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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5980989
(24)【登録日】2016年8月5日
(45)【発行日】2016年8月31日
(54)【発明の名称】有効なコンジュゲートおよび親水性リンカー
(51)【国際特許分類】
C07D 498/18 20060101AFI20160818BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20160818BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20160818BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20160818BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20160818BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20160818BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20160818BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20160818BHJP
【ＦＩ】
C07D498/18 311
A61K39/395 L
A61P35/00
A61P37/02
A61P37/06
A61P31/12
A61P33/00
A61K31/537
C07D498/18CSP
【請求項の数】21
【外国語出願】
【全頁数】47
(21)【出願番号】特願2015-89052(P2015-89052)
(22)【出願日】2015年4月24日
(62)【分割の表示】特願2011-507633(P2011-507633)の分割
【原出願日】2009年4月30日
(65)【公開番号】特開2015-163622(P2015-163622A)
(43)【公開日】2015年9月10日
【審査請求日】2015年5月15日
(31)【優先権主張番号】61/049,289
(32)【優先日】2008年4月30日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】504039155
【氏名又は名称】イミュノジェン・インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100140109
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 新次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100075270
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 泰
(74)【代理人】
【識別番号】100101373
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 茂雄
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100128750
【弁理士】
【氏名又は名称】廣瀬 しのぶ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ラジーヴァ
(72)【発明者】
【氏名】コヴトゥン，エレーナ
(72)【発明者】
【氏名】ウィルヘルム，シャロン・ディー
(72)【発明者】
【氏名】チャリ，ラビ・ヴイ・ジェイ
【審査官】
谷尾 忍
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００７／１４０３７１（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
特表２００５−５１７０３２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｄ ４９８／１８
Ａ６１Ｋ ３１／５３７
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下：
［式中、ｎは１から２０００までの整数であり；ＲはＨであり且つｑは１であるか、またはＲはＣＨ３であり且つｑは２である］
から選択される式により表される化合物。
【化1-1】
【化1-2】
から選択される式により表される化合物。
【請求項2】
【化2】
【請求項3】
ＲはＨであり且つｑは１である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
ｎは１から１４までの整数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項5】
ｎは１から４までの整数である、請求項４に記載の化合物。
【請求項6】
以下：
［式中、ｎ
は１から２０００までの整数であり；ｍＡｂはモノクローナル抗体であり；ｍは２から１５までの整数であり；ＲはＨであり且つｑは１であるか、またはＲはＣＨ３であり且つｑは２である］
より選択される式により表される、細胞結合剤−細胞毒薬コンジュゲート。
【化3-1】
【化3-2】
は１から２０００までの整数であり；ｍＡｂはモノクローナル抗体であり；ｍは２から１５までの整数であり；ＲはＨであり且つｑは１であるか、またはＲはＣＨ３であり且つｑは２である］
より選択される式により表される、細胞結合剤−細胞毒薬コンジュゲート。
【請求項7】
以下：
【化4-1】
【化4-2】
【請求項8】
ＲはＨであり且つｑは１である、請求項６又は７に記載のコンジュゲート。
【請求項9】
ｎは１から１４までの整数である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項10】
ｎは１から４までの整数である、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項11】
前記モノクローナル抗体が、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）モノクローナル抗体、表面再構成一本鎖モノクローナル抗体、または表面再構成モノクローナル抗体フラグメントである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項12】
前記モノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項13】
前記モノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項14】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ドメイン抗体、又は、その抗原結合フラグメントである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項15】
前記モノクローナル抗体が、ＭＹ９、Ｂ４若しくはＣ２４２抗体、又は、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、メソテリン、ｃｒｉｐｔｏ、αｖβ３、αｖβ５、およびαｖβ６インテグリンからなる群から選択される抗原に結合する抗体である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項16】
前記モノクローナル抗体は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、または黒色腫細胞；ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＭＹ９、抗−Ｂ４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、メソテリン、ｃｒｉｐｔｏ、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、Ａｐｏ２、およびＣ２４２抗原のうち１以上を発現する細胞；およびインスリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体、または葉酸受容体を発現する細胞から選択される標的細胞に結合する、請求項６〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項17】
前記腫瘍細胞が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞性肺癌細胞、および精巣癌細胞から選択される、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項18】
有効量の請求項６〜１７のいずれか１項に記載の前記細胞結合剤−細胞毒薬コンジュゲート、その医薬的に許容できる塩または溶媒和物、および医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項19】
医薬組成物であって、前記組成物による処置に対して感受性の疾患を処置するためのものであり、当該医薬組成物は請求項６〜１７のいずれか１項に記載のコンジュゲートを含み、そして患者に非経口で投与される、前記医薬組成物。
【請求項20】
前記疾患が、腫瘍、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、ウイルス感染症、および寄生虫感染症から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項21】
前記腫瘍が、肺、血液、血漿、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌のうち１種類以上から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、米国仮特許出願Ｎｏ．６１／０４９，２８、２００８年４月３０日出願に基づく優先権を主張する。発明の分野
[01] 本発明は、薬物（たとえば細胞毒薬）を細胞結合剤（たとえば抗体）に、リンカーが薬物の活性を増強するのに寄与する様式で連結するための新規リンカーに関する。特に、本発明は新規な親水性リンカーの使用に関するものであり、それらのリンカーは、細胞表面に低い抗原数を発現するものまたは処置に対して耐性である癌細胞を含めた多様な癌細胞タイプにおいて、細胞結合剤−薬物コンジュゲートの力価または有効性を数倍増強する。
【背景技術】
【0002】
[02] 標的特異的療法薬として細胞毒薬の抗体コンジュゲートが開発されつつある。種々の癌細胞表面抗原に対する抗体が、本質的な細胞標的、たとえば下記のものを阻害する種々の細胞毒薬とコンジュゲートされている：微小管（メイタンシノイド類、オーリスタチン類、タキサン類：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２０８，０２０；５，４１６，０６４；６．３３３，４１０；６，４４１，１６３；６，３４０，７０１；６，３７２，７３８；６，４３６，９３１；６，５９６，７５７；７，２７６，４９７）、ＤＮＡ（カリケアマイシン、ドキソルビシン、ＣＣ−１０６５類似体；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４７５，０９２；５，５８５，４９９；５，８４６，５４５；６，５３４，６６０；６，７５６，３９７；６，６３０，５７９）。抗体とこれらの細胞毒薬のうちあるものとのコンジュゲートが癌治療臨床において試験中である(Richart, A. D., and Tolcher, A. W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-255)。
【0003】
[03] 抗体−細胞毒薬コンジュゲートは、一般にまず抗体上の反応性部分、たとえばリジンのアミノ基、またはシステイン基（天然ジスルフィド結合の還元により、または分子生物学的方法を用いて工学的に非天然システイン残基を付加することにより生成）を修飾することにより作製される。たとえば、抗体をこれまでに記載されているヘテロ二官能性リンカー試薬、たとえばＳＰＤＢ、ＳＭＣＣおよびＳＩＡＢ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，９１３，７５８およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５０１６９９３３）でまず修飾して、反応性基、たとえば混合ピリジルジスルフィド、マレイミドまたはハロアセトアミドをもつリンカーを取り込ませる。抗体に取り込まれた反応性リンカー基を、次いで反応性部分、たとえばチオール基を含む細胞毒薬とコンジュゲートさせる。他のコンジュゲーション経路は、チオール反応性基（たとえばハロアセトアミドまたはマレイミド）を含む細胞毒薬誘導体と細胞結合剤上のチオール基との反応によるものである。チオール基は、細胞結合剤、たとえば抗体に、下記により取り込まれる：天然ジスルフィド残基の還元(R. Singh et al., Anal. Biochem., 2002, 304, 147-156)、または取り込まれたジスルフィド部分の還元(ＳＰＤＰ、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートによる取込み、続いてジチオトレイトールによる還元、D. G. Gilliland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, 77, 4539-4543)、または追加の非天然システイン残基の取込み(J. B. Stimmel et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30445-30450)、または２−イミノチオラン(R. Jue et al., Biochemistry, 1978, 17, 5399-5406)もしくはメチル 3-メルカプトプロピオンイミデートエステル(T. P.
King et al., Biochemistry, 1978, 17, 1499-1506)との反応によるチオールの取込み。
【0004】
[04] ジスルフィドまたはチオエーテル結合をもつ抗体−細胞毒薬コンジュゲートは細胞内で、おそらくリソソームにおいて開裂して、有効な細胞毒薬を癌細胞の内部へ送達するであろう(H. K. Erickson et al., 2006, Cancer Research, 66, 4626-4433)。還元性
ジスルフィド結合をもつ抗体−細胞毒薬コンジュゲートは、標的細胞を死滅させるほか、インビトロで、および異種移植モデルにおいてインビボで、抗原陰性細胞と抗原陽性細胞の混合集団内の近接する抗原陰性細胞をも死滅させる；これは、不均一抗原発現を伴う腫瘍内の、抗原を発現しない隣接細胞に対する力価の改善において、標的細胞で放出された細胞毒薬がもつ役割を示唆する(Y. V. Kovtun et al., Cancer Research, 2006, 66, 3214-3221)。
【0005】
[05] 抗体−細胞毒薬コンジュゲートはインビトロ細胞死滅活性およびインビボ抗腫瘍活性を示すが、特に標的癌細胞における抗原発現が低い場合、または標的細胞が処置に対して耐性である場合、それらの力価は多くの症例において減退する。これは臨床状況でしばしば起き、その結果、患者における抗腫瘍活性は低度ないし中等度となる。耐性を回避するために可能性のある方法は、親水性または親油性官能基を保有する新規薬物を合成することである(参照：G. Szokacs et al., Nature Reviews, 5; 219-235, 2006)。しかし、この方法は繁雑であり、幾つかの類似体を合成しなければならず、かつ薬物の構造を修飾するとしばしば生物活性が喪失する。したがって、異なる解決方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２０８，０２０
【特許文献2】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４１６，０６４
【特許文献3】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６．３３３，４１０
【特許文献4】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４４１，１６３
【特許文献5】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，３４０，７０１
【特許文献6】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，３７２，７３８
【特許文献7】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４３６，９３１
【特許文献8】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，５９６，７５７
【特許文献9】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，２７６，４９７
【特許文献10】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４７５，０９２
【特許文献11】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，５８５，４９９
【特許文献12】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８４６，５４５
【特許文献13】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，５３４，６６０
【特許文献14】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，７５６，３９７
