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特許5978034オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質の凝集を評価するための方法、およびタンパク質溶液を含有する、オルガノポリシロキサンでコーティングされた医療用品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5978034
(24)【登録日】2016年7月29日
(45)【発行日】2016年8月24日
(54)【発明の名称】オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質の凝集を評価するための方法、およびタンパク質溶液を含有する、オルガノポリシロキサンでコーティングされた医療用品
(51)【国際特許分類】
A61M 5/28 20060101AFI20160817BHJP
A61J 1/05 20060101ALI20160817BHJP
【ＦＩ】
A61M5/28
A61J1/00 311
【請求項の数】8
【全頁数】41
(21)【出願番号】特願2012-154844(P2012-154844)
(22)【出願日】2012年7月10日
(62)【分割の表示】特願2010-531196(P2010-531196)の分割
【原出願日】2008年10月22日
(65)【公開番号】特開2012-205923(P2012-205923A)
(43)【公開日】2012年10月25日
【審査請求日】2012年7月10日
【審判番号】不服2014-15514(P2014-15514/J1)
【審判請求日】2014年8月6日
(31)【優先権主張番号】60/999,920
(32)【優先日】2007年10月22日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】PCT/US2008/068136
(32)【優先日】2008年6月25日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】595117091
【氏名又は名称】ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
(73)【特許権者】
【識別番号】308032460
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ
(74)【代理人】
【識別番号】110001243
【氏名又は名称】特許業務法人 谷・阿部特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジョセフ ティー．トロッター
(72)【発明者】
【氏名】ジャン−バーナード ハメル
(72)【発明者】
【氏名】ジョン フランク カーペンター
(72)【発明者】
【氏名】セオドア ランドルフ
(72)【発明者】
【氏名】ジョン ポール ガブリエルソン
【合議体】
【審判長】
長屋 陽二郎
【審判官】
関谷 一夫
【審判官】
平瀬 知明
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第０１／１７５４２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許第５３３８３１２（ＵＳ，Ａ）
【文献】
特開平８−３８６００（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００６−１８２９６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００９−５２３１０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００１−５０４３２６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
A61M 5/28
A61J 1/05
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）溶液を受けるためのチャンバーを含む容器であって、前記チャンバーの内表面は、１，０００ｃＳｔから１００，０００ｃＳｔの範囲の粘性を有するオルガノポリシロキサンを含む組成物から調製されたコーティングをその上に有する、容器と、
（ｂ）（ｉ）モノクローナル抗体、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、および／または関節リウマチ治療薬からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質性物質と、
（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの糖と
を含む溶液と
を含むことを特徴とする医療用品。
（ｂ）（ｉ）モノクローナル抗体、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、および／または関節リウマチ治療薬からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質性物質と、
（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの糖と
を含む溶液と
を含むことを特徴とする医療用品。
【請求項2】
チャンバーはシリンジバレル、薬剤カートリッジ容器、無針注射器容器、液体分注装置容器、および液体計量装置容器からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の医療用品。
【請求項3】
チャンバーはシリンジバレルであることを特徴とする請求項２に記載の医療用品。
【請求項4】
チャンバーはガラス、金属、セラミック、プラスチック、ゴム、またはそれらの組合せから形成されることを特徴とする請求項１に記載の医療用品。
【請求項5】
チャンバーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（１−ブテン）、ポリ（２−メチル−１−ペンテン）、および環状ポリオレフィンからなる群から選択されるオレフィンポリマーから調製されることを特徴とする請求項１に記載の医療用品。
【請求項6】
オルガノポリシロキサンはポリジメチルシロキサンであることを特徴とする請求項１に記載の医療用品。
【請求項7】
チャンバーの内表面の少なくとも一部と滑り係合する外表面を有する密封部材をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の医療用品。
【請求項8】
（ａ）溶液を受けるためのチャンバーを含む容器であって、前記チャンバーの内表面は、１，０００ｃＳｔから１００，０００ｃＳｔの範囲の粘性を有するオルガノポリシロキサンを含む組成物から調製されたコーティングをその上に有する、容器と、
（ｂ）（ｉ）モノクローナル抗体、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、および／または関節リウマチ治療薬からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質性物質と、
（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの糖と、
（ｉｖ）少なくとも１つの塩と
を含む溶液と
を含むことを特徴とする医療用品。
（ｂ）（ｉ）モノクローナル抗体、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、および／または関節リウマチ治療薬からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質性物質と、
（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの糖と、
（ｉｖ）少なくとも１つの塩と
を含む溶液と
を含むことを特徴とする医療用品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質性（proteinaceous）物質の凝集を評価するための方法、およびオルガノポリシロキサン（単数または複数）（organopolysiloxane(s)）でコーティングされた表面を有し、タンパク質性物質の懸濁液を含む医療用部品に関する。
【背景技術】
【0002】
関連出願の相互参照本出願は、全体として本明細書に参照により組み込まれている２００７年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９９９，９２０号の利益を主張する。本出願はまた、２００８年６月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８１３６号の利益を主張し、その出願は、２００７年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９３７，１７９号の利益を主張し、その両方の出願は、全体として本明細書に参照により組み込まれている。本出願はまた、特願２０１０−５３１１９６号の分割出願である。
【0003】
治療用タンパク質は、糖尿病、癌、血友病、関節リウマチ、多発性硬化症、および心筋梗塞などの疾患および状態の多数の独特かつ重要な治療をもたらす。市場にはすでに、数十個のタンパク質製品があり、何百個を超えるものが前臨床および臨床開発中である。さらに、抗体を「ヒト化する」ための頑強な方法が最近、出現したことで、ヒト疾患の治療ついて調べられている抗体製品の数の驚異的な増加により、バイオテクノロジー製品の開発が新たに復活している。現代のゲノムおよびプロテオミクスのアプローチを用いて、新規の、より安全かつ効果的なタンパク質治療用物質が日々、発見されつつある。しかしながら、タンパク質製品が十分に安定化することができない場合には、そのヒトの健康への恩恵は決して実現されることはないであろう。典型的なタンパク質医薬品の経済的に成り立つために必要とされる貯蔵期間は、１８〜２４カ月である。この目標を達成することは、天然状態におけるタンパク質の熱力学的安定性が比較的低いために、特に困難である。タンパク質の活性はその天然の３次元構造に依存する。加えて、タンパク質は、折り畳まれていない状態より天然状態に熱力学的には大きく有利に働く条件（例えば、３７℃で中性ｐＨ）下でさえも、非天然の凝集物および沈殿物の形成を非常に起こしやすい。凝集物におけるタンパク質の生物活性は、通常、大きく低下する。より重要なことには、非天然タンパク質凝集物は、免疫応答またはアナフィラキシーショックなどの、患者において有害な反応を引き起こすことがあり得る。所定のタンパク質の凝集物の有害応答を誘導する能力は予測することができず；安全性に必要とされる凝集物の最大レベルも、費用と時間のかかる臨床試験なしに決定することはできない。
【0004】
したがって、製剤科学の主要な目標は、凝集が極めて低レベルに保持される製剤を設計することである。一般的に、目標は、製品の有効期間にわたってタンパク質集団全体のわずか１〜２％だけが凝集物を形成するようにしておくことである。タンパク質の物理的安定性が、バルク溶液においてタンパク質凝集を最小にするように最適化されているように見える溶液条件下でさえも、全タンパク質集団のほんのわずかな割合を構成し得る、肉眼で見えるタンパク質粒子および肉眼では見えないタンパク質粒子の形成があり得る。少数のタンパク質粒子の存在でさえも、製品を臨床的に許容できないものにすることがあり得る。タンパク質微粒子は特に免疫原性である。微粒子は、治療用タンパク質製品においては、（タンパク質分子がアルミニウム塩粒子に結合している）ワクチン製剤にとって望ましいが、そのような粒子に対する免疫応答は、患者において重篤な有害応答を引き起こすことがあり得る。したがって、凝集するタンパク質の質量が、本質的には製品の効力に有害な効果を生じないほどに小さいことがあるにしても、安全性は大いに損なわれ得る。
【0005】
粒子形成は、バイアル／シリンジ充填中のタンパク質溶液のパンピングなどの処理段階の間に日常的に起こり得る。他の場合、粒子形成は無作為であるように見え得る。例えば、粒子は、所定の製品ロットにおいてわずかな割合のバイアルまたはプレフィルドシリンジ（prefilled syringes））に見ることができる。またある時には、所定のロットのバイアルまたはシリンジへ充填された製品が、その容器の大部分でタンパク質粒子を形成する場合がある。残念なことに、これらの粒子は、滅菌濾過段階の下流で出現し、皮下、皮内、または筋肉内注射における濾過によって除去することができない。
【0006】
シリコーンオイルは、一般的に、医療用品における潤滑剤として用いられる。シリコーンオイルは、酸化を受けにくいが、プレフィルドシリンジについて遊走および粘着が起こり得、高いブレークアウト（breackout）力および／またはブレークルース（breackloose）力が問題である。シリコーンオイルは、低濃度でさえも、特定の条件下でタンパク質凝集を誘導することが示されている。エリスロポエチン（例えば、Ｒｅｃｏｒｍｏｎ（商標）およびＥｐｒｅｘ（商標））、インターフェロン（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（商標）およびＲｅｂｉ（商標））、および関節リウマチ治療薬（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（商標）およびＨｕｍｉｒａ（商標））を含むいくつかの新しく商品化された水性タンパク質製品は、プレフィルドシリンジとして製造される。プレフィルドシリンジの内表面は、シリンジ機能を増強するためにシリコーンオイルでコーティングされ、その結果として、製剤化されたタンパク質は、シリコーンオイル表面に曝される。シリコーンオイルにより誘導される治療用タンパク質凝集は、製薬産業における懸案事項であり、製品の損失および製造コストの増加をもたらす可能性がある。
【0007】
凝集を阻害するように溶液中に含み得る適切な凝集阻害剤を決定するために、タンパク質性物質を有する水性懸濁液または乳濁液を評価する方法が必要である。これらの調査の結果は、シリコーンオイル誘導性タンパク質凝集に抵抗性であるタンパク質製剤を開発する方法に関して会社へアドバイスするために必要とされる理解を提供するであろう。加えて、迅速な製剤スクリーニングを可能にする実験系が望ましい。したがって、製薬会社およびバイオテクノロジー会社は、合理的な製剤開発計画に従って、迅速に、シリコーンオイル誘導性タンパク質凝集および患者における潜在的有害応答の問題を回避する各タンパク質についての最適な製剤にたどり着くことができる。開発中の新しいシリンジまたは医療用品を試験するために用いることができるモデルタンパク質および適切な溶液条件を決定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許第６，５２５，１４４号明細書
【特許文献2】米国特許第６，５１１，７５６号明細書
【特許文献3】米国特許第５，５９９，８８２号明細書
【特許文献4】米国特許第５，０３４，４８２号明細書
【特許文献5】米国特許第７，０３７，９９３号明細書
【特許文献6】米国特許第６，９９５，２２６号明細書
【特許文献7】米国特許第６，９０８，９７０号明細書
【特許文献8】米国特許第６，６５３，４２４号明細書
【特許文献9】米国特許第６，４８６，２６４号明細書
【特許文献10】米国特許第７，０２６，４０１号明細書
【特許文献11】米国特許第６，９５１，８９８号明細書
【特許文献12】米国特許第６，０６３，８８６号明細書
【特許文献13】米国特許第５，８６６，６６２号明細書
【特許文献14】米国特許第５，８５６，４１４号明細書
【特許文献15】米国特許第５，６２３，０３９号明細書
【特許文献16】米国特許第５，６１０，２５３号明細書
【特許文献17】米国特許第５，８５４，３４９号明細書
【特許文献18】米国特許第５，６５０，４７１号明細書
【特許文献19】米国特許第４，９５９，４０２号明細書
【特許文献20】米国特許第４，９９４，５５２号明細書
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】J.H. Jettら、"Quantitation of Cell Surface Antigen Density by Flow Cytometry", 4th Annual Symposium of Flow Cytometry, Voss, Norway (June 4, 1979)(January 1, 1979発表)（要約）
