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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5978172
(24)【登録日】2016年7月29日
(45)【発行日】2016年8月24日
(54)【発明の名称】ウイルスの増殖のための二段階温度プロフィール
(51)【国際特許分類】
C12N 7/02 20060101AFI20160817BHJP
C12N 7/04 20060101ALI20160817BHJP
【ＦＩ】
C12N7/02
C12N7/04
【請求項の数】24
【外国語出願】
【全頁数】21
(21)【出願番号】特願2013-141293(P2013-141293)
(22)【出願日】2013年7月5日
(62)【分割の表示】特願2010-504578(P2010-504578)の分割
【原出願日】2008年4月30日
(65)【公開番号】特開2013-198502(P2013-198502A)
(43)【公開日】2013年10月3日
【審査請求日】2013年7月5日
(31)【優先権主張番号】60/927,693
(32)【優先日】2007年5月4日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】591013229
【氏名又は名称】バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
(73)【特許権者】
【識別番号】501453189
【氏名又は名称】バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】マンフレッド ライター
(72)【発明者】
【氏名】レオポルド グリルベルガー
(72)【発明者】
【氏名】ウォルフガング ムント
【審査官】
太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００７−６８４０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００６／０７１５６３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第２００４／０９６９９３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
WECHUCK JAMES B，BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，２００２年 ７月 ５日，V79 N1，P112-119
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＣｉＮｉｉ
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウィルスを産生するための方法であって、以下：
細胞培養増殖温度にて宿主細胞を培養するステップ、
該宿主細胞をウィルスに感染させて、感染した宿主細胞を形成するステップ、
該感染した宿主細胞を、３０℃〜３７．５℃の範囲の第一温度にて１〜４８時間培養し、その後、該感染した宿主細胞を、該第一温度より１℃〜６℃低い第二温度にて培養するステップであって、ここで、該第一温度は増殖温度より低い、ステップ、および
該培養のステップによって産生された該ウィルスの複製を集めるステップ
を包含する、方法。
細胞培養増殖温度にて宿主細胞を培養するステップ、
該宿主細胞をウィルスに感染させて、感染した宿主細胞を形成するステップ、
該感染した宿主細胞を、３０℃〜３７．５℃の範囲の第一温度にて１〜４８時間培養し、その後、該感染した宿主細胞を、該第一温度より１℃〜６℃低い第二温度にて培養するステップであって、ここで、該第一温度は増殖温度より低い、ステップ、および
該培養のステップによって産生された該ウィルスの複製を集めるステップ
を包含する、方法。
【請求項2】
前記ウィルスが、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ウィルスがインフルエンザウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ウィルスがインフルエンザＡ型およびＢ型から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ウィルスがロスリバーウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記ウィルスが西ナイルウィルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記宿主細胞が動物細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記宿主細胞が上皮細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記宿主細胞が腎臓上皮細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記宿主細胞がベロ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第一温度が３２℃〜３７℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記第一温度が３３℃〜３６℃の範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第一温度が３４℃〜３５．５℃の範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記第二温度が、前記第一温度と比較して１．５℃〜５℃低下される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記第二温度が、前記第一温度に対して２℃〜４℃低下される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記第二温度が２９℃〜３５℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記第二温度が３０℃〜３４℃の範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記第二温度が３１℃〜３３℃の範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ウィルスまたはウィルス抗原を単離するステップをさらに包含する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ウィルスを断片化するステップをさらに包含する、請求項１９に記載のウィルスまたはウィルス抗原を産生するための方法。