【特許文献15】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６３０，５７９
【特許文献16】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，９１３，７５８
【特許文献17】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５０１６９９３３
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Richart, A. D., and Tolcher, A. W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-255
【非特許文献2】R. Singh et al., Anal. Biochem., 2002, 304, 147-156
【非特許文献3】D. G. Gilliland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, 77, 4539-4543
【非特許文献4】J. B. Stimmel et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 30445-30450
【非特許文献5】R. Jue et al., Biochemistry, 1978, 17, 5399-5406
【非特許文献6】T. P. King et al., Biochemistry, 1978, 17, 1499-1506
【非特許文献7】H. K. Erickson et al., 2006, Cancer Research, 66, 4626-4433
【非特許文献8】Y. V. Kovtun et al., Cancer Research, 2006, 66, 3214-3221
【非特許文献9】G. Szokacs et al., Nature Reviews, 5; 219-235, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
[06] 本発明は、薬物を細胞結合剤に連結するための新規リンカーを、リンカーが薬物活性の増強に寄与するように設計することにより、耐性の問題に対処するものである。したがって本発明は薬物を細胞結合剤に連結する様式を改良し、これによって広域の腫瘍にわたって、特に抗原発現の低い腫瘍または薬物耐性腫瘍において有効であるコンジュゲートをリンカー設計により提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
[07] 本発明は、従来のリンカー（たとえばＳＭＣＣ、ＳＩＡＢなど；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５０１６９９３３に記載）を、ポリエチレングリコール［ＰＥＧｎ、（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）］スペーサーの取込みにより修飾して親水性リンカーにした場合、細胞結合剤−薬物コンジュゲートの力価または有効性が、細胞表面に低い抗原数を発現するものを含めた多様な癌細胞タイプにおいて予想外に数倍増強されるという新規所見に基づく。
【0010】
[08] これらのＰＥＧ含有コンジュゲートは予想外に、処置に対して耐性である細胞系に対しても、これまでに記載されているコンジュゲートより有効である。[09] さらに、抗体コンジュゲートの場合、親水性リンカーの取込みにより、高収率で、凝集または沈殿なしに、抗体分子当たり最高１５分子の薬物のコンジュゲーションが可能になった。親水性リンカーによる抗体分子当たり最高１５分子の薬物を含むこれらのコンジュゲートは、高い親和性で標的抗原に結合した（修飾されていない抗体のものと同様に）。
【0011】
[10] したがって本発明は、式（１）の化合物または式（１’）の特定の化合物を提供し：Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ （１）
Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ−Ｚ （１’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合する、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｎは、１から２０００までの整数である。
【0012】
[11] 本発明の他の観点は、式（２）の細胞結合剤−細胞毒薬コンジュゲートまたは式（２’）の特定の化合物であり：ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ］ｍ （２）
［Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （２’）
式中：
ＣＢは、細胞結合剤を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテ
ル結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｍは、２から１５までの整数であり；
ｎは、１から２０００までの整数である。
【0013】
[12] 本発明の他の観点は、式（３）の化合物または式（３’）の特定の化合物であり：Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ （３）
Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ−Ｚ （３’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合する、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物にジスルフィド結合により結合した、脂肪族、非芳香族複数環式または芳香族複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｎは、１から１４までの整数である。
【0014】
[13] 本発明の他の観点は、式（４）の細胞結合剤−細胞毒薬コンジュゲートまたは式（４’）の特定の化合物であり：ＣＢ−（Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ）ｍ （４）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （４’）
式中：
ＣＢは、細胞結合剤を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤にチオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物にジスルフィド結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｍは、３から８までの整数であり；
ｎは、１から１４までの整数である。
【0015】
[14] 本発明のさらに他の観点は、その方法による処置に対して感受性の癌を処置するための方法であって、その必要がある患者に有効量の式（２）または（４）のコンジュゲートを含む組成物を非経口投与することを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図6】[20] 図６は、本発明のＰＥＧ含有ジスルフィド連結した化合物の合成スキームを示す：ａ．）細胞結合剤への１工程コンジュゲーションのためのＰＥＧ含有ジスルフィド連結した化合物の合成；およびｂ．）ヘテロ二官能性ＰＥＧ含有ジスルフィド連結した架橋用化合物の合成。
【図16】[30] 図１６は、本発明のＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミジル連結した化合物の合成スキームを示す：ａ．）１工程コンジュゲーションのためのＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミド連結した化合物の合成；およびｂ．）２工程コンジュゲーションのためのヘテロ二官能性ＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性架橋用化合物の合成。
【図19】[33] 図１９は、本発明のＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオエーテル連結した化合物の合成スキームを示す：ａ．）１工程コンジュゲーションのためのＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミジル連結した化合物の合成；およびｂ．）２工程コンジュゲーションのためのホモ二官能性ＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性架橋用化合物の合成。
【発明を実施するための形態】
【0017】
[53] 本発明は、薬物（たとえば細胞毒薬）にポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシドリンカー（（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）により連結した細胞結合剤（たとえば抗体）のコンジュゲートが、標的癌細胞に対して、一般的な脂肪族リンカーおよび同様な薬物装填量をもつ従来の細胞結合剤−薬物コンジュゲートとの比較に基づいて予想したものより数倍大きい細胞毒性を示すという新規所見を開示する。重要なことに、本発明に記載するコンジュゲートは、細胞毒薬による処置に対する感受性に乏しい多剤耐性（ｍｄｒ）癌細胞に対してきわめて有効または効果的である。癌療法は、種々の化学療法薬による多数ラウンドの処置後にしばしば遭遇する薬物耐性機序を克服するという難関がある。癌細胞にみられる多剤耐性と呼ばれるそのような機序のひとつは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターによる薬物輸出の増強により起きる(C. Drumond, B. I. Sikic, J. Clin. Oncology, 1999, 17, 1061-1070, G, Szokacs et al., Nature Reviews, 5; 219-234, 2006)。これらの薬物耐性機序を克服する療法、たとえば癌細胞によるこの薬物流出を妨害または克服することは、きわめて有用であろう。ＰＥＧリンカーがこれらの耐性細胞に対抗する何らかの利点をもたらすかを試験するために、多剤耐性癌細胞に対する細胞結合剤と細胞毒薬とのＰＥＧ連結コンジュゲートの細胞毒性を評価した。多剤耐性細胞に対するこれらのアッセイにおいて、細胞結合剤と細胞毒薬とのＰＥＧ連結コンジュゲートは、一般的なリンカーから誘導したはるかに効力の低いコンジュゲートと比較して、予想外に有効な多剤耐性細胞死滅を示した。さらに本発明のコンジュゲートは、多剤耐性腫瘍細胞を用いて樹立した動物モデルにおいても、顕著に、より高い抗腫瘍活性を示す。
【0018】
[54] 親水性ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシドリンカー（ＰＥＧまたはＰＥＯ；（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）は、療法用途に望まれる１ｍｇ／ｍｌを超える濃度において９０％を超える高いタンパク質モノマーレベルで、細胞結合剤分子当たり比較的多数の薬物の取込みをも可能にする。さらに、広範な細胞毒薬装填量（細胞結合剤当たり２の少数からたとえば１５の多数までの薬物）をもつ細胞結合剤のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結コンジュゲートは、標的癌細胞に対して、コンジュゲートの薬物装填量の増大に基づく薬物送達の化学量論的増大から予想したものより著しく増強した細胞毒性を示した。ＰＥＧスペーサーを保有する、細胞結合剤と薬物とのコンジュゲートを本発明に記載する；これらは、標的癌細胞に対し、従来法で製造した同様な薬物装填量をもつコンジュゲートと比較して２６０〜６５０倍もの力価増強という超化学量論的増大を示した（たとえば図２９を参照）。
【0019】
[55] したがって、本発明の１観点において、ポリエチレングリコールスペーサー（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎおよび細胞結合剤と反応しうる反応性基を保有するリンカーを含む、薬物を記載する。
【0020】
[56] この観点において特に考慮されるのは、修飾された式（１）の化合物または式（１’）の特定の化合物であり：Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ （１）
Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ−Ｚ （１’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合する、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｎは、１から２０００までの整数である。
【0021】
[57] 好ましくは、Ｙを薬物に結合させる共有結合はチオエーテル結合またはアミド結合である。[58] 好ましくは、ｎは１から１００までの整数である。よりさらに好ましくは、ｎは１から１４までの整数である。最も好ましい観点において、ｎは１から４までの整数である。
【0022】
[59] 本発明の第２観点において、ポリエチレングリコールリンカー（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎによる細胞結合剤と薬物との新規コンジュゲートを記載する。これらのコンジュゲートは、癌細胞に対して、従来のリンカーおよび同等の薬物装填量をもつコンジュゲートより有効である。
【0023】
[60] 好ましい観点において特に考慮されるものは、式（２）の細胞結合剤と薬物とのコンジュゲートまたは式（２’）の特定の化合物であり：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ］ｍ （２）
［Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （２’）
式中：
ＣＢは、細胞結合剤を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｍは、２から１５までの整数であり；
ｎは、１から２０００までの整数である。
【0024】
[61] 好ましくは、共有結合はチオエーテル結合またはアミド結合である。[62] 好ましくは、ｍは３から８までの整数である。
[63] 好ましくは、ｎは１から１００までの整数である。よりさらに好ましくは、ｎは１から１４までの整数である。最も好ましい観点において、ｎは１から４までの整数である。
【0025】
[64] 本発明は、抗体が細胞毒薬にジスルフィド結合により連結した抗体コンジュゲートである場合、このイムノコンジュゲートの力価または有効性の増強において、連結した薬物の個数とポリエチレングリコールスペーサーの長さとの間に重要な相関性があるという新規所見にも基づく。このリンカー設計のさらに他の有益性は、抗体−薬物コンジュゲートの望ましい高モノマー比、および凝集が最少であることである。したがって、１観点において本発明は、ジスルフィド連結したコンジュゲートのためのポリエチレングリコールスペーサーが２〜８のエチレンオキシ単位からなり、連結した薬物の個数が３〜８の範囲である場合、それは抗体−薬物コンジュゲートに最高の生物学的力価または有益性を与え、かつ望ましい高いモノマー含量を与えるという重要な所見に基づく。
【0026】
[65] 好ましい観点において、短いポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＝１−１４）を保有するジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を介して、細胞結合剤と反応しうる官能基と連結した、細胞毒薬を記載する。
【0027】
[66] この観点において特に考慮されるものは、式（３）の修飾された細胞毒性化合物または式（３’）の特定の化合物であり：Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ （３）
Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ−Ｚ （３’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合する、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物にジスルフィド結合により結合した、脂肪族、非芳香族複数環式または芳香族複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｎは、１から１４までの整数である。
【0028】
[67] 好ましくは、ｎは２から８までの整数である。[68] 他の好ましい観点において、ポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＝１−１４）を保有するジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を介して３〜８の狭い薬物装填量で連結した細胞毒薬と薬物とのコンジュゲートを記載する；これは、癌細胞に対して相対的に高い効力の生物活性を示し、かつ最少のタンパク質凝集で、高いコンジュゲーション収率および高いモノマー比の望ましい生化学的特性をもつ。
【0029】
