特許 5972283 新規のＷｎｔ組成物およびそのような組成物の治療的使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5972283

(24)【登録日】2016年7月22日

(45)【発行日】2016年8月17日

(54)【発明の名称】新規のＷｎｔ組成物およびそのような組成物の治療的使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160804BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20160804BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160804BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160804BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20160804BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20160804BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20160804BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/47

   C07K19/00

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K37/02

   A61K48/00

   A61P43/00 105

   A61P21/00

   A61P21/02

   A61P21/04

【請求項の数】14

【全頁数】56

(21)【出願番号】特願2013-548636(P2013-548636)

(86)(22)【出願日】2012年1月11日

(65)【公表番号】特表2014-507938(P2014-507938A)

(43)【公表日】2014年4月3日

(86)【国際出願番号】US2012020984

(87)【国際公開番号】WO2012097093

(87)【国際公開日】20120719

【審査請求日】2014年12月3日

(31)【優先権主張番号】61/431,701

(32)【優先日】2011年1月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】312000284

【氏名又は名称】フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】リー， トム トン

(72)【発明者】

【氏名】ベネット， モニカ ヘイハースト

(72)【発明者】

【氏名】フィッチ， マイケル ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】フリン， ピーター

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 Genes Cells, 2007, 12, [4], p.521-534

【文献】 石川統、外6名編, 「生物学辞典」, 第1版, 株式会社東京化学同人, (2010), p.1021

【文献】 Dev. Cell, (2006), 11, [6], p.791-801

【文献】 Cell Stem Cell, (2009), 4, [6], p.535-547

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドであって、配列番号２および６〜１１のいずれか１つの７３位および２０６位に対応する一方または両方のアミノ酸位置において、該Ｗｎｔ７ａポリペプチドの脂質付加を低下させる１個もしくはそれより多いアミノ酸改変を含む、改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。

【請求項2】

Ｗｎｔ７ａポリペプチドであって、配列番号２および６〜１１のいずれか１つの７３位および２０６位に対応する一方または両方のアミノ酸位置において、該Ｗｎｔ７ａポリペプチドの脂質付加を低下させるアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、Ｗｎｔ７ａポリペプチド。

【請求項3】

配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つに対応する成熟Ｗｎｔ７ａポリペプチドの脂質付加に対して、低下した脂質付加を有する、改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドであって、配列番号２および６〜１１のいずれか１つの７３位もしくは２０６位に対応するアミノ酸位置において、アミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。

【請求項4】

ａ）配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位もしくは２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含むか；
ｂ）配列番号２および６〜１１のうちのいずれかの７３位および２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含むか；または
ｃ）配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含む、請求項３に記載の改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。

【請求項5】

配列番号３〜５、および１２〜１３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、Ｗｎｔ７ａポリペプチド。

【請求項6】

請求項５に記載のＷｎｔ７ａポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。

【請求項7】

ａ）天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを含むか；
ｂ）ＣＤ３３シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチド、成長ホルモンシグナルペプチド、エリスロポエチンシグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチドからなる群より選択される異種シグナルペプチドを含むか；
ｃ）ＣＤ３３シグナルペプチド、ＩｇＧκシグナルペプチド、もしくはＩｇＧμシグナルペプチドである異種シグナルペプチドを含むか；
ｄ）異種プロテアーゼ切断部位を含むか；
ｅ）タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位からなる群より選択される異種プロテアーゼ切断部位を含むか；または
ｆ）ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープからなる群より選択されるエピトープタグを含む、請求項６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項11】

請求項１０に記載の宿主細胞によって生成される、ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、請求項９に記載のベクター内に含まれる請求項８に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。

【請求項12】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド；請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、組成物。

【請求項13】

ａ）薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含むか；
ｂ）水性溶液において可溶性であるか；
ｃ）注射のために処方されているか；
ｄ）界面活性剤なしで処方されているか；または
ｅ）静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために処方されている、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

成体幹細胞集団を請求項１２または１３に記載の組成物と接触させることによって該成体幹細胞集団を増殖させるのに使用するための、請求項１２または１３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表についての陳述）
本出願に関連付けられている配列表は、紙の写しの代わりに、テキストフォーマットで提供され、それによって、本明細書に参考として援用される。上記配列表を含むテキストファイルの名称は、ＦＡＴＥ＿０９５＿００ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ．である。上記テキストファイルは、１２４ＫＢであり、２０１１年１月１１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。

【0002】

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１２年１月１１日に出願された米国仮出願第６１／４３１，７０１号の米国特許法１１９条（ｅ）項の下での利益を主張し、上記米国仮出願は、その全容が参考として本明細書に援用される。

【背景技術】

【0003】

（背景）
（技術分野）
本発明は、一般に、新規なＷｎｔ組成物およびこれを使用する治療法に関する。本発明のＷｎｔポリペプチドおよびその組成物は、例えば、幹細胞増殖および筋肥大を促進することによって、筋肉再生を促進するために、治療的に使用され得る。

【0004】

（関連技術の説明）
遺伝子のＷｎｔファミリーは、標的細胞上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）レセプターに結合することによって作用する、２０個を超えるシステインリッチな、分泌型Ｗｎｔ糖タンパク質をコードする。Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターは、Ｇプロテイン共役レセプタータンパク質のファミリーである。上記Ｆｚｄファミリーの特定のメンバーへの上記Ｗｎｔファミリーの様々なメンバーの結合は、いくつかの異なる経路のうちの１つによるシグナル伝達を開始し得る。「標準経路」において、シグナル伝達分子であるＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄの活性化は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３β）、細胞質セリン−スレオニンキナーゼの不活性化をもたらす。上記ＧＳＫ−３β標的であるβ−カテニンは、それによって安定化し、特異的プロモーターのＴＣＦ（Ｔ細胞因子）依存性転写を活性化する場所である核へ位置を変える（Ｗｏｄａｒｚ， １９９８， Ｄｉｅｒｉｃｋ， １９９９）。「非標準」Ｗｎｔ経路活性化は、Ｃａ^２＋経路シグナル伝達および潜在的には、ＰＩ３Ｋシグナル伝達、Ｒｈｏ経路シグナル伝達、および平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路シグナル伝達を活性化し得るＷｎｔとＦｚｄとの間の相互作用のサブセットを含む。

【0005】

Ｗｎｔは、いくつかの原始的な細胞タイプにおいて活性なパラクリンもしくはオートクリンシグナルとして機能する分泌型糖タンパク質である。Ｗｎｔタンパク質は、細胞から分泌されるが、それらは、疎水性であることが見いだされ、保存されたシステイン残基および保存されたセリン残基における脂質部分の付加によって翻訳後修飾されている。これら脂質修飾は、Ｗｎｔタンパク質の生物学的活性および分泌に重要であると広く受け入れられている。しかし、脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）および脂質付加Ｗｎｔの低溶解度は、処方の間に界面活性剤が使用されない場合に低い生産量と関連し、従って、Ｗｎｔの臨床スケール生成にとって特有の難題を示す。従って、Ｗｎｔは、種々の臨床状況において治療剤としての使用に関して素晴らしい潜在能色を有するが、上記Ｗｎｔの治療潜在性は、Ｗｎｔの不溶性、および精製され、生物学的に活性な治療剤としての対応する不十分な生成に起因して、依然として完全に実現されてはいない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

よって、Ｗｎｔ生物学的活性を保持する、可溶性の新規Ｗｎｔポリペプチド、臨床スケールで上記新規なＷｎｔを生成するための方法、ならびに組織形成、再生、維持および修復を促進するために上記新規なＷｎｔを使用する方法が当該分野で必要である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

（要旨）
本発明は、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を低下させる、１個もしくはそれより多いアミノ酸を含む改変Ｗｎｔポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を低下させる、１個もしくはそれより多いアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む。

【0008】

一実施形態において、上記ポリペプチドは、非標準Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化するＷｎｔポリペプチドである。

【0009】

特定の実施形態において、非標準Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化するＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１からなる群より選択される。

【0010】

本発明のいくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、Ｗｎｔ７ａポリペプチドもしくはＷｎｔ５ａポリペプチドである。

【0011】

特定の実施形態において、本発明は、配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つに対応するＷｎｔ７ａポリペプチドの脂質付加に対して、低下した脂質付加を有する改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの２０６位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含むＷｎｔ７ａポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位および２０６位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含むＷｎｔ７ａポリペプチドを提供する。

【0012】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位もしくは２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含むＷｎｔ７ａポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位および２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含むＷｎｔ７ａポリペプチドを提供する。本発明はまた、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドがヒトもしくはマウスのＷｎｔ７ａポリペプチドである本明細書中の実施形態のうちのいずれかを含む組成物を提供する。

【0013】

特定の実施形態において、本発明は、配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つに対応するＷｎｔ５ａポリペプチドの脂質付加に対して、低下した脂質付加を有する改変Ｗｎｔ５ａポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの１０４位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む改変Ｗｎｔ５ａポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの２４４位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含むＷｎｔ５ａポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの１０４位および２４４位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含むＷｎｔ５ａポリペプチドを提供する。

【0014】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１５および１９〜１１のうちのいずれか１つの１０４位もしくは２４４位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含むＷｎｔ５ａポリペプチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの１０４位および２４４位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含むＷｎｔ５ａポリペプチドを提供する。本発明はまた、上記Ｗｎｔ５ａポリペプチドがヒトもしくはマウスのＷｎｔ５ａポリペプチドである本明細書中の実施形態のうちのいずれかを含む組成物を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３〜５、１２〜１３、および１６〜１８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＷｎｔポリペプチドを提供する。

【0016】

種々の実施形態において、本発明は、配列番号３〜５、１２〜１３、および１６〜１８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むＷｎｔポリペプチドを含む融合ポリペプチドを一部企図する。

【0017】

一実施形態において、上記融合ポリペプチドは、天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを含む。

【0018】

特定の実施形態において、上記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチド、成長ホルモンシグナルペプチド、エリスロポエチンシグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチドからなる群より選択される。

【0019】

特定の実施形態において、上記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、ＩｇＧκシグナルペプチド、もしくはＩｇＧμシグナルペプチドである。

【0020】

さらなる実施形態において、上記融合ポリペプチドは、異種プロテアーゼ切断部位を含む。

【0021】

一実施形態において、上記異種プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位からなる群より選択される。

【0022】

さらなる実施形態において、上記融合ポリペプチドは、ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープからなる群より選択されるエピトープタグを含む。

【0023】

特定の実施形態において、上記融合ポリペプチドは、配列番号３〜５および１２〜１３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、配列番号２および６〜１１に示される対応する天然Ｗｎｔポリペプチドと比較して、増大した生産、分泌もしくは溶解度を有する。

【0024】

特定の実施形態において、上記融合ポリペプチドは、配列番号１６〜１８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、配列番号１５および１９〜２３に示される対応する天然Ｗｎｔポリペプチドと比較して、増大した生産、分泌もしくは溶解度を有する。

【0025】

本発明はまた、Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を低下させる、１個もしくはそれより多いアミノ酸を有する上記Ｗｎｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のいくつかの実施形態は、Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を低下させる、１個もしくはそれより多いアミノ酸を有する上記Ｗｎｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明はまた、このようなベクターを含む宿主細胞、および上記宿主細胞によって生成されるＷｎｔポリペプチドを提供する。

【0026】

本発明はまた、本発明のＷｎｔポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、上記組成物は、薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含み、いくつかの実施形態において、上記組成物は、水性溶液において可溶性である。本発明の特定の実施形態において、上記組成物は、注射用に処方される。特定の実施形態において、上記組成物は、界面活性剤なしで処方される。関連の実施形態において、界面活性剤は、上記組成物の処方において実質的に存在しない。別の関連の実施形態において、上記処方された組成物は、実質的に界面活性剤を含まない。より具体的な実施形態において、上記組成物は、静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために処方される。

【0027】

本発明のいくつかの実施形態において、上記組成物は、組織形成、再生、維持もしくは修復を促進する。特定の実施形態において、上記組織は筋肉であり、より具体的な実施形態において、上記筋肉は、骨格筋、心筋、もしくは平滑筋である。

【0028】

他の実施形態において、本発明の組成物は、幹細胞増殖を促進する。いくつかの実施形態において、上記幹細胞は、成体幹細胞であり、特定の実施形態において、上記成体幹細胞は、サテライト幹細胞である。

【0029】

いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、筋肥大を促進するか、または萎縮症を予防する。

【0030】

本発明はさらに、筋肉喪失を処置もしくは予防するための方法を提供し、上記方法は、被験体に、Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を低下させる１個もしくはそれより多いアミノ酸を含む上記Ｗｎｔポリペプチドを有する組成物を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記組成物は、薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含み、特定の実施形態において、上記組成物は、水性溶液において可溶性である。他の特定の実施形態において、上記組成物は、注射用に処方され、さらにより特定の実施形態においては、上記組成物は、静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために処方される。

【0031】

特定の実施形態において、上記組成物は、界面活性剤なしで処方される。関連の実施形態において、界面活性剤は、上記組成物の処方において実質的に存在しない。別の関連の実施形態において、上記処方された組成物は、界面活性剤を実質的に含まない。

【0032】

本発明の方法のいくつかの実施形態において、上記被験体は、筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態を有するか、またはそのリスクがある。特定の実施形態において、上記疾患は、変性疾患であり、より特定の実施形態においては、上記変性疾患は、筋ジストロフィーである。さらにより特定の実施形態においては、上記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病）および先天性筋ジストロフィーから選択される。

【0033】

上記方法の他の実施形態において、上記筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態は、消耗性疾患、筋減衰、筋萎縮症、ＩＣＵ誘導性虚弱、長期不使用、手術誘導性虚弱、もしくは筋変性疾患である。より特定の実施形態において、上記状態は、筋不使用、固定、手術誘導性虚弱、もしくは傷害と関連した筋萎縮症である。

【0034】

いくつかの実施形態において、上記組成物を投与する工程は、筋萎縮症を促進する。特定の実施形態において、上記筋肉は、骨格筋もしくは心筋である。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
改変Ｗｎｔポリペプチドであって、Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を低下させる１個もしくはそれより多いアミノ酸を含む、改変Ｗｎｔポリペプチド。
（項目２）
Ｗｎｔポリペプチドであって、Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を低下させる１個もしくはそれより多いアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、Ｗｎｔポリペプチド。
（項目３）
非標準のＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する、項目１または項目２に記載のＷｎｔポリペプチド。
（項目４）
Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１からなる群より選択される、項目３に記載のＷｎｔポリペプチド。
（項目５）
Ｗｎｔ７ａポリペプチドもしくはＷｎｔ５ａポリペプチドである、項目３に記載のＷｎｔポリペプチド。
（項目６）
配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つに対応するＷｎｔ７ａポリペプチドの脂質付加に対して、低下した脂質付加を有する、改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。
（項目７）
配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、項目６に記載の改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。
（項目８）
配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの２０６位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、項目６に記載の改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。
（項目９）
配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位および２０６位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、項目６に記載の改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。
（項目１０）
配列番号２および６〜１１のうちのいずれか１つの７３位もしくは２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含む、項目６に記載の改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。
（項目１１）
配列番号２および６〜１１のうちのいずれかの７３位および２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含む、項目６に記載の改変Ｗｎｔ７ａポリペプチド。
（項目１２）
配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つに対応するＷｎｔ７ａポリペプチドの脂質付加に対して、低下した脂質付加を有する、改変Ｗｎｔ５ａポリペプチド。
（項目１３）
配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの１０４位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、項目１２に記載の改変Ｗｎｔ５ａポリペプチド。
（項目１４）
配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの２４４位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、項目１２に記載の改変Ｗｎｔ５ａポリペプチド。
（項目１５）
配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの１０４位および２４４位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換を含む、項目１２に記載の改変Ｗｎｔ５ａポリペプチド。
（項目１６）
配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれか１つの１０４位もしくは２４４位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含む、項目１２に記載の改変Ｗｎｔ５ａポリペプチド。
（項目１７）
配列番号１５および１９〜２３のうちのいずれかの１０４位および２４４位に対応するアミノ酸位置においてアラニンを含む、項目１２に記載の改変Ｗｎｔ５ａポリペプチド。
（項目１８）
配列番号３〜５、１２〜１３、および１６〜１８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、Ｗｎｔポリペプチド。
（項目１９）
項目１８に記載のＷｎｔポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
（項目２０）
天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを含む、項目１９に記載の融合ポリペプチド。
（項目２１）
前記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチド、成長ホルモンシグナルペプチド、エリスロポエチンシグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチドからなる群より選択される、項目２０に記載の融合ポリペプチド。
（項目２２）
前記異種シグナルペプチドは、ＣＤ３３シグナルペプチド、ＩｇＧκシグナルペプチド、もしくはＩｇＧμシグナルペプチドである、項目２０に記載の融合ポリペプチド。
（項目２３）
異種プロテアーゼ切断部位を含む、項目１９〜２２のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
（項目２４）
前記異種プロテアーゼ切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位からなる群より選択される、項目２３に記載の融合ポリペプチド。
（項目２５）
ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープからなる群より選択されるエピトープタグを含む、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
（項目２６）
項目１９〜２４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチドは、配列番号３〜５および１２〜１３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、配列番号２および６〜１１に示される対応する天然Ｗｎｔポリペプチドと比較して、増大した生産、分泌もしくは溶解度を有する、融合ポリペプチド。
（項目２７）
項目１９〜２４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチドは、配列番号１６〜１８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、配列番号１５および１９〜２３に示される対応する天然Ｗｎｔポリペプチドと比較して、増大した生産、分泌、もしくは溶解度を有する、融合ポリペプチド。
（項目２８）
項目１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
（項目２９）
項目２８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目３０）
項目２９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目３１）
項目３０に記載の宿主細胞によって生成される、ポリペプチド。
（項目３２）
項目１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド；項目１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または項目１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、組成物。
（項目３３）
薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含む、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
水性溶液において可溶性である、項目３２に記載の組成物。
（項目３５）
注射のために処方されている、項目３２に記載の組成物。
（項目３６）
界面活性剤なしで処方されている、項目３２に記載の組成物。
（項目３７）
静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために処方されている、項目３２に記載の組成物。
（項目３８）
組織形成、再生、維持もしくは修復を促進する、項目３２に記載の組成物。
（項目３９）
前記組織は筋肉である、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記筋肉は、骨格筋、心筋、もしくは平滑筋である、項目３８に記載の組成物。
（項目４１）
幹細胞増殖を促進する、項目３２に記載の組成物。
（項目４２）
前記幹細胞は、成体幹細胞である、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記成体幹細胞は、サテライト幹細胞である、項目４２に記載の組成物。
（項目４４）
筋肥大を促進するか、または萎縮症を予防する、項目３２に記載の組成物。
（項目４５）
筋肉喪失を処置もしくは予防するための方法であって、該方法は、項目３２に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４６）
前記組成物は、薬学的に受容可能な塩、キャリア、もしくは賦形剤を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記組成物は、水性溶液において可溶性である、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記組成物は、界面活性剤中に処方されていない、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物は、注射のために処方されている、項目４５に記載の方法。
（項目５０）
前記組成物は、静脈内注射、心臓内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉への直接注射のうちの１つ以上のために処方されている、項目４５に記載の方法。
（項目５１）
前記被験体は、筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態を有するか、または有するリスクがある、項目４５に記載の方法。
（項目５２）
前記疾患は、変性疾患である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記変性疾患は、筋ジストロフィーである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー、ランドジー−デジェリーヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー、フォングレーフェ−フックス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病）および先天性筋ジストロフィーから選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態は、消耗性疾患、筋減衰、筋萎縮、ＩＣＵ誘導性虚弱、長期不使用、手術誘導性虚弱、もしくは筋変性疾患である、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記状態は、筋不使用、固定、手術誘導性虚弱、もしくは傷害と関連した筋萎縮である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記組成物を投与する工程は、筋肥大を促進する、項目４５に記載の方法。
（項目５８）
前記筋は、骨格筋もしくは心筋である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記組成物を投与する工程は、サテライト細胞増殖を促進する、項目４５に記載の方法。

