特許 5977269 試料の分析方法及びそれに用いる溶液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5977269

(24)【登録日】2016年7月29日

(45)【発行日】2016年8月24日

(54)【発明の名称】試料の分析方法及びそれに用いる溶液

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/447 20060101AFI20160817BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/447 301A

   G01N27/447 301B

   G01N27/447 331E

   G01N27/447 315K

   G01N27/447 331G

【請求項の数】12

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-3525(P2014-3525)

(22)【出願日】2014年1月10日

(65)【公開番号】特開2014-160058(P2014-160058A)

(43)【公開日】2014年9月4日

【審査請求日】2014年1月10日

(31)【優先権主張番号】特願2013-9469(P2013-9469)

(32)【優先日】2013年1月22日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000141897

【氏名又は名称】アークレイ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】特許業務法人池内・佐藤アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】大沼 直嗣

【審査官】 蔵田 真彦

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−０３２６７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−０５７１１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０１０８５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１３６３２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００３２２９４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−１６９８９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１７４６２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−１４５５３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０９−５１０７９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１０９２３０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／２６−２７／４０４、２７／４１４−２７／４１６、

２７／４２−２７／４９

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料の分析方法であって、
キャピラリ電気泳動により試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、
分析対象物質の分離及び／又は検出が、イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われ、
前記イオン性の擬似固定相が、アニオン性基を有する多糖類であり、
前記非界面活性剤型の両イオン性物質が、非界面活性剤型のベタインであり、
前記試料が、ヘモグロビンを含む試料であり、
前記分析対象物質の分離及び／又は検出は、ｐＨ３．０〜６．９の泳動液を用いて行われる、試料分析方法。

【請求項2】

試料の分析方法であって、
泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、
前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、
分析対象物質の分離及び／又は検出が、イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われ、
前記イオン性の擬似固定相が、アニオン性基を有する多糖類であり、
前記非界面活性剤型の両イオン性物質が、非界面活性剤型のベタインであり、
前記泳動液のｐＨが、３．０〜６．９であり、
前記試料が、ヘモグロビンを含む試料である、試料分析方法。

【請求項3】

前記試料が、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質を含有する、請求項１又は２に記載の試料分析方法。

【請求項4】

前記試料が、イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質を含有する、請求項１から３のいずれかに記載の試料分析方法。

【請求項5】

非界面活性剤型の両イオン性物質が、四級アンモニウムカチオン、及び、スルホ基（-SO₃^-）若しくはカルボキシル基（-COO^-）を同一分子内の隣り合わない位置に有する物質である、請求項１から４のいずれかに記載の試料分析方法。

【請求項6】

ｐＨ緩衝物質は、そのｐＫａ又はｐＫｂの値が、泳動条件のｐＨの±２．０の範囲に含まれる物質である、請求項１から５のいずれかに記載の試料分析方法。

【請求項7】

前記ヘモグロビンが、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−ＨｂＡ１ｃ）、ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＡ１ｄ（ＨｂＡ１ｄ）、ヘモグロビンＡ１ｅ（ＨｂＡ１ｅ）、ヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ、鎌状赤血球ヘモグロビン）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ、胎児ヘモグロビン）、ヘモグロビンＭ（ＨｂＭ）、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、ヘモグロビンＤ（ＨｂＤ）、ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）、メト化ヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン、アルデヒド化ヘモグロビン、及び不安定型ＨｂＡ１ｃ（ｌ−ＨｂＡ１ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１から６のいずれかに記載の試料分析方法。

【請求項8】

イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び、水を含有する、キャピラリ電気泳動用溶液であり、
前記イオン性の擬似固定相が、アニオン性基を有する多糖類であり、
前記非界面活性剤型の両イオン性物質が、非界面活性剤型のベタインであり、
ｐＨが、３．０〜６．９である、キャピラリ電気泳動用溶液。

【請求項9】

非界面活性剤型の両イオン性物質が、四級アンモニウムカチオン、及び、スルホ基（-SO₃^-）若しくはカルボキシル基（-COO^-）を同一分子内の隣り合わない位置に有する物質である、請求項８記載のキャピラリ電気泳動用溶液。

【請求項10】

ｐＨ緩衝物質は、そのｐＫａ又はｐＫｂの値が、泳動条件のｐＨの±２．０の範囲に含まれる物質である、請求項８又は９に記載のキャピラリ電気泳動用溶液。

【請求項11】

請求項８から１０のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液、及び、キャピラリ電気泳動チップを含み、
前記キャピラリ電気泳動チップは、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を含み、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップである、試料分析用キット。

【請求項12】

さらに、校正用物質、及び／又は、精度管理用物質を含む、請求項１１記載の試料分析用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、試料の分析方法、キャピラリ電気泳動用溶液、及び試料分析用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

キャピラリ電気泳動法を利用した血中タンパク質の分析方法として、特許文献１は、キャピラリ電気泳動法によりヘモグロビンを分析することを開示する。同文献は、フマル酸、チオシアン酸ナトリウム、アルギニン、及びコンドロイチン硫酸Ｃを含むｐＨ４．８の電気泳動液を開示する。同文献は、また、血中タンパク質の分析時間が３５秒以下であることを開示する。

【0003】

特許文献２は、キャピラリ電気泳動法により安定型ＨｂＡ１ｃを測定することを開示する。同文献は、泳動用緩衝液として、亜硝酸ナトリウム及び界面活性剤を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）又は亜硝酸カリウム及びデキストラン硫酸を含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．２）を開示する。

【0004】

特許文献３は、脂肪族ジアミンや脂肪族ポリアミン等の流れ阻害剤を含む双性イオン性バッファーを用いるキャピラリ電気泳動法によりヘモグロビンを分析することを開示する。同文献は、分析バッファー溶液として、トリシン／１，４−ジアミノブタンバッファー（ｐＨ９．３７）、トリシン／１，５−ジアミノペンタンバッファー（ｐＨ９．３７）、トリシン／ジエチレントリアミンバッファー（ｐＨ９．４０）、トリシン／Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，４−ブタジエンアミンバッファー（ｐＨ９．１９）を開示する。

【0005】

特許文献４は、グリケート化ヘモグロビンの毛管電気泳動検出に適する緩衝液として、水、糖複合体化化合物（ホウ酸、ホウ砂等）、緩衝液をｐＨ９〜１２とする塩基化合物、及びｐＫａが９〜１２の双性イオン化合物を含む緩衝液を開示する。

【0006】

特許文献５は、キャピラリ電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法を開示する。同文献は、キャピラリ管に含ませる緩衝液として、フマル酸、アルギニン酸及びコンドロイチン硫酸Ｃを含む緩衝液（ｐＨ４．８）に、非イオン性界面活性剤（ドデシルマルトシド等）を添加した緩衝液を開示する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】WO2010-010859号

【特許文献2】特開2009-109230号公報

【特許文献3】特開2006-145537号公報

【特許文献4】特表平9-510792号公報

【特許文献5】WO2008-136321号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

キャピラリ電気泳動法を用いた試料の分析方法は、必要とする試料が少量である点、及び、装置の小型化が可能な点など利点がある。一方で、臨床検査での利用の観点から、さらなる精度の向上と分析時間の短縮化が期待されている。

【0009】

しかしながら、分析時間の短縮化を図ろうとすると、電流値の増加及び／又は発熱が起り、ヘモグロビンの熱変性、ピーク幅の増大、メト化ヘモグロビンの発生、キャピラリ内における気泡発生等の恐れがあり、分析精度が十分でないという問題がある。例えば、WO 2010-010859 ではヘモグロビンの熱変性が問題となり、JP 2009-109230 A では亜硝酸塩の添加による電流値の増加による発熱量の増加が問題となり、いずれも分析精度の向上が難しい。また、JP 2006-145537 A 及びJP 09(1997)-510792 A では測定時間が長時間（例えば、１０分以上）となり、多数の試料を短時間で処理することが望まれる臨床検査には実質的に適用できないという問題がある。さらに、WO 2008-136321 の方法では、界面活性剤の作用によってヘモグロビンが変性し、ピーク幅の増大、メト化ヘモグロビンの発生等の恐れがあり、分析精度が十分でないという問題がある。

【0010】

そこで、本開示は、一態様において、分析精度の向上が可能なキャピラリ電気泳動を用いた試料の分析方法、キャピラリ電気泳動用溶液、及び試料分析用キットを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本開示は、一態様において、キャピラリ電気泳動により試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、分析対象物質の分離及び／又は検出が、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われる試料分析方法に関する。

【0012】

本開示は、その他の態様において、ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び、水を含有する、キャピラリ電気泳動用溶液を含有するキャピラリ電気泳動用溶液に関する。

