特許 5976922 二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター、癌細胞増殖抑制剤、及び医薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5976922

(24)【登録日】2016年7月29日

(45)【発行日】2016年8月24日

(54)【発明の名称】二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター、癌細胞増殖抑制剤、及び医薬

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20160817BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160817BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20160817BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160817BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 GZNA

   A61K48/00

   A61K31/713

   A61P35/00

【請求項の数】7

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2015-506816(P2015-506816)

(86)(22)【出願日】2014年3月19日

(86)【国際出願番号】JP2014057471

(87)【国際公開番号】WO2014148529

(87)【国際公開日】20140925

【審査請求日】2015年9月29日

(31)【優先権主張番号】特願2013-57785(P2013-57785)

(32)【優先日】2013年3月21日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504013775

【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】井上 聡

(72)【発明者】

【氏名】池田 和博

(72)【発明者】

【氏名】高山 賢一

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−００５４７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０７８４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Mol. Endocrinol.，２０１２年 ５月，Vol. 26, No. 5，pp. 748-761

【文献】 J. Cell Sci.，２００９年 ８月，Vol. 122，pp. 3190-3198

【文献】 Clin. Cancer Res.，２０１２年，Vol. 18，pp. 5617-5627

【文献】 Expert Opin. Ther. Targets，２０１０年，Vol. 14, No. 12，pp. 1343-1354

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＡＣＣ２遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：２の標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、
を含むことを特徴とする二本鎖核酸分子。

【請求項2】

センス鎖が、配列番号：２の標的配列に対応するヌクレオチド配列からなるセンス鎖である請求項１に記載の二本鎖核酸分子。

【請求項3】

ｓｉＲＮＡである請求項１から２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。

【請求項4】

請求項１から３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。

【請求項5】

請求項４に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。

【請求項6】

請求項１から３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、請求項４に記載のＤＮＡ、及び請求項５に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。

【請求項7】

癌を予防乃至治療するための医薬であって、請求項６に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌の予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子を含むＤＮＡ及びベクター、該二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含む癌細胞増殖抑制剤、並びに該癌細胞増殖抑制剤を含む医薬に関する。

【背景技術】

【0002】

癌の中で、前立腺癌は、欧米において男性が罹患する最も頻度の高い癌であることが知られている。日本においても、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、前立腺癌の患者数は飛躍的に増加している。
その治療技術として、臨床的には前立腺摘出術をはじめとする外科的治療、抗癌剤による化学療法、及び放射線治療が広く応用されている。前記治療では、外科的治療が第一選択であるが、既に癌が進行した状態で診断されたときや、外科手術後の再発などにより手術困難な場合には、外科的治療以外の治療法が選択される。
一般に、前立腺癌の増殖はアンドロゲンにより刺激される。そのため、前記外科的治療以外の治療法として、アンドロゲンの産生、機能を阻害するホルモン療法がしばしば行われる。前記ホルモン療法の効果は極めてよいものの、治療開始から数年以内にアンドロゲン非依存性前立腺癌として再燃するという問題がある。そのため、アンドロゲン非依存性前立腺癌の制御が最も重要な課題となっている。

【0003】

アンドロゲン依存性癌から非依存性癌への進行の詳細な分子メカニズムは未だ明らかでないが、アンドロゲン受容体（以下、「ＡＲ」と称することがある）の関与が示唆されている。即ち、アンドロゲン非依存性癌は、ＡＲの変異又は増幅により、超低濃度のアンドロゲン、抗アンドロゲン剤、その他のステロイドホルモンなどに感受性を示すことが示唆されている。
再燃した前立腺癌においては、ＡＲ拮抗薬による前立腺癌の治療が難航し、又は無効となる。そこで、ＡＲに対して薬剤によりリガンドの結合を阻害する、又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）技術を用いてＡＲの発現を抑制する方法が研究されている。しかしながら、ＡＲを標的とするだけでは限界があり、臨床的に十分なものは未だ開発されておらず、より効率的にＡＲを抑制する方法の開発が求められている。

【0004】

これまでに、アンドロゲン応答遺伝子であるＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ａｃｉｄｉｃ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＴＡＣＣ２）遺伝子が、ＡＲの下流遺伝子として機能しており、術後の再発、前立腺癌の予後に関与している因子であることが示されている。具体的には、前記ＴＡＣＣ２遺伝子は、細胞周期の分裂（Ｍｉｔｏｓｉｓ）期において微小管の安定性に関わり細胞周期を正に制御する。それにより、前記ＴＡＣＣ２遺伝子は、前立腺癌のホルモン依存性の増殖に関わっていること、及びＡＲの過敏性を獲得した細胞モデルにおいて高発現し、ホルモン枯渇性の増殖能獲得に関与していることが示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。

【0005】

また、同じくアンドロゲン応答遺伝子である１４−３−３ζ（以下、「１４−３−３ ｚｅｔａ」と称することがある）遺伝子が、ＡＲの下流遺伝子として機能しており、かつ前立腺癌の発症に伴い発現が亢進している因子であることが示されている。具体的には、前記１４−３−３ζ遺伝子は、細胞質中において抗アポトーシス効果を有しており、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路の活性化などにより癌の増殖を促進し、また、核内においてＡＲと結合しアンドロゲンのシグナルを正に制御することにより、前立腺癌のホルモン依存性の増殖に関わることが示されている（例えば、非特許文献２参照）。

【0006】

このような状況下、ＡＲの拮抗薬による治療が難航し、又は無効となった癌をも治療することができる優れた治療方法の速やかな開発が強く求められているのが現状である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｔａｋａｙａｍａ Ｋ， Ｈｏｒｉｅ−Ｉｎｏｕｅ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ， Ｕｒａｎｏ Ｔ， Ｉｋｅｄａ Ｋ， Ｆｕｊｉｍｕｒａ Ｔ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ， Ｈｏｍｍａ Ｙ， Ｏｕｃｈｉ Ｙ， Ｉｎｏｕｅ Ｓ．、ＴＡＣＣ２ ｉｓ ａｎ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２０１２ Ｍａｙ；２６（５）：７４８−６１．

