特許 5981347 ＰＣＳＫ９アンタゴニスト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5981347

(24)【登録日】2016年8月5日

(45)【発行日】2016年8月31日

(54)【発明の名称】ＰＣＳＫ９アンタゴニスト

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/40 20060101AFI20160818BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160818BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160818BHJP

   A61K 31/197 20060101ALI20160818BHJP

   A61K 31/40 20060101ALI20160818BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20160818BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160818BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160818BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20160818BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/40ZNA

   A61K39/395 P

   A61K45/00

   A61K31/197

   A61K31/40

   A61P3/06

   A61P43/00 121

   !C12N15/00 A

   !C12P21/08

【請求項の数】37

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2012-543320(P2012-543320)

(86)(22)【出願日】2010年12月10日

(65)【公表番号】特表2013-513620(P2013-513620A)

(43)【公表日】2013年4月22日

(86)【国際出願番号】US2010059959

(87)【国際公開番号】WO2011072263

(87)【国際公開日】20110616

【審査請求日】2013年11月12日

(31)【優先権主張番号】61/285,942

(32)【優先日】2009年12月11日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100176094

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 満

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】サラ・ルー

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン・ビー・コーヘン

(72)【発明者】

【氏名】リ・ジュン

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド・ヨーウィー

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０６３３８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０２６５５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３３３０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２０５８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１００２９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 NI YAN G.，A PCSK9 C-TERMINAL DOMAIN BINDING FAB INHIBITS PCSK9 INTERNALIZATION AND RESTORES LDL-UPTAKE，CIRCULATION，米国，LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS，２００９年１１月 １日，V120 N18 SUPPL2，P S477

【文献】 LI HAI，RECENT PATENTS ON PCSK9: A NEW TARGET FOR TREATING HYPERCHOLESTEROLEMIA，RECENT PATENTS ON DNA & GENE SEQUENCES，２００９年１１月，V3 N3，P201-212

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に特異的に結合する抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、
抗体。

【請求項2】

プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に特異的に結合する抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、
抗体。

【請求項3】

重鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

重鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項5】

重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。

【請求項6】

ａ）ＰＣＳＫ９が低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するのを遮断せず、 ｂ）ＰＣＳＫ９が媒介するＬＤＬＲの分解を阻害する、
請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項7】

ヒトＰＣＳＫ９の６８０〜６９２位の残基内の少なくとも１個のアミノ酸に結合する、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項8】

平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が５００ｐＭ以下でヒトＰＣＳＫ９に結合する、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項9】

インビボにおける半減期が少なくとも７日である、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項10】

ＦＡｂ’断片である、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項11】

ＩｇＧである、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項12】

１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項13】

ヒト定常領域を含む、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項14】

担体タンパク質に連結している、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項15】

ＰＥＧ化されている、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。

【請求項16】

請求項１から１４のいずれかに記載の抗体および生理学的に適合した賦形剤を含む組成物。

【請求項17】

個体における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させる第２の薬剤をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

第２の薬剤がスタチンである、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。

【請求項21】

必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃを低下させるための、請求項１６から２０のいずれかに記載の組成物。

【請求項22】

個体がスタチン治療に低応答性または耐性である、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

個体がスタチン治療に不耐性である、請求項２１に記載の組成物。

【請求項24】

個体のベースラインＬＤＬ−Ｃレベルが少なくとも１００ｍｇ／ｄＬである、請求項２１に記載の組成物。

【請求項25】

個体が家族性高コレステロール血症を有する、請求項２１に記載の組成物。

【請求項26】

全コレステロールがＬＤＬ−Ｃと共に低下する、請求項２１に記載の組成物。

【請求項27】

個体がトリグリセリド血症を有する、請求項２１に記載の組成物。

【請求項28】

個体が機能獲得型ＰＣＳＫ９遺伝子変異を有する、請求項２１に記載の組成物。

【請求項29】

個体が薬剤誘導性脂質代謝異常を有する、請求項２１に記載の組成物。

【請求項30】

ＬＤＬ−Ｃの低下に有効な第２の薬剤の治療有効量を個体に投与することを含む、請求項２１に記載の組成物。

【請求項31】

第２の薬剤がスタチンである、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項３０に記載の組成物。

【請求項34】

抗体および第２の薬剤を混合物として同時投与する、請求項３０に記載の組成物。

【請求項35】

抗体および第２の薬剤を別々に同時投与する、請求項３０に記載の組成物。

【請求項36】

抗体を静脈内投与する、請求項２１に記載の組成物。

【請求項37】

抗体を皮下投与する、請求項２１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連特許出願の相互参照
本出願は、全目的のために参照により組み込んだ２００９年１２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／２８５，９４２号の優先権の利益を主張する。

【0002】

本発明は、ＰＣＳＫ９に対する抗体アンタゴニストに関する。

【背景技術】

【0003】

低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）は、血流中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を排除することによってアテローム性動脈硬化および高コレステロール血症を防御する。ＬＤＬ−Ｒは、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型（「ＰＣＳＫ９」）によって翻訳後のレベルが調節される。最近、マウスにおけるＰＣＳＫ９のノックアウトが報告された。これらのマウスでは血漿コレステロールレベルが約５０％低下しており、血漿コレステロール低下においてスタチンに対する高い感受性を示した（Rashid S, et al (2005) Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379。ヒトの遺伝子データによってもＬＤＬ恒常性維持におけるＰＣＳＫ９の役割が裏付けられる。おそらくＰＣＳＫ９の「機能損失」変異と考えられる２つの変異が最近同定された。これらの変異を有する個体は、ＬＤＬ−Ｃの血漿レベルが約４０％低下しており、このことは冠動脈心疾患が約５０〜９０％減少することを意味している。考え合わせると、これらの研究は、ＰＣＳＫ９の阻害剤がＬＤＬ−Ｃの血漿濃度およびＰＣＳＫ９によって媒介されるその他の病的状態の軽減に有益で、効率を高めるために、例えば、コレステロールを低下させるために有用な第２の薬剤と一緒に同時投与することができることを示唆している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（例えば、配列番号４７）と結合し、その機能と拮抗する抗体および、例えば、ＰＣＳＫ９によって媒介される病的状態を治療するためにこのような抗体を使用するための方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

一態様では、本発明はプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合する抗体および抗原結合分子を提供する。いくつかの実施形態では、この抗体は、
ａ）ＰＣＳＫ９が低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するのを阻止せず、
ｂ）ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９の媒介による分解を阻害する。