【0035】

本発明の方法の他の実施形態において、上記組成物を投与する工程は、サテライト細胞増殖を促進する。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1-1】図１は、１９種全てのヒトＷｎｔポリペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。保存された潜在的翻訳後修飾の脂質付加部位は、グレーで陰影を付け、ヒトＷｎｔ７ａのシステイン７３およびセリン２０６と整列させている。グリコシル化部位であると考えられるアスパラギン残基には、下線が付される。

【図1-2】図１は、１９種全てのヒトＷｎｔポリペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。保存された潜在的翻訳後修飾の脂質付加部位は、グレーで陰影を付け、ヒトＷｎｔ７ａのシステイン７３およびセリン２０６と整列させている。グリコシル化部位であると考えられるアスパラギン残基には、下線が付される。

【図1-3】図１は、１９種全てのヒトＷｎｔポリペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。保存された潜在的翻訳後修飾の脂質付加部位は、グレーで陰影を付け、ヒトＷｎｔ７ａのシステイン７３およびセリン２０６と整列させている。グリコシル化部位であると考えられるアスパラギン残基には、下線が付される。

【図1-4】図１は、１９種全てのヒトＷｎｔポリペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。保存された潜在的翻訳後修飾の脂質付加部位は、グレーで陰影を付け、ヒトＷｎｔ７ａのシステイン７３およびセリン２０６と整列させている。グリコシル化部位であると考えられるアスパラギン残基には、下線が付される。

【図2】図２は、種々の種に由来する保存されたＷｎｔ７ａポリペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。

【図3】図３は、非標準Ｗｎｔでの刺激の際の筋芽細胞肥大を示す。図３ａは、非標準Ｗｎｔ処置（Ｗｎｔ７ａ）によって刺激されるインビトロ筋芽細胞肥大の代表的画像を示す。図３ｂは、特定のＷｎｔ処置によって誘導されるインビトロ筋芽細胞線維肥大のデータを示す。１００線維を、各処置群につき３つの生物学的複製物の各々について計数し、ミクロン単位での個々の計数および複製物のメジアンを示す。

【図4】図４は、種々の構築されたＷｎｔ７ａ改変体の模式図を示す。野生型ヒトＷｎｔ７ａ配列は、白で示され、アミノ酸変化をもたらす特定の点変異を有する改変体は、示されるとおりのアミノ酸変化とともに白で示される。天然に存在するＷｎｔ７ａ分泌シグナルペプチドの、ヒトＩｇＧκ鎖のものでの置換を、グレーの陰影で示す。免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端融合物もしくはカルボキシ末端融合物を、示されるように、リンカー領域とともに構築した。

【図5】図５は、哺乳動物組織培養においてＨＥＫ２９３細胞から発現されかつ分泌されたＷｎｔ７ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットを示す。ＣＤ３３もしくはＩｇＧκ鎖に由来する外因性分泌シグナルペプチドを有するＷｎｔポリペプチドの増大した発現およびその後の分泌は、天然シグナルペプチドのものを超えることが明らかに認められ得る。

【図6-1】図６は、溶液中に界面活性剤ＣＨＡＰＳを検出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。図６ａは、上記システムを較正するためにリン酸緩衝化食塩水中のｃｈａｐｓの標準曲線を示す。図６ｂは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓの市販のタンパク質（上記市販のタンパク質は、第２のより大きなピークを生じるキャリアタンパク質を含む）と比較して、１％ ＣＨＡＰＳ中に処方された改変Ｗｎｔポリペプチドの調製物を示す。図６ｃは、示されるように、４時間および２０時間にわたる透析を使用する、上記Ｗｎｔポリペプチドの処方物からのＣＨＡＰＳの効率的除去を示す。

【図6-2】図６は、溶液中に界面活性剤ＣＨＡＰＳを検出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。図６ａは、上記システムを較正するためにリン酸緩衝化食塩水中のｃｈａｐｓの標準曲線を示す。図６ｂは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓの市販のタンパク質（上記市販のタンパク質は、第２のより大きなピークを生じるキャリアタンパク質を含む）と比較して、１％ ＣＨＡＰＳ中に処方された改変Ｗｎｔポリペプチドの調製物を示す。図６ｃは、示されるように、４時間および２０時間にわたる透析を使用する、上記Ｗｎｔポリペプチドの処方物からのＣＨＡＰＳの効率的除去を示す。

【図7】図７は、界面活性剤の存在下もしくは非存在下で処方したＷｎｔ７ａ改変体の活性を示す、筋芽細胞肥大アッセイを示す。Ｗｎｔタンパク質を、上記ＩｇＧκ分泌シグナルペプチドとともに構築した。タンパク質を、ＨＥＫ２９３哺乳動物培養系において生成し、アフィニティー精製した。上記タンパク質を、１％ Ｃｈａｐｓ界面活性剤を含むＰＢＳ中に処方した。各タンパク質改変体のアリコートを、透析を使用する界面活性剤除去によって再処方した。タンパク質を、等モル濃度を有すると認め、Ｃ２Ｃ１２肥大アッセイに適用した。

【図8】図８は、本明細書中の他の箇所で考察されるとおりの改変ヒトＷｎｔ７ａポリペプチド、野生型ヒトＷｎｔ７ａ、もしくはＬａｃＺコントロールをコードする発現プラスミドでエレクトロポレーションしたマウス前脛骨（ＴＡ）筋の平均線維直径を決定する実験の結果を示す。

【図9】図９は、本明細書中の他の箇所で考察されるように、改変ヒトＷｎｔ７ａポリペプチドをコードする発現プラスミド、もしくは食塩水コントロールでエレクトロポレーションしたマウス前脛骨（ＴＡ）筋の重量を決定する実験の結果を示す。

【図10】図１０は、本明細書中の他の箇所で考察されるとおりの改変ヒトＷｎｔ７ａポリペプチド、野生型ヒトＷｎｔ７ａ、もしくはＬａｃＺコントロールをコードする発現プラスミドでエレクトロポレーションしたマウス前脛骨（ＴＡ）筋におけるＰａｘ７＋サテライト幹細胞の数を決定する実験の結果を示す。

【図11A】図１１は、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質を示す。図１１ａは、その天然の分泌シグナルペプチドを、免疫グロブリンκに由来するシグナルペプチドで置換し、免疫グロブリンＦｃドメイン融合タンパク質として構築したＷｎｔ７ａタンパク質のウェスタンブロットを示す。哺乳動物培養系からの分泌は、Ｆｃドメイン単独コントロールとの比較において、図１１ａに示される。図１１ｂは、抗Ｗｎｔ７ａ検出抗体を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ ウェスタンブロットによって、Ｗｎｔ７ａとＷｎｔ７ａ−Ｆｃ融合タンパク質との間の相対的分子量差異を示す。

【図11B】図１１は、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質を示す。図１１ａは、その天然の分泌シグナルペプチドを、免疫グロブリンκに由来するシグナルペプチドで置換し、免疫グロブリンＦｃドメイン融合タンパク質として構築したＷｎｔ７ａタンパク質のウェスタンブロットを示す。哺乳動物培養系からの分泌は、Ｆｃドメイン単独コントロールとの比較において、図１１ａに示される。図１１ｂは、抗Ｗｎｔ７ａ検出抗体を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ ウェスタンブロットによって、Ｗｎｔ７ａとＷｎｔ７ａ−Ｆｃ融合タンパク質との間の相対的分子量差異を示す。

【発明を実施するための形態】

【0037】

（配列識別子の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトＷｎｔ７ａのｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、配列番号１によってコードされるヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、アミノ酸７３位においてアラニン変異を有する、配列番号２のヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、アミノ酸２０６位においてアラニン変異を有する、配列番号２のヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、アミノ酸７３位および２０６位においてアラニン変異を有する、配列番号２のヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、マウスＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ラットＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ニワトリＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ゼブラフィッシュＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ブタＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ウシＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、天然の分泌シグナルペプチドをヒト免疫グロブリンκ鎖のシグナルペプチドで置換した、ヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、天然の分泌シグナルペプチドをヒト免疫グロブリンκ鎖のシグナルペプチドで置換した、アミノ酸７３位および２０６位においてアラニン変異を有するヒトＷｎｔ７ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ヒトＷｎｔ５ａのｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５は、配列番号１４によってコードされるヒトＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、アミノ酸１０４位においてアラニン変異を有する、配列番号１５のヒトＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、アミノ酸２４４位においてアラニン変異を有する、配列番号１５のヒトＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、アミノ酸１０４位および２４４位においてアラニン変異を有する、配列番号１５のヒトＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、マウスＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ラットＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ニワトリＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ゼブラフィッシュＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ウシＷｎｔ５ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ヒトＷｎｔ１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ヒトＷｎｔ２ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ヒトＷｎｔ２ｂポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ヒトＷｎｔ３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ヒトＷｎｔ４ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ヒトＷｎｔ５ｂポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ヒトＷｎｔ６ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ヒトＷｎｔ７ｂポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ヒトＷｎｔ８ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ヒトＷｎｔ８ｂポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ヒトＷｎｔ９ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、ヒトＷｎｔ９ｂポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、ヒトＷｎｔ１０ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、ヒトＷｎｔ１０ｂポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、ヒトＷｎｔ１１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、ヒトＷｎｔ１６ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１〜４６は、オリゴヌクレオチド配列を示す。

【0038】

（詳細な説明）
（概説）
Ｗｎｔの翻訳後脂質付加は、生物学的活性およびタンパク質分泌に必要とされると考えられているが、本発明は、翻訳後脂質付加が起こらないように変化させられた、脂質付加のアミノ酸部位を有する新規なＷｎｔポリペプチドを提供する。本発明のタンパク質は、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するので、本発明は、増強された溶解度、生成、および処方のような改善された生物製剤様特性を有する改変Ｗｎｔ組成物、ならびにこのようなＷｎｔ組成物の治療的使用を提供する。本発明は、Ｗｎｔポリペプチドの不溶性によって提起された問題に対する新規な解決策を提供し、さらに、臨床スケール生成および治療的使用に適した本発明のＷｎｔポリペプチド（融合ポリペプチドが挙げられる）を提供する。本発明のＷｎｔ組成物の治療的使用としては、例えば、組織形成、再生、修復もしくは維持の促進が挙げられる。

【0039】

本発明の実施は、具体的にそうでないと示されなければ、当該分野の技術範囲内の化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来法を使用する。これらのうちの多くは、例示目的で以下に記載される。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９）； Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８２）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）； Ｓｈｏｒｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ｇｌｏｖｅｒ， ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌ． Ｉ ＆
ＩＩ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５）； Ａｎａｎｄ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２）； Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｅｄｓ．， １９８４）； Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９９８）。

【0040】

本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。

【0041】

（定義）
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものに類似もしくは等価な任意の方法および材料が本発明の実施もしくは試験において使用され得るものの、方法および材料の好ましい実施形態が、本明細書に記載される。本発明の目的に関して、以下の用語が、以下に定義される。

【0042】

冠詞「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、上記冠詞の文法的対象物の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）に言及するために本明細書で使用される。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つ以上の要素を意味する。

【0043】

本明細書で使用される場合、用語「約」もしくは「およそ」は、参照となる分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さに対して３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％程度変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さに言及する。特定の実施形態において、用語「約」もしくは「およそ」は、数値の前につく場合、上記値±１５％、１０％、５％、もしくは１％の範囲を示す。

【0044】

本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、参照となる値の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である分量、レベル、濃度、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さに言及する。例えば、ある物質（例えば、界面活性剤）を実質的に含まない組成物は、上記特定された物質を９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％含まないか、または上記物質は、従来の手段によって測定される場合に検出不能である。類似の意味は、用語「〜の非存在」に適用され得、これは、組成物の特定の物質もしくは成分の非存在に言及する。

【0045】

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」とは、（１）長期の自己再生、もしくは元の細胞の少なくとも１つの同一のコピーを生成する能力、（２）単一の細胞レベルでの、複数の、およびいくつかの場合には、ただ１つの専門化した細胞（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ）タイプへの分化、および（３）組織のインビボ機能再生、の能力がある未分化の細胞である細胞に言及する。幹細胞は、全能性、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）および少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）／単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）として、それらの発生能に従って下位分類される。

【0046】

本明細書で使用される場合、用語「成体幹細胞」とは、発達した生物において見いだされる幹細胞に言及する。成体幹細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：外胚葉幹細胞、内胚葉幹細胞、中胚葉幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、筋幹細胞など。筋幹細胞は、伝統的には、単能性であると考えられ、筋細胞のみを生じる幹細胞の例である。

【0047】

本明細書で使用される場合、用語「サテライト幹細胞」とは、筋性系統の細胞（例えば、筋芽細胞および筋細胞）を生じる成体幹細胞のタイプに言及する。

【0048】

本明細書で使用される場合、用語「前駆細胞」とは、自己再生し、より成熟した細胞へと分化する能力を有するが、ある系統へとコミットした細胞に言及する（例えば、造血前駆細胞は、血液系統へとコミットしている）のに対して、幹細胞は、必ずしもそのように限定されているわけではない。筋芽細胞は、前駆細胞の一例であり、これは、ただ１つの細胞タイプへと分化する能力があるが、それ自体は、完全に成熟してもいないし、完全に分化してもいない。筋芽細胞は、筋細胞へと分化し得る。

【0049】

本明細書で使用される場合、用語「筋細胞」もしくは「筋線維」とは、筋肉において見いだされる分化した細胞のタイプに言及する。各筋細胞は、筋原線維を含み、これは、筋細胞の収縮単位である長いサルコメアの鎖である。筋細胞には、種々の特定された形態がある：当該分野で公知の種々の特性を有する、心筋細胞、骨格筋細胞および平滑筋細胞。

【0050】

本明細書で使用される場合、用語「自己再生」とは、変化していない娘細胞を生成し、専門化した細胞のタイプを生成する特有の能力（潜在能（ｐｏｔｅｎｃｙ））を有する細胞に言及する。自己再生は、２つの方法において達成され得る。非対称性細胞分裂は、親細胞に対して同一である１つの娘細胞、および親細胞とは異なり、前駆細胞もしくは分化した細胞である１つの娘細胞を生成する。非対称性細胞分裂は、従って、上記親細胞に対して同一の娘細胞の数を増大させないが、上記親細胞タイプの細胞数を維持する。対称性細胞分裂は、対照的に、上記親細胞に対して各々同一である２つの娘細胞を生成する。対称性細胞分裂は、従って、上記親細胞に対して同一の細胞の数を増大させ、親細胞の集団を増殖させる。特定の実施形態において、対称性細胞分裂は、「細胞増殖」と交換可能に使用される。

【0051】

本明細書で使用される場合、用語「分化」とは、細胞が、特定の機能のために専門化される発生プロセスに言及し、例えば、ここで細胞は、１つ以上の、最初の細胞タイプのものとは異なる形態的特徴および／もしくは機能を獲得する。用語「分化」は、系統コミットメント（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）および最終分化プロセスの両方を含む。未分化もしくは分化の状態は、例えば、免疫組織化学もしくは当業者に公知の他の手順を使用して、生体マーカーの存在もしくは非存在を評価もしくはモニターすることによって、評価され得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、用語「系統コミットメント」とは、幹細胞が分化した細胞タイプの特定の限定された範囲を形成するようにコミットするプロセスに言及する。系統コミットメントは、例えば、幹細胞が非対称性細胞分裂の間に前駆細胞を生じる場合に、生じる。コミットした前駆細胞は、しばしば、自己再生もしくは細胞分裂の能力がある。