【非特許文献2】Ｍｕｒａｔａ Ｔ， Ｔａｋａｙａｍａ Ｋ， Ｕｒａｎｏ Ｔ， Ｆｕｊｉｍｕｒａ Ｔ， Ａｓｈｉｋａｒｉ Ｄ， Ｏｂｉｎａｔａ Ｄ， Ｈｏｒｉｅ−Ｉｎｏｕｅ Ｋ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ， Ｏｕｃｈｉ Ｙ， Ｈｏｍｍａ Ｙ， Ｉｎｏｕｅ Ｓ、１４−３−３ζ， ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｄｒｏｇｅｎ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｇｅｎｅ， Ｉｓ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５， ２０１２ １８：２０ ５６１７−５６２７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかを標的として、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ、癌の予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子を含むＤＮＡ及びベクター、該二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含む癌細胞増殖抑制剤、並びに該癌細胞増殖抑制剤を含む医薬を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：１８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、
を含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜３＞ 前記＜２＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子、前記＜２＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜５＞ 癌細胞に、前記＜４＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法である。
＜６＞ 癌を予防乃至治療するための医薬であって、前記＜４＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬である。
＜７＞ 個体に、前記＜６＞に記載の医薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法である。

【発明の効果】

【0010】

本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかを標的として、これらの遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ、癌の予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子を含むＤＮＡ及びベクター、該二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含む癌細胞増殖抑制剤、並びに該癌細胞増殖抑制剤を含む医薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】図１Ａは、試験例１−１−１の結果を示すグラフである。

【図1B】図１Ｂは、試験例１−１−２の結果を示すグラフである。

【図2】図２は、試験例１−２の結果を示すグラフである。

【図3】図３は、試験例２−１の結果を示す図である。

【図4】図４は、試験例２−２の結果を示す図である。

【図5A】図５Ａは、試験例３−１−１の結果を示すグラフである。

【図5B】図５Ｂは、試験例３−１−２の結果を示すグラフである。

【図6】図６は、試験例３−２の結果を示すグラフである。

【図7A】図７Ａは、試験例４−１の結果を示す写真である。

【図7B】図７Ｂは、試験例４−１の結果を示すグラフである。

【図8A】図８Ａは、試験例４−２の結果を示す写真である。

【図8B】図８Ｂは、試験例４−２の結果を示すグラフである。

【図9】図９は、試験例５−１の結果を示すグラフである。

【図10】図１０は、試験例５−２の結果を示すグラフである。

【図11】図１１は、試験例６−１の結果を示すグラフである。

【図12】図１２は、試験例６−２の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

（二本鎖核酸分子）
本発明の二本鎖核酸分子は、ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であり、（ａ）配列番号：１〜配列番号：１８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。
なお、本発明において「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子をいう。

【0013】

＜ＴＡＣＣ２遺伝子、１４−３−３ζ遺伝子＞
前記ＴＡＣＣ２遺伝子、及び前記１４−３−３ζ遺伝子は、前記したように、ともにアンドロゲン応答遺伝子である。
前記ＴＡＣＣ２遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができ、例えば、ヒトＴＡＣＣ２遺伝子は、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００６９９７．２である。
また、前記１４−３−３ζ遺伝子遺伝子の塩基配列も、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができ、例えば、ヒト１４−３−３ζ遺伝子は、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００１１３５６９９．１である。
本発明において、前記ＴＡＣＣ２遺伝子、前記１４−３−３ζ遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列が前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、本明細書中において前記ＴＡＣＣ２遺伝子、前記１４−３−３ζ遺伝子を、前記二本鎖核酸分子の「標的遺伝子」と称することがある。
なお、参考として、前記ヒトＴＡＣＣ２遺伝子配列を配列番号：１９に、前記ヒト１４−３−３ζ遺伝子配列を配列番号：２０に示す。

【0014】

＜センス鎖、アンチセンス鎖＞
本発明者らは、鋭意検討の結果、前記ＴＡＣＣ２遺伝子、前記１４−３−３ζ遺伝子のｍＲＮＡ配列の中でも、ある特定の標的配列（配列番号：１〜配列番号：１８）に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子が、前記ＴＡＣＣ２遺伝子、前記１４−３−３ζ遺伝子に対して顕著に優れた発現抑制効果を有することを見出した。したがって、本発明の二本鎖核酸分子は、（ａ）配列番号：１〜配列番号：１８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むものである。
ここで、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよいし、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ鎖であってもよい。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とは、互いにハイブリダイズすることで前記二本鎖核酸分子を形成することができる。
なお、前記配列番号：１〜配列番号：１８のうち、配列番号：１〜配列番号：１０はＴＡＣＣ２遺伝子配列（配列番号：１９）の一部であり、配列番号：１１〜配列番号：１８はヒト１４−３−３ζ遺伝子配列（配列番号：２０）の一部である。

【0015】

前記二本鎖核酸分子の中でも、前記センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：４、配列番号：７〜配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１６、及び配列番号：１８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることが好ましく、配列番号：２、及び配列番号：１３のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するものであることがより好ましい。
前記センス鎖が、前記好ましいセンス鎖以外のセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の前記標的遺伝子に対する発現抑制効果が弱くなる場合がある。一方で、前記センス鎖が、前記より好ましいセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の使用量が少量であっても、前記標的遺伝子に対する強い発現抑制効果が得られる点で、有利である。
なお、前記二本鎖核酸分子におけるセンス鎖は、前記所定の配列番号の標的配列に対応するヌクレオチド配列を有していればよく、その他のヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、前記所定の配列番号の標的配列に対応するヌクレオチド配列からなることが好ましい。
また、前記二本鎖核酸分子におけるアンチセンス鎖は、前記センス鎖とハイブリダイズすることができる程度に相補的なヌクレオチド配列を有していればよく、その他のヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、前記センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を７０％以上含むことが好ましく、８０％以上含むことがより好ましく、９０％以上含むことが特に好ましい。

【0016】

＜種類＞
前記二本鎖核酸分子の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラなどが挙げられる。これらの中でも、二本鎖ＲＮＡが好ましい。
ここで、「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいい、「二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。

【0017】

前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）であることが特に好ましい。ここで、ｓｉＲＮＡとは、１８塩基長〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、前記したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、かつ前記標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基〜６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
前記ｓｉＲＮＡの具体例としては、配列番号：２１と配列番号：２２とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２３と配列番号：２４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２５と配列番号：２６とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２７と配列番号：２８とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２９と配列番号：３０とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３１と配列番号：３２とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３３と配列番号：３４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３５と配列番号：３６とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３７と配列番号：３８とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３９と配列番号：４０とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４１と配列番号：４２とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４３と配列番号：４４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４５と配列番号：４６とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４７と配列番号：４８とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４９と配列番号：５０とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：５１と配列番号：５２とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：５３と配列番号：５４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：５５と配列番号：５６とからなるｓｉＲＮＡが挙げられる。
これらの中でも、配列番号：２１と配列番号：２２とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２３と配列番号：２４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２５と配列番号：２６とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２７と配列番号：２８とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３３と配列番号：３４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３５と配列番号：３６とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３７と配列番号：３８とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３９と配列番号：４０とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４１と配列番号：４２とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４３と配列番号：４４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４５と配列番号：４６とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４９と配列番号：５０とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：５１と配列番号：５２とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：５５と配列番号：５６とからなるｓｉＲＮＡが好ましく、配列番号：２３と配列番号：２４とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４５と配列番号：４６とからなるｓｉＲＮＡがより好ましい。