【0006】

いくつかの実施形態では、この抗体または抗原結合分子はヒトＰＣＳＫ９の６８０〜６９２位の残基内の少なくとも１個のアミノ酸に結合する。例えば、いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子は、アミノ酸配列ＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ（配列番号４９）内のＰＣＳＫ９のエピトープに結合する。

【0007】

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子はヒトＰＣＳＫ９に平衡解離定数（ＫＤ）約５００ｐＭ以下で結合する。例えば、いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子はヒトＰＣＳＫ９に平衡解離定数（ＫＤ）約４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１９０ｐＭ、１８０ｐＭ、１７０ｐＭ、１６０ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭまたはそれ以下で結合する。

【0008】

いくつかの実施形態では、抗体抗原結合分子は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）における半減期が少なくとも約７日である。いくつかの実施形態では、抗体抗原結合分子は、インビボにおける半減期が少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０日である。いくつかの実施形態では、抗体抗原結合分子は、インビボにおけるコレステロール低下効果が少なくとも約２週間、例えば、２、３、４週間またはそれ以上である。好ましくは、インビボにおける半減期はヒト対象において測定する。

【0009】

いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３、および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域と
を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＳＹＹＹＹ（Ａ／Ｎ）ＭＤ（Ａ／Ｆ／Ｓ／Ｖ／Ｙ）（配列番号１４）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３、および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域と
を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＳＹＹＹＹＮＭＤＹ（配列番号１２）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、抗体は、
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３、および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域と
を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＳＹＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１３）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域がアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、配列番号２８と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、軽鎖Ｖセグメントは、配列番号３１と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

【0014】

いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、配列番号２７と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、軽鎖Ｖセグメントは、配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

【0015】

いくつかの実施形態では、重鎖ＦＲ４がヒト生殖系列ＦＲ４である。いくつかの実施形態では、重鎖ＦＲ４が配列番号３５である。

【0016】

いくつかの実施形態では、軽鎖ＦＲ４がヒト生殖系列ＦＲ４である。いくつかの実施形態では、軽鎖ＦＲ４が配列番号３９である。

【0017】

いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントがそれぞれ、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントがそれぞれ、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号７を含み、
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号１０を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号２１を含み、
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号２４を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号２６を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域が配列番号４０の可変領域と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号４１の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0021】

いくつかの実施形態では、抗体が配列番号４０を含む重鎖および配列番号４１を含む軽鎖を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域が配列番号２および配列番号４からなる群から選択される可変領域と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される可変領域と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0023】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域が配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する重鎖を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１７および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する軽鎖を有する。

【0025】

いくつかの実施形態では、抗体はＦａｂ’断片である。いくつかの実施形態では、抗体は１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ１定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域は、細胞または補体のＣ１成分上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＦｃガンマＲ１などのエフェクターリガンドに対する結合親和性が低下するように変異させる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号参照。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５をＡｌａ２３４およびＡｌａ２３５に置換させる。重鎖定常領域中の残基の番号は、ＥＵインデックスの番号である（Kabat, et al., (1983) “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. Dept. Health and Human Servicesを参照のこと）。

【0026】

いくつかの実施形態では、抗体は担体タンパク質、例えば、アルブミンに連結させる。

【0027】

いくつかの実施形態では、抗体はペグ化する。

【0028】

関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。

【0029】

いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む。

【0030】

関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。

【0031】

関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。

【0032】

関連する態様では、本発明はＰＣＳＫ９に結合する抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれ以下の３種類の相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含む
抗体を提供する。

【0033】

他の態様では、本発明は本明細書で記載したような抗体または抗原結合分子および生理学的に適合できる賦形剤を含む組成物を提供する。

【0034】

いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、個体において低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させる第２の薬剤を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、この第２の薬剤はスタチンである。例えば、スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択することができる。

【0036】

いくつかの実施形態では、第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される。

【0037】

他の態様では、本発明は、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロールの低下を必要とする個体におけるＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロールの低下方法であって、個体に本明細書で記載したような抗体または抗原結合分子の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。

【0038】

いくつかの実施形態では、個体は、スタチン治療に低応答性または耐性である。いくつかの実施形態では、個体はスタチン治療に不耐性である。いくつかの実施形態では、個体のベースラインＬＤＬ−Ｃレベルは、少なくとも約１００ｍｇ／ｄＬ、例えば、少なくとも約１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬであるかまたはそれを上回る。いくつかの実施形態では、個体は家族性高コレステロール血症を有する。いくつかの実施形態では、個体はトリグリセリド血症を有する。いくつかの実施形態では、個体は機能獲得型ＰＣＳＫ９遺伝子変異を有する。いくつかの実施形態では、薬剤誘導性脂質代謝異常を有する。

【0039】

いくつかの実施形態では、全コレステロールがＬＤＬ−Ｃと共に低下する。

【0040】

いくつかの実施形態では、方法がＬＤＬ−Ｃの低下に有効な第２の薬剤の治療有効量を個体に投与することをさらに含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、第２の薬剤はスタチンである。例えば、スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択することができる。

【0042】

いくつかの実施形態では、第２の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそれらの類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤、甲状腺ホルモン様物質、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される。

【0043】

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子および第２の薬剤は混合物として同時投与される。

【0044】

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合分子および第２の薬剤は別々に同時投与される。

【0045】

いくつかの実施形態では、抗体は静脈内投与される。いくつかの実施形態では、抗体は皮下投与される。

【0046】

定義
「抗体」とは、イムノグロブリンファミリーのポリペプチドまたは非共有的、可逆的、かつ特異的な様式で対応する抗原に結合することができるイムノグロブリンの断片を含むポリペプチドを意味する。抗体構造単位の一例には、テトラマーが含まれる。各テトラマーは、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対は、ジスルフィド結合によって連結した１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。確認されたイムノグロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、次に、それぞれイムノグロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを決定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００個から１１０個以上のアミノ酸の可変領域を決定する。可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）および可変重鎖（Ｖ_Ｈ）という用語はそれぞれ、軽鎖および重鎖のこれらの領域を意味する。本出願で使用したように、「抗体」は、特に、例えばＰＣＳＫ９に対して、特定の結合性を有する抗体およびその断片の変種全てを包含する。したがって、この概念の範囲内には、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および同じ結合特異性を有するこれらの断片の多量体変種（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２）が存在する。