【0053】

本明細書で使用される場合、用語「最終分化」とは、細胞が、成熟した完全に分化した細胞へと最終分化することに言及する。通常、最終分化は、細胞周期からの離脱および増殖の停止と関連する。

【0054】

本明細書で使用される場合、用語「筋肥大」とは、筋肉のサイズにおける増大に言及し、個々の線維体積における増大および／もしくは筋線維の断面積における増大を含み得、また、筋線維あたりの核の数における増大を含み得る。筋肥大はまた、筋肉全体の体積および質量における増大を含み得る；しかし、筋肥大は、筋過形成（これは、筋線維の増大した数である）とは異なり得る。一実施形態において、筋肥大は、アクチンおよびミオシン収縮タンパク質の数における増大に言及する。

【0055】

本明細書で使用される場合、用語「促進する」、「増強する」、「刺激する」、もしくは「増大する」とは、一般に、本発明のＷｎｔ組成物が、ビヒクルもしくはコントロール分子／組成物のいずれかによって引き起こされる生理学的応答と比較して、より大きな応答（すなわち、測定可能な下流効果）を生じるかもしくは引き起こす能力に言及する。１つのこのような測定可能な生理学的応答としては、非対称性細胞分裂と比較して、対称性幹細胞分裂における増大（例えば、サテライト幹細胞における増大）、および／または正常な、未処理、もしくはコントロール処理した筋細胞と比較して、筋肥大の増大が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、上記生理学的応答は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上増大し得る。別の非限定的例において、本発明のＷｎｔ組成物の投与に応じた筋肥大は、正常な、未処理の、もしくはコントロール処理の筋肉と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上増大し得る。「増大した」もしくは「増強した」応答は、代表的には、「統計的に有意」な応答であり、ビヒクル（因子の非存在）もしくはコントロール組成物によって生成される応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍以上（例えば、５００倍、１０００倍）（その間、および１を超える全ての整数および小数を含む（例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など））である増大を含み得る。

【0056】

本明細書で使用される場合、用語「保持」もしくは「維持」、または「保持する」もしくは「維持する」とは、一般に、本発明のＷｎｔ組成物（すなわち、改変Ｗｎｔの組成物）が、天然に存在するＷｎｔアミノ酸もしくは核酸配列のＷｎｔ組成物によって引き起こされる応答に類似の性質である生理学的応答（すなわち、測定可能な下流効果）を生成するかもしくは引き起こす能力に言及する。例えば、本発明のＷｎｔ組成物は、Ｗｎｔ生物学的活性を示し、従って、Ｗｎｔ活性を保持する。本発明の組成物はまた、天然に存在するＷｎｔポリペプチドによって引き起こされる応答に類似の性質のものである生理学的応答（例えば、筋肥大）を生じる。類似の生理学的応答を誘発する本発明のＷｎｔ組成物は、天然に存在するＷｎｔアミノ酸もしくは核酸配列を含む組成物によって誘発される生理学的応答のレベルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは約１００％である生理学的応答を誘発し得る。

【0057】

「天然に存在するＷｎｔ７ａ活性」を保持する、本発明の改変もしくは操作されたＷｎｔ７ａポリペプチドは、上記タンパク質の脂質付加を低下させる１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を有する改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドに言及し、ここで上記ポリペプチドは、その対応する天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドによって生成される生理学的応答の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％である生理学的応答を生じる。

【0058】

「天然に存在するＷｎｔ５ａ活性」を保持する本発明の改変もしくは操作されたＷｎｔ５ａポリペプチドとは、上記タンパク質の脂質付加を低下させる１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を有する改変Ｗｎｔ５ａポリペプチドに言及し、ここで上記ポリペプチドは、その対応する天然に存在するＷｎｔ５ａポリペプチドによって生成される生理学的応答の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％である生理学的応答を生じる。

【0059】

本明細書で使用される場合、用語「低下する」もしくは「低くする」、または「少なくする」、もしくは「低下させる」、または「弱める」とは、一般に、ビヒクルもしくはコントロール分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、本発明のＷｎｔ組成物がより低い生理学的応答（すなわち、下流効果）（例えば、低下したアポトーシス）を生じるかもしくは引き起こす能力に言及する。一実施形態において、上記低下は、遺伝子発現における低下、または通常は細胞生存性の低下と関連する細胞シグナル伝達の低下であり得る。「低下」もしくは「低下した」応答は、代表的には、「統計的に有意」な応答であり、ビヒクル（因子の非存在）もしくはコントロール組成物によって生成される応答の１／１．１、１／１．２、１／１．５、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１５、１／２０、１／３０以上（例えば、１／５００、１／１０００）（その間、および１を超える全ての整数および小数を含む（例えば、１／１．５、１／１．６、１／１．７、１／１．８など））である低下を含み得る。

【0060】

（Ｗｎｔシグナル伝達経路）
上記Ｗｎｔシグナル伝達経路は、発生の間および成体の生命全体を通じて、細胞運命決定、細胞移動、細胞極性、神経パターン形成および器官形成の重要な局面を調節する古代からの進化的に保存された経路である。上記Ｆｚレセプターの下流にあるＷｎｔシグナル伝達経路は、同定されており、これは、標準のもしくはＷｎｔ／β−カテニン依存性経路および非標準のもしくはβ−カテニン非依存性経路を含み、これらは、平面内細胞極性、Ｗｎｔ／Ｃａ^２＋経路などにさらに分けられ得る。

【0061】

Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）レセプターファミリー（その中には、ヒトにおいて１０個のＦｚがある）のＮ末端細胞外システインリッチドメインに結合する。上記Ｆｚタンパク質は、Ｇプロテイン共役レセプターに対してトポロジー的に相同性を有する７回膜貫通タンパク質である。さらに、ＷｎｔとＦｚとの間の相互作用に対して、さらに、共レセプターが、Ｗｎｔシグナル伝達を媒介するために必要とされる。例えば、低密度リポプロテイン関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）は、上記標準のＷｎｔシグナルを媒介するために必要とされるのに対して、レセプターチロシンキナーゼＲＹＫは、非標準の機能のために必要とされ得る。Ｗｎｔシグナル伝達の調節の別のレベルは、多様な数の分泌型Ｗｎｔアンタゴニストの存在によって、細胞外環境において起こる。Ｗｎｔがレセプター複合体に結合した後、上記シグナルは、細胞質ホスホプロテインＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ／Ｄｖｌ）に伝達される。Ｄｓｈは、Ｆｚと直接相互作用し得る。Ｄｓｈのレベルにおいて、上記Ｗｎｔシグナルは、少なくとも３種の主要なカスケード（標準（β−カテニン）、平面内細胞極性およびＷｎｔ／Ｃａ^２＋）に枝分かれする。さらに、Ｇプロテイン共役レセプターシグナル伝達はまた、ＰＩ３Ｋのような増殖および生存経路を刺激し得る。

【0062】

（標準のＷｎｔシグナル伝達経路）
上記標準のＷｎｔシグナル伝達経路は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける遺伝的スクリーニングから初めて同定され、詳細に示された。そしてハエ、蠕虫、カエル、魚類およびマウスにおける集中的な研究から、基本的な分子シグナル伝達フレームワークの同定がもたらされた。上記標準のＷｎｔ経路の顕著な特徴は、核へのアドへレンジャンクション関連タンパク質（ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ）β−カテニンの蓄積および移動である。Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下では、細胞質β−カテニンは、β−カテニン破壊複合体（これは、Ａｘｉｎ、ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）およびカゼインキナーゼ１α（ＣＫ１α）を含む）によって分解される。ＣＫ１αおよびＧＳＫ３βによるこの複合体内でのβ−カテニンのリン酸化は、β−カテニンを、ユビキチン化およびその後のプロテオソーム機構によるタンパク質分解的破壊のための標的とする。Ｗｎｔの、上記Ｆｚおよび上記ＬＲＰ５／６から構成されるそのレセプター複合体への結合は、ＣＫ１およびＧＳＫ３−βによるＬＲＰ６の二重リン酸化を誘導し、このことは、Ａｘｉｎを含むタンパク質複合体が、サイトゾルから形質膜へ移動することを可能にする。Ｄｓｈはまた、上記膜へとリクルートされ、Ｆｚへ結合し、Ａｘｉｎは、リン酸化ＬＲＰ５／６へ結合する。Ｆｚ／ＬＲＰ５／６において上記膜に形成されるこの複合体は、Ａｘｉｎの隔離および／もしくはＡｘｉｎの分解のいずれかを介して、β−カテニンの安定化を誘導する。β−カテニンは、核へと移動し、ここでβ−カテニンは、Ｌｅｆ／Ｔｃｆファミリーメンバーと複合体形成して、標的遺伝子の転写誘導を媒介する。

【0063】

標準のＷｎｔシグナル伝達は、前方頭部構造の形成および神経外胚葉パターン形成、後部パターン形成および尾部形成に影響を及ぼし、ならびに心臓、肺、腎臓、皮膚および骨を含む種々の器官系の形成に影響を及ぼす。

【0064】

上記標準のＷｎｔシグナル伝達経路を介してシグナル伝達し得るＷｎｔとしては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、およびＷｎｔ１６が挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

（非標準のＷｎｔシグナル伝達経路）
上記非標準の経路は、しばしば、β−カテニン非依存性経路といわれる。この経路は、少なくとも２つの異なる枝（平面内細胞極性経路（もしくはＰＣＰ経路）およびＷｎｔ／Ｃａ２＋経路）へとさらに別れ得る。そのうち、上記ＰＣＰのみが、本明細書においてさらに詳細に考察される。上記ＰＣＰ経路は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける遺伝的研究から浮かび上がってきた。この研究において、Ｗｎｔシグナル伝達成分（ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄを含む）における変異は、毛小皮（ｃｕｔｉｃｌｅ ｈａｉｒｓ）および感覚剛毛を含む上皮構造の配向を無作為化することが見いだされた。上皮における細胞は、規定された先端−基底側極性を有することが公知であるが、さらに、上記細胞はまた、上記上皮層の平面に沿って極性化される。この固定した組織化は、毛包、感覚剛毛および眼における単眼の六角配列の配向を含む構造の配向を左右する。脊椎動物において、この組織化は、筋細胞の組織化および配向、内耳の感覚上皮における不動毛、毛包の組織化、および原腸形成を受けている背側の中胚葉細胞の形態および移動性の挙動の根底にあることが示された。

【0066】

Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｄｓｈの活性化をもたらすＬＲＰ５／６とは無関係に、Ｆｚを介して伝達される。Ｄｓｈは、Ｄａａｍ１を介して、Ｒｈｏの活性化を媒介し、このことは、続いて、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）を活性化する。Ｄａａｍ１はまた、アクチン結合タンパク質であるプロフィリンを介して、アクチン重合を媒介する。Ｄｓｈはまた、Ｒａｃの活性化を媒介し、このことは、続いて、ＪＮＫを活性化する。Ｒｏｃｋ、ＪＮＫおよびプロフィリンからのシグナル伝達は、細胞極性化および原腸形成の間の運動性のための細胞骨格変化のために統合される。

【0067】

上記非標準Ｗｎｔシグナル伝達経路を介してシグナル伝達し得るＷｎｔとしては、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

（筋細胞発生におけるＷｎｔシグナル伝達）
サテライト幹細胞は、筋細胞を生じる成体幹細胞である。成体の骨格筋におけるサテライト細胞は、それらのホスト筋線維の筋細胞膜と基底板との間の小さなくぼみに位置する。損傷（例えば、物理的外傷、反復運動、もしくは疾患における）の際に、サテライト細胞は活性化され、増殖し、筋原性調節因子（ＭＲＦ）であるＭｙｏＤおよびＭｙｆ５を発現する筋原性前駆細胞（筋芽細胞）の集団を生じる。上記再生プロセスの過程において、筋芽細胞は、数回の分裂を経て最終分化へとコミットし、ホスト線維と融合するかまたは新たな筋線維を生成して、損傷した組織を再構築する（Ｃｈａｒｇｅ ａｎｄ Ｒｕｄｎｉｃｋｉ， ２００４）。骨格筋再生の間に、上記サテライト細胞集団は、幹細胞亜集団によって維持され、従って、組織ホメオスタシスおよび個体の寿命の間の複数回の再生が可能になる（Ｋｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。サテライト幹細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５−）は、上記成体サテライト細胞プールのうちの約１０％を示し、非対称性の先端−基底細胞分裂を介して娘サテライト筋原性細胞（Ｐａｘ７＋／Ｍｙｆ５＋）を生じる。

【0069】

Ｗｎｔシグナル伝達は、胚発生を介する発生プログラムを調節すること、および成体組織において幹細胞機能を調節することにおいて重要な役割を果たす（Ｃｌｅｖｅｒｓ， ２００６）。Ｗｎｔは、沿軸中胚葉における胚性筋原性誘導に必須であり（Ｂｏｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｔａｊｂａｋｈｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、同様に、筋線維発生の間の分化の制御において必須である（Ａｎａｋｗｅ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。近年では、上記Ｗｎｔ平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路は、発生中の筋節における筋細胞増殖の配向を調節することに関わっていた（Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。成体において、Ｗｎｔシグナル伝達は、急性の損傷後の筋組織における成体幹細胞の筋原性へのコミットメントに必須であると考えられる（Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｔｏｒｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。他の研究から、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、予備の筋芽細胞の活性化およびリクルートを介して筋原性分化を調節することが示唆されている（Ｒｏｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。さらに、成体の筋肉内のサテライト細胞における上記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を制限し、従って分化を促進することによって筋原性系統の進行を制御するようである（Ｂｒａｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。

【0070】

近年になって、上記ＷｎｔレセプターＦｚｄ７は、静止サテライト幹細胞において顕著にアップレギュレートされることが決定された。さらに、さらなる研究から、Ｗｎｔ７ａは、筋再生の間に発現され、そのレセプターＦｚｄ７およびＶａｎｇｌ２（上記平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路の成分）を介して作用して、対称性のサテライト幹細胞増殖を誘導し、筋再生を劇的に増強することが明らかになった。

【0071】

上記ＰＣＰ経路におけるレセプターもしくはエフェクター分子（例えば、Ｆｚｄ７もしくはＶａｎｇｌ２）の阻害は、サテライト幹細胞に対するＷｎｔ７ａの効果を排除すると考えられる（Ｌｅ Ｇｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。脂質付加されたＷｎｔ７ａポリペプチドの投与、脂質付加によって後で翻訳後修飾されるＷｎｔ７ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与は、インビトロおよびインビボでサテライト幹細胞数を有意に増大させ、インビボで組織形成を促進し、損傷および罹患した筋組織において増強された修復および再生をもたらすことがさらに実証された（Ｌｅ Ｇｒａｎｄ ｅｔ
ａｌ．， ２００９）。

【0072】

いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、損傷および罹患した筋組織において増強された修復および再生をもたらすＷｎｔ７ａの作用機構は、２つの経路を有すると予期される：Ｗｎｔ７ａは、ＰＣＰ経路を介して筋サテライト（幹）細胞の対称性の増殖を刺激し得、その後に筋芽細胞へと分化し得る、より大きな細胞のプールを生じる；そして第２に、Ｇプロテイン共役レセプター（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）を介するＷｎｔ７ａシグナル伝達は、筋芽細胞および筋線維においてシグナル伝達するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）／ラパマイシン哺乳動物標的（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ）経路を刺激し得る。この経路は、肥大を刺激することが示された（Ｂｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２００１； ｖｏｌ． ３； ｐｐ． １０１４−１０１７； Ｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２００３； ｖｏｌ． ５； ｐｐ． ８７−９０； Ｃｉｃｉｌｉｏｔ ａｎｄ Ｓｃｈｉａｆｆｉｎｏ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ． ２０１０； １６（８）； ｐｐ． ９０６−９１４）。Ｗｎｔ７ａは、上記Ｇプロテイン共役レセプターＦｒｉｚｚｌｅｄ ７を介してシグナル伝達し得、このＷｎｔ／Ｆｒｚ相互作用は、両方の生物学的効果に寄与し得る。

【0073】

種々の実施形態において、本発明は、一部、上記非標準Ｗｎｔシグナル伝達経路を介してシグナル伝達して、損傷した筋組織を修復および再生する１種以上の改変Ｗｎｔを含むＷｎｔ組成物を使用することを企図する。特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１からなる群より選択される改変非標準Ｗｎｔを含む。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、改変Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の脂質付加部位を欠いている改変Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドを含む。

【0074】

特定の実施形態において、本発明の組成物は、天然の、異種の、もしくはハイブリッドのシグナルペプチド、および非標準のＷｎｔポリペプチド（必要に応じて、１つ以上の脂質付加部位を欠いている）を含む融合ポリペプチドを含む。

【0075】

筋細胞肥大にとっての上記ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の重要性は、記載されてきたものの、筋細胞においてこの経路を特異的に刺激することの治療的な困難性は、損傷および罹患した筋組織において修復および再生を増強することへのかなりの障害を提起している。強力なＰＩ３−キナーゼアクチベーター（例えば、ＩＧＦ−１）での初期の研究は、インビトロで肥大を生じたが、「オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）」代謝効果の可能性が存在する（すなわち、ＩＧＦ−１およびＰＩ３Ｋは、ハウスキーピング代謝プロセス、生存プロセスおよび代謝プロセスの重要なレギュレーターである）。従って、非標準Ｗｎｔ経路の筋特異的刺激（例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のＷｎｔ７ａ−Ｆｚｄ７刺激）の可能性は、重要かつ独特な治療的なブレイクスルーを表す。