【0018】

また、前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であってもよい。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
前記ｓｈＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。

【0019】

また、前記二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラは、キメラｓｉＲＮＡであることが特に好ましい。ここで、キメラｓｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列の一部がＤＮＡに変換された、１８塩基長〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラをいう。中でも、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’側の８塩基、及び、アンチセンス鎖の５’側の６塩基がＤＮＡに変換された、２１塩基長〜２３塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラであることが好ましい。前記キメラｓｉＲＮＡは、前記ｓｉＲＮＡと同様に、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。なお、前記キメラｓｉＲＮＡには、ＤＮＡに変換された配列の一部をＲＮＡに再度変換した態様も含まれる。
前記キメラｓｉＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
前記キメラｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ）は、血中安定性が高い、免疫応答誘導性が低い、製造コストが低いなどの点で、有利である。

【0020】

＜修飾＞
また、前記二本鎖核酸分子は、目的に応じて、適宜修飾を有していてもよい。例えば、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を付与し、培養液中や生体中における安定性を向上させる等の目的から、前記二本鎖核酸分子に、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾や、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）修飾等を施すことができる。また、例えば、細胞への導入効率を高める等の目的から、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。なお、前記二本鎖核酸分子にこのような修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。

【0021】

＜入手方法＞
前記二本鎖核酸分子の入手方法としては、特に制限はなく、それぞれ従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、前記ｓｉＲＮＡは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長〜２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、アニーリング済の二本鎖ｓｉＲＮＡの市販品を入手することもできるし、ｓｉＲＮＡ合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
また、前記キメラｓｉＲＮＡは、例えば、キメラ核酸分子であるセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ化学合成し、それらをアニーリングすることにより、作製することができる。

【0022】

（ＤＮＡ、ベクター）
本発明のＤＮＡは、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡを含むベクターである。

【0023】

＜ＤＮＡ＞
前記ＤＮＡとしては、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。
また、更に、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。

【0024】

＜ベクター＞
前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸分子を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記二本鎖核酸分子の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸分子としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡとしての一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。

【0025】

前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸分子を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。

【0026】

（癌細胞増殖抑制剤）
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、癌細胞の増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤（「腫瘍増殖抑制剤」と称することがある）であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。

【0027】

＜二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター＞
前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とするＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現を効果的に抑制することができるので、癌細胞の増殖を抑制するための前記癌細胞増殖抑制剤の有効成分として好適である。また、前記ＤＮＡ、ベクターの詳細としても、前記した本発明のＤＮＡ、ベクターの項目に記載した通りである。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞増殖抑制剤としては、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかそのものであってもよい。
前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの中でも、配列番号：２の標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び該ＤＮＡを含むベクターの少なくともいずれかと、配列番号：１３の標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び該ＤＮＡを含むベクターの少なくともいずれかとを含む態様が好ましい。

【0028】

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0029】

＜癌細胞＞
前記癌細胞増殖抑制剤の適用対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前立腺癌細胞が好適に挙げられる。前記前立腺癌細胞は、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞であってもよい。
前記癌細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、癌を患う患者の体内に存在する細胞であってもよい。
前記体外で培養されている前立腺癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＮＣａＰ細胞（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＰＣ−３細胞（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）、ＤＵ１４５細胞（ｃａｒｃｉｎｏｍａ由来）などが挙げられる。
これらの細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。

【0030】

＜作用＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、例えば、癌細胞に導入（トランスフェクト）することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
癌細胞に対して作用させる前記癌細胞増殖抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、１×１０^６個の細胞数に対し、有効成分（前記二本鎖核酸分子）の量として、０．１μｇ程度が好ましく、５μｇ程度がより好ましく、１５μｇ程度が特に好ましい。

【0031】

＜癌細胞増殖抑制方法＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、癌細胞に作用させることにより、ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを癌細胞に作用させることを特徴とする、癌細胞の増殖抑制方法（「腫瘍増殖抑制方法」と称することがある）にも関する。前記癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前立腺癌細胞が好適に挙げられる。前記前立腺癌細胞は、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞であってもよい。

【0032】

（医薬）
本発明の医薬は、癌を予防乃至治療するための医薬であり、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤を含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。

【0033】

＜癌細胞増殖抑制剤＞
前記癌細胞増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤の項目に記載した通りである。前記癌細胞増殖抑制剤は、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、標的とするＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。即ち、前記癌細胞増殖抑制剤は、癌を予防乃至治療するための医薬として好適に利用可能である。前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前立腺癌が好適に挙げられる。前記前立腺癌は、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌であってもよい。
前記医薬中の前記癌細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記癌細胞増殖抑制剤そのものであってもよい。

【0034】

ここで、前記医薬の有効成分となる前記二本鎖核酸分子としては、非修飾の状態の二本鎖核酸分子そのものを用いてもよいが、適切に予防乃至治療効果が得られるよう、生体への投与に適した形態の二本鎖核酸分子を用いることが好ましい。
例えば、前記二本鎖核酸分子は、生体内における二本鎖核酸分子の安定性を高めることができる点で、修飾が施されていることが好ましい。前記二本鎖核酸分子に施し得る修飾の種類としては、特に制限はなく、例えば、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ化修飾、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）修飾などが挙げられる。また、標的細胞への導入効率を高める等の目的から、例えば、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともまた好ましい。前記二本鎖核酸分子に前記修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
また、前記二本鎖核酸分子は、標的細胞への導入効率を高めることができる点で、リポソームや高分子マトリックス等と複合体を形成していることも好ましい。前記複合体を形成する方法としても、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。

【0035】

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0036】

＜剤型＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。

【0037】

前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。

【0038】

前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。

【0039】

前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。

【0040】

前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。

【0041】

前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。

【0042】

＜投与＞
前記医薬は、癌の予防乃至治療に好適である。したがって、前記医薬は、癌に罹患した患者に投与することにより好適に使用することができる。

【0043】

前記医薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。

【0044】

前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬の有効成分（前記二本鎖核酸分子）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分（前記二本鎖核酸分子）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。

【0045】

前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分（前記二本鎖核酸分子）の量として、１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましい。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。

【0046】

前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。中でも、前記医薬は、癌細胞の増殖を阻害し、前記癌細胞の増殖による腫瘍の増大を防ぐ効果に優れることから、前記医薬は前記疾患の出来る限り早期の段階に投与されることが望ましいと考えられる。