【請求項21】
前記ウィルスを不活性化するステップをさらに包含する、請求項１９に記載のウィルスまたはウィルス抗原を産生するための方法。
【請求項22】
請求項１９に記載の方法を実施するステップ、および、前記ウィルスまたはウィルス抗原を用いて免疫原性組成物を調製するステップを包含する、免疫原性組成物を調製する方法。
【請求項23】
第一温度での前記培養が少なくとも二時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
第二温度での前記培養が２４〜６７時間である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２００７年５月４日に出願された米国仮特許出願第６０／９２７，６９３号に対する優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／９２７，６９３号の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【0002】
本発明は、ウィルス増殖の分野に関する。
【背景技術】
【0003】
動物細胞培養におけるウィルス増殖が、ウィルスの特性と増殖のための宿主系に依存する温度条件下で、行われる。ある温度が細胞増殖のために（細胞培養または有胚卵育種において）選択された後、ウィルス増殖のための温度が選択される。ほとんどの場合、ウィルス増殖温度は、細胞増殖温度より低い。温度感受性のウィルスの増殖は、昆虫細胞培養（例えばバクロウィルス産生を伴う）で大体２０℃周辺の温度範囲内で、および哺乳類細胞培養におけるウィルス産生では最大約３７℃の温度で、ウィルス／宿主細胞組み合わせごとに特定の最適条件を伴って、ウィルス増殖速度および抗原の形成に影響を与えることに関する。高温は、感染キネティクスおよびウィルス安定性の両方に影響する。ウィルスを３７℃の温度で増殖させると、ウィルス複製後期に、ウィルス力価の低下およびウィルス抗原品質の低下が観察されることが多い。この影響は、ワクチン産生のためのラージスケールのウィルス増殖に有害な結果をもたらしうる。
【0004】
本発明の目標は、ワクチン接種目的で生成される抗原の品質に影響しない、改善された増殖条件を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、ウィルスの産生方法を提供し、一つ以上の宿主細胞がウィルスで感染された後、第一温度で培養され（例えば３１℃〜３７℃の温度で１〜４８時間）、その後、第一温度と比較して低下した（例えば１℃〜６℃）第二温度で、培養される。そして、これらの培養ステップにより生成されたウィルスが、回収される。
【0006】
驚くべきことに、インフルエンザ（Ｏｒｔｈｏ−ｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ロスリバーウィルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）および西ナイルウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）を含む多くのウィルスで、二温度プロフィールを用いることにより、培養条件が大幅に改善されうることが現在分かった。高いほうの温度が、ウィルス増殖の第一段階に適用され、感染性ウィルス粒子の形成を加速する。第二段階においては、低いほうの温度が適用されて、高温増殖期間に得られた最初の高力価が維持され、免疫原性ワクチンのさらなる製造に使用できる安定した抗原の形成が可能となる。例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ウィルスの産生方法であり、前記方法が、
前記ウィルスに感染させた宿主細胞を提供するステップと、
前記感染した宿主細胞を、３１℃〜３７℃の範囲の第一温度で、１〜４８時間培養するステップと、
その後、前記感染した宿主細胞を、前記第一温度より１℃〜６℃低い第二温度で培養するステップと、
前記培養ステップにより生成される前記ウィルスの複製を集めるステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記ウィルスが、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ウィルスが、インフルエンザウィルスである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ウィルスが、インフルエンザＡ型およびＢ型より選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ウィルスが、ロスリバーウィルスである、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記ウィルスが、西ナイルウィルスである、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記宿主細胞が、動物細胞培養または細胞系統である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記宿主細胞が、上皮細胞である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記宿主細胞が、腎臓上皮細胞である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記宿主細胞が、ベロ細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記第一温度が、３２℃〜３７℃の範囲である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第一温度が、３３℃〜３６℃の範囲である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第一温度が、３４℃〜３５．