【0013】

本開示は、その他の態様において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液、及び、キャピラリ電気泳動チップを含み、前記キャピラリ電気泳動チップが、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を含み、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップである試料分析用キットに関する。

【発明の効果】

【0014】

本開示によれば、一態様において、分析精度の向上が可能なキャピラリ電気泳動を用いた試料の分析方法、キャピラリ電気泳動用溶液、又は、試料分析用キットを提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１（Ａ）は、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す平面図である。図１（Ｂ）は、図１（Ａ）に示す電気泳動チップにＩ−Ｉ方向に見た断面図である。

【図2】図２（Ａ）は、実施例１のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。図２（Ｂ）は、実施例２のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。図２（Ｃ）は、比較例１のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。

【図3】図３（Ａ）は、実施例３のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。図３（Ｂ）は、実施例４のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。図３（Ｃ）は、比較例２のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。

【図4】図４（Ａ）は、実施例５のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。図４（Ｂ）は、比較例３のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。図４（Ｃ）は、比較例４のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。

【図5】図５は、実施例３のキャピラリ電気泳動用溶液を用いたキャピラリ電気泳動法によるエレクトロフェログラムの一例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本開示は、一態様において、キャピラリ電気泳動法の泳動中において分離対象の物質群と非界面活性剤型の両イオン性物質を存在させると、電気泳動中の電流値を低下させることで発熱を防ぐことができ、それにより分析精度を向上できるという知見に基づく。すなわち、本開示は一態様において、キャピラリ電気泳動により試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、分析対象物質の分離及び／又は検出が、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われる試料分析方法に関する。また、本開示はその他の態様において、泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、分析対象物質の分離及び／又は検出が、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われる試料分析方法に関する。

【0017】

［非界面活性剤型の両イオン性物質］
本開示において「非界面活性剤型の」とは、一又は複数の実施形態において、ミセルを形成しないことをいう。本開示において「ミセルを形成しない」とは、一又は複数の実施形態において、水性媒体中でミセルを形成しない、或いは、実質的にミセルを形成しないことをいう。本開示において「ミセルを形成しない、或いは、実質的にミセルを形成しない」とは、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が２００ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、より好ましくは３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは両イオン性物質が臨界ミセル濃度を持たないことをいう。

【0018】

また、非界面活性剤型の両イオン性物質は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、ｐＨ緩衝作用を有さない物質であることが好ましく、泳動条件のｐＨにおいてｐＨ緩衝作用を発揮しない又は実質的に発揮しない物質であることがより好ましい。限定されない一又は複数の実施形態において、後述するｐＨ緩衝物質としてｐＫａを泳動条件のｐＨの付近に有する物質の濃度が４０ｍｍｏｌ/Ｌのときに、非界面活性剤型の両イオン性物質を１００ｍｍｏｌ／Ｌを添加しても、ｐＨは好ましくは０．２以下、又は０．１以下の変動に留まり、ｐＨを変動させない又は実質的に変動させないことが好ましい。なお、本開示において「泳動条件のｐＨ」とは、一又は複数の実施形態において、泳動前にキャピラリ内に充填される泳動液（ランニングバッファー）のｐＨ、又は、試料若しくは試料を調製するための試料調製液のｐＨをいう。

【0019】

本開示において「両イオン性物質」として、限定されない一又は複数の実施形態において、双性イオン、又は、ベタインが挙げられる。本開示において「双性イオン」は、分子内塩とも呼ばれ、一又は複数の実施形態において、１分子内に正電荷と負電荷の両方を持つ分子をいう。本開示において「ベタイン」は、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置にもち、正電荷を持つ原子には解離しうる水素原子が結合しておらず、分子全体として電荷を持たない化合物をいう。本開示において「ベタイン」は、一又は複数の実施形態において、負電荷を与える基がスルホ基（-SO₃^-）であるスルホベタイン、負電荷を与える基がカルボキシル基（-COO^-）であるカルボキシベタイン、負電荷を与える基がリン酸基（-PO₄^-）であるホスホベタイン、を含む。

【0020】

非界面活性剤型の両イオン性物質は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、非界面活性剤型のベタインが好ましく、より好ましくは非界面活性剤型のスルホベタイン及びカルボキシベタインが挙げられ、さらに好ましくは四級アンモニウムカチオンとスルホ基（-SO₃^-）若しくはカルボキシル基（-COO^-）とを同一分子内の隣り合わない位置に有する非界面活性剤型の物質、さらにより好ましくは非界面活性剤型スルホベタイン（ＮＤＳＢ）である。ＮＤＳＢの限定されない一又は複数の実施形態として

【化1】

が挙げられる。

【0021】

［ｐＨ緩衝物質］
本開示において「ｐＨ緩衝物質」とは、一又は複数の実施形態において、泳動条件のｐＨ付近にｐＫａ又はｐＫｂを有する物質、及び、その対イオンとなる酸又は塩基のことをいう。泳動条件のｐＨ付近は、限定されない一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、泳動条件のｐＨの±２．５、±２．０、±１．５、又は、±１．０の範囲が好ましい。

【0022】

電気泳動は、分析対象物質の電荷状態によって分離する方法であるため、分析精度の向上の観点から、分析中の分析対象物質の電荷状態を一定の状態に規定することが好ましい。分析対象物質の電荷状態は、周囲のｐＨや、泳動条件のｐＨにおいて正電荷や負電荷となっている物質の影響を受けるため、「ｐＨ緩衝物質」、すなわち、泳動条件のｐＨ付近にｐＫａ又はｐＫｂを有する物質及びその対イオンとなる酸又は塩基を添加して、分析対象物質の電荷状態を一定とすることが好ましい。したがって、本開示においてｐＨ緩衝物質は、少なくとも１つの化合物であって、複数種類の化合物の組み合わせであってもよい。

【0023】

限定されない一又は複数の実施形態において、泳動条件のｐＨがｐＨ５．３の場合には、ｐＨ５．３付近にｐＫａを有する酸のクエン酸（ｐＫａ=４．８）又はプロピオン酸（ｐＫａ=４．９）などと、対イオンとなる塩基のナトリウム又はアルギニンなどを添加するか、或いは、ｐＨ５．３付近にｐＫａを有する塩基のクレアチニン（ｐＫａ＝４．８３）などと、対イオンとなる酸の塩素などを添加する。限定されないその他の一又は複数の実施形態において、泳動条件のｐＨがｐＨ７．２の場合には、ｐＨ７．２付近にｐＫａを有する酸のリン酸（ｐＫａ=７．２）などと、対イオンとなる塩基のナトリウムやアルギニンなどを添加するか、或いは、ｐＨ７．２付近にｐＫａを有する塩基のトリス（ｐＫａ=８．０）などと、対イオンとなる酸の塩素などを添加する。

【0024】

ｐＨ緩衝物質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、有機酸、無機酸、アミノ酸、及びその対イオンとなる酸又は塩基、並びに、これらの組み合わせが挙げられる。有機酸としては、限定されない一又は複数の実施形態において、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸、クエン酸、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-Morpholinopropanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）、ＴＲＩＣＩＮＥ（N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine）、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)），ＰＯＰＳＯ（Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid), dihydrate）、炭酸又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。無機酸としては、限定されない一又は複数の実施形態において、リン酸、ホウ酸が挙げられる。アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。塩基は、限定されない一又は複数の実施形態において、有機酸、無機酸、及び／又はアミノ酸に加えて使用される。塩基として、限定されない一又は複数の実施形態において、強塩基、弱塩基、又はジアミン化合物などが挙げられる。強塩基としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。弱塩基としては、限定されない一又は複数の実施形態において、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジメチルアミノエタノール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、クレアチニン等が挙げられる。ジアミン化合物としては、１，４−ジアミノブタン等が挙げられる。

【0025】

弱塩基を使用すると、強塩基を使用した場合と比較してイオンの移動速度が遅いことから泳動中の電流値を抑制することができる。電気浸透流の速度において、イオンの移動速度の遅い弱塩基は遅い電気浸透流の速度となるように思えるが、多くの弱塩基は強塩基と比較して分子量が大きいために、電気浸透流の速度が同じか大きく損なうことはない。したがって、ｐＨ緩衝物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、弱塩基を含むことが好ましい。

