特許 5975462 アブレーション装置及び３次元電子顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5975462

(24)【登録日】2016年7月29日

(45)【発行日】2016年8月23日

(54)【発明の名称】アブレーション装置及び３次元電子顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/28 20060101AFI20160809BHJP

   H01J 37/22 20060101ALI20160809BHJP

   H01J 37/28 20060101ALI20160809BHJP

   G02B 21/16 20060101ALI20160809BHJP

   G01N 23/225 20060101ALI20160809BHJP

【ＦＩ】

   G01N1/28 G

   H01J37/22 502A

   H01J37/22 502H

   G01N1/28 J

   G01N1/28 F

   H01J37/22 502L

   H01J37/28 B

   G02B21/16

   G01N23/225

【請求項の数】5

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2012-63526(P2012-63526)

(22)【出願日】2012年3月21日

(65)【公開番号】特開2013-195265(P2013-195265A)

(43)【公開日】2013年9月30日

【審査請求日】2014年12月17日

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】100099634

【弁理士】

【氏名又は名称】平井 安雄

(72)【発明者】

【氏名】金丸 孝昭

(72)【発明者】

【氏名】興 雄司

【審査官】 渡邊 吉喜

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−１０３７０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２８１９７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２０２２２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１８５８４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１４０１６９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０００−３２９６６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−３３８０３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０９３３１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−２３１１７２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ１／００−１／４４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料を支持する支持部と、
前記生体試料の切削面に垂直な方向に対して角度を付けた方向を含み、前記生体試料の切削面に対して複数の方向から、前記生体試料の切削面に深紫外光を照射する光源と、
を備え、
前記生体試料の切削面に垂直な方向に対する前記光源の照射方向の中に、５０度以上であり、８０度以下である角度となる方向を含むことを特徴とするアブレーション装置。

【請求項2】

前記請求項１に記載のアブレーション装置において、
前記支持部の支持方向を中心に当該支持部を回転させる駆動部を備え、
前記駆動部が前記支持部を回転させることにより、前記光源が前記生体試料の切削面に対して複数の方向から前記生体試料の切削面に深紫外光を照射することになることを特徴とするアブレーション装置。

【請求項3】

前記請求項１又は２に記載のアブレーション装置において、
前記深紫外光の波長が、１９３ｎｍ以下であることを特徴とするアブレーション装置。

【請求項4】

前記請求項１乃至３のいずれかに記載のアブレーション装置と、
前記生体試料の切削面を撮像する撮像手段と、
前記アブレーション装置及び撮像手段を交互に駆動させる制御部と、
前記撮像手段により撮像された画像を記憶する記憶部と、
前記記憶部に記憶された連続する複数の画像に基づいて合成像を構築する演算部と、
を備えることを特徴とする３次元電子顕微鏡。

【請求項5】

前記請求項４に記載の３次元電子顕微鏡において、
前記撮像手段が、
電子ビームを放出する電子銃と、
前記電子ビームを前記生体試料に集光する対物レンズと、
前記電子ビームを偏向して前記生体試料に対して走査する走査コイルと、
前記生体試料から放出された二次電子を検出し、当該検出した二次電子の光の強度を示す電気信号を出力する電子検出器と、
前記走査コイルを駆動させる走査信号を当該走査コイルに出力する走査回路と、
を備え、
前記演算部が、前記制御部からの制御信号、前記走査回路からの走査信号及び前記電子検出器からの電気信号値に基づき、前記生体試料のＳＥＭ像を各層毎にそれぞれ構築し、当該各ＳＥＭ像を重ね合わせた合成像である３次元のＳＥＭ像を構築することを特徴とする３次元電子顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この発明は、生きた細胞若しくは生体組織、凍結させた細胞若しくは生体組織、乾燥させた細胞若しくは生体組織、又は有機重合物質で包埋した細胞若しくは生体組織（以下、総称して「生体試料」と称す）をナノレベルで薄く切削（ablation：アブレーション）すると共に、生体試料の切削する表面（以下、「切削面」と称す）を平滑にするアブレーション装置に関し、特に、アブレーション装置により切削後の生体試料の切削面を撮像する３次元電子顕微鏡に関する。

【背景技術】

【0002】

生体の超高分解能の三次元解析は、医療分野やバイオ分野における重要なキーテクノロジーであるが、この解析には、生体試料をサブミクロンで切り出す超薄切片（Micro Tome）の作製技術が必須であり、一般的な切削刃（Ultra Micro Tome）や、超高分解能であるが切削面積が０．１ｍｍ四方と制限され、価格も高価なイオンビームによる切削技術が応用されている。