５℃の範囲である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第二温度が、前記第一温度と比較して１．５℃〜５℃低下される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記第二温度が、前記第一温度に対して２℃〜４℃低下される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第二温度が、２９℃〜３５℃の範囲である、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記第二温度が、３０℃〜３４℃の範囲である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第二温度が、３１℃〜３３℃の範囲である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記宿主細胞が、接種後直接培養される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
ウィルスまたはウィルス抗原の産生方法であり、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、項目１により産生されるウィルスから得られ、前記生成されたウィルスまたはウィルス抗原が、単離される、方法。
（項目２１）
前記ウィルスが、断片化される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記ウィルスが、不活性化される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ウィルスのワクチンを調製するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記第一温度での培養が、少なくとも二時間である、項目１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ベロ細胞において（Ａ）３２℃および（Ｂ）３６℃で増殖させた、ニューカレドニアウィルスの抗原バンドパターン。
【図2】感染後の様々な時点での、３７℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図3】感染後の様々な時点での、３５℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図4】感染後の様々な時点での、３２℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図5】感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃でのロスリバーウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図6】３７℃および３５℃／３２℃での感染のロスリバーウィルス接種菌のウェスタンブロット。
【図7A】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図7B】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図7C】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図7D】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図8A】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図8B】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図8C】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図8D】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図9A】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図9B】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図9C】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【図9D】顕微鏡画像を伴う、感染後の様々な時点での、３５℃／３２℃での西ナイルウィルス感染のＮａＢｒプロット。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の一態様は、本明細書に記載の二段階温度プロフィールが、（１）宿主細胞の複数回感染のための活性ウィルスの形成、（２）複製の後段階で得られた高力価の維持、および（３）産生プロセスの後段階における抗原形成の、独立した最適化および制御を可能にするという認識である。
【0009】
本発明の好ましい実施形態においては、当該ウィルスは、オルトミクソウィルス、アルファウィルスまたはフラビウィルスである。
【0010】
ウィルスは、インフルエンザウィルスであるのが好ましく、ある実施形態では、インフルエンザＡ型およびＢ型、ロスリバーウィルスおよび西ナイルウィルスからなる群より選択される。本明細書に提供される実施例は、本発明の二温度方法を用いた、これらのウィルスでの改良された抗原産生を示すが、本発明により予定される他のウィルスの非限定的な例には、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＢｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ等のＲＮＡウィルスファミリー、および、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＨｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ等のＤＮＡウィルスファミリーの群より選択されるウィルスが含まれる。ある実施形態では、ウィルスは、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５、およびＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６からなる群より選択される。
