥデイ(Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ)４、７２]、並びにヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ法[コール（Ｃｏｌｅ）ら（１９８５）モノクローナル抗体及び癌治療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、アラン・アール・リス社（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．）、７７]が含まれる。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）システムで用いられるような表面プラズモン共鳴を用いて、本発明のポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の性能を増加させることも出来る[シアー（Ｓｃｈｉｅｒ）（１９９６）、ヒト抗体ハイブリドーマ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）７、９７；マルムボルグ（Ｍａｌｍｂｏｒｇ）（１９９５）、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３）７]。本発明と関連して、「抗体」と言う用語は、細胞において発現され得る抗体コンストラクト、例えば、とりわけ、ウイルスベクター又はプラスミドベクターを介してトランスフェクション及び／又は形質導入され得る抗体コンストラクトを含む。本発明と関連して記載される抗体は、言及するポリペプチド、好ましくは、本明細書においてさらに定義されるようなＣＡ−ＸＩＩのエピトープと特異的に結合／相互作用することが可能である。本発明に応じて用いられる「特異的に結合／相互作用する」と言う用語は、抗体が、類似の構造のエピトープと交差反応しないか又は本質的に交差反応しないことを意味する。研究中の抗体パネルの交差反応性は、例えば、目的とするエピトープへの、並びに、幾つかの多かれ少なかれ（構造的に及び／又は機能的に）近縁関係にあるエピトープへの、慣用的条件下での、上記抗体パネルの結合を評価することによって、試験することが出来る。関連する状況において目的とするエピトープ（例えば、ＣＡ、特にＣＡ−ＸＩＩの構造における特異的モチーフ）に結合するが、他のエピトープの何れにも結合しないか又は本質的に結合しない抗体のみが、目的とするエピトープに特異的あり、従って本発明による抗体であると考慮される。相応の方法が、例えば上述のハーロウ(Harlow)及びレーン(Lane)、１９８８及び１９９９に記載されている。抗体は、言及するポリペプチド、好ましくはＣＡ−ＸＩＩに特徴的な、立体構造エピトープ又は連続エピトープに特異的に結合／相互作用する。立体構造エピトープ又は不連続エピトープは、ポリペプチド抗原に関して、一次配列においては分離されているが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原にフォールディングした際に、分子表面上で一体となる、２個以上の別個のアミノ酸残基の存在を特徴とする[セラ（Ｓｅｌａ）（１９６９）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１６６、１３６５；レーバー（Ｌａｖｅｒ）（１９９０）、セル（Ｃｅｌｌ）６１、５５３）。エピトープに寄与する２個以上の別個のアミノ酸残基は、１以上のポリペプチド鎖の別個のセクション上に存在する。これらの残基は、ポリペプチド鎖（単数又は複数）が、三次元構造にフォールディングしてエピトープを構成した際に、分子表面上で一体になる。対照的に、連続又は直鎖エピトープは、ポリペプチド鎖の単一直鎖セグメントに存在する、２個以上の別個のアミノ酸残基からなる。例えば、ＷＯ／２０００／０２９０１９及び米国特許第６，２９４，１７１号に記載される通り抗体を投与してもよい。これに関連して、触媒活性が抗体EXO 6A10によって阻害されるＣＡ−ＸＩＩの触媒ドメインが図６に示されていることを付言する。

【0014】

「ＣＤＲ」と言う用語は、当該技術分野において周知であり、相補性決定領域を特定するものである（例えば、ハーロウ(Harlow)及びレーン(Lane)、「抗体、実験室マニュアル」（“Antibodies, a laboratory manual”）、ＣＳＨプレス，コールド・スプリング・ハーバー、１９８８を参照されたい）。ＣＤＲは、抗体の可変（Ｖ）領域に見られる、比較的短いアミノ酸配列である。抗体の各可変領域（重鎖Ｖ_H及び軽鎖Ｖ_L）は、４つの比較的保存されたフレームワーク領域、即ち「ＦＲ」が両側に隣接する、ときに超可変領域と呼ばれる３つの相補性決定領域を含む。抗体の６つのＣＤＲは、抗体の特異性を本質的に決定し、かつ特定のリガンドと接触する。

【0015】

当業者は、さらに向上した特異性及び生物学的機能を有する抗体を構築するために、上記ＣＤＲ（配列番号１から６）を有する抗体の可変領域が用いられ得ることを、容易に認識するであろう。この限りにおいて、本発明は、添付の実施例に記載される抗体と実質的に同一であるか、類似であるか、或いはより向上した結合特性を有利に有する、上記可変領域を含む抗体を包含する。

【0016】

本発明によれば、本発明の抗体又はその対応する免疫グロブリン鎖（単数又は複数）は、従って、配列番号１から６のアミノ酸配列の何れか１つにおける、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換（単数又は複数）によってさらに修飾され得る。これに関連して、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満のアミノ酸、又は１つのアミノ酸が、配列番号１から６のアミノ酸配列の何れか１つにおいて、保存的に置換されていることが好ましく、後者になるほどより好ましい。

【0017】

「保存的置換」と言う用語は、当該技術分野において広く用いられており、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、類似の特性を有するアミノ酸による置換を特定するものである。類似の特性は、例えば、サイズ、疎水性、又は電荷である。周知であるように、アミノ酸は、正電荷であるか、負電荷であるか、非荷電側鎖又は疎水性側鎖を有するかに分類される。保存的置換の例は、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｌｙｓに対するＡｒｇ、ＰｈｅからＴｒｐ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＳｅｒからＴｈｒ、或いはそれらの逆である。一般的に、アミノ酸配列、特にＣＤＲのアミノ酸配列の全体としての機能は、保存的置換によって本質的に影響を受ける可能性が低く、向上さえし得る。

【0018】

ＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列において、こうした修飾、特に、アミノ酸置換（単数又は複数）を導入するための方法は、当業者には周知である[例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキュラー・クローニング 実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）、ニューヨークを参照されたい。]。

【0019】

本発明の抗体は、その阻害活性及び生物学的活性について有利な特性を示す。添付の実施例からわかるように、配列番号１から６を有するＣＤＲを含む抗体EXO 6A10は、スルホンアミド(sulfonamide)、アゼダゾールアミド（ａｚｅｄａｚｏｌａｍｉｄｅ）即ち、ＣＡの既知の阻害剤、例えばカウアー（Ｋａｕｒ）ら（２００２）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマセウティクス(Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ)、２４８（１−２）：１−１４]に比較した際、ＣＡ−ＸＩＩの酵素活性を４０倍より良く阻害する。さらに、本実施例は、抗体EXO 6A10が、毒性減弱培養条件下で、腫瘍細胞株Ａ５４９（腺癌由来）の増殖を阻害することを示す。