【0047】

「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は同義で、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈの超可変領域を意味する。ＣＤＲとは、このような標的タンパク質に特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。ヒトＶ_ＬまたはＶ_Ｈそれぞれには３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から順番に番号付け）があり、可変ドメインの約１５〜２０％を構成する。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに対して構造的に相補的であり、したがって、結合特異性に直接関与する。Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈの残りの連続部分、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列の変動が少ないことが示された（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。

【0048】

ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当業界で周知の様々な定義法、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｃｈｏｔｈｉａ，ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）およびＡｂＭ（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)；Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)；Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)；Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)を参照のこと）を使用して決定する。抗原結合（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位の定義はまた、以下に記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219?221 (2000)およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)；MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268?9272 (1989)；Martin et al., Methods Enzymol., 203:121?153 (1991)およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141?172 (1996)。

【0049】

「結合特異性決定基」または「ＢＳＤ」という用語は同義で、抗体の結合特異性を決定するために必要な相補性決定領域内の最小限の連続または非連続アミノ酸配列を意味する。最小限の結合特異性決定基は、１個または複数のＣＤＲ配列内にあってもよい。いくつかの実施形態では、最小限の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３配列の一部または完全長内に存在する（すなわち、それによってのみ決定される）。

【0050】

本明細書で使用した「抗体軽鎖」または「抗体重鎖」はそれぞれ、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈを含むポリペプチドを意味する。内在性Ｖ_Ｌは、遺伝子セグメントＶ（可変）およびＪ（連結）によってコードされ、内在性Ｖ_ＨはＶ、Ｄ（多様性）およびＪによってコードされる。Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈのそれぞれは、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む。本出願では、抗体軽鎖および／または抗体重鎖は、時々、集合的に「抗体鎖」を意味することもある。これらの用語には、当業者であれば容易に理解するように、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈの基本構造を破壊しない変異を含有する抗体鎖が包含される。

【0051】

抗体は、完全なイムノグロブリンとして、または様々なペプチダーゼで消化することによって生成したいくつかの良く特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合より下で抗体を消化して、それ自体がＦａｂ’の二量体、Ｆ（ａｂ）’_２を生じ、Ｆａｂ’はＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１にジスルフィド結合によって連結した軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’_２は、穏和な条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド結合が切断し、それによってＦ（ａｂ）’_２二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体はヒンジ領域の一部を含むが、本質的にはＦａｂである。Paul, Fundamental Immunology 3d ed. (1993)。様々な抗体断片が完全な抗体の消化に関して定義されているが、当業者であれば、このような断片は化学的に、または組換えＤＮＡ法を使用することによって、新たに合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用したように、「抗体」という用語はまた、抗体全体の改変によって生成した抗体断片、または組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成された抗体断片（例えば、１本鎖Ｆｖ）またはファージディスプレーライブラリーを使用して同定された抗体断片を含む（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照のこと）。

【0052】

モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製では、当業界で公知の任意の技術を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)；Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)；Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985を参照のこと）。１本鎖抗体を生成するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体の生成に適合させることができる。また、トランスジェニックマウス、またはその他の生物、例えば、その他の哺乳類を、ヒト化抗体の発現のために使用することができる。あるいは、ファージディスプレー技術は、選択した抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂ断片を同定するために使用することができる（例えば、McCafferty et al.、前述; Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)を参照のこと）。

【0053】

非ヒト抗体のヒト化または霊長類化の方法は、当業界では周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである原料からヒト化抗体に導入された１個または複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、移入残基（ｉｍｐｏｒｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）と呼ばれることが多く、通常は移入可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲ（複数）配列またはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと）にしたがって本質的に実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種の対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は通常、いくつかの相補性決定領域（ＣＤＲ）残基およびおそらくいくつかのフレームワーク（「ＦＲ」）残基が齧歯類抗体の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体である。

【0054】

「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変化したクラス、エフェクター機能および／または種類の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子および薬剤に結合するように定常領域またはその一部が変化、置換または交換しているか、あるいは（ｂ）可変領域、またはその一部が、異なるかまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化しているか、置換または交換している抗体分子である。

【0055】

本発明の抗体または抗原結合分子はさらに、化学的に結合した、またはその他のタンパク質との融合タンパク質として発現した、１個または複数のイムノグロブリン鎖を含む。二特異性抗体も含む。二特異性または二機能性抗体は、２個の異なる重鎖／軽鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。本発明のその他の抗原結合断片または抗体部分には、２価ｓｃＦｖ（二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ））、抗体分子が２個の異なるエピトープを認識する二特異性ｓｃＦｖ抗体、単一の結合ドメイン（ｄＡｂ）および小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）が含まれる。

【0056】

本明細書で記載した様々な抗体または抗原結合断片は、完全な抗体の酵素的もしくは化学的改変によって生成することができるか、または組換えＤＮＡ法を使用して新たに合成することができ（例えば、１本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレーライブラリーを使用して同定することができる（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990を参照のこと）。例えば、小型抗体は、当業界で記載された方法、例えば、Vaughan and Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001を使用して作製することができる。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む様々な方法によって生成することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)）を参照のこと。１本鎖抗体は、ファージディスプレーライブラリーまたはリボソームディスプレーライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリーを使用して同定することができる。このようなライブラリーは、合成、半合成または天然および免疫適格性材料から構築することができる。

【0057】

「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変化したクラス、エフェクター機能および／または種類の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子および薬剤等に結合するように定常領域またはその一部が変化、置換または交換しているか、あるいは（ｂ）可変領域、またはその一部が、異なるかまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化しているか、置換または交換している抗体分子である。例えば、以下の実施例で示したように、マウス抗ＰＣＳＫ９抗体は、その定常領域をヒトイムノグロブリンの定常領域と置換することによって改変することができる。ヒト定常領域と置換することによって、キメラ抗体はヒトＰＣＳＫ９の認識においてその特異性を保持することができる一方、元のマウス抗体と比較してヒトにおける抗原性が低下する。

【0058】

「抗体結合分子」または「非抗体リガンド」という用語は、非イムノグロブリンタンパク質骨格を使用する抗体様物質を意味しており、アドネクチン、アビマー、１本鎖ポリペプチド結合分子および抗体様結合ペプチド様物質が含まれる。

【0059】

「可変領域」または「Ｖ領域」という用語は同義で、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖または軽鎖を意味する。図１参照のこと。内在性可変領域は、イムノグロブリン重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子または軽鎖Ｖ−Ｊ遺伝子によってコードされる。Ｖ領域は、天然に生じるか、組換えられているか、または合成されていてもよい。