【0003】

これに対し、従来の細胞の加工方法は、細胞に光ファイバーを介してレーザー光を照射し、前記細胞の細胞壁及び/又は細胞膜あるいは細胞全体を、切断、除去又は開孔する（例えば、特許文献１参照）。

【0004】

また、従来のレーザー光による平滑面の洗浄方法は、洗浄しようとする非生体組成の平滑な洗浄面の少なくとも一部にレーザー光を照射して洗浄面上に付着した生体由来の汚染物質を完全除去する事を目的としたレーザー光による平滑面の洗浄方法において、洗浄面に達するレーザー光のビーム入射方向と、洗浄面法線とのなす角度が６０度以上（洗浄面とのなす角度が３０度以下）となるようにレーザー光を十分な光量で洗浄面に照射するようにした（例えば、特許文献２参照）。

【0005】

また、従来の細胞活性アッセイ装置は、大量の電磁放射が膜を貫通するのを防止する複数のオフアクシス孔を有する不透明膜に、ほぼオフアクシスのエキシマレーザー電磁放射により除去することにより孔を形成するか、あるいは、ほぼオフアクシスの蓄積粒子を衝突させ、エッチングすることにより孔を形成する（例えば、特許文献３参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００２−２８１９７０号公報

【特許文献2】特開２０００−２０２３８５号公報

【特許文献3】特表２００２−５３８８１６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

従来の細胞の加工方法は、細胞あるいは生組織を全面的に除去するか、あるいは非常に狭い領域に穿孔することをする事を目的とし、細胞あるいは生組織の切削面のみを平滑かつ均一深さで、変性や荒れを防ぎながら切削することができないという課題がある。
また、従来のレーザー光による平滑面の洗浄方法は、洗浄対象がハードディスク装置のディスクやシリコンウエハー等の高度な洗浄が要求される一方で非生体材質であり、細胞や脂肪及びタンパク質等を含む生体組織と比較して光による蒸発条件が著しく異なり（＝高エネルギーを必要とし）、レーザー光の照射条件は生体の全面除去を満たせば良いため、生体試料（生体組織）の表層のみを切削するという目的には単純に転用することができないという課題がある。
また、従来の細胞活性アッセイ装置は、複数のオフアクシス孔を有する不透明膜に対してレーザーライトのビームを一方向から照射して直線状の孔を生成するものであり、不透明膜の切削面を１mm四方という広範な面積にわたり平滑かつ均一に切削することができないという課題がある。

【0008】

この発明は、上述のような課題を解決するためになされたもので、生体試料をナノレベルで薄く切削することができ、生体試料の切削面を平滑にすることができるアブレーション装置を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

この発明に係るアブレーション装置においては、生体試料を支持する支持部と、生体試料の切削面に垂直な方向に対して角度を付けた方向を含み、生体試料の切削面に対して複数の方向から、生体試料の切削面に深紫外光を照射する光源と、を備え、生体試料の切削面に垂直な方向に対する光源の照射方向の中に、５０度以上であり、８０度以下である角度となる方向を含むものである。

【発明の効果】

【0010】

開示のアブレーション装置は、生体試料を生体組成を変性する事無しにナノレベルで薄く切削することができ、生体試料の切削面の平滑性を維持しながら、あるいはやや平滑性を欠いた切削面の平滑性を改善しつつ、連続的に掘削することができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】第１の実施形態に係るアブレーション装置の概略構成を示す概念図である。

【図2】（ａ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が０度におけるアブレーション前の第１の生体試料の全体（１ｍｍ角程度）を１００倍で撮像した全体画像であり、（ｂ）は図２（ａ）の白矢印で示す血液成分が集積した部位を３０００倍で撮像した拡大画像であり、（ｃ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が０度におけるアブレーション後の第１の生体試料の全体（１ｍｍ角程度）を１００倍で撮像した全体画像であり、（ｄ）は図２（ｃ）の白矢印で示す血液成分が集積した部位を３０００倍で撮像した拡大画像である。

【図3】光学系のレンズから第２の生体試料の切削面までの距離と照射強度との関係を示すグラフである。

【図4】（ａ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が８０度におけるアブレーション前の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像であり、（ｂ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が８０度におけるアブレーション後の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像である。

【図5】（ａ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が７０度におけるアブレーション前の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像であり、（ｂ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が７０度におけるアブレーション後の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像である。

【図6】（ａ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が６０度におけるアブレーション前の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像であり、（ｂ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が６０度におけるアブレーション後の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像である。

