特許 5979318 試薬容器、試薬入り試薬容器、反応ユニット、および分析システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5979318

(24)【登録日】2016年8月5日

(45)【発行日】2016年8月24日

(54)【発明の名称】試薬容器、試薬入り試薬容器、反応ユニット、および分析システム

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/75 20060101AFI20160817BHJP

   G01N 21/76 20060101ALI20160817BHJP

   G01N 1/00 20060101ALI20160817BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/75 D

   G01N21/76

   G01N1/00 101H

【請求項の数】11

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2015-535636(P2015-535636)

(86)(22)【出願日】2014年12月24日

(86)【国際出願番号】JP2014084151

(87)【国際公開番号】WO2015098967

(87)【国際公開日】20150702

【審査請求日】2015年7月30日

(31)【優先権主張番号】特願2013-265683(P2013-265683)

(32)【優先日】2013年12月24日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000219451

【氏名又は名称】東亜ディーケーケー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108578

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 詔男

(74)【代理人】

【識別番号】100106057

【弁理士】

【氏名又は名称】柳井 則子

(72)【発明者】

【氏名】荒川 智

(72)【発明者】

【氏名】八幡 悟史

(72)【発明者】

【氏名】長峯 秀和

【審査官】 ▲高▼場 正光

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５３５４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１８３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−８８３９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０６９３０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １／００ − Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｃ１２Ｍ １／００ − Ｃ１２Ｍ ３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００ − Ｃ１２Ｑ ３／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

軸方向の一端が第一の開口端とされ、他端が第二の開口端とされているシリンジと、該シリンジ内を摺動可能なプランジャを備え、
前記プランジャは、前記シリンジの内面に摺接する摺接部と、前記シリンジの内面に摺接せず、かつ前記摺接部に囲まれている試薬保持部とを有し、
前記試薬保持部は、前記シリンジの内部から、前記シリンジの第一の開口端の外部まで移動可能とされていることを特徴とする試薬容器。

【請求項2】

前記シリンジの側面に試薬供給孔が形成され、該試薬供給孔は、前記試薬保持部が前記シリンジの内部に位置する状態で、前記試薬保持部と連通可能とされている請求項１に記載の試薬容器。

【請求項3】

前記シリンジは、軸方向の中間部に内側に突出する突出部を有する請求項１または２に記載の試薬容器。

【請求項4】

さらに、弾性部材を備え、
前記試薬保持部を前記シリンジの第一の開口端の外部に移動させたとき、
前記弾性部材は、前記プランジャに、前記第二の開口端側に移動させる付勢力を与える請求項１〜３のいずれか一項に記載の試薬容器。

【請求項5】

前記シリンジは、第二の開口端またはその近傍に、外側に突出する鍔部を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の試薬容器。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項に記載の試薬容器と、前記試薬保持部に保持された試薬を備えることを特徴とする試薬入り試薬容器。

【請求項7】

請求項１〜５のいずれか一項に記載の試薬容器と、上端が開口端とされている有底筒状の反応容器とを備え、
前記試薬容器は、前記シリンジの第一の開口端が前記反応容器の軸方向中間部に達するように、前記第一の開口端側から前記反応容器に挿入可能とされていることを特徴とする反応ユニット。

【請求項8】

前記試薬容器の前記試薬保持部に試薬が保持されている請求項７に記載の反応ユニット。

【請求項9】

前記反応容器内に第一試薬が、前記試薬容器の試薬保持部内に第二試薬が、各々保持されている請求項７に記載の反応ユニット。

【請求項10】

請求項８に記載の反応ユニットと、前記反応容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記試薬容器を前記反応容器に挿入した状態で、前記試薬保持部を前記シリンジの第一の開口端の外部に移動させて予め前記反応容器に導入された試料液に接触させ、前記試薬を反応させる工程と、
前記試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の分析システム。

【請求項11】

請求項９に記載の反応ユニットと、前記反応容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記反応容器に導入された試料液と、前記第一試薬を反応させる工程と、
前記試薬容器を前記反応容器に挿入した状態で、前記試薬保持部を前記シリンジの第一の開口端の外部に移動させて前記第一試薬と反応後の試料液に接触させ、前記第二試薬を反応させる工程と、
前記第二試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の分析システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試薬容器、試薬入り試薬容器、反応ユニット、および分析システムに関する。
本発明は、２０１３年１２月２４日に日本国に出願された、特願２０１３−２６５６８３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

エンドトキシン、βグルカン等の微生物夾雑物を高感度で検出する方法として、試料液に、微生物夾雑物によって活性化する試薬、および活性化された試薬により発光基質を遊離する合成基質、を反応させる工程と、発光試薬を作用させて発光基質が遊離したか否かを検出する工程を順次行う技術が提案されている（特許文献１、２）。
この技術では、少なくとも発光基質を遊離させる工程と発光試薬の添加工程の各工程を順次行う二段反応とすることが求められ、少なくとも２〜３回のピペット操作が必要である。そのため、試料液に外部の微生物夾雑物の混入が起こるおそれがあり、高感度測定には不向きであると共に、操作も煩雑であった。また、発光試薬等は、時間経過と共に失活するため用時調製が必要であり、特許文献１、２のような測定方法は自動化も困難であった。

【0003】

そこで、特許文献３では、容器内に試薬を固定し、導入した試料液で試薬を溶解して反応させる技術が提案されている。特許文献３では、発光基質を遊離させる工程と発光試薬の添加工程を順次行うため、隔膜で仕切られた複数の反応室を有する容器を用いることが提案されている（特許文献３の図８等）。そして、まず、発光基質を遊離させるために必要な試薬を固定した反応室に試料液を導入して反応させた後、隔膜に針等で孔を空け、この孔を通して試料液を発光試薬が固定された反応室に落下させて発光試薬と反応させることが記載されている。

