特許 5978258 線維症をモジュレートするマイクロＲＮＡファミリー及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5978258

(24)【登録日】2016年7月29日

(45)【発行日】2016年8月24日

(54)【発明の名称】線維症をモジュレートするマイクロＲＮＡファミリー及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20160817BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20160817BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20160817BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20160817BHJP

   A61K 31/07 20060101ALI20160817BHJP

   A61K 31/375 20060101ALI20160817BHJP

   A61K 31/355 20060101ALI20160817BHJP

   A61K 31/712 20060101ALN20160817BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALN20160817BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20160817BHJP

   A61P 19/04 20060101ALN20160817BHJP

   A61P 19/08 20060101ALN20160817BHJP

   A61P 9/00 20060101ALN20160817BHJP

   A61P 9/10 20060101ALN20160817BHJP

   A61L 31/00 20060101ALN20160817BHJP

   A61K 31/337 20060101ALN20160817BHJP

   A61K 31/436 20060101ALN20160817BHJP

   A61K 31/706 20060101ALN20160817BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20160817BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20160817BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7088ZNA

   A61P17/00

   A61P17/02

   A61K9/06

   A61K31/07

   A61K31/375

   A61K31/355

   !A61K31/712

   !A61K31/7125

   !A61P43/00 121

   !A61P19/04

   !A61P19/08

   !A61P9/00

   !A61P9/10 103

   !A61L31/00 B

   !A61K31/337

   !A61K31/436

   !A61K31/706

   !A61K48/00

   !C12N15/00 G

【請求項の数】6

【外国語出願】

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2014-150540(P2014-150540)

(22)【出願日】2014年7月24日

(62)【分割の表示】特願2010-520206(P2010-520206)の分割

【原出願日】2008年7月31日

(65)【公開番号】特開2014-198728(P2014-198728A)

(43)【公開日】2014年10月23日

【審査請求日】2014年7月25日

(31)【優先権主張番号】60/952,917

(32)【優先日】2007年7月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/980,303

(32)【優先日】2007年10月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/047,014

(32)【優先日】2008年4月22日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500039463

【氏名又は名称】ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(72)【発明者】

【氏名】オルソン，エリック

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン，ローイス，エヴァ

【審査官】 深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５０５４２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５４５６１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０７０４８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Am.J.Pathol.，２００７年 ６月，Vol.170，p.1831-1840

【文献】 Pro.Natl.Acad.Sci.USA，２００６年，Vol.103，p.18255-18260

【文献】 J.Mol.Cell.Cardiol.，２００７年 ６月，Vol.42，p.1137-1141

【文献】 Science，２００７年 ４月，Vol.316，p.575-579

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

コラーゲンの喪失、欠乏、又は産生不足を特徴とする病状又は欠陥を治療するための医薬品組成物であって、
ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を備え、
前記拮抗薬が、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃ配列に相補的な配列を備えるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、
医薬品組成物。

【請求項2】

前記コラーゲンの喪失、欠乏、又は産生不足を特徴とする病状又は欠陥が、日光のダメージによる皮膚の光老化、皺、伸展裂創、又は、創傷、化学的損傷、熱損傷又は低温損傷を含む組織である、請求項１に記載の医薬品組成物。

【請求項3】

組織への注射、組織に供給する脈管構造への注射、又は局所適用薬のために処方される、請求項１に記載の医薬品組成物。

【請求項4】

前記局所適用薬が、軟膏、クリーム、ゲル、膏薬、又は香膏である、請求項３に記載の医薬品組成物。

【請求項5】

局所ビタミンＡ、局所ビタミンＣ、又はビタミンＥから選択される第２の薬剤と共に投与されるよう処方される、請求項１に記載の医薬品組成物。

【請求項6】

化学的剥離、レーザー治療、削皮術、又は皮膚擦傷法から選択される第２の治療と共に使用されるよう処方される、請求項１に記載の医薬品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２００７年７月３１日出願の米国仮出願第６０／９５２，９１７号、２００７年１０月１６日出願の米国仮出願第６０／９８０，３０３号、及び２００８年４月２２日出願の米国仮出願第６１／０４７，０１４号の利益を主張するものであり、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

【0002】

政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所（the National Institutes of Health）からの認可番号ＨＬ５３３５１−０６の下で助成支援によってなされたものである。政府は、本発明の特定の権利を有する。

【0003】

電子提出されたテキストファイルの記述
本明細書と共に電子提出されたテキストファイルの内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名: UTFD:_2021WO.txt、記録日: 2008年7月30日、ファイルサイズ５キロバイト）。

【0004】

本発明は、一般に、発生生物学及び分子生物学の分野に関する。より特定すれば、本発明は、ｍｉＲ−２９ファミリーによる、線維芽細胞における遺伝子調節及び細胞生理に関する。このｍｉＲＮＡファミリーは、コラーゲン沈着、特に線維芽細胞によって媒介されるコラーゲン沈着で、重要な役割を演ずる。

【背景技術】

【0005】

冠動脈疾患や心筋梗塞、うっ血性心不全、心臓肥大などの心疾患及びその徴候は、今日の米国において主要な健康上のリスクであることを明らかに示している。これらの疾患に罹っている患者の診断、治療、及び支援にかかるコストは、何十億ドルにもなる。心疾患の、２つの特に重篤な徴候は、心筋梗塞及び心臓肥大である。心筋梗塞は、典型的には、アテローム性動脈硬化の結果として急性血小板冠動脈閉塞が冠動脈に生じ、心筋細胞死が引き起こされる。心筋細胞、即ち心臓の筋肉細胞は最終分化し、一般に細胞分裂が不可能になるので、これらの細胞は一般に、急性心筋梗塞の過程で死んだ場合に瘢痕組織に置き換えられる。瘢痕組織は収縮を起こさず、心臓機能に寄与することができず、心収縮中に拡張することによって、あるいは心室のサイズ及び有効半径を増大させることによって、例えば肥大性になることによって、心臓機能にしばしば有害な役割を演じる。初期コラーゲン沈着は、梗塞の治癒及び心臓破裂の予防に必要とされるが、線維芽細胞によるコラーゲンの連続生成は、梗塞心臓の梗塞境界領域及び遠隔心筋で筋細胞を取り囲む間質性線維症を誘発する。この線維症は、ストレスの増大により硬直、拡張機能障害、及び心筋細胞肥大を誘発し、不整脈ももたらす可能性がある。

【0006】

心臓肥大は、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、心不整脈、内分泌障害、及び心収縮タンパク質遺伝子の遺伝変異を生じるものを含めた事実上全ての形の心疾患に対する心臓の適応反応である。肥大応答は、最初は心拍出量を増大させる補償的機構であるが、持続的肥大によって拡張型心筋症（DCM）、心不全、及び突然死をもたらす可能性がある。米国では、約５０万人が毎年心不全と診断されており、その死亡率は５０％に達する。心臓肥大の原因及び結果は、十分に文書化されてきたが、根本的な分子機構は明らかにされていない。これらの機構を理解することは、心疾患の予防及び治療における主要な課題であり、心臓肥大及び心不全を特に目標とする新しい薬物の設計の際に、治療様式として極めて重要になる。

【0007】

薬剤での治療は、心不全の徴候を低減又は無くすための、主な機構である。利尿薬は、軽度から中程度の心不全の第一線の治療を構成する。利尿薬が有効でない場合、アンギオテンシン転換酵素（ACE）阻害薬（例えば、エナロプリル及びリシノプリル）などの血管拡張薬、又は変力薬療法（即ち、心筋収縮の力を増大させることによって心拍出量を改善する薬物）を使用してもよい。残念ながら、これら標準的な療法の多くには、非常に数多くの副作用があり、一部の患者には禁忌である。このように、現在使用されている薬剤には、特定の患者集団で深刻な欠点がある。新しく安全で効果的な薬剤が利用可能であることは、現在利用可能な薬理学的様式を使用することができない、あるいはこれらの様式の十分な軽減を受けていない患者に、間違いなく利益をもたらす。

【0008】

心筋細胞は、通常、コラーゲン線維の微細な網状構造によって取り囲まれている。病的ストレスに応答して、心臓線維芽細胞及び細胞外基質タンパク質が不釣り合いにかつ過剰に蓄積される。病的な肥大の全ての形の特徴である心筋線維症は、収縮不全に寄与する機械的な硬直をもたらす（Abrahamら、2002）。病的な肥大及び心不全の別の顕著な特徴は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、及び骨格α−アクチンやβ−ミオシン重鎖（MHC）などの収縮性タンパク質の胎児アイソフォームをコードするものを含む、一組の胎児心臓遺伝子の再活性化である。これらの遺伝子は、典型的には生後抑制され、一組の成体心臓遺伝子の発現に取って代わられる（McKinsey及びOlson、2005）。胎児遺伝子発現又は心臓機能及びリモデリング（例えば、線維症）の結果は、完全に理解されていない。しかし、ストレスに応答した、β−ＭＨＣ、遅速ＡＴＰアーゼの上方制御と、α−ＭＨＣ、高速収縮ＡＴＰアーゼの下方制御とは、心臓機能の低下に関わっており（Bartel、2004）、ＢＮＰは、心臓線維症で主要な役割を演じることが知られている。

【0009】

心臓線維症に加え、様々な組織の線維症に関連したいくつかの障害又は状態がある。先天性肝線維症、常染色体劣性疾患は、肝臓と腎臓の両方に影響を及ぼすまれな遺伝的疾患である。疾患は、肝腫脹、門脈圧亢進症、及び肝臓の表面及び内部に拡がる線維様結合組織（肝線維症）など、肝臓の異常を特徴とする。肺線維症、又は肺の瘢痕化は、正常肺気嚢が線維化組織に徐々に置き換えられることから生ずる。瘢痕が形成される場合、組織はより厚くなり、酸素を血流内に移動させるという組織の能力に、不可逆的な喪失を引き起こす。最も新しい考え方は、肺組織での線維化プロセスが、肺に対する顕微鏡下の損傷との反応（遺伝的特徴により罹りやすい。）。正確な原因はわからないままであるが、吸入環境及び職業的汚染物質、喫煙、強皮症や関節リウマチ、ループス、サルコイドーシスなどの疾患、ある投薬法、及び放射線治療との関連付けがなされている。

【0010】

強皮症は、皮膚又はその他の器官での、コラーゲンの過剰な沈着を特徴とする慢性疾患である。局所型の疾患は、機能がなくなるが、致命的になるわけではない。一般的なタイプの疾患である全身型又は全身性硬化症は、心臓、腎臓、肺、又は腸の損傷の結果、致命的になる可能性がある。強皮症は、皮膚に影響を及ぼし、より重篤な場合には、血管及び内部器官に影響を及ぼす可能性がある。

【0011】

骨格筋線維症は、罹患又は損傷した筋肉に頻繁に生じる現象である。この現象は、通常は損傷から回復しようとする身体の試みから生じる、線維性組織の過剰な増殖を特徴とする。線維症は、筋機能を損ない、衰弱を引き起こす。筋機能の喪失の程度は、一般に、線維症の程度と共に増大する。筋ジストロフィー、特にベッカー型筋ジストロフィー（BMD）、及びより重篤な浸透性の対立形質の顕在化であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）の犠牲者は、疾患が進行するにつれて、増大する骨格筋線維症に頻繁に罹患する。脱神経萎縮などのその他の苦痛は、急性多発性神経炎、灰白脊髄炎、ウェルディッヒ／ホフマン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、及び進行性眼球萎縮疾患などの神経筋疾患と同様に、骨格筋線維症をもたらすことが知られている。

【0012】

マイクロＲＮＡは、最近、とりわけ発生タイミング、アポトーシス、脂肪代謝、及び造血性細胞分化の調節を含めたいくつかの生物学的プロセスに関係している。マイクロＲＮＡ（miRs）は、個々のｍｉＲＮＡ遺伝子から、又はタンパク質コーディング遺伝子のイントロンから、又は多数の緊密に関連したｍｉＲＮＡをしばしばコードするポリシストロン転写物から得られる長さ約１８〜約２５ヌクレオチドの小さな非タンパク質コーディングＲＮＡである。Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００３）の概説を参照されたい。ｍｉＲは、その配列が完全に相補的である場合はその分解を促進させることによって、又はその配列がミスマッチを含有する場合は翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして働く。

【0013】

ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（pol II）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（pol III; Qiら、（2006）Cellular & Molecular Immunology Vol.3: 411-419参照）によって転写され、初期転写物から発生し、一般に数千塩基の長さである１次ｍｉＲＮＡ転写物（pri-miRNA）で終わる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮアーゼＤｒｏｃｈａによって、核内で、約７０〜約１００ヌクレオチドヘアピン形前駆体（pre-meRNA）に処理される。細胞質に輸送した後、ヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをさらにＤｉｃｅｒで処理して、二本鎖ｍｉＲＮＡを生成する。次いで成熟ｍｉＲＮＡ鎖をＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（RISC）に組み込み、その標的ｍＲＮＡに、塩基対相補性によって結合させる。ｍｉＲＮＡ塩基がｍＲＮＡ標的と完全に対になる比較的まれなケースでは、ｍＲＮＡ分解が促進される。より一般的には、ｍｉＲＮＡは、不完全なヘテロ二本鎖を標的ｍＲＮＡと形成し、ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼし、あるいはｍＲＮＡの翻訳を阻害する。

【0014】

「シード」領域で終わる、塩基２〜８個に跨るｍｉＲＮＡの５’部分は、標的認識のため特に重要である（Krenz及びRobbins、2004; Kiriazis及びKranias, 2000）。シードの配列は、標的配列の系統発生的保存と共に、多くの現行の標的予測モデルの基礎を形成する。ｍｉＲＮＡ及びその標的を予測するための、増えつつある最先端のコンピュータ的アプローチが利用可能になっているが、標的の予測は、依然として主な課題であり実験検証を必要とする。ｍｉＲＮＡの機能が特定のｍＲＮＡ標的の調節にあると見ることは、ｍｉＲＮＡが何百もの潜在的な高及び低親和性ｍＲＮＡ標的と塩基対を形成することができること、及び複数のｍｉＲＮＡが個々のｍＲＮＡを標的とすることによって、さらに複雑になる。ｍｉＲＮＡの機能に関する理解を高めることによって、正常な発生、分化、細胞間及び細胞内通信、細胞周期、血管新生、アポトーシス、及び多くのその他の細胞過程に寄与する調節ネットワークが、間違いなく明らかにされよう。最近、本発明者らは、α−ミオシン重鎖（MHC）遺伝子のイントロンによってコードされ、かつ心臓ストレスに応答するβ−ＭＨＣ発現の上方制御及び心臓の速骨格筋遺伝子の抑制に必要とされる、心臓特異的マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２０８について報告した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている同時係属出願ＷＯ２００８／０１６９２４参照）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は、心臓ならびに他の組織におけるマイクロＲＮＡの関与について詳述する。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明は、ストレスに応答して心臓で下方制御されるｍｉＲ−２９ファミリーが、コラーゲンの沈着及び心臓線維症を含めた線維症の発症を調節するという発見に基づく。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現又は機能の上方制御は、コラーゲン及びフィブリン遺伝子の発現の低下をもたらし、心臓線維症を軽減させる。したがって本発明は、心臓線維症、心臓肥大、又は心不全を有する対象を特定する工程と、前記対象にｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現又は機能の作動薬を投与する工程とを含む、その必要がある対象の心臓線維症、心臓肥大、又は心不全を治療する方法を提供する。一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、又はこれらの組合せの成熟配列を含むポリヌクレオチドである。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、非経口投与（例えば、静脈内又は皮下）、経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、カテーテル、又は舌下投与によって投与してもよい。別の実施形態では、この方法はさらに、対象に第２の治療薬を投与する工程を含む。第２の治療薬は、β遮断薬、イオノトロープ、利尿薬、ＡＣＥ−Ｉ、ＡＩＩ拮抗薬、ＢＮＰ、Ｃａ^＋＋遮断薬、エンドセリン受容体拮抗薬、及びＨＤＡＣ阻害薬からなる群から選択される。

【0017】

本発明は、病的な心臓肥大又は心不全を発症する危険性がある対象を特定する工程と、前記対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程とを含む、その必要がある対象の病的な肥大又は心不全を予防する方法も提供する。一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬又はｍｉＲ−２９ａ〜ｃをコードする発現ベクターを、心臓細胞に送達する工程を含む。別の実施形態では、危険性がある対象は、長期にわたって管理されていない高血圧、矯正されていない弁膜症、慢性アンギナ、最近の心筋梗塞、心疾患に対する先天的素因、及び病的な肥大からなる群から選択された１つ又は複数の危険因子を示す。別の実施形態では、危険性がある対象は、心臓肥大に対して遺伝的素因を有すると診断した。さらに別の実施形態では、危険性がある対象は、心臓肥大の家族歴を有する。

【0018】

本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その細胞が、機能性ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ２９ｂ、及び／又はｍｉＲ２９ｃを発現できない哺乳類も包含する。別の実施形態では、本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その細胞が、前記非ヒト哺乳類の細胞で活性な異種プロモーターの制御下でｍｉＲ−２９ａ〜ｃコード領域を含んでいる哺乳類を提供する。トランスジェニック哺乳類は、マウスであってもよい。

【0019】

一実施形態では、本発明は、前記対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、その必要がある対象の心筋梗塞を治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、その必要がある対象の心臓肥大及び拡張型心筋症を予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、その必要がある対象の心臓肥大の進行を阻害する方法を提供する。

【0020】

本発明は、線維症の危険性を有する、あるいはその危険性がある対象を特定する工程と、対象の骨格筋又は線維芽細胞でｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現及び／又は活性を増大させる工程とを含む、対象の組織線維症を治療又は予防する方法も企図する。組織線維症は、心臓線維症、強皮症、骨格筋線維症、肝線維症、腎臓線維症、肺線維症、又は糖尿病性線維症であってもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現及び／又は活性を増大させる工程は、対象にｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬を投与する工程を含む。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃ配列の配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃをコードする発現ベクターであってもよい。一実施形態では、この方法はさらに、非ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ抗線維化治療薬を対象の投与する工程を含む。

【0021】

本発明は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃのモジュレーターを特定するための方法であって、細胞を候補化合物に接触させる工程と、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの活性又は発現を評価する工程と、工程（ｂ）での活性又は発現を、候補化合物が存在しない状態でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの活性又は発現と比較する工程とを含み、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃについて測定された活性又は発現の間の差から、候補化合物がｍｉＲ−２９のモジュレーターであることが示される方法も提供する。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで候補化合物に接触させてもよい。適切な候補化合物には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子が含まれる。

【0022】

本発明は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬又は拮抗薬を含む、医薬品組成物も包含する。いくつかの実施形態では、医薬品組成物は、注射又は局所投与用に処方してもよい。局所投与用の製剤は、ゲル、クリーム、ローション、又は軟膏であってもよい。

【0023】

本発明は、組織をｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬に接触させる工程を含む、前記組織でコラーゲン沈着を誘発させる方法を提供する。拮抗薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃの拮抗薬であってもよい。拮抗薬は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃのアンタゴｍｉｒ、成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列と同一の配列を含む、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの阻害ＲＮＡ分子、又はリボザイム、又は別の阻害核酸であってもよい。一実施形態では、この方法はさらに、前記組織を第２の薬剤に接触させる工程を含む。第２の薬剤は、局所ビタミンＡ、局所ビタミンＣ、又はビタミンＥであってもよい。別の実施形態では、この方法はさらに、前記組織を、化学薬品による剥離やレーザー治療、削皮術、皮膚擦傷法などの第２の処理にかける工程を含む。別の実施形態では、組織は、エーラー−ダンロス症候群又はビタミンＣ欠乏に罹っている対象にある。

【0024】

本発明は、これらの図面の１つ又は複数を、本明細書に提示する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解できる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ｍｉＲ−２０８が、α−ＭＨＣ遺伝子によりコードされ、心臓において特異的に発現されることを示した図である。（図１Ａ）ＭｉＲ−２０８は、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内にコードされる。星印は、配列保存を示す（配列番号１〜５）。（図１Ｂ）成体マウス組織のノーザン分析よるｍｉＲ−２０８の転写産物の検出。Ｕ６ｍＲＮＡは、ローディングコントロールとしての役目を果たす。

【図2A】α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣの制御を示す図である。甲状腺ホルモン及びＴＲＥによる、クラススイッチの制御。

【図2B】α−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣの制御を示す図である。速から遅への筋線維収縮性スイッチにおけるストレス／甲状腺機能低下のモデル。

【図3】ヒトの心臓におけるｍｉＲ−２０８の検出を示す図である。α−ＭＨＣ及びｍｉＲ−２０８の転写産物を、６匹の正常個体及び６匹の特発性心筋症の個体に由来する心臓組織のノーザンブロットにより検出した。α−ＭＨＣ及びｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８の発現レベルの間には、密接な相関があり、一方、成熟ｍｉＲ−２０８の発現は、後者が下方制御された後も維持されている。

【図4】ｍｉＲ−２０８突然変異マウスの作製を示す図である。（図４Ａ）相同的組換えによるｍｉＲ−２０８突然変異マウスを作製するための戦略。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（ほとんどの転写物で、マウスα−ＭＨＣ遺伝子のイントロン２９内に位置する。）を、ｌｏｘＰ部位によって挟まれたネオマイシン耐性カセットに代えた。ネオマイシンカセットを、ヘテロ接合マウスとＣＡＧ−Ｃｒｅトランス遺伝子を包含する遺伝子導入マウスとを交配させることにより、マウスの生殖細胞系列において除去した。（図４Ｂ）野生型及びｍｉＲ−２０８突然変異マウスに由来する心臓のノーザン分析によるｍｉＲ−２０８の転写産物の検出。

【図5】表示の遺伝子型の新生仔マウスの心臓におけるα−ＭＨＣ及びβ−ＭＨＣのタンパク質レベルのウェスタン分析を示す図である。各遺伝子型の２匹のマウスを分析した。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして検出した。