【0076】

以下にさらに詳細に記載されるように、本発明は、一部、この技術的ハードルおよびＷｎｔ組成物の治療的使用への他の障害に対する予測外の解決策を提供して、損傷および罹患した筋組織において修復および再生を増強する本発明のＷｎｔ組成物を企図する。

【0077】

（ポリペプチド）
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞シグナル伝達ネットワークの重要な成分である。上記ヒトＷｎｔ遺伝子ファミリーは、１９のメンバーからなり、２２個もしくは２４個のＣｙｓ残基およびいくつかの保存されたＡｓｎおよびＳｅｒ残基を有する、進化的に保存された糖タンパク質をコードする。例示的なヒトＷｎｔタンパク質としては、以下が挙げられる：Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６。

【0078】

上記Ｗｎｔは、分泌型糖タンパク質であり、細胞外環境への輸送および放出前に、大いに改変されている。シグナル配列切断および小胞体（ＥＲ）への移動の後に、Ｗｎｔは、細胞内膜系を介して細胞表面へと輸送され、いくつかの改変を受ける。Ｗｎｔは、Ｎ結合型グリコシル化を受ける（Ｂｕｒｒｕｓ ａｎｄ ＭｃＭａｈｏｎ １９９５； Ｋａｄｏｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｋｏｍｅｋａｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｋｕｒａｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９２； Ｓｍｏｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ． ２００２）。多くのＷｎｔはまた、最初の保存されたシステイン（例えば、Ｗｎｔ１においてはＣ９３、Ｗｎｔ３ａにおいてはＣ７７、およびＷｎｔ５ａにおいてはＣ１０４（Ｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｋａｄｏｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｋｏｍｅｋａｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ． ２００３））においてパルミトイル化される。さらに、Ｗｎｔ３ａは、保存されたセリンであるＳ２０９（これはまた、Ｗｎｔ１（Ｓ２２４）およびＷｎｔ５ａにおいても保存されている）においてパルミトレイン酸で改変される（Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。さらに、これら保存されたシステインおよびセリン残基は、多くのＷｎｔ（例えば、とりわけ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ９ａ、ｗｎｔ１０ａ、およびＷｎｔ１１）において存在する（Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００６；図１もまた参照のこと）。

【0079】

Ｗｎｔアシル化は、分泌型Ｗｎｔのよく知られた疎水性の性質の原因であることは広く受け入れられている（Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。さらに、哺乳動物Ｗｎｔの翻訳後脂質付加は、機能にとって重要であると考えられている。Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、もしくはＷｎｔ５ａの保存されたＮ末端システインを変異させると、細胞培養物においてパルミトイル化が妨げられた。これら変異型Ｗｎｔは分泌されたが、ほとんどもしくは全くシグナル伝達活性を有しないことが示された（Ｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｋｏｍｅｋａｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｋｕｒａｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。そして非パルミトイル化Ｗｎｔは、Ｆｚレセプターを結合できないと考えられている（Ｋｏｍｅｋａｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｋｕｒａｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００７）。Ｗｎｔ３ａの中心部分における保存されたセリンを変異させると、パルミトレイン酸付加が妨げられ、分泌がブロックされ、従って、活性がブロックされた（Ｔａｋａｄａ ｅｔ
ａｌ．， ２００６）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｗｇに対する研究から、アシル化の重要性が確認された（Ｆｒａｎｃｈ−Ｍａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８ａ； Ｎｕｓｓｅ ２００３； ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。

【0080】

さらに、これらデータは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいてｐｏｒｃｕｐｉｎｅ（ｐｏｒｃ）表現型によって裏付けられ、これは、Ｗｇシグナル伝達の強力な喪失を示す（ｖａｎ
ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。Ｐｏｒｃは、Ｗｇパルミトイル化（Ｚｈａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４）およびＷｇがＥＲを出て行く（Ｔａｎａｋａ
ｅｔ ａｌ．， ２００２）のに必要とされるＥＲ局在膜内在型Ｏ−アシルトランスフェラーゼである（Ｋａｄｏｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。脊椎動物Ｐｏｒｃはまた、Ｗｎｔ脂質付加を促進し、Ｗｎｔシグナル伝達およびＷｎｔ生物学的活性に必要とされる（Ｇａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。

【0081】

これら研究は、パルミトレイン酸改変が、分泌に必要とされ、Ｆｚ結合のためにパルミチン化するというモデルを確立する。従って、これら脂質改変のいずれかもしくは両方を欠いているＷｎｔポリペプチドは、生物学的活性を欠くと予測される。

【0082】

種々の実施形態において、本発明は、一部、標準の脂質付加部位を減少させるかもしくは除去するように改変もしくは操作されたが、Ｗｎｔ生物学的活性を予測外に保持するＷｎｔポリペプチドを企図する。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔポリペプチドは、細胞増殖および筋肥大を促進し、組織形成、再生、維持および修復を促進する。本明細書で使用される場合、用語「標準の」とは、アミノ酸配列を参照して使用される場合、天然に存在するポリペプチドに存在するアミノ酸もしくはアミノ酸の群に言及する。いくつかの状況において、「標準の」とは、上記天然に存在するポリペプチドに存在するアミノ酸に言及する場合、「天然の」と交換可能に使用される。

【0083】

特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加のための天然のアミノ酸のうちの１個もしくはそれより多くを欠くように改変もしくは操作された。ある特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加のための天然のアミノ酸の全てを欠くように改変もしくは操作された。いくつかの実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、非標準Ｗｎｔポリペプチド（非標準Ｗｎｔシグナル伝達経路を介してシグナル伝達するＷｎｔポリペプチド）である。特定の実施形態において、上記非標準Ｗｎｔは、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１からなる群より選択される。好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、本明細書で考察されるとおり、標準のもしくは天然の脂質付加部位を欠くように改変もしくは操作されているが、標準のおよび／もしくは非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するかもしくは増大させた、Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドである。

【0084】

上記のように、本発明は、実施形態において、当該分野で公知および利用可能な技術を使用して、操作されたＷｎｔポリペプチドもしくはそのように操作されたＷｎｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、１つ以上もしくは全ての脂質付加部位を除去するように操作されている。

【0085】

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、そうではないと特定されなければ、従来の意味に従って、すなわち、ペプチド結合もしくは改変ペプチド結合によって連結されるアミノ酸の配列として交換可能に使用される。特定の実施形態において、用語「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドを含む。ポリペプチドは、特定の長さに限定されない。例えば、上記ポリペプチドは、全長のタンパク質配列もしくは全長タンパク質のフラグメントを含んでいてもよいし、上記ポリペプチドの翻訳後修飾を含んでいてもよい（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該分野で公知の他の改変（天然に存在する、および天然に存在しないの両方））。本発明のポリペプチドは、種々の周知の組換えおよび／もしくは合成技術のうちのいずれかを使用して調製され得る。そのうちの例は、以下でさらに考察される。しかし、特定の実施形態において、本発明のＷｎｔポリペプチドは、それらが、上記Ｗｎｔポリペプチド上の１個、２個、もしくはこれ以上の、または全ての脂質付加部位を除去もしくは排除する、１個もしくはそれより多いアミノ酸置換、欠失、挿入、もしくは変異を有するように操作された。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、非標準のＷｎｔポリペプチド（すなわち、非標準のＷｎｔシグナル伝達経路を介してシグナル伝達するＷｎｔポリペプチド）である。

【0086】

種々の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１からなる群より選択され、ここで上記Ｗｎｔポリペプチドは、１個以上のまたは全ての脂質付加部位を、例えば、アミノ酸置換、欠失、もしくは変異によって欠いている。好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、１個以上のまたは全ての脂質付加部位を、例えば、アミノ酸置換、欠失、もしくは変異によって欠いているＷｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドである。

【0087】

本明細書で使用される場合、用語「非標準のＷｎｔポリペプチド」とは、非標準のＷｎｔシグナル伝達経路を介して、一般にもしくは主にシグナル伝達するＷｎｔポリペプチドに言及する。例示的な非標準のＷｎｔポリペプチドとしては、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、用語「非標準のＷｎｔポリペプチド」とは、天然に存在する非標準のＷｎｔポリペプチド配列に対して少なくとも約７０％、より好ましくは、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは約１００％同一である配列を有する、改変もしくは操作された非標準のＷｎｔポリペプチドに言及する。同一性は、少なくとも約１０個、２５個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくはこれ以上の連続するアミノ酸にわたって評価されてもよいし、配列の全長にわたって評価されてもよい。％同一性もしくは％相同性を決定するための方法は、当該分野で公知であり、任意の適切な方法が、この目的のために使用され得る。非標準のＷｎｔポリペプチドの例は、配列番号２〜１３および１５〜２３、２９〜３２、ならびに３９に示される。

【0088】

本明細書で使用される場合、用語「Ｗｎｔ７ａポリペプチド」とは、野生型Ｗｎｔ７ａ配列に対応するポリペプチド配列を有するＷｎｔ７ａタンパク質に言及する。いくつかの実施形態において、用語「Ｗｎｔ７ａポリペプチド」とは、天然に存在するＷｎｔ７ａ配列に対して、少なくとも約７０％、より好ましくは、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは約１００％同一である配列を有する、改変もしくは操作されたＷｎｔ７ａポリペプチドに言及する。同一性は、少なくとも約１０個、２５個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくはこれ以上の連続するアミノ酸にわたって評価されてもよいし、配列の全長にわたって評価されてもよい。Ｗｎｔ７ａポリペプチドの例は、配列番号２〜１３に示される。

【0089】

本明細書で使用される場合、用語「Ｗｎｔ５ａポリペプチド」とは、野生型Ｗｎｔ５ａ配列に対応するポリペプチド配列を有するＷｎｔ５ａタンパク質に言及する。いくつかの実施形態において、用語「Ｗｎｔ５ａポリペプチド」とは、天然に存在するＷｎｔ５ａ配列に対して、少なくとも約７０％、より好ましくは、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは約１００％同一である配列を有する、改変もしくは操作されたＷｎｔ５ａポリペプチドに言及する。同一性は、少なくとも約１０個、２５個、５０個、１００個、２００個、３００個、もしくはこれ以上の連続するアミノ酸にわたって評価されてもよいし、配列の全長にわたって評価されてもよい。Ｗｎｔ５ａポリペプチドの例は、配列番号１５〜２３に示される。

【0090】

本明細書で使用される場合、用語「改変Ｗｎｔポリペプチド」、「改変もしくは操作されたＷｎｔポリペプチド」、および「操作されたＷｎｔポリペプチド」は、交換可能に使用され、Ｗｎｔポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、または１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、もしくは置換を含むそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログに言及する。本発明の特定の実施形態において、改変Ｗｎｔポリペプチドは、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加を妨げるために、保存された脂質付加部位の１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含むが、それはまた、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するＷｎｔポリペプチドを生じる。特定の実施形態において、上記改変Ｗｎｔポリペプチドは、１個以上のまたは全ての脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ活性を保持する。好ましくは、本発明の改変Ｗｎｔポリペプチドは、上記天然に存在するＷｎｔ活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持する。

【0091】

本明細書で使用される場合、用語「改変された非標準のＷｎｔポリペプチド」、「改変もしくは操作された非標準のＷｎｔポリペプチド」および「操作された非標準のＷｎｔポリペプチド」は、交換可能に使用され、非標準のＷｎｔポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、または１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、もしくは置換を含むそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログに言及する。本発明の特定の実施形態において、改変された非標準のＷｎｔポリペプチドは、上記非標準のＷｎｔポリペプチドの脂質付加を妨げるために、保存された脂質付加部位の１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含むが、それはまた、非標準のＷｎｔ生物学的活性を保持する（例えば、上記非標準のＷｎｔ経路を介してシグナル伝達する）非標準のＷｎｔポリペプチドを生じる。特定の実施形態において、上記改変された非標準のＷｎｔポリペプチドは、１個以上のもしくは全ての脂質付加部位を欠いているが、非標準のＷｎｔ活性を保持する。好ましくは、本発明の改変された非標準のＷｎｔポリペプチドは、上記天然に存在する非標準のＷｎｔ活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持する。

【0092】

本明細書で使用される場合、用語「改変されたＷｎｔ７ａポリペプチド」、「改変もしくは操作されたＷｎｔ７ａポリペプチド」、および「操作されたＷｎｔ７ａポリペプチド」は、交換可能に使用され、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、または１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、もしくは置換を含むそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログに言及する。特定の実施形態において、本発明の改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドの脂質付加を妨げるために、保存された脂質付加部位の１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含むが、それはまた、Ｗｎｔ７ａ生物学的活性を保持するかもしくは増大したＷｎｔ７ａポリペプチドを生じる。特定の実施形態において、上記改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、１個以上のもしくは全ての脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ生物学的活性を保持する。好ましくは、本発明のＷｎｔ７ａポリペプチド改変体は、上記天然に存在するＷｎｔ７ａ活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持する。改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドの例は、配列番号３〜５および１２〜１３に示される。

【0093】

本明細書で使用される場合、用語「改変Ｗｎｔ５ａポリペプチド」、「改変もしくは操作されたＷｎｔ５ａポリペプチド」、および「操作されたＷｎｔ５ａポリペプチド」は、交換可能に使用され、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、または１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、もしくは置換を含むそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログに言及する。特定の実施形態において、本発明の改変Ｗｎｔ５ａポリペプチドは、上記Ｗｎｔ５ａポリペプチドの脂質付加を妨げるために、保存された脂質付加部位の１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含むが、それはまた、Ｗｎｔ５ａ生物学的活性を保持するかもしくは増大したＷｎｔ５ａポリペプチドを生じる。特定の実施形態において、上記改変Ｗｎｔ５ａポリペプチドは、１個以上のもしくは全ての脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ生物学的活性を保持する。好ましくは、本発明のＷｎｔ５ａポリペプチド改変体は、上記天然に存在するＷｎｔ５ａ活性のうちの少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、もしくは少なくとも５％を保持する。改変Ｗｎｔ５ａポリペプチドの例は、配列番号１６〜１８に示される。

【0094】

特定の実施形態において、本発明の改変Ｗｎｔポリペプチドは、上記ポリペプチドの脂質付加を低下もしくは妨げるアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含み、そのようなポリペプチドは、なおＷｎｔ生物学的活性を有する。特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、表１に同定されるアミノ酸位置のうちの１もしくはそれより多い位置においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含む標準のＷｎｔポリペプチドであり、ここで上記アミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換は、上記同定された位置での脂質付加を妨げ、そして上記標準のＷｎｔポリペプチドは、標準のＷｎｔ生物学的活性を保持するかもしくはそのレベルを増大させる。

【0095】

【表1】

特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、表２に同定されるアミノ酸位置のうちの１個もしくはそれより多い位置においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含む非標準のＷｎｔポリペプチドであり、ここで上記アミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換は、上記同定された位置での脂質付加を妨げ、そして上記非標準のＷｎｔポリペプチドは、非標準のＷｎｔ生物学的活性を保持するかもしくはそのレベルを増大させる。

【0096】

【表2】

特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、アミノ酸７３および／もしくは２０６においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含み、そのような位置において脂質付加が妨げられているＷｎｔ７ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、Ｗｎｔ７ａ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大したレベルを有する。一実施形態において、上記ポリペプチドは、アミノ酸７３位においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含み、この位置での脂質付加が妨げられているＷｎｔ７ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、Ｗｎｔ７ａ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大したレベルを有する。いくつかの実施形態において、本発明のＷｎｔポリペプチドは、アミノ酸２０６位においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含み、この位置においてＷｎｔ７ａの脂質付加が妨げられているＷｎｔ７ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、Ｗｎｔ７ａ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大したレベルを有する。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、アミノ酸７３位および２０６位においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含むＷｎｔ７ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、翻訳後脂質付加を欠いており、Ｗｎｔ生物学的活性を有する。

【0097】

特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ａポリペプチドのＣ７３および／もしくはＳ２０６は、これら残基の脂質付加を妨げるように、Ａｌａもしくは別のアミノ酸で置換される。他の実施形態において、Ｃ７３および／もしくはＳ２０６は、これら残基の脂質付加を妨げるように変異もしくは欠失される（例えば、配列番号３〜５）。いくつかの実施形態において、Ｃ７３およびＳ２０６は、Ａｌａで置換され、そして本発明のＷｎｔ７ａポリペプチドは、脂質付加部位を欠いており、Ｗｎｔ生物学的活性のあるレベルを保持する（例えば、配列番号５）。

【0098】

特定の実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、アミノ酸１０４および／もしくは２４４においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含み、このような位置での脂質付加が妨げられているＷｎｔ５ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ５ａポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大したレベルを有する。一実施形態において、上記ポリペプチドは、アミノ酸１０４位においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含み、この位置での脂質付加が妨げられているＷｎｔ５ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ５ａポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大したレベルを有する。いくつかの実施形態において、本発明のＷｎｔポリペプチドは、アミノ酸２４４位においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含み、この位置においてＷｎｔ５ａの脂質付加が妨げられているＷｎｔ５ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ５ａポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大したレベルを有する。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、アミノ酸１０４位および２４４位においてアミノ酸変異、付加、欠失、および／もしくは置換を含むＷｎｔ５ａポリペプチドであり、ここで上記Ｗｎｔ５ａポリペプチドは、翻訳後脂質付加を欠いており、Ｗｎｔ生物学的活性を有する。

【0099】

特定の実施形態において、Ｗｎｔ５ａポリペプチドのＣ１０４および／もしくはＳ２４４は、これら残基の脂質付加を妨げるように、Ａｌａもしくは別のアミノ酸で置換される。他の実施形態において、Ｃ１０４および／もしくはＳ２４４は、これら残基の脂質付加を妨げるように変異もしくは欠失される（例えば、配列番号１６〜１８）。いくつかの実施形態において、Ｃ１０４およびＳ２４４は、Ａｌａで置換され、本発明のＷｎｔ５ａポリペプチドは、脂質付加部位を欠いており、Ｗｎｔ生物学的活性のあるレベルを保持する（例えば、配列番号１８）。