【0026】

［イオン性の擬似固定相］
キャピラリ電気泳動法の１つに、擬似固定相を用いる動電クロマトグラフィーがある。例えば、WO 2010-010859 では、コンドロイチン硫酸などのアニオン性基含有化合物、すなわち、イオン性の擬似固定相を使用して血中タンパク質を分離することが開示される。イオン性擬似固定相を用いるキャピラリ電気泳動法においては、泳動中に試料中の物質とイオン性擬似固定相との相互作用を行わせることにより、試料中の物質をイオン性擬似固定相との親和性（分配係数の差）に応じて分離することで分析対象物質を他の物質から分離させている。

【0027】

イオン性の擬似固定相を用いるキャピラリ電気泳動法において電気泳動液にベタイン型両性界面活性剤を添加することは提案されたことがある（例えば、WO 2010-010859）。しかしながら、ベタイン型両性界面活性剤を電気泳動液に添加すると、電流値は低下するが、測定時間が長時間化したり、ピーク幅が増大したりするという問題があった。

【0028】

本開示は、その他の一態様において、イオン性の擬似固定相を用いるキャピラリ電気泳動法の泳動中において分離対象の物質群とイオン性擬似固定相とが相互作用する場に非界面活性剤型の両イオン性物質を存在させると、電流値の増加を抑制しつつ測定時間の短縮化が可能になるという知見に基づく。非界面活性剤型の両イオン性物質により電流値の増加を抑制しつつ測定時間の短縮化が可能となるメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように推測される。すなわち、分離対象の物質群とイオン性擬似固定相との相互作用が非界面活性剤型の両イオン性物質によって阻害されることにより、分離対象の物質群とイオン性擬似固定相の相互作用のターンオーバーが促進される。それにより測定時間が短縮化されると推測される。ただし、本開示はこれらのメカニズムに限定されて解釈されなくてもよい。

【0029】

したがって、本開示は、その他の一態様において、キャピラリ電気泳動により試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、分析対象物質の分離及び／又は検出が、イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われる試料分析方法に関する。本態様によれば、分析精度の向上と測定時間の短縮化が可能な、キャピラリ電気泳動を用いた試料の分析方法が提供されうる。

【0030】

本開示において「イオン性の擬似固定相」とは、一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動法に用いるものであって、試料中の物質を親和性（分配係数の差）に応じて分離することで試料中の分析対象物質を他の物質から分離させる目的、すなわち、分離精度を向上する目的で使用されるイオン性の物質をいう。イオン性の擬似固定相は、一又は複数の実施形態において、試料及び／又は分析対象物質に応じ、すでに使用され又は今後使用され得るイオン性擬似固定相を選択して使用できる。イオン性の擬似固定相は、一又は複数の実施形態において、アニオン性又はカチオン性のポリマーであってもよい。前記ポリマーは、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、多糖類であってもよい。

【0031】

［分析対象物質］
本開示において「分析対象物質」としては、限定されない一又は複数の実施形態において、タンパク質、生体内物質、血液中物質等が挙げられ、タンパク質の具体例としてはヘモグロビン、アルブミン、グロブリン等が挙げられる。ヘモグロビンとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、糖化ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、変異ヘモグロビン、マイナーヘモグロビン、修飾ヘモグロビン等が挙げられ、より具体的には、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−ＨｂＡ１ｃ）、ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＡ１ｄ（ＨｂＡ１ｄ）、ヘモグロビンＡ１ｅ（ＨｂＡ１ｅ）、ヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ、鎌状赤血球ヘモグロビン）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ、胎児ヘモグロビン）、ヘモグロビンＭ（ＨｂＭ）、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、ヘモグロビンＤ（ＨｂＤ）、ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）、メト化ヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン、アルデヒド化ヘモグロビン、及び不安定型ＨｂＡ１ｃ（ｌ−ＨｂＡ１ｃ）等が挙げられる。生体内物質及び血中物質等としては、限定されない一又は複数の実施形態において、ビリルビン、ホルモン、代謝物質等が挙げられる。ホルモンとしては、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質剌激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、インスリン、グルカゴン、副腎髄質ホルモン、エピネフリン、ノルエピネフリン、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロン、アルドステロン、コルチゾール等が挙げられる。前述したイオン性の擬似固定相を用いる場合の分析対象物質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、糖化ヘモグロビン、変異ヘモグロビン、マイナーヘモグロビン、修飾ヘモグロビン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

【0032】

本開示において「試料」としては、限定されない一又は複数の実施形態において、試料原料から調製したもの、又は試料原料そのものをいう。試料原料としては、限定されない一又は複数の実施形態において、上記分析対象物質を含むもの、及び／又は、生体試料が挙げられる。生体試料としては、限定されない一又は複数の実施形態において、血液、赤血球成分を含む血液由来物、唾液、髄液等が含まれる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、限定されない一又は複数の実施形態において、動物の血液、哺乳類の血液、ヒトの血液が挙げられる。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むものが挙げられ、限定されない一又は複数の実施形態において、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球等が挙げられる。

【0033】

キャピラリ電気泳動法を用いた試料分析において、分析の正確性や再現性を向上させることを目的として校正用物質（Calibration Material）を用いることがある。また、分析の正確性や再現性を管理又は維持することを目的として精度管理用物質（Control Material）を用いることがある。このため、本開示における「試料」又は「試料原料」は、限定されない一又は複数の実施形態において、校正用物質や精度管理用物質を含みうる。なお、本開示において「校正用物質」は、例えば、装置の校正等に用いられる標準物質を含み、「精度管理用物質」は、分析の正確性及び／又は再現性の管理又は維持に用いる試料を含み、例えば、管理血清、プール血清、管理全血及び標準液等が挙げられる。

【0034】

限定されない一又は複数の実施形態において、分析対象物質がヘモグロビン又はＨｂＡ１ｃのように正の電荷を有する場合、イオン性擬似固定相は、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、アニオン性基を有する多糖類であることが好ましい。アニオン性基を有する多糖類として、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、及びリン酸化多糖類が挙げられ、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、硫酸化多糖類及びカルボン酸化多糖類が好ましい。硫酸化多糖類としては、限定されない一又は複数の実施形態において、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、又はその塩等が挙げられ、中でもコンドロイチン硫酸又はその塩が好ましい。コンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸、ヒアルロン酸又はその塩等が挙げられる。アニオン性基を有する多糖類が塩である場合、対イオンとしては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アミン化合物、有機塩基等のイオンが挙げられる。カルボン酸化多糖類の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリス塩、アルギニン塩、リジン塩、ヒスチジン塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩、ジメチルアミノエタノール塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、クレアチニン塩等がある。カルボン酸化多糖類としては、限定されない一又は複数の実施形態において、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、アルギン酸又はその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が好ましい。また、分析対象物質がヘモグロビン又はＨｂＡ１ｃである一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動による分析対象物質の分離及び／又は検出は、分析精度の向上の観点から、ｐＨは、３．０〜６．９、又は、４．０〜６．０のキャピラリ電気泳動用溶液及び／又は泳動液を用いて行われることが好ましい。

【0035】

［キャピラリ電気泳動用溶液］
本開示において「キャピラリ電気泳動用溶液」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、キャピラリ電気泳動前にキャピラリ流路に充填される泳動液（以下、「ランニングバッファー」ともいう）、試料をキャピラリに導入後に試料に換えて泳動のために用いる泳動液、これらの泳動液を調製するための溶液、又は、試料を調製するための溶液（以下、「試料調製液」ともいう）の少なくとも１つとして使用できる溶液をいう。キャピラリ電気泳動前にキャピラリ流路に充填される泳動液（ランニングバッファー）と、試料をキャピラリに導入後に試料に換えて泳動のために用いる泳動液は、同じ液組成でもよいし、異なっていてもよい。

【0036】

本開示は、一態様において、ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び、水を含有するキャピラリ電気泳動用溶液に関する。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、本開示の試料分析方法に使用でき、それにより、試料分析の分析精度の向上に寄与できる。

【0037】

本開示は、その他の一態様において、イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び、水を含有するキャピラリ電気泳動用溶液に関する。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、本開示の試料分析方法に使用でき、それにより、試料分析の分析精度の向上と測定時間の短縮化に寄与できる。

【0038】

本開示の試料分析方法において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、分析精度向上の観点から、少なくとも試料調製液として使用される。本開示の試料分析方法の限定されない一又は複数の実施形態において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、以下のケースで使用されうる；
試料調製液としてのみ使用されるケース；
ランニングバッファー又は該ランニングバッファーを調製するための溶液、並びに、試料調製液として使用されるケース；
試料をキャピラリに導入後に試料に換えて泳動のために用いる泳動液又は該泳動液を調製するための溶液、並びに、試料調製液として使用されるケース；
ランニングバッファー又は該ランニングバッファーを調製するための溶液としてのみ使用されるケース；
試料をキャピラリに導入後に試料に換えて泳動のために用いる泳動液又は該泳動液を調製するための溶液としてのみ使用されるケース；
ランニングバッファー又は該ランニングバッファーを調製するための溶液、試料をキャピラリに導入後に試料に換えて泳動のために用いる泳動液又は該泳動液を調製するための溶液、並びに、試料調製液として使用されるケース。