【0020】

本発明者らが知る限りでは、EXO 6A10は、従って、生存細胞上でＣＡ−ＸＩＩの活性を阻害すると同定された最初の抗体である。これは、炭酸脱水酵素活性及び特にＣＡ−ＸＩＩの活性と関連する疾患の治療手段及び診断手段に関し、本発明によって提供される抗体の適格性の概念実証である。

【0021】

本発明の抗体は、ＣＡの多様なメンバー、好ましくは、細胞外活性部位空隙が相同性を共有する他の膜結合型α−炭酸脱水酵素（ＣＡ）に結合すると想定されている[アルテリオ（Ａｌｔｅｒｉｏ）ら（２００９）、ＰＮＡＳ １０６：１６２３３−１６２３８]。本発明の抗体が、膜結合型ＣＡである、ＣＡ−ＩＸ又はＣＡ−ＸＩＩに、並びにさらにより好ましくはＣＡ−ＸＩＩに結合することがより好ましい。

【0022】

従って、好ましい実施形態において、本発明の抗体は炭酸脱水酵素ＸＩＩに結合する。

【0023】

これに関連して、ＣＡ−ＸＩＩがヒトＣＡ−ＸＩＩであることが好ましい。抗体が、細ＣＡ−ＸＩＩ胞外ドメインの少なくとも１つのエピトープ（配列番号１７のアミノ酸２５から３０１）に結合することがさらに好ましく、さらにＣＡ−ＸＩＩの不連続触媒ドメインの領域（配列番号１７のアミノ酸９４から１９９）において結合することがさらにより好ましい[ウィッティングトン(Whittington)ら（２００１）]。本発明による「細胞外ドメイン」と言う用語は、当該技術分野において周知の用語であり、また、本発明との兼ね合いでは、細胞外環境へと伸長する、ＣＡ−ＸＩＩの部分に関する。また、本発明による「触媒ドメイン」と言う用語は、当該技術分野において周知の用語であり、さらにまた、本発明との兼ね合いでは、炭酸から重炭酸塩及びプロトンへの触媒が生じる、ＣＡ−ＸＩＩの部分に関する。

【0024】

上記により詳細に説明するように、ＣＡ−ＸＩＩは、低酸素症、癌及び眼疾患におけるその役割に関して知られており、従って、診断目的及び医学目的に関して重要な標的である。本発明の診断目的及び医学目的は、本明細書において、以下により詳細に論じられる。

【0025】

好ましい実施形態においては、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列によって決定されるＶ_H領域及び配列番号８のアミノ酸配列によって決定されるＶ_L領域を含む抗体に関する。

【0026】

本明細書において上記に言及するように、抗体は、２つの可変ドメインである、重鎖ドメインＶ_H及び軽鎖ドメインＶ_Lを有する。配列番号７及び８は、本発明の抗体EXO 6A10のＶ_H及びＶ_Lドメインの配列を示す。

【0027】

さらに好ましい態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。

【0028】

モノクローナル抗体は、例えば、ケーラー(Kohler)及びミルスタイン(Milstein)、ネイチャー(Ｎａｔｕｒｅ)２５６（１９７５）、４９５、並びにガルファー（Ｇａｌｆｒｅ）、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．)７３（１９８１）、３に元来記載されるような、よく確立された手法によって調製出来るが、このようなよく確立された手法は、この場合は、当該技術によって開発された改変を伴い、免疫した哺乳動物由来の脾臓細胞に、マウス骨髄腫細胞を融合させることを含む。

【0029】

これに関連して、本発明の抗体EXO 6A10は、図１１に示されるような、かつ図１２に示される核酸によってコードされる、ＣＡ−ＸＩＩのヒト配列に対して、ラットにおいて、作製されているモノクローナル抗体であることは注目すべきである。従って、本発明のモノクローナル抗体はラット・モノクローナル抗体であることが特に好ましい。

【0030】

別の好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、（ａ）標識基、（ｂ）毒素、又は（ｃ）抗腫瘍薬と結合している。

【0031】

これに関連して、標識基は、ハプテン又は蛍光色素であってもよく、例えば、フラッグ（ＦＬＡＧ）、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄトマト（ｄＴｏｍａｔｏ）、チェリー（ｃｈｅｒｒｙ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、タムラ（Ｔａｍｒａ）、テキサスレッド、ローダミン、アレクサ・フロー（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒｓ）、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣから選択される。或いは、標識基は、例えば³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹⁵Ｎ、³⁵Ｓ、⁹⁰Ｙ、⁹⁹Ｔｃ、¹¹¹Ｉｎ、¹²⁵Ｉ、又は¹³¹Ｉなどの放射性同位体あってもよい。適切な標識基のさらなる例は、酵素基（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、西洋ワサビガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、又は第二のレポーターによって認識される、あらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）である。

【0032】

「毒素」と言う用語は、本明細書において、生細胞又は生物によって産生され、かつ細胞又は生物に対して毒性を有する、任意の化合物に関する。従って、毒素は、例えば小分子、ペプチド、又はタンパク質であってもよい。特定の例としては、神経毒、壊死毒、血液毒及び細胞毒である。

【0033】

「抗腫瘍薬」と言う用語は、本発明によれば、組織の異常増殖を停止させるか又は遅延させるか何れかが可能な薬剤を特定する。従って、抗腫瘍薬は、特に、癌を治療する際に有用である。抗腫瘍薬は、血管新生阻害剤、ＤＮＡ挿入剤若しくはＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ−ＲＮＡ転写制御因子、酵素阻害剤、遺伝子制御因子、微小管阻害剤、又はその他抗腫瘍剤であり得る。

【0034】

当該技術分野において周知の方法によって、本発明の抗体は、本明細書に定義するような標識基、毒素、又は抗腫瘍薬と結合され得ることは当業者に明らかである。こうした結合は、抗体又は抗原の発現後、付着部位に化学的に行うことも可能であるし、或いはＤＮＡレベルで本発明の抗体又は抗原内にカップリング産物を操作して入れてもよい。次いで、本明細書において、以下に記載するような適切な宿主系において、ＤＮＡを発現させ、そして発現させたタンパク質を回収し、必要に応じて再生させる。結合は、当該技術水準において知られるリンカーを介して達成してもよい。特に、この技術とともに、酸性条件若しくは還元条件の下で、又は特定のプロテアーゼに対する曝露に際して、毒素又は抗腫瘍薬を放出する、様々なリンカーを利用してもよい。