【非特許文献2】"Polycyclic olefins", process Economics Program (July 1998) SRI Consulting
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質性物質の凝集を評価するための方法であって、（ａ）蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の水性懸濁液を供給するステップと、（ｂ）蛍光活性化粒子選別を用いて、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対粒子蛍光強度を測定するステップと、（ｃ）蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度を蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較するステップとを含む方法を提供する。
【0011】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質性物質の凝集を評価するための方法であって、（ａ）蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の水性懸濁液を供給するステップであって、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質がそれぞれ、レーザーにより放射される同じ波長の光に曝された場合、第１の波長範囲内の光を放射する第１の蛍光部分でオルガノポリシロキサンは標識され、２の波長範囲内の光を放射する第２の蛍光部分でタンパク質性物質は標識され、第１の波長範囲が第２の波長範囲との重複を実質的に含まない、ステップと、（ｂ）蛍光活性化粒子選別を用いて、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対粒子蛍光強度を測定するステップと、（ｃ）蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度を蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較するステップとを含む方法を提供する。
【0012】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質性物質の凝集を阻害するための方法であって、（ａ）蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の複数の水性懸濁液を供給するステップであって、各水性懸濁液は、非イオン性界面活性剤および糖からなる群から選択される少なくとも１つの凝集阻害剤をさらに含み、（ｉ）少なくとも１つの凝集阻害剤が各水性懸濁液において異なるか、または（ｉｉ）凝集阻害剤の量が各水性懸濁液において異なる、ステップと、（ｂ）蛍光活性化粒子選別を用いて、各水性懸濁液において蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対粒子蛍光強度を測定するステップと、（ｃ）各水性懸濁液について蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度を蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較するステップと、（ｄ）各水性懸濁液についての蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度の蛍光標識タンパク質性物質の相対強度との比較に基づいて、タンパク質性物質を含む懸濁液に用いる少なくとも１つの凝集阻害剤を選択するステップとを含む方法を提供する。
【0013】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、（ａ）溶液を受けるためのチャンバーを含む容器であって、チャンバーの内表面は、オルガノポリシロキサンを含む組成物から調製されたコーティングをその上に有する、容器と、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのタンパク質性物質と、（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの糖とを含む溶液とを含む医療用品を提供する。
【0014】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、（ａ）溶液を受けるためのチャンバーを含む容器であって、チャンバーの内表面は、オルガノポリシロキサンを含む組成物から調製されたコーティングをその上に有する、容器と、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのタンパク質性物質と（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤を含む溶液とを含む医療用品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
本発明は、添付された図面と共に読む場合、以下の特定の実施形態の記載から最も良く理解されるであろう。【図1A】スクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤、ならびにｍＡｂおよびシリコーンオイルを含む製剤についての、時間の関数としてのｍＡｂのシリコーンオイルとの吸着／凝集のプロットの図である。
【図1B】本発明による、スクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤、ならびにスクロース、非イオン性界面活性剤、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤についての、時間の関数としてのｍＡｂのシリコーンオイルとの吸着／凝集のプロットの図である。
【図2A】スクロースも界面活性剤も含まない対照製剤についてのＦＬ１強度およびＦＬ２強度の蛍光強度散布図である。
【図2B】スクロースを含む製剤についてのＦＬ１強度およびＦＬ２強度の蛍光強度散布図である。
【図2C】非イオン性界面活性剤を含む製剤についてのＦＬ１強度およびＦＬ２強度の蛍光強度散布図である。
【図2D】本発明によるスクロースおよび非イオン性界面活性剤を含む製剤についてのＦＬ１強度およびＦＬ２強度の蛍光強度散布図である。
【図3A】スクロースも界面活性剤も含まない対照製剤についてのシリコーンオイル液滴の側方光散乱（９０°光散乱）対前方光散乱（１８０°光散乱）の散布図である。
【図3B】スクロースを含む製剤についてのシリコーンオイル液滴の側方光散乱（９０°光散乱）対前方光散乱（１８０°光散乱）の散布図である。
【図3C】非イオン性界面活性剤を含む製剤についてのシリコーンオイル液滴の側方光散乱（９０°光散乱）対前方光散乱（１８０°光散乱）の散布図である。
【図3D】本発明による非イオン性界面活性剤を含む製剤についてのシリコーンオイル液滴の側方光散乱（９０°光散乱）対前方光散乱（１８０°光散乱）の散布図である。
【図4A】スクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤、ならびにｍＡｂおよびシリコーンオイルを含む製剤についての、時間の関数としての光オブスキュレーションのプロットの図である。
【図4B】本発明による、スクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤、ならびにスクロース、非イオン性界面活性剤、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤についての、時間の関数としての光オブスキュレーションのプロットの図である。
【図5A】スクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤、ならびにｍＡｂおよびシリコーンオイルを含む製剤についての、時間の関数としてのｍＡｂのシリコーンオイルとの吸着／凝集のプロットの図である。
【図5B】スクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤、ならびにスクロース、非イオン性界面活性剤、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤についての、時間の関数としてのｍＡｂのシリコーンオイルとの吸着／凝集のプロットの図である。
【図6】前方光散乱および側方光散乱に基づいた、シリコーンオイル液滴の仮説的表示および集塊物分布の図である。
【図7】３つの異なるシリコーンオイル粘性についての、シリコーンオイル乳剤の時間の関数としての光オブスキュレーションのプロットの図である。
【図8】１０００ｃＳｔシリコーンオイルから調製された製剤についてのシリコーンオイル液滴の側方光散乱（９０°光散乱）対前方光散乱（１８０°光散乱）の散布図である。
【図9】１２，５００ｃＳｔシリコーンオイルから調製された製剤についてのシリコーンオイル液滴の側方光散乱（９０°光散乱）対前方光散乱（１８０°光散乱）の散布図である。
【図10】本発明によるオルガノポリシロキサン溶液の試料を調製および分析するための方法のフローチャートである。
【図11】Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素およびナイルレッド色素の波長の関数としての、標準化された蛍光励起スペクトルおよび発光スペクトルのプロットの図である。
【図12A】非標識シリコーンオイルの試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図12B】ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルの試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図12C】Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図12D】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図13A】完全球形のサイズ範囲についての粒子体積の関数としての理論的粒子表面積のプロットの図である。
【図13B】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、粒子体積の関数としての粒子表面積のプロットの図である。
【図14A】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図14B】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図15A】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図15B】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図16A】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図16B】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および１５０ｍＭの塩の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図16C】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．５Ｍのスクロースの試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図16D】本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、０．５Ｍのスクロース、１５０ｍＭの塩、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図17A】本発明による、１０μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図17B】本発明による、１０μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図17C】本発明による、２μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【図17D】本発明による、２μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットの図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
操作例、または別に規定がある場合以外、本明細書および特許請求の範囲に用いられた成分量、反応条件などを表す全ての数は、全ての場合において用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、反対の規定がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示された数値パラメーターは、本発明によって獲得しようとする所望の性質に依存して変動し得る近似値である。少なくとも、かつ均等論の適用を特許請求の範囲に限定しようとする試みとしてではなく、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数を考慮に入れ、かつ通常の丸め技術を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【0017】
広範にわたる本発明に示された数値範囲およびパラメーターは近似値であることにかかわらず、特定の例に示された数値はできる限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は本質的に、それらの個々の試験測定値に見出される標準偏差に必然的に起因するある程度の誤差を含む。さらに、変動範囲の数値域が本明細書に示されている場合、列挙された値を含めたこれらの値の任意の組合せを用いてもよいことが企図される。
【0018】
また、本明細書に列挙された任意の数値域が、それに包含される全ての部分的範囲を含むことを意図されることは理解されるべきである。例えば、「１から１０」の範囲は、１の列挙された最小値と１０の列挙された最大値を含む、それらの値の間の全ての部分的範囲を含む、すなわち、１以上の最小値および１０以下の最大値を有することを意図される。
【0019】
いかなる理論によっても縛られるつもりはないが、タンパク質粒子形成は、外来材料のナノ粒子およびマイクロ粒子の表面上でのタンパク質凝集物の不均一な核形成から生じることができる。これらの微粒子混入物として、バイアル充填ポンプから脱落した金属またはシリコーン、ガラスシリンジの製造中に生成されたタングステンマイクロ粒子、および高温発熱物質除去手順（high-temperature depyrogenation process）の結果として脱落したガラスナノ粒子を挙げることができる。いくつかの非限定的な実施形態において、本発明の方法は、表面がシリコーンオイル（単数または複数）またはオルガノポリシロキサン（単数または複数）でコーティングされているプレフィルドシリンジの調製に関して有用であり得る。シリコーンオイルは、製品を注射する時、シリンジのバレル中を通るストッパーの滑らかで自由な運動を保証するのに望ましい。シリコーンオイルの微液滴によって核形成され得るシリコーンオイル処理されたプレフィルドシリンジにおけるタンパク質粒子の形成がまた、心配の種であり得る。そのような粒子−およびその粒子から生じ得るタンパク質凝集物−は、どこにでもあるが、事実上、その問題およびその問題を司る機構の系統的特徴付けは、どの文献にも扱われていない。そのような洞察がなければ、産業界は、タンパク質凝集事象、ならびにその結果として生じる、製品の損失、費用の増加、および患者への安全性リスクに悩まされ続けるであろう。
【0020】