【0039】

本開示のキャピラリ電気泳動用溶液を、どのような実施形態で使用して本開示の試料分析方法を行うかは、分析対象物質、ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び、イオン性の擬似固定相（使用する場合）に応じて当業者が適切に判断できる。

【0040】

〔非界面活性剤型の両イオン性物質〕
非界面活性剤型の両イオン性物質についての説明及び実施形態については上述したとおりである。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液をランニングバッファーとして使用する場合、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液における非界面活性剤型の両イオン性物質の含有量は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、１０〜２０００ｍＭであり、好ましくは１００〜１０００ｍＭ、より好ましくは２００〜６００ｍＭである。

【0041】

〔ｐＨ緩衝物質〕
ｐＨ緩衝物質についての説明及び実施形態については上述したとおりである。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液をランニングバッファーとして使用する場合、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液におけるｐＨ緩衝物質の含有量は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上の観点から、５〜５００ｍＭであり、好ましくは１０〜３００ｍＭ、より好ましくは２０〜１００ｍＭである。

【0042】

〔イオン性擬似固定相〕
イオン性擬似固定相についての説明及び実施形態については上述したとおりである。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液をランニングバッファーとして使用する場合であって、イオン性の擬似固定相を測定時間短縮化の目的で使用する場合、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液におけるイオン性擬似固定相の含有量は、一又は複数の実施形態において、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、０．００１〜１０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜５ｗ／ｖ％である。

【0043】

〔水〕
本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、媒体として水を含有する。本開示において「媒体として水」とは、一又は複数の実施形態において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液が緩衝液を含む場合、該緩衝液に含まれる水を含む。水としては、蒸留水、イオン交換水、純水及び超純水等が使用され得る。

【0044】

〔保存剤〕
本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、微生物の繁殖などを抑制するための保存剤を含んでいてもよく、例えば、アジ化ナトリウム、エチルパラベン、プロクリンなどを含んでいてもよい。

【0045】

〔キャピラリ電気泳動用溶液のｐＨ〕
本開示のキャピラリ電気泳動用溶液のｐＨは、試料及び／又は分析対象物質に応じ、すでに使用され又は今後使用され得るｐＨの範囲を選択して使用できる。ｐＨの調整は、一又は複数の実施形態において、必要に応じて、酸又は塩基を添加することで行うことができる。一又は複数の実施形態において、分析対象物質がヘモグロビンである場合、キャピラリ電気泳動用溶液のｐＨは、分析精度向上の観点から、３．０〜６．９、又は、４．０〜６．０が好ましい。なお、上記のｐＨは、２５℃におけるキャピラリ電気泳動用溶液のｐＨであり、ｐＨメータを用いて測定でき、電極の浸漬後４０分後の数値である。

【0046】

〔その他の成分〕
本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、さらに、試料調製液として試料原料を処理する（例えば、血球の溶血を促進する）観点から非イオン性界面活性剤を含んでもよい。本開示のキャピラリ電気泳動用溶液における非イオン性界面活性剤の濃度は、一又は複数の実施形態において、不溶成分の可溶化の点から０．０１ｗ／ｖ％以上が好ましく、より好ましくは０．０５ｗ／ｖ％以上である。また、取り扱いが容易になる点から２ｗ／ｖ％以下が好ましく、より好ましくは１ｗ／ｖ％以下である。

【0047】

〔有機酸、塩基〕
また、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、さらに、有機酸又は塩基を含みうる。キャピラリ内壁がカチオン性物質又はアニオン性物質で被覆されたキャピラリを用いて、キャピラリ電気泳動溶液に、それぞれ、アニオン性擬似固定相又はカチオン性擬似固定相を用いた場合には、アニオン性擬似固定相又はカチオン性擬似固定相がキャピラリ内壁に電気的に結合し、キャピラリ内壁を被覆する場合がある。この場合、擬似固定相の分子量が大きいと、擬似固定相がキャピラリ内壁を完全に被覆できず、擬似固定相の隙間の部分にキャピラリ内壁のカチオン性物質又はアニオン性物質が表面に露出する場合がある。このとき、キャピラリ内に通液させるキャピラリ電気泳動用溶液又はその他の液が、例えばカルボキシル基、スルホン酸基などの酸性官能基を２以上の有する有機酸、又は、例えばアミノ基などの塩基性官能基を２以上の有する塩基を含有すると、キャピラリ内壁のカチオン性物質に有機酸の１つの酸性官能基、又は、アニオン性物質に塩基の１つの塩基性官能基が結合し、残りの有機酸の酸性官能基、又は、塩基の塩基性官能基がキャピラリ内壁に露出することで、有効にアニオン性又はカチオン性とすることができる。このような、有機酸として、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、フタル酸、マロン酸、リンゴ酸、クエン酸、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯなどが挙げられ、塩基としては、アルギニン、リジンなどがある。したがって、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、これらの有機酸を含有してもよい。これらの有機酸は、ｐＨ緩衝物質と同一物質であってもよい。

【0048】

また、一又は複数の実施形態において、キャピラリ内壁がカチオン性物質で被覆されたキャピラリを用いて、キャピラリ内壁をアニオン性にする場合、塩基としての１つの塩基性官能基と、水酸基などのアニオン性となり易い官能基とを有する化合物を選択することが好ましい。例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジメチルアミノエタノール、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンなどがある。キャピラリ内壁がアニオン性物質で被覆されたキャピラリを用いて、キャピラリ内壁をカチオン性にする場合、酸としての１つの酸性官能基と、１〜３級アミノ基などのカチオン性となり易い官能基とを有する化合物を選択することが望ましい。例えば、ＡＣＥＳ、４−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸などがある。２価以上の酸と２価以上の塩基を用いると、液の粘性が上昇し、電気浸透流の速度が遅くなったり、イオンの速度の低下により分析時間の遅延が発生したりする場合がある。しかし、前記のような塩基及び酸の組み合わせ、例えば、塩基としての１つの塩基性官能基と水酸基などのアニオン性となり易い官能基とを有する化合物を用いることで、液の粘性が変化することなく、電気浸透流の速度を維持し、分析時間を維持したまま分析が可能となる。

【0049】

したがって、本開示は、一態様において、試料の分析方法であって、泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、さらに、キャピラリ内壁がカチオン性物質で被覆されたキャピラリに対し、アニオン性の擬似固定相と酸性官能基が２つ以上有する酸とを含む液、又は、１つの塩基性官能基とアニオン性となり易い官能基とを有する弱塩基化合物を含む液を接触させることを含む試料分析方法に関する。

【0050】

［キャピラリ電気泳動用溶液の調製方法］
本開示のキャピラリ電気泳動用溶液は、一又は複数の実施形態において、ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び、水、さらに、必要に応じてイオン性の擬似固定相を、最終含有量が上述の各範囲となるように混合することで調製できる。その他の態様として、キャピラリ電気泳動用溶液を濃縮物として調製してもよい。

【0051】

［試料分析方法］
本開示の試料分析方法における「キャピラリ電気泳動により試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うこと」は、一又は複数の実施形態において、泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含む。

【0052】

本開示の試料分析方法における「分析対象物質の分離及び／又は検出」は、キャピラリ電気泳動により分離された分析対象物質を光学的手法により検出する工程を含んでいてもよい。光学的手法による検出としては、例えば、吸光度の測定が挙げられる。吸光度の波長は、試料、分析対象物質の種類に応じて適宜決定できる。

【0053】

本開示の試料分析方法は、さらに、光学的手法により得られたエレクトロフェログラムを解析する工程を含んでいてもよい。連続的にサンプリングしながら分離（キャピラリ電気泳動）を行う場合、得られるエレクトロフェログラムからは試料中の分析対象物質を個別に分析することは因難であるが、解析処理を行うことにより、試料中の分析対象物質を個別に分離・分析できる。解析工程は、エレクトロフェログラムを演算処理することにより、移動度（分離時間）に応じて分離したエレクトロフェログラムを得ることを含んでいてもよく、処理後のエレクトロフェログラムにおける各ピークの高さ及び／又はピークの面積に基づき、試料中の分析対象物質の成分比を求めることを含んでいてもよい。演算処理としては、例えば、微分処理、差分処理が挙げられる。