[69] この観点において特に考慮されるものは、式（４）の細胞結合剤と薬物とのコンジュゲートまたは式（４’）の特定の化合物であり：ＣＢ−（Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ）ｍ （４）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （４’）
式中：
ＣＢは、細胞結合剤を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、ジスルフィド結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｍは、３から８までの整数であり；
ｎは、１から１４までの整数である。
【0030】
[70] 好ましくは、ｍは３から６までの整数である。[71] 同様に好ましくは、ｎは２から８までの整数である。
[72] 本発明において、薬物は親油性分子であり、これらは細胞結合剤、たとえば抗体にコンジュゲートすると、タンパク質の凝集または沈殿のためしばしば収量損失が生じる。細胞結合剤当たりの薬物数を増加させると、一般にタンパク質の凝集または沈殿が増悪し、これに伴ってモノマーパーセントが低くなり、収率が低下する。一般的なリンカーについての典型的なコンジュゲート挙動と対比して、ＰＥＧリンカーは、療法用途に有用な１ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度で、細胞結合剤と薬物とのコンジュゲートのモノマーパーセント（＞９０％のモノマー）および収率（＞７０％）において望ましい改良をもたらす。さらに、これらのコンジュゲートは、４℃での長期貯蔵に際して安定である。
【0031】
[73] すべての観点において、“脂肪族単位”はアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であると定義される。アルキル基は脂肪族炭化水素基であり、直鎖または分枝鎖であってよく、好ましくは、鎖または環中に１〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜１０個の炭素原子をもつ。より好ましくは、アルキル基は鎖中に１〜１２個の炭素原子をもつ。“分枝鎖”は、１個以上の低級アルキル基、たとえばメチル、エチルまたはプロピルが線状アルキル鎖に結合していることを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−ペンチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが含まれる。
【0032】
[74] アルケニル基は、炭素−炭素二重結合をもつ脂肪族炭化水素基であり、直鎖または分枝鎖であってよく、好ましくは、鎖中に２〜１５個の炭素原子をもつ。より好ましくは、アルケニル基は鎖中に２〜１２個の炭素原子をもつ；より好ましくは、鎖中に約２〜４個の炭素原子をもつ。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、ｉ−ブテニル、３−メチルブタ−２−エニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルが含まれる。
【0033】
[75] アルキニル基は、炭素−炭素三重結合をもつ脂肪族炭化水素基であり、直鎖または分枝鎖であってよく、好ましくは、鎖中に２〜１５個の炭素原子をもつ。より好ましくは、アルキニル基は鎖中に２〜１２個の炭素原子をもつ；より好ましくは、鎖中に２〜４個の炭素原子をもつ。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル、ヘプチニル、オクチニルおよびデシニルが含まれる。
【0034】
[76] 本明細書中で用いる用語“芳香族単位”は、置換または非置換アリール基を意味し、炭素原子６〜１４個、好ましくは炭素原子６〜１０個の芳香族単環式または多環式炭化水素環系からなる。アリール基の例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。置換基にはアルキル基、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシおよびアルコキシ基が含まれるが、これらに限定されない。
【0035】
[77] ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子が含まれる。フッ素および塩素原子が好ましい。[78] 本明細書中で用いる用語“複素環式単位”は、飽和、部分不飽和または不飽和の非芳香族の安定な３〜１４員、好ましくは５〜１０員の、単環式、二環式または多環式の環において、環の少なくとも１つの員子がヘテロ原子であるもの、あるいは、芳香族の、好ましくは５〜１０員、単環式、二環式または多環式の環であって、少なくとも１個のヘテロ原子を保有するものを表わす。一般に、ヘテロ原子には酸素、窒素、硫黄、セレン、およびリン原子が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄である。
【0036】
[79] 好ましい複素環式単位には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロ−ピラニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ピラニル、イミダゾリニル、ピロリニル、ピラゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ジヒドロ−ピラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリニジニル、ジヒドロチオピラニル、アゼパニル、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、１，２，４−チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾイル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンゾイミダゾリル、およびイソオキサゾリル、ピリジル−Ｎ−オキシド、ならびにフェニル基との縮合により生じる縮合系。
【0037】
[80] ＸおよびＹにより表わされる脂肪族、芳香族および複素環式の単位は、荷電した置換基をもつこともできる。荷電した置換基は、カルボキシレート、スルホネートおよびホスフェート（これらに限定されない）から選択される陰電荷をもつことができ、あるいは、第三級または第四級アミノ基から選択される陽電荷をもつことができる。
【0038】
[81] 本明細書中で用いる“細胞結合剤に連結した”という表現は、適切な連結基またはその前駆体を介して細胞結合剤に結合した少なくとも１つの薬物誘導体を含むコンジュゲート分子を表わす。好ましい連結基は、チオールまたはジスルフィド結合、またはその前駆体である。
【0039】
[82] 本明細書中で用いる、ある基の“前駆体”は、いずれかの脱保護、化学的修飾またはカップリング反応によりその基に導くことができるいずれかの基を表わす。たとえば、チオール前駆体としてのチオエステルまたはチオエーテルにより例示されるように、前駆体は適切に保護された官能基であってもよい。
【0040】
[83] 本明細書中で用いる用語“反応性官能基”は、アミン−、チオール−またはヒドロキシル−反応性官能基を表わす。言い換えると、反応性官能基は、細胞結合剤中に存在するアミン、スルフヒドリル（チオール）またはヒドロキシル基と反応することができる。たとえば、アミン反応性官能基について、官能基は反応性カルボン酸エステル（Ｎ−スクシンイミジル、Ｎ−スルホスクシンイミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタルイミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホ−４−ニトロフェニル、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル、テトラフルオロフェニルエステルを含む）、反応性スルホン酸誘導体、または反応性チオエステルであって、アミド結合を生成することができ；チオール反応性官能基について、官能基はマレイミド、ハロアセトアミド、またはビニルスルホンであって、チオエーテル結合を生成することができ；ヒドロキシル反応性官能基について、官能基は反応性カルボン酸エステルであって、エステル結合を生成することができる。
【0041】
Ａ．修飾した薬物および修飾した細胞結合剤を保有する親水性リンカー[84] リンカーは、薬物、たとえばメイタンシノイドを細胞結合剤に安定な共有結合様式で連結させることができるいずれかの化学物質部分である。リンカーは、薬物または細胞結合剤が活性を維持する条件下で、酸誘発開裂、光誘発開裂、ペプチダーゼ誘発開裂、エステラーゼ誘発開裂、およびジスルフィド結合開裂に対して、感受性または実質的に抵抗性の可能性がある。図１、２および３は、本発明のコンジュゲートの構造式を例示する。
【0042】
[85] 薬物と細胞結合剤の間にリンカーを形成する親水性ＰＥＧ鎖を含む適切な架橋試薬は当技術分野で周知であるか、あるいは市販されている（たとえば、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから、オハイオ州パウエル）。適切なＰＥＧ含有架橋剤は、市販のＰＥＧ自体から、当業者に既知の標準的な合成化学技術を用いて合成することもできる。本明細書に記載の方法により薬物を二官能性のＰＥＧ含有架橋剤と反応させて、式（１）、Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄの化合物にすることができる。たとえば、チオール含有メイタンシノイド薬物を、ＰＥＧスペーサーを保有するビス−マレイミド架橋剤と反応させて、チオエーテル結合によりＰＥＧスペーサーに結合したメイタンシノイド薬物にすることができる（たとえば図１３を参照）。ＰＥＧスペーサーおよび末端マレイミド基を保有するこの修飾されたメイタンシノイドを、次いでたとえば図１４に示すように細胞結合剤と反応させて、本明細書の式（２）の細胞結合剤−薬物コンジュゲートを得ることができる。
【0043】
[86] あるいは、反応性アミン基、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを保有する二官能性ＰＥＧ含有架橋剤の一端に細胞結合剤をまず反応させて、リンカーにアミド結合により共有結合した修飾された細胞結合剤にすることができる（たとえば図１５を参照）。次の工程で、メイタンシノイドをＰＥＧスペーサーの他端のマレイミド置換基と反応させて、本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲートにする。
【0044】
[87] 図１６および１７は、たとえばＰＥＧ架橋剤の合成、およびチオアセトアミド連結によるそれとメイタンシノイドの反応を示す。次いでマレイミド置換基をＰＥＧに取り込ませて、チオエーテル結合による細胞結合剤との反応を可能にする。あるいは、たとえば図１８に示すように、細胞結合剤をまずＰＥＧ架橋剤にチオエーテル結合により連結する。この修飾された細胞結合剤を次いでメイタンシノイド薬物と反応させて、コンジュゲートにする。ＰＥＧスペーサーの両端がヨードアセトアミド部分を含むホモ二官能性ＰＥＧ架橋剤であって、細胞毒薬と細胞結合剤の両方をチオエーテル結合により連結して親水性ＰＥＧスペーサーを含むコンジュゲートにすることができる架橋剤の合成を、たとえば図１９に示す。本発明のコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション方法を、たとえば図２０および２１に示す。
【0045】
[88] 本明細書に記載した方法により種々の反応性基を保有する他のＰＥＧ含有架橋剤を容易に合成しうることは、当業者には理解されるであろう。たとえば、ヒドロキシル基を保有する薬物、たとえば１９−デメチルメイタンシノイド類（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，３６１，６５０）とヨード−アセチル−ＰＥＧリンカー（図５）を、塩基、たとえば炭酸カリウムの存在下で反応させて、メイタンシノイドをエーテル結合により連結させることができる。同様に、アミン含有メイタンシノイド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，３０１，０１９の記載に従って合成）とヨードアセチルＰＥＧ（図５に示す）を、塩基、たとえばピリジンまたはトリエチルアミンの存在下で反応させて、アミン連結によりＰＥＧに連結したメイタンシノイドを得ることができる。アミド結合によるＰＥＧへの薬物の連結については、カルボキシ−ＰＥＧ（図５に示す）とアミン含有メイタンシノイドを、縮合剤、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応させて、アミド結合したＰＥＧ−メイタンシノイドを得ることができる。薬物をＰＥＧスペーサーにカルバメート連結により連結させるためには、ＰＥＧをまずジホスゲンと反応させてＰＥＧクロロホルメートを製造し、次いでこれとアミン含有メイタンシノイドを、塩基、たとえばトリエチルアミンの存在下で反応させて、カルバメート連結したＰＥＧ−メイタンシノイドを得ることができる。
【0046】
[89] 適切なリンカーの例には、細胞結合剤との反応のためのＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分、および薬物との反応のためのマレイミドまたはハロアセチルをベースとする部分をもつリンカーが含まれる。ＰＥＧスペーサーを、本明細書に記載する方法により既知のいずれかの架橋剤に取り込ませることができる。マレイミドをベースとする部分を含む架橋剤であってＰＥＧスペーサーを取り込ませることができる架橋剤には、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Ｎ−スクシンイミジル ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）：これはＳＭＣＣの“長鎖”類似体である（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）。ハロアセチルをベースとする部分を含む架橋剤には、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル ３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が含まれる。
【0047】
[90] 硫黄原子を含まない他の架橋剤も本発明方法に使用できる。そのような架橋剤は、ジカルボン酸をベースとする部分から誘導することができる。ジカルボン酸をベースとする適切な部分には下記に示す一般式のα，ω−ジカルボン酸が含まれるが、これらに限定されない：ＨＯＯＣ−Ａ’ｐ−Ｅ’ｑ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＧ’ｒ−ＣＯＯＨ
式中：Ａ’は２〜２０個の炭素原子をもつ任意の直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、Ｅ’は３〜１０個の炭素原子をもつ任意のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基であり、Ｇ’は６〜１０個の炭素原子をもつ任意の置換もしくは
非置換芳香族基、またはヘテロ原子がＮ、ＯもしくはＳから選択される置換もしくは非置換複素環式基であり、ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ０または１であり、ただし、ｐ、ｑおよびｒが同時にすべてゼロであることはなく、ｎは１から２０００までの整数である。
【0048】
[91] 本明細書に開示するリンカーの多くはＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５０１６９９３３に詳細に記載されている。[92] 本発明の他の観点において、細胞結合剤は二官能性架橋試薬を細胞結合剤と反応させることにより修飾され、これにより細胞結合剤へのリンカー分子の共有結合が得られる。本明細書中で用いる“二官能性架橋試薬”は、細胞結合剤を薬物、たとえば本明細書に記載する薬物に共有結合させるいずれかの化学物質部分である。本発明の好ましい観点において、連結部分の一部は薬物により供給される。この観点において薬物は、細胞結合剤を薬物に結合させるために用いる、より大きいリンカー分子の一部である連結部分を含む。たとえば、メイタンシノイドＤＭ１を形成するために、メイタンシンのＣ−３ヒドロキシ基にある側鎖を、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）をもつように修飾する。このチオール化形メイタンシンを、修飾した細胞結合剤と反応させて、コンジュゲートを形成することができる。したがって、最終リンカーは２成分から組み立てられ、その一方は架橋試薬から供給され、他方はＤＭ１からの側鎖により供給される。
【0049】
[93] 本発明の他の観点において、薬物をジスルフィド結合により細胞結合剤に連結させる。リンカー分子は、細胞結合剤と反応しうる反応性化学基を含む。細胞結合剤との反応に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。さらにリンカー分子は、薬物と反応してジスルフィド結合を形成しうる反応性化学基、好ましくはジチオピリジル基を含む。特に好ましいリンカー分子には下記のものが含まれる：たとえばＮ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）(参照：たとえば、Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978))、Ｎ−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）(参照：たとえば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，５６３，３０４）、Ｎ