【0060】

本明細書で使用したように、「可変セグメント」または「Ｖセグメント」という用語は同義で、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含む可変領域の部分配列である。図１参照のこと。内在性Ｖセグメントは、イムノグロブリンＶ遺伝子によってコードされる。Ｖセグメントは、天然に生じるか、組換えられているか、または合成されていてもよい。

【0061】

本明細書で使用したように、「Ｊセグメント」という用語は、ＣＤＲ３およびＦＲ４のＣ末端部分を含む、コードされた可変領域の部分配列を意味する。内在性Ｊセグメントは、イムノグロブリンＪ遺伝子によってコードされる。図１参照のこと。Ｊセグメントは、天然に生じるか、組換えられているか、または合成されていてもよい。

【0062】

「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持する一方、ヒトにおける免疫原性が少ない抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残存する部分をヒトの対応部分と置換することによって実現することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照のこと。

【0063】

「対応するヒト生殖系列配列」という用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン可変領域配列によってコードされた公知のその他の可変領域アミノ酸配列全てと比較して、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列との決定されたアミノ酸配列同一性が最高であるヒト可変領域アミノ酸配列または部分配列をコードする核酸配列を意味する。対応するヒト生殖系列配列はまた、その他の評価された可変領域アミノ酸配列全てと比較して、参照可変領域アミノ酸配列または部分配列とのアミノ酸配列同一性が最高であるヒト可変領域アミノ酸配列または部分配列を意味することができる。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変セグメント（上記で定義）または可変領域を含む配列もしくは部分配列のその他の組み合わせであってもよい。配列同一性は、本明細書で記載した方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたは当業界で公知の別の配列比較アルゴリズムを使用して、２つの配列をアラインメントさせることによって決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸配列またはアミノ酸配列は、参照可変領域核酸配列またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％の配列同一性を有することができる。対応するヒト生殖系列配列は、例えば、公式に利用可能な国際的ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）およびＶ−ｂａｓｅ（ワールドワイドウェブｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）によって決定することができる。

【0064】

抗原、例えば、タンパク質と抗体または抗体由来の結合物質との間の相互作用を述べる場合に使用したときの「特異的に（または選択的に）結合する」という表現は、タンパク質およびその他の生物学的物質の不均一な集団、例えば、生物学的試料、例えば、血液、血清、血漿または組織試料中における抗原の存在を決定する結合反応を意味する。したがって、指定した免疫アッセイ条件下では、特定の結合特異性を有する抗体または結合物質は、背景の少なくとも２倍で特定の抗原と結合し、試料中に存在するその他の抗原とは有意な量では実質的に結合しない。このような条件下での抗体または結合物質の特異的結合には、抗体または物質が特定のタンパク質に対する特異性で選択されることが必要であり得る。所望であれば、または適切であれば、この選択は、例えば、その他の種（例えば、マウス）のＰＣＳＫ９分子またはその他のＰＣＳＫ亜型と交差反応する抗体を差し引くことによって実現することができる。様々なイムノアッセイ形式を、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、イムノアッセイ形式および特異的免疫反応を測定するために使用できる条件についての説明は、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照のこと）。典型的は、特異的または選択的結合反応は、背景シグナルの少なくとも２倍のシグナルを生成し、より典型的には背景の少なくとも１０から１００倍のシグナルを生成する。

【0065】

「平衡解離定数（Ｋ_Ｄ、Ｍ）」という用語は、結合速度定数（ｋ_ａ、時間^−１、Ｍ^−１）によって除した解離速度定数（Ｋ_ｄ、時間^−１）を意味する。平衡解離定数は、当業界で公知の任意の方法を使用して測定することができる。本発明の抗体の平衡解離定数は一般的に、約１０^−７または１０^−８Ｍ未満、例えば、約１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満、いくつかの実施形態では、約１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍまたは１０^−１３Ｍ未満である。

【0066】

本明細書で使用したように、「抗原結合領域」という用語は、分子とＰＣＳＫ９の特異的結合に関与する本発明のＰＣＳＫ９結合分子のドメインを意味する。抗原結合領域には、少なくとも１個の抗体重鎖可変領域および少なくとも１個の抗体軽鎖可変領域が含まれる。本発明の各ＰＣＳＫ９結合分子にはこのような抗原結合領域が少なくとも１個存在し、抗原結合領域はそれぞれその他のものと同一であるかまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のＰＣＳＫ９結合分子の抗原結合領域の少なくとも１個はＰＣＳＫ９のアンタゴニストとして作用する。

【0067】

本明細書で使用した「アンタゴニスト」という用語は、標的分子に特異的に結合して標的分子の活性を阻害することができる薬剤を意味する。例えば、ＰＣＳＫ９のアンタゴニストは、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解を完全に、または部分的に阻害する。ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解の阻害は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を妨害してもよく、または妨害しなくてもよい。いくつかの場合において、ＰＣＳＫ９アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９に結合しＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する能力によって同定することができる。ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解が、本発明のアンタゴニストに曝露したときに生じる阻害は、対照の存在下またはアンタゴニストなしでのＰＣＳＫ９媒介による分解と比較して、少なくとも約１０％低下している、例えば、少なくとも約２５％、５０％、７５％低下しているか、または完全な阻害である。対照は、抗体もしくは抗原結合分子に曝露しないか、または別の抗原に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合分子、またはアンタゴニストとしての機能を果たすことが知られていない抗ＰＣＳＫ９抗体もしくは抗原結合分子であってもよい。「抗体アンタゴニスト」とは、アンタゴニストが阻害抗体である場合を意味する。

【0068】

「ＰＣＳＫ９」または「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型」という用語は同義で、分泌型サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属する天然に生じるヒトプロタンパク質転換酵素を意味する。ＰＣＳＫ９は、小胞体において自己触媒的細胞内プロセシングを受ける可溶性酵素前駆体として合成され、プロタンパク質転換酵素として機能を果たすと考えられている。ＰＣＳＫ９は、コレステロール恒常性維持において役割を果たし、皮質ニューロンの分化において役割を担う可能性がある。このＰＣＳＫ９遺伝子における変異は、常染色体優性家族性高コレステロール血症の形態に関連づけられている。例えば、Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26を参照のこと。ＰＣＳＫ９の核酸配列およびアミノ酸配列は公知で、それぞれジェンバンク受入番号ＮＭ＿１７４９３６．２およびＮＰ＿７７７５９６．２として発表された。本明細書で使用したように、ＰＣＳＫ９ポリペプチドは、ＬＤＬＲに機能的に結合し、ＬＤＬＲの分解を促進する。構造的に、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列は、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿７７７５９６．２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。構造的に、ＰＣＳＫ９核酸配列は、ジェンバンク受入番号ＮＭ＿１７４９３６．２の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0069】

「ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異」という表現は、例えば、ＬＤＬＲ分解の増加およびＬＤＬＲレベルの低下による家族性高コレステロール血症表現型、加速化アテローム硬化症および早期冠状動脈心疾患（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）に関連した、かつ／または原因となる、ＰＣＳＫ９遺伝子中に生じる天然の突然変異を意味する。ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異の対立遺伝子出現頻度は稀である。Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev. (2008) 29(1):11-26を参照のこと。ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異の例には、Ｄ１２９Ｎ、Ｄ３７４Ｈ、Ｎ４２５ＳおよびＲ４９６Ｗが含まれる。Fasano, et al., Atherosclerosis (2009) 203(1):166-71を参照のこと。ＰＣＳＫ９機能獲得型突然変異は、例えば、Burnett and Hooper、前述；Fasano, et al、前述；Abifadel, et al., J Med Genet (2008) 45(12):780-6；Abifadel, et al., Hum Mutat (2009) 30(4):520-9およびLi, et al., Recent Pat DNA Gene Seq (2009) Nov. 1 (PMID 19601924)に概説されている。

【0070】

本発明のポリペプチドの「活性」とは、天然の細胞または組織におけるポリペプチドの構造的、調節的または生化学的機能を意味する。ポリペプチドの活性の例には、直接的活性および間接的活性の両方が含まれる。ＰＣＳＫ９の直接的活性の例は、ＬＤＬＲへの結合およびＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解を含む、ポリペプチドとの直接的相互作用の結果である。ＰＣＳＫ９の場合の間接的活性の例は、ポリペプチドの直接的活性に対する細胞、組織、臓器または対象における表現型の変化または応答、例えば、増加した肝臓ＬＤＬＲの低下、血漿ＨＤＬ−Ｃの低下、血漿コレステロールの減少、スタチンに対する感受性の増加として観察される。

【0071】

核酸またはタンパク質に適用したときの「単離した」という用語は、核酸またはタンパク質が、天然の状態で関連しているその他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。好ましくは均一な状態である。乾燥しているか、または水溶液であってもよい。純度および均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの化学分析技術を使用して測定する。調製物中に存在する主な種がタンパク質であれば、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、関心のある遺伝以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製した」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを意味する。特に、核酸またはタンパク質は少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。

【0072】

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖または２本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを意味する。特に限定はしないが、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に生じるヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に指示がなければ、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明瞭に指示された配列も非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１個または複数の選択される（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって実現することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。

【0073】

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書では同義で、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に生じるアミノ酸ポリマーおよび天然には生じないアミノ酸ポリマーに適用される。

【0074】

「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に生じるアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然に生じるアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸ならびに後で改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド主鎖を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と類似の方法で機能する化合物を意味する。

【0075】

「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を意味する。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸、アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置において、コードするポリペプチドを変化させることなく、記載した対応するコドンのいずれかにコドンを変化させることができる。このような核酸の変動は、「サイレント変動」であり、保存的に改変された変動の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全核酸配列はまた、核酸の可能な全サイレント変動を記載する。当業者であれば、核酸の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を生じるために改変することができることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変動は、記載した各配列に事実上含まれる。

【0076】

アミノ酸配列については、当業者であれば、コードされた配列の１個のアミノ酸またはごく少数のアミノ酸を変化させるか、付加するか、または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変化が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を引き起こす場合、「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸をもたらす保存的置換の一覧は、当業界では周知である。このような保存的に改変された変異体はさらに、本発明の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子を排除しない。

【0077】

以下の８群はそれぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。

【0078】

「配列同一性のパーセント」は、比較窓にわたって２種類の最適にアラインメントさせた配列を比較することによって決定され、比較窓中のポリヌクレオチド配列の一部は、２種類の配列の最適なアラインメントのために付加または欠失を含まない参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列内に生じる位置の数を測定して、一致した位置の数を出し、一致した位置の数を比較窓中の位置の全数によって除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを出すことによって算出する。

【0079】

２種以上の核酸またはポリペプチド配列の場合、「同一な」またはパーセント「同一性」という用語は、配列が同じ２種以上の配列または部分配列を意味する。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動のアラインメントおよび目視検査によって測定したときに、比較窓または指定した領域にわたって最大限対応するように比較し、アラインメントさせたとき、２種類の配列が特定のパーセントの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合（すなわち、特定の領域にわたって、または特定していないときは、参照配列の全配列にわたって、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する場合）、２種類の配列は「実質的に同一」である。本発明は、本明細書で例示したポリペプチドまたはポリヌクレオチドそれぞれに実質的に同一なポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する（例えば、配列番号１〜５、１５〜１９および４０〜４１のいずれか１つに例示した可変領域、配列番号２７〜３１のいずれか１つに例示した可変セグメント、配列番号６〜１４、２０〜２６のいずれか１つに例示したＣＤＲ、配列番号３２〜３９のいずれか１つに例示したＦＲ、配列番号４２〜４５のいずれか１つに例示した核酸配列）。所望により、同一性は長さが少なくとも約１５、２５または５０ヌクレオチドの領域にわたって、より好ましくは、長さが１００から５００または１０００以上のヌクレオチドである領域にわたって、あるいは参照配列の全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０個のアミノ酸の領域にわたって、所望により長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００個のアミノ酸にわたって、所望により少なくとも約１５０、２００または２５０個のアミノ酸にわたって、あるいは参照配列の全長にわたって存在し得る。より短いアミノ酸配列、例えば、アミノ酸２０個以下のアミノ酸配列に関して、本明細書で定義した保存的置換によって、１個または２個のアミノ酸残基が保存的に置換されているとき、実質的同一性が存在する。

【0080】

配列比較のため、通常、１配列は、試験配列を比較する参照配列とする。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、その後の位置を指定し、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用することができ、または代わりのパラメータを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメータをベースにして、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。

【0081】

本明細書で使用した「比較窓」には、２種類の配列を最適にアラインメントさせた後、１配列を同数の連続した位置の参照配列と比較することができる２０から６００、通常約５０から約２００、より通常は約１００から約１５０からなる群から選択される連続した位置の数のいずれか１個のセグメントに対する参照が含まれる。比較のための配列のアラインメント方法は、当業界では周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる手法（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照のこと）によって実施することができる。