【0011】
ウィルスは、ウィルス産生に適切な任意の細胞において産生されうる。細胞は、動物細胞培養または細胞系統のものであるのが好ましい。このような細胞は、特定の組織または胚細胞からのものでありうる。動物は、哺乳類または鳥類であるのが好ましい。本発明の様々な実施形態は、イヌ細胞系統、齧歯目細胞系統、鳥類細胞系統または霊長類組織細胞系統を利用しうる。例えば、ある実施形態では、細胞は、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ｐｅｒＣ６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはウィルス増殖において一般に使用される他の細胞でありうる。いくつかの特定の実施形態においては、細胞は、上皮細胞、特に腎臓上皮細胞、例えばアフリカミドリザルのベロ細胞などである。
【0012】
本発明のある実施形態においては、細胞は、動物の血清タンパク質を含まない培地で培養される。このような培地は、例えば、ウシ血清またはその部分、例えば胎児ウシ血清を含まない。このような培地は、「無血清無タンパク質培地」と呼ばれる。ウィルス増殖期間中、トリプシン等、ウィルス増殖に必要とされるプロテアーゼが、培地に加えられうる。いくつかの実施形態においては、このようなプロテアーゼは、バクテリアまたは組換え源のような非動物源に由来し、または動物源に由来しうる。このような添加培地も、本明細書で用いられるところの用語の意義の範囲内の、無血清タンパク質培地であると考えられる。
【0013】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明の方法は、工業規模で実施される。本発明のいくつかの実施形態においては、方法は、５０リットル以上の細胞培養、五十〜１００リットルの細胞培養、１００〜５００リットルの細胞培養、５００〜１０００リットルの細胞培養、または１０００リットルを上回る細胞培養（例えば６０００リットル、１０，０００リットル、またはさらに大きなバイオリアクター）で実施される。本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の方法は、撹拌槽バイオリアクターで実施される。
【0014】
本発明の好ましい方法においては、第一ウィルス増殖温度は、所与の宿主細胞型のための細胞培養増殖温度より低い。いくつかの実施形態においては、第一温度は、３２℃〜３７℃の間であり、好ましくは３３℃〜３６℃の間、より好ましくは３４℃〜３５．５℃の間、特に３５℃である。他の実施態様においては、第一温度は、３０℃〜３６℃の間であり、好ましくは３０℃〜３５℃の間、より好ましくは３１℃〜３５℃の間、より好ましくは３１℃〜３４℃の間、より好ましくは３２℃〜３４℃の間、より好ましくは３２℃〜３３．５℃の間、より好ましくは３３℃および３４℃の間、最も好ましくは３３．５℃であり、または、いくつかの実施形態においては、３３℃である。特に、大きな細胞培養体積（１０００リットル以上）では、第一温度範囲が低めであるのが好まれうる。第一温度は、少なくとも３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、または３６℃、または３８℃、３７．５℃、３７℃、３６℃、３５．５℃、または３５℃未満でありうる。第一温度での細胞培養は、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０時間を上回り、または、６０、５８、５６、５４、５２、５０、４８、４６、４４、４２、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４または１２時間未満でありうる。
【0015】
追加的な実施形態においては、第二温度は、第一温度と比較して１．５℃〜５℃低下し、好ましくは２℃〜４℃低下し、より好ましくは２．５℃〜３．５℃、最も好ましくは３℃低下する。低下は、少なくとも１℃、２℃、２．５℃、３℃、または４℃、または６℃、５℃、４℃、３．５℃、３℃、２．５℃、または２℃未満でありうる。
【0016】
他の実施形態においては、第二温度は、２９℃〜３５℃の範囲であり、好ましくは３０℃〜３４℃、より好ましくは３１℃〜３３℃、より好ましくは３１．５℃〜３２．５℃、最も好ましくは３２℃である。第二温度は、２８℃、２９℃、３０℃、または３１℃を上回り、または３５℃、３４℃、３３℃、または３２℃を下回りうる。
【0017】
この方法は、ウィルス抗原の産生のためにも用いられうる。したがって、さらなる態様では、本発明は、ウィルスまたはウィルス抗原の産生方法を提供し、ウィルスが本明細書に記載のように産生され、ウィルスまたはウィルス抗原が単離される。細胞を分解し、または細胞上清を採取した後、抗原を単離することにより単離し、選択的に精製するための標準的方法（例えば遠心分離またはクロマトグラフィ）を用いて、単離が実行されうる。
【0018】
さらなる実施形態においては、ウィルスが、（例えば国際公開第０５／１１８００号に示される方法に従って）精製の前または後に断片化または不活性化される。さらに、ウィルスのワクチンが調製されうる。ワクチンは、抗原物質の免疫原性組成物であり、抗原物質は、非感染性ウィルス、その外皮、粒子またはその抗原でありうる。ワクチンが投与されると、宿主（例えばヒト等の哺乳類または鳥類）における免疫化が生じる。ワクチン接種はワクチンに対する特異反応および軽微な炎症を引き起こしうるが、一般に、ワクチン接種に対する反応は、完全に成育可能なウィルスによる感染に対する反応と比較して大きく減少される。
【0019】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、それらは単に例示であり、本発明をいかなる形でも制限するものではない。
【実施例】
【0020】
多くのウィルス膜タンパク質は、複製能のあるウィルスを産生するために、翻訳後修飾を必要とする。インフルエンザウィルスにおいては、ＨＡ２のアミノ末端領域で融合ドメインを生成する、前駆体ヘマグルチニン（ＨＡ）分子（ＨＡ０）のＨＡ１およびＨＡ２サブユニットへのタンパク質分解的切断が、細胞へのウィルスの侵入のために必須である。したがって、細胞培養における感染サイクルの開始は、プロテアーゼの添加により触媒されねばならない。ワクチン製造プロセスでは、ブタ起源のγ線を照射したトリプシンが使用される。