【0035】

特定の態様においては、標識基、毒素、又は抗腫瘍薬剤を、様々な長さのスペーサーアームによって結合させ、潜在的な立体障害を減少させることが望ましい場合もある。

【0036】

さらなる実施形態においては、本発明は、本発明による抗体をコードする核酸分子に関する。

【0037】

本発明の抗体をコードする、本発明の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成により産生されるＤＮＡ若しくはＲＮＡ、或いはこれらの核酸分子の何れかを単独で又は組み合わせて含む組換え技術により産生されるキメラ核酸分子であってもよい。核酸分子はまた、遺伝子全体若しくはその相当部分、又はその断片及び誘導体に対応するゲノムＤＮＡであってもよい。ヌクレオチド配列は、天然型のヌクレオチド配列に対応してもよいし、或いは、本発明の核酸が配列番号１から６若しくは配列番号７及び８；又は少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換されているこれら配列をコードする核酸を含むのに必要な、単一又は複数のヌクレオチド置換、欠失又は付加をヌクレオチド配列が含有してもよいし、或いはヌクレオチド配列が、配列番号９から１５若しくは配列番号１５及び１６によって定義される核酸を含む。

【0038】

本発明の特に好ましい実施形態においては、核酸分子はｃＤＮＡ分子である。

【0039】

本発明の一実施形態はまた、核酸分子を発現可能な形態で含むベクターにも関する。

【0040】

本発明のベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製可能であってもよいし、或いは複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に、補完宿主/細胞(complementing host/cells)においてのみ生じる。

【0041】

核酸分子は、幾つかの市販のベクター内に挿入してもよい。限定されない例としては、ｐＵＣシリーズ、ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）[ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）]、発現ベクターのｐＥＴシリーズ[ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）]又はｐＣＲＴＯＰＯ[インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）]等の原核生物プラスミドベクター、並びにｐＲＥＰ（インビトロジェン）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＸＴ１（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ[クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）]、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（クロンテック）、ｐＥＡＫ−１０[エッジバイオシステムズ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）]、ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（ノバジェン）及びｐＣＩＮｅｏ[プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）]のような哺乳動物細胞における発現と適合するベクターが含まれる。植物発現ベクターは、ｐジェム−Ｔ（ｐＧＥＭ−Ｔ）（プロメガ）、ｐキャンビア１３９１（ｐＣＡＭＢＩＡ １３９１）[キャンビア（Ｃａｍｂｉａ）]、ゲイトウェイ（ＧＡＴＥＷＡＹ）（インビトロジェン）、ｐグリーン（ｐＧｒｅｅｎ）及びｐグリーンＩＩ（ｐＧｒｅｅｎＩＩ）[Ｐグリーン（ＰＧＲＥＥＮ）]を含む。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に適したプラスミドベクターの例は、例えばプラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９Ｋ及びｐＰＩＣ３．５Ｋ（全てインビトロジェン）を含む。

【0042】

上記に引用する核酸分子を、別のポリヌクレオチドとの翻訳融合が生じるように、ベクター内に挿入してもよい。ベクター改変の手法に関しては、サムブルック(Sambrook)及びラッセル（Russel）（２００１）、上記を参照されたい。一般に、ベクターは、１以上の複製起点（ｏｒｉ）及びクローニング又は発現に関する遺伝系(inheritance systems for cloning or expression)、宿主における選択のための1以上のマーカー、例えば抗生物質耐性、並びに１以上の発現カセットを含有し得る。適切な複製起点（ｏｒｉ）には、例えばＣｏｌ Ｅ１、ＳＶ４０ウイルス及びＭ１３の複製起点が含まれる。

【0043】

ベクター中に挿入されるコード配列は、例えば標準的な方法によって合成してもよいし、又は天然源から単離してもよい。転写制御因子への、及び／又はその他アミノ酸コード配列へのコード配列のライゲーションは、確立された方法を用いて実施し得る。原核生物又は真核細胞において発現を確保する転写制御因子（発現カセットの一部）は当業者に周知である。これらの因子は、転写開始を確保する制御配列（例えば翻訳開始コドン、プロモーター、例えば天然に関連した、又は異種性のプロモーター及び／又はインスレーター）、内部リボソーム進入部位（internal ribosomal entry site;ＩＲＥＳ）[オーウェンズ（Ｏｗｅｎｓ）、米国科学アカデミー紀要(Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ)９８（２００１），１４７１−１４７６]、並びに、任意に、転写の停止及び転写産物の安定化を確保するポリＡシグナルを含む。さらなる制御因子には、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサーが含まれてもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、こうした発現調節配列に機能可能であるように連結して、原核生物又は真核細胞における発現を可能にする。ベクターは、さらなる制御因子として、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。このような配列は当業者に周知である。さらに、用いる発現系に応じて、発現されたポリペプチドを細胞内区画に導くことが可能なリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加してもよい。このようなリーダー配列は当該技術分野に周知である。

【0044】

さらに、ベクターが選択可能マーカーを含むことが好ましい。選択可能マーカーの例には、ネオマイシン、アンピシリン、及びハイグロマイシン、カナマイシン耐性等が含まれる。

【0045】

本発明による発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド及びコードされる抗体の複製、及び発現を導くことが可能である。記載される制御要素を含む、適切な発現ベクターが当該技術分野において知られている。これに関連して、本発明の抗体のＶ_H及びＶ_L領域は、様々な発現ベクターによってコードされていてもよいことが留意される。

【0046】

本明細書において上述するような核酸分子は、宿主への直接導入、或いはリポソーム、ファージベクター又はウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）を介した導入のために設計され得る。さらに、バキュロウイルス・システム、又はワクシニアウイルス若しくはセムリキ森林ウイルスに基づくシステムを、本発明の核酸分子のための真核生物発現システムとして用いることが出来る。