【0082】

パーセント配列同一性および類似性を決定するために適切なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムで、それぞれAltschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公式に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列内の長さがＷの短いワードであって、データベース配列内の同じ長さのワードとアライメントしたときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすワードを同定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、前述）。これら最初の近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットは、累積アライメントスコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対の一致残基に対するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスを用いて累積スコアを算出する。累積アライメントスコアが最高到達値から数量Ｘだけ低下した場合；負のスコアを有する残基アライメントが１個または複数累積したことにより累積スコアが０以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合には、各方向におけるワードヒットの伸長が停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、既定値として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、規定値として、ワード長３および期待値（Ｅ）１０を用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと）は、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。

【0083】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２種類の配列の類似性の統計学的分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってもたらされた類似性の１測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２種類のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一致が偶然生じる可能性の指標となる。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であるならば、その核酸は、参照配列と類似であると考えられる。

【0084】

２種類の核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第１の核酸によってコードされたポリペプチドが、以下に説明したように、第２の核酸によってコードされたポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、ポリペプチドは通常、第２のポリペプチドと実質的に同一で、例えば、２種類のペプチドは保存的置換のみが異なる。２種類の核酸配列が実質的に同一である別の指標は、以下に説明したように、２種類の分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２種類の核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅することができることである。

【0085】

本発明のＰＣＳＫ９結合分子内で抗原結合領域がどのように連結するかを説明する場合に使用される「結合（ｌｉｎｋ）」という用語は、物理的に領域を結合するために可能な手段全てを包含する。多数の抗原結合領域は、共有結合（例えば、ペプチド結合またはジスルフィド結合）または非共有結合などの化学的結合によって結合することが多く、直接的結合（すなわち、２種類の抗原結合領域の間にリンカーがない）であってもよく、または間接的結合（すなわち、２種類以上の抗原結合領域の間の少なくとも１個のリンカー分子による）であってもよい。

【0086】

「対象」、「患者」および「個体」という用語は同義で、哺乳類、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類哺乳類を意味する。哺乳類はまた、実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターであってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳類は農業用哺乳類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）または家畜哺乳類（例えば、イヌ、ネコ）であってもよい。

【0087】

「治療上許容される量」または「治療有効用量」は同義で、所望する結果を達成するために（すなわち、血漿非ＨＤＬ−Ｃ、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患の減少）十分な量を意味する。いくつかの実施形態では、治療上許容される量は、所望しない副作用を誘導しないか、または引き起こさない。治療上許容される量は、まず低用量を投与し、次に、所望する効果が実現するまで、その用量を徐々に増加させることによって決定することができる。本発明のＰＣＳＫ９拮抗抗体の「予防的有効用量」は、ＰＣＳＫ９の存在に関連した疾患症状（例えば、高コレステロール血症）の発症を防御するができ、「治療有効用量」は疾患症状の重症度の減少を引き起こすことができる。前記用語はまた、疾患症状のない期間の頻度を高め、持続期間を延長させることができる。「予防有効用量」および「治療有効用量」はまた、ＰＣＳＫ９の活性から生じた障害および疾患による機能障害または能力障害を予防するかまたは回復させることができる。

【0088】

「同時投与」という用語は、個体の血液における２種類の活性薬剤の同時存在を意味する。同時投与された活性薬剤は、同時に、または順次送達され得る。

【0089】

本明細書で使用したように、「本質的に構成される」という表現は、方法または組成物に含まれた活性のある医薬品の部類または種類ならびに方法または組成物の企図した目的のために不活性な任意の賦形剤を意味する。いくつかの実施形態では、「本質的に構成される」という表現は、本発明のアンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体以外の１種または複数の追加的活性薬剤の包含を明白に除外する。いくつかの実施形態では、「本質的に構成される」という表現は、本発明のアンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体以外の１種または複数の追加的活性薬剤および第２の同時投与された薬剤の包含を明白に除外する。

【0090】

「スタチン」という用語は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素の競合的阻害剤である薬理学的作用物質の種類を意味する。

【図面の簡単な説明】

【0091】

【図1】図１は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０の重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号１５）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。

【0092】

【図2】図２は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９の重鎖（配列番号２）および軽鎖（配列番号１６）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。

【0093】

【図3】図３は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０の重鎖（配列番号２）および軽鎖（配列番号１８）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。

【0094】

【図4】図４は、親マウスモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の重鎖（配列番号４）および軽鎖（配列番号１６）アミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列には下線を引き、太字にしている。

【0095】

【図5】図５Ａ〜Ｃは、いくつかの異なるヒトおよびマウス抗原に対するＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＮＸ−４と比較したＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を試験するＥＬＩＳＡアッセイを示す。

【0096】

【図6】図６Ａ〜Ｃは、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）Ｐｃｓｋ９に対するＥＬＩＳＡにおけるＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（Ｂ）およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１（Ｃ）の結合を示す。第２抗体はヤギ抗マウス抗体で、１：５０００に希釈する。第２のみ（２ｎｄ ｏｎｌｙ）とは、第２抗体のみの対照である。

【0097】

【図7】図７は、親マウスモノクローナル抗体、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０がＰＣＳＫ９のＣ末端、残基６８０〜６９２（ＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ；配列番号４９）に結合することを示す。Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１は同じエピトープで競合する。Ｃ−末端変異体Ａ６８５Ｘ＝配列番号５６である。

【0098】

【図8】図８は、親マウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０（５ｐ２０）は、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）生化学アッセイで測定すると、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒの相互作用を十分に分断しないことを示す。対照的に、１３Ｃ１０は、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ ＦＲＥＴ相互作用をＩＣ_５０５０ｎＭで分断する。アッセイ緩衝液中（ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．２、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＣａＣｌ_２ １ｍＭ、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ）で、蛍光色素（ｈＰＣＳＫ９−ＡＦ）で標識したヒトＰＣＳＫ９をＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１または１３Ｃ１０で室温で３０分間インキュベートした。この後ユーロピウム標識ＬＤＬ−Ｒ（ｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ）を添加し、室温で９０分間さらにインキュベートし、したがって、最終濃度はｈＰｃｓｋ９−ＡＦ ８ｎＭおよびｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ １ｎＭであった。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル（３３０ｎｍ励起および６６５ｎｍ放射）をプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定し、５Ｐ２０または１３Ｃ１０存在下での％阻害を計算した。ＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）でパーセント阻害値をプロットすることによって計算した。各データ点は平均±ＳＤ（点当たりｎ＝４連）を表す。データは、少なくとも２回の独立した実験を表す。