【図6】ＭｉＲ−２０８^−／−マウスは、圧負荷に応答して心臓肥大の減少を示す。野生型及びＭｉＲ−２０８^−／−マウスの心臓の組織切片を、マッソントリクロームで染色した。ｍｉＲ−２０８の不在により、胸部大動脈瘤絞扼術（TAB）に２１日間供された野生型マウスに見られた肥大及び線維症が減少する。スケールバーは、上のパネルにおいて２ｍｍに等しく、下のパネルにおいて２０μｍに等しい。

【図7】ＭｉＲ−２０８^−／−マウスは、カルシニューリンの活性化に応答して心臓肥大の減少を示す。カルシニューリントランス遺伝子（CnA-Tg）を発現する６週齢のマウスの心臓及びＭｉＲ−２０８^−／−；ＣｎＡ−Ｔｇマウスの心臓の組織切片を、マッソントリクロームで染色した。ｍｉＲ−２０８の不在により、ＣｎＡ−Ｔｇマウスに見られた肥大及び線維症が減少する。スケールバーは、上のパネルにおいて２ｍｍに等しく、下のパネルにおいて２０μｍに等しい。

【図8】ＭｉＲ−２０８^−／−マウスが、ＴＡＢ及びカルシニューリンの活性化に応答して、β−ＭＨＣの上方制御に失敗したことを示す図である。

【図9】成体野生型及びｍｉＲ−２０８遺伝子導入マウスにおける、α−及びβ−ＭＨＣタンパク質レベルのウェスタン分析を示す図である。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして検出した。

【図10】ＭｉＲ−２０８^−／−マウスが、ＰＴＵ投与による甲状腺機能低下に応答して、β−ＭＨＣの上方制御に失敗したことを示す図である。

【図11】β−ＭＨＣ発現の調節におけるｍｉＲ−２０８の役割の概略図である。

【図12】Ｔｈｒａｐ１を介したβ−ＭＨＣ及び速骨格筋遺伝子の発現の制御におけるｍｉＲ−２０８の役割の概略図である。

【図13】心臓肥大におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの作用機構を示す図である。

【図14A】心臓肥大及びリモデリング中のｍｉＲＮＡ発現を示す図である。擬似及びＴＡＢで２１日経過後のマウスと、ＣｎＡ Ｔｇマウスからの、代表的な心臓のＨ＆Ｅ染色切片を示す図である。

【図14B】心臓肥大及びリモデリング中のｍｉＲＮＡ発現を示す図である。心臓のそれぞれのタイプで発現が変化したマイクロＲＮＡの数を示すベン図を、以下に示す。

【図14C】心臓肥大及びリモデリング中のｍｉＲＮＡ発現を示す図である。肥大中に発現が変化するマイクロＲＮＡのノーザンブロットである。Ｕ６ＲＮＡを、負荷対照として検出した。

【図15】ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現が、心臓ストレスに応答して下方制御されることを示す図である。野生型マウス（WT）と、カルシニューリントランス遺伝子（CnA）またはＴＡＢによって誘発された肥大及び線維症を有するマウスからの心臓を、左側に示す。心臓のそれぞれのタイプでの、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現の相対レベルを、右側に示す。

【図16】野生型と比較したｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスからの心臓のマイクロアレイ分析を示す図である。マイクロアレイ分析は、野生型及び６週齢のｍｉＲ−２０８−ヌル心臓から単離されたｍＲＮＡで行った。ｍｉＲ−２０８の次に、最も下方制御されたｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４９９である。

【図17】ｍｉＲ−２９ファミリーが、ｍｉＲ−２０８−ヌル心臓で劇的に上方制御されることを示す図である。

【図18】ｍｉＲ−２９ファミリーが、コラーゲンをコードするｍＲＮＡと、線維症に関与する細胞外基質のその他の成分を標的とすることを示す図である。その高い配列相同性の基づき、ｍｉＲ２９ファミリーは、４つのメンバー、即ちｍｉＲ−２９ａ、ｍ２９ｂ−１及び２、及びｍｉＲ−２９ｃからなる。成熟ｍｉＲＮＡの配列を示す（配列番号１８〜２０）。ｍｉＲ−２９ｂ−１及びｍｉＲ−２９ｂ−２の成熟配列は、同一である。このファミリーは一緒に、線維症に関与する細胞外基質の多くの成分に向けられる。

【図19】ｍｉＲ−２０８及びｍｉＲ−２９ファミリーにより心臓線維症を制御するためのモデルを示す図である。正常な心臓では、ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現を阻害する。ｍｉＲ−２０８が存在しない状態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現は上方制御され、ストレスに応答する細胞外基質及び線維症の発現を予防する。ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、及びｍｉＲ−２９の機能は、相互に関連する。ｍｉＲ−２０８の喪失は、ｍｉＲ−４９９の発現を予防し、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現を上方制御することによって、心臓保護的にすることができ、その結果、線維症が妨害される。

【図20】ｍｉＲ−２９ａ〜ｃが、細胞外基質タンパク質の発現を調節することを示す図である。（図２０Ａ）鍵となる線維化遺伝子の３’ＵＴＲ領域でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関する潜在的な結合部位。（図２０Ｂ）ＭＩから３日後の、境界領域及び遠隔の両方の心筋で予測される標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析は、コラーゲン（COL1A1、COL1A2、及びCOL3A1）及びフィブリリン（FBN1）の増加に相関したｍｉＲ−２９ａ〜ｃの低下を示すが、エラスチン（ELN1）に著しい変化はなかった。（図２０Ｃ）ｍｉＲ−２９ｂ−１／ｍｉＲ−２９ａクラスターをコードする多量のＣＭＶ発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のノーザンブロット分析は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｂの効率的な過発現を示す。最上部のバンドはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに対応し、一方、より低いバンドは成熟ｍｉＲＮＡに対応する。（図２０Ｄ）予測される標的遺伝子の内因性ＵＴＲ配列を使用するルシフェラーゼ実験は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃが、多量のｍｉＲ−２９ａ〜ｃに応答したルシフェラーゼの発現を抑制することを示すが、この減少は、関連のないｍｉＲ、ｍｉＲ−２０６を使用した場合は存在しない。

【図21】ＴＧＦβに対して応答性があるｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現を示す図である。（図２１Ａ）リアルタイムＰＣＲ分析は、３種のｍｉＲ−２９ファミリーメンバー全てが、ＴＧＦβに応答して線維芽細胞が下方制御されることを示す。（図２１Ｂ）ノーザン分析は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現が、ｍｉＲ−２０８変異体動物で上方制御されることを示すが、このことは、実時時間ＰＣＲによって決定されるＢＮＰ発現の増加と同時に起こる。

【図22】ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ阻害が、ｉｎ ｖｉｖｏで線維症を誘発させることを示す図である。（図２２Ａ）抗ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ及びミスマッチ（mm）ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの化学構造。（図２２Ｂ）ノーザンブロット分析は、抗ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ又はｍｍ ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ又は同等体積の生理食塩液の、８０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射に応答した、３日後の組織特異的ノックダウンを示す。（図２２Ｃ）肝臓抽出物のリアルタイムＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃノックダウンに応答したコラーゲン発現の明らかな増大を示すが、この効果は、生理食塩液又はｍｍ注射の後には存在しなかった。（図２２Ｄ）抗ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ又はｍｍ ｍｉＲ−２９ａ〜ｃオリゴヌクレオチド又は同等体積の生理食塩液８０ｍｇ／ｋｇを２日連続して静脈内注射した３週間後の組織収集物は、心臓、肝臓、及び腎臓においてｍｉＲ−２９ａ〜ｃの重度のノックダウンを示すが、肺中のｍｉＲ−２９ａ〜ｃのレベルに影響はなかったようである。（図２２Ｅ）心臓抽出物のリアルタイムＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃノックダウンに応答した心臓コラーゲン発現の増大を示す。（図２２Ｆ）リアルタイムＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−２９ｂで模擬治療した２日後の、線維芽細胞でのｍｉＲ−２９ｂ発現の増大を示すが、ｍｉＲ−２９ａレベルは変化せず、ｍｉＲ−２９ｃレベルわずかに増加しただけである。（図２２Ｇ）線維芽細胞でのｍｉＲ−２９ｂ過発現は、リアルタイムＰＣＲ分析によって決定されるように、コラーゲン遺伝子の発現を抑制する。

【図23】ｍｉＲ−２９ｂノックダウンに応答した様々な組織でのｍｉＲ−２９ファミリーメンバーの発現を示す図である。異なる組織でのｍｉＲ−２９メンバー全てのノックダウンは、ｍｉＲ−２９ｂが、抗ｍｉＲ−２９ｂに応答して心臓で５０％減少することを示すが、ｍｉＲ−２９ａ及びｃは、わずかな変化しか示さない。しかし、抗ｍｉＲ−２９ｂに応答した肝臓及び腎臓でのｍｉＲ−２９ｂのノックダウンはほぼ完全であり、一方、ｍｉＲ−２９ａ及びｃも、抗ｍｉＲ−２９ｂに応答してこれら組織を減少させたようである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

心筋及び骨格筋は、収縮の効率を規制する、ミオシンアイソフォームの発現を調節することによって、仕事負荷、甲状腺ホルモンシグナル伝達、及び損傷などの様々な病態生理学的刺激に応答する。最近、本発明者らは、α−ミオシン重鎖（MHC）遺伝子のイントロンによってコードされ、かつ心臓ストレスに応答したβ−ＭＨＣ発現の上方制御及び心臓の速骨格筋遺伝子の抑制に必要とされる、心臓特異的マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２０８について報告した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている同時係属出願ＷＯ２００８／０１６９２４参照）。

【0027】

ここで本発明者らは、その初期の研究を拡大し、ｍｉＲ−２０８が、関連あるｍｉＲＮＡのファミリー、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃを下方制御することも示す。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃは、遍在的に発現するので、またコラーゲン沈着の調節に関与するので、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現を上方制御する戦略は、心臓線維症、並びに骨格筋、肝臓、肺、糖尿病性、及び腎臓線維症を含めた様々な組織線維症の予防に適用される。心臓線維芽細胞などの心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの調節は、対象の心臓肥大又は心不全を治療又は予防するのに使用することができる。このように、本発明の一態様は、任意選択によりｍｉＲ−２０８の阻害と併せたｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性のアゴニズムである。アゴニズムでは、外因性ｍｉＲ−２９ａ〜ｃを、裸の核酸又は脂質／リポソーム／ナノ粒子などの送達ビヒクルを使用して直接、又は遺伝子発現を通して、例えばアデノウイルスベクター又は線維症を低減させる異所発現のその他の手段を使用することによって、心臓又はその他の問題の組織に導入してもよい。医薬品「小分子」を通したｍｉＲ−２９ａ〜ｃの抗線維化機能の活性化も、そのような化合物を特定するためのスクリーニングと同様に企図される。

【0028】

ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現の抑制の後、例えば心筋梗塞（MI）及びその他のストレス形態の後に続くコラーゲンの増加は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの別の役割を示すことができる。本発明者らの研究の１つの焦点は心臓線維症であり、鍵となる調節遺伝子のサブセット、即ちコラーゲンＩ、ＩＩＩ、エラスチン、よびフィブリリンの検査は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ下流制御に応答してコラーゲン及びフィブリリンの両方で著しい増加を示したが、エラスチンに増加はなかった。したがって、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃを治療上抑制してコラーゲン沈着を増大させることは、化粧品の用途や瘢痕など、コラーゲンの喪失を特徴とする状態に対処するための独自の選択肢である。

【0029】

マイクロＲＮＡ２９（miR-29）は、４つの知られているメンバー、ｍｉＲ−２９ａ、ｂ１、及び２（同一）、及びｃからなるマイクロＲＮＡのファミリーである。ｍｉＲ２９ｂ−１及び２９ａは、ヒトの染色体７及びマウスの染色体６から得られた同じ転写物から生ずるのに対し、ｍｉＲ２９ｂ−２及びｍｉＲ２９ｃを含有するｍｉＲＮＡクラスターは、両方の種の染色体１から転写される。ヒトｍｉＲ−２９ファミリーメンバーのそれぞれに関する成熟ｍｉＲＮＡ配列を、以下に列挙する。
ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ ｕａｇｃａｃｃａｕｃｕｇａａａｕｃｇｇｕｕａ
（配列番号１８）
ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１及びｂ−２ ｕａｇｃａｃｃａｕｕｕｇａａａｕｃａｇｕｇｕｕ （配列番号１９）
ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ ｕａｇｃａｃｃａｕｕｕｇａａａｕｃｇｇｕｕａ
（配列番号２０）

【0030】

これらのマイクロＲＮＡは、それらの配列相同性に基づいてファミリーを形成する（Yuら; 2006）。ファミリーメンバーの間にはわずかな差しかなく、またこれらのメンバーは１００％保存されたシード領域（標的決定を定義するのを助ける）を有するので、同じｍＲＮＡ標的を目標にする傾向が強く（図１８）、これら特定の標的遺伝子の遺伝子発現を低下させる。ｍｉＲ−２９ファミリーに関する標的決定は、ｍｉＲ−２９ファミリーが、コラーゲン形成に関与する遺伝子、並びにエラスチン（ELN）やフィブリリン１（FBN1）、コラーゲンＩ型、α１及びα２（COL1A1、COL1A2）コラーゲンＩＩＩ型、α１（COL3A1）、メタロペプチダーゼ、インテグリンなどのその他の細胞外基質タンパク質を標的とすることに高い優先性を示すことを明らかにする。病的なストレスに応答して、心臓線維芽細胞及び細胞外基質タンパク質は、非比例的にかつ過剰に蓄積される。病的な肥大の全ての形の特徴である心筋線維症は、収縮不全に寄与する機械的な硬直をもたらす（Berkら、2007）。ｍｉＲ−２９ファミリーは、このリモデリングプロセス中に下方制御されるので、このファミリーは、コラーゲン沈着のモジュレーション中に活動的な役割を演じる傾向があり、それによって心臓線維症及び心臓収縮性を調節し、副次的に肥大及び病理的リモデリングを誘発する可能性がある。

【0031】

先に論じたように、ｍｉＲ−２９は、ｍｉＲ−２０８の両方のコピーに欠けているマウスの心臓で著しく上方制御されるので、ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−２９発現を調節するように見える（実施例１参照）。このように、ｍｉＲ−２０８のモジュレーションは、ｍｉＲ−２９の発現及びｍｉＲ−２９標的遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性がある。ｍｉＲ−２０８は、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内に位置するイントロンｍｉＲＮＡである。正確なイントロンの位置は、特定の種及び特異的な転写物に依存する。例えばヒトでは、ｍｉＲ−２０８が、α−ＭＨＣ遺伝子の２８番目のイントロン内にコードされ、一方マウスでは、２９番目のイントロン内にコードされる。ヒト、マウス、ラット、及びイヌに関するｍｉＲ−２０８のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡコード配列は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に示される。成熟ｍｉＲ−２０８配列は、配列番号１５に示される。α−ＭＨＣのように、ｍｉＲ−２０８は、心臓で単独に発現する（図１）。

【0032】

ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１４）
ａｃｇｇｇｃｇａｇｃ ｔｔｔｔｇｇｃｃｃｇ ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ ｇａｔｇｃｔｃａｃｇ ｔａｔａａｇａｃｇａ ｇｃａａａａａｇｃｔ ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ ａ

【0033】

マウスｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１５）
ａｃｇｇｇｔｇａｇｃ ｔｔｔｔｇｇｃｃｃｇ ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ ｇａｃｔｃｔｃａｃｇ ｔａｔａａｇａｃｇａ ｇｃａａａａａｇｃｔ ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ ａ

【0034】

ラットｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１６）
ａｃｇｇｇｔｇａｇｃ ｔｔｔｔｇｇｃｃｃｇ ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ ｇａｃｔｃｔｃａｃｇ ｔａｔａａｇａｃｇａ ｇｃａａａａａｇｃｔ ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ ａ

【0035】

イヌｐｒｅ−ｍｉＲ−２０８（配列番号１７）
ａｃｇｃａｔｇａｇｃ ｔｔｔｔｇｇｃｔｃｇ ｇｇｔｔａｔａｃｃｔ ｇａｔｇｃｔｃａｃｇ ｔａｔａａｇａｃｇａ ｇｃａａａａａｇｃｔ ｔｇｔｔｇｇｔｃａｇ ａ

【0036】

ｍｉＲＮＡ標的の確認のためにＰｉｃＴａｒアルゴリズムを使用して（Krekら、2005）、本発明者らは、甲状腺ホルモン受容体関連タンパク質１（THRAP1）がｍｉＲ−２０８に関して予測された標的であることを確認した。ヒト、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、フグ、及びゼブラフィッシュからのＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ配列を、それぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３に示す。

【0037】

ヒトＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号６）
ｕｕｃｕｕｇｃｕｕｕ ａａａｇｃａａｕｕｇ ｇｕｃｕａａａａｕａ ｕａｕｇｕａａｕｃｇ ｕｃｕｕａａｕｕａａ ａａａｇｕｕｇｃａｇ ｕａｇｇｇｕｕｇｃ
チンパンジーＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号７）
ｕｕｃｕｕｇｃｕｕｕ ａａａｇｃａａｕｕｇ ｇｕｃｕａａａａｕａ ｕａｕｇｕａａｕｃｇ ｕｃｕｕａａｕｕａａ ａａｃｇｕｕｇｃａｇ ｕａｇｇｇｕｕｇｃ
マウスＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号８）
ｕｕｃｕｕｇｃｕｕｕ ａａａｇｃａａｕｕｇ ｇｕｃｕａａａａｕａ ｕａｕｇｕａａｕｃｇ ｕｃｕｕａａｕｕａａ ａａｃｇｕｕｇｃａｇ ｕａｇｇｇｕｕｇｃ
ラットＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号９）
ｕｕｃｕｕｇｃｕｕｕ ａａａｇｃａａｕｕｇ ｇｕｃｕａａａａｕａ ｕａｕｇｕａａｕｃｇ ｕｃｕｕａａｕｕａａ ａａｃｇｕｕｇｃａｇ ｕａｇｇｇｕｕｇｃ
イヌＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号１０）
ｕｕｃｕｕｇｃｕｕｕ ａａａｇｃａａｕｕｇ ｇｕｃｕａａａａｕａ ｕａｕｇｕａａｕｃｇ ｕｃｕｕａａｕｕａａ ａａｃｇｕｕｇｃａｇ ｕａｇｇｇｕｕｇｃ
ニワトリＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号１１）
ｕｕｃｕｕｇｃｕｕｕ ａａａｇｃａａｕｕｇ ｇｕｃｕａａａａｕａ ｕａｕｇｕａａｕｃｇ ｕｃｕｕａａｕｕａａ ａａｃｇｕｕｇｃａｇ ｕａｇｇｇｕｕｇｃ
フグＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号１２）
ｕｕｃｃｕｇｃｕｕｕ ａａｇｃａａｕｕｇｇ ｕｕｇａａａａｕａｕ ａｕｇｕａｕｇｕａａ ｕｇｇｕｃｕｕａａｕ ｕａａａａａａａｃａ ａａｃｕａａｇａｃａ ａａ
ゼブラフィッシュＴＨＲＡＰ１ ３’ＵＴＲ（配列番号１３）
ｕｕｃｃｕｇｃｕｕｕ ａａａｇｃａａｕｕｇ ｇｕｃｕａａａａｕａ ｕａｕｇｕａａｕｃｇ ｕｃｕｕｃａｕｕａｃ ａａａａａｃｇａａｃ ｃａｕｃａａａｃｇ

【0038】

本発明は、心臓線維症、心臓肥大、又は心不全を有する対象を特定する工程と、ｍｉＲ−２９の発現又は機能の作動薬を対象に投与する工程とを含む、その必要がある対象の心臓線維症、心臓肥大、又は心不全を治療する方法を提供する。ｍｉＲ−２９作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃの作動薬であってもよい。

【0039】

一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０の配列を含む。別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃに関するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ、又はｐｒｉ−ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、ロックト核酸やペプチド核酸などの１つ又は複数の化学修飾、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）や２’−フルオロ及び４’チオ修飾などの糖修飾と、１つ又は複数のホスホロチオエート、モルホリノ、又はホスホノカルボキシレート結合などの主鎖修飾を含有してもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列を含むポリヌクレオチドがコレステロールに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの機能を増大させ、補い、又は置換するよう作用するｍｉＲ−２９ａ〜ｃとは異なる薬剤であってもよい。

【0040】

別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬は、ベクターからｉｎ ｖｉｖｏで発現してもよい。「ベクター」は、問題の核酸を細胞の内部に送達するのに使用することができる組成物である。限定するものではないが直鎖型ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に結合したポリヌクレオチド、プラスミド、又はウイルスを含めた数多くのベクターが、当技術分野では知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自己複製プラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例には、限定するものではないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターなどが含まれる。発現構造は、生細胞内で複製することができるし、あるいは合成によって作製することができる。本出願の目的で、「発現構造」、「発現ベクター」、及び「ベクター」という用語は、一般的な例示の意味で本発明の適用を実証するために同義に使用され、本発明を限定するものではない。

【0041】

一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃを発現させるための発現ベクターは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、又はこれらの組合せをコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結された」プロモーターを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−２９ｂ−１／ｍｉＲ−２９ａクラスターをコードしてもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−２９ｂ−２／ｍｉＲ−２９ｃクラスターをコードしてもよい。本明細書で使用される「作動可能に連結された」又は「転写制御下」という文言は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現が制御されるように、プロモーターが、ポリヌクレオチドに対して正しい位置及び向きにあることを意味する。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃをコードするポリヌクレオチドは、１次マイクロＲＮＡ−２９ａ〜ｃ配列（prｉ-mｉR-29a〜c）、前駆体マイクロＲＮＡ−２９ａ〜ｃ配列（pre-mｉR-229a〜c）、又は成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列をコードしてもよい。別の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、配列番号１８の配列を含むポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、配列番号１９の配列を含むポリヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは配列番号２０の配列を含む。配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の配列を含むポリヌクレオチドは、長さ約１８〜約２０００ヌクレオチド、長さ約７０〜約２００ヌクレオチド、長さ約２０〜約５０ヌクレオチド、又は長さ約１８〜約２５ヌクレオチドであってもよい。