【図7】（ａ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が５０度におけるアブレーション前の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像であり、（ｂ）は支持部の中心軸に対する光源の照射方向のなす角が５０度におけるアブレーション後の第２の生体試料の一部を１０００倍で撮像した拡大画像である。

【図8】（ａ）は切削面に突起がある生体試料を説明するための説明図であり、（ｂ）は図８（ａ）に示す生体試料の切削面に対して垂直方向から深紫外光を照射した場合の生体試料の切削面を説明するための説明図であり、（ｃ）は図８（ａ）に示す生体試料の切削面に対して斜め方向から深紫外光を照射した場合の生体試料の切削面を説明するための説明図である。

【図9】第２の実施形態に係る３次元電子顕微鏡の概略構成を示す概念図である。

【図10】図９に示す３次元電子顕微鏡の処理動作を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

（本発明の第１の実施形態）
アブレーション装置１０は、図１に示すように、生体試料２００を支持する支持部１と、生体試料２００の切削面に垂直な方向に対して角度を付けた方向（斜め方向）を含み、生体試料２００の切削面に対して複数の方向から、生体試料２００の切削面に深紫外光を照射する光源２と、を備える。

【0013】

また、光源２が生体試料２００の切削面に対して複数の方向から生体試料２００の切削面に深紫外光を照射する機構としては、生体試料２００の切削面に照射するように一又は複数の光源２を固定すると共に、支持部１の支持方向（中心軸Ｏ）を中心に当該支持部１を回転させる駆動部４を備えることや、駆動部４を備えずに、生体試料２００の切削面に照射するように複数の光源２を固定することが考えられる。

【0014】

なお、本実施形態に係るアブレーション装置１０は、生体試料２００の切削面に照射するように一の光源２を固定すると共に、支持部１の支持方向（中心軸Ｏ）を中心に当該支持部１を回転させる駆動部４を備える。これにより、高価な光源２の個数を削減すると共に、生体試料２００の切削面に対して円周方向に沿った様々な方向から深紫外光を照射することができ、生体試料２００の切削面の平滑度を高めることができる。
また、本実施形態に係る駆動部４は、電気エネルギーを機械エネルギーに変換するモータである。

【0015】

なお、本実施形態に係る生体試料２００は、生体組織に対して、化学固定又は物理固定と、脱水及び包埋と、重合と、トリミング及び面出しとの各過程を経て生成される包埋試料であるが、有機重合物質で包埋されていない、生きた細胞若しくは生体組織、凍結させた細胞若しくは生体組織又は乾燥させた細胞若しくは生体組織などの無包埋試料でもよい。ここで、生きた細胞若しくは生体組織には、架橋の弱いパラフォルムアルデヒド（para form aldehyde：ＰＦＡ）又はアルコール若しくはアセトンなどで化学固定した、ほぼ生の状態（免疫染色用）も含まれる。
なお、生体試料２００は、トリミング過程において、包埋の際に余った樹脂をカプセルに流し込んで製作した略円柱状の台座２０１に、導電性両面テープ、導電性接着剤又は瞬間接着剤を用いて接着される。

【0016】

支持部１は、略円柱状であり、支持部１の中心軸Ｏと台座２０１の中心軸Ｏとを一致させた状態で台座２０１を挿入するための凹部を上面に有し、駆動部４であるモータのシャフト４ａの中心軸Ｏに支持部１の中心軸Ｏを一致させてネジ止めにより固定される。

【0017】

光源２は、深紫外光を放射するレーザーやランプである。
なお、深紫外光は、光子エネルギーが大きく、光子が生体試料２００の切削面近傍で吸収され（浅浅度吸収）、原子間の結合を切断して（光解離）、分子を分解及び消滅させる（光蒸発）。

【0018】

特に、深紫外光の波長が１９３ｎｍでは、光子がＣ−Ｎ、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｏ及びＣ＝Ｃ結合を切断するエネルギーを有し、タンパク質の基本単位であるペプチドを分解できると共に、エネルギーの余剰（光子エネルギーと結合エネルギーの差）が、並進エネルギーとなり、解離物の噴出（移動）に使用させる。このため、深紫外光の波長を１９３ｎｍ以下にすることは、多少の並進エネルギーの関与はあるものの、生体試料２００の光の熱化は起こらず、照射部位の熱の影響はほとんどないために好ましい。

【0019】

なお、本実施形態に係る光源２は、レーザー発振器として、発振波長が１９３ｎｍのＡｒＦ（フッ化アルゴン）エキシマレーザーを用いているが、波長が１９３ｎｍ以下の深紫外光を放射することができるのであれば、ＡｒＦエキシマレーザーに限られるものではない。