【0047】

＜予防乃至治療方法＞
前記医薬は、前記癌細胞増殖抑制剤を含むので、癌を患う個体に投与することにより、ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制し、癌を予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記医薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法にも関する。前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前立腺癌が好適に挙げられる。前記前立腺癌は、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌であってもよい。

【実施例】

【0048】

以下に本発明の試験例等を説明するが、本発明は、これらの試験例等に何ら限定されるものではない。

【0049】

（製造例１：二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）の作製）
ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための本発明の二本鎖核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を、以下のようにして準備した。
ＴＡＣＣ２遺伝子に対する本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃１０）と、１４−３−３ζ遺伝子に対する本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃８）は、それぞれのｓｉＲＮＡのターゲットとする遺伝子配列（以下に記載）とその相補的な配列を、３’末端が２塩基オーバーハングするようなＲＮＡの二本鎖として合成した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）。これらは、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぐことができるものである。
また、ネガティブコントロールとして、全既知遺伝子へのオフターゲット効果がないｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１（ＲＮＡｉ社製）、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２（Ａｍｂｉｏｎ社製、４３９０８４３））を用意した。
また、ＴＡＣＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡのポジティブコントロールとして、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＨＳＳ１１６２８９）を用意した。

【0050】

それぞれのｓｉＲＮＡのターゲットとする遺伝子配列、及び作製したｓｉＲＮＡの配列を以下に示す。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃１＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＴＡＣＣＣＴＴＡＡＧＣＧＡＡＣＴＡＡＡＡ−３’（配列番号：１）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＵＡＣＣＣＵＵＡＡＧＣＧＡＡＣＵＡＡＡＡ−３’（配列番号：２１）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＵＡＧＵＵＣＧＣＵＵＡＡＧＧＧＵＡＣＵＡ−３’（配列番号：２２）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における９３２番目から９５４番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＴＴＡＡＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＡＴ−３’（配列番号：２）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＵＵＡＡＣＵＧＵＵＧＣＧＵＧＣＡＡＵＡＵ−３’（配列番号：２３）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＵＵＧＣＡＣＧＣＡＡＣＡＧＵＵＡＡＧＵＣ−３’（配列番号：２４）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における３４３６番目から３４５８番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃３＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＧＣＴＡＡＧＡＡＴ−３’（配列番号：３）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＧＵＧＣＣＵＣＡＧＡＣＧＣＵＡＡＧＡＡＵ−３’（配列番号：２５）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＣＵＵＡＧＣＧＵＣＵＧＡＧＧＣＡＣＧＡＧ−３’（配列番号：２６）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における７３０番目から７５２番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃４＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＣＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＧＴＡＣＴＴＡＣＡ−３’（配列番号：４）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＣＡＵＵＧＣＵＡＡＡＧＧＵＡＣＵＵＡＣＡ−３’（配列番号：２７）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＡＡＧＵＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＧＧＧＧ−３’（配列番号：２８）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における１５５３番目から１５７５番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃５＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣＧＧＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：５）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＧＧＡＧＧＡＡＧＵＣＣＡＣＧＧＡＵＵＣＣ−３’（配列番号：２９）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＡＵＣＣＧＵＧＧＡＣＵＵＣＣＵＣＣＧＵＧ−３’（配列番号：３０）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における７７２番目から７９４番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃６＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＴＡＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：６）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＵＧＧＵＧＣＡＣＵＵＧＡＣＵＡＵＣＵＧＧ−３’（配列番号：３１）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＧＡＵＡＧＵＣＡＡＧＵＧＣＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号：３２）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における２５３４番目から２５５６番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃７＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号：７）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＧＡＧＡＡＡＣＵＵＧＡＣＡＡＣＡＣＵＣＣ−３’（配列番号：３３）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＧＵＧＵＵＧＵＣＡＡＧＵＵＵＣＵＣＧＧＧ−３’（配列番号：３４）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における１４９１番目から１５１３番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃８＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＧＡＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴＡＡＡ−３’（配列番号：８）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＧＡＣＣＵＧＵＣＣＡＣＣＵＵＵＧＵＡＡＡ−３’（配列番号：３５）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＡＣＡＡＡＧＧＵＧＧＡＣＡＧＧＵＣＣＧＡ−３’（配列番号：３６）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における２０６４番目から２０８６番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃９＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧ−３’（配列番号：９）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＣＣＵＵＡＡＧＧＡＧＵＧＵＡＡＡＣＵＵＧ−３’（配列番号：３７）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＧＵＵＵＡＣＡＣＵＣＣＵＵＡＡＧＧＣＡＡ−３’（配列番号：３８）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における３７８３番目から３８０５番目に対応する。
＜ｓｉＴＡＣＣ２ ＃１０＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡ−３’（配列番号：１０）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＵＧＣＣＧＵＣＵＵＣＧＡＵＧＡＡＧＡＣＡ−３’（配列番号：３９）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＣＵＵＣＡＵＣＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＧＡＧ−３’（配列番号：４０）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００６９９７．２における６２９番目から６５１番目に対応する。