均一なタンパク質凝集は、天然状態アンサンブルを、構造的に拡大した立体構造から構造的に最もコンパクトな種へシフトさせる熱力学的安定剤（例えば、スクロース）を用いることによって阻害することができる。スクロースなどの安定剤は、それらがタンパク質分子の表面から優先的に排除されるため、タンパク質の熱力学的安定性を増加させる。優先的排除と同時に起こるのは、タンパク質の化学ポテンシャルの増加である。これらの２つの効果の大きさは、溶媒に曝されたタンパク質の表面積に正比例し、曝された残基の側鎖の化学的性質には依存しない。優先的に排除された溶質は、天然状態アンサンブル内での最もコンパクトな天然状態と完全に折り畳まれていない状態または構造的に拡大した種との間の自由エネルギー障壁を増加させ、これは、後者がより大きな表面積を有し、それゆえに、化学ポテンシャルの増加がより大きいからである。したがって、スクロースは、平衡を、構造的に拡大した凝集能力の高い種からシフトさせる。
【0021】
タンパク質分子集団内の種分布の熱力学的調節に加えて、溶液中のタンパク質−タンパク質相互作用のエネルギー特性は、タンパク質凝集の動態の重要な決定因子である。タンパク質の部分的アンフォールディングは、凝集を引き起こすにはそれだけでは十分ではない。それらはまた、２つ以上のタンパク質分子が凝集するアセンブリー反応に従わなければならない。このプロセスの動態は、タンパク質−タンパク質分子間エネルギーによって調節され、そのエネルギーは、溶液条件を変えることによって変化させることができる。そのような「コロイド」安定性は、第２の浸透圧ビリアル係数、Ｂ２２に関連し得る。このパラメーターは、タンパク質分子間の電荷−電荷相互作用によって大きく影響される。それゆえに、溶液のｐＨおよびイオン強度の変化は、タンパク質−タンパク質相互作用を変化させる。
【0022】
オルガノポリシロキサンの粒子の表面上に付着したタンパク質性物質の表面積は、粒子体積２／３に等しい表面積を有する完全液滴の理論的モデルを用いて推定することができる。（非特許文献１参照）。光学的バックグラウンドの存在下で蛍光標識オルガノポリシロキサンの表面上に会合した蛍光標識タンパク質の検出の確認は、相関した測定値の勾配によって推測され、その勾配は、完全球形での体積の関数としての表面積について１０の２／３乗（１０２／３）の理論値に近い。
【0023】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質性物質の凝集を評価するための方法であって、（ａ）蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の水性懸濁液（または乳濁液）を供給するステップと、（ｂ）蛍光活性化粒子選別を用いて、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対粒子蛍光強度を測定するステップと、（ｃ）蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度を蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較するステップとを含む方法を提供する。
【0024】
本明細書に用いられる場合、「タンパク質性物質」は、少なくとも１つのタンパク質を含む材料を意味する。本明細書に用いられる場合、「タンパク質」は、線状鎖に配置され、かつ隣接アミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合によって結合したアミノ酸を含む大きな有機化合物であり、例えば、線維性タンパク質、球状タンパク質、およびタンパク質複合体である。本発明に用いるのに適したタンパク質性物質の非限定的な例として、モノクローナル抗体（ｍＡｂまたはｍｏＡｂ）、全て単一の親細胞のクローンである１つの型の免疫細胞によって産生されているため同一である単一特異性抗体が挙げられる。適切なモノクローナル抗体の非限定的な例には、インフリキシマブ、バシリキシマブ、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、トラスツズマブ、およびエタネルセプトが挙げられる。適切なタンパク質性物質の他の非限定的な例には、顆粒球コロニー刺激因子（例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（商標））、エリスロポエチン（例えば、Ｒｅｃｏｒｍｏｎ（商標）およびＥｐｒｅｘ（商標））、インターフェロン（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（商標）およびＲｅｂｉｆ（商標））、および関節リウマチ治療薬（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（商標）、Ｈｕｍｉｒａ（商標）、およびＯｒｅｎｃｉａ（商標））が挙げられる。下記で詳細に論じられているように、タンパク質性物質は標識され、または紫外線光もしくは赤外線光への曝露によって蛍光を発する能力がある蛍光部分をそれらに付着している。
【0025】
いくつかの非限定的な実施形態において、タンパク質性物質は、水性溶液の全容量に基づいて約２０μｇ／ｍＬから約６００μｇ／ｍＬ、または約１００μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬの濃度で溶液中に存在する。
【0026】
オルガノポリシロキサンは、例えば、シリンジバレルなどの医療用品の表面をコーティングするために用いることができるような任意のオルガノポリシロキサンまたはシリコーンオイルであり得る。いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、任意の硬化段階の前において、約１００センチストーク（ｃＳｔ）から約１，０００，０００センチストークまで、または約１，０００ｃＳｔから約１００，０００ｃＳｔ、または約１，０００ｃＳｔから約１５，０００ｃＳｔもしくは約１２，５００ｃＳｔの範囲の粘性を有する。
【0027】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、例えば、以下の構造式（Ｉ）によって表されているように、アルキル置換オルガノポリシロキサンを含む：
【0028】
【化1】
【0029】
式中、Ｒはアルキルであり、Ｚは約３０から約４，５００である。いくつかの非限定的な実施形態において、式（Ｉ）のオルガノポリシロキサンは、以下の構造式（ＩＩ）によって表すことができる：
【0030】
【化2】
【0031】
式中、Ｚは上記の通りであり得、または例えば、約３００から約２，０００、約３００から約１，８００、もしくは約３００から約１，３５０であり得る。いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、約１００ｃＳｔから約１，０００，０００ｃＳｔまでの範囲の粘性を有するＤＯＷ ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）３６０ポリジメチルシロキサンまたはＮＵＳＩＬポリジメチルシロキサンなどのポリジメチルシロキサンである。
【0032】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、アルケニル基などの１つまたは複数の硬化性または反応性官能基を含む。各アルケニル基は、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、およびデセニルからなる群より独立して選択することができる。オルガノポリシロキサンが上記の型のアルケニル基のいずれかの１つまたは複数およびそれらの混合物を含み得ることを当業者は理解しているであろう。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアルケニル基はビニルである。より高いアルケニルまたはビニルの含有量は、より効率的な架橋を提供する。
【0033】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、以下の構造式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）によって表すことができる：
【0034】
【化3】
【0035】
式中、Ｒはアルキル、ハロアルキル、アリール、ハロアリール、シクロアルキル、シラシクロペンチル、アラルキル、およびそれらの混合物であり、Ｘは約６０から約１，０００、好ましくは約２００から約３２０であり、ｙは約３から約２５である。これらのポリマーのコポリマーおよび混合物もまた企図される。
【0036】
有用なビニル官能性オルガノポリシロキサンの非限定的な例として、ビニルジメチルシロキシ末端ポリジメチルシロキサン；トリメチルシロキシ末端ビニルメチル、ジメチルポリシロキサンコポリマー；ビニルジメチルシロキシ末端ビニルメチル、ジメチルポリシロキサンコポリマー；ジビニルメチルシロキシ末端ポリジメチルシロキサン；ビニル、ｎ−ブチルメチル末端ポリジメチルシロキサン；およびビニルフェニルメチルシロキシ末端ポリジメチルシロキサンが挙げられる。
【0037】
いくつかの実施形態において、式ＩＩ、ＩＩＩ、および／またはＩＶのものから選択されたシロキサンポリマーの混合物を用いることができる。例えば、混合物は、２つの異なる分子量のビニルジメチルシロキシ末端ポリジメチルシロキサンポリマーを含むことができ、それらのポリマーの一方が約１，０００から約２５，０００、好ましくは約１６，０００の平均分子量をもち、他方のポリマーが約３０，０００から約７１，０００、好ましくは約３８，０００の平均分子量をもつ。一般的に、低い方の分子量のシロキサンが、この混合物の約６０重量％などの約２０重量％から約８０重量％の量で存在し得、高い方の分子量のシロキサンは、この混合物の約４０重量％などの約８０重量％から約２０重量％の量で存在し得る。
【0038】
適切なビニル官能性オルガノポリシロキサンの別の非限定的な例は、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＰＡのＧｅｌｅｓｔ， Ｉｎｃ．から市販されているＶＤＴ−７３１ビニルメチルシロキサンコポリマーなどのトリメチルシロキシ末端の（７．０〜８．０％ビニルメチルシロキサン）−ジメチルシロキサンコポリマーである。
【0039】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、少なくとも２つの極性基を含み得る。各極性基は、アクリレート、メタクリレート、アミノ、イミノ、ヒドロキシ、エポキシ、エステル、アルキルオキシ、イソシアネート、フェノール、ポリウレタンオリゴマー、ポリアミドオリゴマー、ポリエステルオリゴマー、ポリエーテルオリゴマー、ポリオール、およびカルボキシプロピル基からなる群より独立して選択することができる。当業者は、オルガノポリシロキサンが上記の極性基のいずれかの１つまたは複数、およびそれらの混合物を含み得ることを理解しているであろう。いくつかの非限定的な実施形態において、極性基は、アクリレート基、例えば、アクリロキシプロピル基である。他の実施形態において、極性基は、メタクリロキシプロピル基などのメタクリレート基である。極性基を有するオルガノポリシロキサンは、メチル基、エチル基、またはフェニル基などの１つまたは複数のアルキル基および／またはアリール基をさらに含むことができる。
【0040】
そのようなオルガノポリシロキサンの非限定的な例として、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＰＡのＧｅｌｅｓｔ， Ｉｎｃ．から入手できるＵＭＳ−１８２アクリレート官能性シロキサンおよびＲｈｏｄｉａ−Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓから入手できるＳＩＬＣＯＬＥＡＳＥ（登録商標）ＰＣ９７０アクリル化シリコーンポリマーなどの［１５〜２０％（アクリロキシプロピル）メチルシロキサン］−ジメチルシロキサンコポリマーが挙げられる。
【0041】
いくつかの非限定的な実施形態において、そのようなオルガノポリシロキサンは、以下の式（Ｖ）によって表すことができる：
【0042】
【化4】
【0043】
式中、Ｒ１は、アクリレート基、メタクリレート基、アミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基、エポキシ基、エステル基、アルキルオキシ基、イソシアネート基、フェノール基、ポリウレタンオリゴマー基、ポリアミドオリゴマー基、ポリエステルオリゴマー基、ポリエーテルオリゴマー基、ポリオール基、カルボキシプロピル基、およびフルオロ基からなる群から選択され、Ｒ２はアルキルであり、ｎは２から４までの範囲であり、ｘは約１００ｃＳｔから１，０００，０００ｃＳｔの粘性を潤滑剤に与えるのに十分な整数である。
【0044】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、−Ｆ、またはトリフルオロメチル基などのフルオロアルキル基などの１つまたは複数のフルオロ基をさらに含むことができる。他の有用なオルガノポリシロキサンには、ポリフルオロアルキルメチルシロキサンおよびフルオロアルキル、ジメチルシロキサンコポリマーが挙げられる。
【0045】
いくつかの非限定的な実施形態において、組成物は、１つまたは複数の環状シロキサン（単数または複数）、例えば、オクタメチルシクロテトラシロキサンおよび／またはデカメチルシクロペンタシロキサンをさらに含むことができる。
【0046】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、以下の構造式（ＶＩ）によって表すことができる：
【0047】
【化5】
【0048】
式中、Ｒはハロアルキル、アリール（フェニルなど）、ハロアリール、シクロアルキル、シラシクロペンチル、アラルキル、およびそれらの混合物であり、Ｚは約２０から約１，８００である。
【0049】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、少なくとも２つのペンダント（側鎖（pendant））水素基を含む。少なくとも２つのペンダント水素基を含む適切なオルガノポリシロキサンの非限定的な例として、ポリマーバックボーンに沿ったペンダント水素基または末端水素基を有するオルガノポリシロキサンが挙げられる。いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、以下の構造式（ＶＩＩ）によって表すことができる：
【0050】
【化6】
【0051】
式中、ｐは約８から約１２５、例えば、約３０である。他の非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、以下の構造式（ＶＩＩＩ）によって表すことができる：ＨＭｅ２ＳｉＯ（Ｍｅ２ＳｉＯ）ｐＳｉＭｅ２Ｈ （ＶＩＩＩ）
式中、ｐは約１４０から約１７０、例えば、約１５０から約１６０である。２つの異なる分子量の材料を含むこれらのポリマーの混合物を用いることができる。例えば、約４００から約７，５００、例えば、約１９００の平均分子量をもつトリメチルシロキシ末端ポリメチルヒドロシロキサンの混合物の約２重量％から約５重量％が、約４００から約３７，０００、好ましくは約１２，０００の平均分子量をもつジメチルヒドロシロキシ末端ポリジメチルシロキサンの約９８％から約９５％と混合して用いることができる。少なくとも２つのペンダント水素基を含む有用なオルガノポリシロキサンの非限定的な例として、ジメチルヒドロ末端ポリジメチルシロキサン；メチルヒドロ、ジメチルポリシロキサンコポリマー；ジメチルヒドロシロキシ末端メチルオクチルジメチルポリシロキサンコポリマー；およびメチルヒドロ、フェニルメチルシロキサンコポリマーが挙げられる。
【0052】
いくつかの非限定的な実施形態において、組成物は、ヒドロキシ官能性シロキサン、例えば、少なくとも２つのヒドロキシル基を含むヒドロキシ官能性シロキサンを含み、例えば、以下などである：
【0053】
【化7】
【0054】
式中、Ｒ２はアルキルであり、ｎは０から４までの範囲であり、ｘは約１００ｃＳｔから１，０００，０００ｃＳｔの粘性を潤滑剤に与えるのに十分な整数である。いくつかの非限定的な実施形態において、官能性の結果として水分硬化特性を有する水分硬化型シロキサンとして、アルコキシ；アリールオキシ；オキシム；エポキシ；−ＯＯＣＲ；Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ；Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノキシ；Ｎ−アルキルアミド；−Ｏ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ；−Ｏ−Ｃ（＝ＮＣＨ３）−ＮＨ−ＣＨ３；および−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２（式中、ＲはＨまたはヒドロカルビルである）などの官能基を有するシロキサンが挙げられる。本明細書に用いられる場合、「水分硬化型（moisture-curable）」とは、シロキサンが、大気水分の存在下の周囲条件で硬化性であることを意味する。