【0004】

特許文献３には、また、内部に微生物夾雑物によって活性化する試薬を固定した試薬収容カップを配置すると共に、天井部分に合成基質を、底部に発光試薬を各々固定した容器を用いることが提案されている（特許文献３の図１０等）。そして、まず、試薬収容カップに試料液を導入して反応させた後、天地を逆転させて、合成基質が固定された天井部分に試料液を移動させ、その後再度天地を逆転させて、発光試薬が固定された容器底部に試料液を移動させ、順次反応を進めることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第０９／０６３８４０号

【特許文献2】特開２０１０−１８７６３４号公報

【特許文献3】特開２０１２−１３２８７８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかし、特許文献３の隔膜を使用する方法では、特に数１００μＬ程度の少量の試料液を用いる場合、隔膜に孔を空けても試料液が隔膜に付着等して孔から抜けきらない液量が無視できず、高感度な検出が困難であった。
また、特許文献３の図１０等の容器は、内部に試薬収容カップを設けるため、構造が複雑となる上、反応を進めるために転倒動作が必要であるため、自動化も困難であった。さらに、数１００μＬ程度の少量の試料液を用いる場合、容器を転倒させても試料液が試薬収容カップに付着等して移動しきれない液量が無視できず、高感度な検出が困難であった。

【0007】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、液状では不安定な試薬を試料液との反応直前まで密閉状態で保持できる試薬容器と、当該試薬容器に試薬が保持された試薬入り試薬容器を提供することを課題とする。
また、前記試薬容器を用い、安定に保持された試薬を試料液のほぼ全量と反応させることができ、かつ、二段反応も簡便に行うことができる反応ユニットを提供することを課題とする。
また、前記反応ユニットを用い、試料液を高感度かつ簡便に分析することが可能で、かつ、二段反応による分析も簡便に行うことができる分析システムを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記の課題を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］軸方向の一端が第一の開口端とされ、他端が第二の開口端とされているシリンジと、該シリンジ内を摺動可能なプランジャを備え、
前記プランジャは、前記シリンジの内面に摺接する摺接部と、前記シリンジの内面に摺接せず、かつ前記摺接部に囲まれている試薬保持部とを有し、
前記試薬保持部は、前記シリンジの内部から、前記シリンジの第一の開口端の外部まで移動可能とされていることを特徴とする試薬容器。
［２］前記シリンジの側面に試薬供給孔が形成され、該試薬供給孔は、前記試薬保持部が前記シリンジの内部に位置する状態で、前記試薬保持部と連通可能とされている［１］に記載の試薬容器。
［３］前記シリンジは、軸方向の中間部に内側に突出する突出部を有する［１］または［２］に記載の試薬容器。
［４］さらに、弾性部材を備え、
前記試薬保持部を前記シリンジの第一の開口端の外部に移動させたとき、
前記弾性部材は、前記プランジャに、前記第二の開口端側に移動させる付勢力を与える［１］〜［３］のいずれか一項に記載の試薬容器。
［５］前記シリンジは、第二の開口端またはその近傍に、外側に突出する鍔部を有する［１］〜［４］のいずれか一項に記載の試薬容器。
［６］［１］〜［５］のいずれか一項に記載の試薬容器と、前記試薬保持部に保持された試薬を備えることを特徴とする試薬入り試薬容器。
［７］［１］〜［５］のいずれか一項に記載の試薬容器と、上端が開口端とされている有底筒状の反応容器とを備え、
前記試薬容器は、前記シリンジの第一の開口端が前記反応容器の軸方向中間部に達するように、前記第一の開口端側から前記反応容器に挿入可能とされていることを特徴とする反応ユニット。
［８］前記試薬容器の前記試薬保持部に試薬が保持されている［７］に記載の反応ユニット。
［９］前記反応容器内に第一試薬が、前記試薬容器の試薬保持部内に第二試薬が、各々保持されている［７］に記載の反応ユニット。
［１０］［８］に記載の反応ユニットと、前記反応容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記試薬容器を前記反応容器に挿入した状態で、前記試薬保持部を前記シリンジの第一の開口端の外部に移動させて予め前記反応容器に導入された試料液に接触させ、前記試薬を反応させる工程と、
前記試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の分析システム。
［１１］［９］に記載の反応ユニットと、前記反応容器内の試料液を光学的に測定する光学測定手段を備え、
前記反応容器に導入された試料液と、前記第一試薬を反応させる工程と、
前記試薬容器を前記反応容器に挿入した状態で、前記試薬保持部を前記シリンジの第一の開口端の外部に移動させて前記第一試薬と反応後の試料液に接触させ、前記第二試薬を反応させる工程と、
前記第二試薬と反応後の試料液を、前記光学測定手段により測定する工程とを順次行うように構成されたことを特徴とする試料液の分析システム。

【発明の効果】

【0009】

本発明の試薬容器及び試薬入り試薬容器によれば、液状では不安定な試薬を試料液との反応直前まで密閉状態で保持できる。
また、本発明の反応ユニットによれば、安定に保持された試薬を試料液のほぼ全量と反応させることができ、かつ、二段反応も簡便に行うことができる。
また、本発明の分析システムによれば、試料液を高感度かつ簡便に分析することが可能で、かつ、二段反応による分析も簡便に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】一実施形態に係る反応ユニットを示す縦断面図であり、図１（ａ）が試薬容器、図１（ｂ）が反応容器の一態様を示す。

【図2】図１（ａ）のプランジャを示す図で、図２（ａ）が斜視図、図２（ｂ）が側面図、図２（ｃ）が図２（ｂ）のII−II断面図である。

【図3】図１の反応ユニットに試薬を保持させる方法を説明する図で、図３（ａ）が試薬容器１０に第二試薬Ｒ２を保持させる方法を、図３（ｂ）が反応容器５０に第一試薬Ｒ１を保持させる方法を、各々示す。