−スクシンイミジル ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）(参照：た
とえば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６）、および他の反応性架橋剤、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，９１３，７４８に記載のもの：それの全体を本明細書に援用する。
【0050】
[94] あるいは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，４４１，１６３ Ｂ１に開示されるように、薬物をまず修飾して、細胞結合剤と反応させるのに適切な反応性エステルを導入することができる。活性化されたリンカー部分を含むこれらの薬物と細胞結合剤との反応は、細胞結合剤−薬物コンジュゲートを製造するための他の方法を提供する。ｓｉＲＮＡの連結のために、オリゴヌクレオチドの修飾に一般に用いられる方法によりｓｉＲＮＡを本発明の架橋剤に連結させることができる（参照：たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ２００５０１０７３２５および２００７０２１３２９２）。よって、３’または５’−ホスホロアミダイト形のｓｉＲＮＡを、ヒドロキシル官能基を保有する架橋剤の一端と反応させて、ｓｉＲＮＡと架橋剤の間にエステル結合を生成させる。同様に、ｓｉＲＮＡホスホロアミダイトと末端アミノ基を保有する架橋剤との反応により、架橋剤がアミンによりｓｉＲＮＡに連結する。
【0051】
Ｂ．細胞結合剤[95] 本発明に用いる細胞結合剤は、癌細胞上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質（たとえば免疫グロブリンおよび非−免疫グロブリンタンパク質）である。これらの細胞結合剤には下記のものが含まれる：
−下記を含む抗体：
−表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６
３９，６４１）；
−ヒト化抗体または完全ヒト抗体（ヒト化抗体または完全ヒト抗体は下記のものから選択されるが、これらに限定されない：ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ｈｕＮ９０１、ＤＳ６、ＣＤ３８、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣＮＴＯ ９５、Ｂ−Ｂ４、トラスツヅマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ビバツヅマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツヅマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツヅマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）およびリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（参照：たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６３９，６４１、５，６６５，３５７、および７，３４２，１１０；Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６０／４２４，３３２、国際特許出願ＷＯ ０２／１６，４０１、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｕｍｂｅｒ ２００６００４５８７７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ２００６０１２７４０７、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５０１１８１８３、Pedersen et al., (1994) J. Mol. Biol. 235, 959-973, Roguska et al., (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 91, 969-973, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et
al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995), Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994)、およびMaloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997));ならびに
−抗体のエピトープ結合フラグメント、たとえばｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２(Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113: 470-478 (1974); Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960))。
【0052】
[96] 他の細胞結合剤には、下記に例示する他の細胞結合性のタンパク質およびポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない：−アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ類；Zahnd et al., J. Biol. Chem., 281, 46, 35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268)またはアンキリン様リピートタンパク質もしくは合
成ペプチド、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００７０２３８６６７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，１０１，６７５；ＷＯ／２００７／１４７２１３；およびＷＯ／２００７／０６２４６６に記載）；
−インターフェロン（たとえばα、β、γ）；
−リンホカイン、たとえばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
−ホルモン、たとえばインスリン、ＴＲＨ（チロトロピン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、たとえばアンドロゲンおよびエストロゲン；ならびに
−増殖因子およびコロニー刺激因子、たとえばＥＧＦ、ＴＧＦ−a、ＩＧＦ−１、Ｇ−
ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ(Burgess, Immunology Today 5: 155-158 (1984))。
【0053】
[97] 細胞結合剤が抗体である場合、それは、ポリペプチドでありかつ膜貫通分子（たとえば受容体）の可能性がある抗原、またはリガンド、たとえば増殖因子に結合する。抗原の例には、下記の分子が含まれる：たとえばレニン；成長ホルモン：ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む；成長ホルモン放出ホルモン；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、たとえばｖｍｃ因子、ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンビルブラント因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ ｆａｃｔｏｒ）；抗凝固因子、たとえばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲンアクチベーター、たとえばウロキナーゼもしくはヒトの尿、または組織タイプのプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血性増殖因子；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、たとえばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシン（ｒｅｌａｘｉｎ）Ａ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；微生物タンパク質、たとえばベータ−ラクタマーゼ；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、たとえばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、たとえば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、または神経成長因子、たとえばＮＧＦ−β；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、たとえばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、たとえばＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸受容体、ＦＯＬＲ１、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ｃｒｉｐｔｏ、αｖβ６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、トランスフェリン受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５；ＣＤタンパク質、たとえばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２；エリスロポエチン；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、たとえばインターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、たとえばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ−細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、たとえばＨＩＶエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）類；調節タンパク質；インテグリン、たとえばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、たとえばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；ならびに以上に挙げたポリペプチドのいずれかのフラグメント、抗体模倣体アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）類（ＵＳ ａｐｐｌ ２００７００８２３６５）、または１以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体：ＵＳ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８０１７１０４０またはＵＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８０３０５０４４に開示されるもの；それらの全体を本明細書に援用する。
【0054】
[98] さらに、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦを、急性骨髄性白血病由来の罹患細胞に対する細胞結合剤として使用できる。活性Ｔ細胞に結合するＩＬ−２を、移植片拒絶の予防のために、移植片対宿主疾患の治療および予防のために、ならびに急性Ｔ細胞性白血病の治療のために使用できる。メラノサイトに結合するＭＳＨを、黒色腫の処置のために使用できる。葉酸を用いて、卵巣その他の腫瘍に発現する葉酸受容体をターゲティングすることができる。上皮増殖因子を用いて、扁平上皮癌、たとえば肺癌および頭頚部癌をターゲティングすることができる。ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）を用いて、神経芽細胞腫その他のタイプの腫瘍をターゲティングすることができる。
【0055】
[99] 乳腺および精巣の癌は、それぞれ細胞結合剤としてのエストロゲン（またはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）で効果的にターゲティングすることができる。
【0056】
[100] 本発明に包含される抗体に対する好ましい抗原には、下記のものが含まれる：ＣＤタンパク質、たとえばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、およびＣＤ１５２；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、たとえばＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、たとえばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびαｖ／β３インテグリン：そのαまたはβサブユニットを含む（たとえば、抗−ＣＤ１１ａ、抗−ＣＤ１８または抗−ＣＤ１１ｂ抗体）；増殖因子、たとえばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β；アルファインターフェロン（アルファ−ＩＦＮ）；インターロイキン、たとえばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、デスレセプター（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣなど。本発明において最も好ましい標的は下記のものである：ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＡ６、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｐＣＡＭ、ＣＲＩＰＴＯ（大部分のヒト乳癌細胞において高レベルで産生されるタンパク質）、ダルピン（ｄａｒｐｉｎ）類、αｖ／β３インテグリン、αｖ／β５インテグリン、αｖ／β６インテグリン、ＴＧＦ−β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、Ａｐｏ２およびＣ２４２、または１以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体：ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８０１７１０４０またはＵＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００８０３０５０４４に開示されるもの；それらの全体を本明細書に援用する。
【0057】
[101] 本発明に包含される抗体に対する好ましい抗原には、下記のものも含まれる：ＣＤタンパク質、たとえばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４６、ＣＤ５６およびＣＤ１３８；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、たとえばＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；細胞接着タンパク質、たとえばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびαｖ／β３インテグリン：そのαまたはβサブユニットを含む（たとえば、抗−ＣＤ１１ａ、抗−ＣＤ１８または抗−ＣＤ１１ｂ抗体）；増殖因子、たとえばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β；アルファインターフェロン（アルファ−ＩＦＮ）；インターロイキン、たとえばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、デスレセプター；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣなど。本発明において最も好ましい標的は下記のものである：ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥＧＦ−Ｒ、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＡ６、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＲＩＰＴＯ（大部分のヒト乳癌細胞において高レベルで産生されるタンパク質）、αｖ／β３インテグリン、αｖ／β５インテグリン、ＴＧＦ−β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、Ａｐｏ２、ＥｐＣＡＭおよびＣ２４２。
【0058】
[102] モノクローナル抗体技術により、モノクローナル抗体の形の特異的細胞結合剤の製造が可能になる。当技術分野で特に周知のものは、マウス、ラット、ハムスター、または他のいずれかの哺乳動物を、目的抗原、たとえば無傷の標的細胞、標的細胞から分離