【0054】

本開示の試料分析方法におけるキャピラリ流路は、一又は複数の実施形態において、内径が１００μｍ以下である管である。管の断面形状は、特に制限されず、円でも、矩形でも、その他の形状でもよい。また、キャピラリの長さは、特に制限されないが、本開示の試料分析方法は、例えば、１０〜１５０ｍｍであり、又は、２０〜６０ｍｍである。

【0055】

本開示の試料分析方法におけるキャピラリ電気泳動は、キャピラリ流路がマイクロチップ化されたキャピラリ電気泳動チップを用いて行うことが好ましい。電気泳動チップの大きさは、一又は複数の実施形態において、長さ１０〜２００ｍｍ、幅１〜６０ｍｍ、厚み０．３〜５ｍｍであり、又は、長さ３０〜７０ｍｍ、幅１〜６０ｍｍ、厚み０．３〜５ｍｍである。キャピラリ電気泳動チップの限定されない実施形態は後述する。

【0056】

本開示の試料分析方法において、分析に十分な量の試料が流路に供給された後、試料に替えて泳動液及び／又は洗浄液を流路に導入してもよい。この場合、泳動液は、流路に充填されていた泳動液と同じであってもよいし、異なっていてもよい。

【0057】

［分析対象物質の測定方法］
本開示は、さらにその他の態様として、試料中の分析対象物質の測定方法であって、本開示の試料分析方法を用いて試料中の分析対象物質を測定することを含む方法に関する。試料及び分析対象物質は上記のとおりである。分析対象物質の限定されない一実施形態が、ヘモグロビンであり、ＨｂＡ１ｃであり、又は、糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃである。また、本開示の測定方法は、限定されない一又は複数の実施形態において、糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃとその他のヘモグロビン成分とを測定する。したがって、本開示は、さらにその他の態様として、本開示の試料分析方法を用いてＨｂＡ１ｃを測定することを含むＨｂＡ１ｃの測定方法に関し、糖尿病の診断を行う観点から、本開示の試料分析方法を用いて安定型ＨｂＡ１ｃをその他のヘモグロビン成分と分離して測定することが好ましい。

【0058】

［試料分析用キット］
本開示は、さらにその他の態様として、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液、及び、キャピラリ電気泳動チップを含む試料分析用キットに関する。本開示のキットにおいて、キャピラリ電気泳動チップは、限定されない一又は複数の実施形態において、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を含み、前記試料保持槽と前記泳動液保持槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップが挙げられる。本開示の測定用キットは、限定されない一又は複数の実施形態において、さらに、校正用物質及び精度管理用物質を含んでいてもよい。

【0059】

以下、本開示の試料分析方法について、限定されない一実施形態を説明する。

【0060】

（実施の形態１）
図１に示すキャピラリ電気泳動チップを用い、試料原料が全血であり、分析対象物質がヘモグロビンである場合を例にとり説明する。

【0061】

図１は、本開示の試料分析方法に使用するキャピラリ電気泳動チップの構成の限定されない一又は複数の実施形態を示す概念図である。図１に示すキャピラリ電気泳動チップ１は、下基板２ｂに上基板２ａが積層されている構成である。上基板２ａには２つの貫通孔が形成され、下基板２ｂで封止されることで試料保持槽４及び泳動液（ランニングバッファー）保持槽５が形成されている。下基板２ｂにはＩ字状の溝が形成されており、この溝の上部に上基板２ａが積層されることでキャピラリ流路３が形成されている。試料保持槽４及び泳動液保持槽５は、キャピラリ流路３で連通している。試料保持槽４からｘｍｍ及び泳動液保持槽５からｙｍｍの位置が検出部６である。キャピラリ流路３の長さ（ｘ＋ｙ）は、キャピラリ電気泳動チップの長さに応じて適宜決定されるが、限定されない一又は複数の実施形態において、１０〜１５０ｍｍ、又は、２０〜６０ｍｍである。キャピラリ流路３の内径は、限定されない一又は複数の実施形態において、１００μｍ以下、１０〜１００μｍ、又は、２５〜７５μｍである。また、流路３の形状は、特に制限されず、円でも、矩形でも、その他の形状でもよい。キャピラリ電気泳動チップ全体の大きさは、限定されない一又は複数の実施形態において、長さ１０〜２００ｍｍ、幅１〜６０ｍｍ、厚み０．３〜５ｍｍであり、又は、長さ３０〜７０ｍｍ、幅１〜６０ｍｍ、厚み０．３〜５ｍｍである。

【0062】

キャピラリ流路３の材質は、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等が挙げられる。プラスチック製としては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等が挙げられる。キャピラリ流路３の内壁は、限定されない一又は複数の実施形態において、アニオン性基含有化合物、カチオン性基含有化合物、無極性化合物等で被覆されていてもよい。例えば、シリル化剤、アニオン性基含有多糖類、官能基含有化合物等で被覆されていてもよい。シリル化剤等によるキャピラリ流路３の内壁の被覆は、例えば、国際公開２００８／０２９６８５号、国際公開２００８／１３４６５号、特開２００９−１８６４４５号公報、特願２０１１−２３９３６５号に記載された方法等と同様に行うことができる。また、内壁は、キャピラリ電気泳動用溶液又はその他の液を通液することで、前記液中に含まれる擬似固定相などの物質により被覆してもよい。また、キャピラリ流路３は、市販のキャピラリであってもよい。

【0063】

試料保持槽４及び泳動液保持槽５の容積は、流路の内径及び長さ等に応じて適宜決定されるが、例えば、それぞれ、１〜１０００ｍｍ³の範囲であり、好ましくは５〜１００ｍｍ³の範囲である。試料保持槽４及び泳動液保持槽５は、キャピラリ流路３の両端に電圧を印加するための電極をそれぞれ備えていてもよい。

【0064】

キャピラリ流路３、試料保持槽４及び泳動液保持槽５は、試料及び泳動液の蒸発を抑制し、濃度変化を低減する点から、必要に応じて上面がシール材等により覆われていることが好ましい。

【0065】

つぎに、図１に示すキャピラリ電気泳動チップを用いた試料の分析方法の一例について説明する。

【0066】

まず、キャピラリ電気泳動チップの泳動液保持槽５に本開示のキャピラリ電気泳動用溶液を泳動液として充填し、毛細管現象により前記泳動液をキャピラリ流路３に充填する。

【0067】

つぎに、キャピラリ流路３に本開示のキャピラリ電気泳動用溶液が充填された前記キャピラリ電気泳動チップの試料保持槽４に試料を配置する。

【0068】

試料保持槽４に配置する試料は、試料原料である全血を本開示のキャピラリ電気泳動用溶液により希釈することにより調製できる。試料原料の希釈率は、例えば、１．２〜１００倍であり、好ましくは２〜３０倍、より好ましくは３〜１５倍である。また、試料原料中に分離能に影響を及ぼし得る程度にイオン成分が含まれている場合、試料原料の希釈率は、例えば、２〜１０００倍であり、好ましくは５〜３００倍、より好ましくは１０〜２００倍である。

【0069】

ついで、キャピラリ流路３の両端、すなわち、試料保持槽４及び泳動液保持槽５との間に電圧を印加する。これにより、試料保持槽４からキャピラリ流路３への試料の導入及びキャピラリ流路３において分離が行われ、ヘモグロビンを含む試料が試料保持槽４から泳動液保持槽５に向かって移動する。キャピラリ流路３の両端に印加する電圧は、例えば、０．５〜１０ｋＶであり、好ましくは０．５〜５ｋＶである。

【0070】

そして、所定の位置において測定を行う。測定は、例えば、吸光度測定等の光学的手法により行うことができる。分析対象物質がヘモグロビンの場合は、例えば、波長４１５ｎｍの吸光度の測定を行うことが好ましい。

【0071】

測定を行う位置、すなわち、分離に要する長さ（図１におけるｘ）は、キャピラリ流路３の長さ等に適宜決定できる。例えば、キャピラリ流路３の長さが１０〜１５０ｍｍである場合、キャピラリ流路３の試料保持槽４側の端部からの５〜１４０ｍｍの位置、１０〜１００ｍｍ、又は、１５〜５０ｍｍである。

【0072】

上述のように分析を行うことによって、ヘモグロビンの測定を行うことができ、好ましくはＨｂＡ１ｃとその他のヘモグロビン成分、さらに好ましくは糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃとその他のヘモグロビン成分とを分離して測定することができる。その他のヘモグロビン成分としては、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＳ、ＨｂＦ、ＨｂＡ２、ＨｂＣ等が挙げられる。さらに、得られたエレクトロフェログラムを解析することにより、例えば、ＨｂＡ１ｃの比率（％ＨｂＡ１ｃ）やＨｂＡ１ｃの量を測定することができる。このため、本開示の試料分析方法は、糖尿病の予防、診断及び治療等の用途に利用することができる。