【0042】

本出願の全体を通して、「発現構造」という用語は、核酸コード配列の一部又は全てを転写することができる遺伝子産物をコードする核酸を含有する、任意のタイプの遺伝子構造を含むことを意味する。一般的に、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構、又は導入された合成機構によって認識された、ＤＮＡ配列を指す。

【0043】

プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼの開始部位の周りにクラスター形成された転写制御モジュールの群を指すため、本明細書で使用されることになる。プロモーターをどのように組織化するかに関する考えの多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（tk）及びＳＶ４０早期転写単位に関するものを含めたいくつかのウイルスプロモーターの分析から得られる。より最近の研究によって増強されたこれらの研究は、プロモーターが、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなりかつ転写アクチベーター又はリプレッサータンパク質用の１つ又は複数の認識部位を含有している、個別の機能的モジュールからなることを示した。

【0044】

各プロモーター内の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成の開始部位を位置付けるよう機能する。この最も良く知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳類末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターやＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスが不十分ないくつかのプロモーターでは、開始部位そのものの上にある個別のエレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。

【0045】

追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位から３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが最近示された。プロモーターエレメント同士の間隔はしばしば柔軟性があり、したがってプロモーター機能は、これらエレメントが互いに反転又は移動したときに保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント同士の間隔を、活性が低下する前に５０ｂｐ引き離すことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協調的に又は独立して、転写を活性化するよう機能することができるように見える。

【0046】

その他の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復、ラットインスリンプロモーター、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、及びクリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターを使用して、問題のポリヌクレオチドの高レベルの発現を得ることができる。問題のポリヌクレオチドを発現させるための、当技術分野で周知のその他のウイルス又は哺乳類細胞もしくは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図されるが、発現レベルが所与の目的に十分であることを条件とする。

【0047】

周知の性質を有するプロモーターを用いることによって、形質移入又は形質転換後に問題のポリヌクレオチドの発現のレベル及びパターンを、最適化することができる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択によって、遺伝子産物の誘導発現を行うことができる。表１及び２は、問題の遺伝子の発現を調節するために、本発明の文脈で用いてもよいいくつかの調節エレメントを列挙する。このリストは、遺伝子発現の促進に関与する可能性があるエレメントの全てを網羅したものではなく、単にそのエレメントを例示したものである。

【0048】

エンハンサーは、ＤＮＡの同じ分子の遠位に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと同様に組織化される。即ちエンハンサーは、それぞれが１種又は複数の転写タンパク質に結合する多くの個々のエレメントからなる。

【0049】

エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は、実用可能である。エンハンサー領域は全体として、ある距離を隔てて転写を刺激することができなければならず、これは、プロモーター領域又はその成分エレメントに関して必ずしも真実である必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位及び特定の向きでＲＮＡ合成の開始を誘導する１つ又は複数のエレメントを持たなければならず、それに対してエンハンサーは、これらの特異性に欠けている。プロモーター及びエンハンサーは、しばしば重複及び近接し、しばしば非常に類似したモジュラー組織を有するように見える。

【0050】

以下は、発現構造内で問題の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用することができる、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、及び誘導性プロモーター／エンハンサーのリストである（表１及び表２）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（真核プロモーターデータベースEPDBのように）を、遺伝子発現の促進に使用することができる。真核細胞は、送達複合体の一部として、あるいは追加の遺伝子発現構造として、適切な細菌ポリメラーゼが提供された場合、ある細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。好ましい実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ又はｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬をコードするポリヌクレオチドは、線維芽細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている。

【0051】

【表1】

【0052】

【表2】

【0053】

【表3】

【0054】

ｃＤＮＡインサートを用いる場合、典型的には、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化が行われるように、ポリアデニル化シグナルを含むことが望まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を首尾良く実施するのに極めて重要とは考えられず、ヒト成長ホルモンやＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの任意のそのような配列を用いてもよい。発現カセットのエレメントとしては、ターミネーターも企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるように、かつカセットからその他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるように働くことができる。

【0055】

本発明のある実施形態では、本発明の核酸構造を含有する細胞を、発現構造にマーカーを含めることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで特定することができる。そのようなマーカーは、特定可能な変化を細胞にもたらし、発現構造を含有する細胞の容易な特定を可能にする。通常、薬物選択マーカーを含めることによって、形質転換体のクローニング及び選択が支援され、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに耐性を与える遺伝子が、有用な選択可能なマーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などの酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーを用いることもできる。用いられる選択可能なマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することが可能である限り、重要とは考えられない。選択可能なマーカーのその他の例は、当業者に周知である。

【0056】

発現ベクターを細胞に導入することができるいくつかの方法がある。本発明のある実施形態では、発現構造が、ウイルスゲノムからのウイルス又は設計製作された構造を含む。あるウイルスが、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に進入し、宿主細胞と一体化し、ウイルス遺伝子を安定にかつ効率的に発現する能力によって、このウイルスは、外来遺伝子が哺乳類細胞に移動するのに魅力的な候補になった（Ridgeway、1988; Nicolas及びRubenstein、1988; Baichwal及びSugden、1986; Temin、1986）。

【0057】

ｉｎ ｖｉｖｏ送達に好ましい方法の１つでは、アデノウイルス発現ベクターを使用する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構造のパッケージングを支援し、（ｂ）内部でクローニングされたポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するような構造を含むことを意味する。発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子組換え形態を含む。アデノウイルス、３６ｋＢ直鎖型二本鎖ＤＮＡウイルスの遺伝子構成の知識により、アデノウイルスＤＮＡの大部分を７ｋＢまでの外来配列で置換することが可能である（Grunhaus及びHorwitz、1992）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体の組込みをもたらさないが、それはアデノウイルスＤＮＡが、潜在的な遺伝毒性無しでエピソーム的手法により複製できるからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、広範な増幅後にゲノム再配列が検出されなかった。アデノウイルスは、その細胞周期段階とは無関係に、事実上全ての上皮細胞に感染することができる。

【0058】

アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作のしやすさ、高い力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染性により、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なｃｉｓエレメントである１００〜２００塩基対逆方向反復（ITR）を含有する。

【0059】

アデノウイルスベクターが複製欠損であるか、あるいは少なくとも条件付き欠損であるという要件以外、アデノウイルスベクターの性質は、本発明を首尾良く実施するのに極めて重要とは考えられない。アデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型又はサブグループＡ〜Ｆのいずれかであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明で使用される条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための、好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス５型が、多量の生化学及び遺伝情報について知られているヒトアデノウイルスであるからであり、ベクターとしてアデノウイルスを用いるほとんどの構造で歴史的に使用されてきた。

【0060】

上述のように、本発明による典型的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を持たないことになる。したがって、Ｅ１コード配列が除去される位置で、問題の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入するのに最も都合が良くなる。しかし、アデノウイルス配列内の構造の挿入位置は、本発明では重要でない。問題の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）によって記述されるように、Ｅ３置換ベクターの欠失Ｅ３領域の代わりに、ヘルパー細胞系もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完するＥ４領域で挿入されてもよい。

【0061】

アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子の発現（Levreroら、1991; Gomez-Foixら、1992）及びワクチン開発（Grunhaus及びHorwitz、1992; Graham及びPrevec、1991）で使用した。最近の動物研究では、組換えアデノウイルスを遺伝子療法に使用できることが示唆された（Stratford-Perricaudet及びPerricaudet、1991; Stratford-Perricaudetら、1990; Richら、1993）。組換えアデノウイルスを種々の組織に投与する研究は、気管注入（Rosenfeldら、1991; Rosenfeldら、1992）、筋肉注射（Ragotら、1993）、抹消静脈注射（Herz及びGerard、1993）、及び脳への定位接種（Le Gal La Salleら、1993）を含む。

【0062】

レトロウイルスベクターは、細胞内で本発明のポリヌクレオチドを発現させるのにも適している。レトロウイルスは、そのＲＮＡを、逆転写のプロセスによって感染細胞内で二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする、一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Coffin、1990）。次いで得られたＤＮＡを、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を誘導する。組込みは、受容細胞及びその後継でのウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、及びエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子の上流で見出される配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含有する。２つの長い末端反復（LTR）配列は、ウイルスゲノムの５’及び３’末端に存在する。これらの配列は、強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組込みも必要とする（Coffin、1990）。

【0063】

レトロウイルスベクターを構成するために、問題の遺伝子をコードする核酸を、あるウイルス配列の位置でウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系が構成される（Mannら、1983）。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを、この細胞系に導入する場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージすることが可能になり、次いで培地に分泌される（Nicolas及びRubenstein、1988; Temin、1986; Mannら、1983）。次いで組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、任意選択により濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、広く様々な細胞型に感染することができる。しかし、組込み及び安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskindら、1975）。

【0064】

その他のウイルスベクターは、本発明で発現構造として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988; Baichwal及びSugden、1986; Couparら、1988）アデノ随伴ウイルス（AAV）（Ridgeway、1988; Baichwal及びSugden、1986; Hermonat及びMuzycska、1984）、及びヘルペスウイルスなどウイルスから得られたベクターを使用してもよい。これらのベクターは、様々な哺乳類細胞に関していくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989; Ridgeway、1988; Baichwal及びSugden、1986; Couparら、1988; Horwichら、1990）。

【0065】

センス又はアンチセンス遺伝子構造の発現を行うために、発現構造を細胞に送達しなければならない。この送達は、細胞系を形質転換する実験室手順のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで、あるいはある疾患状態の治療のようにｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで実現してもよい。送達のための１つの機構は、ウイルス完成を介するものであり、発現構造が感染性ウイルス粒子内にカプシド形成される。

【0066】

発現構造を培養哺乳類細胞内に移動させるためのいくつかの非ウイルス的方法も、本発明によって企図される。これらの方法は、リン酸カルシウム沈殿（Graham及びVan Der Eb、1973; Chen及びOkayama、1987; Rippeら、1990）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Gopal、1985）、電気穿孔法（Tur-Kaspaら、1986; Potterら、1984）、直接微量注入（Harland and Weintraub, 1985）、ＤＮＡ−負荷リポソーム（Nicolau及びSene、1982; Fraleyら、1979）、及びリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（Fechheimerら、1987）、高速微粒子銃を使用した遺伝子照射（Yangら、1990）、及び受容体媒介性形質移入（Wu及びWu、1987; Wu及びWu, 1988）を含む。これら技法のいくつかは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用で首尾良く適応させることができる。

【0067】

発現構造が細胞内に送達されると、問題の遺伝子をコードする核酸を様々な部位に位置付け、発現させることができる。ある実施形態では、遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。この組込みは、同族組換え（遺伝子置換）を介した同種の位置及び向きであってもよく、あるいはランダムな非特異的位置に組み込んでもよい（遺伝子増加）。さらに別の実施形態では、核酸を、ＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞内で安定に維持することができる。そのような核酸セグメント又は「エピソーム」は、宿主細胞周期とは無関係に、あるいは同調して、維持及び複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構造を細胞にどのように送達するか、及び細胞内で核酸がどこに残っているかは、用いられる発現構造のタイプに依存する。

【0068】

本発明のさらに別の実施形態では、発現構造は、裸の組換えＤＮＡ又はプラスミドからのみなる。この構造の移動は、細胞膜を物理的に、あるいは化学的に透過可能にする上述の方法のいずれかによって行うことができる。これは、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの移動に適用可能であるが、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用にも適用することができる。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、リン酸カルシウム沈殿物の形をとるポリオーマウイルスＤＮＡを、成体及び新生マウスの肝臓及び脾臓に首尾良く注入し、活発なウイルス複製及び急性感染を実証した。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ及びＮｅｓｈｉｆ（１９８６）も、リン酸カルシウム沈殿プラスミドの直接腹腔内注射の結果、トランスフェクトされた遺伝子が発現したことを実証した。問題の遺伝子をコードするＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで同様の手法で移動させることができ、かつ遺伝子産物を発現できることも考えられる。

【0069】

裸のＤＮＡ発現構造を細胞に移動させるための、本発明のさらに別の実施形態では、粒子衝突を行ってもよい。この方法は、ＤＮＡコーティングされた微小発射物を高速に加速させて、細胞膜を穿孔させ、死滅させることなく細胞に進入することができる能力に依存する（Kleinら、1987）。小粒子を加速させるためのいくつかの機器が、開発されてきた。そのような１つの機器は、電流を発生させるのに高電圧放電を利用し、それによって動力を供給する（Yangら、1990）。使用される微小発射物は、タングステンや金のビーズなど、生物学的に不活性な物質からなる。

【0070】

ラット及びマウスの肝臓、皮膚、及び筋組織を含めた選択された器官に、ｉｎ ｖｉｖｏで衝撃を与えた（Yangら、1990; Zeleninら、1991）。これは、銃と標的器官との間で任意の介在組織を無くすため、即ちｅｘ ｖｉｖｏ処置のため、組織又は細胞の外科的曝露を必要とし得る。この場合も、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達されてもよく、依然として本発明により組み込むことができる。

【0071】

本発明のその他の実施形態では、発現構造をリポソームに閉じ込めてもよい。リポソームは、リン脂質２重層膜及び内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。これらのリポソームは、リン脂質が過剰な水溶液に懸濁したときに自発的に形成される。脂質成分は、閉構造の形成の前に自己再配列し、水を閉じ込め、脂質２重層の間に溶質を溶解する（Ghosh及びBachhawat、1991）。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も企図される。

【0072】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、リポソーム媒介性核酸送達及び外来ＤＮＡの発現は、非常に首尾良く行われた。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養されたニワトリ胚、ＨｅＬａ及びヘパトーマ細胞での、リポソーム媒介性送達及び外来ＤＮＡの発現の実現可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内注射後にラットで首尾良く行われるリポソーム媒介性遺伝子移動を実現した。

【0073】

本発明のある実施形態では、リポソームを赤血球凝集ウイルス（HVJ）と複合させてもよい。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソーム被包ＤＮＡの細胞進入を促進させることが示された（Kanedaら、1989）。その他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合して、あるいは併せて用いることができる（Katoら、1991）。さらに別の実施形態では、リポソームを、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１と複合させて、あるいは併せて用いることができる。そのような発現構造が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで核酸の移動及び発現に首尾良く用いられた場合、これらの構造は本発明に適用可能である。細菌プロモーターをＤＮＡ構造に用いる場合、適切な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に含むことも望ましくなる。

【0074】

特定の遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達するのに用いることができる、その他の発現構造は、受容体媒介性送達ビヒクルである。これらのビヒクルは、ほぼ全ての真核細胞における受容体媒介性エンドサイトーシスによる、高分子の選択的摂取を利用する。様々な受容体の細胞型特異的分布により、送達は、非常に特異的に行うことができる（Wu及びWu、1993）。

【0075】

受容体媒介性遺伝子標的ビヒクルは、一般に、２つの成分、即ち細胞受容体特異的リガンド及びＤＮＡ結合剤からなる。いくつかのリガンドを、受容体媒介性遺伝子移動のために使用した。最も詳細にわたって特徴付けられたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ASOR）（Wu及びWu、1987）及びトランスフェリン（Wagnerら、1990）である。最近、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオグリコタンパク質を遺伝子送達ビヒクルとして使用し（Ferkolら、1993; Peralesら、1994）、表皮成長因子（EGF）も、遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するのに使用した（Myers、ＥＰＯ ０２７３０８５）。

【0076】

その他の実施形態では、送達ビヒクルは、リガンド及びリポソームを含んでもよい。例えばＮｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、リポソームに組み込まれたラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドを用い、肝細胞によるインスリン遺伝子の摂取の増加が観察された。このように、特定の遺伝子をコードする核酸を、リポソームを含む、あるいは含んでいない任意の数の受容体−リガンド系によって細胞型に特異的に送達できることは、可能性のあることである。例えば、表皮成長因子（EGF）は、ＥＧＦ受容体の上方制御を示す細胞内への核酸の媒介性送達の受容体として使用することができる。マンノースは、肝細胞にマンノース受容体を向けるのに使用することができる。また、ＣＤ５（CLL）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（T細胞白血病）、及びＭＡＡ（メラノーマ）に対する抗体を、標的部分として同様に使用することができる。

【0077】

特定の例では、オリゴヌクレオチドを陽イオン脂質と組み合わせて投与してもよい。陽イオン脂質の例には、限定するものではないがリポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＯＴＡＰが含まれる。参照により特に組み込まれるＷＯ／００７１０９６の公報は、ＤＯＴＡＰ、即ち遺伝子療法に効果的に使用することができるコレステロール又はコレステロール誘導体製剤など、種々の製剤について記述している。その他の開示は、ナノ粒子を含む種々の脂質又はリポソーム製剤と、投与方法についても論じており、これらには、限定するものではないが米国特許公開第２００３０２０３８６５号、第２００２０１５０６２６号、第２００３００３２６１５号、及び第２００４００４８７８７号が含まれ、いずれも、製剤とその他の関連する核酸の投与及び送達形態及びその他の関連する投与態様を開示する程度まで、参照により特に組み込まれているものである。粒子を形成するのに使用される方法も、それらの態様に関して参照により組み込まれている米国特許第５，８４４，１０７号、第５，８７７，３０２号、第６，００８，３３６号、第６，０７７，８３５号、第５，９７２，９０１号、第６，２００，８０１号、及び第５，９７２，９００号に開示されている。

【0078】

ある実施形態では、遺伝子移動は、ｅｘ ｖｉｖｏ条件下でより容易に行うことができる。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法は、動物から細胞を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に核酸を送達し、次いで修飾した細胞を元の動物に戻すことを指す。この療法では、動物からの組織／器官の外科的除去、又は細胞及び組織の１次培養を行う。

【0079】

本発明のいくつかの実施形態では、コラーゲン沈着が増加するように、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を阻害することが望ましい。例えば一実施形態では、本発明は、組織をｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬に接触させる工程を含む、前記組織でコラーゲン沈着を誘発する方法を提供する。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの機能の拮抗薬又は阻害薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃを対象としてもよい。

【0080】

ｍｉＲＮＡの機能は、アンタゴｍｉｒの投与によって、阻害し得る。最初にＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ及びその同業者によって、「アンタゴｍｉｒ」は、ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖の化学修飾されたリボヌクレオチドであることが記述された（Krutzfeldtら、2005）。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル−糖修飾など、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴｍｉｒは、修飾ヌクレオチドのみ含む。アンタゴｍｉｒは、部分又は完全ホスホロチオエート主鎖をもたらす１つ又は複数のホスホロチオエート結合を含んでいてもよい。ｉｎ ｖｉｖｏ送達及び安定性を促進させるため、アンタゴｍｉｒを、コレステロール部分にその３’末端で結合してもよい。ｍｉＲＮＡを阻害するのに適したアンタゴｍｉｒは、長さが約１５〜約５０ヌクレオチドであってもよく、より好ましくは長さ約１８〜約３０ヌクレオチド、最も好ましくは長さ約２０〜約２５ヌクレオチドである。「部分的に相補的」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を指す。アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であってもよい。いくつかの実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に倒して実質的に相補的であってもよく、即ち、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。その他の実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的である。

【0081】

一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬は、アンタゴｍｉｒである。アンタゴｍｉｒは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃの成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列を含んでもよい。別の実施形態では、アンタゴｍｉｒは、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０の配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列を含む。別の実施形態では、アンタゴｍｉｒは、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０に対して１００％相補的な配列を含む。

【0082】

マイクロＲＮＡ機能の阻害は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって、実現してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種又は複数の「ロックト核酸」からなるものであってもよい。「ロックト核酸」（LNA）は、リボース糖部分の２’及び４’炭素の間に余分な橋を含有することによって、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドに高い熱安定性を与える「ロックされた」構造をもたらす、修飾されたリボヌクレオチドである。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸主鎖ではなくペプチドをベースにした主鎖を含有するペプチド核酸（PNA）を含んでいてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドが含有していてもよいその他の化学修飾には、限定するものではないが、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、及び４’チオ修飾などの糖修飾と、１種又は複数のホスホロチオエート、モルホリノ、又はホスホノカルボキシレート結合などの主鎖修飾が含まれる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，６９３，１８７号及び第７，０６７，６４１号参照）。いくつかの実施形態では、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’及び３’末端の両方に２’−Ｏ−メトキシエチル−修飾リボヌクレオチドを含有し少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドが中央にある、２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」である。これらの「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮアーゼＨ依存性分解機構を引き起こすことが可能である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，８３８，２８３号に記載されるように、安定性を高め効力を改善するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドのその他の修飾は当技術分野で知られており、本発明の方法で使用するのに適している。マイクロＲＮＡの活性を阻害するのに有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約１９〜約２５ヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的であってもよく、即ち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であってもよい。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的な配列を含む。

【0083】

本発明の別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬は、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃの成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列を含んでもよい。さらに別の実施形態では、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０の配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列を含む。別の実施形態では、化学的に修飾されたアンチセンスオリグヌクレオチドは、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０に対して１００％相補的な配列を含む。

【0084】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関する前駆体ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に対して実質的に相補的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ａ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｂ、又はｐｒｅ−ｍｉＲ−２９ｃ配列のステムループ領域の外側に位置する配列に対して実質的に相補的な配列を含む。

【0085】

ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの機能を阻害するための別の手法は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及びｍｉＲ−２９ｃ配列に対して少なくとも部分的な配列同一性を有する阻害ＲＮＡ分子を投与することである。阻害ＲＮＡ分子は、ステムループ構造を含む二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ分子（shRNA）であってもよい。阻害ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に同一な配列、例えば約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、阻害ＲＮＡの二本鎖領域は、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に同一な配列を含む。「実質的に同一な」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を指す。その他の実施形態では、阻害ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、標的ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％同一性であってよい。