【0055】
上記で論じられたオルガノポリシロキサンのいずれかの混合物を本発明に用いることができる。
【0056】
いくつかの非限定的な実施形態において、オルガノポリシロキサンは、溶液の約０．００１重量パーセントから約１重量パーセントを含む。
【0057】
タンパク質性物質およびオルガノポリシロキサンをそれぞれ、異なる、実質的に重複しない波長の光で蛍光を発する蛍光部分で標識する。また、複数の型のタンパク質性物質および／または複数の型のオルガノポリシロキサンが存在する場合には、各異なる型のタンパク質性物質および／または各異なる型のオルガノポリシロキサンを、異なる、実質的に重複しない波長の光で蛍光を発する蛍光部分で標識することができる。
【0058】
本明細書に用いられる場合、「異なる型」のタンパク質性物質とは、化学的に異なるタンパク質性物質を意味し、例えば、第１のタンパク質性物質は、第２の型のタンパク質性物質と異なる、少なくとも１つの原子または原子配置を有する。同様に、本明細書に用いられる場合、「異なる型」のオルガノポリシロキサンとは、化学的に異なるオルガノポリシロキサンを意味し、例えば、第１のオルガノポリシロキサンは、第２の型のオルガノポリシロキサンと異なる、少なくとも１つの原子または原子配置を有する。
【0059】
タンパク質性物質（単数または複数）およびオルガノポリシロキサン（単数または複数）を標識するのに用いられる個々の蛍光部分は、他の蛍光部分を測定するために用いられる検出器で現れる１つの蛍光部分のスペクトル放射から生じ得る光学的なバックグラウンドの寄与を最小限にするような励起および／または発光特性について選択される。
【0060】
第１の蛍光部分および第２の蛍光部分がそれぞれ、レーザーによって放射される同じ波長の光に曝された場合、第１の波長範囲内の光を放射する第１の蛍光部分でオルガノポリシロキサンは標識され、第２の波長範囲内の光を放射する第２の蛍光部分でタンパク質性物質は標識され、第１の波長範囲は、第２の波長範囲との重複を実質的に含まない。
【0061】
本明細書に用いられる場合、「実質的に重複しない」とは、それぞれの蛍光色素は、それらの発光スペクトルが、同じレーザーによって励起された場合、極小の、または有意ではない重複を有するように選択されることを意味する。いくつかの非限定的な実施形態において、「実質的に重複しない」とは、第１の波長範囲が、第１の波長範囲と第２の波長範囲を合わせた合計標準化波長範囲に基づいて、第２の波長範囲との重複が５％未満、または２％未満、または１％未満であることを意味し得る。例えば、４０５ｎｍの紫色レーザーに曝された場合、４５０ｎｍから６５０ｎｍの範囲にわたる検出不可能なレベルの光を放射するナイルレッド蛍光部分でオルガノポリシロキサンを標識することができ、３４０ｎｍから４５０ｎｍの範囲にわたる光を放射するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ色素でタンパク質性物質を標識することができる。
【0062】
このアプローチは、異なる蛍光部分で標識された他の材料からの光学バックグラウンドの寄与を最小限にすることによって少量の第１の蛍光標識材料についての検出感度を最大限にする。例えば、少量の標識タンパク質についての検出感度は、蛍光標識オルガノポリシロキサンからの光学バックグラウンドの寄与を最小限にすることによって増強することができる。これは、周囲の緩衝液中に残存する油滴と会合していないいくらかの遊離標識タンパク質がある場合には、検出感度にとって望ましいことであり得る。
【0063】
タンパク質性物質（単数または複数）およびオルガノポリシロキサン（単数または複数）の標識については、今、単一の型のタンパク質性物質および単一の型のオルガノポリシロキサンに関して論じるつもりであるが、当業者は、実質的に異なる波長で蛍光を発する部分を用いるという同じ概念を複数のタンパク質性物質（単数または複数）および複数のオルガノポリシロキサン（単数または複数）について用いることができることを認識しているであろう。いくつかの非限定的な実施形態において、タンパク質に結合した蛍光部分は、上記で論じられているように、発光バンドが、オルガノポリシロキサンを標識するために選択された他の蛍光部分または色素の発光バンドと実質的に重複しない限り、紫色（４０５ｎｍ）、青色（４８８ｎｍ）、または赤色（６３５ｎｍ）のレーザーで励起する部分から選択することができる。
【0064】
例えば、図１１に示されているように、ナイルレッドは、オルガノポリシロキサンを標識するのに用いてもよく、広範囲（最大値５５９ｎｍ付近を有する４５０ｎｍから６５０ｎｍまで）または５７５ｎｍから７５０ｎｍまでにわたって励起または発光し、青色かまたは緑色のレーザーのいずれかと用いることができる。ナイルレッドを用いて油を標識する場合には、スペクトルの異なる領域で励起および発光する、タンパク質の標識を選択すること、ならびに最適な感度を得るために空間的に分離されたレーザーを有するフローサイトメーターシステムを用いて測定を行うことが望ましい。オルガノポリシロキサンがナイルレッドで標識された場合、タンパク質性物質を標識するために用いるのに適した蛍光部分の非限定的な例として、４０３ｎｍ付近で最大値を有する３４０ｎｍから４５０ｎｍまでの特定の範囲で励起し、紫色レーザーと用いてもよい６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシクマリンフルオロフォアに基づいたＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；特定の範囲（４０３ｎｍ付近で最大値を有する３４０ｎｍから４５０ｎｍまで）で励起し、紫色レーザーと用いてもよいＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；４３５ｎｍ付近で最大値を有する３５０ｎｍから４９５ｎｍまでの特定の範囲で励起し、紫色レーザーと用いてもよいシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）；特定の範囲（４５８ｎｍ付近で最大値を有する３６０ｎｍから５００ｎｍまで）で励起し、紫色レーザーと用いてもよいアネモニア・マジャノ（Ａｎｅｍｏｎｉａ Ｍａｊａｎｏ）由来のＡｍＣｙａｎ １０８ｋＤａタンパク質（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；＜３００ｎｍから５２０ｎｍまでの特定の範囲で励起し、紫色レーザーと用いてもよいＱＤｏｔ（登録商標）５２５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、および＜３００ｎｍから５４０ｎｍまでの特定の範囲で励起し、紫色レーザーと用いてもよいＱＤｏｔ（登録商標）５４５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。あるいは、ナイルレッドは、タンパク質性物質を標識するのに用いることができ、すぐ上で論じられた他の色素の１つを、オルガノポリシロキサンを標識するのに用いることができる。
【0065】
あるいは、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン（ＤＰＨ）、ジオクタデシル−インドカルボシアニン（ＤｉＬ）、過塩素酸３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯ）、ＤｉＩＣ１８（５）（ＤｉＤ）、ヨウ化１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）、または任意の他の親油性色素などの様々な親油性色素を用いて、当業者によく知られた様々な手段によってオルガノポリシロキサンを標識し、蛍光標識タンパク質を検出するためにスペクトルの他の領域を用いる、必要とされる任意の同時高感度測定に与える影響を最小限にする様々なレーザーおよび蛍光スペクトルの領域を特に用いることができる。例えば、ＤｉＤを用いてオルガノポリシロキサンを標識した場合（赤色レーザー励起および６７０ｎｍ付近での発光）、それより下の励起および発光範囲の全部が、１つまたは複数の蛍光標識タンパク質を検出するために用いることができ、用いられるべきそれらの発光スペクトルにおいて実質的な重複なしに、ＵＶ、紫色、青色、または緑色レーザーで励起される蛍光色素を用いてタンパク質性物質を標識することを可能にする。
【0066】
いくつかの実施形態において、蛍光部分は、赤色ダイオードレーザー（６３５ｎｍ）を用いて、ＦＩＴＣフルオレセインイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＧＦＰ緑色蛍光タンパク質、ＣＦＤＡ−ＳＥカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、ＰＩホスホイノシチドなどの緑色領域（５２５〜５８５ｎｍ）（通常、ＦＬ１と分類される）；ＰＥ Ｒ−フィコエリトリンなどのオレンジ色領域（通常ＦＬ２）；ＰｅｒＣＰペリジニンクロロフィルタンパク質、ＰＥ−Ｃｙ５ Ｒ−フィコエリトリンシアニン５、ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｃｙ５．５ Ｒ＿フィコエリトリンシアニン５．５などの赤色領域（通常ＦＬ３）；ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＰＥ−Ｃｙ７などの赤外領域（通常ＦＬ４）で蛍光を発する部分から選択することができる。
【0067】
スキャンされる粒子について、紫色レーザー（４０５ｎｍ）、青色レーザー（４８８ｎｍ）、緑色レーザー（５３２ｎｍ）、黄色レーザー（５６１ｎｍ）、および赤色レーザー（６３５ｎｍ）励起蛍光色素からの前方光散乱（ＦＳＣ、狭角光散乱）および側方光散乱蛍光（ＳＳＣ、９０°光散乱）を用いることができる。いくつかの非限定的な実施形態において、タンパク質性物質は、きちんと解説されたプロトコール（ＭＰ ００１４３、Ａｍｉｎｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で化学的に標識することができる。他の非限定的な実施形態において、タンパク質性物質は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できる適切な市販キットを用いることによるなどの当業者によく知られた方法に従ってＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で化学的に標識することができる。オルガノポリシロキサンを標識するために、ナイルレッド色素をオルガノポリシロキサン中に５ｍｇ／ｍＬで溶解することができる。ナイルレッド、９−ジエチルアミノ−５−ベンゾフェノキサジン−５−オンは、蛍光が水中で完全に消光される極めて疎水性の高い色素である。
【0068】
Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素は、４０４ｎｍで励起最大値および４５５ｎｍの発光最大値を有し、ナイルレッド色素は、５５９ｎｍで励起最大値および６３７ｎｍの発光最大値を有する。ナイルレッドは本質的に、紫色レーザー波長で励起せず、そのことが、タンパク質粒子を測定するために用いられる検出器においてオルガノポリシロキサンからの光学バックグラウンドを最小限にする。逆に、粒子が青色レーザーを横断する場合、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素は励起せず、ナイルレッド検出器へのシグナルの漏れ込みを最小限にする。化学的に標識されたｍＡｂおよび染色されたオルガノポリシロキサンを含む懸濁液は、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ（商標）フローサイトメーターアナライザー、またはマルチレーザーＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーターアナライザー、またはＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）でスキャンすることができる。
【0069】
フローサイトメトリーは、流体の流れに浮遊した微視的粒子をカウントし、調べ、かつ選別するための分析プロセスである。それは、光学的および／または電子的検出装置の中を流動する単一粒子の物理的および／または化学的特性の同時多重パラメーター分析を可能にする。フローサイトメーターにおいて、１つまたは複数のビームの単色光（通常、レーザー光）を、試料を含む流体の流体力学的に集束した流れに焦点を合わせる。複数の検出器は、流れが光線の中を通過する地点に整列している；即ち、主要な光線に沿って（前方散乱またはＦＳＣ）１個およびそれと垂直（側方散乱またはＳＳＣ）に数個、ならびに１個または複数の蛍光検出器である。強く集束されたビームの中を通過する各浮遊粒子は、ミー理論に従って様々な方向に光を散乱させ、粒子に付着した蛍光標識は、励起されて、光源より低い周波数で光を放射することができる。この散乱光と蛍光の組合せは、検出器によって検出される。各検出器で輝度のゆらぎ（各蛍光発光ピークについてのゆらぎ）を分析することによって、各個々の粒子の物理的および化学的構造についての様々なタイプの情報を引き出すことが可能である。ＦＳＣは一般的に、粒子サイズおよび屈折特性とよく相関し、ＳＳＣは、粒子のサイズおよび内部複雑さ（すなわち、細胞核の形、粒子の量および型、または粒子粗さ）に依存する。一部のフローサイトメーターは、各粒子の蛍光、散乱光、および透過光の画像を形成する。
【0070】
フローサイトメーターは、毎秒、数千個の粒子を分析する能力があり、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩおよびＢＤ（商標）ＩｎｆｌｕｘソーティングプラットフォームなどのマルチレーザーＦＡＣＳセルソーターは、特定された性質を有する粒子を能動的に分離および単離することができる。フローサイトメーターは、細胞がセンシングのために光線の中を一列で通過するように細胞を運び、整列させるフローセル液体流（溶液）；水銀またはキセノンランプなどの１つまたは複数の光源、高出力水冷式レーザー（アルゴン、クリプトン、色素レーザー）、低出力空冷式レーザー（アルゴン（４８８ｎｍ）、赤色−ＨｅＮｅ（６３３ｎｍ）、緑色−ＨｅＮｅ、ＨｅＣｄ（ＵＶ））、またはダイオードレーザー（青色、緑色、赤色、紫色）；ＦＳＣシグナルおよびＳＳＣシグナル、ならびに蛍光シグナルを発生する多重検出器、アナログデジタル変換（ＡＤＣ）システム、線形または対数増幅システム、およびシグナルの分析のためのコンピューターを含む。フローサイトメーターによって生じたデータは、１パラメーターヒストグラムとして、２次元ドットプロット（散布図、密度プロット、または等高線図）として、またはさらに３次元等角ディスプレイとしてプロットすることができる。対象とする集団を限定するように対象とするグラフ領域を描くことができ、通常、階層的ゲートツリーの形をとる含意ブールＡＮＤ論理によって組み合せられ、ここで、ゲートという用語は、対象とする粒子が属する、対象とする１つまたは複数の組み合せられた領域を指す。プロットは、データが最大４桁または５桁までの大きなダイナミックレンジを有する場合はいつでも、対数スケールで作成されることが多い。異なる蛍光色素の発光スペクトルは重複するため、検出器からのシグナルは電気的および計算的に補正することができる。しかしながら、このプロセスは、集団の中央値を再編成する一方で、最初の測定値からの光子統計由来の効果は残ったままであり、結果として、有意に再編成された集団（すなわち、他の蛍光シグナルからのバックグラウンドの寄与が有意であった場合）の間での「拡散（spread）」を生じる。典型的には、フローサイトメーターを用いて得られたデータは、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅなどのソフトウェアを用いて、取得後、再分析される。
【0071】
蛍光活性化細胞選別または粒子選別は、フローサイトメトリーの特殊な型である。それは、各細胞の特定の光散乱および蛍光特性に基づいて、１度に１細胞、不均一な粒子混合物を２つ以上の容器へ選別するための方法を提供する。それは、個々の細胞からの蛍光シグナルを記録し、特に対象とする細胞を物理的に分離する。頭字語ＦＡＣＳは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎによって商標登録され、所有されている。