【0073】

なお、上記実施形態では、試料原料として全血を溶血処理した溶血試料を使用し、それを試料調製液で希釈した試料を用いた場合を例にとり説明したが、本開示はこれに限定されるものではない。分析対象試料は、例えば、生体から採取したままの試料原料（例えば、溶血した血液）そのものであってもよいし、試料原料を溶媒（本開示のキャピラリ電気泳動用溶液）で希釈した試料であってもよい。試料原料は、例えば、血液を含む血液試料でもよいし、ヘモグロビンを含有する市販品を含む試料であってもよい。血液試料としては、特に制限されず、例えば、全血等の血球含有物を溶血処理した溶血試料等があげられる。前記溶血処理は、特に制限されず、例えば、超音波処理、凍結解凍処理、加圧処理、浸透圧処理、界面活性剤処理等があげられる。前記浸透圧処理は、特に制限されないが、全血等の血球含有物を低張液等で処理してもよい。前記低張液としては、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されないが、例えば、前述の緩衝剤、添加剤等を含んでもよい。前記界面活性剤処理としては、特に限定されないが、例えば、非イオン性界面活性剤等を用いる処理があげられる。前記非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００」）等があげられる。

【0074】

本開示の試料分析方法によるヘモグロビンの分析においては、限定されない一又は複数の実施形態において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液中に陰イオン性のカオトロピックイオンを含んでいてもよく、例えば、特開２００９−１８６４４５号公報などに記載された方法等と同様に行うことができる。

【0075】

また、本開示の試料分析方法によるヘモグロビンの分析においては、限定されない一又は複数の実施形態において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液中に、カルボキシル基を二つ以上有する酸性物質であって、少なくとも二つのカルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ）が泳動液のｐＨよりも２．５、２．０、１．５、又は１．０を超えて低いものを含んでいてもよく、例えば、特開２０１１−１４９９３４号報などに記載された方法等と同様に行うことができる。前記酸性物質として、限定されない一又は複数の実施形態において、トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，１−シクロヘキサン二酢酸、（１α，２α，４α）−１，２，４−シクロヘキサントリカルボン酸、１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサカルボン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−酒石酸、L−酒石酸、フマル酸、クエン酸、アスパラギン酸、フタル酸、Ｄ−リンゴ酸等がある。

【0076】

また、本開示の試料分析方法によるヘモグロビンの分析においては、限定されない一又は複数の実施形態において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液中に、疎水部としてアルキル基を有し、親水部として糖を有する非イオン性界面活性剤を含んでいてもよく、試料中に、ベタイン型両性界面活性剤を含んでいてもよく、例えば、WO 2008-136321 などに記載された方法等と同様に行うことができる。

【0077】

また、本開示の試料分析方法によるヘモグロビンの分析においては、限定されない一又は複数の実施形態において、本開示のキャピラリ電気泳動用溶液中に、ヘモグロビンの性状を均一化するためのヘモグロビン変性剤を含んでいてもよく、例えば、アジ化ナトリウム、フェリシアン化カリウムなどを含んでいてもよい。

【0078】

［測定値の算出方法］
上記のような試料分析方法を用いて試料中の分析対象物質を測定する場合において、分析対象物質の相対濃度を測定値として算出することがある。例えば、ＨｂＡ（成人型Ｈｂ）に対する安定型ＨｂＡ１ｃの比率を測定値としてＨｂＡ１ｃ％（＝安定型ＨｂＡ１ｃ量／ＨｂＡ量×１００）やＨｂＡ１ｃ ｍｍｏｌ／ｍｏｌ（＝安定型ＨｂＡ１ｃ量／ＨｂＡ量×１０００）といった単位で算出する場合がある。しかし、試料中にＨｂＡ以外のヘモグロビン成分である変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンが多量に含まれる場合がある。変異ヘモグロビンとしては、ＨＢＳ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＭなどがあり、マイナーヘモグロビンとしては、ＨｂＦ、ＨｂＡ２などがある。これらの変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンも、ＨｂＡと同様に糖化が生じて、糖化変異ヘモグロビンや糖化マイナーヘモグロビンが生じる。

【0079】

安定型ＨｂＡ１ｃを酵素や抗体を用いて測定する方法があり、一般的に安定型ＨｂＡ１ｃ濃度とヘモグロビン濃度を測定することで安定型ＨｂＡ１ｃの比率を測定値として求めている。これらの方法において変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンが多量に含まれる試料を測定したときに、酵素や抗体の特異性により安定型ＨｂＡ１ｃのみの濃度を測定できる場合と、安定型ＨｂＡ１ｃに加えて糖化変異ヘモグロビンや糖化マイナーヘモグロビンも含めた濃度を測定してしまう場合がある。ヘモグロビン濃度の測定は、多くの場合にはＨｂＡと変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンとを区別することなく、総ヘモグロビン濃度として測定するため、安定型ＨｂＡ１ｃに加えて糖化変異ヘモグロビンや糖化マイナーヘモグロビンも含めた濃度を測定している場合には、安定型ＨｂＡ１ｃの比率の値は変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンの影響を受けないか、受けても比較的軽微な影響であるが、安定型ＨｂＡ１ｃ濃度しか測定していない場合には、安定型ＨｂＡ１ｃの比率の値は、変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンの影響により低値となる。

【0080】

これ対して、ヘモグロビンを様々な分画に分離して測定する分離分析法、例えばＨＰＬＣによる陽イオン交換クロマトグラフィーや等電点クロマトグラフィー、キャピラリ電気泳動、ゲル電気泳動などにおいては、安定型ＨｂＡ１ｃ、糖化変異ヘモグロビン、糖化マイナーヘモグロビン、ＨｂＡ、変異ヘモグロビン、マイナーヘモグロビンなどを分離できる場合がある。このような分離分析法においては、その分離のさせ方により、安定型ＨｂＡ１ｃを他のヘモグロビンの成分から分離できる場合や、安定型ＨｂＡ１ｃと糖化変異ヘモグロビンや糖化マイナーヘモグロビンとが分離できない場合、ＨｂＡと変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンとを分離できる場合、ＨｂＡと変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンが分離できない場合がある。

【0081】

安定型ＨｂＡ１ｃを他のヘモグロビンの成分から分離できた場合でも、ＨｂＡと変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンを区別することなく計算するとヘモグロビンの量が大きく計算され、安定型ＨｂＡ１ｃの比率を誤って低く計算した結果となる。このような誤りを防ぐために、変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンを除いたＨｂＡのみの量を用いて計算することで、正しい安定型ＨｂＡ１ｃの比率の値が求められる。計算の一例としては、安定型ＨｂＡ１ｃ％＝安定型ＨｂＡ１ｃ量／（全ヘモグロビン量−変異ヘモグロビン量）×１００、安定型ＨｂＡ１ｃ％＝安定型ＨｂＡ１ｃ量／（全ヘモグロビン量−マイナーヘモグロビン量）×１００といった式で求めることができる。一方で、安定型ＨｂＡ１ｃと糖化変異ヘモグロビンや糖化マイナーヘモグロビンを分離して測定できない場合には、ＨｂＡと変異ヘモグロビンやマイナーヘモグロビンを合わせた値を用いることが望ましい。計算の一例としては、安定型ＨｂＡ１ｃ％＝（安定型ＨｂＡ１ｃ量＋糖化変異ヘモグロビン量）／（ＨｂＡと変異ヘモグロビンを含んだヘモグロビン量）×１００、安定型ＨｂＡ１ｃ％＝（安定型ＨｂＡ１ｃ量＋糖化マイナーヘモグロビン量）／（ＨｂＡとマイナーヘモグロビンを含んだヘモグロビン量）×１００といった式で求めることができる。

【0082】

また、全ヘモグロビンに対するマイナーヘモグロビンや変異ヘモグロビンの比率を測定値として、変異ヘモグロビンの％といったように、例えば、ＨｂＦ％やＨｂＳ％といったとように算出する場合がある。しかし、ヘモグロビンの種類毎に１つのピークとして分離されないことがあり、例えば、ＨｂＡが安定型ＨｂＡ１ｃや不安定型ＨｂＡ１ｃやそれ以外のＨｂＡに分かれている場合がある。このような場合、ＨｂＡに由来する各成分の量を合計してＨｂＡの量を計算するか、全ヘモグロビン量からマイナーヘモグロビンや変異ヘモグロビンの量を差し引いた値をＨｂＡの量とすることが望ましい。計算の一例として、変異ヘモグロビン％＝変異ヘモグロビン量／（全ヘモグロビン量−変異ヘモグロビン量）×１００、マイナーヘモグロビン％＝マイナーヘモグロビン量／（安定型ＨｂＡ１ｃ量＋不安定型ＨｂＡ１ｃ量＋ＨｂＡ０量）×１００といった式で求めることができる。