【0086】

一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬は、二本鎖領域を含む阻害ＲＮＡ分子であって、その二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−２９ａ（配列番号１８）、ｍｉＲ−２９ｂ（配列番号１９）、又はｍｉＲ−２９ｃ（配列番号２０）に対して１００％の同一性を有する配列を含んでいる分子である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬は、二本鎖領域を含む阻害ＲＮＡ分子であって、前記二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含んでいる分子である。

【0087】

別の実施形態では、阻害ＲＮＡ分子はリボザイムであってもよい。リボザイムは、ＲＮＡ分子のホスホジエステル結合を加水分解する触媒ＲＮＡである。リボザイムは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及びｍｉＲ−２９ｃの１つ又は複数を標的としてそれらの加水分解をもたらすように、設計することができる。

【0088】

ある実施形態では、発現ベクターを用いてｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を発現させる（例えば、アンタゴmｉr、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び阻害RNA分子）。一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を発現させるための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、発現したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃ配列に対して少なくとも部分的に相補的なものである。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの阻害薬を発現させるための発現ベクターは、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した１つ又は複数のプロモーターを含み、発現したｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はｍｉＲ−２９ｃ配列に対して同一な、部分的に同一な、又は実質的に同一な配列を含む。「部分的に同一な」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を指す。「実質的に同一な」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を指す。

【0089】

心血管障害の状況における心臓肥大の現行の医療管理は、少なくとも２つのタイプの薬物、即ちレニン−アンギオテンシン系の阻害薬及びβ−アドレナリン遮断薬の使用を含む（Bristow、1999）。心不全の状況における病的な肥大を治療する治療薬には、アンギオテンシンＩＩ変換酵素（ACE）阻害薬及びβ−アドレナリン受容体遮断薬が含まれる（Eichhorn及びBristow、1996）。心臓肥大の治療に関して開示されているその他の医薬品には、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（米国特許第５，６０４，２５１号）及び神経ペプチドＹ拮抗薬（ＷＯ９８／３３７９１）が含まれる。現在利用可能な医薬品化合物にも関わらず、心臓肥大及びその後に生ずる心不全の予防及び治療は、治療上の課題を提示し続けている。

【0090】

非薬理学的治療は、薬理学的治療の補助として、主に使用される。非薬理学的治療の一手段では、食餌に含まれるナトリウムを減少させる。さらに、非薬理学的治療では、陰性変力薬（例えば、あるカルシウムチャネル遮断薬及び抗不整脈薬、例えばジソピラミド）、心臓毒（例えば、アムフェタミン）、及び血漿増量剤（例えば、非ステロイド系抗炎症薬及びグルココルチコイド）を含めたある沈殿薬物も必然的に排除される。

【0091】

本発明は、心臓線維症、心臓肥大、又は心不全を有する対象を特定する工程と、ｍｉＲ−２９の発現又は機能の作動薬を対象に投与する工程とを含む、その必要がある対象の心臓線維症、心臓肥大、又は心不全を治療する方法を提供する。好ましくは、ｍｉＲ−２９作動薬の投与は、対象の病的な心臓線維症、肥大、又は心不全の１つ又は複数の症状の改善をもたらし、又は心臓肥大から心不全への移行を遅延させる。１つ又は複数の改善された症状は、高い運動能力、高い心臓駆出容積、低い左心室拡張末期圧、低い肺毛細血管楔入圧、高い心拍出量、高い心係数、低い肺動脈圧、低い左心室収縮末期及び拡張末期径、低下した心臓線維症、心筋での少ないコラーゲン沈着、低い左心室及び右心室壁応力、低い壁張力、高い生活の質、及び低い疾患関連罹患率又は死亡率であってもよい。さらに、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬の使用は、心臓肥大及びその関連症状が直接又は間接的に生ずることを予防することができる。

【0092】

別の実施形態では、病的な心臓肥大又は心不全を発症する危険性がある対象を特定する工程と、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程とを含む、その必要がある対象の病的な肥大又は心不全を予防する方法が提供される。心臓細胞には、心筋細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、及び心臓組織に通常見られる任意のその他の細胞型が含まれる。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃの作動薬であってもよい。危険性がある対象は、心臓線維症、ｍｉＲ−２９の低発現、長期にわたって管理されていない高血圧、矯正されていない弁膜症、慢性アンギナ、最近の心筋梗塞、心疾患に対する先天的素因、及び／又は病的な肥大を含めた、１つ又は複数の危険因子を示す可能性があり、及び／又は心臓肥大に対する遺伝的素因を有すると診断される可能性があり、心臓肥大の家族歴を有する可能性がある。

【0093】

別の実施形態では、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、その必要がある対象の心筋梗塞を治療する方法が提供される。別の実施形態では、本発明は、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、その必要がある対象の心臓肥大及び拡張型心筋症を予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、その必要がある対象の心臓肥大の進行を阻害する方法を提供する。別の実施形態は、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、心不全又は心臓肥大を有する対象の運動耐性を増大させる方法である。別の実施形態は、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、心不全又は心臓肥大を有する対象の入院期間を短縮する方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、対象の心臓細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は活性を促進させる工程を含む、心不全又は心臓肥大を有する対象の生活の質を改善し、かつ罹患率又は死亡率を低下させるための方法を提供する。

【0094】

治療計画は、臨床状況に応じて様々となる。しかし、長期にわたる維持は、ほとんどの状況で適切であると見なされる。疾患の進行中の短い期間内など断続的に、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬で肥大を治療することが望ましい可能性もある。

【0095】

さらに、ｍｉＲ−２９ファミリーは、心臓線維症の調節に関与する。このｍｉＲファミリーは、筋細胞に比べて線維芽細胞に富むので、筋細胞は、因子を、おそらくはＢＮＰを分泌し、それによって線維芽細胞中のｍｉＲ−２９ファミリーを上方制御して、心臓心筋症の発症を予防する傾向がある。この因子は、ｍｉＲ−２０８ＫＯマウスで非常に高く、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの上方制御及び線維症の抑制に相関している。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃレベルは、通常の心臓疾患では高く、おそらくはコラーゲン沈着を制限する保護作用である。このように、心臓線維症及び心臓組織でのコラーゲン沈着の抑制におけるｍｉＲ−２９ａ〜ｃ及びその作動薬の特定の使用が企図される。ｍｉＲ−２９ファミリーの活性化に相当する機構が、骨格筋線維症にも適用可能であり得る。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃは、フィブリリン１（FBN1）、コラーゲンＩ型、α１（COL1A1）、コラーゲンＩ型α２（COL1A2）、及びコラーゲンＩＩＩ型、α１（COL3A1）（実施例４参照）など、いくつかの細胞外基質遺伝子の発現を調節する。したがって本発明は、細胞内で１つ又は複数の細胞外基質遺伝子を調節する方法も提供する。

【0096】

一実施形態では、この方法は、細胞を、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬と接触させる工程を含む。別の実施形態では、この方法は、細胞を、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬と接触させる工程を含む。さらに別の実施形態では、１つ又は複数の細胞外基質遺伝子には、フィブリリン１（FBN1）、コラーゲンＩ型、α１（COL1A1）、コラーゲンＩ型α２（COL1A2）、及びコラーゲンＩＩＩ型、α１（COL3A1）が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の細胞外基質遺伝子は、細胞をｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬と接触させた後に、上方制御される。その他の実施形態では、１つ又は複数の細胞外遺伝子は、細胞をｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬と接触させた後に、下方制御される。

【0097】

本発明者らは、ＴＧＦβに曝された心臓線維芽細胞で、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現が減少することを実証したが、これは、心筋梗塞後のｍｉＲ−２９ａ〜ｃの減少が、ＴＧＦβ調節され得ることを示唆している（実施例５）。興味深いことに、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）などのナトリウム利尿ペプチドは、線維症及び筋線維芽細胞の変換に関連したＴＧＦβ調節遺伝子発現を阻害することが示された（Kapounら、2004）。これに関し、本発明者らは先に、心臓特異的ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ−２０８に欠けているマウスが心臓線維症及びリモデリングに対して耐性があり、ベースラインでＢＮＰの高い発現を示すことを報告した（van Rooijら、2007）。ＢＮＰは、ＴＧＦβの作用に拮抗することが知られているので、本発明者らは、これらマイスでの高レベルのＢＮＰがｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現を高めることができると提示する。確かに、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現の用量依存性の増加が、ＢＮＰの高い発現レベルと同時に、ｍｉＲ−２０８の除去後に観察された（実施例５）。これらのデータは、ＴＧＦβが、心筋細胞から分泌されたＢＮＰによって阻害することができる、少なくとも部分的なｍｉＲ−２９ａ〜ｃのレベルの低下を通して、線維芽細胞内でコラーゲン関連遺伝子の発現を誘発することを示す。このように本発明は、少なくとも１種のＴＧＦβ阻害薬を投与することによって、対象でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現及び／又は活性を増大させる方法を提供する。ＴＧＦβ阻害薬は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，５０９，３１８号に記載された、ＴＧＦβ活性を阻害する抗ＴＧＦβ抗体、ＴＧＦβアンチセンス分子、及び小分子を含んでもよい。ＴＧＦβ阻害薬は、対象の心臓線維症、心臓肥大、又は心不全を治療する併用療法として、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬と併せて使用してもよい。ＴＧＦβ阻害薬は、対象の組織線維症を治療又は予防するために、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬と同時投与してもよい。

【0098】

心臓の線維症を制御する際に重要な役割を演じることに加え、ｍｉＲ−２９ファミリーの遍在発現は、腎臓、肝臓、及び肺に関与するようなその他の線維症の徴候でも役割を演ずる可能性があることを示唆する。また線維症は、糖尿病で副次的に観察される。１型及び２型糖尿病の患者は、心筋症の高い危険性にある。糖尿病での心筋症は、低い拡張期コンプライアンス、間質線維症、及び菌細胞肥大を含めた一群の特徴に関連する。

【0099】

本発明は、対象の組織線維症を治療又は予防する方法も提供する。一実施形態では、この方法は、組織線維症の危険性を有する、あるいは危険性にある対象を特定する工程と、対象の骨格筋又は線維芽細胞でｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現及び／又は活性を増大させる工程とを含む。別の実施形態では、組織線維症は、心臓線維症、強皮症（局所又は全身）、骨格筋線維症、肝線維症、腎臓線維症、肺線維症、又は糖尿病線維症である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現及び／又は活性を増大させる工程は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬を対象に投与する工程を含む。その他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現及び／又は活性を増大させる工程は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃをコードする発現ベクターを対象に投与する工程を含む。別の実施形態では、この方法はさらに、非ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ線維症治療薬を対象に投与する工程を含む。

【0100】

本発明は、その必要がある対象の１つ又は複数の状態又は障害に関連した組織線維症を治療する方法を包含する。一実施形態では、この方法は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬を対象に投与する工程を含む。別の実施形態では、この方法は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃをコードする発現ベクターを、対象に投与する工程を含む。組織線維症に関連する１つ又は複数の状態又は障害には、限定するものではないが先天性肝線維症（CHF）、腎尿細管間質線維症、自己免疫障害に関連した肺線維症（例えば、リウマチ様関節炎、ループス、及びサルコイドーシス）、糖尿病性心筋症に関連した間質線維症、筋ジストロフィーに関連した骨格筋線維症（例えば、ベッカー筋ジストロフィー及びデュシェンヌ筋ジストロフィー）、除神経萎縮、及び神経筋疾患（例えば、急性多発性神経炎、小児麻痺、ウェルディヒ／ホフマン病、筋萎縮性側索硬化症、及び進行性眼球萎縮疾患）を含めてもよい。

【0101】

本発明は、コラーゲンの喪失、欠乏、又は産生不足を特徴とする病状／欠陥を治療する方法も企図する。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を使用して、コラーゲンの発現を増大させ、それによって、失われたコラーゲンの代わりにすることができるし、あるいは必要な場合に既存のコラーゲンを補うことができる。このように本発明は、組織にｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を接触させる工程を含む、前記組織でコラーゲン沈着を誘発させる方法を提供する。拮抗薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃを対象としてもよい。一実施形態では、拮抗薬は、配列番号１８に対して相補的な配列を含む。別の実施形態では、拮抗薬は、配列番号１９に対して相補的な配列を含む。別の実施形態では、拮抗薬は、配列番号２０に対して相補的な配列を含む。拮抗薬は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃのアンタゴｍｉｒ、成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列、リボザイム、又は任意のその他の阻害核酸と同一な配列を含むｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの阻害ＲＮＡ分子であってもよい。拮抗薬は、細胞又は組織への拮抗薬の進入を容易にする薬剤と結合又は接合してもよい。コラーゲン沈着の増加が有益となりかつｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を投与することによって治療することができる様々な状態及び障害には、限定するものではないがエーラー−ダンロス症候群（EDS）、ビタミンＣ欠乏症（壊血病）、皮膚の老化（例えば、自然な老化、及び日光のダメージによる光老化）、及び伸展裂創（すじ）が含まれる。

【0102】

エーラー−ダンロス症候群（EDS）は、コラーゲン合成の欠陥によって引き起こされる、ヒト及び家畜に影響を及ぼすまれな遺伝的障害の群である。個々の変異に応じて、疾患の重症度を中程度から命を脅かす程度まで様々になる可能性がある。ＡＤＡＭＴＳ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＰＬＯＤ１、及びＴＮＸＢ遺伝子の変異は、ＥＤＳを引き起こす。これら遺伝子の変異は、通常、コラーゲン又はコラーゲンと相互に作用するタンパク質の構造、生成、又は進行を変化させる。コラーゲンの欠損は、皮膚、骨、血管、及び器官の結合組織を弱める可能性があり、その結果、障害の特徴がもたらされる。このように、本発明のｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬によって誘発されるコラーゲン沈着は、ＥＤＳ患者での通常のコラーゲンレベルを補うように作用し、疾患の症状が軽減される。同様に、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬の投与は、ビタミンＣ欠乏症又は壊血病に罹っている患者に利益をもたらす。ビタミンＣ欠乏症は、ヒトで通常のコラーゲン合成に必要とされるビタミンＣの、不十分な摂取から得られる疾患である。

【0103】

ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬の投与から得られる組織でのコラーゲン沈着は、様々な化粧品の適用例で役立てることもできる。自然な老化プロセス又は日光に過度に曝されることから生ずる光損傷によってもたらされた、皮膚の老化の影響は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬をその必要がある対象に投与することによって低減することができる。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬の投与は、伸展裂創の消失を促進させることもできる。伸展裂創は、真皮の裂傷によって引き起こされる、皮膚表面の瘢痕の形である。伸展裂創は、素早い成長（思春期で一般的）又は体重増加（例えば、妊娠）に関連した、皮膚の急速な延伸の結果である。

【0104】

本発明の方法を適用してもよい組織には、額の組織、唇、頬、顎、眉、瞼、目の下、又は口の付近などの顔面の組織、手の組織、首の組織、腕の組織、足の組織、胃の組織、乳房組織が含まれる。いくつかの実施形態では、組織は、創傷、植皮、瘢痕組織、皺、弛緩した皮膚、日光による損傷、化学的損傷、熱損傷、低温損傷、及び／又は伸展裂創を含んでもよい。

【0105】

本発明の別の実施形態では、組織をｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬に接触させる工程は、前記組織への注射、前記組織を供給する脈管構造への注射、又は局所適用を含む。局所適用は、軟膏、クリーム、ゲル、膏薬、又は香膏であってもよい。別の実施形態では、この方法はさらに、圧迫包帯又はドレッシングの使用を含む。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬は、前記組織に複数回接触させてもよい。いくつかの実施形態では、拮抗薬を、前記組織に２，３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００回接触させる。その他の実施形態では、拮抗薬を、前記組織に２、３、４、５、又は６日、１、２、３、又は４週、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１カ月、又は１、２、３、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５年以上接触させる。

【0106】

さらに別の実施形態では、この方法はさらに、前記組織を第２の薬剤に接触させる工程を含む。第２の薬剤には、限定するものではないが局所ビタミンＡ、局所ビタミンＣ、又はビタミンＥを含めてもよい。別の実施形態では、この方法はさらに、前記組織に第２の治療を行う工程を含む。第２の治療は、化学的剥離、レーザー治療、削皮術、又は皮膚擦傷法を含んでもよい。別の実施形態では、組織は、エーラー−ダンロス症候群又はビタミンＣ欠乏症に罹っている対象のものである。

【0107】

本発明は、心筋梗塞を予防するために、脈管構造内の軟質プラークを線維化組織に変換する前線維化薬として、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬を使用することも企図する。軟質プラークは、動脈壁の内膜の下にある、主にコレステロールを含有する脂質の蓄積物である。最近、これらの軟質プラークは、破砕されて血栓を形成しやすくなり、動脈を通る血流を遮断して心臓麻痺（即ち、心筋梗塞）を引き起こす可能性があることが認められた。これらの軟質プラークは、見たところ予期せぬ心臓麻痺に罹る症状がない健康な対象において、しばしば責任を負うものである。軟質プラークが破砕された後、血管壁は治癒し、軟質プラークは硬質プラークになり、それがまれに、別の問題を引き起こす。このように、軟質プラークを線維化組織に変換する戦略は、軟質プラークが破砕されるのを防止し、おそらくは心筋梗塞を誘発させる可能性がある。

【0108】

上記にて詳述したように、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの阻害は、コラーゲン沈着の増加及び線維化組織の形成をもたらす。したがって本発明は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を、血管壁の１つ又は複数の軟質プラーク部位に送達する工程を含み、この軟質プラークはｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬の送達後に線維化組織に変換される、血管壁での線維化組織形成を増大させるための方法を提供する。軟質プラークは、血管内超音波法及びコンピュータ断層撮影法を含むがこれに限定するものではない、当技術分野で知られている方法によって特定することができる（Saharaら、（2004）European Heart Journal、Vol.25: 2026-2033; Budhoff（2006）J. Am. Coll. Cardiol.、Vol.48: 319-321; Hausleiterら、（2006）J. Am. Coll. Cardiol.、Vol. 48: 312-318）。本明細書に記述されるｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬のいずれかは、この方法で使用するのに適している。

【0109】

ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬は、直接注射によって、あるいは冠循環を分離するカテーテル又は機器を使用することによって、１つ又は複数の軟質プラーク部位に送達してもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬は、ステントやバルーンなどの血管手術で使用される医療機器によって、１つ又は複数の軟質プラーク部位に送達される。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬は、薬物溶出ステントを形成するために、金属ステントの面にコーティングを行ってもよい。薬物溶出ステントは、狭窄した、あるいは罹患した動脈を開いて保持し、かつ細胞増殖及び／又は炎症を予防する化合物を放出する足場である。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬は、経時的にｍｉＲ−２９ａ〜ｃを放出するために薄いポリマーに組み込まれた金属ステントに適用してもよい。治療用化合物でステントをコーティングする方法は、当技術分野で知られている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，１４４，４２２号、米国特許第７，０５５，２３７号、及びＷＯ２００４／００４６０２号を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃは、薬物溶出ステント及びバルーンに組み込むための製剤が生成されるよう、その他の抗再狭窄化合物と組み合わせて使用してもよい。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬と組み合わせて使用するのに適した化合物には、限定するものではないがパクリタキセル、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、ゾタロリムス、エベロリムス、ドセタキセル、ピメクロリムス、及びこれらの誘導体が含まれる。

【0110】

本発明は、治療後にｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬を一掃又は除去するための方法も企図する。一実施形態では、この方法は、線維芽細胞特異的プロモーターを使用した、線維芽細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関する結合部位領域の、過発現を含む。結合部位領域は、好ましくは、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関するシード領域の配列を含有する。いくつかの実施形態では、結合部位は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ１Ａ３、及び／又はＦＢＮ１など、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの１つ又は複数の標的の３’ＵＴＲからの配列を含有してもよい。別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬は、マイクロＲＮＡの機能を弱めるか、あるいは停止させるため、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬の後に投与してもよい。別の実施形態では、本発明は、治療後にｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬を一掃又は除去するための方法を提供する。この方法は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ拮抗薬が投与された線維芽細胞又はその他の組織でｍｉＲ−２０ａ〜ｃ拮抗薬の結合部位を過発現させる工程を含んでもよい。

【0111】

併用療法
別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬を、心臓肥大、心不全、及び心筋梗塞を治療するためのその他の治療様式と組み合わせて使用することが考えられる。このように、より「標準的な」医薬品による心臓療法をｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬と組み合わせて、対象に提供することもできる。その他の治療薬の例には、限定するものではないがいわゆる「β遮断薬」、抗高血圧薬、強心薬、抗血栓薬、血管拡張薬、ホルモン拮抗薬、変力薬、利尿薬、エンドセリン受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、アンギオテンシン２型拮抗薬、及びサイトカイン遮断薬／阻害薬、及びＨＤＡＣ阻害薬が含まれる。

【0112】

組合せは、心臓細胞と、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬及び標準的な薬剤を含む単一の組成物又は医薬品製剤とを接触させることによって、あるいは心臓細胞と、２種の異なる組成物又は製剤、即ち一方の組成物がｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬を含み他方が標準的な薬剤を含んでいるものとを同時に接触させることによって、実現することができる。あるいは、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬を使用する療法は、数分から数週間までに及ぶ間隔で（１種又は複数の）その他の薬剤を投与する前又は後に行ってもよい。標準的な薬剤及びｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬を別々に細胞に適用する実施形態では、一般にそれぞれの送達時と送達時との間で有効時間が確実に途切れないようになされ、したがって、薬剤及びｍｉＲ−２９ａ〜ｃ作動薬は、有利に複合された効果を依然として細胞に及ぼすことができるようになる。そのような場合、典型的には、細胞と両様式とを互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に接触させることが企図され、その遅延時間は、わずかに約１２時間であることが最も好ましい。しかしそのような状況では、治療時間を著しく延ばすことが望ましい可能性があり、その場合、それぞれの投与と投与の間で数日（2、3、4、5、6又は7）から数週間（1、2、3、4、5、6、7、又は8）が続く。