した抗原、全ウイルス、弱毒化した全ウイルス、およびウイルスタンパク質、たとえばウイルスコートタンパク質で免疫化することにより産生されるモノクローナル抗体の作製技術である。感作されたヒト細胞も使用できる。モノクローナル抗体を作製するための他の方法は、ｓＦｖ（一本鎖可変部）、特にヒトｓＦｖのファージライブラリーの使用である(参照：たとえばGriffiths et al, U.S. Patent No. 5,885,793; McCafferty et al, Ｗ
Ｏ ９２／０１０４７; Liming et al, ＷＯ ９９／０６５８７)。
【0059】
[103] 適切な細胞結合剤の選択は、ターゲティングすべき個々の細胞集団に依存する選択肢であるが、適切なものが得られるならば、一般にモノクローナル抗体およびそのエピトープ結合フラグメントが好ましい。
【0060】
[104] たとえば、モノクローナル抗体Ｍｙ９は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞上にみられるＣＤ３３抗原に対して特異的なネズミＩｇＧ２ａ抗体であり(Roy et al. Blood 77: 2404-2412 (1991))、ＡＭＬ患者の処置に使用できる。同様に、モノクローナル抗
体、抗−Ｂ４は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するネズミＩｇＧ１であり(Nadler et al, J. Immunol. 131: 244-250 (1983))、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ芽球性白
血病の場合のように標的細胞がこの抗原を発現するＢ細胞または罹患細胞であれば使用できる。抗体Ｎ９０１は、小細胞性肺癌細胞上および神経内分泌由来の他の腫瘍の細胞上にみられるＣＤ５６に結合するネズミモノクローナルＩｇＧ１抗体である(Roy et al. J. Nat. Cancer Inst. 88: 1136-1145 (1996))；ｈｕＣ２４２はＣａｎＡｇ抗原に結合する抗体である；トラスツヅマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）はＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する抗体である；抗−ＥＧＦ受容体抗体はＥＧＦ受容体に結合する。
【0061】
Ｃ．薬物[105] 本発明に使用する薬物は、細胞結合剤に結合させることができる細胞毒薬であ
る。適切な薬物の例には、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）類、ＤＮＡ結合性薬物、たとえばＣＣ−１０６５およびその類似体、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）類、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびその類似体、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ）、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）類、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）およびその類似体、ツブライシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）類、タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）類、およびｓｉＲＮＡが含まれる。
【0062】
[106] 好ましいメイタンシノイド類は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２０８，０２０；５，４１６，０６４；６，３３３．４１０；６，４４１，１６３；６，７１６，８２１；ＲＥ３９，１５１および７，２７６，４９７に記載のものである。好ましいＣＣ−１０６５類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４７５，０９２；５，５９５，４９９；５，８４６，５４５；６，５３４，６６０；６，５８６，６１８；６，７５６，３９７および７，０４９，３１６に記載のものである。好ましいドキソルビシン類およびその類似体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６３０，５７９に記載のものである。好ましいタキソイド類は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，３４０，７０１；６，３７２，７３８；６．４３６，９３１；６，５９６，７５７；６，７０６，７０８；７，００８，９４２；７，２１７，８１９および７，２７６，４９９に記載のものである。カリケアマイシン類は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７１４，５８６および５７３９，１１６に記載のものである。
【0063】
[107] ビンカアルカロイド化合物、ドラスタチン化合物、およびクリプトフィシン化合物は、ＷＯ０１／２４７６３に詳細に記載されている。オーリスタチンには、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメ
チルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が含まれ、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６３５，４８３、Int. J. Oncol. 15: 367-72 (1999); Molecular Cancer Therapeutics, vol. 3, No. 8, pp. 921-932 (2004);Ｕ．Ｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ １１
／１３４８２６、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６００７４００８、２００６０２２９２５に記載されている。ツブライシン化合物は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５０２４９７４０に記載されている。クリプトフィシン化合物は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，６８０，３１１および６，７４７，０２１に記載されている。エポチロン類は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，９５６，０３６および６，９８９，４５０に記載されている。
【0064】
[108] ｓｉＲＮＡは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：２００７０２７５４６５、２００７０２１３２９２、２００７０１８５０５０、２００７０１６１５９５、２００７００５４２７９、２００６０２８７２６０、２００６００３５２５４、２００６０００８８２２、２００５０２８８２４４、２００５０１７６６６７に詳細に記載されている。
【0065】
類似体および誘導体[109] 本明細書に記載した細胞毒薬を、得られる化合物がなお出発化合物の特異性お
よび／または活性を保持する様式で修飾しうることは、細胞毒薬の分野の当業者に容易に理解されるであろう。当業者は、これらの化合物の多くを本明細書に記載する細胞毒薬の代わりに使用しうることも理解するであろう。したがって、本発明の細胞毒薬には、本明細書に記載する化合物の類似体および誘導体が含まれる。
【0066】
[110] 細胞結合剤をこれまでに記載された方法により細胞毒薬にコンジュゲートさせることができる（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，０１３，７４８；６，４４１，１６３ｌ、および６，７１６，８２１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５０１６９９３３；ならびにＷＯ２００６／０３４４８８ Ａ２）。
【0067】
Ｄ．療法用途[111] 本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲート（たとえばイムノコンジュゲート）
を、化学療法薬と併用することもできる。そのような化学療法薬は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，３０３，７４９に記載されている。
【0068】
[112] 本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲート（たとえばイムノコンジュゲート）を、インビトロ、インビボおよび／またはエクスビボで投与して、患者を処置し、および／または選択した細胞集団の増殖を調節することができ、これにはたとえば下記のものが含まれる：肺、血液、血漿、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌；自己免疫疾患、たとえば全身性狼瘡、リウマチ性関節炎、および多発性硬化症；移植片拒絶、たとえば腎移植片拒絶、肝移植片拒絶、肺移植片拒絶、心臓移植片拒絶、および骨髄植片拒絶；移植片対宿主疾患；ウイルス感染症、たとえばＣＭＶ感染症、ＨＩＶ感染症、およびエイズ；ならびに寄生虫感染症、たとえばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症など。好ましくは、本発明のイムノコンジュゲートおよび化学療法薬をインビトロ、インビボおよび／またはエクスビボで投与して、患者の癌を処置し、および／または癌細胞の増殖を調節することができ、これにはたとえば血液、血漿、肺、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌；より好ましくは肺、大腸前立腺、血漿、血液または大腸の癌が含まれる。最も好ましい観点において、癌は多発性骨髄腫である。
【0069】
[113] “選択した細胞集団の増殖を調節する”ことには、選択した細胞集団（たとえば多発性骨髄腫の細胞集団、たとえばＭＯＬＰ−８細胞、ＯＰＭ２細胞、Ｈ９２９細胞な
ど）が分裂によって増殖してより多数の細胞を生じるのを阻害すること；たとえば非処置細胞と比較して、細胞分裂が増加する速度を低下させること；選択した細胞集団を死滅させること；および／または選択した細胞集団（たとえば癌細胞）が転移するのを阻止することが含まれる。選択した細胞集団の増殖をインビトロ、インビボまたはエクスビボで調節することができる。
【0070】
[114] 本発明方法において、細胞結合剤−薬物コンジュゲート（たとえばイムノコンジュゲート）をインビトロ、インビボまたはエクスビボで投与することができる。細胞結合剤−薬物コンジュゲート（たとえばイムノコンジュゲート）を、医薬的に許容できる適切なキャリヤー、希釈剤および／または賦形剤と共に使用でき、これらは周知であり、臨床状況に応じて当業者が決定できる。適切なキャリヤー、希釈剤および／または賦形剤の例には、下記のものが含まれる：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有する、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ約６．５、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース。
【0071】
[115] 本明細書に記載する化合物および組成物は、適切な形態で、好ましくは非経口的に、より好ましくは静脈内に投与することができる。非経口投与のために、化合物または組成物は水性または非水性の無菌の液剤、懸濁液剤または乳剤であってもよい。プロピレングリコール、植物油、および注射用有機エステル、たとえばオレイン酸エチルを、溶剤またはビヒクルとして使用できる。組成物は、佐剤、乳化剤または分散剤を含有することもできる。
【0072】
[116] 本発明組成物は、無菌水または他のいずれかの無菌媒質に溶解または分散することができる無菌固体組成物の形態であってもよい。
[117] 本明細書に記載する細胞結合剤−薬物コンジュゲート（たとえばイムノコンジ
ュゲート）の“療法有効量”は、選択した細胞集団の増殖を調節しおよび／または患者の疾患を処置するための用量計画を表わし、患者の年齢、体重、性別、食事および医学的状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに薬理学的考慮事項、たとえば使用する特定の化合物の活性、有効性、薬物動態および毒性プロフィールを含めた多様な要因に従って選択される。“療法有効量”は、標準医療テキスト、たとえばＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００４を参照して決定することもできる。患者は、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。患者は雄または雌であってよく、乳児、小児または成人であってよい。
【0073】
[118] 細胞結合剤−薬物コンジュゲート（たとえばイムノコンジュゲート）投与の適切なプロトコルの例は、下記のものである。コンジュゲートを１日１回で約５日間投与することができる；毎日の静脈内ボーラスとして約５日間、または約５日間の連続注入として。
【0074】
[119] あるいは、本発明のコンジュゲートを週１回で６週間、またはより長期間、投与することができる。他の別法として、コンジュゲートを２または３週に１回投与することができる。ボーラス量を約５０〜約４００ｍｌの生理食塩水中で投与し、これに約５〜約１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加することができる。連続注入は、２４時間当たり約２５０〜約５００ｍｌの生理食塩水中で投与され、これに約２５〜約５０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加することができる。投与量は、静脈内に一人当たり約１０ｐｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ（約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲）であろう。
【0075】
[120] 処置の約１〜４週間後、患者は第２コースの処置を受けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投与量および時間に関する具体的な臨床プロトコルは、臨床状況
に応じて当業者が決定できる。
【0076】
[121] 本発明の組成物およびコンジュゲート（たとえばイムノコンジュゲート）は、たとえば異常な細胞増殖を特徴とする障害（たとえば癌）の処置またはその重症度の軽減に有用な医薬の製造に使用することもできる。
【0077】
[122] 本発明は、１種類以上のイムノコンジュゲートおよび１種類以上の化学療法薬を含む本発明の医薬化合物および／または組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬キットをも提供する。そのようなキットは、たとえば他の化合物および／または組成物、それらの化合物および／または組成物を投与するための器具（単数または複数）、ならびに医薬または生物製剤の製造、使用または販売を規制する行政当局により指示された形式の指示書をも含むことができる。
【0078】
[123] 癌療法ならびにそれらの投与量、投与経路および推奨される用途は当技術分野で既知であり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ'ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）など
の文献に記載されている。ＰＤＲには、種々の癌の処置に用いられている薬剤の投与量が示されている。療法に有効なこれらの前記化学療法薬の投与計画および投与量は、処置する個々の癌、疾患の程度、およびこの技術分野の医師に周知の他の要因に依存し、医師が決定できるであろう。たとえば、２００６年版のＰｈｙｓｉｃｉａｎ'ｓ Ｄｅｓｋ Ｒ
ｅｆｅｒｅｎｃｅに、下記のことが開示されている：タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（２９４７頁を参照）はチューブリン脱重合の阻害薬であり；ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）（７８６頁を参照）、ドキシル（Ｄｏｘｉｌ）（３３０２頁を参照）およびオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）（２９０８頁を参照）はＤＮＡ相互作用薬であり、イリノテカル（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｌ）（２６０２頁を参照）はトポイソメラーゼＩ阻害薬であり、エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（９３７頁を参照）およびタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（２４７０頁を参照）は上皮増殖因子受容体と相互作用する。ＰＤＲの内容全体を特に本明細書に援用する。当業者は、下記のパラメーターのうち１以上を用いてＰＤＲを検討して、本発明の教示に従って使用しうる化学療法薬およびコンジュゲートの投与計画および投与量を決定できる。これらのパラメーターには下記のものが含まれる：
１．包括的インデックス
ａ）製造業者による
ｂ）製品（企業名または商標薬剤名による）
ｃ）カテゴリーインデックス（たとえば“抗ヒスタミン薬”、“ＤＮＡアルキル化剤”、タキサン類など）
ｄ）一般／化学インデックス（商標ではない薬物一般名）