【0047】

典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写開始を媒介するプロモーター要素、タンパク質コード配列、並びに転写終結及び転写産物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。さらに、複製起点、薬剤耐性遺伝子、制御因子（誘導性プロモーターの一部として）などの要素もまた含まれてもよい。ｌａｃプロモーターは、原核細胞に有用な、典型的な誘導性プロモーターであり、ラクトース類似体であるイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を用いて誘導可能である。組換え発現及び分泌のために、例えば、ｐＨＥＮ４と称されるファージミドにおいて、組換えタンパク質をペリプラズムに導くＰｅｌＢリーダーシグナルと、遺伝子ＩＩＩとの間に、目的のポリヌクレオチドを連結してもよい[ガーロウディ（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ）ら、１９９７、フェブズ・レター（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）４１４：５２１−５２６に記載される）。さらなる要素には、エンハンサー、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列、並びにＲＮＡスプライシングのドナー部位及びアクセプター部位が両側に位置する介在配列が含まれ得る。ＳＶ４０由来の初期プロモーター及び後期プロモーター、レトロウイルス、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ由来の長反復配列（long terminal repeat;ＬＴＲ）、並びにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて、非常に効率的な転写を達成してもよい。しかしながら、細胞要素もまた使用可能である（例えばヒト・アクチン・プロモーター）。或いは、染色体に組み込まれた遺伝子コンストラクトを含有する安定発現細胞株において、組換えポリペプチドを発現させることも出来る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの選択マーカーとの同時トランスフェクションによって、トランスフェクションされた細胞の同定及び単離が可能になる。また、トランスフェクションされた核酸を増幅して、コードされるポリペプチドを多量に発現させることが出来る。上記に示すように、発現ベクターには、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーが含まれる。こうしたマーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌（エシェリキア・コリ；Ｅ．ｃｏｌｉ）及びその他細菌における培養のためのテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。適切な宿主の代表的な例には、限定されるわけではないが、大腸菌（エシェリキア・コリ）細胞、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；例えばドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びボウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞などの動物細胞；並びに植物細胞が含まれる。上述の宿主細胞に適した培地及び培養条件は当該技術分野に知られている。

【0048】

本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む非ヒト宿主に関する。

【0049】

上記宿主は原核細胞又は真核細胞であってもよい。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてもよいし、或いは染色体外に維持されていても、いずれでもよい。これに関連して、本発明の核酸分子は、相同組換えを介して、「遺伝子ターゲティング」及び／又は「遺伝子置換」のために、変異遺伝子を回復するために、又は変異遺伝子を生成するために用いられ得ることもまた理解されるべきである[例えば、モーエリック（Ｍｏｕｅｌｌｉｃ）、米国科学アカデミー紀要(Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ)、８７（１９９０），４７１２−４７１６；ジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）、遺伝子ターゲティング、実際のアプローチ（Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。]。

【0050】

適切な原核宿主細胞は、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属、及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の種の細菌を含む。適切な真核宿主細胞は、例えば、真菌細胞、とりわけ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母、又はドロソフィラＳ２細胞及びスポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞、及び植物細胞、並びに哺乳動物細胞である。上記宿主細胞に適した培地及び培養条件は、当該技術分野に知られている。使用可能な哺乳動物宿主細胞には、ヒト・ヒーラ（Ｈｅｌａ）、ＨＥＫ２９３、Ｈ９及びジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １、Ｃｏｓ ７及びＣＶ１、ウズラ（ｑｕａｉｌ）ＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ２Ｃ１２細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。また、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblasts;ＭＥＦ）などの初代哺乳動物細胞などの宿主も本発明の範囲内である。或いは、染色体内に組み込まれた遺伝子コンストラクトを含有する安定発現細胞株において、組換え抗体を発現させることが出来る。より好ましい実施形態においては、上記細胞は、初代細胞又は初代細胞株である。初代細胞は、生物から直接得られる細胞である。

【0051】

本発明はまた、本発明の抗体を産生するのに用いられ得る、本発明の１以上の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物にも関する。ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター又はその他哺乳動物の、組織、又は乳、血液若しくは尿などの体液において抗体を産生し、それらから回収することも可能である。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、第５，７５６，６８７号、第５，７５０，１７２号、及び第５，７４１，９５７号を参照されたい。

【0052】

さらなる実施形態においては、本発明は、本発明の抗体を産生するための方法であって、以下を含む、方法：（ａ）上記抗体の合成を可能にする条件下で、本発明の宿主を培養すること；並びに（ｂ）当該培養物から上記抗体を回収すること、に関する。

【0053】

形質転換宿主は、発酵槽（ファーメンター）において増殖させ、当該技術分野において知られる手法で培養し、最適な細胞増殖を達成することが出来る。ひとたび発現させたら、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動等を含む、当該技術分野の標準的な方法に従って、本発明の全抗体を精製することが出来る[スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、「タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），ニューヨーク州（１９８２）を参照されたい。]。次いで、増殖培地、細胞溶解物、又は細胞膜画分から、本発明の抗体又はその対応する免疫グロブリン鎖（単数又は複数）を単離することが出来る。例えば、微生物学的に発現された本発明の抗体又は免疫グロブリン鎖の単離及び精製は、例えば調製用クロマトグラフィー分離及び免疫学的分離、例えば本発明の抗体の定常領域に対して作製されたモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を伴うものなどの、任意の従来手段によってもよい。

【0054】

別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクター又は本発明の宿主を含む診断組成物に関する。

【0055】

本明細書において用いられる「組成物」と言う用語は、以下において、化合物とも総称される、本発明の少なくとも１つの抗体、核酸分子、ベクター、及び／又は宿主を含む組成物を定義するものである。

【0056】

本発明の診断組成物は、様々な細胞、組織又は別の適切な試料における、ＣＡ、特にＣＡ−ＩＸ又はＣＡ−ＸＩＩの望ましくない発現又は過剰発現の検出であって、試料を本発明の抗体と接触させること、並びに試料においてＣＡ、特にＣＡ−ＩＸ又はＣＡ−ＸＩＩの存在を検出することを含む検出に有用である。従って、本発明の診断組成物を、以下に定義するような発病又は疾患状態を評価するために用いてもよい。特に、ＣＡ、特にＣＡ−ＩＸ又はＣＡ−ＸＩＩを発現する、癌細胞などの悪性細胞を、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体でターゲティングしてもよい。本発明の抗体が結合した細胞は、それ故、補体系などの免疫系機能によって、又は細胞媒介性細胞毒性によって攻撃され、従って、ＣＡ、特にＣＡ−ＩＸ又はＣＡ−ＸＩＩの望ましくない発現又は過剰発現を示す細胞の数が減少するか又はこうした細胞が根絶される。

【0057】

本明細書において上述する本発明の一態様においては、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体を、標識基に結合させる。こうした抗体は、診断アプリケーションに特に適している。

【0058】

本発明の診断組成物は、単独活性薬剤として投与出来るし、又は他の薬剤と組み合わせて投与出来る。

【0059】

さらなる実施形態においては、本発明は、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクター又は本発明の宿主を含む医薬組成物に関する。

【0060】

医薬組成物は、好ましくは、家畜及びペット動物などの哺乳動物に投与される。最も好ましくは、ヒトに投与される。本明細書に記載される医薬組成物は、適切な用量で対象に投与され得る。本発明に応じた使用のための医薬組成物は、１以上の生理学的担体又は賦形剤を用いて、当該技術分野に見られる方法に従って、従来の方式で製剤化することが出来る[例えば、アンセル（Ａｎｓｅｌ）ら、「医薬剤型及び薬剤送達系（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、第７版、リピンコット、ウィリアムズ、及びウィルキンス出版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９９９を参照されたい。]。従って、医薬組成物は、経口投与、或いは例えば皮下、静脈内、筋内、腹腔内、髄腔内、経皮、経粘膜、硬膜下、イオン導入（ｉｏｎｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）を介した局所又は局部投与、舌下、吸入スプレーによって、エアロゾル又は直腸投与等の非経口投与等により、従来の医薬的に許容可能な賦形剤を任意に含む投薬単位製剤(dosage unit formulation)において、投与してもよい。