【0021】
ベロ細胞等の細胞培養におけるインフルエンザ増殖のための従来の温度プロフィールは、温度が例えば３３℃（Ｂ−菌種）〜３７℃（Ａ−菌種）で一定であるものである。［例えば、Ｇｏｖｏｒｋａｖａ Ｅ Ａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０，Ｎｒ．８，Ａｕｇ．１９９６，ｐ．５５１９−５５２４を参照］。本発明の態様は、１０Ｌバイオリアクターシステムにおけるスモールスケール実験による、最初の感染段階中の温度プロフィールの上昇が、インフルエンザ産生プロセスの全体的サイクル時間にプラスの効果を有しうるという認識である。さらに、ベロタンパク質／ＳＲＤ比として測定される抗原の純度に対するプラスの効果も、得られた。このコンセプトを証明するために、本明細書に記載のように、１００Ｌスケール実験が行われた。
【0022】
（実施例１）３２℃および３６℃でのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９産生
３２℃および３６℃でのバイオリアクター運転のベロ培養を、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ウィルスで感染させた。ｐＨ、ｐＯ２、細胞密度および培養に加えられるトリプシン量の設定パラメータは同等であり、インフルエンザ抗原の製造のためのラージスケール条件を反映した。ウィルス収量およびサイクル時間に対する温度上昇の効果が、表１において比較される。
【0023】
【表1】
【0024】
本産生プロセスでは、蔗糖密度勾配からウィルス抗原が採取される。したがって、３６℃実験では、抗原の一部が、低密度画分にシフトしていると結論づけられうる（図１Ｂ）。
【0025】
（実施例２）３２℃、３３℃、および３４℃でのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９産生
パナマウィルス収量およびサイクル時間に対する培養温度上昇の効果を調査するために、三つの１０Ｌバイオリアクターシステムが同時に、温度をそれぞれ３２℃、３３℃および３４℃に設定して運転された。他の全てのパラメータ設定点は、実施例１の下に記載される実験と同等だった。
【0026】
表２には、三つのバイオリアクターシステムのプロセスサイクル時間が与えられる。２０％残留酸素吸収速度（代謝性酸素消費の８０％減少）に達した後に培養が終了され、感染サイクルのキネティクスが比較された。３４℃実験では、２１時間のサイクル時間減少が達成できた。
【0027】
【表2】
【0028】
【表3】
【0029】
（実施例３）３５℃での初期ウィルス増幅を伴うＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９産生
本実施例は、インフルエンザウィルス産生プロセスの最初の２４時間の温度設定を上昇させた、培養実験に関する。ベロ細胞培養を、１００リットルスケールでＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ウィルスで感染させた。
【0030】
従来の温度プロフィール（すなわち発酵プロセス全体で３２℃の温度設定点）と、初期ウィルス増幅を３５℃とした改変プロセスとの比較が行われた。この新しいプロセスは、感染後（ｐ．ｉ．）２４時間の初期ウィルス複製を３５℃で行った後、ｐ．ｉ．９１時間まで３２℃でインキュベートすることを特徴とする。表４では、１００リットルスケール運転からの、蔗糖密度勾配精製ウィルスの、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度の比較が与えられる。
【0031】
【表4】
【0032】
（実施例４）初期ウィルス増幅を３５℃とするＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９産生
二温度プロセスにつき実施例３で観察された反応を確認するために、同じ温度プロフィールを用いて、１００リットルのベロ培養においてＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９ウィルスを増殖させた。他の全ての条件およびパラメータは、実施例３にしたがって設定された。
【0033】
表５において、１００リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）およびベロタンパク質不純度が比較される。
【0034】
【表5】
【0035】
インフルエンザウィルス抗原の純度は、インフルエンザワクチンの製造における要因である。ベロ細胞におけるインフルエンザウィルスの複製では、前駆体ヘマグルチニンの切断のためのタンパク質分解条件および適切な温度条件が、重要な要因の一部であることが一般に認められている。本明細書に提示される例示的な実験においては、ウィルス複製の初期段階の間に高い温度を有する温度プロフィールが、蔗糖密度勾配ステップで抗原の改善をもたらすことが示された。さらに、最初の２４時間を３５℃とするインフルエンザウィルスの産生は、サイクル時間に関して、より良好なプロセス性能に対応した。Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９およびＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９が、モデル系として用いられて、二温度ウィルス増殖の有用性が証明された。したがって、１０および１００リットルスケールで実行された培養実験からの結果は、ウィルス増殖プロセスの最初の約２４時間を、３２℃から３５℃に変更することによる利益を示す。
【0036】
（実施例５）初期ウィルス増幅を３５℃でｐ．ｉ．１８時間対ｐ．ｉ．３６時間行った後、ウィルス増殖終了まで３２℃とする、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５ウィルスで感染させた５０Ｌベロ培養において、抗原収量、ＳＲＤ／タンパク質比率、およびベロタンパク質／ＳＲＩ比率に対する、高温サイクル継続時間の変更による影響を示す。二つの別々の試料で、３５℃の温度を、それぞれｐ．ｉ．１８時間およびｐ．ｉ．３６時間維持した後、温度を３２℃に低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【0037】