２．医薬の外観（Ｃｏｌｏｒ ｉｍａｇｅ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）
３．ＦＤＡラベリングと一致した製品情報
ａ）化学的情報
ｂ）機能／作用
ｃ）適応症および配合禁忌
ｄ）試験研究、副作用、警告。
【0079】
[124] 前記の参考文献、特許出願、および特許それぞれの内容全体を、明細書、特許請求の範囲および要約ならびにその図面、表または図式（これらに限定されない）を含めて全体として特に本明細書に援用する。
【実施例】
【0080】
[125] いずれか特定の観点により拘束されることなく、ポリエチレングリコール（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）連結した、細胞結合剤とのコンジュゲーションのための種々の反応
性リンカーを含む薬物の合成のための方法を記載する。これらのコンジュゲーション方法には、ポリエチレングリコール（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）リンカーを介してＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応性基における反応により連結した、抗体と薬物、たとえばメイタンシノイドの、１工程コンジュゲーションが含まれる。
【0081】
[126] ジスルフィド基含有ポリエチレングリコール（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）連結した、抗体とのコンジュゲーションのための種々の反応性リンカーを含む薬物を合成する方法も記載する。これらのコンジュゲーション方法には、ジスルフィド基を保有するポリエチレングリコール（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）リンカーでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応性基における反応により連結した、抗体と薬物、たとえばメイタンシノイドの、１工程コンジュゲーションが含まれる。
【0082】
[127] 以下の実施例は説明のためのものにすぎず、本発明を限定するためのものではない。
実施例Ｉ
従来の脂肪族炭素スペーサーを含むジスルフィドリンカーによる抗体と抗体分子当たり数個の連結メイタンシノイド分子とのコンジュゲーション：
[128] 抗体を数個のメイタンシノイドＤＭ４またはＤＭ１の分子とコンジュゲートさ
せるための２工程法において、ヒト化抗体をまず、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）およびチオール反応性２−ピリジルジチオ基（−ＳＳＰｙ基）の両方を含む市販のヘテロ二官能性リンカー（ＳＰＤＢ）で修飾して、数個のリンカー分子を抗体分子に取り込ませた(W. C. Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408の記載に従う)。反応性リンカーを抗体分子に取り込ませた後、第２反応工程で、反応性
チオール基をもつメイタンシノイドＤＭ４またはＤＭ１をリンカー修飾抗体に添加して、メイタンシノイドをジスルフィド結合により抗体にコンジュゲートさせた。具体例において、５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト化抗体を、１０〜１５倍モル過剰の、−（ＣＨ２）−ｎアルキル基をもつ市販のヘテロ二官能性リンカー（たとえばＳＰＤＢ、ＳＰＰ、ＳＰＤＰ）により、水性緩衝液中、ｐＨ６．５〜８で０．２５〜３時間、周囲温度で修飾し、次いでゲル濾過により精製して（たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５クロマトグラフィーを使用）、抗体分子当たり平均８〜１２個のリンカー基で修飾された抗体を高収率で得た（一般に８０〜９０％の収率）。連結した基は、過剰の１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）試薬を少量のリンカー修飾抗体試料に添加した際の２−チオピリドンの放出を３４３ｎｍ（ε３４３ｎｍ＝８０８０Ｍ−１ ｃｍ−１）におけるそれの吸光に基づいて測定することにより推定された。抗体に連結した反応性基を測定した後、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のリンカー修飾抗体を過剰のメイタンシノイドＤＭ４（反応性リンカーより１．７倍モル過剰のＤＭ４チオール）とｐＨ６．５でコンジュゲートさせた。しかし、抗体−メイタンシノイドコンジュゲーション反応中に沈殿がみられ、ゲル濾過により抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを精製すると低い収率の抗体−メイタンシノイドコンジュゲート（約３８〜６０％の収率）が得られた。抗体分子当たり連結したメイタンシノイドの個数を２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度測定値から、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるメイタンシノイドおよび抗体の吸光係数を用いて判定した。約１〜１．５ｍｇ／ｍｌにおける沈殿および抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの低い収率のほか、抗体分子当たり取り込まれたメイタンシノイドの個数は、抗体分子当たり取り込まれたはるかに高い初期の反応性リンカー基の平均数（抗体分子当たり約８〜１２個の反応性リンカー基）に基づいて予想したよりはるかに少なかった（抗体分子当たり約５．２〜５．５個の平均メイタンシノイド分子）；これは、メイタンシノイドを保有する抗体コンジュゲートが比較的多量に沈殿したことを示唆する。他の例において、ヒト化抗体をまずＳＰＤＢヘテロ二官能性リンカーで修飾して、抗体分子当たり１１個のピリジルジチオ基を取り込ませた；これは、１．７倍モル過剰のＤＭ４メイタンシノイドチオールとの２回目の反応に際して反応混合物中に著しい沈殿を示し、＜３０％のきわめて低い回収率の抗体−メイタ
ンシノイドコンジュゲートが得られた。脂肪族スペーサーをもつ市販のヘテロ二官能性リンカー、たとえばＳＰＤＢまたはＳＰＤＰを用いると、抗体−メイタンシノイドコンジュゲート濃度１ｍｇ／ｍｌまたはそれより高い濃度については、抗体当たり４または５個のメイタンシノイド分子より多くを高いコンジュゲーション収率で取り込ませるのは一般に困難である。ＳＰＤＢ−またはＳＰＤＰ−由来のリンカーを保有する抗体−メイタンシノイドコンジュゲートにみられたこの沈殿および低い収率は、抗体の最初のＳＰＤＢ−またはＳＰＤＰ−リンカー修飾（メイタンシノイドとのコンジュゲーション前）についてはみられなかった；これは、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの凝集および沈殿がおそらく疎水性分子の結合により起きたことを示唆する。
【0083】
実施例ＩＩ親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧｎ、または（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ＝１−１４）を含むジスルフィドリンカーによる抗体と抗体分子当たり数個の連結メイタンシノイド分子とのコンジュゲーション：
[129] 親水性スペーサー、たとえばポリエチレンオキシド（ＰＥＧｎ、または（−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ＝１−１４）が、高い個数のメイタンシノイド分子（抗体分子当たり平均＞４）を含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの凝集および沈殿を阻止するであろうという可能性を調べるために、幾つかの新規なヘテロ二官能性および一官能性メイタンシノイド誘導体を製造した；これらは、直接修飾により、または抗体のリジン残基における最初の誘導体化に続いてメイタンシノイドを反応させることによる２工程反応により、抗体にコンジュゲートさせることができる（たとえば、図３、６、１１および１２を参照）。
【0084】
１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸の合成[130] アルドリチオール−２（１．１７ｇ，５．３１ｍｍｏｌ）の溶液を、１０ｍＬ
丸底フラスコ内で５．０ｍＬの１，２−ジメトキシエタン中に調製した。この反応フラスコに、１．０ｍＬの１，２−ジメトキシエタンに溶解した３−（２−チオテトラエチレングリコール）プロピオン酸（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ，４９０ｍｇ，１．７３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。撹拌しながら３．５時間、反応を進行させ、生成物をシリカクロマトグラフィーにより、塩化メチレン中の５％メタノールで溶離して精製した。溶媒を真空中で除去して、４３２ｍｇ（６４％の収率）の目的生成物を得た。
【0085】
ＰｙＳＳ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ［１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル］の合成[131] １０ｍＬ丸底フラスコに、１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１
３−テトラオキサペンタデカン酸（４３１ｍｇ，１．１０ｍｍｏｌ）、５．０ｍＬの塩化メチレンおよび撹拌バーを装入した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（６．８ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）をこの反応器に添加し、室温で２時間、撹拌しながら反応を進行させた。生成物をシリカクロマトグラフィーにより、塩化メチレン中の７％ １，２−ジメトキシエタンで溶離して精製した。溶媒を真空中で除去して、２０６ｍｇ（３８％の収率）の目的生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ：実測値：５１１．１（Ｍ＋Ｎａ）＋，計算値：５１１．２。
【0086】
１５−（ＤＭ４−ジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸の合成[132] Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペ
ンチル）メイタンシン（ＤＭ４，１８．６ｍｇ，０．０２３９ｍｍｏｌ）および１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸（１４．０ｍｇ，０．０３５８ｍｍｏｌ）の溶液を、０．７５ｍＬの１，２−ジメトキシエタン中に調
製した。４−メチルモルホリン（６．０ｍｇ，０．０５９７ｍｍｏｌ）を反応器に添加し、室温で２４時間、撹拌しながら反応を進行させた。反応が終了すると、粗製反応混合物を真空中で乾燥させ、それ以上精製せずに使用した（図６）。
【0087】
１５−（ＤＭ４−ジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭ４−ＳＰＥＧ４−ＮＨＳ）の合成[133] 粗製１５−（ＤＭ４−ジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデ
カン酸を２．０ｍＬの塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（６．８ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）と混和した。この溶液を２．５時間撹拌し、生成物をシリカクロマトグラフィーにより、塩化メチレン中の４％メタノールで溶離して精製した。溶媒を真空下で除去して、１５．０ｍｇ（５４％の収率）の目的生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ：実測値：１１７９．３（Ｍ＋Ｎａ）＋，計算値：１１７９．４（図６）。
【0088】
抗体分子当たり高い個数のメイタンシノイド分子を連結するための、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧｎ、または（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ＝１−１４）を含むジスルフィドリンカーを用いる２工程の抗体コンジュゲーション：[134] 親水性スペーサー、たとえばポリエチレンオキシド（ＰＥＧｎ、または（−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ＝１−１４）を含む新規なヘテロ二官能性試薬を用いて抗体を修飾し、次いでＤＭ４チオールとコンジュゲートさせた際に、新規な所見が得られた。親水性ＰＥＧｎスペーサーをもつ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのコンジュゲーション混合物は、何ら沈殿を示さず、一貫してきわめて高いモノマー画分（＞９０％）で高いコンジュゲート収率（＞７０％）を生じた。一例として、８ｍｇ／ｍｌ濃度のヒト化抗体を、抗体濃度より数倍モル過剰のＰｙＳＳ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ試薬で、ｐＨ８の緩衝液中において３０℃で１時間修飾し、次いでゲル濾過により精製した。抗体分子当たり連結したジチオピリジル基は、過剰のジチオトレイトールを用いて部分標本の２−チオピリドン放出アッセイにより約４〜１６個と推定された；これに基づいて、ｐＨ６．５、２５℃で一夜のコンジュゲーション工程について、１．４倍モル過剰のＤＭ４メイタンシノイドチオールをジチオピリジル−ＰＥＧｎ−リンカー修飾した抗体の各溶液に添加し、次いでコンジュゲートをゲル濾過により精製した（図１２）。種々の初期リンカー取込み量をもつ種々のコンジュゲーション混合物について抗体当たり取り込まれたメイタンシノイドの最終値は、抗体分子当たり３から９個までの平均メイタンシノイドに及び、沈殿はみられず、＞７０％の収率およびきわめて高いモノマー量が得られた（＞９０％のモノマー；２０％イソプロパノールまたは０．４Ｍ過塩素酸ナトリウムを用いるサイズ排除ＴＳＫ−ＧＥＬ
Ｇ３０００ ＨＰＬＣに基づく）。最終コンジュゲート中のコンジュゲートしていない薬物は０．６％未満であることがＨｉＳｅｐ Ｍｉｘｅｄ−Ｍｏｄｅクロマトグラフィー（ＨｉＳｅｐカラム、Ｓｕｐｅｌｃｏ）により測定され、メイタンシノイドが抗体に共有結合したことが示唆された。他の例において、８ｍｇ／ｍｌ濃度のヒト化抗体を、抗体濃度より数倍モル過剰のＰｙＳＳ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ試薬で、ｐＨ６．５の緩衝液中において２５℃で１．５時間修飾し、次いでゲル濾過により精製した。抗体試料上のジチオピリジル−ＰＥＧｎを保有するリンカー基は抗体分子当たり６〜１８個と推定され、次いでこれを１．３〜１．７倍モル過剰のＤＭ４メイタンシノイドチオールとｐＨ６．５、２５℃で一夜反応させ、次いでゲル濾過により精製した。沈殿はみられず、約１〜２ｍｇ／ｍｌで抗体−メイタンシノイドコンジュゲート最終試料は高いモノマー画分（＞９０％）を示し、凝集がなく、抗体分子当たり約３．１〜７．１個の高い個数のメイタンシノイドが共有結合しており、コンジュゲートしていないメイタンシノイドがきわめて少ないことを示す（ＨｉＳｅｐクロマトグラフィーにより推定して、コンジュゲートしていないメイタンシノイドは＜１．７％）。抗体当たりの薬物装填量が高いこのコンジュゲートは、４℃での貯蔵に際し、分析した最長期間（１．５カ月間）まですら安定であった。
【0089】
抗体分子当たり高い個数のメイタンシノイド分子を連結するための、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧｎ、または（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ＝１−１４）を含むジスルフィドリンカーを用いる１工程の抗体コンジュゲーション：[135] １工程コンジュゲーション方法において、親水性ポリエチレンオキシドスペー
サー（ＰＥＧｎ、または（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ＝１−１４）を含むジスルフィドリンカーを用いた抗体−メイタンシノイドコンジュゲートが、４ｍｇ／ｍｌ濃度のヒト化抗体と１０〜２０倍モル過剰のＤＭ４−ＳＰＥＧ４−ＮＨＳ試薬をｐＨ８の緩衝液中、３０℃で２時間コンジュゲートさせ、次いでゲル濾過により精製することによって作製され、抗体分子当たり６．６個のコンジュゲートしたメイタンシノイド（８２％のモノマー）を含む１．４ｍｇ／ｍｌ濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートが得られた（図１１）。したがって、２工程法および１工程法の両方により、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧｎ、または（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ＝１−１４）を含むジスルフィドリンカーを用いて、抗体分子当たり高い個数の連結メイタンシノイドが得られた。
【0090】
実施例ＩＩＩ親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧｎ、または（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ）を含むチオエーテルリンカーによる抗体と抗体当たり数個の連結メイタンシノイド分子とのコンジュゲーション