【0083】

一実施形態として、図５のエレクトロフェログラムから安定型ＨｂＡ１ｃ％、ＨｂＦ％、ＨｂＡ％を算出する。図５のエレクトロフェログラムは、ＨｂＦ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、及び、ＨｂＳを含む試料を、後述する実施例３のキャピラリ電気泳動用溶液を用いて実施例３と同様の条件でキャピラリ電気泳動を行った結果の一例である。各ヘモグロビンの量は各ピークの終わりの吸光度から始まりの吸光度を差し引いて求めた。なお、安定型ＨｂＡ１ｃには、糖化ＨｂＦ及び糖化ＨｂＳは含まれていない。
ＨｂＦ ６２
安定型ＨｂＡ１ｃ ２１
ＨｂＡ０ ３４９
ＨｂＳ ２９８
安定型ＨｂＡ１ｃ％、ＨｂＦ％、ＨｂＡ％は、下記のように計算することが可能となる。
安定型ＨｂＡ１ｃ％＝２１／３４９×１００＝６．０％
ＨｂＦ％＝６２／（６２＋２１＋３４９＋２９８）＝８．５％
ＨｂＡ％＝（２１＋３４９）／（６２＋２１＋３４９＋２９８）＝５０．７％

【0084】

すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ａ１］ 試料の分析方法であって、
キャピラリ電気泳動により試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、
分析対象物質の分離及び／又は検出が、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われる、試料分析方法。
［Ａ２］ 試料の分析方法であって、
泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、
前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、
分析対象物質の分離及び／又は検出が、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われる、試料分析方法。
［Ａ３］ 分析対象物質の分離及び／又は検出が、イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質の存在下で行われる、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の試料分析方法。
［Ａ４］ 前記試料が、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質を含有する、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ５］ 前記試料が、イオン性の擬似固定相、ｐＨ緩衝物質及び非界面活性剤型の両イオン性物質を含有する、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ６］ 非界面活性剤型の両イオン性物質は、ミセルを形成しない両イオン性物質である、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ７］ 非界面活性剤型の両イオン性物質は、ｐＨ緩衝作用を有さない物質である、［Ａ１］から［Ａ６］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ８］ 非界面活性剤型の両イオン性物質が、非界面活性剤型のベタインである、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ９］ 非界面活性剤型の両イオン性物質が、四級アンモニウムカチオン、及び、スルホ基（-SO₃^-）若しくはカルボキシル基（-COO^-）を同一分子内の隣り合わない位置に有する物質である、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ１０］ ｐＨ緩衝物質は、そのｐＫａ又はｐＫｂの値が、泳動条件のｐＨの±２．０の範囲に含まれる物質である、［Ａ１］から［Ａ９］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ１１］ イオン性の擬似固定相が、アニオン性又はカチオン性のポリマーである、［Ａ３］から［Ａ１０］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ１２］ 試料が、ヘモグロビンを含む試料である、［Ａ１］から［Ａ１１］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ１３］ 試料が、分析対象物質として、安定型ＨｂＡ１ｃ（ｓ−ＨｂＡ１ｃ）、ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）、ヘモグロビンＡ１ａ（ＨｂＡ１ａ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、ヘモグロビンＡ１ｄ（ＨｂＡ１ｄ）、ヘモグロビンＡ１ｅ（ＨｂＡ１ｅ）、ヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ、鎌状赤血球ヘモグロビン）、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ、胎児ヘモグロビン）、ヘモグロビンＭ（ＨｂＭ）、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）、ヘモグロビンＤ（ＨｂＤ）、ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）、メト化ヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン、アルデヒド化ヘモグロビン、及び不安定型ＨｂＡ１ｃ（ｌ−ＨｂＡ１ｃ）からなる群から選択される物質を含む、［Ａ１］から［Ａ１２］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ１４］ キャピラリ電気泳動の泳動液のｐＨが、３．０〜６．９である、［Ａ１］から［Ａ１３］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ１５］ イオン性の擬似固定相が、アニオン性基を有する多糖類である、［Ａ３］から［Ａ１４］のいずれかに記載の試料分析方法。
［Ａ１６］ ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び、水を含有する、キャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ１７］ さらに、イオン性の擬似固定相を含有する、［Ａ１６］記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ１８］ 非界面活性剤型の両イオン性物質は、ミセルを形成しない両イオン性物質である、［Ａ１６］又は［Ａ１７］に記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ１９］ 非界面活性剤型の両イオン性物質は、ｐＨ緩衝作用を有さない物質である、［Ａ１６］から［Ａ１８］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ２０］ 非界面活性剤型の両イオン性物質が、非界面活性剤型のベタインである、［Ａ１６］から［Ａ１９］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ２１］ 非界面活性剤型の両イオン性物質が、四級アンモニウムカチオン、及び、スルホ基（-SO₃^-）若しくはカルボキシル基（-COO^-）を同一分子内の隣り合わない位置に有する物質である、［Ａ１６］から［Ａ２０］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ２２］ ｐＨ緩衝物質は、そのｐＫａ又はｐＫｂの値が、泳動条件のｐＨの±２．０の範囲に含まれる物質である、［Ａ１６］から［Ａ２１］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ２３］ イオン性の擬似固定相が、アニオン性又はカチオン性のポリマーである、［Ａ１７］から［Ａ１２２］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ２４］ イオン性の擬似固定相が、アニオン性基を有する多糖類である、［Ａ１７］から［Ａ２３］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ２５］ 泳動液のｐＨが、３．０〜６．９である、［Ａ１６］から［Ａ２４］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液。
［Ａ２６］ ［Ａ１６］から［Ａ２５］のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動用溶液、及び、キャピラリ電気泳動チップを含み、
前記キャピラリ電気泳動チップは、試料貯留槽、泳動液貯留槽及びキャピラリ流路を含み、前記試料貯留槽と前記泳動液貯留槽とが前記キャピラリ流路により連通している電気泳動チップである、試料分析用キット。
［Ａ２７］ さらに、校正用物質、及び／又は、精度管理用物質を含む、［Ａ２６］記載の試料分析用キット。
［Ａ２８］ 試料の分析方法であって、
泳動液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入すること、及び、前記流路の全体又は一部に電圧を印加してキャピラリ電気泳動を行い前記試料中の分析対象物質の分離及び／又は検出を行うことを含み、
さらに、
キャピラリ内壁がカチオン性物質で被覆されたキャピラリに対し、
アニオン性の擬似固定相と酸性官能基が２つ以上有する酸とを含む液、又は、１つの塩基性官能基とアニオン性となり易い官能基とを有する弱塩基化合物を含む液を接触させることを含む、試料分析方法。

【実施例】

【0085】

以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。

【0086】

実施例１〜４及び比較例１〜２
［１．キャピラリ電気泳動用溶液の調製］
４０ｍＭクエン酸、１ｗ／ｖ％コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（和光純薬工業社製）、０．１ｗ／ｖ％エマルゲンＬＳ−１１０（花王社製）を混合し、ジメチルアミノエタノールを添加してｐＨを５．３に調整し、比較例１のキャピラリ電気泳動用溶液を調製した（表１）。

【0087】

この比較例１のキャピラリ電気泳動用溶液に最終濃度が５００ｍＭ及び２５０ｍＭとなるようにＮＤＳＢ−２０１(3-(1-Pyridino)-1-pronane sulfonate、非界面活性剤型スルホベタイン、Affymetrix社製)を添加して、それぞれ、実施例１及び２のキャピラリ電気泳動用溶液を調製した（表１）。また、比較例１と同じキャピラリ電気泳動用溶液を比較例２のキャピラリ電気泳動用溶液として調製し、この比較例２のキャピラリ電気泳動用溶液に最終濃度が５００ｍＭとなるようにベタイン(トリメチルグリシン、非界面活性剤型ベタイン、和光純薬工業社製)を添加し実施例３のキャピラリ電気泳動用溶液を調製し、２５０ｍＭとなるようにＮＤＳＢ−２１１（Dimethyl(2-hydroxyethyl)ammonium propane sulfonate、非界面活性剤型スルホベタイン、Affymetrix社製)を添加し実施例４のキャピラリ電気泳動用溶液を調製した（表２）。