【図4】図１の反応ユニットを用いた分析システムと、この分析システムを用いて、二段反応後の試料液を光学的に測定する方法を示す図で、図４（ａ）が第一反応工程を、図４（ｂ）が第二反応工程を、図４（ｃ）が測定工程を、各々示す。

【図5】プランジャの変形例を示す図で、図５（ａ）が斜視図、図５（ｂ）が側面図、図５（ｃ）が図５（ｂ）と異なる方向から見た側面図、図５（ｄ）が図５（ｂ）のＶ−Ｖ断面図である。

【図6】プランジャの別の変形例を示す図で、図６（ａ）が斜視図、図６（ｂ）が側面図、図６（ｃ）が図６（ｂ）と異なる方向から見た側面図である。

【図7】プランジャの別の変形例を示す図で、図７（ａ）が斜視図、図７（ｂ）が側面図、図７（ｃ）が図７（ｂ）のＶII−ＶII断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［反応ユニット］
図１は、本発明の一実施形態に係る反応ユニットで、図１（ａ）が試薬容器の一態様、図１（ｂ）が反応容器の一態様を示す。
図１（ａ）に示す試薬容器１０は、シリンジ２０とプランジャ３０と、バネ４０（弾性部材）とから概略構成されている。

【0012】

シリンジ２０は、軸方向の一端が第一の開口端２０aとされ、他端が第二の開口端２０ｂとされ、第一の開口端２０aには開口２１ａを、第二の開口端２０ｂには開口２１ｂを、各々有している。
また、第二の開口端２０ｂには、周方向全体にわたって径方向外側に突出する鍔部２２が設けられている。また、シリンジ２０の内面２０ｃには、径方向内側に周方向全体にわたって突出する突出部２３が設けられている。突出部２３は、シリンジ２０の軸方向の中間部であって、軸方向の中心よりもやや第一の開口端２０ａに近い部分の内面２０ｃに設けられている。

【0013】

突出部２３の径方向内側には、シール材２４が取り付けられている。シール材２４は管状部２４ａと、管状部２４ａの一端側において径方向外側に突出する鍔部２４ｂとから構成されている。管状部２４ａは突出部２３とプランジャ３０のプランジャ軸３１との間に介在し、プランジャ３０との摺面を構成している。また、鍔部２４ｂは突出部２３の第二の開口端２０ｂ側に密着し、バネ４０と突出部２３との間の緩衝体となっている。
また、シリンジ２０の側面には、試薬供給孔２５が形成されている。試薬供給孔２５は、シリンジ２０の軸方向の中間部であって、突出部２３が設けられている部分よりも第一の開口端２０ａに近い部分に形成されている。

【0014】

プランジャ３０は、プランジャ軸３１と、プランジャ軸３１の先端に螺合されたガスケット３２とから構成されている。
図２を用いて詳述するように、プランジャ軸３１は、円柱状の軸本体３１ａと、軸本体３１ａの一方の端部に設けられ、軸本体３１ａよりも大径の略円盤状の押し板３１ｂと、軸本体３１ａの他方の端部に設けられ、ガスケット３２内に挿入される雄ねじ部３１ｃとを有している。
軸本体３１ａと、押し板３１ｂと、雄ねじ部３１ｃは、剛性の材質、例えばポリプロピレン等の樹脂、ガラス、金属により一体成形されている。

【0015】

ガスケット３２は、プランジャ軸３１が挿入される側から、円錐台部３２ａ、第一大径部３２ｂ、小径部３２ｃ、第二大径部３２ｄ、先端部３２ｅを有し、これらが一体に形成されている。
第一大径部３２ｂと第二大径部３２ｄの外径は、シリンジ２０の突出部２３が設けられていない部分の内径と略同一で、これらの側面は、各々シリンジ２０の内面と摺接する第一摺接部３２Ａと第二摺接部３２Ｂとなっている。

【0016】

また、小径部３２ｃの外径は、第一大径部３２ｂと第二大径部３２ｄの外径より小さくシリンジ２０の内面と摺接しない。この小径部３２ｃの側面が、第一大径部３２ｂと第二大径部３２ｄの各々の小径部３２ｃ側の面と共に、第一摺接部３２Ａと第二摺接部３２Ｂに囲まれた凹状の試薬保持部３２Ｃを構成している。なお、小径部３２ｃの両端は、漸次拡径し、第一大径部３２ｂとの境界と第二大径部３２ｄとの境界の各々において、曲面が形成されている。
試薬供給孔２５は、プランジャ３０をガスケット３２がシリンジ２０の突出部２３に当接するまで第二の開口端２０ｂ側に引いた際に、この試薬保持部３２Ｃと連通する位置に形成されている。

【0017】

円錐台部３２ａは第一大径部３２ｂより小径で、かつ第一大径部３２ｂ側の方の径が大きい円錐台状となっている。
先端部３２ｅは、球体を、中心を通らない面で切り取った際の体積の小さい方の形状とされている。この切断面は、第二大径部３２ｄと同径の円形とされ、先端部３２ｅは、この切断面側で第二大径部３２ｄに接続している。
また、円錐台部３２ａから小径部３２ｃの中程にかけて、プランジャ軸３１の雄ねじ部３１ｃが螺合される雌ねじ３２Ｄが形成されている。
ガスケット３２は、弾性ゴムのようなエラストマーで構成されている。ガスケット３２の材質は、耐薬品性、耐寒性を備え、ガス透過性が低いものが好ましい。具体的には、ブチルゴム、テトラフルオロエチレン等のフッ素ゴムが挙げられる。

【0018】

バネ４０は、内側にプランジャ軸３１を挿通するように配置されている。バネ４０は、試薬保持部３２Ｃを第一の開口端２０ａの外部に移動させた際、突出部２３と押し板３１ｂとの間で圧縮され、プランジャ３０に対して、第二の開口端２０ｂ側に移動させる付勢力を与えるようになっている。