【0020】

また、光源２から出射された深紫外光は、生体試料２００に導くためのミラーや光ファイバー及び生体試料２００に集光するためのレンズなどから構成される光学系３を介して、生体試料２００の切削面に照射される。

【0021】

つぎに、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対して斜め方向から生体試料２００の切削面に深紫外光を照射することによる作用効果について、電子顕微鏡により撮像した画像を用いて説明する。なお、実験に使用した生体試料２００は、以下に説明する第１の生体試料２００及び第２の生体試料２００である。

【0022】

第１の生体試料２００は、固定液としてブアン液（ピクリン酸飽和水溶液：ホルマリン：氷酢酸＝１５：５：１）を用いた灌流固定法によってマウス胎仔の肝臓を保存して、エポキシ系樹脂であるＥＰＯＮ（登録商標）で包埋し、オスミウム（Ｏｓ）により染色して後固定したものに対して、トリミング及び面出しを行なったものである。

【0023】

また、第２の生体試料２００は、固定液としてブアン液を用いた灌流固定法によってラットの腎臓を保存して、エポキシ系樹脂であるＥＰＯＮ（登録商標）で包埋し、４種の重金属（オスミウム（Ｏｓ）、ウラン（Ｕ）、鉛（Ｐｂ）、白金（Ｐｔ））により４重染色して後固定したものに対して、トリミング及び面出しを行なったものである。
なお、第２の生体試料２００は、電子顕微鏡で撮像した画像のコントラストの向上を図るために、４種の重金属により複合染色を行なったものである。
また、第２の生体試料２００は、切削面の平坦化の確認を容易にするため、ガラスナイフ又はダイヤモンドナイフで切削した場合に生じるチャター（傷）を切削面に残したものである。

【0024】

また、実験に使用した光源２は、ＡｒＦエキシマレーザーであり、照射条件として、パルス繰返周波数が１Ｈｚであり、印加電圧が３０．０ｋＶである。
また、実験に使用した電子顕微鏡は、株式会社日立ハイテクノロジーズ製の卓上顕微鏡（Miniscope（登録商標）、ＴＭ３０００）である。

【0025】

まず、第１の生体試料２００を用いて、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが０度の場合、すなわち、第１の生体試料２００の切削面に対して垂直方向から深紫外光を照射した場合（第１の実験）について、図２を用いて説明する。

【0026】

この第１の実験では、アブレーション前として、第１の生体試料２００を電子顕微鏡にセットし、第１の生体試料２００の切削面を反射電子線像により撮像した（図２（ａ）、図２（ｂ））。
そして、本実施形態に係るアブレーション装置１０に第１の生体試料２００をセットし、大気中において、第１の生体試料２００の切削面全体に対して垂直方向から深紫外光を５分間（照射回数：３００ショット）照射した。
そして、アブレーション後として、深紫外光を照射した第１の生体試料２００を電子顕微鏡にセットし、アブレーション前の撮像範囲と同一の範囲について、第１の生体試料２００の切削面を反射電子線像により撮像した（図２（ｃ）、図２（ｄ））。

【0027】

アブレーション後の図２（ｄ）に示す画像は、アブレーション前の図２（ｂ）に示す画像と比較すると、生体組織の周縁がエッジ効果で白く光っており、生体組織を包埋したＥＰＯＮ（登録商標）だけが除去されて生体組織が浮き出ていることがわかる。すなわち、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが０度の場合には、生体試料２００の切削面が平滑に切削できていないことがわかる。

【0028】

これは、切削面に突起がある生体試料２００（図８（ａ））において、図８（ｂ）に示すように、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが０度の場合、すなわち、生体試料２００の切削面に対して垂直方向から深紫外光を照射した場合に、平坦な部分が先に削れて、高い部分（突起）が相対的に残るからである。

【0029】

なお、図２（ａ）及び図２（ｃ）に示す白矢印は、血液成分が集積しているところを示しており、図２（ａ）及び図２（ｃ）は同じ試料であることがわかる。また、第１の実験でのアブレーションは、大気中において行なっているため、図２（ｃ）の黒矢印に示すように、真空中でのアブレーションでは出現しないと考えられる「デブリ」が見られ、第１の生体試料２００の切削面に複数のデブリがある。

【0030】

つぎに、第２の生体試料２００を用いて、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが０度より大きく９０度より小さい場合、すなわち、第２の生体試料２００の切削面に対して斜め方向から深紫外光を照射した場合（第２の実験）について、図３乃至図７を用いて説明する。