【0088】

［２．試料原料の準備］
抗凝固剤入りの採血管を用いて採取された健常人の全血を試料原料とした。

【0089】

［３．分離デバイス（キャピラリ電気泳動チップ）］
試料分析用のキャピラリ電気泳動デバイスとして、図１に示すキャピラリ電気泳動チップ１を用いた。このキャピラリ電気泳動チップ１は、下基板２ｂに上基板２ａが積層されている構成である。上基板２ａには２つの貫通孔が形成され、下基板２ｂで封止されることで試料保持槽４及び泳動液（ランニングバッファー）保持槽５が形成されている。下基板２ｂにはＩ字上の溝が形成されており、この溝の上部に上基板２ａが積層されることでキャピラリ流路３が形成されている。試料保持槽４及び泳動液保持槽５は、キャピラリ流路３で連通している。キャピラリ流路３の断面積は０．０４×０．０４ｍｍであり、試料保持槽４及び泳動液保持槽５間の距離は３０ｍｍである。試料保持槽４から２０ｍｍ及び泳動液保持槽５から１０ｍｍの位置を検出部６とした。

【0090】

〔キャピラリ電気泳動チップＡ及びＢの製造〕
キャピラリ電気泳動チップＡは、上記キャピラリ電気泳動チップ１の流路内にタンパク質（ヘモグロビン）を吸着させ、さらにコンドロイチン硫酸でコーティングした。具体的には、ヘモグロビン溶液をキャピラリに満たして十分に疎水吸着させた後、４０ｍＭのクエン酸と１ｗ／ｖ％のコンドロイチン硫酸を含む溶液（ｐＨ５．３）をキャピラリに通液してコーティングした。

【0091】

キャピラリ電気泳動チップＢは、上記キャピラリ電気泳動チップ１の流路内をシランカップリング剤（３-アミノプロピルトリメトキシシラン）で処理してアミノ基を導入し、さらにコンドロイチン硫酸でコーティングした。具体的には、４０ｍＭのクエン酸と１ｗ／ｖ％のコンドロイチン硫酸を含む溶液（ｐＨ５．３）をキャピラリに通液してコーティングした。

【0092】

［４．キャピラリ電気泳動］
実施例１，２及び比較例１のキャピラリ電気泳動用溶液及びキャピラリ電気泳動チップＡを使用して下記条件Ａでキャピラリ電気泳動を行った。また、実施例３，４及び比較例２のキャピラリ電気泳動用溶液及びキャピラリ電気泳動チップＢを使用して下記条件Ｂでキャピラリ電気泳動を行った。得られたエレクトロフェログラムを図２及び３に示し、測定された平均電流値の相対値を表２及び３に示す。なお、平均電流値とは、電気泳動開始から終了までの電極間の電流値を平均することにより算出される。
〔測定装置〕
キャピラリ電気泳動チップのキャピラリ電気泳動は、アークレイ社製の装置を用いて行った。キャピラリ電気泳動チップ１の検出部６において、４１５ｎｍの波長における吸光度を測定した。吸光度の測定は、電気泳動開始から終了まで、０．０２秒間隔で連続的に行った。
〔泳動条件Ａ〕
１：キャピラリ電気泳動チップＡ上の泳動液保持槽５に比較例１のキャピラリ電気泳動用溶液９μＬを添加して、キャピラリ３内に比較例１のキャピラリ電気泳動用溶液を充填する。
２：次に、実施例１，２及び比較例１の各キャピラリ電気泳動用溶液で試料原料を２５倍に希釈して調製した試料９μＬを、チップ上の試料保持槽に添加する。
３：次に、試料保持槽４に陽電極、泳動液保持槽５に負電極を接触させ、１８００Ｖの電圧を印加して電気泳動を開始する。
４：検出部にて４１５ｎｍの吸光度を測定し、エレクトロフェログラムを得る。また、電圧印加中は電流値を測定する。電気泳動は９０秒間行う。
〔泳動条件Ｂ〕
１：キャピラリ電気泳動チップＢ上の泳動液保持槽５に比較例２のキャピラリ電気泳動用溶液９μＬを添加して、キャピラリ３内に比較例２のキャピラリ電気泳動用溶液を充填する。
２：次に、実施例３，４及び比較例２の各キャピラリ電気泳動用溶液で試料原料を２５倍に希釈して調製した試料９μＬを、チップ上の試料保持槽に添加する。
３：次に、試料保持槽４に陽電極、泳動液保持槽５に負電極を接触させ、１８００Ｖの電圧を印加して電気泳動を開始する。
４：検出部にて４１５ｎｍの吸光度を測定し、エレクトロフェログラムを得る。また、電圧印加中は電流値を測定する。電気泳動は９０秒間行う。

【0093】

【表1】

【表2】

【0094】

図２及び図３から、非界面活性剤型両イオン性物質を添加したキャピラリ電気泳動用溶液で試料を調製して用いた実施例１〜４では、添加していない比較例１及び２に比べ検出時間が短くなった。

【0095】

また、図２に示すとおり、比較例１ではメト化ヘモグロビンが検出されているのに対し、実施例１及び２ではメト化ヘモグロビンの発生が抑制された。このとき、実施例１及び２では比較例１よりも電気泳動中の電流値の増加が抑制されていた（表１）。

【0096】

さらに、図３に示すとおり、実施例３及び４では比較例２よりもピーク幅の増大が抑制された。このとき、実施例３及び４では比較例２よりも電気泳動中の電流値の増加が抑制されていた（表２）。

【0097】

キャピラリ電気泳動チップＡ及びＢではキャピラリ流路３の内壁処理条件が異なるが、短時間の測定及び電流値増加の抑制という効果は共通していた。また、実施例１〜４では非界面活性剤型両イオン性物質が異なるが、短時間の測定及び電流値増加の抑制という効果は共通していた。

【0098】

実施例５及び比較例３〜４
［１．キャピラリ電気泳動用溶液の調製］
比較例１と同じように、比較例３のキャピラリ電気泳動用溶液を調製した。

【0099】

この比較例３のキャピラリ電気泳動用溶液に最終濃度が２５０ｍＭとなるようにＮＤＳＢ−２０１を添加して、実施例５のキャピラリ電気泳動用溶液を調製した（実施例２と同じ）。また、比較例３のキャピラリ電気泳動用溶液に最終濃度が１．０ｖ／ｖ％となるようにパルミチルスルホベタイン（商品名 ＳＢ３-１６，東京化成工業社製）を添加し比較例４のキャピラリ電気泳動用溶液を調製した。

【0100】

［２．試料原料及び分離デバイス］
前述の全血を試料原料として使用した。キャピラリ電気泳動チップは、前記キャピラリ電気泳動チップＢを使用した。

【0101】

［３．キャピラリ電気泳動］
実施例５及び比較例３，４のキャピラリ電気泳動用溶液及びキャピラリ電気泳動チップＢを使用して下記条件Ｃでキャピラリ電気泳動を行った。得られたエレクトロフェログラムを図２及び３に示し、測定された平均電流値の相対値を表４に示す。
〔測定装置〕
キャピラリ電気泳動チップのキャピラリ電気泳動は、前述と同じ装置を用いた。
〔泳動条件Ｃ〕
１：キャピラリ電気泳動チップＢ上の泳動液保持槽５に実施例５及び比較例３、４の各キャピラリ電気泳動用溶液９μＬを添加して、キャピラリ３内にキャピラリ電気泳動用溶液を充填する。
２：次に、実施例５及び比較例３、４の各キャピラリ電気泳動用溶液で試料原料を２５倍に希釈して調製した試料９μＬを、チップ上の試料保持槽に添加する。
３：次に、試料保持槽４に陽電極、泳動液保持槽５に負電極を接触させ、１６００Ｖの電圧を印加して電気泳動を開始する。
４：検出部にて４１５ｎｍの吸光度を測定し、エレクトロフェログラムを得る。また、電圧印加中は電流値を測定する。電気泳動は６０秒間行う。

【0102】

【表3】

【0103】

表３及び図４の実施例５の結果から、泳動開始前に流路内に非界面活性剤型両イオン性物質が存在する場合であっても電流値抑制と分析時間短縮に効果があることが確認された。

【0104】

また、表３及び図４の比較例４の結果から、非界面活性剤型両イオン性物質に換えて界面活性剤型の両イオン性物質を使用した場合、電流値抑制には効果があるものの、分析時間の短縮には効果がないことが確認された。

【符号の説明】

【0105】

１： キャピラリ電気泳動チップ
２： 基板
２ａ：上基板
２ｂ：下基板
３： キャピラリ流路
４： 試料保持槽
５： 泳動液保持槽
６： 検出部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】