【0051】

＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＴＧＧＡＣＡＴＣＧＧＡＴＡＣＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号：１１）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＵＧＧＡＣＡＵＣＧＧＡＵＡＣＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号：４１）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＵＧＧＧＵＡＵＣＣＧＡＵＧＵＣＣＡＣＡＡ−３’（配列番号：４２）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における８３４番目から８５６番目に対応する。
＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃２＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＡＧＣＡＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＡＡＴＴ−３’（配列番号：１２）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＡＧＣＡＣＧＣＵＡＡＵＡＡＵＧＣＡＡＵＵ−３’（配列番号：４３）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＵＧＣＡＵＵＡＵＵＡＧＣＧＵＧＣＵＧＵＣ−３’（配列番号：４４）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における７９２番目から８１４番目に対応する。
＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＣＧＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＴＧＣ−３’（配列番号：１３）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＣＧＵＵＡＣＵＵＧＧＣＵＧＡＧＧＵＵＧＣ−３’（配列番号：４５）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＡＣＣＵＣＡＧＣＣＡＡＧＵＡＡＣＧＧＵＡ−３’（配列番号：４６）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における５３１番目から５５３番目に対応する。
＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃４＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＴＴＡＴＡＡＧＴＧＴＴＴＧＧＣＡＴＡＧＴ−３’（配列番号：１４）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＵＵＡＵＡＡＧＵＧＵＵＵＧＧＣＡＵＡＧＵ−３’（配列番号：４７）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＵＡＵＧＣＣＡＡＡＣＡＣＵＵＡＵＡＡＣＵＵ−３’（配列番号：４８）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における１１３９番目から１１６１番目に対応する。
＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃５＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＴＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＡＧＴＴＴＴ−３’（配列番号：１５）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＵＡＧＣＡＵＵＡＡＣＵＧＵＡＡＧＵＵＵＵ−３’（配列番号：４９）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＡＣＵＵＡＣＡＧＵＵＡＡＵＧＣＵＡＣＣＣ−３’（配列番号：５０）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における２２４２番目から２２６４番目に対応する。
＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃６＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＣＡＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＡＡＴＴＡＣ−３’（配列番号：１６）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＣＡＣＧＣＵＡＡＵＡＡＵＧＣＡＡＵＵＡＣ−３’（配列番号：５１）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＡＵＵＧＣＡＵＵＡＵＵＡＧＣＧＵＧＣＵＧ−３’（配列番号：５２）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における７９４番目から８１６番目に対応する。
＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃７＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＣＣＴＡＣＣＴＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＣＴ−３’（配列番号：１７）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＣＣＵＡＣＣＵＡＵＣＣＵＧＡＡＵＧＧＵＣＵ−３’（配列番号：５３）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＣＣＡＵＵＣＡＧＧＡＵＡＧＧＵＡＧＧＧＵ−３’（配列番号：５４）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における２５７８番目から２６００番目に対応する。
＜ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃８＞
−ターゲットとする遺伝子配列−
５’−ＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＴＴＡ−３’（配列番号：１８）
−ｓｉＲＮＡの配列−
−−センス鎖−−
５’−ＧＵＡＧＵＡＡＵＵＧＵＧＧＧＵＡＣＵＵＵＡ−３’（配列番号：５５）
−−アンチセンス鎖−−
５’−ＡＡＧＵＡＣＣＣＡＣＡＡＵＵＡＣＵＡＣＡＣ−３’（配列番号：５６）
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＮＭ＿００１１３５６９９．１における１２８８番目から１３１０番目に対応する。

【0052】

ネガティブコントロールに用いたｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１の配列を以下に示す。
＜ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１＞
−センス鎖−
５’−ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ−３’（配列番号：５７）
−アンチセンス鎖−
５’−ＵＡＣＧＡＡＵＧＡＣＧＵＧＣＧＧＵＡＣＧＵ−３’（配列番号：５８）

【0053】

（試験例１−１−１：ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡレベルでの標的遺伝子発現抑制効果の検討）
前記製造例１で得られたｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃１０を、前立腺癌細胞にトランスフェクションし、４８時間後に全ＲＮＡを回収してｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行うことにより、各ｓｉＲＮＡの前立腺癌細胞におけるＴＡＣＣ２遺伝子発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２及びｓｉＴＡＣＣ２ ＃０を用いた。
実験方法の詳細を以下に示す。

【0054】

［細胞］
前記前立腺癌細胞として、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）を用いた。

【0055】

［細胞培養］
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。

【0056】

［トランスフェクション］
６穴プレートに、ＬＮＣａＰ細胞 １×１０^５個／穴をまき、その翌日（細胞数：３×１０^５個／穴）に、ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、１０ｎＭとなるように調整した。

【0057】

［遺伝子発現レベルの測定］
トランスフェクションし４８時間培養した後に、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを細胞より回収した。前記全ＲＮＡ ５００ｎｇを用いて、Ｐｒｉｍｅ ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）により、ｃＤＮＡを合成した。
前記ｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μＬを用いてｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。前記ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ （Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及びＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ＰＣＲ ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社製）を用いて行い、ＴＡＣＣ２遺伝子及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。
前記ＴＡＣＣ２遺伝子の発現レベルは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて算出した。

【0058】

結果を図１Ａに示した。図１Ａ中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
図１Ａの結果から、本発明のｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃１０は、Ｒｅａｇｅｎｔ、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べてＴＡＣＣ２遺伝子の発現を抑制した。

【0059】

（試験例１−１−２：ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡレベルでの標的遺伝子発現抑制効果の検討）
試験例１−１−１において、導入したｓｉＲＮＡの量を１０ｎＭから５０ｎＭに変えた以外は、試験例１−１−１と同様にして試験した。
結果を図１Ｂに示した。図１Ｂ中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
図１Ｂの結果から、本発明のｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃３、＃５、＃７、及び＃８は、ｓｉＴＡＣＣ２＃０と同等、若しくはそれ以上のノックダウン効果を有することが確認できた。

【0060】

（試験例１−２：ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡレベルでの標的遺伝子発現抑制効果の検討）
試験例１−１−１において、ｓｉＲＮＡをｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃８とし、コントロールをｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２とし、１４−３−３ζ遺伝子の発現レベルを測定した以外は、試験例１−１−１と同様にして試験した。
結果を図２に示した。図２中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
図２の結果から、本発明のｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃８は、Ｒｅａｇｅｎｔ、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べてｍＲＮＡレベルで１４−３−３ζ遺伝子の発現を抑制した。これらの中でも、ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１、＃３、＃４、＃６が特に効果が高かった。

【0061】

（試験例２−１：ｓｉＲＮＡによるタンパク質レベルでの標的遺伝子発現抑制効果の検討）
前記製造例１で得られたｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃１０を、前立腺癌細胞にトランスフェクションし、４８時間後にタンパク質サンプルを回収してウエスタンブロット解析を行うことにより、各ｓｉＲＮＡの前立腺癌細胞におけるＴＡＣＣ２遺伝子発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２を用いた。
実験方法の詳細を以下に示す。

【0062】

［細胞］
前記前立腺癌細胞として、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）を用いた。

【0063】

［細胞培養］
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。

【0064】

［トランスフェクション］
６穴プレートに、ＬＮＣａＰ細胞 １×１０^５個／穴をまき、その翌日（細胞数：３×１０^５個／穴）に、ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、５０ｎＭとなるように調整した。

【0065】

［ウエスタンブロット解析］
トランスフェクションし４８時間培養した後に、ＮＰ４０ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ナカライテスク株式会社製）］を用いて細胞より全細胞抽出液を採取した。
前記全細胞抽出液のタンパク質濃度をＢＣＡ ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）により調製した。
前記タンパク質濃度を調整した全細胞抽出液１０μｇを、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロットした。
その後、１次抗体として、１，０００倍希釈したＡｎｔｉ−ＴＡＣＣ２抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ社製、０７−２２８）を用いて一晩反応させ、次いで、２次抗体として、５，０００倍希釈したペルオキシダーゼの結合した抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を１時間反応させた。また、内部コントロールとして、５００倍希釈したａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製、Ａ５３１６）を用いて一晩反応させ、次いで、２次抗体として、５，０００倍希釈したペルオキシダーゼの結合した抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製、ＮＡ９３１−１００ＵＬ）を１時間反応させた。
次いで、抗原抗体複合体を、ＩｍｍｕｎｏＣｒｕｚ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて反応させ、Ｘ線フィルムへ撮影した。