表６において、５０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５抗原純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）およびベロ−タンパク質不純度が、比較される。
【0038】
【表6】
【0039】
（実施例６）ｐ．ｉ．１８時間の初期ウィルス増幅を異なる温度（３４℃、３５℃および３６℃）で行った後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させる（３１℃、３２℃および３３℃へ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウィルスで感染させた３２リットル〜８０リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる二重温度プロフィールの使用に関する。３４℃、３５℃および３６℃の高温をｐ．ｉ．１８時間維持した後、３１℃、３２℃および３３℃に、それぞれ３℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【0040】
表７では、３２リットル〜８０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４抗原収量、純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度が、異なる温度プロフィールにつき比較される。
【0041】
【表7】
【0042】
（実施例７）ｐ．ｉ．１８時間の初期ウィルス増幅を異なる温度（３３．５℃、３５℃および３６．５℃）で行った後、ウィルス増殖終了まで３℃低下させる（３０．５℃、３２℃および３３．５℃へ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６産生
本実施例は、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６ウィルスで感染させた３２リットル〜５０リットルベロ培養における、ウィルス増殖中の異なる温度プロフィールの使用に関する。３３．５℃、３５℃および３６．５℃の高温をｐ．ｉ．１８時間維持した後、３０．５℃、３２℃および３３．５℃に、それぞれ３℃低下させた。ウィルスを含む上清が採取され、不活性化され、超遠心分離により精製された。
【0043】
表８において、３２リットル〜５０リットルスケール運転からの蔗糖密度勾配精製ウィルスのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６抗原収量、純度（ＳＲＤ／タンパク質比率）、およびベロタンパク質不純度が比較される。
【0044】
【表8】
【0045】
（実施例８）ロスリバーウィルスの産生
ロスリバーウィルス（「ＲＲＶ」）が、２Ｌリアクターで、異なる温度で産生された。調査温度は、３０時間３７℃、３５℃、３２℃および３５℃とした後、３０時間以降はｐ．ｉ．９０時間の感染終了まで３２℃とした。動力学的パラメータが決定され、試料が以下の時間間隔で集められた（時間）Ｉ−１８、Ｉ−４２、Ｉ−４２、Ｉ−５４、Ｉ−６６、Ｉ−７６およびＩ−９０。ＮａＢｒ分析のための試料が、１．８５％の２０μＬ／ｍＬホルマリンで処置され、３７℃で４８時間インキュベートされた。感染細胞の代謝活性をモニタするために、ウィルス増殖の間に残留酸素吸収速度（ＯＵＲ）が測定された。細胞剥離率が、微粒子担体培養の顕微鏡画像により定量された。ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）も、決定された。
【0046】
条件は、ｐＨ７．１のＰＢＳおよび２０％ｐＯ２、感染前グルコース１．０ｇ／Ｌであった。Ｉ−１８で１．０ｇ／Ｌグルコースが加えられ、灌流が停止された。Ｉ−４２以降は、グルコースが１．０ｇ／Ｌ未満に減少した場合には、グルコースが加えられた。結果が表９に示される。
【0047】
遠心分離条件：Ｉ−１８： ５０００ｇＩ−４２〜Ｉ−６６： １００００ｇ
Ｉ−７８〜Ｉ−９０： １５０００ｇ
【0048】
【表9-1】
【0049】
【表9-2】
【0050】
ウェスタンブロットが、以下の抗体で実行された：（１）ＲＲ（ＡＴＣＣＶＲ３７３）、Ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ Ａｓｃｉｔｅｓ Ｆｌｕｉｄ、Ｍｏｕｓｅ；Ｎ．Ｉ．Ｈ．（１：１０００）、および（２）抗マウスＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃：Ａ−４６５６、Ｌｏｔ＃：６３Ｈ８８３０（１：５０００）。結果は、表１０のとおりに図６に与えられる。
【0051】
【表10】
【0052】
二相温度実験（Ｉ−３０まで３５℃、その後３２℃）の間だけ、開始時の速やかなウィルス増殖、および感染終了までの安定した力価が確立された。これらの条件下では、ＮａＢｒ勾配実験において、Ｉ−７８まで安定した、最大ピークが測定された。ウェスタンブロットでも、３５℃／３２℃実験において、より安定したバンドが検出された。
【0053】
（実施例９）西ナイルウィルス実験
２Ｌリアクターにおいて、異なる温度で西ナイルウィルスが産生された。調査温度は、３０時間３５℃、３２℃および３５℃とした後、３０時間以降感染終了まで３２℃とした。９０ｈの動力学的パラメータが、集められた。以下の時間的間隔で試料が集められた（時間）Ｉ−１８、Ｉ−３０、Ｉ−４２、Ｉ−４２、Ｉ−５２、Ｉ−６６、Ｉ−７４およびＩ−９０。ＮａＢｒ分析のための試料は、１．８５％の２０μＬ／ｍＬホルマリンで処置され、３７℃で４８時間インキュベートされた。条件は、ｐＨ７．１、２０％ｐＯ２、および感染前グルコース１．０ｇ／Ｌであった。Ｉ−１８で、１．０ｇ／Ｌのグルコースが加えられ、灌流が停止された。結果は表１１に与えられ、図７〜９は、ＮａＢｒプロットおよび顕微鏡画像を示す。微粒子担体培養のこれらの顕微鏡画像により、細胞剥離率が定量された。
【0054】
【表11-1】
【0055】
【表11-2】