【0019】

図１（ｂ）に示す反応容器５０は、上端が開口端５１ａとされた有底筒状の反応容器本体５１と、開口端５１ａの周方向全体にわたって径方向外側に突出する鍔部５２とを有している。
図１（ｂ）では、反応容器５０の開口端５１ａの開口５３を、蓋体５４で閉塞した状態を示している。蓋体５４は、鍔部５２と略同一の外径の蓋部５４ａと、反応容器５０の開口５３に、液密かつ気密に挿入される挿入部５４ｂと、挿入部５４ｂの先端に設けられた複数本（２本）の脚部５４ｃを有し、これらが一体に形成されている。脚部５４ｃの内側は、略円柱状の凹部５４ｄとなっており、脚部５４ｃが凹部５４ｄ側に変形可能であることにより、反応容器５０の開口５３への脚部５４ｃと挿入部５４ｂの挿入が容易となっている。

【0020】

試薬容器１０は、図４（ａ）に示すように、第一の開口端２０a側から反応容器５０に挿入可能とされている。また、シリンジ２０の鍔部２２が反応容器５０の鍔部５２に当接することにより、シリンジ２０の第一の開口端２０aは、反応容器５０の軸方向中間部の位置に留まり、反応容器５０の底部まで到達しないようになっている。
また、図４（ｂ）に示すように、試薬容器１０を反応容器５０に挿入した状態で、プランジャ３０のガスケット３２を、第一の開口端２０aの外部まで移動させ、ガスケット３２を反応容器５０の底部または底部近傍まで到達させられるようになっている。

【0021】

［試薬の保持］
図３は図１の反応ユニットに試薬を保持させる方法を説明する図で、図３（ａ）が試薬容器１０に第二試薬Ｒ２を保持させる方法を、図３（ｂ）が反応容器５０に第一試薬Ｒ１を保持させる方法を、各々示す。

【0022】

図３（ａ）に示すように、第二試薬Ｒ２の保持作業は、試薬容器１０を、試薬供給孔２５を上側とした横置きの状態として行う。また、プランジャ３０を、ガスケット３２がシリンジ２０の突出部２３に当接するまで第二の開口端２０ｂ側に引いた位置とし、試薬供給孔２５が、試薬保持部３２Ｃと連通する状態として行う。
第二試薬Ｒ２の保持作業としては、まず、試薬供給孔２５から試薬保持部３２Ｃに向けて、第二試薬Ｒ２を適当な溶媒（例えば水）に溶解した溶液を充填する。その後、試薬供給孔２５を試薬保持部３２Ｃに連通させたままの状態で凍結乾燥することにより、第二試薬Ｒ２を乾燥状態で試薬保持部３２Ｃに保持させることができる。

【0023】

その後、プランジャ３０を図１（ａ）に示す位置まで移動させると、試薬保持部３２Ｃは、試薬保持部３２Ｃを囲む第一摺接部３２Ａと第二摺接部３２Ｂ、及びシリンジ２０の内面２０ｃで密閉された空間内に収容されるので、保持された第二試薬Ｒ２を、密閉状態で保管することができる。
なお、凍結乾燥後、第二試薬Ｒ２は、試薬保持部３２Ｃだけでなく、シリンジ２０の内面２０ｃにも付着しうる。しかし、プランジャ３０を図１（ａ）に示す位置まで移動させると、シリンジ２０の内面２０ｃにも付着した第二試薬Ｒ２は、第一摺接部３２Ａによって擦り取られる。そして、移動後の試薬保持部３２Ｃと、移動後の試薬保持部３２Ｃに対向するシリンジ２０の内面２０ｃに囲まれた領域まで移動するので、ほぼ全量を試薬保持部３２Ｃとその近傍に保持しておくことができる。
第二試薬Ｒ２を保持させる上記作業は、真空又は不活性ガス雰囲気内で行うことが好ましい。

【0024】

図３（ｂ）に示すように、第一試薬Ｒ１の保持作業は、反応容器５０を、開口端５１ａを上側とした縦置きの状態として行う。
第一試薬Ｒ１の保持作業としては、まず、蓋体５４を外し、開口５３から第一試薬Ｒ１を適当な溶媒（例えば水）に溶解した溶液を充填する。その後、開口５３が外部と連通した状態を保つように、脚部５４ｃの一部が開口端５１ａの外側に露出する程度に蓋体５４を開口５３に挿入した状態で凍結乾燥することにより、第一試薬Ｒ１を乾燥状態で反応容器５０内に保持することができる。
その後、蓋体５４を図１（ｂ）に示す位置まで押し込むと、反応容器５０内に保持された第一試薬Ｒ１を、密閉状態で保管することができる。
第一試薬Ｒ１を保持させる上記作業は、真空又は不活性ガス雰囲気内で行うことが好ましい。

【0025】

［分析システム］
図４は図１の反応ユニットを用いた分析システムと、この分析システムを用いて、二段反応後の試料液を光学的に測定する方法を示す図である。
図４の分析システムは、図１の反応ユニットと光学測定手段５５から構成されている。
光学測定手段５５としては、反応ユニットの反応容器５０内から発せられる光（蛍光や生物発光を含む）を検出する光検出装置、光源と、反応容器５０を透過した光を検出する受光装置とからなる吸光度検出装置、光源と、反応容器５０内で散乱された光を検出する受光装置とからなる散乱光検出装置等を適宜採用できる。
図４の分析システムは、反応の進行を促進するため、反応容器５０を適宜加温する加温手段を備えていてもよい。

【0026】

図４の分析システムは、図示を省略する制御装置により、その動作が制御され、反応ユニットに対して、以下の工程を順次行うようになっている。
（ｉ）反応容器５０に導入された試料液Ｓと、第一試薬Ｒ１を反応させる工程（以下「第一反応工程」という。）。
（ii）試薬容器１０を反応容器５０に挿入した状態で、試薬保持部３２Ｃをシリンジ２０の第一の開口端２０ａの外部に移動させて第一試薬Ｒ１と反応後の試料液Ｓに接触させ、第二試薬Ｒ２を反応させる工程（以下「第二反応工程」という。）。
（iii）第二試薬Ｒ２と反応後の試料液Ｓを、光学測定手段５５により測定する工程（以下「測定工程」という。）。