[136] 抗体のリジン残基を直接修飾するために、ＳＰＰから誘導した従来の脂肪族リ
ンカー、たとえばアルキルリンカーをもつメイタンシノイドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(W.C. Widdison et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408に記載)を用いて、まず抗体を１工程法でコンジュゲートさせた。ヒト化抗体と被験試薬としての８倍モル過剰の５ｍｇ／ｍｌのＤＭ１−ＳＰＰ−ＮＨＳ試薬を、ｐＨ８の緩衝液中、３０℃で２時間コンジュゲートさせる試み（次いでゲル濾過および透析する）は、著しい沈殿および凝集を生じ、したがって最終コンジュゲートはわずか６１％のモノマーであり、抗体当たり連結したメイタンシノイドは約３．３個であった。これに対し、ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ試薬を同様な条件下で用いると１．１ｍｇ／ｍｌで抗体当たり５．４個のメイタンシノイド分子が連結したコンジュゲートが得られ、最終コンジュゲート中に沈殿はなかった（図７または９）。同様に、ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ２−ＮＨＳ試薬を用いて、抗体当たり高い個数の連結メイタンシノイドがチオエーテル結合によりコンジュゲートしたものが得られた。他の例において、ネズミＩｇＧ１抗体を４ｍｇ／ｍｌで１０および２０倍モル過剰のＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ試薬と、ｐＨ８の緩衝液中、３０℃で２時間コンジュゲートさせ、次いでゲル濾過して、約１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを得た；抗体分子当たり４．１および７．８個のメイタンシノイド分子が共有結合によりコンジュゲートし（９８％のモノマー）、コンジュゲートしていない薬物は検出不可能なレベルであった（ＨｉＳｅｐ ＨＰＬＣアッセイ）。他の例において、ヒト化抗体を過剰のＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ試薬とコンジュゲートさせて、抗体当たり平均１０．７個の連結メイタンシノイド分子が得られた（９９％モノマー；１．１ｍｇ／ｍｌ濃度）。図８および図１０に概説した２工程コンジュゲーション方法を用いて、抗体からＰＥＧ４−連結チオエーテルコンジュゲートも製造した。したがって、親水性リンカー、たとえばＰＥＧｎまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎの使用により、抗体当たり多数のメイタンシノイド分子を導入することができる（たとえば図１、２、４、５、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１を参照）。
【0091】
ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ２−ＮＨＳの合成[137] Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メ
イタンシン（ＤＭ１，１３．４ｍｇ，０．０１８２ｍｍｏｌ）の溶液を０．７０ｍＬのＴＨＦ中に調製し、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ジエチレ
ングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ２−マレイミド，Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，１１．６ｍｇ，０．０２７３ｍｍｏｌ）を、水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６）およびＴＨＦの２：１（ｖ／ｖ）混合物１．５ｍＬ中において添加した。室温で撹拌しながら１時間、反応を進行させ、ＴＬＣ分析は反応が完了したことを示した。粗製反応混合物をシリカクロマトグラフィーにより、塩化メチレン中の８％エタノールで溶離して精製した；溶媒を真空下で除去して、６．０ｍｇ（２８％の収率）の目的生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ実測値：１１８５．３（Ｍ＋Ｎａ）＋，計算値：１１８４．４（図４）。
【0092】
ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳの合成[138] Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メ
イタンシン（ＤＭ１，２８．１ｍｇ，０．０３８１ｍｍｏｌ）の溶液を０．５０ｍＬのＴＨＦ中に調製し、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド，Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，３９．１ｍｇ，０．０７６２ｍｍｏｌ）を、水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６）およびＴＨＦの２：１（ｖ／ｖ）混合物１．５ｍＬ中において添加した。室温で撹拌しながら１時間、反応を進行させ、ＴＬＣ分析は反応が完了したことを示した。粗製反応混合物をシリカクロマトグラフィーにより、塩化メチレン中の６％エタノールで溶離して精製した；溶媒を真空下で除去して、９．６ｍｇ（２０％の収率）の目的生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ実測値：１２７３．５（Ｍ＋Ｎａ）＋，計算値：１２７３．５（図４）。
【0093】
実施例ＩＶ高メイタンシノイドを保有する抗体種の質量分析：
[139] 親水性ＰＥＧリンカーを含む、高メイタンシノイドを保有する抗体種を分析す
るために、抗体当たり平均１０．７個のＤＭ１を含むきわめて高いメイタンシノイドを保有するＡｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートを選択した。このコンジュゲートを脱グリコシルし、次いでＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した（図２２）。質量スペクトルは、抗体当たり薬物４〜１５個の種々の個数の連結メイタンシノイドで標識された種々の抗体種を示す；抗体当たり薬物８〜９個付近に最大値。この分布は正規であり、高い薬物保有種について選択的な消失がみられなかったことを示唆し、これは最終コンジュゲートの高い溶解度と一致する。抗体当たり平均１０．７個のＤＭ１を含む高いメイタンシノイドを保有するＡｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲーのサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣトは、予想外に高い＞９９％量のモノマーを示した（図２３）。
【0094】
実施例Ｖ高メイタンシノイドを保有する抗体種のＦＡＣＳ結合は非修飾抗体のものに類似する：
[140] ＥｐＣＡＭ、ＣａｎＡｇおよびＣＤ５６など種々の標的に対する、数種類の抗
体の高メイタンシノイド保有コンジュゲートの結合を、フローサイトメトリーにより非修飾抗体と比較した。要約すると、抗原陽性細胞をコンジュゲートまたは非修飾抗体と共に４℃でインキュベートし、次いで二次抗体−ＦＩＴＣコンジュゲートと共に４℃でインキュベートし、ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中１％）で固定し、フローサイトメトリーにより分析した。評価したすべてのコンジュゲートについて、コンジュゲートの結合と非修飾抗体の結合の間に有意差はみられなかった。一例を図２４に示す；この場合、１０．７個のメイタンシノイドを保有するＡｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが非修飾抗体のものに類似する高い親和性で抗原陽性細胞に結合した。
【0095】
実施例ＶＩポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧｎ、または（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ）を含むチオエーテルおよびジスルフィドリンカーをもつ、抗体のメイタンシノイドコンジュ
ゲートのインビトロ細胞毒性評価
[141] ＰＥＧｎスペーサーを含むチオエーテルおよびジスルフィドリンカーをもつ抗
体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を、一般にＷＳＴ−８細胞生存率アッセイにより、癌細胞とコンジュゲートの４〜５日連続インキュベーション後に評価した。抗原を発現する癌細胞（約１０００〜５０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート内で、ウシ胎仔血清を種々の濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートと共に含有する普通増殖培地において約５日間インキュベートした。次いでＷＳＴ−８試薬を添加し、約２〜５時間後に４５０ｎｍにおけるプレートの吸光度を測定した。生存画分をコンジュゲート濃度に対してプロットして、コンジュゲートのＩＣ５０値（５０％の細胞を死滅させる濃度）を判定した。
【0096】
[142] 図２５は、抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲートの力価がＰＥＧ４連結チオエーテルコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１）に対する薬物装填量の増加に伴って増強されることを示す；これは、抗体当たりメイタンシノイド約４個の同様な薬物装填量のチオエーテル連結ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびジスルフィド連結ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートより、ＥｐＣＡＭ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５−多剤耐性細胞（ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞）に対する力価が大きいことも示す。メイタンシノイド装填量４．１および７．８のチオエーテル連結した抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの力価は新規であり、療法用途にとってきわめて有望な可能性をもつ。
【0097】
[143] 図２６は、ＣａｎＡｇ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲに対する抗ＣａｎＡｇＡｂ−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。この場合も、チオエーテル連結したＡｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１およびＡｂ−ＰＥＧ２−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートは、同様なメイタンシノイド装填量をもつチオエーテル連結Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較して、より大きい力価を示した。
【0098】
[144] 図２７は、ＣＤ５６発現Ｍｏｌｐ−８多発性骨髄腫細胞に対する、ＰＥＧを含むチオエーテルおよびジスルフィドリンカーをもつ抗ＣＤ５６抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。抗体当たり７．７個の薬物を含むチオエーテル連結ＰＥＧ４コンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ１）は、３．８個の薬物を保有するコンジュゲート（ＩＣ５０＝１．９ｎＭ）と比較して、予想外の１００倍の細胞毒性力価増大を示した（ＩＣ５０値０．０１９ｎＭ）。
【0099】
[145] 図２８は、ＥｐＣＡＭ陽性多剤耐性ＨＣＴ１５細胞に対して、ＰＥＧ４連結チオエーテルコンジュゲートを保有する抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１）の力価が、抗体当たりメイタンシノイド約４個の同様な薬物装填量の一般的なチオエーテル連結ＳＭＣＣ−ＤＭ１より増強したことを示す。チオエーテル連結した抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの高い力価は新規所見であり、療法用途にとってきわめて有望な可能性をもつ。図２９は、ＥｐＣＡＭ陽性多剤耐性ＣＯＬＯ ２０５細胞に対して、ＰＥＧ４連結チオエーテルコンジュゲートを保有する抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１）の力価が、抗体当たりメイタンシノイド約４個の同様な薬物装填量の一般的なチオエーテル連結ＳＭＣＣ−ＤＭ１より増強したことを示す。チオエーテル連結した抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの増強した力価は新規所見であり、療法用途にとってきわめて有望な可能性をもつ。図３７は、ＥＧＦＲ陽性ＵＯ−３１ヒト腎癌細胞に対して、親水性チオエーテル結合ＰＥＧ４リンカーをもつ抗ＥＧＦＲ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１）の細胞毒性が、メイタンシノイド３．７個／Ａｂを含む非親水性ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較して著しく増強したことを示す。ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１の力
価は、従来のリンカーをもつＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのものより約１０倍大きかった。
【0100】
実施例ＶＩＩインビボ薬物動態：
[146] 親水性ＰＥＧ４リンカーを含む６．７Ｄ／Ａ（メイタンシノイド／抗体）を保
有するヒト化−抗ＣＤ５６抗体（Ａｂ）−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの血漿薬物動態を、従来の脂肪族炭素鎖リンカーを含む４Ｄ／Ａを保有するＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのものと比較した（図３８Ａ）。ＣＤ１マウスに５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートを単回ボーラスにより静脈内注射した（抗体基準の投与量；グループ当たり３匹のマウス）。血漿試料を４週間までの数回の時点で採集した。血漿試料を抗体濃度およびコンジュゲート濃度についてＥＬＩＳＡにより分析した。抗体ＥＬＩＳＡについては、コートした固定化−ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含むマイクロタイタープレートに血漿試料を添加し、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートしたヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）抗体を用いて検出した。コンジュゲート濃度については、コートした固定化−ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含むマイクロタイタープレートに血漿試料を添加し、洗浄し、ビオチニル化−抗メイタンシン抗体およびアルカリホスファターゼコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出した。抗体濃度およびコンジュゲート濃度両方のＥＬＩＳＡ結果が、親水性ＰＥＧ４リンカーを含む６．７ＤＭ１／Ａｂの高い装填量を保有するＡｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートは４週間の試験期間にわたって血漿中に良好に保持されることを証明した。
【0101】