【0061】

経口投与のため、本発明の医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、あらかじめゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（フィラー）（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム）、或いは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬的に許容可能な賦形剤を用いて、従来の手段によって調製される錠剤又はカプセルの形態を取ることも出来る。医薬組成物は、本明細書に記載されるように、患者に生理学的に許容可能な担体とともに投与可能である。「担体」と言う用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指し、これらと共に治療薬が投与される。こうした医薬担体は、水及び油等の無菌液体であることが出来、これらには、例えばピーナツ油、大豆油、ミネラルオイル、ゴマ油等の、石油、動物、植物又は合成の起源のものが含まれる。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。生理食塩水溶液、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射可能溶液のための液体担体として利用することが出来る。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、ナトリウムイオン、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。望ましい場合、組成物はまた、微量の乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態であり得る。組成物は、トリグリセリド等の、従来の結合剤及び担体を用いて、座薬として製剤化できる。経口製剤は、医薬グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含み得る。適切な医薬担体の例が、Ｅ．Ｗ．マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）による「レミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）”に記載されている。こうした組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、治療有効量の上述の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量の担体と共に含有する。製剤は、投与様式に適合していなければならない。

【0062】

経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップ、又は懸濁物の形態であってもよいし、或いは水又はその他適切なビヒクルで使用前に構成するための乾燥産物として提示されることも可能である。こうした液体調製物は、医薬的に許容可能な添加剤、例えば懸濁化剤（例えば、ソルビトール、シロップ、セルロース誘導体、食用硬化油脂）、乳化剤（例えば、レシチン、アカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、分画化植物油）、保存剤（例えば、メチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシカーボネート、ソルビン酸）と共に、従来の手段によって調製されることも可能である。調製物はまた、相当と認められる場合、緩衝塩、フレーバー剤、着色剤及び甘味剤も含有し得る。経口投与のための調製物は、本発明の医薬組成物の徐放を生じるように適宜に製剤化することも可能である。

【0063】

吸入による投与のため、本発明の医薬組成物は、適切な噴霧剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他適切な気体）を用いて、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で好適に送達される。加圧エアロゾルの場合、バルブを提供することによって、投薬量単位を決定し、一定量を送達することが出来る。本発明の医薬組成物及びラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有する、吸入具（ｉｎｈａｌｅｒ）又は吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）において用いるための、例えばゼラチンの、カプセル及びカートリッジを製剤化することも出来る。

【0064】

本発明の医薬組成物を、注射による、例えばボーラス注射又は連続注入による、非経口投与用に製剤化することが出来る。注射の部位には、静脈内、腹腔内又は皮下が含まれる。注射用の製剤は、単位投与剤型[例えば、薬瓶（ｐｈｉａｌ）、多回投与容器、密封アンプル又はバイアル中、水溶液として又は再構成のための凍結乾燥製剤として）で、並びに添加される保存剤とともに提示されてもよい。本発明の医薬組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁物、溶液又はエマルジョンなどの形態を取ることができ、さらに懸濁剤、安定化剤、又は分散剤などの配合剤を含有し得る。或いは、薬剤は、使用前に適切なビヒクル（例えば無菌のピロジェン非含有水）で構成するための粉末形態であってもよい。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物にはまた、可溶化剤、及び注射部位で疼痛を和らげる局所麻酔、例えばリグノカインを含むことも出来る。一般に、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又は小袋などの密封容器における凍結乾燥粉末又は水非含有濃縮物として、成分は、単位投与剤型において別々に、或いは互いに混合されて供給される。組成物を点滴によって投与しようとする場合、無菌で医薬グレードの水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルを用いて調剤することも可能である。組成物を注射によって投与する場合、成分が投与前に混合可能であるように、無菌注射用水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【0065】

本発明の医薬組成物は、経皮投与用に製剤化することも出来る。経皮組成物は、典型的には、一般的に約０．０１〜約２０重量％、好ましくは約０．１〜約２０重量％、好ましくは約０．１〜約１０重量％、そしてより好ましくは約０．５〜約１５重量％の範囲の量で、有効成分（単数又は複数）を含有する局所軟膏又はクリームとして製剤化され得る。軟膏として製剤化される場合、有効成分は、典型的には、パラフィン性又は水混和性の軟膏基剤の何れかと組み合わされるであろう。或いは、有効成分は、例えば水中油型クリーム基剤とともにクリーム中に製剤化されてもよい。こうした経皮製剤は当該技術分野において周知であり、一般に、有効成分又は製剤を安定して皮膚に浸透させることを増進するさらなる成分を含む。全てのこうした既知の経皮製剤及び成分は、本発明の範囲内に含まれる。本発明の化合物はまた、経皮デバイスによっても投与可能である。従って、容器又は多孔質膜タイプの何れかの、或いは多様な固体マトリックスのパッチを用いて、経皮投与を達成し得る。

【0066】

本発明の医薬組成物は、中性又は塩の形態で製剤化することも出来る。医薬的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの等のアニオンで形成されるもの、並びに、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するもの等のカチオンで形成されるものが含まれる。

【0067】

また、望ましい場合には、本発明の医薬組成物を、上記薬剤を含有する１以上の単位投与剤型を含有し得る、パック、又はディスペンサーデバイス中で提示してもよい。パックは、例えば、金属又はプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含んでもよい。パック又はディスペンサーデバイスには、投与のための使用説明書が付随してもよい。

【0068】

本発明の医薬組成物は、単独活性薬剤として投与してもよいし、又はその他薬剤と組み合わせて、好ましくは当該技術分野において、問題の疾患の治療に適していることが知られるものと組み合わせて投与してもよい。

【0069】

医薬組成物は、一般に、所望の度合いの純度で、単位投与注射可能型（溶液、懸濁物、又はエマルジョン）で、医薬的に許容可能な担体、即ち使用する投薬量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、かつ製剤の他の成分と適合するものと混合することによって製剤化される。