【0066】

結果を図３に示した。図３中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、上段は、ＴＡＣＣ２遺伝子の発現レベルを示し、下段は、内部コントロールであるβ−アクチンの発現レベルを示す。
図３の結果から、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃３、＃６、及び＃９は、Ｒｅａｇｅｎｔ、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりもタンパク質レベルでＴＡＣＣ２遺伝子の発現を抑制した。これらの中でも、＃１が最も効果が高かった。

【0067】

（試験例２−２：ｓｉＲＮＡによるタンパク質レベルでの標的遺伝子発現抑制効果の検討）
試験例２−１において、ｓｉＲＮＡをｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃８とし、導入したｓｉＲＮＡの量を５０ｎＭから１０ｎＭに変え、１次抗体を１，０００倍希釈したａｎｔｉ−１４−３−３ ｚｅｔａ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、Ｃ−１６）とし、ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製、Ａ５３１６）を１，０００倍希釈したものに変えた以外は、試験例２−１と同様にして試験した。
結果を図４に示した。図４中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、上段は、１４−３−３ζ遺伝子の発現レベルを示し、下段は、内部コントロールであるβ−アクチンの発現レベルを示す。
図４の結果から、ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃４、及び＃６〜＃８は、Ｒｅａｇｅｎｔ、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりもタンパク質レベルで１４−３−３ζ遺伝子の発現を抑制した。これらの中でも、＃３が最も効果が高かった。

【0068】

（試験例３−１−１：ｓｉＲＮＡによるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
前記製造例１で得られたｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃１０を、前立腺癌細胞にトランスフェクションし、その後の細胞増殖速度を測定することにより、各ｓｉＲＮＡの前立腺癌細胞増殖抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２及びｓｉＴＡＣＣ２ ＃０を用いた。
実験方法の詳細を以下に示す。

【0069】

［細胞］
前記前立腺癌細胞として、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）を用いた。

【0070】

［細胞培養］
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。

【0071】

［トランスフェクション］
トランスフェクション前日に、９６穴プレートに、ＬＮＣａＰ細胞を３×１０^３個／穴になるよう継代し、トランスフェクション当日に、ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、１０ｎＭとなるように調整した。

【0072】

［細胞増殖試験］
細胞増殖試験は、トランスフェクション１日後、３日後、５日後にＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて２時間反応させ、マイクロプレートリーダーにて吸光度４９０ｎｍで細胞増殖能を測定することにより行った。前記試験は、ＰＥＳ（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）を介して、テトラゾリウム塩［ＭＴＳ；３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ］を発色物質であるホルマザン産物へ変換する還元反応に基づいて、生細胞数を測定するものである。

【0073】

結果を図５Ａに示した。図５Ａ中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、各ｓｉＲＮＡ等の欄における棒グラフは、左から順に、トランスフェクション１日後、３日後、５日後の結果を示す。
図５Ａの結果から、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃４、＃７〜＃９は、Ｒｅａｇｅｎｔ、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりも細胞増殖が抑えられていた。

【0074】

（試験例３−１−２：ｓｉＲＮＡによるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
試験例３−１−１において、導入したｓｉＲＮＡの量を１０ｎＭから５０ｎＭに変えた以外は、試験例３−１−１と同様にして試験した。
結果を図５Ｂに示した。図５Ｂ中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、各ｓｉＲＮＡ等の欄における棒グラフは、左から順に、トランスフェクション１日後、３日後、５日後の結果を示す。
図５Ｂの結果から、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃１〜＃４、及び＃７〜＃１０は、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃０と同等、若しくはそれ以上の細胞増殖抑制効果が確認できた。これらの中でも、特にｓｉＴＡＣＣ２ ＃２、及び＃９において細胞増殖抑制効果が強いことが観察された。

【0075】

（試験例３−２：ｓｉＲＮＡによるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
試験例３−１−１において、ｓｉＲＮＡをｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃８とし、コントロールをｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２とし、細胞増殖試験をトランスフェクション１日後、４日後、５日後、及び６日後に行った以外は、試験例３−１−１と同様にして試験した。
結果を図６に示した。図６中、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、各ｓｉＲＮＡ等の欄における棒グラフは、左から順に、トランスフェクション１日後、４日後、５日後、６日後の結果を示す。
図６の結果から、ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃８は、Ｒｅａｇｅｎｔ、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２よりも有意に細胞増殖を抑制効果した。これらの中でも、特にｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃１〜＃３、＃５、＃６、及び＃８は、トランスフェクション４日後以降、細胞の増殖を強く抑制することが認められた。

【0076】

（試験例４−１：ｓｉＲＮＡによるｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果の検討）
前記製造例１で得られたｓｉＴＡＣＣ２のうち、前記試験において、ｍＲＮＡレベルでの発現抑制効果と、細胞増殖抑制効果が共に高かったｓｉＴＡＣＣ２ ＃２について、ヌードマウスの皮下に腫瘍細胞を移植し、その腫瘍に対する増殖抑制効果を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１を用いた。
実験方法の詳細を以下に示す。

【0077】

［細胞］
前記腫瘍細胞として、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）を用いた。

【0078】

［マウス］
前記マウスとして、日本クレア株式会社より購入したオスの８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ）を用いた。

【0079】

［腫瘍細胞の皮下移植］
前記ＬＮＣａＰ細胞をヌードマウス一匹あたり１×１０^７個になるように調整し、ＰＢＳ １００μＬと混合した。前記混合物をマトリゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）１００μＬと混合した。前記混合物を、２５Ｇ注射針を用いてマウスの皮下に注入した。

【0080】

［ｓｉＲＮＡの投与］
マウスへ腫瘍細胞を移植後、腫瘍体積が１００ｍｍ^３に達したところでｓｉＲＮＡの投与を開始した。
前記ｓｉＲＮＡの投与は、ｓｉＲＮＡが５μｇ／匹となるように、ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１５μＬ、ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ−ｆｒｅｅ ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（８５μＬ）と混合した溶液（１００μＬ）をマウスの腫瘍内へ局注することにより行った。
前記投与は、２回／週を４週間繰り返した。