【0027】

図４の分析システムで上記各工程を行って二段反応を利用した分析を行うためには、第一反応工程に先立ち、以下の準備が必要である。まず、第一試薬Ｒ１が保持され、蓋体５４により密閉された反応容器５０、並びに第二試薬Ｒ２が試薬保持部３２Ｃに保持され、図１（ａ）に示す状態で試薬保持部３２Ｃが密閉された空間に収容された試薬容器１０（試薬入り試薬容器）を用意する。
次に、第一試薬Ｒ１が保持された反応容器５０から蓋体５４を外し、試料液Ｓを入れる。その後、図４（ａ）に示すように、反応容器５０に試薬容器１０を挿入した状態で、分析システムにセッティングする。
ここまでの作業は人手により行うことが好ましいが、分析システムにサンプリング機構を追加して自動化してもよい。反応容器５０に試料液Ｓを導入すると、導入した試料液Ｓによって第一試薬Ｒ１が溶解され、試料液Ｓと第一試薬Ｒ１とが反応可能となる。

【0028】

第一反応工程は、反応ユニットを分析システムにセッティングしてから、次の第二反応工程を開始するまでの間の工程である。
第一反応工程の時間は、反応容器５０に導入された試料液Ｓと第一試薬Ｒ１とを反応させるために必要な反応時間を考慮して適宜設定する。試料液Ｓと第一試薬Ｒ１との反応が速い場合は、システムの動作上物理的に必要な時間のみをとって、次の第二反応工程に移行すればよい。第一反応工程では、反応を促進するため反応容器５０を適宜加温することができる。

【0029】

第二反応工程では、図示を省略する押棒により、プランジャ３０の押し板３１ｂを押してプランジャ３０を押し下げる。これにより、ガスケット３２をシリンジ２０の内部から第一の開口端２０ａの外部まで移動させ、図４（ｂ）に示すように、ガスケット３２の先端を反応容器５０の底部まで到達させる。このようにして、試薬保持部３２Ｃ全体を第一試薬Ｒ１と反応後の試料液Ｓ内に浸漬させる。

【0030】

試薬保持部３２Ｃが第一試薬Ｒ１と反応後の試料液Ｓ内に浸漬されると、試料液Ｓによって第二試薬Ｒ２が溶解され、試料液Ｓと第二試薬Ｒ２とが反応可能となる。なお、第二試薬Ｒ２は、試薬保持部３２Ｃに直接固定されるだけでなく、試薬保持部３２Ｃと試薬保持部３２Ｃに対向するシリンジ２０の内面２０ｃに囲まれた領域にも保持されうる。しかし、この領域内の第二試薬Ｒ２は、第一摺接部３２Ａによって押し出すことができ、ほぼ全量を第一試薬Ｒ１と反応後の試料液Ｓ内に入れ、反応させることができる。

【0031】

プランジャ３０を図４（ｂ）に示す状態に留めておく時間は、第二試薬Ｒ２が溶解されるのに充分であればよく、第二試薬Ｒ２の溶解性が高ければ、プランジャ３０を押し下げた後、直ちに測定工程に移行することができる。
たとえば、蛍光測定や生物発光測定のように、試料液Ｓと第二試薬Ｒ２の反応開始後、検出すべき光の発生が短時間で終了するような反応系の場合、プランジャ３０を図４（ｂ）に示す状態に押し下げた後、直ちに測定工程に移行することが好ましい。
試料液Ｓへの第二試薬Ｒ２の溶解や、試料液Ｓと第二試薬Ｒ２との反応に時間を要する場合は、適宜の待機時間経過後、測定工程に移行する。

【0032】

測定工程では、図示を省略する押棒によるプランジャ３０の押し板３１ｂの押圧を解除する。すると、図４（ｃ）に示すように、図４（ｂ）で圧縮されていたバネ４０の付勢力により押し板３１ｂが第二の開口端２０ｂ側に押し上げられる。これにより、光路を妨げるガスケット３２が反応容器５０の底部から離れ、第二試薬Ｒ２と反応後の試料液Ｓを光学測定手段５５により測定可能となる。
測定工程では、光学測定手段５５により、第二試薬Ｒ２と反応後の試料液Ｓを光学的に測定する。
光学的な測定の種類に特に限定はなく、蛍光検出、生物発光検出、吸光度検出、散乱光検出等を適宜採用できる。

【0033】

反応ユニットが複数ある場合、以上の操作を、各反応ユニットに対して順次行う。
本実施形態によれば、各反応ユニットに導入した試料液について、所定のタイムテーブルに従って分析を行うことにより、光学的測定の条件を容易に均一化できる。そのため、測定条件の変動による検出誤差を排除しやすい。
また、第一試薬Ｒ１と第二試薬Ｒ２は、ほぼ全量が反応容器５０内での反応に使用される。また、試料液Ｓは、反応容器５０に入れた後、他の場所に移動させる必要がない。そのため、試料液Ｓが少量であっても、高い精度でかつ再現性よく分析できる。

【0034】

［プランジャの変形例］
上記実施形態では、試薬容器に用いるプランジャを図２に記載した構造としたが、プランジャの具体的構造に特に限定はなく、図２のプランジャ３０に代えて、例えば、図５〜７に示すプランジャ６０、７０、８０を用いてもよい。

【0035】

図５のプランジャ６０は、プランジャ軸６１と、プランジャ軸６１の先端に螺合されたガスケット６２とから構成されている。
プランジャ軸６１は、円柱状の軸本体６１ａと、軸本体６１ａの一方の端部に設けられ、軸本体６１ａよりも大径の略円盤状の押し板６１ｂと、軸本体６１ａの他方の端部に設けられ、ガスケット６２内に挿入される雄ねじ部６１ｃとを有している。
軸本体６１ａと、押し板６１ｂと、雄ねじ部６１ｃは一体成形されており、図２の軸本体３１ａ、押し板３１ｂ、雄ねじ部３１ｃと同様の材質のものを使用できる。