【0070】

一般に、製剤は、医薬組成物の構成要素を、液体担体若しくは微細化した固形担体又はその両方と、均一かつ密接に接触させることによって調製される。次いで、必要であれば産物を所望の剤型に成形する。こうした担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液が含まれる。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクル、並びにリポソームもまた、本発明において有用である。担体は、適宜、等張性及び化学安定性を増進する物質などの、微量の添加剤を含有する。このような物質は、使用する投薬量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、それらにはリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、及びその他有機酸又はそれらの塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニン等のアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及びその他炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロキサマー、又はＰＥＧが含まれる。

【0071】

治療目的の投与のために用いられる、医薬組成物の成分は、無菌でなければならない。無菌性は、無菌ろ過膜（例えば０．２ミクロン膜）を介したろ過によって容易に達成される。医薬組成物の治療成分は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈注射用溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアル内に入れられる。

【0072】

本発明の一実施形態によれば、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクター又は本発明の宿主は、低酸素症、固形腫瘍、又は眼疾患を治療又は阻害するのに用いるためのものである。

【0073】

また、本明細書に記載されるものは、本発明の核酸分子、本発明のベクター又は本発明の宿主の有効量を、投与の必要がある対象に投与することによって、低酸素症、固形腫瘍、又は眼疾患を治療又は阻害するための方法である。

【0074】

これに関連して、「低酸素症」と言う用語は、身体全体（全身性低酸素症）又は体の一部（組織低酸素症）として身体が、十分な酸素供給に欠乏している病態を指す。例えば、細胞レベルでの酸素供給及びその需要の間のミスマッチは、低酸素症状態を生じ得る。酸素供給の完全な喪失がある低酸素症は、無酸素症と称され、従って、低酸素症と言う包括的用語に包含される。

【0075】

本発明による「固形腫瘍」と言う用語は、嚢胞又は液体領域を通常は含有しない、組織の異常な塊を定義するものである。固形腫瘍は、良性（癌でない）又は悪性（しばしば当該技術分野において癌と称される）であってもよい。様々な種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類に対して名付けられる。固形腫瘍の例は、以下本明細書に提供されている。

【0076】

本明細書において用いられる「眼疾患」と言う用語は、眼（その付属器を含む）の病態又は傷害を指す。眼疾患は、例えば、目の天然レンズの濁り又は混濁化、例えば液体又は中心網膜の漏洩及び集積から生じる黄斑膨張、網膜の下の硝子体の小さな蓄積、視神経の損傷、黄斑細胞の変性、失明、又は目の結膜及び角膜の炎症、並びに瘢痕組織の形成を伴い得る。眼疾患の例は、以下本明細書に提供されている。

【0077】

当業者に理解されるように、さらに本明細書に援用される、序論部分に提供した情報から特に明らかであるように、本発明の抗体、核酸分子、ベクター又は宿主は、本明細書において言及される特定の疾患を治療又は阻害するのに特に有用である。

【0078】

本発明の好ましい実施形態においては、低酸素症は、腫瘍低酸素症、ニューロン低酸素症、脳低酸素症、狭窄、及び虚血から選択される。

【0079】

本発明のさらに好ましい実施形態においては、固形腫瘍は、肉腫、神経膠腫、癌腫、中皮腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、子宮頸部腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝臓腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、及び頭頸部腫瘍から選択される。

【0080】

本発明の別の好ましい実施形態においては、眼疾患は、高眼圧症、緑内障、黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、ブドウ膜炎、網膜炎、Ｘ連鎖性網膜分離症、及び高血圧性網膜症から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】炭酸脱水酵素の機能[イノセンティ（Ｉｎｎｏｃｅｎｔｉ）ら、２００７から抜粋）。細胞質（ＣＡ−ＩＩ）及び膜貫通（ＣＡ−ＩＸ及びＸＩＩ）タンパク質と、ｐＨホメオスタシス及びアニオン輸送に関与する他のタンパク質、例えば（１）モノカルボン酸トランスポーター；（２）Ｎａ⁺−Ｈ⁺−アンチポーター；（３）ＡＴＰ依存性Ｎａ⁺−Ｋ⁺−アンチポーター；（４）Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼ；（５）アクアポリン；（６）膜結合ＣＡ（ＣＡ−ＩＸ、ＸＩＩ又はＸＩＶ）；（７）炭酸水素塩／塩素アニオンエクスチェンジャー（ＡＥ）との相互作用。

【図2】様々な種類のヒト癌におけるＣＡ−ＸＩＩ発現レベル。

【図3】抗体EXO 6A10及び蛍光色素標識二次抗体を用いたＡ５４９細胞の免疫蛍光染色によって、ＣＡ−ＸＩＩの膜結合局在が明らかになる。

【図4-1】Ａ：フローサイトメトリーによって明らかにされる、ヒト癌細胞株及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞表面上のＣＡ−ＸＩＩ発現（灰色＝アイソタイプ対照；黒線＝EXO 6A10）。Ｂ：イミュノブロットで示すような、卵巣癌患者の悪性腹水から単離されたエキソソーム上のＣＡ−ＸＩＩ。ＧＭ１＝ガングリオシドＭ１（エキソソームマーカー）；アイソ＝アイソタイプ対照。

【図4-2】Ａ：フローサイトメトリーによって明らかにされる、ヒト癌細胞株及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞表面上のＣＡ−ＸＩＩ発現（灰色＝アイソタイプ対照；黒線＝EXO 6A10）。Ｂ：イミュノブロットで示すような、卵巣癌患者の悪性腹水から単離されたエキソソーム上のＣＡ−ＸＩＩ。ＧＭ１＝ガングリオシドＭ１（エキソソームマーカー）；アイソ＝アイソタイプ対照。

【図5】上部：ＣＡ−ＸＩＩのEXO 6A10阻害（ＩＣ５０＝６．１４ｘ１０^-9Ｍ）及びスルホンアミド、アゼタゾールアミド（ＩＣ５０＝２．３８ｘ１０^-7Ｍ）。下部：ＣＡ ＩＩのEXO 6A10阻害。

【図6】ＣＡ−ＸＩＩの活性へのEXO 6A10の干渉に関する、ＣＡ−ＸＩＩの不連続触媒ドメインの関連するアミノ酸残基[ウィッティングトン（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ）ら、２００１より抜粋]。

【図7】三次元腫瘍スフェロイドにおける代謝活性のEXO 6A10阻害。上部：スフェロイドを、アゼタゾールアミド（ＡＡＺ、最終濃度１００μＭ）とEXO 6A10（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）の存在下で培養し、対照スフェロイドはいかなるさらなる処理も伴わずに培養した（未処理）。２日後に、ＭＴＴアッセイ及び５９５ｎｍでの吸光度の読み取りによって、スフェロイドの代謝活性を測定した[コリー（Ｃｏｒｙ）ら １９９１]。全てのデータは平均±標準誤差で示されている。ｔ検定を用いて、未処理スフェロイドと処理スフェロイドとの間で比較を行った。下部：EXO 6A10と共に、或いは未処理のまま、２日間培養し、続いて（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドで処理したＡ５４９スフェロイドを撮影した写真。