【0081】

［腫瘍増殖の測定、評価］
マウスの腫瘍の大きさは、週１回計測した。
腫瘍体積は、長径（ｒ１）と、短径（ｒ２，ｒ３）を２か所とを計測し、「｛長径（ｒ１）（ｍｍ）×短径（ｒ２）（ｍｍ）×短径（ｒ３）（ｍｍ）｝／２〕の式により算出した。

【0082】

結果を図７Ａ及び７Ｂに示した。
図７Ａは、ｓｉＲＮＡ投与開始４週間後に、アバチンにて麻酔をかけ、腫瘍の大きさが分かるように撮影した写真である（左側：ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１を投与、右側：ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２を投与）。
図７Ｂは、腫瘍体積の変化を表したグラフである。図７Ｂ中、「◇」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１」を投与したマウス（ｎ＝７）における結果を示し、「□」は、「ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２」を投与したマウス（ｎ＝８）における結果を示す。また、同図中、「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を表す。
図７Ａ及び７Ｂの結果から、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２の投与により、マウスにおけるＬＮＣａＰ細胞の増殖が有意に抑制されることが明らかになった。

【0083】

（試験例４−２：ｓｉＲＮＡによるｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果の検討）
試験例４−１において、ｓｉＲＮＡを上述の試験例において最も抑制効果が高かったｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３とした以外は、試験例２−１と同様にして試験した。
結果を図８Ａ及び８Ｂに示した。
図８Ａは、ｓｉＲＮＡ投与開始４週間後に、アバチンにて麻酔をかけ、腫瘍の大きさが分かるように撮影した写真である（左側：ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１を投与、右側：ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３を投与）。
図８Ｂは、腫瘍体積の変化を表したグラフである。図８Ｂ中、「◇」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１」を投与したマウス（ｎ＝７）における結果を示し、「△」は、「ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３」を投与したマウス（ｎ＝７）における結果を示す。また、同図中、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を表す。
図８Ａ及び８Ｂの結果から、ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３の投与により、マウスにおけるＬＮＣａＰ細胞の増殖が有意に抑制されることが明らかになった。

【0084】

（試験例５−１：ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２と、既報のｓｉＲＮＡとの比較）
前記製造例１で得られたｓｉＴＡＣＣ２ ＃２と、「Ｔａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２６：７４８−７６１， ２０１２」（以下、「既報文献１」と称することがある）に記載のＴＡＣＣ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（下記参照）とについて、前立腺癌細胞におけるＴＡＣＣ２遺伝子発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２及びｓｉＴＡＣＣ２ ＃０を用いた。

【0085】

＜既報文献１に記載のｓｉＲＮＡ＞
（１）ｓｉＴＡＣＣ２ｓ２０７６５（既報文献１におけるｓｉＴＡＣＣ２（ＭＥ）＃１、ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
（２）ｓｉＴＡＣＣ２ｓ２０７６７（既報文献１におけるｓｉＴＡＣＣ２（ＭＥ）＃２、ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

【0086】

実験方法の詳細は、以下の通りである。
［細胞］
前記前立腺癌細胞として、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）を用いた。

【0087】

［細胞培養］
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。

【0088】

［トランスフェクション］
トランスフェクション前日に、６穴プレートに、ＬＮＣａＰ細胞 ３×１０^５個／穴をまき、トランスフェクション当日に、ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、０．０５ｎＭとなるように調整した。

【0089】

［遺伝子発現レベルの測定］
トランスフェクションし７２時間後に、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを細胞より回収した。前記全ＲＮＡ ５００ｎｇを用いて、Ｐｒｉｍｅ ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）により、ｃＤＮＡを合成した。
前記ｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μＬを用いてｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。前記ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ （Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及びＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ＰＣＲ ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社製）を用いて行い、ＴＡＣＣ２遺伝子及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。
前記ＴＡＣＣ２遺伝子の発現レベルは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて算出した。

【0090】

図９に、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２で処理した群におけるＴＡＣＣ２遺伝子の発現レベルに対する、ｓｉＴＡＣＣ２ｓ２０７６５、ｓｉＴＡＣＣ２ｓ２０７６７、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃０、又はｓｉＴＡＣＣ２ ＃２で処理した群におけるＴＡＣＣ２遺伝子の発現レベルを算出した結果を示す。図９中、縦軸は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２で処理した群に対する割合（％）を示す。
図９における横軸は、「１」がｓｉＴＡＣＣ２ｓ２０７６５の結果を示し、「２」がｓｉＴＡＣＣ２ｓ２０７６７の結果を示し、「３」がｓｉＴＡＣＣ２ ＃０の結果を示し、「４」がｓｉＴＡＣＣ２ ＃２の結果を示す。また、図９中、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」、「＊」は「Ｐ＜０．０５」を示す。

【0091】

図９の結果から、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２は、０．０５ｎＭという低濃度において、他のｓｉＲＮＡよりも高い遺伝子発現抑制効果を示した。したがって、前記ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２のノックダウン効果の優位性が確認された。

【0092】

（試験例５−２：ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３と、既報のｓｉＲＮＡとの比較）
前記製造例１で得られたｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３と、「Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｅｒ Ｒｅｓ １８：５６１７−２７， ２０１２」（以下、「既報文献２」と称することがある）に記載の１４−３−３ζ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（下記参照）とについて、前立腺癌細胞における１４−３−３ζ遺伝子発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２を用いた。

【0093】

＜既報文献２に記載のｓｉＲＮＡ＞
（１）ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ（既報文献２、ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

【0094】

実験方法の詳細は、以下の通りである。
［細胞］
前記前立腺癌細胞として、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）を用いた。

【0095】

［細胞培養］
ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。

【0096】

［トランスフェクション］
トランスフェクション前日に、６穴プレートに、ＬＮＣａＰ細胞 ３×１０^５個／穴をまき、トランスフェクション当日に、ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、０．０５ｎＭとなるように調整した。

【0097】

［遺伝子発現レベルの測定］
トランスフェクションし７２時間後に、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを細胞より回収した。前記全ＲＮＡ ５００ｎｇを用いて、Ｐｒｉｍｅ ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）により、ｃＤＮＡを合成した。
前記ｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μＬを用いてｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。前記ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ｓｔｅｐ ｏｎｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ （Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及びＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ＰＣＲ ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社製）を用いて行い、１４−３−３ζ遺伝子及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。
前記１４−３−３ζ遺伝子の発現レベルは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて算出した。

【0098】

図１０に、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２で処理した群における１４−３−３ζ遺伝子の発現レベルに対する、ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ（既報文献２）、又はｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３で処理した群における１４−３−３ζ遺伝子の発現レベルを算出した結果を示す。図１０中、縦軸は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃２で処理した群に対する割合（％）を示す。
図１０における横軸は、「１」がｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ（既報文献２）の結果を示し、「２」がｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３の結果を示す。また、図１０中、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」を示す。