【0036】

ガスケット６２は、プランジャ軸６１が挿入される側から、円錐台部６２ａ、第一大径部６２ｂ、側壁部６２ｃ、第二大径部６２ｄ、先端部６２ｅを有し、これらが一体に形成されている。
第一大径部６２ｂと第二大径部６２ｄの外径は、シリンジ２０の突出部２３が設けられていない部分の内径と略同一で、これらの側面は、各々シリンジ２０の内面と摺接する第一摺接部６２Ａと第二摺接部６２Ｂとなっている。

【0037】

側壁部６２ｃは、第一大径部６２ｂ及び第二大径部６２ｄと同径の円柱を、底面の中心を通らない縦方向の面で切断した際の体積の小さい方の形状とされている。残された円柱の側面に該当する部分は、シリンジ２０の内面と摺接する第三摺接部６２Ｃとなっている。また、円柱の切断面に該当する側面は、シリンジ２０の内面と摺接しない。この側面が、第一大径部６２ｂと第二大径部６２ｄの各々の側壁部６２ｃ側の面と共に、第一摺接部６２Ａと第二摺接部６２Ｂと第三摺接部６２Ｃに囲まれた凹状の試薬保持部６２Ｄを構成している。
試薬供給孔２５は、プランジャ６０をガスケット６２がシリンジ２０の突出部２３に当接するまで第二の開口端２０ｂ側に引いた際に、この試薬保持部６２Ｄと連通する位置とされている。

【0038】

円錐台部６２ａは第一大径部６２ｂより小径で、かつ第一大径部６２ｂ側の方の径が大きい円錐台状となっている。
先端部６２ｅは、球体を、中心を通らない面で切り取った際の体積の小さい方の形状とされている。この切断面は、第二大径部６２ｄと同径の円形とされ、先端部６２ｅは、この切断面側で第二大径部６２ｄに接続している。
また、円錐台部６２ａ内に、プランジャ軸６１の雄ねじ部６１ｃが螺合される雌ねじ６２Ｅが形成されている。
ガスケット６２は、図２のガスケット３２と同様のエラストマーで構成することができる。

【0039】

図６のプランジャ７０は、プランジャ軸７１と、プランジャ軸７１の先端に螺合されたガスケット７２とから構成されている。
プランジャ軸７１は、円柱状の軸本体７１ａと、軸本体７１ａの一方の端部に設けられ、軸本体７１ａよりも大径の略円盤状の押し板７１ｂと、軸本体７１ａの他方の端部に設けられ、ガスケット７２内に挿入される雄ねじ部７１ｃとを有している。
軸本体７１ａと、押し板７１ｂと、雄ねじ部７１ｃは一体成形されており、図２の軸本体３１ａ、押し板３１ｂ、雄ねじ部３１ｃと同様の材質のものを使用できる。

【0040】

ガスケット７２は、プランジャ軸７１が挿入される側から、円錐台部７２ａ、貫通孔形成部７２ｂ、先端部７２ｃを有し、これらが一体に形成されている。
貫通孔形成部７２ｂは、外径がシリンジ２０の突出部２３が設けられていない部分の内径と略同一の円柱に、円柱状の貫通孔７２ｄが径方向に形成された構造とされている。
貫通孔形成部７２ｂの貫通孔７２ｄが形成されている以外の部分の側面は、シリンジ２０の内面と摺接する摺接部７２Ａとなっている。貫通孔形成部７２ｂの貫通孔７２ｄが形成された内面は、シリンジ２０の内面と摺接しない試薬保持部７２Ｂとされており、摺接部７２Ａに囲まれている。

【0041】

プランジャ３０に代えてプランジャ７０を用いる場合、試薬供給孔２５は、プランジャ７０をガスケット７２がシリンジ２０の突出部２３に当接するまで第二の開口端２０ｂ側に引いた際に、この試薬保持部７２Ｂ（貫通孔７２ｄ）と連通する位置に形成されている。
なお、プランジャ７０を用いる場合、シリンジ２０の径方向の対向する２カ所に、試薬保持部７２Ｂ（貫通孔７２ｄ）と連通する試薬供給孔を各々形成してもよい。

【0042】

円錐台部７２ａは貫通孔形成部７２ｂより小径で、かつ貫通孔形成部７２ｂ側の方の径が大きい円錐台状となっている。
先端部７２ｃは、球体を、中心を通らない切断面で切り取った際の体積の小さい方の形状とされている。この切断面は、貫通孔形成部７２ｂと同径の円形とされ、先端部７２ｃは、この切断面側で貫通孔形成部７２ｂに接続している。
また、円錐台部７２ａ内に、プランジャ軸７１の雄ねじ部７１ｃが螺合される雌ねじ７２Ｄが形成されている。
ガスケット７２は、図２のガスケット３２と同様のエラストマーで構成することができる。

【0043】

図７のプランジャ８０は、プランジャ軸８１と、プランジャ軸８１の一方の端部側に取り付けられたＯリング８２a、８２ｂと、プランジャ軸８１の他方の端部に螺合された押し板８３とから構成されている。
プランジャ軸８１は、円柱状の軸本体８１ａと、軸本体８１ａの一方の端部近傍に設けられたＯリング取り付け板８１ｃと、軸本体８１ａの一方の端部に設けられたＯリング取り付け板８１ｄとを有している。Ｏリング取り付け板８１ｃとＯリング取り付け板８１ｄは、各々軸本体８１ａの軸方向と垂直な面を有する略円盤状で、その周面にＯリングを取り付けるための溝が形成されている。
軸本体８１ａと、Ｏリング取り付け板８１ｃと、Ｏリング取り付け板８１ｄは一体成形されており、図２の軸本体３１ａ、押し板３１ｂ、雄ねじ部３１ｃと同様の材質のものを使用できる。軸本体８１ａの他方の端部には、雌ねじ８１ｂが形成されている。
また、押し板８３は、軸本体８１ａよりも大径の略円盤状の押し板本体８３ａと、押し板本体８３ａに垂設され、雌ねじ８１ｂと螺合する雄ねじ部８３ｂを有している。
押し板本体８３ａと雄ねじ部８３ｂは一体成形されており、図２の軸本体３１ａ、押し板３１ｂ、雄ねじ部３１ｃと同様の材質のものを使用できる。
Ｏリング８２a、８２ｂは、図２のガスケット３２ｃと同様の材質のものを使用できる。