【0072】
粒子浮遊物は、狭く急速に流動する液流の中央で運ばれる。フローは、平均して（ポアソン分布）、粒子間に、それらの直径に対して大きな分離があるように計画される。振動機構は、粒子流を個々の液滴に分裂させる。そのシステムは、複数の粒子が液滴中に存在する確率が低いように調整される。流れが液滴に分裂する直前、フローは、１つまたは複数のレーザー横断点を通過し、そこで各粒子の対象とする蛍光特性が測定される。粒子が収集されることになっている場合には、１個または複数の液滴が形成し、流れから離脱する時間中、フローセルに電荷が加えられる。その後、これらの荷電液滴は、液滴に加えられた電荷に基づいて液滴を標的容器へと方向転換させる静電偏光システムを通り抜ける。
【0073】
蛍光活性化粒子スキャニング装置またはＦＡＣＳ（商標）フローサイトメーターなどの機器を用いることによって、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対粒子蛍光強度は、蛍光活性化粒子選別（fluorescence-activated particle sorting）を用いて決定することができる。蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度は、蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較することができ、オルガノポリシロキサンで凝集した、または塊になったタンパク質性物質の量を決定することができる。オルガノポリシロキサンでのタンパク質性物質の「凝集」は、タンパク質性物質のオルガノポリシロキサンへの吸着、加えて、オルガノポリシロキサンによって核形成されたタンパク質性物質の凝集を含み、オルガノポリシロキサンとタンパク質性物質との間のいかなる不可逆性会合も含む。
【0074】
各溶液は、蛍光活性化粒子スキャニングによって分析され、粒子組成を決定することができる。蛍光活性化粒子スキャニングを用いて、粒子サイズ、形態、および相対粒子蛍光を分析することができる。他の有用な分析として、懸濁液濁度、シリコーンオイル液滴数濃度、およびシリコーンオイル液滴サイズ分布の決定が挙げられる。光学密度は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ３５分光光度計（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用いて決定することができる。液滴集塊物を解膠するための短時間の穏やかな撹拌後、シリコーンオイル懸濁液の光学密度は、時間および製剤条件の関数として６６０ｎｍで測定することができる。水性濾液において、２８０ｎｍでのタンパク質性物質吸光度を測定して、ｍＡｂ濃度を決定することができる。あるいは、タンパク質性物質濃度をクーマシー色素結合アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｅｔｔｅｒ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で測定することができる。
【0075】
シリコーンオイル液滴サイズ分布は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ２３０レーザー回折粒子サイズアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて測定することができる。相対サイズ分布は、均質化後すぐに、および懸濁液調製から２週間目までの間、時間の関数として、懸濁液について測定することができる。シリコーンオイル液滴相対サイズ分布および数濃度から、シリコーンオイル総表面積を推定することができる。
【0076】
いくつかの非限定的な実施形態において、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対粒子蛍光強度は、ドナー蛍光部分がそのオイルに付着しており、アクセプター蛍光部分がそのタンパク質に付着しているＦＲＥＴ（蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）共鳴エネルギー移動またはＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動）を用いて決定することができる。ＦＲＥＴテクノロジーを用いることによって、アクセプターからの発光は、アクセプターがオイル表面と極めて近くで接触しているのではない限り生じず、そのことから、より正確な測定を可能にすることができる。励起状態でのドナー発色団は、非放射性長距離的双極子−双極子結合機構により、エネルギーを極めて近接する（典型的には、＜１０ｎｍ）アクセプター発色団へ移動することができる。２つの分子間での複合体形成をモニターするために、それらの一方がドナーで標識され、他方がアクセプターで標識され、これらのフルオロフォア標識分子が混合される。分子が解離している場合、ドナー発光が、ドナー励起で検出される。他方、ドナーとアクセプターが、その２つの分子の相互作用によって近接している（１〜１０ｎｍ）場合、ドナーからアクセプターへの分子間ＦＲＥＴのために、アクセプター発光が主に観察される。
【0077】
いくつかの非限定的な実施形態において、水性懸濁液は、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤をさらに含む。非イオン性界面活性剤は、シリコーンオイル癒着速度を低下させることができる。したがって、浮遊した油滴は、非イオン性界面活性剤が存在する場合、より長く溶液中に留まる。
【0078】
適切な非イオン性界面活性剤の非限定的な例として、アセチレングリコール、アルカノールアミド、アルカノールアミン、アルキルフェノール、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、グリセロールエステル、モノドデシルエーテル、フェノール誘導体、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリオキシエチレンアクリルエーテル、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、ソルビトール、ソルビタン誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。いくつかの非限定的な実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびそれらの混合物からなる群から選択されるソルビタン誘導体である。いくつかの非限定的な実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０としても知られている、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレートなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。他の有用なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルには、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２１、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ４０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ６０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ６１、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ６５、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８１、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８５、またはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ １２０が挙げられる。
【0079】
溶液中の非イオン性界面活性剤の量は、水性溶液の全重量に基づいて約０．００１重量パーセントから約０．５重量パーセントまでの範囲であり得る。
【0080】
いくつかの非限定的な実施形態において、水性懸濁液は、少なくとも１つの糖をさらに含む。糖は、オルガノポリシロキサンの癒着の速度を増強することができ、その結果、タンパク質性物質を引き付けるのに利用可能であるオルガノポリシロキサンの表面積がより少なくなる。適切な糖として、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、およびそれらの混合物が挙げられる。適切な糖の非限定的な例には、スクロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、ガラクトース、マンノース、トレハロース、およびそれらの混合物が挙げられる。
【0081】
溶液中の糖の量は、水溶液の全重量に基づいて約０．００５重量パーセントから約１０重量パーセントまでの範囲であり得る。
【0082】
糖および非イオン性界面活性剤の存在の組合せは、タンパク質性物質の凝集をさらに低下させることができる。いくつかの非限定的な実施形態において、溶液は、上記のような量または濃度で、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびスクロースなどの少なくとも１つの糖および少なくとも１つの非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【0083】
いくつかの非限定的な実施形態において、この方法は、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の複数の水性懸濁液を供給するステップであって、各水性懸濁液は、非イオン性界面活性剤および糖からなる群から選択される少なくとも１つの凝集阻害剤をさらに含み、少なくとも１つの凝集阻害剤の濃度は各水性懸濁液において異なる、ステップと、蛍光活性化粒子選別を用いて、各水性懸濁液において蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対粒子蛍光強度を測定するステップと、各水性懸濁液について蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度を蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較するステップとをさらに含む。
【0084】
いくつかの非限定的な実施形態において、この方法は、蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の複数の水性懸濁液を供給するステップであって、各水性懸濁液は、非イオン性界面活性剤および糖からなる群から選択される少なくとも１つの凝集阻害剤をさらに含み、少なくとも１つの凝集阻害剤が各水性懸濁液において異なる、ステップと、蛍光活性化粒子選別を用いて、各水性懸濁液において蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対的粒子蛍光強度を測定するステップと、各水性懸濁液について蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度を蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較するステップとをさらに含む。各溶液中の凝集阻害剤は、化学的に異なるか、または異なる型であり、例えば、異なる糖および／または異なる非イオン性界面活性剤である。
【0085】
図１０によって、本発明によるオルガノポリシロキサン溶液の試料を調製および分析する方法についてのフローチャートが示されている。溶液は、上記、および下記の実施例Ａで詳細に論じられているように、調製および分析することができる。
【0086】
いくつかの非限定的な実施形態において、この方法は、各水性懸濁液について蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度の蛍光標識タンパク質性物質の相対強度との比較に基づいて、タンパク質性物質を含む懸濁液に用いる少なくとも１つの凝集阻害剤を選択するステップをさらに含む。
【0087】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、オルガノポリシロキサンを含む懸濁液においてタンパク質性物質の凝集を阻害するための方法であって、（ａ）蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の複数の水性懸濁液を供給するステップであって、各水性懸濁液は、非イオン性界面活性剤および糖からなる群から選択される少なくとも１つの凝集阻害剤をさらに含み、（ｉ）少なくとも１つの凝集阻害剤が各水性懸濁液において異なるか、または（ｉｉ）凝集阻害剤の量が各水性懸濁液において異なる、ステップと、（ｂ）蛍光活性化粒子選別を用いて、各水性懸濁液において蛍光標識オルガノポリシロキサンおよび蛍光標識タンパク質性物質の相対的粒子蛍光強度を測定するステップと、（ｃ）各水性懸濁液について蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度を蛍光標識タンパク質性物質の相対強度と比較するステップと、（ｄ）各水性懸濁液についての蛍光標識オルガノポリシロキサンの相対強度の蛍光標識タンパク質性物質の相対強度との比較に基づいて、タンパク質性物質を含む懸濁液に用いる少なくとも１つの凝集阻害剤を選択するステップとを含む方法を提供する。
【0088】
上記方法の１つまたは複数により、タンパク質性物質を含む溶液と接触する表面にオルガノポリシロキサンコーティングを用いる医療用品に用いる、糖および非イオン性界面活性剤の適切な組合せ（およびそれらの適切な濃度）を決定することができる。
【0089】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、（ａ）溶液を受けるためのチャンバーを含む容器であって、チャンバーの内表面は、オルガノポリシロキサンを含む組成物から調製されたコーティングをその上に有する、容器と、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのタンパク質性物質と、（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの糖を含む溶液とを含む医療用品を提供する。
【0090】
本明細書に用いられる場合、「医療用品」は、医学的処置に有用であり得る物品または装置を意味する。医療用品の非限定的な例として、シリンジ組立品、薬剤カートリッジ、無針注射器、液体分注装置、および液体計量装置が挙げられる。いくつかの実施形態において、医療用品は、（例えば、タンパク質性物質を含む溶液を受けるための）シリンジチャンバーまたはバレル、および密封部材を含むシリンジ組立品である。
【0091】