【0031】

なお、第２の実験では、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが、８０度、７０度、６０度及び５０度の場合について実験しており、各角度に対応する第２の生体試料２００（８０度：試料２００ａ、７０度：試料２００ｂ、６０度：試料２００ｃ、５０度：試料２００ｄ）をそれぞれ準備した。
また、第２の実験では、第２の生体試料２００の切削面における各角度のＡｒＦエキシマレーザーのエネルギー密度（fluence：フルエンス）を一定に保つために、事前準備として、直径１ｍｍのピンホールを開けた金属板を用いて、光学系３のレンズから第２の生体試料２００の切削面までの距離と照射強度とを測定し、測定結果（下表１、図３）により、フルエンスを２５μＪ／ｃｍ^２に決定した。

【0032】

【表1】

【0033】

この第２の実験では、アブレーション前として、第２の生体試料２００（試料２００ａ、試料２００ｂ、試料２００ｃ、試料２００ｄ）を電子顕微鏡にそれぞれセットし、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが８０度、７０度、６０度及び５０度の場合について、第２の生体試料２００の切削面を反射電子線像によりそれぞれ撮像した（図４（ａ）、図５（ａ）、図６（ａ）、図７（ａ））。

【0034】

そして、本実施形態に係るアブレーション装置１０に第２の生体試料２００（試料２００ａ、試料２００ｂ、試料２００ｃ、試料２００ｄ）をそれぞれセットし、大気中において、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが８０度、７０度、６０度及び５０度の場合について、第２の生体試料２００の切削面全体に深紫外光を５分間（照射回数：３００ショット）照射した。

【0035】

そして、アブレーション後として、深紫外光を照射した第２の生体試料２００（試料２００ａ、試料２００ｂ、試料２００ｃ、試料２００ｄ）を電子顕微鏡にそれぞれセットし、アブレーション前の撮像範囲と同一の範囲について、第２の生体試料２００の切削面を反射電子線像によりそれぞれ撮像した（図４（ｂ）、図５（ｂ）、図６（ｂ）、図７（ｂ））。

【0036】

アブレーション後の図４（ｂ）、図５（ｂ）、図６（ｂ）及び図７（ｂ）に示す画像は、アブレーション前の図４（ａ）、図５（ａ）、図６（ａ）及び図７（ａ）に示す画像とそれぞれ比較すると、生体組織の周縁が白く光っておらず、生体組織を包埋したＥＰＯＮ（登録商標）と共に生体組織が切削できていることがわかる。

【0037】

これは、切削面に突起がある生体試料２００（図８（ａ））において、図８（ｃ）に示すように、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが０度より大きく９０度より小さい場合、すなわち、生体試料２００の切削面に対して斜め方向から深紫外光を照射した場合に、高い部分（突起）が先に削れて、生体試料２００の切削面が総体的に平坦になるからである。

【0038】

特に、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが８０度及び５０度の場合においては、図４（ｂ）及び図７（ｂ）の黒矢印で示すように、ナイフによるチャターがアブレーション後も残っているが、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θが７０度及び６０度の場合においては、図５（ｂ）及び図６（ｂ）の黒矢印で示すように、ナイフによるチャターがアブレーション後に消えており、生体試料２００の切削面の平滑化が行なわれていることがわかる。

【0039】

このため、生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対する光源２の照射方向のなす角θは、０度より大きい（かつ９０度より小さい）ことが好ましく、６０度以上であり、７０度以下であることがより好ましい。なお、生体試料２００の切削面の平滑度は、生体試料２００に対する深紫外光の照射強度を高めることや深紫外光の照射時間を長くすることにより向上することができると考えられ、なす角θの許容範囲を広く予測して、例えば、５０度以上であり、８０度以下であってもよい。
また、本実施形態に係るアブレーション装置１０は、生体試料２００の切削面に垂直な方向に対して斜め方向だけでなく、生体試料２００の切削面に垂直な方向からも併せて、生体試料２００の切削面に深紫外光を照射することにより、斜め照射による生体試料２００の切削面の平滑化と、垂直照射による照射強度及び切削速度の向上とを図ることができる。

【0040】

以上のように、本実施系形態に係るアブレーション装置１０は、生体試料２００をナノレベルで薄く切削することができ、生体試料２００の切削面を平滑にすることができるという作用効果を奏する。また、本実施系形態に係るアブレーション装置１０は、１００回から数万回の切削を繰り返し行なった場合でも、生体試料２００の切削面の平滑性を大きく損なわずに切削を行なう事が可能である。