【0099】

図１０の結果から、ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３は、０．０５ｎＭという低濃度において、他のｓｉＲＮＡよりも高い遺伝子発現抑制効果を示した。したがって、前記ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３のノックダウン効果の優位性が確認された。

【0100】

（試験例６−１：ホルモン療法抵抗性前立腺癌細胞に対する細胞増殖抑制効果の検討）
前記製造例１で得られたｓｉＴＡＣＣ２ ＃２を、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞にトランスフェクションし、その後の細胞増殖を測定することにより、前記ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２のホルモン療法抵抗性前立腺癌細胞に対する細胞増殖抑制効果を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１を用いた。
実験方法の詳細を以下に示す。

【0101】

［細胞］
「Ｔａｋａｙａｍａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２６： ７４８−７６１， ２０１２」に記載の方法にしたがって、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）をホルモン枯渇状態の培地で９ヶ月間以上培養し、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞（以下、「ＬＴＡＤ細胞」と称することがある）を作製した。

【0102】

［細胞培養］
ＬＴＡＤ細胞は、チャコール吸着した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。

【0103】

［トランスフェクション］
９６穴プレートに、ＬＴＡＤ細胞を５，０００個／穴になるよう播き、２４時間後にＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、１ｎＭとなるように調整した。

【0104】

［細胞増殖試験］
トランスフェクション５日後に、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）を用いて細胞増殖試験を行った。

【0105】

結果を図１１に示した。図１１中、縦軸は、４９０ｎｍの吸光度を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１」をトランスフェクションしたものの結果を示す。なお、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示す。
図１１の結果から、ｓｉＴＡＣＣ２ ＃２は、ＬＴＡＤ細胞においても、有意に細胞増殖を抑制することが示された。

【0106】

（試験例６−２：ホルモン療法抵抗性前立腺癌細胞に対する細胞増殖抑制効果の検討）
前記製造例１で得られたｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３を、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞にトランスフェクションし、その後の細胞増殖を測定することにより、前記ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３のホルモン療法抵抗性前立腺癌細胞に対する細胞増殖抑制効果を検討した。
なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１を用いた。
実験方法の詳細を以下に示す。

【0107】

［細胞］
「Ｔａｋａｙａｍａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２６： ７４８−７６１， ２０１２」に記載の方法にしたがって、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陽性のヒト前立腺癌由来ＬＮＣａＰ細胞（入手元：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｎｏ．ＣＲＬ−１７４０）をホルモン枯渇状態の培地で９ヶ月間以上培養し、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞（以下、「ＬＴＡＤ細胞」と称することがある）を作製した。

【0108】

［細胞培養］
ＬＴＡＤ細胞は、チャコール吸着した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。

【0109】

［トランスフェクション］
９６穴プレートに、ＬＴＡＤ細胞を５，０００個／穴になるよう播き、２４時間後にＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。導入したｓｉＲＮＡの量は、１ｎＭとなるように調整した。

【0110】

［細胞増殖試験］
トランスフェクション５日後に、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）を用いて細胞増殖試験を行った。

【0111】

結果を図１２に示した。図１２中、縦軸は、４９０ｎｍの吸光度を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ ＃１」をトランスフェクションしたものの結果を示す。なお、「＊」は、Ｐ＜０．０５を示す。
図１２の結果から、ｓｉ１４−３−３ ｚｅｔａ ＃３は、ＬＴＡＤ細胞においても、有意に細胞増殖を抑制することが示された。

【0112】

以上の試験例１〜試験例６により、本発明の二本鎖核酸分子が、癌細胞におけるＴＡＣＣ２遺伝子、１４−３−３ζ遺伝子の発現に対して高い抑制効果を有することが示された。更に、これらの二本鎖核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示されたことから、癌を予防乃至治療するための医薬の有効成分として好適に利用可能であると考えられる。
また、本発明の二本鎖核酸分子は、従来のＡＲ自体を抑制することにより行われる治療方法と異なり、ＡＲの下流シグナルとして存在するＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかを標的とするものであるため、ホルモン療法不応性となった癌に対しても好適に利用可能であると考えられる。
また、ＴＡＣＣ２遺伝子、及び１４−３−３ζ遺伝子の発現が、前立腺癌で著明に亢進しているとの臨床データもあるため、本発明の二本鎖核酸分子により、癌の進展抑制にも優れた効果が見込まれる。

【0113】

本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１〜配列番号：１８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、
を含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞ センス鎖が、配列番号：１〜配列番号：４、配列番号：７〜配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１６、及び配列番号：１８のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜３＞ センス鎖が、配列番号：２、及び配列番号：１３のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜４＞ 二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜５＞ ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜６＞ ｓｉＲＮＡである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜８＞ 前記＜７＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜９＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜７＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜８＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜１０＞ 配列番号：２の標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び該ＤＮＡを含むベクターの少なくともいずれかと、
配列番号：１３の標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含む二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び該ＤＮＡを含むベクターの少なくともいずれかと、
を含む前記＜９＞に記載の癌細胞増殖抑制剤である。
＜１１＞ 癌細胞が、前立腺癌細胞である前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の癌細胞増殖抑制剤である。
＜１２＞ 前立腺癌細胞が、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞である前記＜１１＞に記載の癌細胞増殖抑制剤である。
＜１３＞ 癌細胞に、前記＜９＞から＜１２＞のいずれかに記載の癌細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法である。
＜１４＞ 癌細胞が、前立腺癌細胞である前記＜１３＞に記載の癌細胞の増殖抑制方法である。
＜１５＞ 前立腺癌細胞が、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌細胞である前記＜１４＞に記載の癌細胞の増殖抑制方法である。
＜１６＞ 癌を予防乃至治療するための医薬であって、前記＜９＞から＜１２＞のいずれかに記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬である。
＜１７＞ 癌が、前立腺癌である前記＜１６＞に記載の医薬である。
＜１８＞ 前立腺癌が、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌である前記＜１７＞に記載の医薬である。
＜１９＞ 個体に、前記＜１６＞から＜１８＞のいずれかに記載の医薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法である。
＜２０＞ 癌が、前立腺癌である前記＜１９＞に記載の癌の予防乃至治療方法である。
＜２１＞ 前立腺癌が、ホルモン療法抵抗性の前立腺癌である前記＜２０＞に記載の癌の予防乃至治療方法である。

【産業上の利用可能性】

【0114】

本発明の二本鎖核酸分子は、ＴＡＣＣ２遺伝子及び１４−３−３ζ遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介し、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができるので、癌に対する優れた医薬の有効成分として有用である。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]