【図8】抗体EXO 6A10を産生するハイブリドーマ（＝６Ａ１０ハイブリドーマ）の免疫グロブリン軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。免疫グロブリンと抗原との相互作用を構成する相補性決定領域（ＣＤＲ）１から３を黄色で示す。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら、１９８９に記載される基準に従って、ＣＤＲを同定した。

【図9-1】抗体EXO 6A10を産生するハイブリドーマ（＝６Ａ１０ハイブリドーマ）の免疫グロブリン重鎖の可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。免疫グロブリンと抗原との相互作用を構成する相補性決定領域（ＣＤＲ）１から３を太字及び下線で示す。チョチアら、１９８９に記載される基準に従って、ＣＤＲを同定した。

【図9-2】抗体EXO 6A10を産生するハイブリドーマ（＝６Ａ１０ハイブリドーマ）の免疫グロブリン重鎖の可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。免疫グロブリンと抗原との相互作用を構成する相補性決定領域（ＣＤＲ）１から３を太字及び下線で示す。チョチアら、１９８９に記載される基準に従って、ＣＤＲを同定した。

【図10】フローサイトメトリーによって明らかになる、ヒトＣＡ−ＸＩＩをコードする発現プラスミドでトランスフェクションしたネズミＬ９２９細胞におけるEXO 6A10の結合（黒線、Ｌ９２９＋ＣＡ−ＸＩＩ）及び対照としての非トランスフェクションＬ９２９細胞に対するEXO 6A10の結合（灰色の領域、Ｌ９２９）。

【図11】ＣＡ−ＸＩＩ、アイソフォーム１の公表されている配列とＲＴ−ＰＣＲによってクローニングされたｃＤＮＡのインシリコ翻訳とのアミノ酸配列のアラインメント。両配列が同一であることは明らかである。

【図12】ＣＡ−ＸＩＩ、アイソフォーム１の公表されているヌクレオチド配列、及びＲＴ−ＰＣＲによってクローニングされたｃＤＮＡのアラインメント。両配列が同一であることは明らかである。

【図13】低酸素症による、膠芽細胞腫細胞株上のＣＡ−ＸＩＩ発現の誘導。細胞を２１％Ｏ₂（正常酸素状態）又は１％Ｏ₂（低酸素状態）条件の何れかで培養した。EXO 6A10抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＣＡＸＩＩ表面発現を測定した。黒線＝EXO 6A10、灰色のヒストグラム＝アイソタイプ対照。

【発明を実施するための形態】

【0082】

実施例により本発明を説明する。

【実施例】

【0083】

実施例１−様々な種類のヒト癌におけるＣＡ−ＸＩＩ発現レベル
ＣＡ−ＸＩＩは、様々な種類のヒト癌において高発現している。ＣＡ−ＸＩＩの過剰発現は、バーネット（Ｂｅｒｎｅｔｔ）ら（２００８）に記載されるデータ（http://ist.genesapiens.orgより入手）に相応するように乳癌において最も顕著である。

【0084】

実施例２−Ａ５４９細胞の免疫蛍光染色
Ａ５４９細胞を、ＰＢＳ中の４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳ及び０．５％（ｖ／ｖ）トリトン−Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）で洗浄し、そして、EXO 6A10抗体と共に、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ及びＰＢＳ／０．５％（ｖ／ｖ）トリトン‐Ｘ‐１００(Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００)で洗浄した後、細胞を蛍光色素標識二次抗体（マウス抗ラットＩｇＧ／Ｃｙ３）とインキュベートし、次いで、結合した抗体をライカ（Ｌｅｉｃａ）レーザー・スキャニング顕微鏡によって視覚化した。核をＤＡＰＩで対比染色した。その結果、ＣＡ−ＸＩＩの染色は、明らかに、Ａ５４９細胞の細胞膜と関連している（図３、矢印）。

【0085】

実施例３−調査したヒト癌細胞株はＣＡ−ＸＩＩを発現する。
調査した永久ヒト癌細胞株の大部分は、フローサイトメトリーによって明らかにされるように、細胞表面上にＣＡ−ＸＩＩを発現する（図４Ａを参照されたい。）。永久ヒト癌細胞株をEXO 6A10（ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（すなわちウシ胎児血清）中、１：５に希釈されたハイブリドーマ上清）と、氷上で１５分間インキュベートし、ＰＢＳ／２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ中で３回洗浄し、次いで、特異的二次抗体（ヤギ抗ラットＩｇＧ／Ｃｙ５）と氷上でさらに１５分間染色した。次いで、ベクトン・ディッキンソンＦＡＣＳカリバー・デバイス(Becton Dicknson FACS Calibur device)及びフロージョー（FlowJo）ソフトウェア[ツリースター（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）社]において、フローサイトメトリーにより、6A10の結合を測定した。特異性が無関係である（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）同一アイソタイプの抗体を対照として用いた（灰色＝アイソトープ対照；黒線＝EXO 6A10）。末梢血単核細胞（Peripheral blood mononuclear cells; PBMC）及び２つの黒色腫細胞株（不図示）に対する結合は検出できなかった。図４Ｂには、このイムノブロットで示されるように、ＣＡ−ＸＩＩが卵巣癌患者の悪性腹水から単離されたエキソソーム上にも存在することが示されている。分画遠心分離（５００×ｇ；１０，０００×ｇ；７０，０００×ｇ）によって悪性腹水からエキソソームを単離し、ＰＢＳ中に再懸濁した。標準的なブラッドフォード・アッセイにより、タンパク質濃度を測定した。２μｇのタンパク質をニトロセルロース膜上にピペッティングした。膜を様々な一次抗体とインキュベートした。洗浄後、膜を特異的二次抗体（抗ラットＩｇＧ／ペルオキシダーゼ）とインキュベートした。ガングリオシドＧＭ１が、コレラ毒素Ｂサブユニット／ペルオキシダーゼで検出された。ＥＣＬシステムで膜を現像した。

【0086】

実施例４−EXO 6A10及びアゼタゾールアミドによるＣＡ−ＸＩＩ阻害
EXO 6A10は、スルホンアミド、アゼタゾールアミド（ＩＣ５０＝２．３８×１０^-7Ｍ）と比較すると、はるかにより効率的に、ＣＡ−ＸＩＩを阻害する（ＩＣ５０＝６．１４×１０^-9Ｍ）（図５、上部を参照されたい。）。対照的に、EXO 6A10は、ＣＡ−ＩＩを有意には阻害しない（図５、下部を参照されたい。）。