【0041】

（本発明の第２の実施形態）
図９は第２の実施形態に係る３次元電子顕微鏡の概略構成を示す概念図である。図１０は図９に示す３次元電子顕微鏡の処理動作を示すフローチャートである。図９及び図１０において、図１と同じ符号は、同一または相当部分を示し、その説明を省略する。

【0042】

本実施形態に係る３次元電子顕微鏡１００は、第１の実施形態に係るアブレーション装置１０と、生体試料２００の切削面を撮像する撮像手段と、アブレーション装置１０及び撮像手段を交互に駆動させる制御部と、撮像手段により撮像された画像を記憶する記憶部と、記憶部に記憶された連続する複数の画像に基づいて合成像を構築する演算部と、を備える。
なお、以下の説明においては、生体試料２００の切削面を撮像する撮像手段として、走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：以下、「ＳＥＭ」と称す）を例に挙げて説明する。

【0043】

３次元電子顕微鏡１００は、図９に示すように、大別すると、第１の実施形態に係るアブレーション装置１０と、ＳＥＭに相当する電子顕微鏡部２０と、コンピュータ３０とからなる。

【0044】

電子顕微鏡部２０は、荷電粒子ビームとして電子ビーム２１ａを放出する電子銃２１と、後述する対物レンズ２４に到達する電子の数（プローブ電流）と細い電子ビーム２１ａ（電子プローブ）の太さとを調整する集束レンズ２２と、電子ビーム２１ａを偏向して生体試料２００に対して走査する走査コイル２３と、電子ビーム２１ａを生体試料２００に集光する対物レンズ２４と、を備える。
また、電子顕微鏡部２０は、生体試料２００から放出された二次電子を検出し、当該検出した二次電子の光の強度を示す電気信号を出力する電子検出器２５と、電子検出器２５からの電気信号を増幅する増幅器２６と、増幅器２６からのアナログ信号をデジタル信号に変換してコンピュータ３０に出力するＡ／Ｄ変換回路２７と、走査コイル２３を駆動させる走査信号を当該走査コイル２３に出力して電子ビーム２１ａを走査する走査回路２８と、を備える。

【0045】

また、電子顕微鏡部２０は、電子銃２１、集束レンズ２２、走査コイル２３及び対物レンズ２４を内設する本体上部を構成する鏡筒２９ａと、生体試料２００及び電子検出器２５並びにアブレーション装置１０を内設する本体下部を構成する試料室２９ｂと、を備える。なお、鏡筒２９ａ及び試料室２９ｂ内部は真空である。

【0046】

コンピュータ３０は、３次元電子顕微鏡１００の使用者が生体試料２００の厚さ方向（支持方向）における撮像範囲（アブレーション装置１０による切削範囲）ｚ等を入力するためのキーボードやマウス等の入力部３１と、入力部３１からの入力信号に基づき、アブレーション装置１０の光源２、光学系３及び駆動部４、電子顕微鏡部２０の電子銃２１及び走査回路２８、並びに、演算部３３に制御信号を出力する制御部３２と、を備える。
また、コンピュータ３０は、制御部３２からの制御信号、走査回路２８からの走査信号及び電子検出器２５からの電気信号値に基づき、生体試料２００のＳＥＭ像を各層毎にそれぞれ構築し、当該各ＳＥＭ像を重ね合わせた合成像である３次元のＳＥＭ像を構築する演算部３３と、演算部３３による演算結果を記憶する記憶部３４と、演算部３３によって構築された合成像を表示する表示部３５と、を備える。

【0047】

つぎに、３次元電子顕微鏡１００の処理動作について、図１０を用いて説明する。
まず、使用者は、電子顕微鏡部２０の試料室２９ｂ内のアブレーション装置１０に生体試料２００をセットする。
そして、使用者は、コンピュータ３０の入力部３１を用いて、生体試料２００の撮像範囲（切削範囲）ｚを入力して設定する（ステップＳ１）。

【0048】

電子顕微鏡部２０は、コンピュータ３０の制御部３２からの制御信号に基づき、電子銃２１から生体試料２００に向けて電子ビーム２１ａを放出し、集束レンズ２２及び対物レンズ２４により生体試料２００上に電子ビーム２１ａを集束して、電子ビーム２１ａを照射する。この場合に、電子顕微鏡部２０の走査回路２８は、コンピュータ３０の制御部３２からの制御信号に基づき、電子顕微鏡部２０の走査コイル２３を駆動させる走査信号を当該走査コイル２３に出力し、走査コイル２３により電子ビーム２１ａを偏向し、生体試料２００の切削面に対して電子ビーム２１ａを走査する（ステップＳ２）。