チャンバーは、ガラス、金属、セラミック、プラスチック、ゴム、またはそれらの組合せから形成することができる。いくつかの非限定的な実施形態において、チャンバーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（１−ブテン）、ポリ（２−メチル−１−ペンテン）、および／または環状ポリオレフィンなどの１つまたは複数のオレフィンポリマーから調製される。例えば、ポリオレフィンは、脂肪族モノオレフィンのホモポリマーまたはコポリマーであり得、脂肪族モノオレフィンは、好ましくは、ポリプロピレンなどの約２個から６個の炭素原子を有する。いくつかの非限定的な実施形態において、ポリオレフィンは、基本的には線状であり得るが、任意で、例えば、従来の低密度ポリエチレンに見出されるような側鎖を含んでもよい。いくつかの非限定的な実施形態において、ポリオレフィンは少なくとも５０％アイソタクチックである。他の実施形態において、ポリオレフィンは、構造において、少なくとも約９０％アイソタクチックである。いくつかの非限定的な実施形態において、シンジオタクチックポリマーを用いることができる。いくつかの実施形態において、環状ポリオレフィンを用いることができる。適切な環状ポリオレフィンの非限定的な例として、特許文献１〜４（それぞれ、日本ゼオン）、特許文献５〜９（それぞれ、日本ゼオン株式会社）、特許文献１０および１１（Ｔｉｃｏｎａ）、特許文献１２（三井化学）、特許文献１３〜１６（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、特許文献１７および１８（三井石油化学およびＨｏｅｃｈｓｔ）に開示されているような、ならびに非特許文献２に記載されているようなノルボルネンポリマーが挙げられる（前述の参考文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている）。適切な環状ポリオレフィンの非限定的な例として、三井石油化学から入手できるＡｐｅｌ（商標）環状ポリオレフィン、Ｔｉｃｏｎａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒｓから入手できるＴｏｐａｓ（商標）環状ポリオレフィン、日本ゼオン株式会社から入手できるＺｅｏｎｏｒ（商標）またはＺｅｏｎｅｘ（商標）環状ポリオレフィン、およびＰｒｏｍｅｒｕｓ ＬＬＣから入手できる環状ポリオレフィンが挙げられる。
【0092】
ポリオレフィンは、適当なモノマーとの共重合によって組成物に組み込まれる追加のポリマーを少量、一般的には約０．１パーセントから１０パーセントまで、含むことができる。そのようなコポリマーは、最終組成物の他の特性を増強するために組成物に加えてもよく、例えば、ポリアクリレート、ポリスチレンなどであってもよい。
【0093】
いくつかの非限定的な実施形態において、チャンバーは、容器に放射線安定性を与えるために放射線安定化添加剤を含むポリオレフィン組成物で構築されてもよく、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに譲渡された特許文献１９および２０に開示されたものなどの容器の放射線安定性に寄与する流動化添加剤などであり、それらの特許文献は参照により本明細書に組み込まれている。
【0094】
チャンバーと接触する医療用品の他の構成要素は密封部材である。密封部材は、任意のエラストマー材料またはプラスチック材料から形成することができる。エラストマーは、医療装置および医薬包装における多くの重要で不可欠な適用に用いられる。材料の類として、柔軟性、弾性、伸展性、および密封性などのそれらの独特な特性は、カテーテル、シリンジチップ、薬剤バイアル品、チューブ、グローブ、およびホースなどの製品に特によく適することが証明されている。以下の３つの主要な合成熱硬化性エラストマーは、典型的には、医学的適用に用いられる：これはポリイソプレンゴム、シリコーンゴム、およびブチルゴムである。その３つのゴムのうち、ブチルゴムは、その高い清浄度、ならびにそのゴムが酸素感受性および水感受性薬剤を保護するのを可能にする透過抵抗性によって、物品についての最も一般的な選択肢となっている。
【0095】
本発明の方法に有用な適切なブチルゴムとして、イソブチレン（約９７〜９８％）とイソプレン（約２〜３％）のコポリマーが挙げられる。ブチルゴムは、塩素または臭素でハロゲン化することができる。適切なブチルゴムの加硫物は、良い耐摩耗性、気体に対する優れた不透過性、高い誘電率、優れた耐老化性および耐日光性、ならびに優秀な緩衝性質および制振性質を、それらから形成された物品に与えることができる。適切なゴムストッパーの非限定的な例として、Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇａｓｋｅｔ Ｒｕｂｂｅｒ、ＳｔｅｌｍｉおよびＨｅｌｖｏｅｔ Ｒｕｂｂｅｒ ＆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＢＶから入手できるものが挙げられる。
【0096】
他の有用なエラストマーコポリマーとして、非限定的に、熱可塑性エラストマー、熱可塑性加硫ゴム、スチレン−ブタジエン（ＳＢＲまたはＳＢＳ）コポリマー、スチレンブロックコポリマーにおけるスチレンの含有量が約１０％から約７０％まで、好ましくは約２０％から約５０％までの範囲であるスチレン−イソプレン（ＳＩＳ）ブロックポリマーまたはスチレン−イソプレン／ブタジエン（ＳＩＢＳ）ブロックポリマーなどのスチレンコポリマーが挙げられる。適切なスチレン−ブタジエンストッパーの非限定的な例は、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｄｏｗ、Ｒｅｉｃｈｈｏｌｄ、Ｋｏｋｏｋｕ Ｒｕｂｂｅｒ Ｉｎｃ．、およびＣｈｅｍｉｘ Ｌｔｄ．から入手できる。他の適切な熱可塑性エラストマーは、例えば、ＧＬＳ、Ｔｅｃｋｎｏｒ Ａｐｅｘ、ＡＥＳ、三菱、およびＳｏｌｖａｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓから入手できる。エラストマー組成物は、非限定的に、抗酸化剤および／または無機補強剤を含み、エラストマー組成物の安定性を保つことができる。
【0097】
いくつかの実施形態において、密封部材は、例えば、ストッパー、Ｏ−リング、プランジャーチップ、またはピストンであり得る。シリンジプランジャーチップまたはピストンは、典型的には、シリンジのプランジャーと内部囲いとの間に密封性を与えるゴムの能力を理由に、ゴムなどの圧縮可能な弾性材料で作製される。シリンジプランジャーは、患者のケアおよび治療に用いられる他の器具のように、シリンジのプランジャーとバレルとの間に密封性を与える能力などの高い性能基準を満たさなければならない。
【0098】
オルガノポリシロキサンコーティングは、チャンバーおよび／または密封部材の滑り表面（単数または複数）の少なくとも一部に施される。いくつかの実施形態において、チャンバーは、下記のコーティング剤でコーティングされ、密封部材は、コーティングされないか、またはポリジメチルシロキサンコーティング剤でコーティングされる。他の実施形態において、密封部材は、下記のコーティング剤でコーティングされ、チャンバーは、コーティングされないか、またはポリジメチルシロキサンコーティング剤でコーティングされる。他の実施形態において、チャンバーおよび密封部材の両方が、下記のようなコーティング剤でコーティングされる。
【0099】
チャンバーおよび／または密封部材は、１つまたは複数のオルガノポリシロキサンを含む組成物から調製されたコーティング剤でコーティングされる。チャンバーの内表面または密封部材の外表面へのコーティング剤の塗布は、例えば、浸し塗り、ブラッシング、吹き付けなどの任意の適切な方法によって達成してもよい。組成物は、何も混合せずに塗布してもよく、または溶媒中として塗布してもよく、その溶媒は、毒物学が重要視されない場合、低分子量シリコーン、無毒性塩素化またはフッ素化炭化水素、例えば、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン、フレオン、またはアルカン、トルエン、石油エーテルなどの通常の炭化水素溶媒などである。溶媒は、蒸発によって実質的に除去される。コーティングは、任意の都合良い厚さであってもよく、実際には、厚さは、塗布される量、潤滑剤の粘性、および塗布温度などのような因子によって決定される。経済的な理由で、コーティングは、より厚いコーティングによって有意な利点が得られるわけではないため、好ましくは、実用的であるくらいの薄さで塗布される。コーティングの正確な厚さが、重要であるとは思われず、非常に薄いコーティング、すなわち、１ミクロンまたは２ミクロンが、効果的な潤滑性を示す。操作性に必要なわけではないが、コーティングの厚さは、全体を通して実質的に均一であることが望ましい。コーティングについては、塗布後、部分的もしくは完全に架橋し、または部分的に架橋して基質に付着させ、その後、しばらく経って、完全に架橋することができる。
【0100】
コーティングされたチャンバーおよび／またはコーティングされた密封部材は、酸化処理、例えば、プラズマ処理に供することができる。プラズマ処理は、任意の一般的な真空または大気プラズマ発生装置内で実施してもよい。例えば、グロー放電またはコロナ放電によって発生するプラズマのような、任意の適切な電離プラズマを用いてもよい。プラズマを、様々なガスまたはそれらの混合物から発生させてもよい。よく用いられるガスとして、空気、水素、ヘリウム、アンモニア、窒素、酸素、ネオン、アルゴン、クリプトン、およびキセノンが挙げられる。任意の気体圧力を用いてもよく、例えば、大気圧、または約０．１ｍｍＨｇから約１．０ｍｍＨｇなどの５ｍｍＨｇ以下である。大気酸化方法などのいくつかの実施形態において、電離プラズマは、チャンバーの小さな出入口から、または後で密封部材によって密封される開口部を通して、直接導入される。コーティングされた密封部材の外表面は、現行のコロナ処理またはプラズマ処理方法と同様に直接処理することができる。他の実施形態において、真空に基づいた装置など、プラズマを、コーティングされた密封部材またはコーティングされたチャンバーの周囲で励起し、チャンバーおよび密封部材機構へと拡散するのを可能にすることができる。あるいは、プラズマを、電極位置を適切に調節することによって、開口したチャンバーの内部内で励起してもよい。酸化処理後、処理されたチャンバーおよび／または処理された密封部材は、熱処理または同位元素での照射（γ線照射など）、電子ビーム、または紫外線照射に供することができる。あるいは、処理されたチャンバーおよび／または処理された密封部材は、オーブンまたはラジオ周波数（ＲＦ）によって熱処理することができる。オーブン架橋の場合、温度は、約１２０℃から約１４０℃までの範囲であり得、オーブン中の滞留時間は、正確な配合に依存して、一般的に、約３０秒間から約４０秒間である。ＲＦ技術が用いられる場合、コイルは、約１５０℃から約２００℃の基質表面温度を得るのに十分な熱を伝えるべきである。これらの温度において、硬化のためにたった約２秒間から約４秒間だけが必要とされる。
【0101】
いくつかの実施形態において、コーティング剤は、同位元素での照射、電子ビーム、または紫外線照射によって少なくとも部分的に架橋される。この技術は、その上、医学的適用において有用である、滅菌するという利点をもつ。電離放射線の形をとる放射線滅菌は、一般に、病院おいて、カテーテル、手術用品、および重要なケア用道具などの医療装置に用いられる。γ線照射は、生物学的組織を酸化することによって殺菌効果を発揮し、したがって、簡単、迅速、かつ効果的な滅菌方法を提供する。コバルト−６０（６０Ｃｏ）同位元素源かまたは機械発生加速電子源のいずれかからのγ線を用いることができる。滅菌されるべき材料を規定の時間、露出した６０Ｃｏ源の周囲に移動させた場合、十分な曝露が達成される。医療用品を滅菌するための最も一般的に用いられる線量は、約５ｋＧｙから約１００ｋＧｙ、例えば、５〜５０ｋＧｙである。
【0102】
いくつかの実施形態において、約０．３ミクロンから１０ミクロン、好ましくは約０．８ミクロンから４．０ミクロンの厚さの粘着防止剤層を、上記の架橋されたオルガノポリシロキサンコーティングの上に塗布してもよい。粘着防止剤は、粘性約１００ｃＳｔから１，０００，０００ｃＳｔ；１００ｃＳｔから６０，０００ｃＳｔ；または好ましくは約１，０００ｃＳｔから１２，５００ｃＳｔの通常のシリコーンオイル（オルガノポリシロキサン）であり得る。粘着防止層は、上記の通常の方法のいずれかによって加えてもよい。粘着防止剤を塗布するための好ましい方法は、クロロホルム、ジクロロメタン、好ましくはＦＲＥＯＮ（商標）ＴＦなどのクロロフルオロカーボンなどの溶媒中の約４重量％の粘着防止剤をシリンジバレルに吹き付けるか、またはその溶液に浸漬することによる。粘着防止剤を、任意で、酸化処理および／または放射線照射によって軽度に架橋してもよい。
【0103】
チャンバーおよび密封部材の両方がオルガノポリシロキサンでコーティングされているいくつかの実施形態において、チャンバーをコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性は、密封部材をコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性より大きくてもよい。例えば、チャンバーをコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性は１２，５００ｃＳｔであり得、一方、密封部材をコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性は１，０００ｃＳｔであり得る。他の実施形態において、チャンバーをコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性は、密封部材をコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性と等しい、またはそれ未満であり得る。例えば、チャンバーをコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性は１２，５００ｃＳｔであり得、一方、密封部材をコーティングするオルガノポリシロキサンの粘性は１０，０００ｃＳｔであり得る。
【0104】
いくつかの実施形態において、コーティングされた物品は、滅菌処理に供される。細菌、酵母、カビ、およびウイルスなどの生きている生物体を除去するために医療装置を滅菌するのに、多くの滅菌技術が今日、利用できる。医療装置用の一般的に用いられる滅菌技術として、加圧滅菌、酸化エチレン（ＥｔＯ）、またはγ線照射が挙げられ、加えて、より最近では、低温ガスプラズマおよび気相滅菌剤を含むシステムが導入されている。
【0105】
医療用品のチャンバーは、（ｉ）少なくとも１つのタンパク質性物質と、（ｉｉ）少なくとも１つの非イオン性界面活性剤と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの糖とを含む溶液で少なくとも部分的に満たされている。溶液の成分および量は上で詳細に記載されている。一般的に、溶液については、チャンバーを満たす前に、例えば、０．２２μｍのフィルターを通す濾過によって、濾過し、当業者によく知られた無菌状態下で滅菌チャンバーへ分注することができる。
【0106】
以下の実施例において本発明をより具体的に記載するが、その実施例は、それらにおける多数の改変および変形が当業者にとって明らかであるように、例示的なものにすぎないことを意図する。
【実施例】
【0107】
実施例Ａこの実施例は、スクロースおよび非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤）の、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）トラスツズマブモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の凝集への効果およびシリコーンオイル液滴特性への効果を研究する。この調査において、ｍＡｂのシリコーンオイルへの吸着とシリコーンオイルによって核形成されたｍＡｂ凝集とを区別しようとする試みはなかった。そうしないで、シリコーンオイルとｍＡｂとの間の任意の不可逆性会合を単に「凝集」と呼ぶ。
【0108】
表１に詳細に示されているように、４つの製剤をこの研究で分析した。各製剤を、蛍光活性化粒子スキャニングによって分析し、粒子組成を決定した。これらの製剤の一部については、より完全な分析を行った。懸濁液濁度、シリコーンオイル液滴数濃度、およびシリコーンオイル液滴サイズ分布を測定した。濾過後、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）トラスツズマブ濃度を水性濾液において測定した。
【0109】
組換えヒト化モノクローナル抗体（ｒｈｍＡｂ）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）の溶液を、大規模な透析（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ，３５００ ＭＷＣＯ）によって１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０へと交換した。スクロースおよび／またはポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）の別々の溶液の適当な容量を、精製されたＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）溶液と１ｍｇ／ｍＬの最終ｍＡｂ濃度まで混合した。製剤添加剤（スクロース、ＮａＣｌ、および界面活性剤）の濃度を、適当な結果のセクションに記載されているように、系統的に変化させた。全ての化学物質は、試薬グレードまたはそれ以上であった。