【0044】

Ｏリング８２a、８２ｂは、各々Ｏリング取り付け板８１ｃ、８１ｄに取り付けられている。Ｏリング８２a、８２ｂは、Ｏリング取り付け板８１ｃ、８１ｄに取り付けられた状態において、その外径が、シリンジ２０の突出部２３が設けられていない部分の内径と略同一となるように構成されている。Ｏリング８２aの外周は、シリンジ２０の内面と摺接する第一摺接部８２Ａとなり、Ｏリング８２ｂの外周は、シリンジ２０の内面と摺接する第二摺接部８２Ｂとなっている。
また、第一摺接部８２Ａと第二摺接部８２Ｂに挟まれた部分（囲まれた部分）は、試薬保持部８２Ｃとされている。試薬保持部８２Ｃはシリンジ２０の内面と摺接しない。

【0045】

プランジャ３０に代えてプランジャ８０を用いる場合、試薬供給孔２５は、プランジャ８０をＯリング取り付け板８１ｃがシリンジ２０の突出部２３に当接するまで第二の開口端２０ｂ側に引いた際に、この試薬保持部８２Ｃと連通する位置に形成されている。
プランジャ８０をシリンジ２０内に配置するためには、押し板８３をプランジャ軸８１から外した状態でプランジャ軸８１をシリンジ２０の第一の開口端２０a側から挿入し、その後、押し板８３をプランジャ軸８１に螺合すればよい。

【0046】

プランジャ３０とプランジャ８０では、周方向全体にわたる試薬保持部が形成されているが、プランジャ６０とプランジャ７０の例から理解できるように、試薬保持部は、周方向全体にわたっていなくともよい。
また、上記各プランジャでは、摺接部の一部または全部が、試薬保持部を軸方向において挟む二カ所にあり、各々が、周方向全体にわたって連続している。
しかし、試薬保持部と摺接部との関係は、そのような態様には限定されず、試薬保持部が摺接部に囲まれており、試薬保持部とシリンジ２０の内壁との間に、密閉空間を形成できるようになっていればよい。例えばプランジャ６０の側壁部６２ｃの側面に、試薬保持部６２Ｄから離間した位置において、縦方向の溝が形成されていても差し支えない。また、プランジャ７０の貫通孔形成部７２ｂの側面に、貫通孔７２ｄから離間した位置において、縦方向の溝が形成されていても差し支えない。
また、プランジャ３０、プランジャ６０、プランジャ７０では、ガスケットが螺合によりプランジャ軸に取り付けられた構成としたが、例えば嵌め合いにより取り付けられていてもよい。同様に、プランジャ８０では、押し板８３が螺合によりプランジャ軸８１に取り付けられた構成としたが、例えば嵌め合いにより取り付けられていてもよい。

【0047】

［その他の態様］
上記実施形態では、シリンジに試薬供給孔が形成された構成としたが、試薬供給孔は必須ではない。試薬供給孔を形成しない場合、試薬保持部の一部または全部を、シリンジの第一の開口端の外部に移動させた状態で試薬の溶液を試薬保持部に向けて供給し、凍結乾燥等により保持させればよい。

【0048】

また、上記実施形態では、シリンジの中間部において内側に突出する突出部を周方向全体にわたって連続的に設ける構成としたが、周方向の一部に断続的に設ける構成としてもよい。例えば、周方向の４カ所に９０゜間隔で、凸部を設ける構成が考えられる。シリンジの中間部において内側に突出する突出部を連続的又は断続的に周方向に設けることにより、試薬保持部に試薬を保持させる際、試薬供給孔との位置合わせが容易となる。また、試薬保持部を第一の開口端の外部に移動させたとき、バネの一端側の位置を固定することによりバネを圧縮することができる。
シリンジの中間部において内側に突出する突出部は必須ではない。これを設けない場合は、試薬供給孔との位置合わせは目視により行えばよい。また、以下に説明するように、内側にプランジャ軸３１を挿通するように配置したバネを圧縮することは必須でない。

【0049】

試薬保持部をシリンジの第一の開口端の外部に移動させたとき、プランジャに、第二の開口端側に移動させる付勢力を与える弾性部材は、内側にプランジャ軸３１を挿通するように配置したバネ４０に限定されない。例えば、押し板３１ｂを上方から引き上げるように配置されたバネやゴム等の弾性部材を用いることができる。この場合、これらの弾性部材が伸張することにより、プランジャに、第二の開口端側に移動させる付勢力を与えることができる。

【0050】

また、試薬保持部をシリンジの第一の開口端の外部に移動させたとき、プランジャに、第二の開口端側に移動させる付勢力を与える弾性部材は必須ではない。例えば、押し板３１ｂを押し下げる押棒の先端を押し板３１ｂに固定し、この押棒を引き上げることにより、ガスケット３２を待避させ、第二反応工程から測定工程に移行することができる。

【0051】

さらに、プランジャを押し下げたままでも測定工程に支障が生じなければ、測定工程を行うためにプランジャを上に戻す必要もない。例えば、図７のプランジャ８０のプランジャ軸８１を透明材料で形成した場合、光の透過を妨げるのはＯリング８２a、８２ｂのみとなるので、試薬保持部８２Ｃ近傍で発生する蛍光や生物発光等の検出を実質的に妨げない。この場合、プランジャ８０を上に戻さなくとも、支障なく測定工程を行える。