【0113】

ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬、又はその他の薬剤の、複数回投与が望まれることも考えられる。これに関し、様々な組合せを用いることができる。例示として、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬が「Ａ」であり、その他の薬剤が「Ｂ」である場合、合計で３及び４回の投与に基づけば、以下の順番が例として挙げられる。
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ
その他の組合せも同様に企図される。

【0114】

薬理学的治療薬及び投与方法、投薬量などは、当業者に周知であり（例えば、参照により関連ある部分が本明細書に組み込まれている「Physicians Desk Reference」、Klaassenの「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、及び「The Merck Index, Eleventh Edition」参照）、本明細書の開示に照らして本発明と組み合わせることができる。投薬量のいくつかの変更は、治療がなされる対象の状態に応じて必ず行われることになる。投与に関与する者は、いずれにしても、個々の対象に適した用量を決定することになり、そのような個々の決定は、当業者の範囲内である。

【0115】

本発明で使用してもよい薬理学的治療薬の非限定的な例には、抗高リポタンパク血症薬、抗動脈硬化薬、抗血栓／線維素溶解薬、血液凝固薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、昇圧薬、うっ血性心不全の治療薬、抗狭心症薬、抗菌薬、又はこれらの組合せが含まれる。

【0116】

さらに、β遮断薬を本発明の実施例では使用したが、新しい組の心臓療法標的遺伝子を開発するのに下記のいずれかを使用してもよいことに、留意すべきである（下記参照）。これら遺伝子の多くは重複し得ることが予測されるが、新しい遺伝子標的をおそらく開発することができる。

【0117】

ある実施形態では、「抗高リポタンパク血症薬」として本明細書で知られているより多くの血液脂質及び／又はリポタンパク質の１種の濃度を低下させる薬剤の投与を、特にアテローム性動脈硬化症及び血管組織の肥厚又は遮断の治療において、本発明による心臓血管療法と組み合わせることができる。ある実施形態では、抗高リポタンパク血症薬は、アリールオキシアルカン／フィブリン酸誘導体、樹脂／胆汁酸捕捉剤、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモン類似体、種々雑多な薬剤、又はこれらの組合せを含んでいてもよい。

【0118】

アリールオキシアルカン／フィブリン酸誘導体の非限定的な例には、ベクロブレート、エンザフィブレート、ビニフィブレート、シプロフィブレート、シノフィブレート、クロフィブレート（アトロミド−Ｓ）、クロフィブリン酸、エトフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル（ロビド）、ニコフィブレート、ピリフィブレート、ロニフィブレート、シムフィブレート、及びテオフィブレートが含まれる。

【0119】

樹脂／胆汁酸捕捉剤の非限定的な例には、コレスチラミン（コリバー、ケストラン）、コレスチポル（コレスチド）、及びポリデキシドが含まれる。

【0120】

ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害薬の非限定的な例には、ロバスタチン（メバコール）、プラバスタチン（プラバコール）、又はシムバスタチン（ゾコール）が含まれる。

【0121】

ニコチン酸誘導体の非限定的な例には、ニコチネート、アセピモックス、ニセリトロール、ニコクロネート、ニコモール、及びオキシニアシン酸が含まれる。

【0122】

甲状腺ホルモン及びその類似体の非限定的な例には、エトロキセート、チロプロピン酸、及びチロキシンが含まれる。

【0123】

種々雑多な抗高リポタンパク血症薬の非限定的な例には、アシフラン、アザコステロール、ベンフルオレックス、β−ベンザブチラミド、カルニチン、コンドロイチン硫酸、クロメストロン、デタキストラン、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、エリタデミン、フラザボール、メグルトール、メリナミド、ミタトリエンジオール、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、４酢酸ペンタエリスリトール、α−フェニルブチラミド、ピロザジル、プロブコール（ロレルコ）、β−シトステロール、スルトシル酸−ピペラジン塩、チアデノール、トリパラノール、及びキセンブシンが含まれる。抗動脈硬化症薬の非限定的な例には、カルバミン酸ピリジノールが含まれる。

【0124】

ある実施形態では、血栓の除去又は予防を補助する薬剤の投与を、特にアテローム動脈硬化症及び血管構造（例えば、動脈）の遮断の治療において、モジュレーターの投与と組み合わせてもよい。抗血栓薬及び／又は線維素溶解薬の非限定的な例には、抗凝血薬、抗凝血拮抗薬、抗血小板薬、血栓溶解薬、血栓溶解拮抗薬、又はこれらの組合せが含まれる。

【0125】

ある実施形態では、例えばアスピリンやワーファリン（クマジン）など、経口投与することができる抗血栓薬が好ましい。

【0126】

抗凝血薬の非限定的な例には、アセノクマロール、アンクロッド、アニシンジオン、ブロミンジオン、クロリンジオン、クメタロール、シクロクマロール、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、ビスクマ酢酸エチル、エチリデンジクマロール、フルインジオン、ヘパリン、ヒルジン、リアポレートナトリウム、オキサジジオン、多硫酸ペントサン、フェニンジオン、フェンプロクモン、ホスビチン、ピコタミド、チオクロマロール、及びワーファリンが含まれる。

【0127】

抗血小板薬の非限定的な例には、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（パーサンチン）、ヘパリン、スルフィンピラノン（アンツラン）、及びチクロピジン（チクリド）が含まれる。

【0128】

血栓溶解薬の非限定的な例には、組織プラミノゲンアクチベーター（アクチバーゼ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、ストレプトキナーゼ（ストレプターゼ）、アニストレプラーゼ／ＡＰＳＡＣ（エミナーゼ）が含まれる。

【0129】

対象が出血しているか、あるいは出血する可能性が高いある実施形態では、血液凝固を高めることができる薬剤を使用してもよい。血液凝固促進薬の非限定的な例には、血栓溶解拮抗薬及び抗凝固拮抗薬が含まれる。

【0130】

抗凝固拮抗薬の非限定的な例には、プロタミン及びビタミンＫ１が含まれる。

【0131】

血栓溶解拮抗薬の非限定的な例には、アミオカプロン酸（アミカール）及びトラネキサム酸（アムスタット）が含まれる。抗血栓薬の非限定的な例には、アナグレリド、アルガトロバン、シルスタゾール、ダルトロバン、デフィブロチド、エノキサパリン、フラキシパリン、インドブフェン、ラモパラン、オザグレル、ピコタミド、プラフィブリド、テデルパリン、チクロピジン、及びトリフルサルが含まれる。

【0132】

抗不整脈薬の非限定的な例には、クラスＩ抗不整脈薬（ナトリウムチャネル遮断薬）、クラスＩＩ抗不整脈薬（β−アドレナリン遮断薬）、クラスＩＩＩ抗不整脈薬（再分極遅延薬）、クラスＩＶ抗不整脈薬（カルシウムチャネル遮断薬）、及び種々雑多な抗不整脈薬が含まれる。

【0133】

ナトリウムチャネル遮断薬の非限定的な例には、クラスＩＡ、クラスＩＢ、及びクラスＩＣ抗不整脈薬が含まれる。クラスＩＡ抗不整脈薬の非限定的な例には、ジスピラミド（ノルペース）、プロカイナミド（プロネスチル）、及びキニジン（キニデックス）が含まれる。クラスＩＢ抗不整脈薬の非限定的な例には、リドカイン（キシロカイン）、トカイニド（トノカード）、及びメキシレチン（メキシチル）が含まれる。クラスＩＣ抗不整脈薬の非限定的な例には、エンカイニド（エンカイド）及びフレカイニド（タムボコル）が含まれる。

【0134】

通常ならβ−アドレナリン遮断薬、β−アドレナリン拮抗薬、又はクラスＩＩ抗不整脈薬として知られているβ遮断薬の非限定的な例には、アセブトロール（セクトラル）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロノール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、塩酸ブチドリン、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ブレビブロック）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ニフェナロール、ニプラジロール、オキスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール、プロパノロール（インデラル）、ソタロール（ベタペース）、スルフィナロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロール、及びキシビノロールが含まれる。ある実施形態では、β遮断薬は、アリールオキシプロパノールアミン誘導体を含む。アリールオキシプロパノールアミン誘導体の非限定的な例には、アセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オキスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、及びトリプロロールが含まれる。

【0135】

クラスＩＩＩ抗不整脈薬としても知られている再分極を引き延ばす薬剤の非限定的な例には、アミオダロン（コルダロン）及びソタロール（ベタペース）が含まれる。

【0136】

通常ならクラスＩＶ抗不整脈薬として知られているカルシウムチャネル遮断薬の非限定的な例には、アリールアルキルアミン（例えば、ベプリジル、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニルアミン、テロジリン、ベラパミル）、ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）、ピペラジン誘導体（例えば、シンナジリン、フルナリジン、リドフラジン）、又はベンシクランやエタフェノン、マグネシウム、ミベフラジル、又はペルヘキシリンなどの種々雑多なカルシウムチャネル遮断薬が含まれる。ある実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬は、長期間作用するジヒドロピリジン（ニフェジピン型）カルシウム拮抗薬を含む。

【0137】

種々雑多な抗不整脈薬の非限定的な例には、アデノシン（アデノカルド）、ジゴキシン（ラノキシン）、アセカイニド、アジュマリン、アモプロキサン、アプリンジン、トシル酸ブレチリウム、ブナフチン、ブトベンジン、カポベン酸、シフェンリン、ジソピラニド、ヒドロキニジン、インデカイニド、臭化イパトロピウム、リドカイン、ロラジュミン、ロルカイニド、メオベンチン、モリシジン、ピルメノール、プラジュマリン、プロパフェノン、ピリノリン、ポリガラクツロン酸キニジン、硫酸キニジン、及びビキジルが含まれる。

【0138】

抗不整脈薬の非限定的な例には、交感神経作動薬、α／β遮断薬、α遮断薬、抗アンギオテンシンＩＩ薬、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、血管拡張薬、及び種々雑多な抗高血圧薬が含まれる。

【0139】

α−アドレナリン遮断薬又はα−アドレナリン拮抗薬としても知られているα遮断薬の非限定的な例には、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール、ドキサゾシン、メシル酸エルゴロイド、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシン、及びヨヒムビンが含まれる。ある実施形態では、α遮断薬は、キナゾリン誘導体を含んでもよい。キナゾリン誘導体の非限定的な例には、アルフゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、及びトリマゾシンが含まれる。

【0140】

ある実施形態では、抗高血圧薬は、α及びβ両方のアドレナリン拮抗薬である。α／β遮断薬の非限定的な例には、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）が含まれる。

【0141】

抗アンギオテンシンＩＩ薬の非限定的な例には、アンギオテンシン変換酵素阻害薬及びアンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が含まれる。アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ACE阻害薬）の非限定的な例には、アラセプリル、エナラプリル（バソテック）、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル、ペリンドプリル、キナプリル、及びラミプリルが含まれる。アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、ＡＮＧ受容体遮断薬、又はＡＮＧ−ＩＩタイプ−１受容体遮断薬（ARBS）としても知られるアンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬の非限定的な例には、アンギオカンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、及びバルサルタンが含まれる。

【0142】

交感神経遮断薬の非限定的な例には、中枢に作用する交感神経遮断薬又は末梢に作用する交感神経遮断薬が含まれる。中枢神経系（CNS）交感神経遮断薬としても知られている、中枢に作用する交感神経遮断薬の非限定的な例には、クロニジン（カタプレス）、グアナベンズ（ワイテンシン）、グアンファシン（テネックス）、及びメチルドーパ（アルドメット）が含まれる。抹消に作用する交感神経遮断薬の非限定的な例には、ガングリオン遮断薬、アドレナリンニューロン遮断薬、β−アドレナリン遮断薬、又はα１−アドレナリン遮断薬が含まれる。ガングリオン遮断薬の非限定的な例には、メカミルアミン（インベルシン）及びトリメタファン（アルフォナド）が含まれる。アドレナリンニューロン遮断薬の非限定的な例には、グアネチジン（イスメリン）及びレセルピン（セルパシル）が含まれる。β−アドレナリン遮断薬の非限定的な例には、アセニトロール（セクトラル）、アテノロール（テノルミン）、ベタキソロール（ケルロン）、カルテオロール（カルトール）、ラベタロール（ノルモジン、トランデート）、メトプロロール（ロプレッサー）、ナダノール（コルガード）、ペンブトロール（レバトール）、ピンドロール（ビスケン）、プロプラノロール（インデラル）、及びチモロール（ブロカドレン）が含まれる。α１−アドレナリン遮断薬の非限定的な例には、プラゾシン（ミニプレス）、ドキサゾシン（カルデュラ）、及びテラゾシン（ヒトリン）が含まれる。

【0143】

ある実施形態では、心臓血管治療薬には、血管拡張薬（例えば、脳血管拡張薬、冠状動脈拡張薬、又は抹消血管拡張薬）を含めてもよい。ある好ましい実施形態では、血管拡張薬は、冠状動脈拡張薬を含む。冠状動脈拡張薬の非限定的な例には、アモトリフェン、ベンダゾール、ヘミコハク酸ベンフロジル、ベンジオダロン、クロラシジン、クロモナール、クロベンフロール、クロニトレート、ジラゼップ、ジピリダモール、ドロプレニルアミン、エフロキセート、エリスリチルテトラニトラン、エタフェノン、フェンジリン、フロレジル、ガングレフェン、ヘレストロールビス（β−ジエチルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、トシル酸イトラミン、ケリン、リドフラニン、マンニトールヘキサニトラン、メジバジン、ニコルグリセリン、４硝酸ペンタエリスリトール、ペントリニトロール、ペルヘキシリン、ピメフィリン、トラピジル、トリクロミル、トリメタジジン、トロルニトレートホスフェート、及びビスナジンが含まれる。

【0144】

ある実施形態では、血管拡張薬には、長期治療血管拡張薬又は高血圧緊急血管拡張薬を含めてもよい。長期治療血管拡張薬の非限定的な例には、ヒドララジン（アプレソリン）及びミノキシジル（ロニテン）が含まれる。高血圧緊急血管拡張薬の非限定的な例には、ニトロプルシド（ニプリド）、ジアゾキシド（ハイパースタットIV）、ヒドララジン（アプレソリン）、ミノキシジル（ロニテン）、及びベラパミルが含まれる。

【0145】

種々雑多な抗高血圧薬の非限定的な例には、アジュマリン、γ−アミノ酪酸、ブフェニオード、シクレタイニン、シクロシドミン、タンニン酸クリプテナミン、フェノルドパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミルアミン、メチルドーパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルギリン、ペムピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン、プロトベラトリン、ラウバシン、レシメトール、リルメニデン、サララシン、ナトリウムニトロルシシド、チクリナフェン、カンシル酸トリメタファン、チロシナーゼ、及びウラピジルが含まれる。

【0146】

ある実施形態では、抗高血圧薬は、アリールエタノールアミン誘導体、ベンゾチアジアジン誘導体、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、第４級アンモニウム化合物、レセルピン誘導体、又はスルホンアミド誘導体を含んでもよい。

【0147】

アリールエタノールアミン誘導体の非限定的な例には、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネタロール、ソタロール、及びスルフィナロールが含まれる。

【0148】

ベンゾチアジアジン誘導体の非限定的な例には、アルチジド、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド、テトラクロルメチアジド、及びトリクロルメチアジドが含まれる。

【0149】

Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の非限定的な例には、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリル、及びラミプリルが含まれる。

【0150】

ジヒドロピリジン誘導体の非限定的な例には、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、及びニトレンジピンが含まれる。

【0151】

グアニジン誘導体の非限定的な例には、ベタニジン、ベブリソキン、グアナベンズ、グアナクリン、グアナドレル、グアナゾジン、グアンチジン、グアンファシン、グアノクロール、グアノキサベンズ、及びグアノキサンが含まれる。

【0152】

ヒドラジン／フタラジンの非限定的な例には、ブドララジン、カドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン、ヒドラカルバジン、ヒドララジン、フェニプラジン、ピルドララジン、及びトドララジンが含まれる。

【0153】

イミダゾール誘導体の非限定的な例には、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラミン、チアメニジン、及びトロニジンが含まれる。

【0154】

第４級アンモニウム化合物の非限定的な例には、臭化アザメトニウム、塩化クロリソンダミン、ヘキサメトニウム、ペンタシニウムビス（メチルスルフェート）、臭化ペンタメトニウム、酒石酸ペントリニウム、塩化フェナクトロピニウム、及びメト硫酸トリメチジニウムが含まれる。

【0155】

レセルピン誘導体の非限定的な例には、ビエタセルピン、デセルピジン、レシンナミン、レセルピン、及びシロシンゴピンが含まれる。

【0156】

スルホンアミド誘導体の非限定的な例には、アムブシド、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネタゾン、トリパミド、及びキシパミドが含まれる。

【0157】

昇圧剤は、一般に、外科処置中に生じる可能性があるショック中に、血圧を上昇させるのに使用される。抗降圧薬としても知られる昇圧剤の非限定的な例には、アメジニウムメチルスルフェート、アンギオテンシンアミド、ジメトフリン、ドーパミン、エチフェルミン、エチレフリン、ゲペフリン、メタラミノール、ミドドリン、ノレピネフリン、フォレドリン、及びシネフリンが含まれる。

【0158】

うっ血性心不全を治療するための薬剤の非限定的な例には、抗アンギオテンシンＩＩ薬、後負荷−前負荷低減治療薬、利尿薬、及び変力薬が含まれる。

【0159】

ある実施形態では、アンギオテンシン拮抗薬に耐えることができない動物対象を、併用療法で治療してもよい。そのような療法は、ヒドララジン（アプレソリン）及び２硝酸イソソルビド（イソルジル、ソルビトレート）の投与を組み合わせることができる。

【0160】

利尿薬の非限定的な例には、チアジド又はベンゾチアジアジン誘導体（例えば、アルチアジド、ベンドロフルメタジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド、テトラクロロメチアジド、トリクロルメチアジド）、有機水銀化合物（例えば、クロルメロドリン、メラルリド、メルカムファミド、メルカプトメリンナトリウム、メルクマリル酸、メルクマチリンドジウム、塩化第１水銀、マーサリル）、プテリジン（例えば、フルテレン、トリアムテレン）、プリン（例えば、アセフィリン、７−モルホリノメチルテオフィリン、パモブロム、プロテオブロミン、テオブロミン）、アルドステロン拮抗薬を含むステロイド（例えば、カンレノン、オレアンドリン、スピロノラクトン）、スルホンアミド誘導体（例えば、アセタゾラミド、アムブシド、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾラミド、クロラミノフェナミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン−４，４’−ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキスゾラミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾラミド、ピレタニド、キネタゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド）、ウラシル（例えば、アミノメトラジン、アミソメトラジン）、カリウム保持性拮抗薬（例えば、アミロリド、トリアムテレン）、あるいはアミノジンやアルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルビド、マンニトール、メトカルコン、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクルナフェン、及び尿素などの種々雑多な利尿薬が含まれる。

【0161】

強心薬としても知られる陽性変力薬の非限定的な例には、アセフィリン、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ヘミコハク酸ベンフロジル、ブクラデシン、セルベロシン、カムホタミド、コンバラトキシン、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドーパミン、ドペキサミン、エノキシモン、エリスロフェレイン、フェナルコミン、ギタリン、ギトキシン、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン、イボパミン、ラナトシド、メタミバム、ミルリノン、ネリホリン、オレアンドリン、オウアバイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロシラリジン、レシブフォゲニン、シラレン、シラレニン、ストルファンチン、スルマゾール、テオブロミン、及びキサモテロールが含まれる。

【0162】

特定の実施形態では、変力薬は、強心グリコシド、β−アドレナリン作動薬、又はホスホジエステラーゼ阻害薬である。強心グリコシドの非限定的な例には、ジゴキシン（ラノキシン）及びジギトキシン（クリストジギン）が含まれる。β−アドレナリン作動薬の非限定的な例には、アルブテロール、バムブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキセテドリン、ドブタミン（ドブトレックス）、ドーパミン（イントロピン）、ドペキサミン、エフェドリン、エタフェドリン、エチルノレピネフリン、フェノテロール、ホルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキシロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール、及びキサモテロールが含まれる。ホスホジエステラーゼ阻害薬の非限定的な例には、アムリノン（イノコール）が含まれる。

【0163】

抗狭心症薬には、有機硝酸化合物、カルシウムチャネル遮断薬、β遮断薬、及びこれらの組合せを含めてもよい。

【0164】

ニトロ血管拡張薬としても知られている有機硝酸化合物の非限定的な例には、ニトログリセリン（ニトロ−ビッド、ニトロスタット）、２硝酸イソソルビド（イソルジル、ソルビトレート）、及び硝酸アミル（アスピロール、バポロール）が含まれる。

【0165】

エンドテリン（ET）は、心不全の発症に関わると考えられる強力な生理学的及び病態生理学的効果を発揮する２１アミノ酸のペプチドである。ＥＴの効果は、２種類の細胞表面受容体との相互作用を通して媒介される。Ａ型受容体（ET-A）は、血管収縮及び細胞増殖に関連しており、一方Ｂ型受容体（ET-B）は、内皮細胞媒介性血管収縮及びアルドステロンなどのその他の神経ホルモンの放出に関連している。ＥＴの生成又は関連ある細胞を刺激するその能力を阻害することができる薬剤は、当技術分野で知られている。ＥＴの生成の阻害では、その前駆体からの活性ペプチドの処理に関わる酵素末端エンドセリン変換酵素を遮断する薬剤を使用する。細胞を刺激するＥＴの能力の阻害では、ＥＴとその受容体との相互作用を遮断する薬剤を使用する。エンドセリン受容体拮抗薬（ERA）の非限定的な例には、ボセンタン、エンラセンタン、アムブリセンタン、ダルセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アボセンタン、クラゾセンタン、エドネンタン、シタクスセンタン、ＴＢＣ ３７１１、ＢＱ １２３、及びＢＱ ７８８が含まれる。