【0110】
【表1】
【0111】
水性緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中の医療グレードのシリコーンオイル（約０．５％ｖ／ｖ）の懸濁液を、高圧均質化によって作製した。ポリジメチルシロキサン医療用液体（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６０、１０００ｃＳｔ）を水性緩衝液に加え、高圧ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ， Ｉｎｃ．から市販されているＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ５ ホモジナイザー）に一度、通過させた。均質化後すぐに、製剤添加剤を含むｍＡｂ溶液を、緩衝液中のシリコーンオイルの懸濁液と混合することによって、分析のための最終懸濁液を作製した。
【0112】
様々なインキュベーション期間後、懸濁液を濾過（Ｗｈａｔｍａｎ Ａｎｏｔｏｐ １０、０．０２μｍのシリンジフィルター）し、水相と油相を分離した。濾過直前に、濾過膜近くの油滴が沈殿するのを可能にするために、懸濁液を約２分間、保持した。相分離の程度を試験するための対照として、シリコーンオイルをナイルレッド色素で標識した後に、含水硝酸エステル（aqueous nitrate）の蛍光を測定した。６２８ｎｍにおけるほんのわずかな蛍光測定値によって、十分な分離が実証された。
【0113】
２つの試料型の光学密度を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ３５分光光度計（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）で測定した。液滴集塊物を解膠するための短時間の穏やかな撹拌後、均一なシリコーンオイル懸濁液光学密度を、時間および製剤条件の関数として６６０ｎｍで測定した。水性濾液において、２８０ｎｍでのｍＡｂ吸光度を測定して、ｍＡｂ濃度を決定した。あるいは、ｍＡｂ濃度をクーマシー色素結合アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｅｔｔｅｒ Ｂｒａｎｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で測定した。
【0114】
シリコーンオイル液滴のサイズ分布を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ２３０レーザー回折粒子サイズアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて測定した。相対サイズ分布を、均質化後すぐに、および懸濁液調製から２週間目までの間、時間の関数として、懸濁液について測定した。シリコーンオイル液滴の相対サイズ分布および数濃度から、シリコーンオイル総表面積を推定した。
【0115】
蛍光活性化粒子スキャニングは、粒子サイズ、形態、および相対粒子蛍光を分析するために用いることができる。閾値サイズ（＞１μｍ直径）の粒子のみがその技術によって分析される。スキャンされる粒子について、前方光散乱（ＦＳＣ、１８００光散乱）、側方光散乱（ＳＳＣ、９０°光散乱）、緑色蛍光強度（ＦＬ１、５２５〜５８５ｎｍ）、および赤色蛍光強度（ＦＬ２、５８５〜６００ｎｍ）を測定した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）トラスツズマブ分子を、きちんと解説されたプロトコール（ＭＰ ００１４３、Ａｍｉｎｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で化学的に標識した。シリコーンオイルを標識するために、ナイルレッド色素をシリコーンオイル中に５ｍｇ／ｍＬで溶解した。ナイルレッド、９−ジエチルアミノ−５−ベンゾフェノキサジン−５−オンは、蛍光が水中で完全に消光される極めて疎水性の高い色素である。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素は、５１９ｎｍの発光最大値を有し、ナイルレッド色素は６２８ｎｍの発光最大値を有する。化学的に標識されたｍＡｂおよび染色されたシリコーンオイルを含む懸濁液を、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ（商標）フローサイトメーターアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）でスキャンした。
【0116】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）トラスツズマブが懸濁液中、シリコーンオイル液滴と相互作用する程度は、製剤環境およびインキュベーション時間に依存する。図１Ａおよび１Ｂは、ｍＡｂのシリコーンオイルとの会合を示す。シンボルは、最初のｍＡｂ濃度と濾液中のｍＡｂ濃度との間の差によって測定された３連の算術的平均である。誤差バーは、±１標準偏差を表す。全シリーズにおいて、ｍＡｂ濃度は１ｍｇ／ｍＬである。両方のパネルにおいて、正方形は、０．５Ｍのスクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤を示す。図１Ａにおいて、三角形は、ｍＡｂおよびオイルのみを含む製剤を示す。図１Ｂにおいて、三角形は、０．５Ｍのスクロース、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤、ｍＡｂ、およびオイルを含む製剤を示す。
【0117】
懸濁、インキュベーション、および濾過後、スクロースを含む製剤は、十分長いインキュベーション時間において、水性濾液中、スクロースを含まないものより高い濃度のｍＡｂを含んだ。したがって、図１Ａに示されているように、スクロースの存在は、長時間におけるｍＡｂ凝集を低減する。図１Ｂは、パネルＡに示されたスクロースを含む製剤を、スクロースおよび非イオン性界面活性剤を含む製剤と比較している。非イオン性界面活性剤の添加は、ｍＡｂのシリコーンオイルとの会合をさらに低減した。
【0118】
標識ｍＡｂおよび標識シリコーンオイルを含む粒子の蛍光強度を測定することによって、製剤添加剤のｍＡｂ凝集への効果をより良く理解することができる。図２Ａ〜２Ｄは、２つの波長バンドの蛍光強度散布図を示す。図２Ａ〜２Ｄにおいて、ＦＬ１強度は、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８標識ｍＡｂ濃度に正比例する。ＦＬ２蛍光強度は、ナイルレッド標識シリコーンオイル体積に正比例する。ＦＬ１およびＦＬ２強度は、おおよそ粒子サイズに対応しており、１０倍より大きいサイズ範囲にわたっている。実験設定を、ｍＡｂおよびシリコーンオイルの相対強度が図２Ａにおいて等価であるように最適化した。これらの設定を全ての他の製剤について保持した（図２Ｂ〜２Ｄ）。したがって、パネル内の傾向およびパネル間の比較は有意義である；絶対強度値は意味がない。軸単位は任意であった。ヒストグラムは粒子強度分布を表す。ヒストグラムスケールは０から０．５までの範囲である。図２Ａ〜２Ｄは、スクロースおよび界面活性剤の様々な組合せを含む１ｍｇ／ｍＬのｍＡｂおよびシリコーンオイルの製剤を示す：Ａ スクロースも界面活性剤も含まない；Ｂ ０．５Ｍのスクロース；Ｃ ０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤；ならびにＤ ０．５Ｍのスクロースおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤。
【0119】
図２Ａ〜２Ｄのそれぞれは、表１における同じ文字をもつ製剤と対応している。したがって、左側の２つのパネル（図２Ａおよび２Ｃ）は、スクロースを含まない製剤を表す。右側の２つのパネル（図２Ｂおよび２Ｄ）は、スクロースを含む製剤を表す。上から下へと、パネルは、界面活性剤なし（図２Ａおよび２Ｂ）および非イオン性界面活性剤有り（図２Ｃおよび２Ｄ）を表す。
【0120】
図２Ａは、ｍＡｂおよびシリコーンオイルだけを含む製剤についての粒子強度を示す。散布図は、サイズの１０倍までの範囲（約１〜１０μｍ）にわたって線形であり、ｍＡｂ濃度のシリコーンオイル体積に対する比は異なるサイズの粒子について一定であることを示す。Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤の添加（図２Ｃ）は、ＦＬ１強度にもＦＬ２強度にも有意には影響しない。スクロースを製剤に導入した場合（右パネル）、蛍光強度の範囲は一般的に圧縮される。さらに、スクロースおよびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤の存在の組合せは、ｍＡｂ凝集を大きく低下させる：粒子の半分より多くは無視できるほどのＦＬ１強度を記録する（図２Ｄ）。図２Ｂにおいて、複数のデータ傾向は、２つ以上の別個の粒子集団を示唆する。
【0121】
散布図における線形からの逸脱は、油滴のサイズが増加するにつれて、粒子成長が線形ではない領域が存在することを示す。代わりに、本質的に同じサイズの粒子について表面粗さの違いが存在するように思われる。いかなる理論によっても縛られるつもりはないが、非線形の非球形粒子成長の１つの説得力のある説明は、粒子が、即時の癒着なしに、より小さな液滴の付加によって成長することである。この「クリーミング（ｃｒｅａｍｉｎｇ）」効果は、多液滴の集塊物である粒子を生じる。蛍光スキャニングは、粒子が塊になるにつれての抗体／オイルの粒子への寄与の測定を可能にする。
【0122】
（赤色強度および緑色強度の増加に対応する）粒子のサイズが成長する時、抗体のオイルに対する比は一般的に一定のままである。これは、より小さな油滴が結合して、より大きな多液滴粒子を形成するという仮説を支持する。液滴が塊になってより大きな粒子を形成した時、小さなシリコーンオイル液滴の表面に吸収された抗体分子は、シリコーンオイルと会合したままであるように思われる。
【0123】
図３Ａ〜３Ｄは、同じ４つの製剤Ａ〜Ｄ（表１参照）についてスクロースおよび界面活性剤の様々な組合せを含む水性ｍＡｂ製剤（１ｍｇ／ｍＬ）におけるシリコーンオイル液滴の側方光散乱（９０°光散乱）対前方光散乱（１８０°光散乱）の散布図である。前方光散乱強度は、主に粒子サイズによって影響され、側方光散乱強度は、粒子サイズおよび表面粗さによって影響を及ぼされる。軸単位は任意である。ヒストグラムは粒子分布を表す。ヒストグラムスケールは０から０．５までの範囲である。図３Ａ〜３Ｄは、スクロースおよび界面活性剤の様々な組合せを含む１ｍｇ／ｍＬのｍＡｂおよびシリコーンオイルの製剤を示す：Ａ スクロースも界面活性剤も含まない、Ｂ ０．５Ｍのスクロース、Ｃ ０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤、ならびにＤ ０．５Ｍのスクロースおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤。図３Ｂおよび３Ｄに示されているように、スクロースの添加は、平均粒子サイズ（ｘ軸）および表面粗さ（ｙ軸）を大きく低下させる。
【0124】
シリコーンオイル癒着の相対速度は、図４Ａおよび４Ｂにプロットされている。図４Ａおよび４Ｂは、浮遊シリコーンオイルを含むｍＡｂ製剤における光オブスキュレーションの時間依存性を示す。各製剤の試料を、懸濁液を解膠および脱クリーミングするための短時間の回旋後、分析した。各製剤の最初の時点を、同じ値に対して標準化した。シンボルは、３連の算術的平均であり、誤差バーは、±１標準偏差を表す。図４Ａおよび４Ｂのそれぞれにおいて、ｍＡｂ濃度は１ｍｇ／ｍＬである。図４Ａおよび４Ｂにおいて、正方形は、０．５Ｍのスクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤を示す。図４Ａにおいて、三角形は、ｍＡｂおよびオイルのみを含む製剤を示す。図４Ａは、スクロースを含む場合とスクロースを含まない場合の、ｍＡｂおよびシリコーンオイルの製剤を比較する。図４Ａに示されているように、スクロースは、シリコーンオイル癒着の速度を増強した。図４Ｂにおいて、三角形は、０．５Ｍのスクロース、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤、ｍＡｂ、およびオイルを含む製剤を示す。図４Ｂは、スクロースを含む製剤を、スクロースおよび非イオン性界面活性剤を含む製剤と比較する。図４Ｂに示されているように、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤は、シリコーンオイル癒着速度を低下させた。したがって、浮遊している油滴は、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤が存在する場合はより長く、スクロースが存在する場合はより短く、溶液中に留まる。
【0125】
各製剤におけるシリコーンオイル表面積を各時点で推定した後、表面積標準化ｍＡｂ凝集を計算することができる（図５Ａ〜５Ｂ）。図５Ａ〜５Ｂのそれぞれは、図１における同じパネルに対応し、シリコーンオイル表面積を考慮するように改変されている。シンボルは、最初のｍＡｂ濃度と濾液中のｍＡｂ濃度の間の差によって測定された３連の算術的平均である。差を、製剤特異的および時間特異的シリコーンオイル表面積で割る。誤差バーは、±１標準偏差を表す。図５Ａおよび５Ｂのそれぞれにおいて、ｍＡｂ濃度は１ｍｇ／ｍＬである。全パネルにおいて、点線は、単層被覆の推定値を表し、正方形は、０．５Ｍのスクロース、ｍＡｂ、およびシリコーンオイルを含む製剤を示す。図５Ａにおいて、三角形は、ｍＡｂおよびオイルのみを含む製剤を示す。図５Ｂにおいて、三角形は、０．５Ｍのスクロース、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤、ｍＡｂ、およびオイルを含む製剤を示す。シリコーンオイル表面積によって標準化すると、ｍＡｂ凝集は、図５Ａに示されているように、スクロースの存在下で十分長い時間において、実際に増加する。スクロースおよびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤を含む製剤において、ｍＡｂ／オイル会合レベルは、低く、かつ相対的に一定のままである（図５Ｂ）。
【0126】
上記の図において示されているように、製剤添加剤は、シリコーンオイル液滴癒着、ｍＡｂのシリコーンオイルへの曝露のレベル、およびｍＡｂ凝集に影響を及ぼすことができる。さらに、２つ以上の製剤添加剤の併用効果は、それぞれの別々の効果より顕著であることがある。具体的には、スクロースおよびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤の両方を含む製剤は、ｍＡｂのシリコーンオイルとの会合を効果的に低下させ、スクロースの製剤への添加は、シリコーンオイル液滴特性を著しく変化させる。
【0127】
いかなる理論によっても縛られるつもりはないが、スクロースがｍＡｂのシリコーンオイルとの会合を低下させる機構は、癒着の推進であると考えられる。上記の実施例において、スクロースは、図４Ａに示されているように、シリコーンオイル癒着の速度を増加させる。液滴が癒着するにつれて、シリコーンオイルの総表面積は減少する。スクロースを含む製剤において、利用可能である表面積が減少しているため、ｍＡｂ凝集速度は、十分長い時間では下降する（図１Ａ）。興味深いことに、スクロースは、シリコーンオイル表面単位あたりのｍＡｂ／シリコーンオイル会合の程度を増加させる（図５Ａ）。たとえそうであっても、全体的な凝集速度は、癒着の増強により改善する。したがって、スクロースの治療用ｍＡｂ製剤への添加は、ｍＡｂ安定化にとって有益であるだけでなく、ｍＡｂのシリコーンオイル表面への曝露を低下させるためにも有益である可能性がある。
【0128】