【0049】

電子ビーム２１ａが照射された生体試料２００から放出する二次電子は、電子検出器２５により検出される。すなわち、電子顕微鏡部２０は、電子ビーム２１ａの走査時における生体試料２００からの二次電子を電子検出器２５の蛍光物質に衝突させて発光させ、その光を再び電子に変換して電気信号にする。そして、電子顕微鏡部２０は、変換した電気信号を増幅器２６により増幅し、Ａ／Ｄ変換回路２７によりアナログ信号をデジタル信号に変換して、コンピュータ３０の演算部３３に出力する（ステップＳ２）。この場合に、電子顕微鏡部２０の走査回路２８は、コンピュータ３０の演算部３３に走査信号（各焦点位置の情報）を出力する。

【0050】

また、コンピュータ３０の演算部３３は、電子顕微鏡部２０の走査回路２８からの走査信号（各焦点位置の情報）及び電子顕微鏡部２０の電子検出器２５からの電気信号値（各焦点位置に対応する電気信号値）に基づいて生体試料２００のＳＥＭ像を構築する（ステップＳ３）。また、コンピュータ３０の演算部３３は、構築したＳＥＭ像を記憶部３４に記憶させる。

【0051】

そして、コンピュータ３０の演算部３３は、撮像範囲（切削範囲）が設定値ｚに到達したか否かを判断する（ステップＳ４）。

【0052】

ステップＳ４において、撮像範囲（切削範囲）が設定値ｚに到達していないと判断した場合に、コンピュータ３０の演算部３３は、制御部３２に制御信号を出力する。
アブレーション装置１０の光源２及び光学系３並びに駆動部４は、コンピュータ３０の制御部３２からの制御信号に基づき、駆動部４が生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）を中心に当該支持部１を回転させ、光源２及び光学系３が生体試料２００の切削面に垂直な方向（中心軸Ｏ）に対して斜め方向から生体試料２００の切削面に深紫外光を所定の時間（例えば、５分間）だけ照射し（ステップＳ５）、ステップＳ２に戻る。

【0053】

また、ステップＳ４において、撮像範囲（切削範囲）が設定値ｚに到達していると判断した場合に、コンピュータ３０の演算部３３は、ステップＳ３により各層毎に構築した各ＳＥＭ像を、記憶部３４から読み出し、３次元空間に配置して重ね合わせ、合成像である３次元のＳＥＭ像を構築する（ステップＳ６）。

【0054】

そして、コンピュータ３０の演算部３３は、構築した合成像を表示部３５に出力して表示することで（ステップＳ７）、生体試料２００の撮像を終了する。

【0055】

以上のように、本実施形態に係る３次元電子顕微鏡１００は、ＳＥＭにアブレーション装置１０を組み合わせた装置であり、深紫外光による光解離及び光蒸発作用により生体試料２００の切削面をｎｍ単位（５ｎｍ厚以下）で薄く切削するステップと、ＳＥＭにより生体試料２００の切削面を撮像して画像データを保存するステップと、を交互に繰返す。そして、本実施形態に係る３次元電子顕微鏡１００は、保存した連続する複数の画像データを積層することにより、生体試料２００の立体再構築を広範囲（１００ｃｍ^２程度）かつ高分解能で可能にすることができるという作用効果を奏する。

【0056】

特に、集束イオンビーム（Focusing Ion Beam：ＦＩＢ）とＳＥＭとを一つの装置にしたＦＩＢ−ＳＥＭは、分解能が十分に高いものの、生体試料２００の断面を出すための切削時間が１枚当たり数分掛かり、観察可能な面積も１００ｎｍ角以下に限定され、観察できる分解能のダイナミックレンジが狭いという問題がある。
これに対し、第２の実施形態に係る３次元電子顕微鏡１００は、生体試料２００の厚さ方向の分解能がＦＩＢ−ＳＥＭに匹敵しつつ、比較的定真空で実施することができ、ＦＩＢ−ＳＥＭと比較して非常に低コストである。
また、第２の実施形態に係る３次元電子顕微鏡１００は、深紫外光の均一な強度照射により、生体試料２００の広い面出し（１ｃｍ角以上）を可能にして、ＦＩＢ−ＳＥＭの観察可能な面積の制限を取り除くことができる。
また、第２の実施形態に係る３次元電子顕微鏡１００は、深紫外光の照射により、生体試料２００の切削面を高速に切削することができ、画像データの取得時間の短縮を図ることができるという作用効果を奏する。