【0166】

ある実施形態では、２次的な治療薬に、例えば予防的、診断的、又は進展度診断的な、治癒及び軽減のための手術を含む、いくつかのタイプの外科処置を含めてもよい。手術、特に治癒のための手術は、本発明や１種又は複数のその他の薬剤など、その他の治療薬と併せて使用してもよい。

【0167】

血管及び心臓血管の疾患及び障害のためのそのような外科的治療薬は、当業者に周知であり、限定するものではないが器官に対して手術を行うこと、心臓血管の機械式プロテーゼを提供すること、血管形成、冠状動脈再潅流、カテーテルアブレーション、対象に対して移植可能な心臓徐細動器を提供すること、機械式循環支援、又はこれらの組合せを含めてもよい。本発明で使用してもよい機械式循環支援の非限定的な例には、大動脈内バルーン反対拍動法、左心室補助デバイス、又はこれらの組合せが含まれる。

【0168】

薬物製剤及び対象への投与経路
本発明は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬又は拮抗薬を含む、医薬品組成物も提供する。作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃをコードする核酸セグメントを含む発現ベクター、又は成熟ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ配列もしくはその有効部分を含むポリヌクレオチドであってもよい。作動薬は、脂質送達ビヒクルに含まれていてもよい。作動薬は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ又はその標的とハイブリダイズするポリヌクレオチドであってもよい。

【0169】

臨床的用途が企図される場合、医薬品組成物は、意図される用途に適した形で調製されることになる。一般に、この調製では、本質的に発熱物質が無く、それと共にヒト又は動物に有害となり得るその他の不純物が無い、組成物が調製される。

【0170】

高分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、及び水中油エマルジョンやミセル、混合ミセル、リポソームなどの脂質をベースにした系などのコロイド分散系は、マイクロＲＮＡ機能のオリゴヌクレオチド阻害薬（例えば、拮抗薬）の送達ビヒクルとして、又は特定のマイクロＲＮＡを発現する構造として、使用してもよい。本発明の核酸を心筋及び骨格筋組織に送達するの適した市販の脂肪エマルジョンには、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、及びその他同様の脂質エマルジョンが含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（即ち、人工膜ベシクル）である。そのような系の調製及び使用は、当技術分野で周知である。例示的な製剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５，９８１，５０５号、第６，２１７，９００号、第６，３８３，５１２号、第５，７８３，５６５号、第７，２０２，２２７号、第６，３７９，９６５号、第６，１２７，１７０号、第５，８３７，５３３号、第６，７４７，０１４号、及びＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。

【0171】

一般に、送達ビヒクルを安定にし、標的細胞による摂取を可能にする、適切な塩及び緩衝液を用いることが望まれる。緩衝液は、組換え細胞が対象に導入されるときにも用いられることになる。本発明の水性組成物は、医薬品として許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散させた、阻害薬であるポリヌクレオチド又はｍｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（例えば、リポソーム又はその他の複合体又は発現ベクター）又は細胞を含む、有効量の送達ビヒクルを含む。「医薬品として許容される」又は「薬理学的に許容される」という文言は、動物又はヒトに投与したときに、有害な、アレルギー性の、又はその他の不適当な反応をもたらさない分子の部分及び組成物を指す。本明細書で使用される「医薬品として許容される担体」には、ヒトへの投与に適した医薬品などの、医薬品の配合に使用するのに適切な、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌薬、等張及び吸収遅延薬などが含まれる。医薬品として活性な物質にそのような媒体及び薬剤を使用することは、当技術分野で周知である。任意の従来の培地又は薬剤が本発明の活性成分に適合しない範囲を除き、治療組成物に使用することが企図される。組成物のベクター又は細胞を不活性にしないことを条件に、追加の活性成分を組成物に組み込むこともできる。

【0172】

本発明の活性組成物は、古典的な医薬品調製物を含んでもよい。本発明によるこれら組成物の投与は、その投与経路を介して標的組織が利用可能である限り、任意の一般的な経路を介するものであってもよい。この経路には、経口、経鼻、又は経頬が含まれる。あるいは投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射によるもの、又は心組織への直接注射によるものであってもよい。ｍｉＲＮＡ拮抗薬を含む医薬品組成物又はｍｉＲＮＡ配列を含む発現構造は、カテーテルシステムによって、又は治療薬を心臓に送達するために冠状動脈循環を分離するシステムによって、投与してもよい。治療薬を心臓及び冠状血管構造に送達するための様々なカテーテルシステムは、当技術分野で知られている。本発明での使用に適したカテーテルをベースにした送達方法又は冠状動脈分離法の、いくつかの非限定的な例は、参照によりその全体が本明細書に全て組み込まれている米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６．９５３，４６６号、ＷＯ２００５／０８２４４０、ＷＯ２００６／０８９３４０、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、及び米国特許公開第２００７／００６０９０７号に開示されている。そのような組成物は、通常、上述のように医薬品として許容される組成物として投与されることになる。

【0173】

活性化合物は、非経口的に、あるいは腹腔内から投与してもよい。例示として、遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合して調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、また油中で調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止する防腐剤を含有する。

【0174】

注射での使用、あるいはカテーテル送達に適した医薬品形態には、例えば、滅菌水性溶液又は分散液と、滅菌注射液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。一般にこれら調製物は、容易に注射することができる可能性が存在する程度まで、滅菌されかつ流体である。調製物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有してもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、また分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物の動作の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどによって行うことができる。多くの場合、等張薬、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましくなる。注射組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤の組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンで使用することによって、行うことができる。

【0175】

滅菌注射液は、活性化合物を適切な量で、所望の任意のその他の成分（例えば、上記にて列挙されたもの）と共に溶媒に組み込み、その後、滅菌濾過することによって調製してもよい。一般に分散液は、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒体及び所望のその他の成分、例えば上記にて列挙されたものを含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法には、（１種又は複数の）活性成分と、任意の追加の所望の成分であって先に滅菌濾過されたその溶液からの成分との粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥技法が含まれる。

【0176】

本発明の組成物は、一般に、天然又は塩の形で配合してもよい。医薬品として許容される塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸など）由来の酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第２鉄）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、及びプロカインなど）から得ることもできる。

【0177】

配合したら、溶液は、投薬製剤に適合する手法で、かつ治療上有効になるような量で、投与することが好ましい。この製剤は、注射液や薬物放出カプセルなどの様々な剤形で、容易に投与することができる。例えば、水溶液での非経口投与では、この溶液は一般に、適切に緩衝され、液体希釈液はまず、例えば十分な生理食塩液又はグルコースで等張的にされる。そのような水溶液を、例えば静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に使用してもよい。好ましくは、滅菌水性媒体は、特に本発明の開示に照らして、当業者に知られているように用いられる。例示として、単回用量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、皮下注入流体１０００ｍｌに添加するか、あるいは提案される輸液部位で注射してもよい（例えば、「Remingon's Pharmaceutical Sciences」第15版、第1035〜1038頁及び1570〜1580頁参照）。投薬量のいくらかの変更は、治療がなされる対象の状態に応じて必ず行われることになる。投薬に責任がある者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ生物学的製剤基準室（FDA Office of Biologics standards）によって求められる滅菌性、発熱原性、全体的な安全性、及び純度の標準を満たすべきである。

【0178】

組織内のコラーゲン沈着を増大させるための化粧品製剤は、少なくとも１種のｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬を含んでもよい。拮抗薬は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、又はこれらの組合せの拮抗薬であってもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの拮抗薬は、アンタゴｍｉｒである。拮抗薬は、細胞又は組織への拮抗薬の進入を容易にする薬剤に、結合又は接合されていてもよい。そのような薬剤は、アンテナペディア、ＴＡＴ、ブホリンＩＩ、トランスポータン、モデル両親媒性ペプチド、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＳｙｎＢ５、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−１、ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール、ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール、及びポリアルギニンなどの細胞内在化トランスポーターを含んでいてもよい。薬剤は、そのアミノ又はカルボキシ末端で、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃに結合されていてもよい。一実施形態では、薬剤は、細胞への進入によって切断される配列によって、拮抗薬に結合される。そのような配列は、典型的には、当技術分野で知られているようなプロテアーゼに関するコンセンサス配列を含む。

【0179】

化粧品組成物は、ビヒクルの全てのタイプに処方することができる。適切なビヒクルの非限定的な例には、エマルジョン（例えば、油中水、水中油中水、水中油、油中水中油、シリコーン中水中油エマルジョン）、クリーム、ローション、溶液（水性及び水−アルコール性の両方）、無水塩基、（口紅やパウダーなど）、ゲル、及び軟膏、又はその他の方法、又は当業者に知られているような前述の任意の組合せが含まれる（Remington's 1990）。変形例及びその他の適切なビヒクルは、当業者に明らかにされ、本発明で使用するのに適している。ある実施形態では、成分の濃度及び組合せは、この組合せが化学的に適合するようなかつ最終生成物から沈殿する複合体を形成しないような方法で選択される。

【0180】

本明細書の全体を通して特定された芳香族皮膚活性成分及び追加の成分は、皮膚などの標的領域に送達させるために包封することができることも企図される。包封技法の非限定的な例には、そのような成分を皮膚に送達する送達ビヒクルとして使用することができる、リポソーム、ベシクル、及び／又はナノ粒子（例えば、成分が捕捉され、包封され、及び／又は吸収されるポリマー材料を含む、生分解性及び非生分解性コロイド粒子、例えば、ナノスフィア及びナノカプセルを含むもの）の使用が含まれる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，３８７，３９８号、米国特許第６，２０３，８０２号、米国特許第５，４１１，７４４号、及びKreuter 1998参照）。

【0181】

医薬品として許容される、あるいは薬理学的に許容される組成物も企図される。「医薬品として許容され」又は「薬理学的に許容され」という文言は、ヒトに投与したときにアレルギー又は同様の有害な反応をもたらさない組成物を含む。典型的には、そのような組成物は、局所組成物、液体溶液又は懸濁液として調製され、使用前には、液体に溶かした溶液又は液体に懸濁した懸濁液に適した固体形態も、調製することができる。投与経路は、治療がなされる状態の部位及び性質に応じて変えることができ、例えば、局所、吸入、皮内、経皮（transdermal）、非経口、静脈内、筋肉内、鼻内、皮下、経皮（percutaneous）、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄、直接注射と、経口投与及び処方を含む。

【0182】

本発明の組成物は、製品に組み込むことができる。製品の非限定的な例には、化粧品製品、食物ベースの製品、医薬品製品などが含まれる。単なる例として、非限定的な化粧品製品には、日焼け止め製品、サンレス皮膚タンニング製品、ヘア製品、指の爪用の製品、保湿クリーム、皮膚用クリーム及びローション、柔軟剤、デイローション、ゲル、軟膏、ファンデーション、ナイトクリーム、口紅、マスカラ、アイシャドウ、アイライナー、チークカラー、クレンザー、トナー、マスク、又はその他の知られている化粧品製品又は適用例が含まれる。さらに、化粧品製品は、つけたままの、あるいは濯ぎ落とせる製品として配合することができる。

【0183】

本発明の組成物は、追加の成分を含むことができる。追加の成分の非限定的な例には、化粧品成分（活性及び非活性の両方）及び医薬品成分（活性及び非活性の両方）が含まれる。ＣＴＦＡ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（2004）は、本発明の文脈で使用することができる、広く様々な非限定的化粧品成分について記述している。これら成分クラスの例には、香料（人工及び天然）、染料及び色素成分（例えば、Blue 1、Blue 1 Lake、Red 40、二酸化チタン、D&Cブルーno.4、D&Cグリーンno.5、D&Cオレンジno.4、D&Cレッドno.17、D&Cレッドno.33、D&Cバイオレットno.2、D&Cイエローno.10、及びD&Cイエローno.11）、吸着剤、乳化剤、安定化剤、潤滑剤、溶媒、保湿剤（皮膚軟化剤、湿潤剤、被膜形成剤、閉塞剤、及び皮膚の自然な保湿機構に影響を及ぼす薬剤を含む。）、撥水剤、ＵＶ吸収剤（パラアミノ安息香酸（「PABA」）及び対応するPABA誘導体、二酸化チタン、酸化亜鉛などの、物理的及び化学的吸収剤）、精油、ビタミン（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＫ）、微量の金属（例えば、亜鉛、カルシウム、及びセレニウム）、抗刺激薬（例えば、ステロイド及び非ステロイド系抗炎症薬）、植物抽出物（例えば、アロエ、カモミール、キュウリエキス、銀杏、朝鮮人参、及びローズマリー）、抗菌薬、抗酸化薬（例えば、BHT及びトコフェロール）、キレート剤（例えば、EDTA二ナトリウム及びEDTA四ナトリウム）、保存剤（例えば、メチルパラベン及びプロピルパラベン）、ｐＨ調節剤（例えば、水酸化ナトリウム及びクエン酸）、吸収剤（例えば、アルミニウムデンプンオクテニルスクシネート、カオリン、コーンスターチ、オートスターチ、シクロデキストリン、タルク、及びゼオライト）、皮膚の漂白及び美白剤（例えば、ヒドロキノン及びナイアシンアミドラクテート）、保湿剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコール、ソルビトール、尿素、及びマニトール）、剥脱剤（例えば、α−ヒドロキシ酸、及び乳酸やグリコール酸、サリチル酸などのβ−ヒドロキシ酸、及びこれらの塩）、防水剤（例えば、水酸化ステアリン酸マグネシウム／アルミニウム）、皮膚コンディショニング剤（例えば、アロエエキス、アラントイン、ビサボロール、セラミド、ジメチコン、ヒアルロン酸、及びグリシルリジン酸二カリウム）、増粘剤（例えば、カルボン酸ポリマー、架橋ポリアクリレートポリマー、ポリアクリルアミドポリマー、多糖、及びガムなどの組成物の粘度を増大させることができる物質）、及びシリコーン含有化合物（例えば、シリコーン油及びポリオルガノシロキサン）が含まれる。

【0184】

医薬品成分は、本発明のエマルジョン組成物で有用であることも企図される。医薬品成分の非限定的な例には、抗にきび薬、酒さの治療に使用される薬剤、鎮痛薬、麻酔薬、肛門直腸薬、抗ヒスタミン薬、非ステロイド系抗炎症薬を含めた抗炎症薬、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス、抗菌薬、抗癌薬、疥癬虫殺虫薬、殺シラミ剤、抗新生物薬、制汗剤、痒み止め、乾癬治療薬、抗脂漏薬、生物学的に活性なタンパク質及びペプチド、熱傷治療薬、焼灼薬、脱色剤、脱毛剤、おむつかぶれ治療薬、酵素、育毛刺激剤、ＤＦＭＯ及びその塩及び類似体を含めた育毛抑制剤、止血薬、角質溶解剤、アフタ性口内炎治療薬、ヘルペス治療薬、歯科及び歯周治療薬、光増感活性剤、皮膚保護剤／障壁剤、ホルモン及びコルチコステロイドを含めたステロイド、日焼け治療薬、日焼け止め、経皮活性薬鼻活性薬、膣活性薬、いぼ治療薬、創傷治療薬、創傷治癒薬などが含まれる。

【0185】

本明細書に記述される組成物のいずれかを、キットに含めてもよい。非限定的な例では、個々のｍｉＲＮＡはキットに含まれる。キットはさらに、水と、二本鎖のｍｉＲＮＡのハイブリッド形成を促進させるハイブリッド形成緩衝液とを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、標的ｍｉＲＮＡの機能を阻害するための１種又は複数のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。キットは、細胞へのｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ拮抗薬の送達を促進させる１種又は複数の形質移入試薬を含んでもよい。

【0186】

キットの構成要素は、水性媒体で、あるいは凍結乾燥形態で包装してもよい。キットの容器手段は、一般に、成分を入れることができ、好ましくは適切に一定分量を採取することができる、少なくとも１種のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその他の容器手段を含むことになる。複数の構成要素がキット内にある場合（標識試薬及び標識を一緒に包装してもよい。）、キットは一般に、追加の成分を別々に入れることができる第２、第３、又はその他の追加の容器を含有することになる。しかし、成分の様々な組合せをバイアルに入れてもよい。本発明のキットは、典型的には、核酸を入れる手段と、市販のため密に閉じ込めた任意のその他の試薬容器も含むことになる。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出又はブロー成型されたプラスチック容器を含んでもよい。

【0187】

キットの成分が１種及び／又は複数の液体溶液で提供される場合、その液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。

【0188】

しかし、キットの成分は、（１種又は複数の）乾燥粉末として提供してもよい。試薬及び／又は成分を乾燥粉末として提供する場合、この粉末は、適切な溶媒を添加することによって元に戻すことができる。溶媒は、別の容器手段で提供してもよいと考えられる。

【0189】

容器手段は、一般に、核酸製剤が入れられる、好ましくは適切に分配される、少なくとも１種のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、及び／又はその他の容器手段を含むことになる。キットは、滅菌した、医薬品として許容される緩衝液及び／又はその他の希釈液を入れるための、第２の容器手段を含んでもよい。

【0190】

本発明のキットは、典型的には、例えば所望のバイアルが保持される射出及び／又はブロー成型されたプラスチック容器など、市販のために密に閉じ込めたバイアルを入れるための手段も含むことになる。

【0191】

そのようなキットは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ阻害薬であるオリゴヌクレオチドを保存又は維持し、又はそれらの分解を防止する、成分を含んでもよい。そのような成分は、ＲＮアーゼを含まなくてもよく、あるいはＲＮアーゼから保護するものであってもよい。そのようなキットは、一般に、適切な手段で、個々の試薬又は溶液のそれぞれに合わせた全く異なる容器を含むことになる。

【0192】

キットは、キットの成分を用いるための、ならびにこのキットに含まれない任意のその他の試薬を使用するための、取扱指示書も含むことになる。取扱指示書は、実施することができる変形例を含んでもよい。キットは、非経口又はカテーテル投与などの様々な投与経路によってｍｉＲＮＡ作動薬又は拮抗薬を投与するための、用具又は機器を含んでもよい。

【0193】

そのような試薬は、本発明のキットの実施形態であることが企図される。しかし、そのようなキットは、上記にて特定された特定の品目に限定されず、ｍｉＲＮＡの取扱い又は特徴付けで使用される任意の試薬を含んでもよい。

【0194】

モジュレーターを特定するための方法
本発明はさらに、心臓線維症、心臓肥大、又は心不全の予防又は治療又は回復に有用な、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの作動薬を特定するための方法を含む。これらのアッセイは、候補化合物の大きなライブラリーのランダムスクリーニングを含んでもよく、あるいはこのアッセイは、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現及び／又は機能をより容易に促進すると考えられる構造的属性に配慮して選択された、特定の種類の化合物に焦点を当てるために使用してもよい。

【0195】

ｍｉＲ−２９ａ〜ｃのモジュレーターを特定するには、一般に、候補化合物の存在下及び不在下でｍｉＲ−２９ａ〜ｃの機能を決定することになる。例えば、その方法は一般に、
（ａ）候補化合物を提供する工程と、
（ｂ）候補化合物とｍｉＲ−２９とを混合する工程と、
（ｃ）ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの活性を測定する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の活性を、候補化合物の不在下でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの活性と比較する工程と
を含み、測定したｍｉＲ−２９ａ〜ｃの活性同士の差から、候補化合物が確かにｍｉＲ−２９ａ〜ｃのモジュレーターであることが示される。
アッセイは、単離された細胞、器官、又は生きている生物で実施してもよい。

【0196】

当然ながら、本発明の全てのスクリーニング法は、有効な候補を見出すことができないという事実にも関わらずそれ自体が有用であることが理解されよう。本発明は、それらを見出す方法だけでなく、そのような候補をスクリーニングするための方法を提供する。

【0197】

本明細書で使用される「候補化合物」という用語は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの線維症−又はコラーゲン−調節態様を潜在的にモジュレートできる任意の分子を指す。典型的には、様々な商業的供給源から、有用な化合物の同定を「強力に推し進める」目的で、有用な薬物の基本的基準を満たすと考えられる、分子ライブラリーを獲得することになる。コンビナトリアル発生ライブラリー（例えば、アンタゴmirライブラリー）を含めたそのようなライブラリーのスクリーニングは、多数の関連（及び非関連）化合物を活性に関してスクリーニングする、迅速で効率的な方法である。コンビナトリアル手法は、活性だが通常なら望ましくない化合物をモデルにした第２、第３、及び第４世代化合物の生成による、潜在的な薬物の迅速な発展にも向いている。

【0198】

実行するのに素早く安価で容易なアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイである。そのようなアッセイは、一般に単離された分子を使用し、素早くかつ大量に実行することができ、それによって短時間で得ることが可能で情報量が増大する。試験管、プレート、皿、及びディップスティックやビーズなどのその他の面を含めた様々な容器を、アッセイの実行に使用することができる。

【0199】

化合物のハイスループットスクリーニングの技法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ８４／０３５６４に記載されている。多数の小アンタゴｍｉｒ化合物は、プラスチックのピンやいくつかのその他の面などの固体基板上で合成してもよい。そのような分子は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃを阻害する能力について、素早くスクリーニングすることができる。

【0200】

本発明は、化合物が細胞内でｍｉＲ−２９ａ〜ｃの活性及び発現を変化させる能力に関するスクリーニングも企図する。骨格筋細胞由来のものを含めた様々な細胞系は、この目的に向けて特に設計製作された細胞も含めてそのようなスクリーニングアッセイで利用することができる。１次心臓細胞も、Ｈ９Ｃ２細胞系で可能であるように、使用することができる。