【0099】

【図9】図９は、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１が、ＬＤＬ−Ｒレベルの増加およびＨｅｐＧ２細胞によるＬＤＬ取り込みの誘導についてマウス抗体ＬＦＵ７２０と同等であることを示す。ＬＤＬ−Ｒ測定のため、細胞をＰＣＳＫ９結合抗体でインキュベートし、抗ＬＤＬ−Ｒ抗体で標識した。ＬＤＬ取り込みのため、細胞をＰＣＳＫ９結合抗体、ＰＣＳＫ９およびＤｉＩ−ＬＤＬでインキュベートした。ＬＤＬ−Ｒ抗体およびＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光はフローサイトメトリーで測定した。反復測定の平均＋ＳＥＭを各アッセイについて示す。結果は、３回の独立した実験を表す。

【0100】

ＬＤＬ取り込みアッセイのために、１０％牛胎児リポタンパク質欠乏血清（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）およびヒトＰＣＳＫ９（Hampton et al. PNAS (2007) 104:14604-14609）２００ｎＭを含有するＤＭＥＭ中でＰＳＣＫ９結合抗体を室温で３０分間インキュベートし、抗体／ＰＣＳＫ９／培地溶液を９６ウェルプレート中の細胞に添加し、一晩インキュベートした。翌日、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸塩標識ＬＤＬ（ＤｉＩ−ＬＤＬ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をさらに２時間かけて添加した。次に培地を吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで分離した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（５％牛胎児血清、ＥＤＴＡ ２ｍＭおよび０．２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）に移し、１０００×ｇで１０分間遠心し、吸引し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＬＤＬ取り込みは、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ ＩＩ）を使用して、細胞のＤｉＩ蛍光（４８８ｎｍで励起し、５７５ｎｍで放射）によって測定した。表面ＬＤＬ−Ｒアッセイのために、抗体を含有する無血清培地で細胞をインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ベルシン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、１７−７７１Ｅ）およびＦＡＣＳ緩衝液中に採取した。細胞を新たなプレートに移し、１２００ｒｐＭで５分間遠心し、正常なウサギＩｇＧ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で遮断した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中でウサギ抗ｈＬＤＬ−Ｒ−Ａｌｅｘａ６４７ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）標識抗体で標識し、遠心して、洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。表面ＬＤＬ−Ｒは、フローサイトメトリー（４８８ｎｍで励起し、６３３ｎｍで放射）によって測定した。ＥＣ５０はＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して計算した。

【0101】

【図10】図１０は、本発明の抗体のコレステロール低下効果を測定するためのヒトＰＣＳＫ９注入マウスモデルの研究設計の概略を示す。ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１は、マウスＰＣＳＫ９には検出可能な結合は示さないが、ｈＰＣＳＫ９には高い親和性で結合するＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗ＰＣＳＫ９抗体である。ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０またはＬＧＴ２１１がｈＰＣＳＫ９媒介による非ＨＤＬコレステロールの上昇を阻害し、かつＰＣＳＫ９媒介による肝ＬＤＬＲの分解を防御できるかどうかを試験するために、ｈＰＣＳＫ９を含有する浸透圧ミニポンプを埋め込む（持続注入のため）３時間前にこれらの抗体を各マウスに注射した。血漿および肝臓組織採取は、ｈＰＣＳＫ９注射の２４時間後に実施した。

【0102】

【図11】図１１は、注入マウスモデルにおいて、抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１による処理がヒトＰＣＳＫ９（「ｈＰＣＳＫ９」）の蓄積を引き起こしたことを示している。簡単に説明すると、全ｈＰＣＳＫ９は捕捉用にｍＡｂ７Ｄ１６を使用したＥＬＩＳＡによって測定した。ｍＡｂ７Ｄ１６はＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１よりもＰＣＳＫ９上のエピトープに結合し、全（遊離および結合）ＰＣＳＫ９を測定するために使用することができる。全ｈＰＣＳＫ９で認められた増加はおそらく、ｈＰＣＳｋＫ９／Ａｂ複合体の増加によるものであろう。遊離抗体は捕捉用にｈＰＣＳＫ９を使用するＥＬＩＳＡによって測定した。このアッセイでは、「遊離」抗体が測定され、おそらく１：１Ａｂ：ＰＣＳＫ９複合体が測定される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを媒体単独、ＰＣＳＫ９単独、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１ ２０ｍｇ／ｋｇ、またはマウス非特異的ＩｇＧ混合物（陰性対照）で処理した。個々のデータ点をプロットし、平均値は水平線で明示し、ｐ＜０．０５は有意とみなした。

【0103】

血漿ＩｇＧレベルは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって定量した。遊離抗体は捕捉用のｈＰＣＳＫ９を使用して測定した。このアッセイでは、「遊離」抗体が測定され、おそらく１：１Ａｂ：ＰＣＳＫ９複合体が測定される。ＩｇＧ ＭＳＤアッセイでは、ＭＳＤ標準９６プレート（Ｌ１１ＸＡ−３）を使用した。簡単に説明すると、ＰＢＳに溶かした捕捉抗原ＰＣＳＫ９−ｈｉｓ １μｇ／ｍｌの２５から２８μｌ（２５〜２８ｎｇ／ウェル）でプレートを４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を除去し、プレートを５％ＭＳＤブロッカーＡ（Ｒ９３ＡＡ−２）１５０μｌ／ウェルで室温で１時間振盪して遮断した。プレートをＰＢＳ+０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０の３００μｌで３回洗浄した後、ＩｇＧ標準物質希釈物（ＭＳＤブロッカーＡで１０，０００から０．０００３ｎｇ／ｍｌまでの１０段階に希釈）、未知の血漿試料希釈物（ＭＳＤブロッカーＡで１０，０００倍）または品質対照試料２５μｌを添加し、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、検出抗体１μｇ／ｍｌ（ＭＳＤヤギ抗マウスＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体、Ｒ３２ＡＣ−５、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈）２５μｌ／ウェルを添加し、室温で１時間振盪しながらインキュベートした。洗浄し、１倍読み取り緩衝液Ｔ １５０μｌ／ウェルを添加した後、プレートをＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００ですぐに読み取った。標準曲線および未知の試料のプロットは、ＭＳＤデータ分析ソフトウェアを使用して計算した。