【0100】

本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する」とは、天然において見いだされ得るポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列に言及する。例えば、天然に存在するポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列は、ある生物に存在するものであり、その生物から単離され得、それは、実験室において人間によって意図的に改変されていない。用語「野生型」は、しばしば、用語「天然に存在する」と交換可能に使用される。

【0101】

本発明の状況において、ポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、またはそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログは、これが、野生型タンパク質の活性のうちの約１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％、好ましくは、上記野生型タンパク質の活性のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％を示す場合に、上記野生型タンパク質と少なくとも実質的に同じ活性を有するとみなされる。特定の実施形態において、上記ポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、またはそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログは、野生型タンパク質の活性のうちの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは約１００％を示す。特定の実施形態において、野生型活性より大きな活性が達成され得る。非標準のＷｎｔポリペプチド、例えば、Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチド、またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体、またはそのホモログ、パラログ、もしくはオルソログの活性は、例えば、野生型Ｗｎｔ生物学的活性を摸倣するその能力を測定し（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激することによって（例えば、対称性の幹細胞増殖もしくは細胞成長を促進することによって））、その能力と、野生型タンパク質の活性とを比較することによって、決定され得る。幹細胞分裂（例えば、サテライト幹細胞分裂）、および細胞増殖（例えば、筋肥大）を測定し特徴付けるための方法は、当該分野で公知である。

【0102】

本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性なフラグメント」は、参照ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列のフラグメントに適用される場合、Ｗｎｔ参照配列の生物学的活性（例えば、上記Ｗｎｔシグナル伝達経路を刺激するためのその生物学的活性）のうちの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、もしくは１０００％以上を有する改変Ｗｎｔポリペプチドのフラグメントに言及する。本発明の特定の実施形態は、一部、長さが少なくとも約２０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、もしくは３００個の連続するアミノ酸残基の改変Ｗｎｔポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、または上記をコードするポリヌクレオチド配列（間にある全ての整数を含む）（これは、参照Ｗｎｔポリペプチド（例えば、天然に存在するＷｎｔポリペプチド）の生物学的活性を有するポリペプチドを含むかもしくはコードする）を企図する。

【0103】

改変ポリペプチドは、ポリペプチド改変体を含む。用語「改変体」とは、本明細書で使用される場合、本明細書中の他の箇所で考察され、当該分野で公知であるように、少なくとも１個のアミノ酸残基の改変、付加、欠失、もしくは置換によって参照ポリペプチドから区別されるポリペプチドに言及する。特定の実施形態において、ポリペプチド改変体は、１個もしくはそれより多いアミノ酸置換（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、もしくはこれ以上の置換）によって参照ポリペプチドから区別され、それは、保存的であっても非保存的であってもよい。例えば、種々の実施形態において、１個もしくはそれより多い保存的もしくは非保存的な置換は、上記天然に存在するＷｎｔポリペプチドにおいて脂質付加のために標的とされる任意のアミノ酸残基において行われ得る。

【0104】

他の特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチド改変体は、上記天然に存在するＷｎｔポリペプチドと比較して、脂質付加を妨げるために、Ｗｎｔ経路シグナル伝達活性を増大させるために、および／または上記改変Ｗｎｔポリペプチドの安定性を増大させるために、１個もしくはそれより多いアミノ酸付加、欠失、もしくは置換を含む。

【0105】

他の特定の実施形態において、非標準のＷｎｔポリペプチド改変体は、上記天然に存在する非標準のポリペプチドと比較して、脂質付加を妨げるために、Ｗｎｔ経路シグナル伝達活性を増大させるために、および／または上記改変Ｗｎｔポリペプチドの安定性を増大させるために、１個もしくはそれより多いアミノ酸付加、欠失、もしくは置換を含む。

【0106】

他の特定の実施形態において、Ｗｎｔ７ａポリペプチド改変体は、上記天然に存在するＷｎｔ７ａポリペプチドと比較して、脂質付加を妨げるために、Ｗｎｔ経路シグナル伝達活性を増大させるために、および／または上記改変Ｗｎｔポリペプチドの安定性を増大させるために、１個もしくはそれより多いアミノ酸付加、欠失、もしくは置換を含む。

【0107】

他の特定の実施形態において、Ｗｎｔ５ａポリペプチド改変体は、上記天然に存在するＷｎｔ５ａポリペプチドと比較して、脂質付加を妨げるために、Ｗｎｔ経路シグナル伝達活性を増大させるために、および／または上記改変Ｗｎｔポリペプチドの安定性を増大させるために、１個もしくはそれより多いアミノ酸付加、欠失、もしくは置換を含む。

【0108】

このような改変体を生成するために、当業者は、例えば、表３に従って、例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１個もしくはそれより多くを変化させ得る。

【0109】

【表3】

どのアミノ酸残基が，生物学的活性も免疫学的活性も破壊することなく、置換、挿入、もしくは欠失され得るかを決定することにおけるガイダンスは、当該分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ^ＴＭソフトウェア）を使用して見いだされ得る。所望される場合、アミノ酸置換は、ポリペプチドから官能基を変化させ、そして／もしくは除去するように行われ得る。あるいは、本明細書で開示されるタンパク質改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化であり得る（すなわち、同様に荷電したかもしくは荷電していないアミノ酸の置換）。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に、４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および荷電していない極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときおり、まとめて芳香族アミノ酸として分類される。表４を参照のこと。

【0110】

【表4】

他の置換も許容され、経験的に、または他の公知の保存的（もしくは非保存的）置換に従って決定され得る。

【0111】

このような変化を行うにあたって、アミノ酸のヒドロパシーインデックスが考慮され得る。タンパク質に対して相互作用的生物学的機能を付与することにおける上記アミノ酸のヒドロパシーインデックスの重要性は、一般に、当該分野で理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， １９８２（本明細書に参考として援用される））。特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシーインデックスもしくはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、類似の生物学的活性を有するタンパク質をなお生じる（すなわち、生物機能的に等価なタンパク質をなお得る）ことは、当該分野で公知である。このような変化を行うにあたって、ヒドロパシーインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものは特に好ましく、±０．５以内であるものは、さらになお、特に好ましい。類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて、効率的に行われ得ることもまた、当該分野で理解される。

【0112】

本発明のポリペプチドの改変体としては、グリコシル化形態、他の分子との集合性結合体、および関連しない化学部分との共有結合的結合体（例えば、ｐｅｇ化分子）が挙げられる。共有結合的改変体は、当該分野で公知であるように、官能基を、アミノ酸鎖において、またはＮ末端もしくはＣ末端の残基において見いだされる基に連結することによって、調製され得る。改変体としてはまた、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインが挙げられる。上記タンパク質の機能的活性に影響を及ぼさない領域の短縮もしくは欠失もまた、改変である。

【0113】

機能に必須の、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位指向性変異誘発もしくはアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５， １９８９））によって同定され得る。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、構造分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴もしくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９−９０４， １９９２およびｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２， １９９２）によって決定され得る。

【0114】

特定の変化は、上記タンパク質の折りたたみにも活性にも大きく影響を及ぼさない。当業者が行うアミノ酸置換の数は、多くの要因（上記に記載されるものが挙げられる）に依存する。概して、任意の所定のポリペプチドあたりの置換の数は、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下もしくは３個以下である。

【0115】

さらに、ポリペプチドのｐｅｇ化および／もしくはムテインは、改善された特性（例えば、増大した半減期、溶解度、およびプロテアーゼ耐性）を提供すると予測される。Ｐｅｇ化は、当該分野で周知である。

【0116】

（融合ポリペプチド）
種々の実施形態において、本発明は、一部、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを企図する。一実施形態において、上記融合ポリペプチドは、改変Ｗｎｔポリペプチド、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドフラグメント、および／もしくは本明細書中の他の箇所に記載されるように、１個もしくはそれより多いアミノ酸変異、置換、および／もしくは付加をさらに含むこのようなポリペプチドを含む。特定の実施形態において、上記融合ポリペプチドは、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１からなる群より選択される非標準のＷｎｔポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、標準のもしくは天然の脂質付加部位を欠くように、本明細書で記載されるとおりに改変もしくは操作されているが、Ｗｎｔシグナル伝達活性を保持するかもしくは該活性の増大を有するＷｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドである。

【0117】

融合ポリペプチドは、上記タンパク質のＮ末端においてシグナルペプチド（これは、翻訳と同時にもしくは翻訳後に上記Ｗｎｔポリペプチドの移動を指示する）を含み得る。融合ポリペプチドはまた、リンカーもしくはスペーサー、１個以上のプロテアーゼ切断部位、１個以上のエピトープタグまたは上記ポリペプチドの合成、精製もしくは生成を容易にするための他の配列を含み得る。

【0118】

融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、直接的にもしくはアミノ酸リンカーを介してのいずれかで、１個以上の異種ポリペプチド配列（融合パートナー）に共有結合的に連結された本発明のポリペプチドに言及する。上記融合タンパク質を形成するポリペプチドは、代表的には、Ｃ末端をＮ末端に連結されるが、それらはまた、Ｃ末端をＣ末端に、Ｎ末端をＮ末端に、またはＮ末端をＣ末端に連結され得る。上記融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序にあり得る。

【0119】

上記融合パートナーは、本質的に任意の望ましい目的のために設計され含まれ得るが、ただし、それらは、上記ポリペプチドの所望の活性に有害な影響を及ぼさない。例えば、一実施形態において、融合パートナーは、上記タンパク質の溶解度もしくは安定性を増大させ、Ｗｎｔポリペプチドの生成および／もしくは精製を促進し、そして／またはＷｎｔの全身送達および／もしくは組織取り込みを促進するように、選択され得る。融合ポリペプチドは、化学合成法によって、または上記２つの部分の間の化学的連結によって生成されてもよいし、一般に、他の標準的技術を使用して調製されてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、以下のうちの１種以上もしくは全てを含む：シグナルペプチド、Ｗｎｔポリペプチド、例えば、非標準のＷｎｔ（例えば、Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａ）、またはその生物学的に活性なフラグメント、プロテアーゼ切断部位、およびエピトープタグ。

【0120】

本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」とは、分泌経路への進入を確実にするリーダー配列に言及する。分泌型タンパク質の産業的生成のために、上記生成されるべきタンパク質は、宿主細胞もしくは宿主生物から効率的に分泌される必要がある。上記シグナルペプチドは、例えば、上記生成されるべきタンパク質の天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、もしくは天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドであり得る。多くのシグナルペプチドは、分泌型タンパク質の生成のために使用される。

【0121】

従って、種々の実施形態において、本発明は、Ｗｎｔポリペプチド（非標準のＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１）が挙げられる）の生成および分泌を改善するための方法を企図し、上記方法は、細胞（例えば、哺乳動物、昆虫、もしくは細菌の）において、シグナルペプチド、および標準のもしくは天然の脂質付加部位を欠くように本明細書で考察されるとおりに改変もしくは操作された非標準のＷｎｔポリペプチドを有する融合ポリペプチドを発現する工程であって、ここで上記ポリペプチドは、標準のおよび／もしくは非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するかもしくは該活性の増大を有する、工程を包含する。好ましい実施形態において、Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａの生成および分泌を改善するための方法は、シグナルペプチド、および標準のもしくは天然の脂質付加部位を欠くように本明細書で考察されるとおりに改変もしくは操作されているが、標準のおよび／もしくは非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するかもしくは該活性の増大を有するＷｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドを有する融合ポリペプチドを細胞において発現する工程を包含する。

【0122】

本発明の融合ポリペプチドにおいて使用するためのシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ３３シグナルペプチド；免疫グロブリンシグナルペプチド（例えば、ＩｇＧκシグナルペプチドもしくはＩｇＧμシグナルペプチド）；成長ホルモンシグナルペプチド；エリスロポエチンシグナルペプチド；アルブミンシグナルペプチド；分泌型アルカリホスファターゼシグナルペプチド、およびウイルスシグナルペプチド（例えば、ロタウイルス（ｒｏｔｏｖｉｒｕｓ）ＶＰ７糖タンパク質シグナルペプチド）。

【0123】

特定の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、非標準のＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ７ａ）の精製および生成を促進するために、プロテアーゼ切断部位およびエピトープタグを含む。上記プロテアーゼ切断部位の位置は、代表的には、上記Ｗｎｔを細胞もしくは組織へ送達する前の、異種配列の除去を促進するために、上記ＷｎｔポリペプチドのＣ末端と上記エピトープタグとの間にある。

【0124】

本発明の融合タンパク質において使用され得る異種プロテアーゼ切断部位の例としては、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、ヘパリン切断部位、トロンビン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位および第Ｘａ因子切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。

【0125】

本発明の融合タンパク質において使用され得るエピトープタグの例としては、ＨＩＳ６エピトープ、ＭＹＣエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、Ｖ５エピトープ、ＶＳＶ−Ｇエピトープ、およびＨＡエピトープが挙げられるが、これらに限定されない。

【0126】

ペプチドリンカー配列はまた、融合ポリペプチド成分を、所望であれば、その二次構造および三次構造へと各ポリペプチドが折りたたまれることを確実にするために十分な距離だけ、分離するために使用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的技術を使用して、上記融合タンパク質へ組み込まれる。特定のペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）それらが可撓性の伸長したコンホメーションを採用できること；（２）それらが、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できないこと；ならびに（３）上記ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性残基もしくは荷電した残基がないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。他の中性に近いアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）はまた、上記リンカー配列において使用され得る。通常リンカーとして使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ４０：３９ ４６ （１９８５）； Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８２５８ ８２６２ （１９８６）；米国特許第４，９３５，２３３号および同第４，７５１，１８０号に開示されるものを含む。上記リンカー配列は、一般に、長さが１〜約５０個のアミノ酸であり得る。リンカー配列は、上記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、上記機能的ドメインを分離し、立体障害を妨げるために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には、必要とされない。上記２つのコード配列は、いかなるリンカーもなしで直接、または１〜３回反復されるペンタマーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒから構成される可撓性ポリリンカーを使用することによって、融合され得る。このようなリンカーは、ＶＨとＶＬとの間に挿入されることによって一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を構築するにあたって使用されてきた（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：５９７９−５８８３）。上記リンカーは、上記一本鎖抗体の可変領域を形成する２つのβ−シートの間での正しい相互作用を可能にするように設計される。使用され得る他のリンカーとしては、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：１０６６−１０７０）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）が挙げられる。

【0127】

一実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、抗体の一部（例えば、免疫グロブリン「Ｆｃ領域」）、ならびに標準のもしくは天然の脂質付加部位を欠くように本明細書中で考察されるとおりに改変もしくは操作されているが、標準のおよび／もしくは非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するかもしくは該活性の増大を有する改変Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチド）を含む。上記抗体のＦｃ領域は、上記抗体のクラスに依存して、２つもしくは３つの定常ドメインを与える２つの重鎖から構成される。上記Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのクラスのうちのいずれか（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）から得られ得る。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、変異したＦｃ領域である。いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、Ｎ末端において１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個のアミノ酸だけ短縮される（例えば、ヒンジドメインにおいて）。Ｆｃ領域を含む本発明のＷｎｔ融合ポリペプチドは、改善された生成および／もしくは精製効率を有し得る。

【0128】

一実施形態において、本発明のＷｎｔ融合ポリペプチドは、天然の脂質付加部位を欠くように改変されているが、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するＷｎｔ７ａポリペプチド、およびヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。具体的実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２の７３位もしくは２０６位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換、およびヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。具体的実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２の７３位および２０６位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸欠失、挿入、もしくは置換、およびヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。具体的実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２の７３位もしくは２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニン、およびヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、上記Ｗｎｔ７ａポリペプチドは、配列番号２の７３位および２０６位に対応するアミノ酸位置においてアラニン、およびヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。

【0129】

Ｆｃ領域および改変された非標準のＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａ）を含む融合ポリペプチドは、天然もしくは異種シグナルペプチド、プロテアーゼ切断部位およびエピトープタグのうちの１つ以上もしくは全てをさらに含み得る。

【0130】

好ましい実施形態において、改変Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドの半減期、薬物動態特性、溶解度、および生成効率を改善するための方法は、Ｆｃ領域および／もしくはシグナルペプチド、ならびに標準のもしくは天然の脂質付加部位を欠くように本明細書で考察されるとおりに改変もしくは操作されているが、標準のおよび／もしくは非標準のＷｎｔシグナル伝達活性を保持するかもしくは該活性の増大を有するＷｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドを有する融合ポリペプチドを、細胞において発現する工程を包含する。

【0131】

例えば、免疫グロブリンＦｃ領域に融合された改変Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドは、増大した全身半減期、改善された薬物動態特性、溶解度および生成効率を有する。一実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドを抗体のＦｃ部分に融合することは、上記融合ポリペプチドの薬物動態および薬力学特性を最適化する。例えば、上記ポリペプチドのＦｃ部分は、上記ポリペプチドを分解から保護し得、上記ポリペプチドを循環中により長く保持する。一般に、ポリペプチド、融合ポリペプチド（ならびにそれらをコードするポリヌクレオチド）、および細胞は、単離される。「単離された」ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、その本来の環境から取り出されているものである。例えば、「単離されたペプチド」もしくは「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、ペプチドもしくはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の成分との会合からの、インビトロでの単離および／もしくは精製に言及する（すなわち、それは、インビボでの物質と顕著に会合していない）。同様に、「単離されたポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態において上記ポリヌクレオチドと隣接している配列から精製されたポリヌクレオチドに言及する（例えば、ＤＮＡフラグメントに通常隣接して存在する配列から取り出された上記フラグメント）。ポリヌクレオチドは、例えば、これが天然の環境の一部ではないベクターにクローニングされている場合に、単離されているとみなされる。「単離された細胞」とは、インビボの組織もしくは器官から得られていて、細胞外マトリクスを実質的に含まない細胞に言及する。好ましくは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、もしくは細胞は、これらが少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは、少なくとも約９５％純粋、および最も好ましくは、少なくとも約９９％純粋である場合に単離されている。