【0201】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイでは、特定の欠陥を有するように、あるいは生体内の種々の細胞に到達し作用するという候補物質の能力の測定に使用することができるマーカーを保持するように設計製作された、トランスジェニック動物を含めた心疾患、筋骨格系疾患、線維症、又はコラーゲン損失の様々な動物モデルを使用する。それらのサイズ、取扱いの容易さ、それらの生理機能及び遺伝子構造に関する情報により、マウスは、特にトランスジェニックに関して好ましい実施形態である。しかし、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、及びサル（チンパンジー、テナガザル、及びヒヒ）を含めたその他の動物も同様に適している。阻害薬のアッセイは、これらの種のいずれかから得られた動物モデルを使用して実施してもよい。

【0202】

試験化合物による動物の治療では、適切な形をとる化合物を動物に投与する。投与は、臨床目的で利用可能な任意の経路によって行われることになる。ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の有効性の決定では、限定するものではないが肥大シグナル伝達経路及び肥大の身体的症状の変化を含めた様々な異なる基準を用いてもよい。また、毒性及び用量応答の測定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｃｙｔｏアッセイの場合よりも有意義な手法で、動物で行うことができる。

【0203】

トランスジェニック動物
本発明の特定の実施形態は、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及び／又はｍｉＲ−２９ｃの機能的対立遺伝子の一方又は両方を欠くトランスジェニック動物を提供する。また、誘導性の組織選択的又は構成的プロモーターの制御下でｍｉＲ−２９ａ〜ｃを発現するトランスジェニック動物、そのような動物から得られる組換え細胞系、及びトランスジェニック胚は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃが線維症の制御でと病的な心臓肥大及び心不全の発症で演ずる、正確な役割を決定するのに役立てることができる。さらに、これらのトランスジェニック動物は心臓の発生に洞察を提供するかもしれない。核酸をコードする誘導性の、あるいは抑制可能なｍｉＲ−２９ａ〜ｃの使用は、過剰に調節された、あるいは調節されていない発現のモデルを提供する。また、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関して「ノックアウト」されたトランスジェニック動物も、一方又は両方の対立遺伝子において、企図される。また、１つ又は両方のクラスターに関する一方又は両方の対立遺伝子において、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関して「ノックアウト」されたトランスジェニック動物も、企図される。

【0204】

一般的な実施形態では、トランスジェニック動物は、トランス遺伝子の発現を可能にする手法でゲノムに所与のトランス遺伝子を組み込むことにより生成される。トランスジェニック動物を生成する方法は、一般に、Ｗａｇｎｅｒ及びＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号; 参照により本明細書に組み込まれている）及びＢｒｉｎｓｔｅｒら（１９８５; 参照により本明細書に組み込まれている。）によって記述されている。

【0205】

典型的には、ゲノム配列によって挟まれた遺伝子を、微量注入によって受精卵に移入する。微量注入された卵を宿主のメスに移植し、後代を、トランス遺伝子の発現についてスクリーニングする。トランスジェニック動物は、限定するものではないが爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、及び魚類を含めたいくつかの動物から得た受精卵から生成してもよい。

【0206】

微量注入用のＤＮＡクローンは、当技術分野で知られている任意の手段によって調製することができる。例えば、標準的な技法を使用して、微量注入用のＤＮＡクローンを、細菌プラスミド配列を除去するのに適した酵素で切断し、そのＤＮＡ断片をＴＢＥ緩衝液中１％のアガロースゲル上で電気泳動することができる。ＤＮＡバンドは、臭化エチジウムで染色することによって視覚化され、発現配列を含有するバンドが切除される。次いで切除されたバンドを、ｐＨ７．０の、０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含有する透析バッグに入れる。ＤＮＡを透析バッグに電気溶離し、１：１のフェノール：クロロホルム溶液で抽出し、２体積のエタノールによって沈殿させる。ＤＮＡを、低塩緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Tris、ｐＨ７．４、及び１ｍＭ EDTA）１ｍｌ中に再溶解し、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（商標）カラムで精製する。カラムを最初に高塩緩衝液３ｍｌ（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Tris、ｐＨ７．４、及び１ｍＭ EDTA）でプライム処理し、その後、低塩緩衝液５ｍｌで洗浄する。ＤＮＡ溶液をカラムに３回通して、ＤＮＡをカラムマトリックスに結合する。低塩緩衝液３ｍｌで１回洗浄した後、ＤＮＡを０．４ｍｌの高塩緩衝液で溶離し、２体積のエタノールにより沈殿させる。ＤＮＡ濃度を、ＵＶ分光光度計で、２６０ｎｍでの吸収により測定する。微量注入では、ＤＮＡ濃度を５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４、及び０．１ｍＭ EDTA）中３μｇ／ｍｌに調節する。微量注入用にＤＮＡを精製するその他の方法は、Ｐａｌｍｉｔｉｅｒら（１９８２）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）に記載されている。

【0207】

例示的な微量注入手順では、６週齢のメスのマウスに、妊馬血清性ゴナドトロピン（PMSG; Sigma）５ ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）で、それから４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG; Sigma）５ ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）で、過剰排卵を誘発させる。メスを、ｈＣＧ注射直後にオスと一緒に置く。ｈＣＧ注射から２１時間後、交尾したメスをＣ０２窒息又は頚椎脱臼によって犠牲にし、切除した卵管から胚を回収し、０．５％ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma）を含んだダルベッコリン酸緩衝生理食塩液に入れる。周囲を取り囲む卵丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。次いで前核胚を洗浄し、注射時まで、５％ＣＯ_２、９５％空気の加湿雰囲気を有する３７．５℃のインキュベータ内で、０．５％ＢＳＡ（EBSS）を含有するアール平衡塩溶液に入れる。胚は、２つの細胞段階で移植することができる。

【0208】

ランダムな周期の成体メスマウスを、精管切除したオスと対にする。Ｃ５７ＢＬ／６又はスイスマウス又はその他同等の株を、この目的で使用することができる。レシピエントのメスを、ドナーのメスと同時に交尾させる。胚移植時に、レシピエントのメスを、体重１ｇ当たり２．５％のアバーチン０．０１５ｍｌを腹腔内注射することによって、麻酔をかける。卵管を、単一正中背面切開によって露出させる。次いで切開を、卵管の直上で体壁に沿って行う。次いで卵嚢を、時計工用ピンセットで破る。移される胚を、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝整理食塩液）中に入れ、注入ピペットの先端に入れる（約１０〜１２胚）。ピペットの先端を卵管漏斗に挿入し、胚を移す。移した後、切開を２針縫うことによって閉じる。

【0209】

定義
本明細書で使用される「心不全」という用語は、心臓が血液を送出する能力が低下する、任意の状態を意味するのに広く使用される。その結果、うっ血及び浮腫が組織に発症する。最も頻繁に、心不全は、冠血流量の減少から生じる心筋の収縮性が低下することによって引き起こされ、しかし、心臓弁の損傷、ビタミンの欠乏、及び原発性心筋疾患を含めた多くのその他の要因が、心不全をもたらす可能性がある。心不全の正確な生理学的機構は、全体が理解されていないが、心不全は一般に、交感神経、副交感神経、及び圧受容器応答を含めた心臓の自律的な性質のいくつかの障害に関わると考えられる。「心不全の徴候」という文言は、心不全に関連した実験所見を含む、息切れ、圧痕水腫、肥大した圧痛肝、うっ血頚静脈、及び肺ラ音などの心不全に関連する続発症の全てを包含するのに広く使用される。

【0210】

「治療」という用語又は文法上の均等物は、心不全の症状の改善及び／又は回復を包含する（即ち、心臓が血液を送出する能力）。心臓の「生理学的機能の改善」は、本明細書に記述される測定（例えば、駆出分画、短縮率、左心室内寸法、心拍数の測定）ならびに動物の生存に対する任意の影響のいずれかを使用して評価することができる。動物モデルの使用では、治療したトランスジェニック動物と未治療のトランスジェニック動物の応答を、本明細書に記述されるアッセイのいずれかを使用して比較する（さらに、治療され及び未治療の非トランスジェニック動物を、対照として含めてもよい。）。それによって、本発明のスクリーニング法で使用される心不全に関連した任意のパラメータに改善を引き起こす化合物を、治療化合物として特定することができる。

【0211】

「拡張型心筋症」という用語は、収縮期の収縮機能が不十分な、対称的に拡張した左心室の存在を特徴とする心不全のタイプを指し、さらに、右心室も頻繁に関与するものである。

【0212】

「化合物」という用語は、疾患、病気、疾病、又は身体機能の障害を治療又は予防するのに使用することができる、化学的部分、医薬品、及び薬物などを指す。化合物は、知られているもの、及び潜在的な治療化合物の両方を含む。化合物は、本発明のスクリーニング法を使用したスクリーニングによって、治療的であると決定することができる。「知られている治療化合物」は、そのような治療に効果的であることが示されている（例えば、動物試験又はヒトへの投与による過去の経験を通して）治療化合物を指す。言い換えれば、知られている治療化合物は、心不全の治療に有効な化合物に限定されない。

【0213】

本明細書で使用される「心臓肥大」という用語は、成人の心筋細胞が肥大成長を通してストレスに応答するプロセスを指す。そのような成長は、細胞分裂無しでの細胞サイズの増大と、力の発生を最大限にするための、細胞内での追加のサルコメアのアセンブルと、胎児心臓遺伝子プログラムの活性化を特徴とする。心臓肥大は、罹患及び死亡の高い危険性をしばしば伴い、したがって、心臓肥大の分子機構の理解を目標にした研究は、人間の健康に著しい影響を及ぼす可能性がある。

【0214】

本明細書で使用される「モジュレート」という用語は、生物学的活性の変化又は変更を指す。モジュレーションは、タンパク質活性の増加又は減少、キナーゼ活性の変化、結合特性の変化、又はタンパク質もしくは問題のその他の構造に関連した生物学的、機能的、もしくは免疫学的な性質の任意のその他の変化であってもよい。「モジュレーター」という用語は、上述の生物学的活性を変化させ、あるいは変更することが可能な任意の分子又は化合物を指す。

【0215】

「β−アドレナリン受容体拮抗薬」という用語は、ベータ（β）型のアドレナリン受容体（即ち、カテコールアミン、特にノレピネフリンに応答するアドレナリン作動系の受容体）を、部分的に、あるいは完全に遮断することが可能な化合物又は化学的実体を指す。いくつかのβ−アドレナリン受容体拮抗薬は、ある受容体サブタイプ（一般に、β_１）に対し、ある程度の特異性を示し；そのような拮抗薬を、「β_１−特異的アドレナリン受容体拮抗薬」及び「β_２−特異的アドレナリン受容体拮抗薬」と呼ぶ。「β−アドレナリン受容体拮抗薬」という用語は、選択的及び非選択的な拮抗薬である化合物を指す。β−アドレナリン受容体拮抗薬の例には、限定するものではないがアセブトロール、アテノロール、ブトキサミン、カルテオロール、エスモロール、ラベトロール、メトプロロール、ナドロール、ペンブトロール、プロパノロール、及びチモロールが含まれる。知られているβ−アドレナリン受容体拮抗薬の誘導体の使用は、本発明の方法に包含される。実際、β−アドレナリン受容体拮抗薬として機能的に振る舞う任意の化合物は、本発明の方法に包含される。

【0216】

「アンギオテンシン変換酵素阻害薬」又は「ＡＣＥ阻害薬」という用語は、レニン−アンギオテンシン系で比較的不活性なアンギオテンシンＩから活性なアンギオテンシンＩＩへの変換に関与する酵素を、部分的に、あるいは完全に阻害することが可能な化合物又は化学的実体を指す。さらにＡＣＥ阻害薬は、ブラジキニンの分解を同時に阻害し、ＡＣＥ阻害薬の抗高血圧作用を著しく高める可能性がある。ＡＣＥ阻害薬の例には、限定するものではないがベナゼプリル、カプトプリル、エナロプリル、フォシノプリル、リシノプリル、キアプリル、及びラミプリルが含まれる。知られているＡＣＥ阻害薬の誘導体の使用は、本発明の方法により包含される。実際、ＡＣＥ阻害薬として機能的に振る舞う任意の化合物は、本発明の方法に包含される。

【0217】

本明細書で使用される「遺伝子型」という用語は、生物の実際の遺伝子構成を指し、一方、「表現型」は、個体によって示される物理的な特徴を指す。さらに、「表現型」は、ゲノムの選択的発現の結果である（即ち、細胞歴の発現であり、細胞外環境に対するその応答である。）。実際、ヒトゲノムは、推定３００００〜３５０００遺伝子を含有する。各細胞型では、これら遺伝子のごくわずかな割合（即ち、１０〜１５％）が発現する。

【0218】

特許請求の範囲及び／又は明細書で「含む（comprising）」という用語と併せて使用するときの、「ａ」又は「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は複数」の意味とも一致している。

【0219】

本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆の場合もできると考えられる。さらに、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を実現するのに使用することができる。

【0220】

本出願の全体を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するのに用いられる機器又は方法に関して誤差の標準偏差を含むことを示すのに使用される。

【0221】

特許請求の範囲での「又は」という用語の使用は、代替物のみ指すことを明示しない限り、又は代替物が相互に排他的であることを明示しない限り、「及び／又は」を意味するのに使用されるが、この開示は、代替物のみと「及び／又は」を指すという定義を支持する。

【0222】

本明細書及び（１つ又は複数の）請求項で使用される「含む（comprising）」（及び「含む（comprise）」や「含む（comprises）」などのcomprisingの任意の形）、「有する（having）」（及び「有する（have）」や「有する（has）」などのhavingの任意の形）、「含む（including）」（及び「含む（includes）」や「含む（include）」などのincludingの任意の形）、又は「含有する（containing）」（及び「含有する（contains）」や「含有する（contain）」などのcontainingの任意の形）は、包括的又は制約の無い形であり、追加の飲用されていない要素又は方法工程を排除するものではない。

【0223】

セクションの見出しを、再検討を容易にするために本出願に挿入したが、そのような見出しは、実施形態の部分と解釈すべきではない。

【0224】

以下の実施例を、本発明の様々な態様をさらに例示するために含める。当業者なら、以下に示す実施例に開示される技法は、本発明の実施に際して十分に機能する本発明者により発見された技法及び／又は組成物を表すものであり、したがってその実施のための好ましい態様を構成すると見なすことができると、解釈すべきである。しかし当業者なら、本発明の開示に照らして、多くの変更を開示された特定の実施形態に行うことができ、それでも本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様の、あるいは類似の結果を得ることができることを理解すべきである。

【実施例】

【0225】

ｍｉＲ−２０８を、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内にコードする（図１Ａ）。α−ＭＨＣと同様に、ｍｉＲ−２０８を、心臓において特異的に発現し、肺においてわずかに発現する（図１Ｂ）。ｍｉＲ−２０８を、別個の転写産物として転写するのではなく、α−ＭＨＣのｐｒｅ−ｍＲＮＡの外側に処理する。しかし、興味深いことに、ｍｉＲ−２０８は、少なくとも１４日の著しく長い半減期を示し、その結果α−ＭＨＣのｍＲＮＡの発現が下方制御された場合でも、機能を発揮できる。マウスにおけるｍｉＲ−２０８の遺伝的欠失は、明白な表現型の誘導に失敗したが、２月齢の野生型及びｍｉＲ−２０８^−／−動物由来の心臓についてのマイクロアレイ分析により、多数の速骨格筋収縮性タンパク質遺伝子の顕著な発現をもたらすｍｉＲ−２０８の除去を明らかにし、速骨格筋収縮性タンパク質遺伝子は通常は心臓において発現しない。したがって、これらの結果は、通常の状態下でｍｉＲ−２０８は、単独の心臓特異的ＭＨＣ遺伝子と共発現し、心臓における骨格筋遺伝子の発現を抑制することにより、心筋細胞の同一性を維持することを示唆する。

【0226】

ｍｉＲ−２０８の最も注目に値する機能が、心臓のストレスに対するｍｉＲ−２０８−ヌルマウスの異常応答によって明らかになった（van Rooijら、2007）。胸部大動脈狭窄による圧負荷又は心臓の病理的リモデリングを起動するカルシウム／カルモジュリン依存性ホスファターゼであるカルシニューリンによるシグナル伝達に応答して、ｍｉＲ−２０８−ヌルマウスは、実質的には心筋細胞の肥大又は線維症がなく、β−ＭＨＣの発現を上方制御できないことを示した（図６〜８）。対照的に、ＡＮＦ及びＢＮＰをコードするストレス応答遺伝子などの他のストレス応答遺伝子は、ｍｉＲ−２０８突然変異動物において強く誘導され、ｍｉＲ−２０８が、心臓ストレス応答の他のファセットから離れることができる、β−ＭＨＣの発現の調節に特異的に関与することを実証した。

【0227】

β−ＭＨＣの発現は、甲状腺ホルモンシグナル伝達によって抑制され、甲状腺機能低下状態において上方制御される（Leungら、2006）。ｍｉＲ−２０８^−／−動物は、甲状腺機能低下を誘導する、Ｔ３阻害剤のプロピルチオウラシル（PTU）投与の後に、β−ＭＨＣの発現の上方制御に対してもさらに耐性であった。しかし、興味深いことに、出生前のβ−ＭＨＣの発現は、ｍｉＲ−２０８突然変異マウスにおいて普通であり、ｍｉＲ−２０８がβ−ＭＨＣの発現の生後の制御に特異的に関与することを示し、このことはβ−ＭＨＣ遺伝子の甲状腺ホルモン応答性の獲得と一致する（図５）。

【0228】

ｍｉＲ−２０８の作用機構の手がかりは、ｍｉＲ−２０８^−／−の心臓と甲状腺機能亢進症心臓との類似性によってもたらされ、これらは両方ともβ−ＭＨＣの発現の遮断、ストレス応答遺伝子の上方制御ならびに病的な肥大及び線維症に対する防御を表す（図６〜１０）。ｍｉＲ−２０８^−／−心臓における速骨格筋遺伝子の上方制御は、甲状腺機能亢進症状態における速骨格筋線維の誘導もまた模倣する（Weiら、2005）。

【0229】

これらの知見は、ｍｉＲ−２０８が、少なくとも部分的に、心臓におけるストレス応答及び甲状腺ホルモンのシグナル伝達経路の共通の構成要素の発現を抑制することによって作用することを示唆している。ｍｉＲ−２０８の最も強い予測標的の１つは、甲状腺ホルモン受容体（TR）共調節因子のＴＨＲＡＰ１であり、これは転写について正及び負の効果を発揮できる。（Pantosら、2006;Yao及びEghbali,1992；図１２）。ＴＲは、負の甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）を介して作用し、成体の心臓においてβ−ＭＨＣの発現を抑制する（Zhaoら、2005）。したがって、ｍｉＲ−２０８の不在下のＴＨＲＡＰ１の発現の増加により、β−ＭＨＣの発現に対するＴＲの抑制活性の強化が予測され、ｍｉＲ−２０８^−／−の心臓におけるβ−ＭＨＣの発現の遮断と一致する。しかし、ＴＨＲＡＰ１はｍｉＲ−２０８の本物の標的であると思われ、これらのデータは、β−ＭＨＣの発現の制御においてさらなる標的の関与の可能性を排除するものではない。

【0230】

β−ＭＨＣに対する微妙なシフトでも、成体の心臓の機械的性能及び効率を低下させるので、心疾患の期間のβ−ＭＨＣの発現における増加を防ぐために、ｍｉＲ−２０８の制御を利用することは治療価値があると思われる。心臓特異性及び正常な心臓の発達に対してではない、心臓ストレス応答に対するｍｉＲ−２０８の関与が、ｍｉＲ−２０８（及びその下流エフェクター）を、β−ＭＨＣのレベルを操作するための魅力的な治療標的にさせる（図１３）。

【0231】

材料及び方法
ノーザンブロット分析。心不全でない、あるいは心不全と診断された、無記名のヒトの左心室の心臓組織試料を、Ｇｉｌｅａｄ Ｃｏｌｏｒａｄｏ（Westminster、CO）から入手した。心筋梗塞に罹っていると診断された匿名の人物の、境界領域の心臓組織試料を得た。トータルＲＮＡを、トリゾール試薬（Gibco/BRL）を使用することによって、細胞、マウス、ラット、ヒト心臓組織試料、又は単離した筋細胞から単離した。臭化エチジウムでノーザンゲルを染色することにより、同等の負荷であることを確認した。マイクロＲＮＡを検出するノーザンブロットを、前述のように行った（van rooijら、2006）。Ｕ６プローブはローディングコントロールの役目を果たした。α−ＭＨＣの発現を検出するために、成体の野生型及びｍｉＲ−２０８突然変異動物の両方の心臓組織由来のＲＮＡ１０μｇを含むノーザンブロットを、５’ＵＴＲ領域及び第１エキソンの一部を包含する、α−ＭＨＣのｃＤＮＡ断片を用いて解析した。

【0232】

ＰＴＵの投与。甲状腺ホルモンの欠乏は、表示の期間、Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ Ｃｏ．（TD 97061）（Madison、WI）から購入したＰＴＵ０．１５％を補足した、ヨードを含まない餌を動物に与えることによって誘導した。

【0233】

マイクロアレイ及びリアルタイムＰＣＲ分析。心臓組織由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Invitrogen）を使用して単離した。マイクロアレイ分析を、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０アレイ（Affymetrix）を使用して実施した。ｍｉＲＮＡのレベルを検出するために、製造業者の推奨に従いタックマンマイクロＲＮＡ逆転写酵素キット（Applied Biosystems、ABI）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡ５ｎｇを使用して、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーによりｃＤＮＡを発生させ、その後、ｍｉＲＮＡ特異的タックマンプローブは、問題のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出する働きをした。ＲＮＡ試料でのランダムヘキサマープライマー（Invitrogen）によるＲＴ−ＰＣＲの後、ＡＢＩから購入したタックマンプローブを使用して、遺伝子のサブセットの発現をＰＣＲ又は定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。