スクロースを含む製剤へのＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤の添加は、ｍＡｂ／オイル会合レベルをさらに低下させることができる。この効果は、特に、短時間で明らかである（図４Ｂ）。興味深いことに、ｍＡｂ／オイル会合を阻害することにおけるＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤の効果は、図２Ｃおよび２Ｄに示されているように、スクロースの共存によって増強される。スクロースの非存在下において、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤を含む製剤についての蛍光強度散布図（図２Ｃ）は、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤を含まない製剤についてのもの（図２Ａ）と有意には異ならない。しかしながら、糖および非イオン性界面活性剤が両方とも製剤に存在する場合（図２Ｄ）、ｍＡｂ／オイル会合の低下は増強される。
【0129】
スクロースおよびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤が一緒にｍＡｂ凝集を防ぐ機構は、スクロース単独の機構と異なる。図４Ｂに証明されているように、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤のスクロースを含む製剤への添加は、オイル癒着速度を遅くする。液滴サイズおよび数濃度測定値から、浮遊シリコーンオイル表面積は、均質化から２週間目まで比較的一定のままである。スクロースおよびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤を含む製剤は、ｍＡｂ凝集を阻害し、スクロースを含むが、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤を含まない２番目に最も良い製剤に対してほとんど１／２の凝集低下を示す（図５Ｂ）。
【0130】
ｍＡｂを含まないシリコーンオイル懸濁液の光散乱ドットプロットは、図３および４に示されたものとほとんど同一であるように思われるため、散布図プロファイルは、主に、シリコーンオイル液滴特性についての情報、すなわち、フロキュレーションおよび癒着を明らかにしている。シリコーンオイル癒着速度およびクリーミング速度のスクロース推進性増加は、これらのドットプロットに影響を及ぼす。スクロースを含む製剤において、液滴は、スクロースを含まない製剤においてより、小さく、表面複雑さが低く、サイズ範囲が狭い。
【0131】
図３におけるスクロースを含まない製剤において、制約されたデータ傾向は興味深い。仮定的には、垂直光散乱が最適に較正されるという条件で、様々なサイズの完全に滑らかな球形粒子が線形トレンドを生じるであろう。線形からの変化は、球形からの形状偏差を示す。いかなる理論によっても縛られるつもりはないが、この研究で観察された偏差は、即時の癒着なしの液滴フロキュレーションに起因すると考えられる。したがって、より小さな球形液滴で構成される大きな粒子は、球形粒子に関しては存在しない表面複雑さを示す。図６は、前方および側方光散乱に基づいた、シリコーンオイル液滴の仮定的表示および集塊物分布である。線形トレンド（点線）は、様々な直径の球形液滴から生じると考えられる。散布図プロファイルにおける線形からの逸脱は、即時の癒着なしの液滴集塊によって説明することができる。
【0132】
液滴の持続性集塊物（すなわち、迅速には癒着しないフロック）の存在は、この調査において観察された他の現象を説明できる。（解膠を誘導する可能性が高い）層流光オブスキュレーションにより測定された粒子サイズ分布は、蛍光活性化粒子スキャニングによる測定値より狭い液滴サイズ範囲を一貫して明らかにした。加えて、スクロースを含まない多くの製剤において、ｍＡｂ濃度のシリコーンオイル体積に対する比は、粒子サイズの幅広い範囲に対して、比較的一定であった。遅い癒着のために、吸着されたｍＡｂは必ずしも、フロキュレーションによってシリコーンオイル表面から追い出されるわけではない。そういうわけで、ｍＡｂ濃度は、表面積の代わりにシリコーンオイル集塊物体積と線形に増加することができる。
【0133】
ＦＬ１対ＦＬ２散布図における分割されたトレンドは、粒子の別々の集団の存在によって説明することができる。これらのトレンドは、スクロースを含む製剤において生じる（図２Ｂ）。製剤条件に依存して、以下のいくつかの粒子集団の組合せが存在し得る：シリコーンオイルを含まないｍＡｂ凝集物、シリコーンオイル核を含むｍＡｂ凝集物、およびｍＡｂが液滴表面に吸着しているシリコーンオイル液滴集塊物。ｍＡｂ凝集物の疎水性ポケットがシリコーンオイルからナイルレッドを剥奪する可能性がある。あるいは、シリコーンオイル液滴は、ｍＡｂ凝集のための核としての役割を果たすことができる。
【0134】
スクロースおよびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤を含む治療用ｍＡｂ製剤は、シリコーンオイルの存在下におけるｍＡｂ凝集を著しく低下させる。程度がより小さくなって、スクロースのみを含む製剤は、おそらくシリコーンオイル癒着速度の増加が原因で、ｍＡｂ凝集を低下させる。シリコーンオイルの混入はタンパク質凝集を引き起こすことが示されているため、タンパク質凝集を低下させる製剤ストラテジーの成功は、シリコーンオイルに曝される製品にとって重要であり得る。スクロースの治療用タンパク質製剤への添加は、タンパク質のシリコーンオイル表面への曝露を低減することができる。上記実施例に示されているように、スクロースおよび非イオン性界面活性剤を含む製剤は、シリコーンオイルが引き起こすタンパク質凝集を阻害することができる。
【0135】
実施例Ｂ懸濁液におけるオイル負荷に対するオイル粘性の効果
医療グレードのシリコーンオイルを、表２に示されているように、非イオン性界面活性剤を含む水溶液、および含まない水溶液に加えた。各試料におけるシリコーンオイルの濃度および粘性は下記の表２に示されている。図７は、６００ｎｍでの光学密度の測定によって間接的に、オイル負荷（oil loading）に対するオイル粘性の影響を示す。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）は、浮遊オイル濃度の間接的測定である。図７および表２に示されているように、より低いオイル粘性はより高い最初のＯＤ６００を反映し、そのより高いＯＤ６００がより高いオイル負荷を許容する。図８および９に示されているように、試験された試料について異なる粘性（１，０００ｃＳｔ対１２，５００ｃＳｔ）のポリジメチルシロキサンの浮遊油滴の癒着挙動における質的違いはなかった。
【0136】
【表2】
【0137】
実施例Ｃシリコーンオイルを、上記の実施例Ａに記載されているように、５ｍｇ／ｍｌでシリコーンオイルにナイルレッド色素を溶解することによって標識した。本研究に用いられるモノクローナル抗体は、標準の市販されているＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）マウス抗ヒトＣＤ４ ｍＡｂ（クローンＲＰＡ−Ｔ４、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）であった。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）色素は、４５５ｎｍの発光最大値を有する。ナイルレッドは６２８ｎｍの発光最大値を有するが、有意なナイルレッド発光シグナルは、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）に通常用いられる検出器において生じ、その発光検出器が、この実施例Ｃについてのナイルレッド標識試料に用いられた。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）標識ｍＡｂおよびナイルレッド標識シリコーンオイルを含む懸濁液を、上記の実施例Ａに記載されているように、調製し、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）検出（４５０／５０ＢＰフィルター）のために紫色レーザー励起（４０５ｎｍ）およびナイルレッド検出（５８５／４２ＢＰフィルター）のために青色レーザー励起（４８８ｎｍ）を用いてＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩ フローサイトメーターアナライザー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）で分析した。各粒子について総蛍光が測定されることを保証するために、全ての蛍光測定を、パルス領域を用いて行った。広いダイナミックレンジ（４桁）に対して蛍光分布を適切に示し、さらにゼロ値および負の値が正確にディスプレイされるのを可能にするために、ＢＤ Ｄｉｖａソフトウェア内からの双指数関数（biexponential）変換（Ｌｏｇｉｃｌｅ、ＤＲ Ｐａｒｋｓ、ＷＡ Ｍｏｏｒｅ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いた。
【0138】
懸濁液において標識ＣＤ３抗体がシリコーンオイル液滴と相互作用する程度は、製剤環境およびインキュベーション時間に依存する。図１２Ａ〜１２Ｄは、ｍＡｂの、非標識シリコーンオイルとの会合およびナイルレッドで標識されたシリコーンオイルとの会合の両方を示す。ｍＡｂを含む全ての試料において、ｍＡｂ濃度は２μｇ／ｍｌであった。
【0139】
今、図１３Ａおよび１３Ｂを参照すれば、ナイルレッドシグナルの関数としての標識ｍＡｂからのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標）シグナルの傾き（図１３Ｂ）は、体積の関数としての表面積についての理想の理論値の傾き（図１３Ａ）と非常に近かった。理論的には、完全な球形について、表面積の体積に対する傾きは、１０の２／３乗（１００．６６７）であり、観察された傾きは１００．６０３であり、ｍＡｂが、オイル粒子の内部の中に捕獲されるか、または分布しているということに対立するものとして、油滴またはオイル粒子の外部上に存在するという予想と一致した。ｍＡｂがナイルレッド標識油滴と線形様式で分布しているならば、傾きは、対数プロット上かまたは双指数関数ディスプレイの対数部分上のいずれかで、約１．０であるはずである。
【0140】
ｍＡｂ粒子およびシリコーンオイル粒子とｍＡｂ粒子の集塊物からのシリコーンオイル粒子の分離への非イオン性界面活性剤の効果は、図１４Ａおよび図１４Ｂに示されている。図１４Ａは、本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１４Ｂは、本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。デジタルベースライン補正後、相対蛍光値は、本質的にスコアを意味し、シグナル強度を示し、検出可能なシグナルをもたない集団は、それらの値のうちの半分が負で、それらの値のうちの半分が正のため、ゼロ近くに中心がある傾向を有する。双指数関数変換は、最も薄暗い集団の分散に基づいてゼロ値および負の値をスケールの下端にディスプレイすること、対数への円滑な移行、ならびに標準対数スケールに等価のディスプレイレンジの大部分を可能にする分散標準化変換である。図１４Ｂに示されているように、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤は、ｍＡｂ／オイル会合を阻害するのに効果的である。
【0141】
ｍＡｂ粒子およびシリコーンオイル粒子とｍＡｂ粒子の集塊物からのシリコーンオイル粒子の分離への非イオン性界面活性剤の効果は、図１５Ａおよび図１５Ｂに示されている。図１５Ａは、本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１５Ｂは、本発明による、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および標識タンパク質を油滴に曝した後に加えられた０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１５Ｂに示されているように、Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤は、ｍＡｂ／オイル会合を阻害するのに効果的である。
【0142】
ｍＡｂ粒子およびシリコーンオイル粒子とｍＡｂ粒子の集塊物からのシリコーンオイル粒子の分離への非イオン性界面活性剤、塩、および糖の効果は、図１６Ａ〜１６Ｄに示されている。図１６Ａは、本発明によるナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１６Ｂは、本発明による、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および１５０ｍＭのＮａＣｌの試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１６Ａ（塩を含まない製剤）および１６Ｂ（塩を含む製剤）の比較によって示されるように、ＮａＣｌ塩の存在は、ｍＡｂ／オイル会合を阻害するようには見えなかった。
【0143】
図１６Ｃは、本発明による、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．５Ｍのスクロースの試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１６Ａ（スクロースを含まない製剤）および１６Ｃ（スクロースを含む製剤）の比較によって示されるように、スクロースの存在は、ｍＡｂ／オイル会合を阻害するようには見えなかった。
【0144】
図１６Ｄは、本発明による、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、０．５Ｍのスクロース、１５０ｍＭの塩、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１６Ａ（塩もスクロースも非イオン性界面活性剤も含まない製剤）および１６Ｄ（塩、スクロース、およびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤を含む製剤）の比較によって示されるように、塩、スクロース、およびＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）非イオン性界面活性剤の存在は、ｍＡｂ／オイル会合を阻害した。
【0145】
蛍光活性化粒子スキャニングにおいて、電子パルスウィンドウは、シグナルが、特定された時間枠内で処理されるのを可能にするタイミングウィンドウ（ウィンドウゲート）である。通常、これは、パルスの完全積分を確実にするように、データ収集中、保存的な一定値（特定の器械についての製造会社の使用説明書によれば、最小限必要とされる値より数マイクロ秒長いことが多い）に設定される。（ウィンドウ拡張を調整することによって）精密較正システム上でシグナルを完全に積分するのに必要とされる時間だけにまで時間を減少させることの効果を、非イオン性界面活性剤を含む試料および含まない試料について１０μｓ対２μｓで評価した。図１７Ａは、本発明による、１０μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１７Ｂは、本発明による、１０μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１７Ｃは、本発明による、２μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイルおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１７Ｄは、本発明による、２μｓのウィンドウ拡張で測定された、ナイルレッド色素で標識されたシリコーンオイル、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート非イオン性界面活性剤の試料についての、ナイルレッド標識シリコーンオイルの相対蛍光強度（ｘ軸）に対するＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）色素で標識されたＣＤ３抗体の相対蛍光強度（ｙ軸）のプロットである。図１７Ａと１７Ｃ、および図１７Ｂと１７Ｄのそれぞれの比較によって示されるように、ウィンドウ拡張を１０μｓから２μｓへ減少させることは、両方の色素範囲における集団変動係数（ＣＶ）を低下させる。
【0146】
本発明の特定の実施形態の特定の詳細に関して本発明を記載してきた。添付された特許請求の範囲に含まれる場合を除いて、そのような詳細が本発明の範囲への限定としてみなされることを意図するものではない。