【0132】

本明細書で使用される場合、用語「〜から得られる」とは、サンプル（例えば、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド）が、特定の供給源（例えば、組換え宿主細胞）から単離されているかもしくはこれに由来することを意味する。別の実施形態において、用語「〜から得られる」とは、インビボでの組織もしくは器官のような供給源から単離されているかもしくはこれに由来する細胞に言及する。

【0133】

（ポリヌクレオチド）
本発明はまた、本発明のＷｎｔポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。種々の実施形態において、本発明は、一部、標準の脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ生物学的活性を保持する、およびいくつかの実施形態においては、増大したＷｎｔシグナル伝達活性を有するポリペプチドをコードするＷｎｔポリヌクレオチドを企図する。特定の実施形態において、本発明のＷｎｔポリヌクレオチドは、幹細胞増殖を促進し、組織形成、再生、維持および修復を促進するＷｎｔポリペプチドをコードする。

【0134】

本発明のＷｎｔポリヌクレオチドは、Ｗｎｔポリペプチドの臨床スケール生成のために、ならびにヒトにおける損傷および罹患した筋組織において修復および再生を増強するための方法において使用するために、適している。特定の実施形態において、Ｗｎｔポリヌクレオチドは、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加のための天然のアミノ酸のうちの１個もしくはそれより多くを欠いているＷｎｔポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態において、Ｗｎｔポリヌクレオチドは、上記Ｗｎｔポリペプチドの脂質付加のための天然のアミノ酸のうちの全てを欠いているＷｎｔポリペプチドをコードする。好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリヌクレオチドは、標準の脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大を有する非標準のＷｎｔポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリヌクレオチドは、標準の脂質付加部位を欠いているが、Ｗｎｔ生物学的活性（例えば、非標準のＷｎｔシグナル伝達活性）を保持するかもしくは該活性の増大を有するＷｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチドをコードする。

【0135】

核酸は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１， ３−１９； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／５４４５９； Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ２６７７−２６８４； Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．， ７４，
５９−６８； Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｅｎｇ．， ６１， ３３−４５；およびＢｒｅｎｎａｎ， 米国特許第６，００１，３１１号に記載されるように、当該分野で公知のプロトコルを使用して合成され得る。

【0136】

「ヌクレオチド」とは、リン酸化糖とＮ−グリコシド結合した複素環式窒素塩基を意味する。ヌクレオチドは、天然の塩基（標準）、および当該分野で周知の改変塩基を含むことが、当該分野で認識されている。このような塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖およびリン酸基を含む。上記ヌクレオチドは、上記糖、リン酸および／もしくは塩基部分において改変されていなくてもよいし、改変されていてもよい（また、ヌクレオチドアナログ、改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどと交換可能に言及される（例えば、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，前出； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／０７０６５； Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， 国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ
９３／１５１８７； Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ，前出を参照のこと））。当該分野で公知の改変核酸塩基のいくつかの例は、以下によってまとめられる：Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， ２１８３−２１９６）。

【0137】

本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、特定の種の総ゲノムＤＮＡを含まずに単離されたＤＮＡ分子に言及する。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、１種以上のコード配列を含み、上記ＤＮＡセグメントが得られる種の総ゲノムＤＮＡからなお実質的に単離されているか、または総ゲノムＤＮＡを含まずに精製されているＤＮＡセグメントに言及する。用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」内に含まれるのは、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、さらに、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる）である。

【0138】

当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列、ゲノム外配列、およびプラスミドコード配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現するように適合され得るより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、天然に単離されていてもよいし、組換えであってもよいし、人の手によって合成して改変されていてもよい。

【0139】

当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）分子であっても、ＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列もしくは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在していてもよいが、存在している必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／もしくは支持物質に連結されていてもよいが、連結されている必要はない。

【0140】

ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、本発明のポリペプチドもしくはその一部をコードする内因性の配列）を含んでいてもよいし、改変体、またはこのような配列の生物学的機能の等価物を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書中他の箇所で記載されるように、１個もしくはそれより多い置換、付加、欠失および／もしくは挿入を含んでいてもよく、好ましくは、その結果として上記改変体は、標準の脂質付加部位を欠いているが、生物学的活性（例えば、経路シグナル伝達活性）を保持し、いくつかの実施形態において、該活性の増大を有するポリペプチドをコードする。

【0141】

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、含まれる。「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズするとは、互いに対して少なくとも６０％同一なヌクレオチド配列がハイブリダイズを保つハイブリダイゼーションプロトコルを記載する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、プローブ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドをその標的配列にのみハイブリダイズさせ得る条件である。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる。中程度にストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドが、本発明の核酸の全体、フラグメント、誘導体もしくはアナログにハイブリダイズするように、高ストリンジェンシーのためのものよりはストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件を使用する条件である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。中程度にストリンジェントな条件は、以下に記載される（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０）。低ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドが、本発明の核酸の全体、フラグメント、誘導体もしくはアナログにハイブリダイズするように、中程度のストリンジェンシーのためのものよりはストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件を使用する条件である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。低ストリンジェンシーの条件（例えば、種交叉ハイブリダイゼーションのための条件）は、以下に記載される（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０； Ｓｈｉｌｏ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１）。

【0142】

さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに同一もしくは相補的な配列の連続する範囲の種々の長さを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの少なくとも約５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、もしくは約３５０個もしくはこれ以上の連続するアミノ酸残基、ならびに全ての中間の長さをコードする。「中間の長さ」とは、この状況において、引用された値の間の任意の長さ（例えば、５６個、５７個、５８個、５９個など、１０１個、１０２個、１０３個など；１５１個、１５２個、１５３個など；２０１個、２０２個、２０３個など）を意味することは、容易に理解される。

【0143】

遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在する（ヒトおよび／もしくは霊長類のコドン選択のために最適化されているポリヌクレオチドが挙げられる）ことは、当業者によって認識される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子もまた、使用され得る。

【0144】

本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のうちのいずれかを使用して、同定、調製および／もしくは操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９，および他の類似の参考文献を参照のこと）。

【0145】

種々の発現ベクター／宿主系が公知であり、ポリヌクレオチド配列を含み、発現するために利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌）；酵母発現ベクターで形質転換される酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させられる昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換される植物細胞系；または動物細胞系。

【0146】

本明細書で使用される場合、用語「制御エレメント」もしくは「調節配列」とは、ベクターの非翻訳領域であり（例えば、エンハンサー、プロモーター、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域）、転写および翻訳を行うために宿主細胞タンパク質と相互作用する、発現ベクターに存在する配列に言及する。このようなエレメントは、それらの強度および特異性が様々であり得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、適切な転写および翻訳エレメント（構成性および誘導性のプロモーターを含む）の任意の数が、使用され得る。例えば、細菌系にクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．）もしくはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーター）が使用され得る。ベクター成分としては、一般に、以下のうちの１種以上が挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１種以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、宿主生物によって認識されるプロモーター、および転写終結配列。特異的な開始シグナルもまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。

【0147】

酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、多くのベクター（構成性プロモーターもしくは誘導性プロモーターを含む（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨ））が、使用され得る。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｎｄｏｒｉｓ発現系もまた含まれる（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２４， ２１０ − ２１５， ２００６；およびＨａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０１：１２４４， ２００３を参照のこと）。

【0148】

植物発現ベクターが使用される場合において、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）は、単独で、もしくはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１ （１９８７））。これら構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換もしくは病原体媒介性トランスフェクションによって、植物細胞へと導入され得る。

【0149】

昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現するために使用され得る。例示的バキュロウイルス発現系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＦ９、ＳＦ２１、およびＴｎｉ細胞を利用するもの（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ， Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． Ｃｈａｐｔｅｒ ５：Ｕｎｉｔ５．４， ２００１を参照のこと）。

【0150】

哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系が、一般に、利用可能である。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）は、哺乳動物宿主細胞において発現を増大させるために使用され得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、以下が挙げられる：ＣＯＳ−７細胞、２９３もしくは２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ−７６細胞、ＨＥＬＡ細胞、およびＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む）。哺乳動物発現系は、接着細胞株（例えば、Ｔフラスコ、ローラーボトル、もしくは細胞工場において）または懸濁培養物（例えば、当該分野で公知のものの中で、１Ｌおよび５Ｌのスピナー、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌおよび２００Ｌの撹拌タンクバイオリアクター、または２０／５０Ｌおよび１００／２００Ｌ ＷＡＶＥバイオリアクター）を利用し得る。

【0151】

タンパク質の無細胞発現もまた、含まれる。これらおよび関連の実施形態は、代表的には、精製ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡおよびリボヌクレオチドを利用し；これら試薬は、細胞からもしくは細胞ベースの発現系からの抽出によって生成され得る。

【0152】

特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、細菌から発現および精製される。例示的な細菌発現ベクターとしては、以下が挙げられる：ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３ ５５０９ （１９８９））；およびｐ
ＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）（これらは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る）。特定の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉベースの発現系を使用し得る。

【0153】

具体的実施形態において、タンパク質発現は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐＥＴベクターシリーズ）によって制御され得る。これらおよび関連の実施形態は、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＢＬ２１のλＤＥ３溶原）（これは、Ｔ７媒介性発現を支持し、改善された標的タンパク質安定性のためにｌｏｎおよびｏｍｐＴプロテアーゼが欠損している）を利用し得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて希に使用されるｔＲＮＡをコードするプラスミドを有する発現宿主株（例えば、Ｒｏｓｅｔｔａ^ＴＭ（ＤＥ３）およびＲｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）株）もまた、含まれる。細胞溶解およびサンプル取り扱いはまた、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼおよびＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）タンパク質抽出試薬のような試薬を使用して、改善され得る。細胞培養について、自己誘導培地（ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｍｅｄｉａ）は、多くの発現系（ハイスループット発現系を含む）の効率を改善し得る。このタイプの培地（例えば、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）は、人工的誘導因子（例えば、ＩＰＴＧ）の添加なしに、代謝シフトを介してタンパク質発現を徐々に誘発する。特定の実施形態は、寒冷ショック誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ高収量生成系を使用し得る。なぜなら、低温でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるタンパク質の過剰発現は、それらの溶解度および安定性を改善するからである（例えば、Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２２：８７７−８８２， ２００４を参照のこと）。

【0154】

組換え細胞によって生成されるタンパク質は、種々の技術に従って精製および特徴付けされ得る。タンパク質精製を行い、タンパク質純度を分析するための例示的システムとしては、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡおよびＢｉｏ−Ｒａｄ ＦＰＬＣシステム）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ＢｅｃｋｍａｎおよびＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ）が挙げられる。精製の例示的な化学としては、以下が挙げられる：当該分野で公知のものの中で、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ、Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、アフィニティー精製（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲル濾過、逆相、セラミックＨｙｐｅｒＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例えば、クーマシー、銀染色）、イムノブロット、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、およびＥＬＩＳＡ（これらは、代表的には、上記タンパク質組成物の純度を測定するために、上記生成もしくは精製プロセスの任意の工程の間に利用され得る）のような分析法もまた、含まれる。

【0155】

特定の実施形態において、臨床グレードのタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から単離され得る。特定の実施形態において、本発明は、本明細書中他の箇所で記載されるように、治療的使用に適している組換えＷｎｔポリペプチドを生成するための方法を企図する。

【0156】

一実施形態において、組換えＷｎｔポリペプチドを生成するための方法は、以下の工程のうちの１つ以上を包含する：ｉ）宿主におけるＷｎｔポリヌクレオチドの発現；ｉｉ）上記宿主細胞を培養して、上記Ｗｎｔポリペプチドを封入体として発現する工程；ｉｉｉ）上記封入体を洗浄する１回以上の工程；ｉｖ）上記ポリペプチドを可溶化する工程；ｖ）上記ポリペプチドを再度折りたたむ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程；ｖｉ）上記ポリペプチドを精製する工程；およびｖｉｉ）上記ポリペプチドを所望の緩衝液中で透析する工程。

【0157】

特定の実施形態において、Ｗｎｔポリヌクレオチド配列は、細菌宿主における発現のためにコドン最適化される。

【0158】

組換え生成法に加えて、本発明のポリペプチド、およびそのフラグメントは、固相技術を使用する直接ペプチド合成によって生成され得る（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５４ （１９６３））。タンパク質合成は、手動の技術を使用して、もしくは自動化技術によって、行われ得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別個に化学合成され、全長分子を生成するために化学的方法を使用して組み合わされてもよい。

【0159】

（組成物）
種々の実施形態において、本発明は、一部、Ｗｎｔポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドの新規な組成物を企図する。本明細書中他の箇所で考察されるように、Ｗｎｔの治療的使用への大きな制限もしくは障害のうちの１つは、それらの低い溶解度であり、このことは、臨床スケールで生成することを実行不能にする。本発明者らは、増大した溶解度、安定性を有し、天然に存在するＷｎｔと比較して、Ｗｎｔ生物学的活性を保持するかもしくは該活性の増大を有する新規なＷｎｔポリペプチドを操作して作った。特定の実施形態において、本発明は、幹細胞増殖および筋肥大を促進し、組織形成、再生、維持および修復を促進するために、可溶性Ｗｎｔポリペプチドの水性処方物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、幹細胞増殖および筋肥大を促進し、組織形成、再生、維持および修復を促進するために、可溶性Ｗｎｔポリペプチドの水性処方物を提供し、ここで界面活性剤は、上記処方物に実質的に存在しない。

【0160】

本発明の組成物は、本明細書に記載されるように、１種以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、上記を含むベクターなど、ならびに１種以上の薬学的に受容可能な塩もしくはキャリアおよび／または細胞もしくは動物への生理学的に受容可能な投与用の溶液を、単独で、または１種以上の他の治療の様式と組み合わせてのいずれかで、含み得る。所望であれば、本発明の組成物は、他の薬剤との組み合わせにおいて（例えば、他のタンパク質、ポリペプチド、低分子もしくは種々の薬学的に活性な因子）投与され得ることもまた、理解される。また、上記組成物に含まれ得る他の成分には実質的に限定はないが、ただし、上記さらなる因子は、上記Ｗｎｔ組成物の治療能力（例えば、上記組成物が筋肥大を促進し、組織形成、再生、維持および修復を促進する能力）に有害な影響を及ぼさない。

【0161】

薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）および無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは鉄の水酸化物）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得られ得る。

【0162】

特定の状況において、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（各々、その全体において本明細書に参考として具体的に援用される）に記載されるように、本明細書で開示される組成物を、非経口的に、脈管内に（例えば、静脈内もしくは動脈内に）、筋肉内に、またはさらに腹腔内に送達することは望ましいことであり得る。

【0163】

本明細書で使用される場合、「キャリア」とは、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝化剤、キャリア溶液、懸濁物、コロイドなどを含む。このような媒体および薬学的に活性な物質のための因子の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体もしくは因子が上記活性成分と不適合である範囲を除いて、上記治療的組成物におけるその使用が予期される。補助的な活性成分はまた、上記組成物に組み込まれ得る。

【0164】

語句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合、アレルギー性反応も類似の都合の悪い反応も生じない、分子実体および組成物に言及する。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。代表的には、このような組成物は、注射物（液体溶液もしくは懸濁物としてのいずれか）として調製される；注射の前に液体に溶解するか、もしくは懸濁物にするために適した固体形態もまた、調製され得る。

【0165】

特定の実施形態において、上記組成物は、鼻内スプレー、吸入、および／もしくは他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を、鼻のエアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および同第５，８０４，２１２号（各々、その全体において本明細書に参考として具体的に援用される）に記載されている。同様に、鼻内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａ ｅｔ ａｌ．， １９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（その全体において本明細書に参考として具体的に援用される））を使用する薬物の送達もまた、薬学分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリクスの形態における経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体において本明細書に参考として具体的に援用される）に記載されている。本発明の特定の実施形態は、他の処方物（例えば、薬学分野において周知であるもの）を含み得、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２０００において記載されている。

【0166】

（送達方法）
一実施形態において、細胞（例えば、サテライト幹細胞のような幹細胞）は、１種以上の本発明のＷｎｔポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物と接触させられる。本発明の細胞は、インビトロ、エキソビボ、もしくはインビボで接触させられ得ることが企図される。他の実施形態において、本発明のＷｎｔ組成物は、被験体に投与される。

【0167】

本発明の組成物は、上記被験体に直接投与され得るか（タンパク質／ポリペプチドとして、もしくは遺伝子治療のための発現ベクターの状況において）、またはエキソビボで、上記被験体に由来する細胞に送達され得る（例えば、エキソビボ遺伝子治療におけるように）。上記組成物の直接的なインビボ送達は、一般に、非経口注射によって（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、心筋に、腫瘍内に、腫瘍周囲に、もしくは組織の間質空間に）達成される。他の投与様式としては、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用、ニードル、および遺伝子銃もしくはハイポスプレーが挙げられる。

【0168】

本発明の組成物はまた、組織（例えば、筋）への直接注射によって投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の組成物は、上記組成物を、注射した筋における筋喪失を防止するか、または上記注射した筋の再生もしくは修復を促進するために（例えば、上記注射した筋の筋細胞の増殖もしくは肥大を促進することによって）、筋組織へ直接注射することによって、投与され得る。