【0057】

（本発明のその他の実施形態）
なお、第２の実施形態においては、第１の実施形態に係るアブレーション装置１０を、ＳＥＭに組み合わせた応用例について説明したが、この応用例に限られるものではなく、以下の応用例も考えられる。

【0058】

第１の応用例としては、第２の実施形態に係る３次元電子顕微鏡１００の電子顕微鏡部２０の代わりに、蛍光顕微鏡（ＦＬＭ：Fluorescent Light. Microscope）とＳＥＭとが融合した顕微鏡（蛍光観察走査型電子顕微鏡：ＦＬ−ＳＥＭ）を、第１の実施形態に係るアブレーション装置１０に組み合わせる（以下、「３次元蛍光観察ＳＥＭ」と称す）。
この３次元蛍光観察ＳＥＭは、免疫蛍光染色にて標識した生体組織をTechnovit（登録商標）８０００のような無蛍光プラスチック樹脂で包埋した生体試料２００に対して、蛍光染色された生体組織の蛍光像とＳＥＭ像とが融合した３次元画像を取得することができ、生体組織の機能を立体的に把握することが可能になる。

【0059】

特に、従来は、蛍光標識された生体試料２００の３次元化は、共焦点レーザー顕微鏡にしかできない機能であったが、この共焦点レーザー顕微鏡は、特殊な機能を付加させた装置（高分解能タイプ）でなければ、高分解能領域の細胞やオルガネラ（細胞小器官）の同定を必要とする生体試料２００の観察が不可能であった。
これに対し、３次元蛍光観察ＳＥＭは、蛍光部位の表示に対してより高分解能なＳＥＭ像による補助観察機能を追加しており、蛍光像及びＳＥＭ像の２つの合成像により、一般的な光学顕微鏡単体の分解能を超えた領域の立体再構築を行なうことができ、細胞や膜の詳細な同定が可能になると共に、標識した生体組織中のより高分解能な３次元における細胞間のネットワーク等の研究も可能になる。
また、３次元蛍光観察ＳＥＭは、生体試料２００の厚さ方向（切削の深さ方向）であるZ軸方向へのアブレーション装置１０による切削に追従して、Ｚ軸方向の蛍光像を表示することができ、従来の共焦点レーザー顕微鏡におけるＺ軸方向への表示制限を無くすことができる。

【0060】

第２の応用例として、第１の実施形態に係るアブレーション装置１０は、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope：ＴＥＭ）用グリッドをトリミング前の包埋試料の厚切片に複数貼り付け、アブレーション装置１０に包埋試料を裏返してセットし、その包埋試料の切削面を切削することにより、ウルトラミクロトームを用いることなく、同時に多量の超薄切片（５０ｎｍ厚程度）を作製することができる。

【0061】

特に、従来の超薄切片法に基づく生体試料２００の作製は、電子顕微鏡用の連続した切片を作製することができる高い技能を有する技術者の教育が必要であると共に、消耗品のダイヤモンドナイフ等の周辺装置等が高額な商品である。このため、従来の超薄切片法に基づく生体試料２００の作製は、作業の困難さから研究機関の利用に事実上制限されており、実施にかかる時間やコストなどが問題となっていた。
これに対し、第１の実施形態に係るアブレーション装置１０は、厚切片の包埋試料の超薄切片化が自動化でき、高額な消耗品等が不要になることで、電子顕微鏡用のＴＥＭ試料の作製における障壁が取り除かれ、安い製作費での超薄切片の作製が可能になる。

【符号の説明】

【0062】

１ 支持部
２ 光源
３ 光学系
４ 駆動部
４ａ シャフト
１０ アブレーション装置
２０ 電子顕微鏡部
２１ 電子銃
２１ａ 電子ビーム
２２ 集束レンズ
２３ 走査コイル
２４ 対物レンズ
２５ 電子検出器
２６ 増幅器
２７ Ａ／Ｄ変換回路
２８ 走査回路
２９ａ 鏡筒
２９ｂ 試料室
３０ コンピュータ
３１ 入力部
３２ 制御部
３３ 演算部
３４ 記憶部
３５ 表示部
１００ ３次元電子顕微鏡
２００ 生体試料，第１の生体試料，第２の生体試料
２００ａ 試料
２００ｂ 試料
２００ｃ 試料
２００ｄ 試料
２０１ 台座

【図1】

【図9】

【図10】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】