【0234】

ｍｉＲ−２０８突然変異マウスの作製。ｍｉＲ−２０８標的ベクターを作製するために、ｍｉＲ−２０８コード領域の上流に伸長した０．４ｋｂの断片（５’アーム）を、ＳｃａＩＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、ｌｏｘＰ部位及びＦｒｔ−隣接ネオマイシンカセットの上流のｐＧＫｎｅｏＦ２Ｌ２ｄｔａ標的プラスミドに連結した。３．３ｋｂの断片（３’アーム）を、ＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ネオマイシン耐性及びＤｔａ陰性選択カセットの間のベクターに連結した。破壊された対立遺伝子を担持する標的ＥＳ細胞を、５’及び３’のプローブを用いてサザンブロット分析により特定した。３種のｍｉＲ−２０８標的ＥＳクローンを特定し、胚盤胞注入に使用した。得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６に交配させ、突然変異対立遺伝子の生殖細胞系列伝達を得た。

【0235】

遺伝子導入マウスの作製。対象のｍｉＲＮＡに隣接するマウスのゲノム断片を、α−ＭＨＣ及びヒトＧＨポリ（ａ）＋シグナルを含む、心臓特異的発現プラスミドにサブクローン化した（Kiriazis及びKranias、2000）。ゲノムＤＮＡをマウスの尾の生検から単離し、ヒトＧＨポリ（ａ）＋シグナルに特異的なプライマーを使用してＰＣＲにより分析した。

【0236】

ウェスタンブロット。ミオシンを、記載のように心臓組織から抽出した（Morkin、2000）。ＭＨＣのイソ型をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、マウスモノクロナールα−ＭＨＣ（BA-G5）（ATCC、Rockville、MD）及びβ−ＭＨＣに高度に特異的なマウスモノクロナール抗ミオシン（遅、骨格Ｍ８４２１）（Sigma、MO）を用いてウェスタンブロットを実施した。すべての横紋筋ミオシンを検出するために、汎特異的抗体（マウスモノクロナール3-48;Accurate Chemical & Scientific Corporation、NY）を使用した。ＴＨＲＡＰ１を、心臓タンパク質溶解物４００μｇから免疫沈降することによって検出した。試料を４℃において１時間予備クリアリング後、上清を、ウサギポリクロナール抗ＴＨＲＡＰ１（R.Roeder、Rockefeller Universityのご厚意により送られた）１μｌ及びプロテインＡビーズ１５μｌと共に４℃において一晩インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで３回洗浄し、ＳＤＳ試料バッファー中で煮沸した。免疫沈降したＴＨＲＡＰ１タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ウサギポリクロナール抗ＴＨＲＡＰ１を１：３０００の希釈、及び抗ウサギＩｇＧ標識ホースラディッシュペルオキシダーゼを１：５０００の希釈で使用し、Ｌｕｍｉｎｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Santa Cruz）により検出して分析した。

【0237】

組織学的分析及びＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。組織学に使用する組織を、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｈｅｉｔ溶液中でインキュベートし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、切片にし、ヘマトキシリン及びエオシン（H&E）処理し、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色又は標準的技術（Krenz及びRobbins、2004）によりｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションした。^３５Ｓ−標識ＲＮＡプローブを、Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔキット（Amersham）を使用して作製した。シグナルを、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して赤く疑似カラー化した。

【0238】

経胸壁心エコー検査。心臓機能及び心臓体積を、断層心エコーにより覚醒マウスにおいて、Ｖｉｎｇｍｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（GE Vingmed Ultrasound、Horten、Norway）及び１１．５−ＭＨｚのリニアアレイ変換器を使用して評価した。Ｍモード心エコー図を使用して、拡張末期及び収縮末期の前壁厚及び後壁厚を測定した。左室（LV）内径（LVID）を、拡張期（LVIDd）又は収縮期（LVIDs）のいずれかにおける最も大きな前後径として測定した。データを、単一観察者による盲検により、マウスの遺伝子型に対して分析した。ＬＶの短縮率（FS）を、以下の式に従って計算した。：ＦＳ（％）＝［（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）／ＬＶＩＤｄ］×１００。

【0239】

プラスミド及び形質移入アッセイ。ｍｉＲ−２０８コード領域を包含する３０５ｂｐのゲノム断片をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＭＶ６に連結した。全ネズミＴＨＲＡＰ１−ＵＴＲを包含する１ｋｂの断片を、ＰＣＲ増幅し、ＨＡ−タグ化ｐＣＭＶ６発現構築体及びホタルルシフェラーゼ（f-luc）レポーター構築体（pMIR-REPORTTm、Ambion）に連結した。ＵＣＧＵＣＵＵＡ ｍｉＲ−２０８のシード結合配列の突然変異体を、ＰＣＲに基づく突然変異生成を介して構築した。

【0240】

細胞培養、トランスフェクション、及びルシフェラーゼアッセイ。ｍｉＲ−２９ｂ−１及びｍｉＲ−２９ａコーディング領域を包含する１７９３−ｂｐゲノム断片を、ＰＣＲによって増幅し、ｐＣＭＶ６中に連結した。（１つ又は複数の）ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ結合部位を包含するマウス３’ＵＴＲのゲノム断片を、ＰＣＲ増幅し、ホタルルシフェラーゼ（f-luc）レポーター構成（pMIR-REPORTTM、Ambion）中に連結した。ＣＯＳ細胞に、製造業者の指示に従ってＦｕｇｅｎｅ ６（Stratagene）をトランスフェクトした。ウェル当たりのＤＮＡの総量を、ｃＤＮＡインサートを用いずに、相当する量の発現ベクターを添加することによって一定に保持した。トランスフェクションから４８時間後、細胞抽出物を、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を使用して、ルシフェラーゼの発現に関するアッセイにかけた。相対的なプロモーターの活性を、細胞抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ発現に関して規準化された、ルミネセンス相対単位として表す。

【0241】

心臓線維芽細胞（CF）を、前述のように単離した（Simpson及びSavion、1982）。手短に言うと、新生児である１〜２日齢の麻酔をかけたスプラーグ−ドーリーラット（Harlan Sprague Dawley、Indianapolis、IN）の心臓を、切除し、細かくし、パンクレアチン０．１％で消化した。細胞を、ｐｒｉｍａｒｉａプレート上に２時間蒔き、消化された組織の心筋細胞画分を含有する媒体を、除去した。心臓線維芽細胞は、心筋細胞よりも非常に素早く結合及び増殖し、これによって、事実上純粋な線維芽細胞培養物が１次継代後に生成されたが、これは、反復される示差プレーティング及び顕微鏡的評価によって確認された。細胞を、継代のため０．０５％トリプシンで引き離し、培養研究を、第２〜４継代で行った。細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ及び抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を含有する高グルコース（４．５ｇｍ／ｌｔ）ダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）で増殖させた。筋線維芽細胞の差別化は、Ｌ−アスコルビン酸（１０μｇ／μｌ）を含む低血清（２％FBS）に培地を交換し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を４８時間投与することによって、誘発された。

【0242】

抗ｍｉＲ処理によるｉｎ ｖｉｖｏ ｍｉＲ−２９ｂサイレンシング。ｍｉＲ−２９ｂに相補的な配列を含む（抗ｍｉＲ−２９ｂ）、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、ｍｉＲ−２９ｂ発現を阻害した。全ての塩基は２’−ＯＭｅ修飾されており、最初の２つ及び最後の４つの塩基はホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含有しており、オリゴヌクレオチドの３’末端は、コレステロールに連結していた。８週齢のＣ５７ＢＬ／６オスマウスに対し、尾静脈注射によって、８０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の抗ｍｉＲ−２９ｂ（AsAsCACUGAUUUCAAAUGGUsGsCsUsAs-コレステロール）又はミスマッチｍｉＲ−２９ｂ（AsAsAACUGAUGUCACAUGGUsGsAsUsAs-コレステロール）を与え、又は同等の体積の生理食塩液を与えた。組織を、治療後３日又は３週間で収集した。

【0243】

(実施例1)
ストレス応答性ｍｉＲＮＡによる心臓肥大及び心不全の調節
その細胞表現型のモデュレーションへの関与に照らし、本発明者らは、ｍｉＲＮＡが、遺伝子発現の転写的及び翻訳的変化をもたらすことが知られている心臓ストレスに対する心臓の応答を調節する役割を演ずると仮定した。心臓肥大でのｍｉＲＮＡの潜在的関与を調査するために、１８６の異なるｍｉＲＮＡを示すマイクロアレイを使用して、心臓肥大の２つの確立されたマウスモデルで、並列ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析を行った（Babakら、2004）。心臓に対する後負荷を増大させることによって肥大を誘発させる、胸部大動脈瘤絞扼術（TAB）を施したマウスを、擬似手術を行った動物と比較した。第２のモデルでは、心臓で活性化カルシニュリン（CnA）を発現するトランスジェニックマウスは、重篤な、十分に特徴付けられた形の肥大をもたらすものであり（Molkentinら、1998）、このマウスを野生型同腹子と比較した（図１４）。ＴＡＢにかけたマウスの心臓から単離されたＲＮＡは、擬似手術した対照に比べて２７ｍｉＲＮＡで高い発現を示し、ＣｎＡ Ｔｇマウスは、非トランスジェニック同腹子対照に比べ、３３ｍｉＲＮＡで高い発現を示し、即ちその２１が両方のモデルで上方制御されたものであった。同様に、ＴＡＢ及びＣｎＡ誘発性肥大は、それぞれ１５及び１４のｍｉＲＮＡという低い発現を伴い、そのうち７ｍｉＲＮＡは、一般に下方制御されたものであった（図１４Ｂ）。これらのｍｉＲＮＡのノーザン分析（公表されていないデータ）及び先のマイクロアレイ分析（Baradら、2004; Sempereら、2004; Shingaraら、2005; Liuら、2004）は、これらが広範な組織で発現することを示す。それらの相対的な発現レベルと、ヒト、ラット、及びマウス配列の保存と、肥大中の発現レベルとに基づき、本発明者らは、１１の上方及び５の下方制御されたｍｉＲＮＡに焦点を当てた（図１４Ｃ）。

【0244】

ＷＴ及びＣｎＡ Ｔｇ動物からの心臓ＲＮＡのノーザンブロット分析は、ｍｉＲ−２１、−２３、−２４、−１２５ｂ、−１９５、−１９９ａ、及び−２１４の高い発現と、ｍｉＲ−２９、−９３、−１５０、及び−１８１ｂの低い発現を確認した（図１４Ｃ及び図１５）。まとめると、これらのデータは、異なるｍｉＲＮＡが心臓肥大中に調節されることを示し、このプロセスのモジュレーターとして機能する可能性を示唆している。

【0245】

(実施例2)
ｍｉＲ−２０８による調節のための下流標的としてのｍｉＲ−２９ファミリーの発見
本発明者らは、ｍｉＲ−２０８の動作を媒介し得る下流ｍｉＲＮＡを特定する試みにおいて、野生型及びｍｉＲ−２０８−ヌルマウスからの心臓でｍｉＲＮＡマイクロアレイを行った（図１６）。本発明者らは、ｍｉＲ−２９ファミリーの多数のメンバーが、ｍｉＲ−２０８−ヌルマウスで上方制御されることを発見した（図１７）。標的の予測は、ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーが、多数のコラーゲン及び細胞外基質のその他の成分をコードするｍＲＮＡを標的とすることを示した（図１８）。このように、ｍｉＲ−２０８−ヌルマウスでのｍｉＲ−２９ファミリーメンバーの上方制御は、これら動物で見られる線維症を遮断する原因である可能性が高い（図１９）。

【0246】

ｍｉＲ−２９ａ〜ｃは、罹患した心臓で下方制御されかつコラーゲン及び細胞外基質タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とするという発見は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又はその標的ｍＲＮＡとの結合を高める戦略が、病的な心臓リモデリング及び線維症の状況にある心臓に対して有益な影響を及ぼすことができることを示唆している。さらに、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現又は機能の増大によって、骨格筋、肝臓、肺、及び腎臓などの組織における多くの疾患に関連した線維症を予防することができる。さらに、ｍｉＲ−２０８がｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現を抑制し、またｍｉＲ−２０８の喪失がｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現を上方制御するという発見は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃが、心臓に対するｍｉＲ＝２０８の動作の下流メディエーターであることを示している。

【0247】

(実施例3)
ｍｉＲ−２９ａ〜ｃは繊維化遺伝子の発現を調節する。
ＭＩ後に心臓でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関する可能性ある機能を定義しようとするため、本発明者らは、可能性あるｍｉＲ−２９ａ〜ｃ標的を特定するのにコンピュータによる予測を利用した。Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ予測ウェブサイトは、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの可能性ある標的として、コラーゲン、メタロペプチド、及びインテグリンをコードする予期せぬ多数の線維症関連ｍＲＮＡを示した（targetscan.orgの世界的なウェブ）。ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの下方制御が心臓線維症を調節し得るか否かを決定するために、本発明者らは、心臓でのＥＣＭ産生に関与することが予測される標的に焦点を当てた。エラスチン（ELN）、フィブリリン１（FBN1）、コラーゲンＩ型、α１及びα２（COL1A1、COL1A2）、及びコラーゲンＩＩＩ型、α１（COL3A1）は全て、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃに関する１つ又は複数の保存された潜在的なシード配列を含有する（図２０Ａ）。

【0248】

ｍｉＲＮＡは、それらの標的ｍＲＮＡの定常状態レベル並びに翻訳を下方制御するので、本発明者らは、予測したｍｉＲ−２９ａ〜ｃ ｍＲＮＡ標的の発現を分析した。ＭＩから３日後の心臓試料での、心臓線維症に関するこれら重要な調節遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、梗塞領域におけるｍｉＲ−２９ａ〜ｃの特定の下方制御が、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、及びＦＢＮ１の発現の増加に相関することを示した。対照的に、ＥＬＮは、境界領域で変化しないように見え、遠隔心筋の増大さえ示した（図２０Ｂ）。

【0249】

ＣＭＶ駆動式発現プラスミドを使用して、本発明者らは、予測されるｍｉＲ−２９ａ〜ｃ標的の３’−ＵＴＲを含有するルシフェラーゼ発現プラスミドにより、ＣＯＳ細胞においてｍｉＲ−２９ｂ−１及びｍｉＲ−２９ａを過発現させた（図２０Ｃ）。多量のＣＭＶ駆動式ｍｉＲ−２９ｂ−１／ｍｉＲ−２９ａは、ルシフェラーゼ活性に用量依存性の低下をもたらし、一方、同量のｍｉＲ−２０６は、対照として効果を発揮せず（図２０Ｃ〜Ｄ）、これらｍＲＮＡが、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃによる抑制のための標的であることを実証した。

【0250】

(実施例4)
心臓線維芽細胞でのｍｉＲ−２９ａ〜ｃの調節
心臓線維症は、欠陥を有する心臓に典型的に見られるリモデリングプロセスの主な態様である。線維芽細胞の増殖及びＥＣＭ成分の多量の沈着は、心筋の硬直及び拡張期不全をもたらす。形質転換増殖因子β（TGFβ）は、心臓でのコラーゲンの産生及び沈着で主要な役割を演じることが示され、線維芽細胞から筋線維芽細胞への形質転換を誘発する（Border及びNoble、1994）。ＴＧＦβに曝された心臓線維芽細胞に関するリアルタイムＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現の低下を明らかにし、ＭＩ後のｍｉＲ−２９ａ〜ｃの減少はＴＧＦβ調節され得ることを示唆している（図２１Ａ）。興味深いことに、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）のようなナトリウム利尿ペプチドは、線維症及び筋線維芽細胞の変換に関連したＴＧＦβ調節遺伝子発現を阻害することが示されている（Kapounら、2004）。これに関して、本発明者らは、心臓特異的ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ−２０８に欠けるマウスが心臓線維症及びリモデリングに対して耐性があり、ベースラインでＢＮＰの高い発現を示すことを、先に報告した（van Rooijら、2007）。ＢＮＰはＴＧＦβの作用に拮抗することが知られているので、本発明者らは、これらマウスにおける高いＢＮＰレベルによって、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの発現が増大し得ると推測した。確かに、ノーザン分析は、ｍｉＲ−２０８を除去した後に、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ発現で用量依存的な増加を示したが、これはＢＮＰの高い発現レベルと一致するものであった（図２１Ｂ）。これらのデータは、ＴＧＦβが、心筋細胞によって分泌されたＢＮＰによって阻害することができる少なくとも部分的にはｍｉＲ−２９ａ〜ｃのレベルの低下を通して、線維芽細胞でコラーゲン関連遺伝子の発現を誘発することを示す。

【0251】

(実施例5)
ｍｉＲ−２９ａ〜ｃのｉｎ ｖｉｖｏノックダウンは、線維症及びコラーゲン遺伝子の発現を誘発する。
コラーゲン発現の負のレギュレーターとしての、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの潜在的な役割をさらに探求するために、本発明者らは、ｍｉＲ−２９ｂの成熟ｍｉＲＮＡ配列に相補的なコレステロール修飾オリゴヌクレオチドを使用して、ｍｉＲ−２９ｂをｉｎ ｖｉｖｏでノックダウンし（抗miR-29b）、負の対照として生理食塩液又は４塩基ミスマッチ含有するオリゴヌクレオチドを用いた（mm miR-29b）（図２２Ａ）。抗ｍｉＲ−２９ｂを尾静脈に１回注射（８０ｍｇ／ｋｇ）してから３日後、本発明者らは、試験をした全ての組織でｍｉＲ−２９ｂ発現の劇的な減少を観察した（図２２Ｂ）。対照的に、同等の用量のｍｍ ｍｉＲ−２９ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理食塩液の対照に比べ、ｍｉＲ−２９ｂの発現レベルに対して効果を発揮しなかった。抗ｍｉＲ−２９ｂによるノックダウンは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのレベルが抗ｍｉＲとｍｍ処理動物との間で同等のままであるので、成熟ｍｉＲＮＡに特異的であるように見えた。肝臓及び腎臓でのノックダウンは完了したように見えたが、低レベルのｍｉＲ−２９ｂが、心臓及び肺では検出可能のままであった（図２２Ｂ）。

【0252】

その他のｍｉＲ−２９メンバーは、ｍｉＲ−２９ｂに対して高い配列相同性を共有するので、抗ｍｉＲ−２９ｂに応答するｍｉＲ−２９ａ及びｃの発現も試験をした。肝臓及び腎臓で著しいノックダウン（特に、miR-29cに関して）が検出されたが、心臓発現は、変化したようには見えなかった（図２３）。リアルタイムＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−２９ｂノックダウンが、特に肝臓でコラーゲン遺伝子の発現を誘発するのに十分であることを示したが、この効果は、ミスマッチ対照では存在しなかった（図２２Ｃ）。

【0253】

ｍｉＲ−２９ｂの心臓ノックダウンを高めるために、本発明者らは、２日連続して静脈内にオリゴヌクレオチド８０ｍｇ／ｋｇを注射し、３週間後に材料を収集した。ノーザン分析は、ｍｍ ｍｉＲ−２９ｂ注射後に見られる発現レベルに比べ、抗ｍｉＲ−２９ｂに応答した腎臓及び肝臓におけるｍｉＲ−２９ｂの完全なノックダウンを示した。ｍｉＲ−２９ｂの心臓レベルも劇的に低下したが、肺におけるｍｉＲ−２９ｂの発現は、抗ｍｉＲ−２９ｂによって影響を受けないように見えた（図２２Ｄ）。心臓内のコラーゲン発現は、ｍｉＲ−２９ｂ阻害に応答して増加した（図２２Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでのコラーゲン遺伝子発現の負のレギュレーターとしての、ｍｉＲ−２９ｂの機能を示し、それによって、心臓及び肝臓でのコラーゲン沈着及び線維症に影響を及ぼす。

【0254】

(実施例6)
ｍｉＲ−２９ａ〜ｃ模倣体によるコラーゲン発現の下方制御
ｍｉＲ−２９ａ〜ｃの過発現によってコラーゲン発現を低下させることが可能か否かを決定するために、本発明者らは、線維芽細胞をｍｉＲ−２９ｂ模倣体に曝した。線維芽細胞培養物中のｍｉＲ−２９ｂ発現のレベルは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣体に曝してから３日後に、４００倍程度に増加した（図２２Ｆ）。ｍｉＲ−２９ａ発現は影響を受けず、ｍｉＲ−２９ｃ発現は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣体によってごくわずかしか増加しなかった（図２２Ｆ）。リアルタイムＰＣＲ分析は、コラーゲン遺伝子の発現が、ｍｉＲ−２９ｂ模倣体に応答して減少することを示した（図２２Ｇ）。しかし、コラーゲン発現の減少の大きさは、ｍｉＲ−２９ｂの発現の増加に比べると中程度であり、ｍｉＲ−２９ａ〜ｃレベルはコラーゲンレベルの唯一の決定因子ではないことが示される。

【0255】

本明細書に論じられ引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示され特許請求の範囲に記載される組成物及び方法の全ては、本発明の開示に照らして過度な実験を行うことなくなされかつ実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して述べてきたが、当業者なら、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記述される組成物及び方法と、方法の工程又は工程の順序とに、変更を加えることができることが明らかにされよう。より具体的には、化学的にかつ生理学的に関連しているある薬剤を、本明細書に記載される薬剤の代わりに用いることができ、それと共に同じ、あるいは同様の結果が実現できることが明らかにされよう。当業者に明らかなそのような類似する置換例及び変更例の全ては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念の範囲内であると見なされる。

【0256】

参考文献
以下の参考文献は、これらが本明細書に記述されるものを補う例示的な手順又はその他の詳細を提供する範囲まで、参照により本明細書に特に組み込む。
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【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]