【0169】

一般に、エキソビボおよびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中の上記ポリヌクレオチドの被包、上記ＤＮＡの、核への直接マイクロインジェクション、およびウイルス媒介性（例えば、アデノウイルス（およびアデノ随伴ウイルス）もしくはアルファウイルス）によって達成され得、全て当該分野で周知である。

【0170】

特定の実施形態において、１種以上の改変Ｗｎｔを、ウイルスベクターもしくは他のインビボポリヌクレオチド送達技術を使用して送達することは、好ましい。好ましい実施形態において、上記ウイルスベクターは、非組み込みベクターもしくはトランスポゾンベースのベクターである。これは、種々の周知のアプローチのうちのいずれか（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含むベクター）を使用して、または発現構築物として他のウイルスベクター（ワクシニア・ウイルス、ポリオウイルスおよびヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、達成され得る。

【0171】

非ウイルス法もまた、本発明のポリヌクレオチドを投与するために使用され得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションを介して細胞に、もしくは注射を介して組織に（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） もしくはＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ＆ Ｒｅｓｈｅｆ （１９８６）に記載される技術を使用することによって）、直接投与され得る。目的の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、インビボで類似の様式において移入され得、上記遺伝子生成物を発現し得ることは、想定される。

【0172】

裸のＤＮＡ発現構築物を細胞へ移入するための本発明の別の実施形態は、粒子ボンバードメントを伴い得る。この方法は、ＤＮＡコート微粒子を高速へと加速して、細胞膜を貫通し、細胞を死滅させることなく細胞に入れることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞へ投与される。

【0173】

（処置方法）
本発明の改変Ｗｎｔポリペプチドおよび組成物は、種々の治療適用に有用である。例えば、本明細書に記載される組成物および方法は、必要な被験体における組織形成、再生、修復もしくは維持を促進するために有用である。

【0174】

本発明のＷｎｔ組成物に関していくつかの関連する治療適用としては、筋肉喪失を防止するか、または失われたもしくは損傷した筋組織を、筋肉のサイズ、体積もしくは強度を増大させることによって再生する必要がある状況が挙げられる。このような状況は、例えば、化学療法もしくは放射線療法の後、筋肉損傷の後、または筋肉に影響を及ぼす疾患および状態の処置もしくは管理において、が挙げられ得る。特定の実施形態において、上記筋肉に影響を及ぼす疾患もしくは状態としては、消耗性疾患、例えば、悪液質（これは、がんもしくはＡＩＤＳのような病気と関連し得る）、筋減衰もしくは萎縮症、または筋変性疾患が挙げられ得る。筋減衰および萎縮症は、例えば、サルコペニア（加齢性サルコペニアが挙げられる）、ＩＣＵ誘導性虚弱、筋肉の不使用（例えば、昏睡、麻痺、傷害、もしくは固定に起因する筋肉の不使用）、手術誘導性虚弱（例えば、股関節置換もしくは膝関節置換の後）、または筋変性疾患（例えば、筋ジストロフィー）と関連し得る。この列挙は、網羅的ではない。

【0175】

特定の実施形態において、本発明のポリペプチドおよび組成物は、筋肉サテライト細胞の対称性の増殖を刺激し、それによって、筋組織における常在のサテライト細胞、もしくはコミットメントされた前駆細胞の割合を増大させるために、使用され得る。上記ポリペプチドおよび組成物はまた、筋肥大を（例えば、個々の筋線維のサイズを増大させることによって）促進するために使用され得る。本発明のポリペプチドおよび組成物は、従って、筋細胞の数および筋細胞のサイズの両方を増大させ得、結果として、例えば、損傷したもしくは欠損した組織を置換するか、または筋萎縮症もしくは筋質量の喪失を防止するために、特に、筋肉に影響を及ぼす疾患および障害（例えば、筋ジストロフィー、神経筋疾患および神経変性疾患、筋消耗性疾患および状態、萎縮症、心血管疾患、脳卒中、心不全、心筋梗塞、がん、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなど）に関連して、有用であり得る。

【0176】

さらなる実施形態において、上記組成物および方法は、機能不全の骨格筋（例えば、筋変性疾患を有する被験体において）を修復もしくは再生するために有用である。上記被験体は、骨格筋損傷、変性もしくは萎縮症を有すると疑われる得か、これらを有するリスクがあり得る。上記骨格筋損傷は、疾患に関連してもよいし、疾患に関連していなくてもよい。上記ヒト被験体は、筋変性もしくは筋消耗を有し得るか、またはこれらを有するリスクがあり得る。上記筋変性もしくは筋消耗は、全体として、もしくは一部は、疾患（例えば、ａｉｄｓ、がん、筋変性疾患、もしくはこれらの組み合わせ）によって引き起こされ得る。

【0177】

筋ジストロフィーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病としても公知）、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィーおよびエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３１８．１３６３−１３６８ （１９８８）； Ｂｏｎｎｅｍａｎｎ， Ｃ． Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｅｄ．， ８： ５６９−５８２ （１９９６）； Ｗｏｒｔｏｎ， Ｒ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０： ７５５−７５６ （１９９５）； Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．
Ｄｉｓｃｏｒｄ．， ９ （２）： １０８−１１４ （１９９９）； Ｌｉｍ， Ｌ． Ｅ． ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｋ． Ｐ．， Ｃｕｒｅ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．， １１ （５）： ４４３−４５２ （１９９８）； Ｖｏｉｔ， Ｔ．，
Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ．， ２０ （２）： ６５−７４ （１９９８）； Ｂｒｏｗｎ， Ｒ． Ｈ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ．， ４８： ４５７−４６６ （１９９７）； Ｆｉｓｈｅｒ， Ｊ． ａｎｄ Ｕｐａｄｈｙａｙａ， Ｍ．， Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ． Ｄｉｓｏｒｄ．， ７ （１）： ５５−６２ （１９９７）を参照のこと。

【0178】

特定の実施形態において、必要な被験体における筋肉の筋形成、維持、修復、もしくは再生を促進するための医薬の製造のための、本明細書に記載される組成物の使用が、提供される。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、必要な被験体における筋肉の筋形成、維持、修復、もしくは再生を促進するための医薬の製造における使用のために提供される。上記Ｗｎｔポリペプチドは、筋萎縮症を（例えば、筋線維のサイズもしくは数を増大させることによって）予防もしくは処置するために使用され得る。

【0179】

上記組成物は、有効量（例えば、治療上有効な量）において投与され得る。ヒトおよび非ヒト被験体のインビボ処置のために、上記被験体は、本発明の１種以上の改変Ｗｎｔポリペプチドの有効量を含む組成物を通常投与される。「有効量」とは、所望の治療効果もしくは予防結果を達成するために有効な量（必要な投薬においておよび期間にわたって）に言及する。

【0180】

本発明のＷｎｔポリペプチド、もしくは上記を含む組成物の「治療上有効な量」は、上記個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびにＷｎｔポリペプチドが上記個体において所望の応答を誘発する能力のような要因に従って変動し得る。治療上有効な量はまた、Ｗｎｔポリペプチドの任意の毒性効果、有害効果に、治療上有益な効果が勝っている量である。用語「治療上有効な量」とは、哺乳動物（例えば、患者）における疾患もしくは傷害を「処置する」ために有効であるＷｎｔポリペプチドもしくはこれを含む組成物の量に言及する。

【0181】

「予防上有効な量」とは、所望の予防結果を達成するために有効な量（必要な投薬においておよび期間にわたって）に言及する。代表的には（しかし必ずしもそうとは限らない）、予防的用量は、疾患の前もしくは疾患の初期段階において被験体において使用されるので、上記予防上有効な量は、上記治療上有効な量より少ない。

【0182】

種々の実施形態において、本発明は、未処理の幹細胞集団と比較して、成体幹細胞（例えば、サテライト幹細胞）の分裂対称性を増大させるための方法を提供する。本明細書で開示される方法は、さらに、幹細胞分裂の速度を変化させることなく、対称性の幹細胞分裂を促進し得、幹細胞の集団の生存を促進し得る。上記方法は、インビトロ、エキソビボ、もしくはインビボで行われ得る。

【0183】

特定の実施形態において、１種以上の改変Ｗｎｔポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドを含む組成物は、必要な被験体にインビボで投与される。本明細書で使用される場合、用語「被験体」としては、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、オランウータン、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、もしくは他の非ヒト哺乳動物が挙げられる）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物である脊椎動物、例えば、トリ（例えば、ニワトリもしくはアヒル）もしくは魚類、および非哺乳動物である非脊椎動物が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、上記被験体は、ヒトである。疾患もしくは状態の処置が必要な被験体としては、このような疾患もしくは状態の症状を示す被験体（例えば、疾患もしくは状態を有するもの）、ならびに疾患もしくは状態を有するリスクのあるものが挙げられる。

【0184】

特定の実施形態において、サテライト幹細胞の集団をインビボ、エキソビボ、もしくはインビトロで増殖させるための方法は、上記幹細胞と、改変された非標準のＷｎｔポリペプチドもしくはこのような改変された非標準のＷｎｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の有効量とを接触させる工程を包含する。特定の実施形態において、上記非標準のＷｎｔは、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、およびＷｎｔ１１からなる群より選択される。好ましい実施形態において、上記Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔレセプターに結合し活性化する、Ｗｎｔ５ａもしくはＷｎｔ７ａポリペプチド、またはその活性なフラグメントもしくは改変体、またはそのオルソログ、パラログ、もしくはホモログである。

【0185】

いかなる特定の理論にも拘束されないが、組織中のサテライト細胞の数を増大させることは、上記組織の増強された再生能力を提供することであると考えられる。

【0186】

特定の実施形態において、幹細胞は、単離されるかもしくは維持され、エキソビボもしくはインビトロで増殖させられ、その後、必要な被験体に投与される。例えば、幹細胞は、エキソビボもしくはインビトロで培養および増殖させられ得、有効量の本発明のＷｎｔ組成物と接触させられ得、次いで、治療的幹細胞組成物として、当業者に公知の方法に従って、患者に投与され得る。特定の実施形態において、上記増殖させられた幹細胞集団は、治療的Ｗｎｔ組成物と組み合わせて、上記患者に投与される。

【0187】

上記幹細胞増殖を促進するための方法は、幹細胞のエキソビボもしくはインビトロでの増殖を刺激し、それによって、必要な被験体への移植もしくは投与に適した細胞集団を提供するために使用され得る。

【0188】

尿自制のいくつかの形態において、機能不全の筋肉は、例えば、上記筋への直接タンパク質注射によって、本発明の組成物もしくは方法で処置され得る。従って、一実施形態において、上記方法は、尿失禁を処置するために有用である。

【0189】

さらなる実施形態において、損傷したかもしくは機能不全の筋組織は、心筋であり得る。例えば、上記損傷した筋組織は、心血管事象（例えば、心筋梗塞、もしくは心不全）によって損傷を受けた心筋であり得る。ここで上記標的幹細胞は、心臓幹細胞である。本発明の別の局面によれば、哺乳動物において心臓幹細胞増殖もしくは心筋肥大を促進するための方法が提供され、上記方法は、本明細書に記載される組成物の有効量を、上記哺乳動物に投与する工程を包含する。

【0190】

さらに、移植物中で幹細胞を使用することに加えて、幹細胞、もしくは幹細胞を含む組成物は、研究ツールとして、および／または診断アッセイもしくはキットの一部として使用され得る。限定されることは望まないが、キットは、筋幹細胞、１種以上の改変Ｗｎｔポリペプチド、細胞培養もしくは増殖培地、細胞低温保存培地、１種以上の薬学的に受容可能な送達媒体、１種以上の改変Ｗｎｔポリヌクレオチド配列もしくは遺伝子構築物、細胞を必要な被験体に移植もしくは送達するための１種以上のデバイス、本明細書に記載されるように、上記細胞を使用、送達、移植、培養、低温保存する、またはこれらの任意の組み合わせのための説明書を含み得る。

【0191】

細胞増殖および／もしくは筋肥大のインジケーターは、定性的にもしくは定量的にモニターされ得、上記インジケーターとしては、以下が挙げられる：例えば、肉眼による形態、総細胞数、組織学、組織化学もしくは免疫組織化学、または特定の細胞マーカーの存在、非存在もしくは相対的レベルの変化。細胞マーカーの存在、非存在もしくは相対的レベルは、例えば、組織化学的技術、免疫学的技術、電気泳動、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリーなどによって分析され得る。あるいは、上記細胞マーカータンパク質をコードする遺伝子から発現されるｍＲＮＡの存在が、例えば、ＰＣＲ技術、ノーザンブロット分析、適切なオリゴヌクレオチドプローブの使用などを使用して、検出され得る。

【0192】

本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は、各個々の刊行物、特許出願もしくは発行された特許が、参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されているかのように、本明細書に参考として援用される。

【0193】

前述の発明は、理解の明瞭さを目的として図示および例示によって、いくぶん詳細に記載されてきたものの、本発明の教示に鑑みれば、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることは、当業者に容易に明らかである。以下の実施例は、例示としてのみ提供されるのであり、限定として提供されるのではない。当業者は、本質的に類似の結果を得るために、変更もしくは改変され得る種々の重要でないパラメーターを容易に認識する。

【実施例】

【0194】

（実施例１：ＷＮＴポリペプチドは、翻訳後修飾のための保存された部位を有する）
Ｗｎｔタンパク質は、細胞生存、増殖、分裂および移動に関与する分泌型シグナル伝達タンパク質である。Ｗｎｔは、胚発生および成体にける組織再生の間の効率的な組織パターン形成のために必要とされる。特定のＷｎｔタンパク質は、サテライト幹細胞の対称性増殖および筋線維肥大の刺激を介して骨格筋再生を駆動する。

【0195】

１９種のヒトＷｎｔが既に同定されており、相同性の不連続な領域に基づいてグループ分けされている。上記Ｗｎｔタンパク質は、グリコシル化および脂質付加の両方を含む、複雑な翻訳後修飾を有する。タンパク質グリコシル化は、効率的なタンパク質折りたたみおよび分泌に必要とされる。図１は、１９種全てのヒトＷｎｔポリペプチドのアラインメントである。グリコシル化もしくは脂質付加のいずれかによって修飾されるアミノ酸残基は、十分に保存されている（陰影を付けた残基を参照のこと）。さらに、これら同じ残基が、図２および図１１におけるＷｎｔ７ａポリペプチドのアラインメントから認められ得るように、種にわたって保存されている。脂質付加は、成熟した分泌型タンパク質を形質膜に固定する；上記Ｗｎｔをそのｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターへと効率的に局在化させることによって、効率的な活性に必要とされると歴史的に考えられてきた。これが理由で、Ｗｎｔは、完全に全身的な増殖因子／サイトカインではなく、オートクリンもしくは局所的パラクリンシグナル伝達分子であると考えられている。

【0196】

本明細書中他の箇所で記載されるように、タンパク質脂質付加は、全てのＷｎｔポリペプチドの活性についての必要条件ではない。野生型Ｗｎｔ（ｗｔＷｎｔ）配列（例えば、Ｗｎｔ７ａ、配列番号２）における脂質付加されるシステインもしくはセリン残基の選択的変異を、非脂質付加アラニン残基で置換した。Ｗｎｔ７ａの具体例において、７３位にあるシステイン残基および／もしくは２０６位にあるセリン残基を、アラニン残基へと変異させた。このことは、配列番号３〜５に列挙した配列を含むタンパク質を生じ、これらは、上記変異した残基において翻訳後脂質付加を欠いていた。

【0197】

（実施例２：非標準のＷｎｔは、筋芽細胞肥大を誘導する）
Ｗｎｔポリペプチドは、ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターおよび共レセプターを介してシグナル伝達して、いくつかの細胞内経路を刺激する。Ｗｎｔは、一般に、「標準の」もしくは「非標準の」シグナル伝達分子のいずれかとして分類され、ここで標準のシグナル伝達は、タンパク質β−カテニンの核局在化およびその後の標的遺伝子の発現を生じる。非標準のシグナル伝達は、一般に、β−カテニンの核局在化を直接的に伴わないＷｎｔの細胞機能（例えば、平面内細胞極性（ＰＣＰ）もしくはカルシウム／ＰＬＣ／ＰＫＣ経路の活性化）を含む。標準のおよび非標準の経路活性化のためのレセプターおよび共レセプターは、異なっている；上記標準のシグナル伝達経路は、上記共レセプターＬＲＰに対して依存性を示す。Ｗｎｔ７ａは、非標準のシグナル伝達分子であり、上記ＰＣＰ経路の活性化を介して筋肉サテライト幹細胞の対称性増殖を駆動することが示されてきた（Ｌｅ Ｇｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｗｎｔ７ａ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｌａｎａｒ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｄｒｉｖｅ ｔｈｅ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４， ５３５−５４７， ２００９）。より最近になって、Ｗｎｔ７ａは、潜在的に、上記ＰＩ３−Ｋｉｎａｓｅ／ｍＴＯＲ経路のＧプロテイン依存性活性化を介して、培養物中において筋芽細胞の肥大を駆動することが示された（Ｊｕｌｉａ ｖｏｎ Ｍａｌｔｚａｈｎ， Ｃ． Ｆｌｏｒｉａｎ ＢｅｎｔｚｉｎｇｅｒおよびＭｉｃｈａｅｌ Ａ． Ｒｕｄｎｉｃｋｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｄｅｃ． １１， ２０１１； ｅｐｕｂ）。

【0198】

いくつかのＷｎｔポリペプチドが筋芽細胞の肥大を誘導する能力を試験した。最初に試験した上記Ｗｎｔポリペプチドを、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから得、標準の（Ｗｎｔ３ａ）および非標準の（Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ７ａ）シグナル伝達ポリペプチドの代表とした。図３に示されるように、緩衝液コントロールもしくは標準のＷｎｔポリペプチドＷｎｔ３ａは、筋芽細胞肥大効果を有しなかった一方で、非標準のＷｎｔポリペプチド（Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ５ａ）はともに、インビトロで有意な筋芽細胞肥大効果を生じた。