[147] 図３８Ａは、ＰＥＧ４リンカーを用いた高いメイタンシノイド装填量（６．７ＤＭ１／Ａｂ）をもつ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ薬物動態を、４ＤＭ１／Ａｂを保有する標準的なリンカーコンジュゲートと比較して示す。高いメイタンシノイド装填量についてすら、メイタンシノイド６．７個／Ａｂを含むＰＥＧ４連結チオエーテルコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１）は、標準的なコンジュゲートより長い半減期をもつ。他の例において、３Ｈ標識ＤＭ１を含むヒト化Ｃ２４２ Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−３Ｈ−ＤＭ１コンジュゲート（メイタンシノイド３．３個／Ａｂ）の血漿薬物動態を、コンジュゲートしていない抗体、および従来の脂肪族炭素鎖リンカーを含む同様な４．２Ｄ／Ａの装填量をもつＡｂ−ＳＭＣＣ−３Ｈ−ＤＭ１コンジュゲートと、ＣＤ−１マウスにおいて１０〜１２ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．（静脈内）投与量で比較した（図３８Ｂ）。Ａｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−３Ｈ−ＤＭ１コンジュゲートは、４週間にわたって、同様なメイタンシノイド装填量をもつ従来のＳＭＣＣリンカーコンジュゲートと比較してより高い血漿濃度を示した；抗体濃度（ＥＬＩＳＡ；図３８Ｂ）およびコンジュゲート濃度（３Ｈ標識計数）の両方により測定。ＰＥＧ４−Ｍａｌ連結コンジュゲートの半減期は、ＳＭＣＣ連結コンジュゲートについての１２．６日と比較して１６日であり、したがってＳＭＣＣコンジュゲートよりはるかに改良された（図３８Ｂ）。重要なことに、ＣＤ−１マウスにおいて、３．３Ｄ／ＡをもつＡｂ−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの１０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与量における曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣ＝３８７９０ｈ．μｇ／ｍＬ）は、コンジュゲートしていない抗体の同様な１２ｍｇ／ｋｇ静脈内投与量におけるもの（ＡＵＣ＝３８７９８ｈ．μｇ／ｍＬ）と類似し、４．２Ｄ／ＡをもつＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの１０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与量におけるもの（ＡＵＣ＝２５９１０ｈ．μｇ／ｍＬ）よりはるかに良好であった（図３８Ｂ）。
【0102】
実施例ＶＩＩＩ耐性大腸癌（ＨＣＴ１５）異種移植に対する抗ＥｐＣＡＭ−メイタンシノイドコンジュゲート、ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性の比較
[148] ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−
ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍効果を、Ｐ糖タンパク質を過剰発現して種々の薬物に対し耐性であることが示されているヒト大腸癌ＨＣＴ１５の異種移植モデルにおいて評価した。ＨＣＴ１５細胞をＳＣＩＤマウスの右肩下領域に皮下注射した（１ｘ１０７細胞／動物）。腫瘍の体積が約１４０ｍｍ３のサイズに達した時点で（腫瘍細胞接種後、９日目）、マウスを腫瘍体積によりランダム化して３グループに分け（５匹／グループ）、各グループをｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１（コンジュゲートタンパク質２０ｍｇ／ｋｇ）、ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１（コンジュゲートタンパク質２０ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ビヒクル対照）の静脈内単回ボーラスで処置した。腫瘍サイズを週２回測定することにより腫瘍の増殖をモニターした。腫瘍サイズは次式により計算された：長さ×幅×高さ×１／２。
【0103】
[149] 腫瘍体積の平均変化を、たとえば図３０に示す。ＰＢＳ対照グループでは、細胞接種後２０日目までに腫瘍が６００ｍｍ３の腫瘍体積に達した。ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置は１５日の腫瘍増殖遅延を生じた。ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１による処置はより大きい抗腫瘍効果を示した：５匹中２匹の動物は腫瘍が完全に退縮してこれが４４日間持続し、３匹は３２日間の腫瘍増殖遅延を伴った。
【0104】
[150] したがって、本発明のコンジュゲートｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１は、このヒト大腸癌異種移植モデルにおいてｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１より有意に有効である。
【0105】
実施例ＩＸ耐性大腸癌（ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ）異種移植に対する抗ＥｐＣＡＭ−メイタンシノイドコンジュゲート（ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１）のインビボ抗腫瘍活性の比較
[151] ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−
ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍効果を、Ｐ糖タンパク質を過剰発現するように工学的に処理されたヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲの異種移植モデルにおいて評価した。ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞をＳＣＩＤマウスの右肩下領域に皮下注射した（１ｘ１０７細胞／動物）。腫瘍の体積が約１７０ｍｍ３のサイズに達した時点で（細胞接種後、８日目）、マウスをランダムに３グループに分け（６匹／グループ）、各グループをｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１（コンジュゲートタンパク質２０ｍｇ／ｋｇ）、ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１（抗体投与量２０ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ビヒクル対照）の静脈内単回ボーラスで処置した。腫瘍サイズを週２回測定することにより腫瘍の増殖をモニターした。腫瘍サイズは次式により計算された：長さ×幅×高さ×１／２。
【0106】
[152] 腫瘍体積の平均変化を、たとえば図３１に示す。ＰＢＳ対照グループでは、３８日で腫瘍が約１０００ｍｍ３にまで増殖した。ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置は１４日の腫瘍増殖遅延を生じた。ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１による処置は顕著な抗腫瘍効果をもち、６匹すべての動物において完全に腫瘍が退縮した（図３１）。
【0107】
[153] 同様な実験をＣＯＬＯ ２０５異種移植に対しても実施した。この場合も、Ｂ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１による処置はより有効であって完全な腫瘍退縮を生じたのに対し、標準的なＳＭＣＣコンジュゲートは中等度の腫瘍増殖遅延を示すにすぎない（図３２）。
【0108】
[154] 同様な結果がヒト化抗ＣａｎＡｇ抗体のコンジュゲートについて得られた（図３３）。
[155] したがって、本発明のコンジュゲートｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−Ｄ
Ｍ１は、このヒト大腸癌異種移植モデルにおいて、これまでに記載されたリンカーを用いて製造されたコンジュゲートｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１より有意に有効である。
【0109】
実施例ＸＰＥＧの長さの評価：
[156] ＰＥＧ４、ＰＥＧ８、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ２４リンカーを用い、かつ抗体当たり種々の個数のＤＭｘを取り込ませて、幾つかのＡｂ−ＰＥＧｎ−Ｍａｌ−ＤＭｘコンジュゲートを製造した。図３４は、きわめて高い１７．１Ｄ／Ａの装填量をもつＡｂ−ＰＥＧ２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが、抗原を発現する癌細胞に非修飾抗体と同様な結合を示すことを証明する（フローサイトメトリーによる相対平均蛍光ＲＭＦ単位で結合を測定）。４〜８Ｄ／Ａを保有するＡｂ−ＰＥＧ８−Ｍａｌ−ＤＭ１およびＡｂ−ＰＥＧ１２−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートも、細胞結合フローサイトメトリーによれば非修飾抗体と同様な結合を示す。ＰＥＧ４、ＰＥＧ８、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ２４リンカーを用いて製造したＡｂ−ＰＥＧｎ−Ｍａｌ−ＤＭｘコンジュゲートは、抗原陽性細胞に対する細胞毒性において有効であった。図３５は、４〜１７Ｄ／Ａをもつ抗ＣａｎＡｇ抗体（ｈｕＣ２４２）−ＰＥＧｎ−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが、ＣａｎＡｇ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５細胞を５日間のインキュベーションに際して約０．１〜０．５ｎＭの有効なＩＣ５０で死滅させたことを証明する。ｐｇｐを発現する多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞は、４〜１７Ｄ／Ａを保有するｈｕＣ２４２−ＰＥＧｎ−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートによって、約０．０５〜０．５ｎＭのＩＣ５０で効果的に死滅した（図３６）。高い１７．１Ｄ／ＡをもつＰＥＧ２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートは、細胞毒性において、４Ｄ／ＡをもつＰＥＧ２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートより有効であった（図３４、３６）。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］
式（１）または（１’）の化合物であって：
Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ （１）
Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ−Ｚ （１’）
［式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合する、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｎは、１から２０００までの整数である］
である、前記化合物。
［態様２］
式（２）または（２’）の細胞結合剤−細胞毒薬コンジュゲートであって：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ］ｍ （２）
［Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （２’）
［式中：
ＣＢは、細胞結合剤を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｍは、２から１５までの整数であり；
ｎは、１から２０００までの整数である］
である、前記コンジュゲート。
［態様３］
式（３）または（３’）の化合物であって：
Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ （３）
Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ−Ｚ （３’）
［式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物にジスルフィド結合により結合した、脂肪族、非芳香族複数環式または芳香族複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｎは、１から１４までの整数である］
である、前記化合物。
［態様４］
式（４）または（４’）の細胞結合剤−細胞毒薬コンジュゲートであって：
ＣＢ−（Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ）ｍ （４）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （４’）
［式中：
ＣＢは、細胞結合剤を表わし；
Ｄは、薬物を表わし；
Ｘは、細胞結合剤に、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合またはエーテル結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
Ｙは、薬物に、ジスルフィド結合により結合した、脂肪族、芳香族または複素環式の単位を表わし；
ｌは、０または１であり；
ｍは、３から８までの整数であり；
ｎは、１から１４までの整数である］
である、前記コンジュゲート。
［態様５］
細胞結合剤が、抗体、一本鎖抗体、標的細胞に優先的に結合する抗体フラグメント、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、標的細胞に特異的に結合するフラグメント、抗体模倣体アドネクチン類、ＤＡＲＰｉｎ類、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、酵素、または栄養素輸送分子である、態様２または４に記載のコンジュゲート。
［態様６］
細胞結合剤が、表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）モノクローナル抗体、表面再構成一本鎖モノクローナル抗体、または標的細胞に優先的に結合する表面再構成モノクローナル抗体フラグメントである、態様２または４に記載のコンジュゲート。
［態様７］
細胞結合剤が、ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化一本鎖モノクローナル抗体、または標的細胞に優先的に結合するヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、態様２または４に記載のコンジュゲート。
［態様８］
抗体が、キメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体、またはそのドメイン抗体フラグメントである、態様５に記載のコンジュゲート。
［態様９］
抗体が、ＭＹ９、抗−Ｂ４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、メソテリン、ｃｒｉｐｔｏ、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６インテグリンまたはＣ２４２である、態様５に記載のコンジュゲート。
［態様１０］
抗体が、Ｍｙ９−６、Ｂ４、Ｃ２４２、Ｎ９０１、ＤＳ６、ＥｐｈＡ２受容体、ＣＤ３８、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣＮＴＯ ９５、Ｂ−Ｂ４、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、またはリツキシマブから選択されるヒト化抗体、ヒト抗体、または表面再構成抗体である、態様５に記載のコンジュゲート。
［態様１１］
細胞結合剤が、腫瘍細胞；ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、または黒色腫細胞；ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＭＹ９、抗−Ｂ４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、メソテリン、ｃｒｉｐｔｏ、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、Ａｐｏ２、およびＣ２４２抗原のうち１以上を発現する細胞；またはインスリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体、および葉酸受容体を発現する細胞から選択される標的細胞に結合する、態様２または４に記載のコンジュゲート。
［態様１２］
腫瘍細胞が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞性肺癌細胞、および精巣癌細胞から選択される、態様１１に記載のコンジュゲート。
［態様１３］
有効量の態様２または４に記載の薬物−細胞結合剤コンジュゲート、その医薬的に許容できる塩または溶媒和物、および医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
［態様１４］
その方法による処置に対して感受性の疾患を処置するための方法であって、その必要がある患者に有効量の態様２または４に記載のコンジュゲートを非経口投与することを含む方法。
［態様１５］
疾患が、腫瘍、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、ウイルス感染症、および寄生虫感染症から選択される、態様１４に記載の方法。
［態様１６］
腫瘍が、肺、血液、血漿、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌のうち１種類以上から選択される、態様１５に記載の方法。
［態様１７］
腫瘍が、ＩＧＦ−ＩＲ、ＦＯＬＲ１、ＣａｎＡｇ、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＭＹ９、抗−Ｂ４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＥｐｈＡ、ＥｐｈＢ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、メソテリン、ｃｒｉｐｔｏ、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、Ａｐｏ２、およびＣ２４２抗原のうち１以上を発現する、態様１５に記載の方法。