【0087】

実施例５−CA-XIIに対するEXO 6A10結合
ＣＡ−ＸＩＩの触媒ドメインの三次元構造。関連するアミノ酸残基を示す（ウィッティングトン(Whittington)ら，２００１より採録）

【0088】

実施例６−三次元腫瘍スフェロイドにおける代謝活性のEXO 6A10阻害
９６ウェル細胞培養プレート上、ＰＢＳ中の１％（ｖ／ｖ）アガロースからなるクッション上に、Ａ５４９肺癌細胞をプレーティングした。これらの条件下では、標準的細胞培養において単層として増殖する大部分の細胞株は、アガロースに接着しない。その代わり、細胞は、自発的に、腫瘍スフェロイドと呼ばれる三次元構造を形成する。

【0089】

図７、上部：幾つかのスフェロイドをEXO 6A10（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）の存在下で培養し、一方、他のものはアセタゾールアミド（ＡＡＺ、最終濃度１００μＭ）と共に培養した。対照スフェロイドは、如何なるさらなる処理もせずに培養した（未処理）。スフェロイドの代謝活性を、２日後に、報告される通りＭＴＴアッセイを利用し、かつ５９５ｎｍにおける吸光度の読み取りによって測定した[コリー(Cory)ら、１９９１]。各群に関して、１０個のスフェロイドが含まれ、平均値、標準偏差を計算した。全てのデータは、平均±標準誤差として表されている。ｔ検定を用いて、未処理スフェロイド及び処理スフェロイド間で比較を行い、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）４[グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェア、ラホーヤ(La Jolla)]を用いて計算した。

【0090】

図７、下部：EXO 6A10と共に、又は未処理のまま、Ａ５４９スフェロイドを２日間培養した。次いで、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを添加し、そして写真撮影した。EXO 6A10処理スフェロイドは、未処理スフェロイドよりも、はるかにより小さく、そしてはるかにより密であることが明らかである。

【0091】

実施例７−ヒトＣＡ−ＸＩＩをコードする発現プラスミドによるネズミＬ９２９細胞のトランスフェクション
ネズミＬ９２９細胞を、ヒトＣＡ−ＸＩＩをコードする発現プラスミドでトランスフェクションした。次いで、フローサイトメトリーによって、EXO 6A10の結合を明らかにした（図１０、黒線、Ｌ９２９＋ＣＡ−ＸＩＩ）。対照として、非トランスフェクションＬ９２９細胞に対するEXO 6A10の結合を試験した（図１０、灰色の領域、Ｌ９２９）。EXO 6A10は、トランスフェクション細胞には結合するが、非トランスフェクション細胞には結合しない。その結果、膜局在過剰発現ヒトＣＡ−ＸＩＩの結合が示された。

【0092】

実施例８−酸素正常状態又は低酸素状態下での膠芽細胞腫株Ｕ３７３及びＵ２５１の培養
ＣＡ−ＸＩＩは、ヒト癌において低酸素症と関連している。膠芽細胞腫株Ｕ３７３及びＵ２５１を、正常酸素状態（およそ２１％Ｏ₂）又は低酸素状態（１％Ｏ₂）の何れかで培養した。ＣＡ−ＸＩＩは、酸素正常状態下では検出可能な程度には発現していなかった（左のヒストグラム）が、細胞が低酸素状態に維持されている場合には、当該酵素は明らかに誘導されていた（図１３）。これらの結果は、ＣＡ−ＸＩＩが、低酸素状態癌細胞に関して、重要な酵素であることを暗示する。

【0093】

参考文献：
アルテリオ（Alterio）, V., ヒルボ（Hilvo）, M., ディフィオレ（Di Fiore）, A., スプラン（Supuran）, C. T., パン（Pan）, P., パーキラ（Parkkila）, S., スキャローニ（Scaloni）, A., パストレック（Pastorek）, J., パストレコバ（Pastorekova）, S., ペドーン（Pedone）, C., スコザファバ（Scozzafava）, A., モンティ（Monti）, S. M., 及びデ・シモン（De Simone）, G. (2009). 腫瘍関連ヒト炭酸脱水酵素ＩＸの触媒ドメインの結晶構造（Crystal structure of the catalytic domain of the tumor-associated human carbonic anhydrase IX.）、米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci U S A） 106, 16233-16238.

【0094】

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【0095】

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【0096】

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【0098】

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【0099】

キベラ（Kivela）, A., パーキラ（Parkkila）, S., サーニオ（Saarnio）, J., カーツネン（Karttunen）, T. J., キベラ（Kivela）, J., パーキラ（Parkkila）, A. K., ワヒード（Waheed）, A., スライ（Sly）, W. S., グラブ（Grubb）, J. H., シャー（Shah）, G., ツレシ（Tureci）, O., 及びラジャニエミ（Rajaniemi）, H. (2000). 正常ヒト腸及び結腸直腸腫瘍における新規膜貫通炭酸脱水酵素アイソザイムＸＩＩの発現（Expression of a novel transmembrane carbonic anhydrase isozyme XII in normal human gut and colorectal tumors.）、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Am J Pathol）156, 577-584.

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【0101】

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【0102】

ブロ（Vullo）, D., イノセンティ（Innocenti）, A., ニシモリ（Nishimori）, I., パストレック（Pastorek）, J., スコザファバ（Scozzafava）, A., パストレコバ（Pastorekova）, S., 及びスプラン（Supuran）, C. T. (2005). 炭酸脱水酵素阻害剤。スルホンアミドでの膜貫通アイソザイムＸＩＩの阻害−抗腫瘍及び抗緑内障薬剤の設計のための新規ターゲット？（Carbonic anhydrase inhibitors. Inhibition of the transmembrane isozyme XII with sulfonamides-a new target for the design of antitumor and antiglaucoma drugs?）、バイオオーガニック・メディスナル・ケミストリー・レター（Bioorg Med Chem Lett）15, 963-969.

【0103】

ウィッティングトン（Whittington）, D. A., ワヒード（Waheed）, A., ウルマソブ（Ulmasov）, B., シャー（Shah）, G. N., グラブ（Grubb）, J. H., スライ（Sly）, W. S., 及びクリスチャンソン（Christianson）, D. W. (2001). 特定の癌腫瘍細胞において過剰発現されるバイトピック膜タンパク質である、ヒト炭酸脱水酵素ＸＩＩの二量体細胞外ドメインの結晶構造（Crystal structure of the dimeric extracellular domain of human carbonic anhydrase XII, a bitopic membrane protein overexpressed in certain cancer tumor cells.）米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci U S A）98, 9545-9550.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]