【0199】

（方法）
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−１７７２）から得、ゼラチンコートした組織培養プレート上で、ＤＭＥＭ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ ＃１０−０１７−ＣＶ）培地（１０％ ５０ ＦＢＳを補充）中で増殖させた。上記細胞は、上記実験の間中、２０％コンフルエントに満たないままであった。９６ウェル組織培養プレートを、０．１％ ゼラチンで少なくとも１５分間にわたって室温（ＲＴ）においてコートし、２，０００細胞（０．２ｍＬの増殖培地中）を、上記９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。次いで、上記プレートを、２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。翌日、上記培地を吸引し、ＤＭＥＭ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ ＃１０−０１７−ＣＶ）（２％ ウマ血清（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７４）を補充）を有する０．２ｍＬの分化培地と交換した。分化の３日後、Ｗｎｔポリペプチド（ｒｈＷｎｔ７ａ ＃３００８−ＷＮ／ＣＦ、ｒｈＷｎｔ３ａ ＃５０３６−ＷＮ／ＣＦもしくはｒｈＷｎｔ５ａ ＃６４５−ＷＮ／ＣＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから））を、上記細胞培養物に添加し、さらに２日間にわたってインキュベートした。

【0200】

上記細胞を固定し、洗浄し、透過化し、ミオシンスロウおよびファストミオシン抗体（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｍ４２７６−．２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ ＃ Ｍ８４２１−．２ＭＬ）で染色した。細胞を可視化した；筋線維直径を、１回の実験あたり１００線維について計算した；３回の独立した生物学的複製物からのデータを、１処置群あたり合計３００のデータ点について集めた。各生物学的複製群のメジアン線維直径を、図３に示す。各群について上記３つの生物学的複製物にわたるメジアンの平均は、１７．５μｍ（培地単独に関して）、１８．８μｍ（Ｗｎｔ３ａ）、２７μｍ（Ｗｎｔ７ａ）、２４．６μｍ（Ｗｎｔ５ａ）、および２５．８μｍ（インスリン増殖因子（ＩＧＦ））であった。Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ５ａおよびＩＧＦで処置した細胞の肥大が増大したことは、培地コントロールもしくはＷｎｔ３ａ処置のいずれと比較しても、統計的に有意であった。

【0201】

（実施例３：改変Ｗｎｔ７ａポリペプチドの構築および発現）
非標準のＷｎｔは、筋肉サテライト幹細胞増殖および筋肥大を誘導する。両プロセスの誘導は、治療として大いに有益である（悪液質、筋萎縮症、および筋ジストロフィーの処置に関して）。治療剤としてのＷｎｔの使用は、特異的Ｗｎｔ活性およびレセプター特異性を維持することと同時に、効率的なスケールでの生成、治療的使用に適用可能な精製および処方を必要とする。Ｗｎｔポリペプチドの翻訳後脂質付加は、これら製造要件に対する潜在的な複雑さを表す。Ｗｎｔは、一般に、有効な活性に脂質を必要とすると考えられていた。脂質付加タンパク質は、高濃度での精製にとって難題となり、溶解度および安定性のために界面活性剤の処方の使用を必要とする。

【0202】

これら難題に対処するために、Ｗｎｔ７ａのいくつかの改変体を構築した。具体的には、翻訳後脂質付加の標的であるアミノ酸残基（Ｗｎｔ７ａにおけるＣｙｓ７３およびＳｅｒ２０６）を、以下の分子生物学技術を使用して、アラニン残基へと変異させた。上記野生型ヒトＷｎｔ７ａを、順方向プライマー ５’−ＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧＧ−３’（配列番号４１）および逆方向プライマー ５’−ＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＣ−３’（配列番号４２）を使用して、ＰＣＲ増幅した。上記ＰＣＲ生成物を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターの中の、ＢａｍＨＩ部位とＮｏｔ Ｉ部位との間に挿入した。改変Ｗｎｔ７ａ構築物を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位指向性変異誘発法を使用して調製した。ヒトＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ構築物（アミノ酸７３にあるシステインをアラニンで置換）を、ヒト野生型Ｗｎｔ７ａをテンプレートとして使用して、順方向プライマー ５’−ＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＣ−３’（配列番号４３）および逆方向プライマー ５’−ＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＴ−３’（配列番号４４）を用いて作製した。ヒトＷｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ構築物（アミノ酸２０６にあるセリンをアラニンで置換）を、ヒト野生型Ｗｎｔ７ａをテンプレートとして使用して、順方向プライマー ５’−ＧＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＴＧＧＣＡＧＧＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号４５）および逆方向プライマー ５’−ＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号４６）を使用して作製した。ヒトＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａ構築物を、個々のＣ７３Ａ構築物およびＳ２０６Ａ構築物についての試薬を使用して作製した。最終ベクターＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ精製キットを使用して調製した。上記ｐｃＤＮＡ３ベクター中のＷｎｔ ｃＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞において４８〜７２時間にわたって発現させた。Ｗｎｔポリペプチドを、その後、生成したＷｎｔ７ａの全ての改変体に対して特異的な抗体（抗体： Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｋ１５ ＃２６３６１）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって、ＨＥＫ２９３培養培地から精製した。精製した改変Ｗｎｔポリペプチドの活性を、その後の実施例において認められるように、インビトロ肥大アッセイを使用して試験した。作った全てのＷｎｔ７ａ構築物の模式図を、図４に示す（配列番号１、２、３、４、５、１２および１３もまた参照のこと）。

【0203】

（実施例４：異種シグナルペプチドは、ＷＮＴ分泌および生成を改善する）
ＨＥＫ２９３細胞における哺乳動物培養系からの不十分な分泌を示す（発現されるタンパク質の大部分は、細胞内に保持される）Ｗｎｔタンパク質の生成、分泌および溶解度を改善するために、Ｗｎｔ融合ポリペプチドを構築した（ここで、内因性Ｗｎｔ分泌シグナルペプチドを、ヒト免疫グロブリンＧκ鎖（ＩｇＧＫ）のシグナルペプチドもしくはヒトタンパク質ＣＤ３３のシグナルペプチドで置換した）。異種シグナルペプチドを含むＷｎｔ７ａ融合ポリペプチドの模式図を、図４に示す（配列番号１２および１３もまた参照のこと）。

【0204】

図５に示されるように、異種シグナルペプチドを有する上記Ｗｎｔ融合ポリペプチドは、ＨＥＫ２９３培養系における発現および分泌について比較した場合、天然シグナルペプチドを含むＷｎｔポリペプチドより有意に良好であった。

【0205】

（実施例５：改変Ｗｎｔポリペプチドは、界面活性剤の非存在下で処方され得、安定性および活性を保持する）
Ｗｎｔタンパク質の生成および処方は、伝統的には、これら脂質付加されたタンパク質の溶解度を保持するために、界面活性剤中での処方に依存してきた。Ｗｎｔポリペプチドの効率的な治療送達は、界面活性剤の非存在下での処方を必要とする。脂質付加部位なしのＷｎｔポリペプチドを、実施例３に記載されるように構築し、哺乳動物培養系において発現させ、上記培養培地から精製し、１％ ＣＨＡＰＳ界面活性剤中に処方した。ＨＰＬＣベースのアッセイを、上記Ｗｎｔポリペプチド処方物中のＣＨＡＰＳ界面活性剤の効率的な測定を可能にするために構成した。

【0206】

図６ａに示されるように、溶液中のＣＨＡＰＳ界面活性剤の力価測定は、上記アッセイの効率的な較正を可能にした。純粋なＷｎｔポリペプチドの種々の調製物を試験したところ、最終処方物は、ＰＢＳ中約１％ ＣＨＡＰＳ溶液であることが示された（図６ｂ）。ＰＢＳ単独に対する上記Ｗｎｔポリペプチド溶液のその後の透析は、上記界面活性剤を検出レベルより下に効率的に除去した（図６ｃ）。次いで、上記透析したポリペプチドを、上記ＣＨＡＰＳ界面活性剤の存在下もしくは非存在下のいずれかで、安定性および活性の両方について試験した。

【0207】

４℃もしくは３７℃のいずれかにおける上記タンパク質処方物の７日間にわたるインキュベーションから、天然の脂質付加部位を有するＷｎｔは、界面活性剤中で処方された場合に比較的安定であるが、界面活性剤の非存在下で処方された場合には不安定であることが示された。逆に、脂質付加部位を除去し、アラニンで置換した改変Ｗｎｔ（Ｃ７３Ａ、Ｓ２０６Ａ）は、天然の脂質付加タンパク質と比較した場合、界面活性剤の非存在下で改善された安定性を有することが認められた。

【0208】

界面活性剤ありもしくは界面活性剤なしで処方されたＷｎｔ改変体を、次いで、実施例２に記載されるように、Ｃ２Ｃ１２肥大アッセイにおいて活性について試験した。Ｗｎｔポリペプチドを、ＨＥＫ２９３哺乳動物培養系において生成し、アフィニティー精製した。上記Ｗｎｔポリペプチドを、１％ ＣＨＡＰＳ界面活性剤とともにＰＢＳ中に処方した。各Ｗｎｔポリペプチド改変体のアリコートを、透析を使用して界面活性剤を除去することによって再処方した。Ｗｎｔタンパク質は、等モル濃度を有し、上記Ｃ２Ｃ１２肥大アッセイに適用した。

【0209】

異種シグナルペプチドを使用して上記ＨＥＫ２９３培養系において生成したＷｎｔポリペプチドは、陽性コントロールである天然のＷｎｔ配列と比較した場合、それらの活性を保持した（図７）。さらに、Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３ＡおよびＳ２０６Ａ変異体は、特異的肥大活性を保持した（図７）。全ての改変Ｗｎｔは、界面活性剤中で処方した場合、活性を保持した。

【0210】

Ｗｎｔを、界面活性剤の非存在下で再処方した場合、上記アラニン置換された脂質付加部位を含む改変Ｗｎｔのみが活性を保持したのに対して、天然のＷｎｔは、筋芽細胞肥大活性を喪失した（図７）。従って、Ｗｎｔは、保存された脂質付加部位において特異的に変化し、生物学的活性を保持した。上記改変Ｗｎｔはまた、界面活性剤の非存在下で処方した場合に、活性を保持した。よって、本発明の改変Ｗｎｔポリペプチドは、上記天然のタンパク質の有用な治療バージョンの代表となる。

【0211】

（実施例６：改変Ｗｎｔ７ａは、筋肥大およびサテライト幹細胞増殖を増大させる）
脂質除去したＷｎｔ（例えば、１個以上の脂質付加部位を除去したＷｎｔ）がインビボで筋再生を刺激する能力を実証するために、上記改変Ｗｎｔ７ａを、ＣＭＶ−Ｗｎｔ７ａ発現プラスミドを３ヶ月齢のマウスのＴＡ筋へとエレクトロポレーションすることによって過剰発現させた。

【0212】

（インビボエレクトロポレーション）
ＬａｃＺ、野生型Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａをコードするプラスミド構築物を、インビボでマウスへとエレクトロポレーションした。０．９％ ＮａＣｌ中の４０μｇの各プラスミドＤＮＡ、もしくは０．９％ ＮａＣｌ（食塩水）を、麻酔したマウスの皮膚を介する切開によって露出した左ＴＡ筋へと直接注射した。注射の直後、電気刺激を、５ｍｍ針電極（ＢＴＸ）を使用して、固定持続時間２０ｍｓおよび間隔２００ｍｓで、６パルスにつき１００〜１５０ボルトのパルス発生器（ＥＣＭ ８３０， ＢＴＸ）によってＴＡへと直接印加した。実験側および対側のＴＡ筋を単離し、ＯＣＴ−１５％ スクロース（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に包埋し、冷窒素によって冷却したイソペンタンで凍結させた。

【0213】

（組織学および定量）
実験側および対側の筋肉の横断切片（８μｍ）を、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０）で切り出した。実験側の筋と対側の筋とを連続切片上で同レベルで比較するために、ＴＡ筋全体を切片化した（約４００枚の切片を、各ＴＡ筋から得た）。ＬａｃＺ反応に関しては、低温切片を、０．１％ グルタルアルデヒドで固定し、Ｘ−ｇａｌ溶液に曝した。Ｈ＆Ｅおよび免疫染色については、切片を４％ パラホルムアルデヒドで固定した。線維の計数に関しては、ラミニン染色した低温切片の写真を集めて、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２で計数した。筋線維直径の定量は、ＩｍａｇｅＪで行った。上記サテライト細胞計数を、再生領域（線維の全てが中央に局在した核を有した）において撮影したＰａｘ７およびラミニンの同時免疫染色した低温切片の写真上で、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで行った。「％ Ｐａｘ−７＋細胞」は、線維数あたりで、および対側の脚に対して正規化したラミナ下（ｓｕｂ−ｌａｍｉｎａｒ）Ｐａｘ７＋ｖｅ サテライト細胞の数を表す。

【0214】

（統計分析）
最小で２つおよび最大で５つの複製を、提示した実験に関して行った。データを、平均の標準誤差として表す。結果を、スチューデントＴ検定（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）を使用して統計的有意差について評価し、差異は、ｐ＜０．０５レベルにおいて統計的有意とみなした。

【0215】

（結果）
ＷＴ Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａ構築物のエレクトロポレーションは、ＬａｃＺコントロールプラスミドと比較して、マウスＴＡ筋の平均線維直径の統計的に有意な増大を生じた。さらに、上記Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａ構築物は、上記野生型Ｗｎｔ構築物のＷｎｔ生物学的活性を保持した。これは、上記Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａ構築物によって生じた上記ＴＡ筋の平均線維直径の増大が、上記野生型Ｗｎｔ構築物によって生じたものに匹敵したからである。これら結果を図１に示す。

【0216】

顕著なことに、図２は、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６ＡおよびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａ構築物でエレクトロポレーションしたＴＡ筋が、さらに、上記野生型Ｗｎｔ構築物でエレクトロポレーションしたＴＡ筋に対して、ＴＡ筋質量における匹敵する増大を示したことを示した。

【0217】

Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａが、サテライト幹細胞の増殖をインビボで同様に刺激したか否かを評価するために、再生した筋の中のサテライト細胞およびサテライト幹細胞の数を、上記改変Ｗｎｔ７ａ発現プラスミドのエレクトロポレーションの後に評価した。Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａの過剰発現は、エレクトロポレーションの３週間後において、切片上の筋線維あたりのＰａｘ７＋ サテライト細胞の数における統計的に有意な増大を生じた（Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、ｐ＝０．００１、ｎ＝４；Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、ｐ＝０．０１、ｎ＝２；Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａ、ｐ＝０．０５、ｎ＝２）。Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａの過剰発現によって誘導されたＰａｘ７ サテライト細胞の数における増大は、野生型Ｗｎｔ７ａによって誘導された増大に匹敵した。これらの結果を図３に示す。

【0218】

まとめると、図１〜３に示されたこれら結果は、より大きな線維の増大した数および筋肉の増大した質量の存在によって実証されるように、Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ
Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａの過剰発現が、筋肉再生を顕著に増強し、さらに、インビボでのサテライト幹細胞の数を増大させることを示す。さらに、これら結果は、Ｗｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ、Ｗｎｔ７ａ Ｓ２０６Ａ、およびＷｎｔ７ａ Ｃ７３Ａ／Ｓ２０６Ａによって生じた効果が、野生型Ｗｎｔ７ａによって生じた効果に匹敵したことを示す。

【0219】

一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲において開示される具体的実施形態に特許請求の範囲を限定するとは解釈されるべきではなく、このような権利が与えられる特許請求の範囲の等価物の全範囲とともに全ての考えられる実施形態を含むと解釈されるべきである。よって、特許請求の範囲は、開示によって限定されない。

【0220】

（実施例７：Ｗｎｔタンパク質は、免疫グロブリンＦＣ融合物として発現され得る）
免疫グロブリン融合タンパク質および／もしくはポリペプチドを使用して、上記Ｗｎｔポリペプチドの薬学的特性（例えば、それらのインビボでの循環半減期）を改善した。本発明のＷｎｔタンパク質を、図４に模式的に表されるように、アミノ末端のＦｃ融合ドメインもしくはカルボキシ末端のＦｃ融合ドメインのいずれかとともに哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３＋）中に構築した。天然のヒトＷｎｔ７ａのアミノ酸残基３１〜３４９、またはＣ７３Ａおよび／もしくはＳ２０６Ａ変異を有する同じものを、Ｎ末端融合物もしくはＣ末端融合物のいずれかとして、ＩｇＧκ分泌シグナルペプチドおよびヒトＩｇＧ１ｅ３−Ｆｃ１ドメインとインフレームでサブクローニングした。このＦｃドメインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の効果を低下させるために、天然のＩｇＧ１配列とは異なるアミノ酸変化を含んだ（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ｄｅｌｔａＧ２３６＋Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）。１７アミノ酸リンカー（ＧＴ（ＧＧＧＧＳ）３）を、上記Ｗｎｔタンパク質配列と上記Ｆｃ融合配列との間に付加して、立体障害を低下させ、Ｗｎｔ比活性の低下を防止した。これらベクターをＨＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトし、タンパク質発現を４８時間にわたって継続した。タンパク質発現および分泌を、ウェスタンブロットによってモニターした。これは、図１１ａおよび図１１ｂに認められ得る。予測分子量のインタクトな融合タンパク質は、抗Ｗｎｔ７ａ抗体もしくは抗Ｆｃ検出のいずれかで免疫検出した場合に認められた。効率的な分泌は、上記融合タンパク質について観察された。分泌型タンパク質を、その後、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

【図11B】

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]