【0052】

また、上記実施形態では、シリンジ２０の第二の開口端２０ｂに鍔部２２を設けたが、鍔部２２を設ける位置は、第二の開口端２０ｂに限定されず、例えば、第二の開口端２０ｂの近傍（第二の開口端２０ｂから、やや第一の開口端２０ａ側）に設けてもよい。
また、鍔部２２の形状にも特に限定はなく、例えば、円盤の周縁に、下方に垂下する鍵状部を設け、反応容器５０の上端と勘合するようにしてもよい。この場合、反応容器５０に鍔部５２がなくとも、安定的に試薬容器１０を支持することができる。
さらに、シリンジ２０の鍔部２２は必須ではない。鍔部２２がない場合は、別途の支持手段で、試薬容器１０の第一の開口端２０ａが反応容器５０の底部に達しないよう、支持すればよい。

【0053】

また、上記実施形態では、反応容器５０に第一試薬Ｒ１を保持させ、二段反応を行わせる態様としたが、反応容器５０に試薬を保持させることは必須でない。反応容器５０に試薬を保持しない場合、試料液Ｓと第二試薬Ｒ２との一段反応をさせることができる。また、試料液Ｓは、予め、第一試薬Ｒ１と反応させたものであってもよい。また、試料液Ｓと第一試薬Ｒ１を、共に手作業で反応容器５０に導入してもよい。これらの場合、反応容器５０に試薬を保持させなくとも、二段反応が可能となる。

【0054】

［エンドトキシンの測定］
本発明の試薬容器、試薬入り試薬容器、反応ユニット、および分析システムを、エンドトキシンの測定に適用する場合、反応容器に保持する第一試薬Ｒ１としては、エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子と、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質を含有する試薬を用いる。また、試薬容器に保持する第二試薬Ｒ２としては、発光酵素および発光反応に必要な他の化合物を含有する試薬を用いる。
あるいは、エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子を、反応容器に保持する第一試薬Ｒ１として用い、ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質を含有する試薬と発光酵素および発光反応に必要な他の化合物を含有する試薬とを、試薬容器に保持する第二試薬Ｒ２として用いてもよい。

【0055】

エンドトキシンとの結合により活性化されるＣ因子を含有する試薬としては、カブトガニ血球抽出成分（リムルス試薬）を好適に使用できる。
ペプチドに発光基質が結合してなる発光合成基質は、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子、および凝固酵素の少なくともいずれか１種の作用（プロテアーゼ活性）により、発光基質とペプチドとの結合が切断される構造を有するものである。活性型Ｃ因子は、Ｃ因子が活性化されることにより生成される。活性型Ｂ因子は、活性型Ｃ因子の作用によりＢ因子が活性化されて生成される。凝固酵素は、活性型Ｂ因子や活性型Ｃ因子の作用により前凝固酵素が活性化されて生成される。
発光基質としては、アミノルシフェリンが好適に使用できる。発光基質と結合するペプチドとしては、該ペプチドのＣ末端におけるアミノルシフェリンとのアミド結合が、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子および凝固酵素の少なくともいずれか１種のプロテアーゼ活性により切断されるアミノ酸配列からなるものであればよい。
なお、試料液中の塩分濃度に起因する誤差を解消するため、第一試薬Ｒ１中に、ＮａＣｌを添加しておいてもよい。
発光酵素は、発光合成基質から遊離される発光基質の生物発光を触媒とし、光を発生させる酵素である。発光基質がアミノルシフェリンである場合の発光酵素はルシフェラーゼであり、発光反応に必要な他の化合物は、ＡＴＰおよび２価金属イオンである。

【0056】

具体的な試薬容器及び反応ユニットの構造、および分析システムの具体的手順は、上記で説明したものを、好適に適用できる。
エンドトキシンの測定のように、発光を利用する測定では、第二試薬Ｒ２を保持した試薬保持部を試料液に浸漬してから、発光反応を光学的に検出するまでの時間は短い方が好ましい。そのため、第二反応工程でプランジャ３０を押し下げてから、押し下げを解除して測定工程に移行する動作は、できるだけ速やかに行うことが好ましい。また、光学測定手段により発光反応の検出が可能な位置に容器ユニットを配置してから、プランジャ３０の押し下げを行うことが好ましい。

【0057】

第一試薬Ｒ１がカブトガニ血球抽出成分（リムルス試薬）とペプチドにアミノルシフェリンが結合している合成基質との混合試薬であり、第二試薬Ｒ２がルシフェラーゼとＡＴＰおよび２価金属イオンを含む混合試薬である場合、第一試薬Ｒ１を保持した反応容器に試料液を最初に導入した後、３７℃で１５〜３０分間程度インキュベートすることが好ましい。
その後、プランジャ３０を押し下げて第二試薬Ｒ２を保持した試薬保持部を試料液に浸漬し、ルシフェリンとルシフェラーゼの発光反応（生物発光反応）を行わせる。発光反応の際の温度は、たとえば室温（２５℃）とすることができる。また、発光反応の反応時間、すなわち、プランジャ３０を押し下げてから、押し下げを解除して、発光反応を光学的に検出するまでの時間は、０秒から１０秒とすることが好ましい。

【産業上の利用可能性】

【0058】

本発明は、エンドトキシン、βグルカン等の微生物夾雑物の検出等、液状では不安定な試薬を用いる分析に好適に使用できる。

【符号の説明】

【0059】

１０…試薬容器、２０…シリンジ、３０…プランジャ、４０…バネ、５０…反応容器、３２Ａ…第一摺接部、３２Ｂ…第二摺接部、３２Ｃ…試薬保持部、５５…光学測定手段、Ｒ１…第一試薬、Ｒ２…第二試薬

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】