【0104】

血漿ＩｇＧおよびｈＰＣＳＫ９の両レベルは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって定量した。ＭＳＤ ｈＰＣＳＫ９アッセイは、ＩｇＧアッセイと類似しているが、以下を除く。プレートを捕捉抗体（７Ｄ１６．Ｃ３：２．９５ｍｇ／ｍｌ）１μｇ／ｍｌの２５〜２８μｌでコーティングした。ｍＡｂ７Ｄ１６はＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１よりもＰＣＳＫ９上のエピトープに結合し、全（遊離および結合）ＰＣＳＫ９を測定するために使用することができる。プレートを遮断した後、ｈＰＣＳＫ９標準物質希釈物（１０，０００から０．０００３ｎｇ／ｍｌの１０箇所）および血漿試料希釈物（ＭＳＤブロッカーＡで１０，０００倍）２５μｌを室温で１時間振盪しながらインキュベートし、その後１次検出抗体（ウサギ抗ＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体、Ａｂ４、施設内ウサギ（ｉｎ ｈｏｕｓｅ ｒａｂｂｉｔ）ＩＤ＃ＲＢ１１８３５）でインキュベートした。ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み取る前に、２次検出抗体（ＭＳＤヤギ抗ウサギＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識検出抗体、Ｒ３２ＡＢ−５）によるインキュベーション工程を追加した。全ｈＰＣＳＫ９で認められた増加はおそらく、ｈＰＣＳｋＫ９／Ａｂ複合体の増加によるものであろう。統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０２（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して群の差を分析し、全体の差が見出されたときは、ニューマンクールズのポストホック検定を使用して処理群の具体的な鎖を決定した。

【0105】

【図12】図１２は、注入マウスモデルにおいて、抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１がｈＰＣＳＫ９媒介による分解から肝ＬＤＬ−Ｒの防御をもたらすことを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを媒体単独、ＰＣＳＫ９単独、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１ ２０ｍｇ／ｋｇ、または非特異的ＩｇＧ混合物（陰性対照）で処理した。個々の動物の肝臓試料を示す。

【0106】

細胞膜試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、２０列の４〜１２％ビス−トリスＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｉｄｉゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＷＧ１４０２ＢＸ１０）を使用してＭＯＰＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００１）を用いて実施した。調製した試料は、７０℃で１０分間加熱し、氷上に置き、その後Ｍａｔｒｉｘマルチチャンネルピペッターを使用して各試料１０μｌをゲル上に添加した。大きさの決定およびゲル方向を示すため、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ５９２５）を試料の横に添加した。色素の先端がゲルの底に到達するまで、ゲルを２００Vの定電圧で泳動した。電気泳動後、ｉＢｌｏｔユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＩＢ１００１ＥＵ）を使用してゲルをニトロセルロース膜（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩＢ３０１０−０１）に移した。移動は２０Ｖで７分間実施した。移動後、膜をＰｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ ３７５３６）で少なくとも３０分間遮断した。膜を「食品密封」袋に入れ、次いでＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中にウサギ抗ＬＤＬＲ抗体の１：５００希釈物を添加し、その後４℃で振盪しながら一晩インキュベートした。膜を振盪しながらＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎで５分間ずつ５回濯ぎ、その後Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中でヤギ抗ウサギＨＲＰ ２次抗体の１：３０，０００希釈物を膜に１時間添加した。膜をＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで振盪しながら５分間ずつ５回再度濯いだ。ＨＲＰ結合体は、Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学ルミネセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ ３７０７９）を使用して、製造者の指示に従って検出した。簡単に説明すると、ペルオキシド溶液およびルミノール／エンハンサー溶液を同部ずつ混合し、膜に５分間添加した（０．２ｍｌ／ｃｍ^２）。過剰な溶液をブロッティングによって除去し、膜を曝露用のＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＲ Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ ８７０ １３０２）に曝露した。

【0107】

【図13】図１３Ａ〜Ｃは、ｈＰＣＳＫ９注入マウスモデルにおいて、抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１が血漿中の非ＨＤＬコレステロールの低下を引き起こすことを示している。ＬＧＴ２０９抗体を予め注射すると、非ＨＤＬコレステロールのｈＰＣＳＫ９媒介による上昇から４６％の防御が引き起こされた。ＬＧＴ２１０またはＬＧＴ２１１を予め注射すると、非ＨＤＬコレステロールのｈＰＣＳＫ９媒介による上昇から同等以上の防御が引き起こされた。１３Ｃ１０は、ｈＰＣＳＫ９に高い親和性で結合する有効なマウス抗ＰＣＳＫ９抗体であり、このアッセイで陽性対照として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを媒体単独、ＰＣＳＫ９単独、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２０９ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＬＧＴ２１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１ ２０ｍｇ／ｋｇ、ＰＣＳＫ９＋１３Ｃ１０ ２０ｍｇ／ｋｇ、またはマウス非特異的ＩｇＧ混合物（陰性対照）で処理した。個々の値は、水平線として明示した平均値で示した。血漿全コレステロールレベルを定量するために、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床用分析器（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．：Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００）を使用した。血漿試料は、ｄｄＨ２Ｏで１：３に希釈し、希釈した血漿試料４０μｌの全コレステロールレベルを製造者の指示に従って定量した。血漿ＨＤＬおよび非ＨＤＬを定量するため、Ｈｅｌｅｎａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＳｐｉｆｅ ３０００を使用してリポタンパク質コレステロール画分を得た。試料調製、ゲル調製、試料添加、ゲル電気泳動、染色、洗浄および乾燥を含む手順は全て、操作者用マニュアルの指示に従った。次に、ゲルをＱｕｉｃｋ Ｓｃａｎ ２０００でスリット５を用いて走査し、リポタンパク質コレステロール画分の相対パーセントをＨｅｌｅｎａ濃度計で計算した。最後に、ＨＤＬおよび非ＨＤＬの絶対値は、各画分のパーセントおよび全コレステロールレベルを乗ずることによって計算した。

【0108】

【図14】図１４は、「典型的」ＩｇＧ１薬物動態（ＰＫ）プロファイルと比較した抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１（ヒトＩｇＧ１−サイレント）のラット（ＰＫ）プロファイルを示す。抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１の半減期は、典型的なＩｇＧ１半減期（約６日）と比較して著しく長い（７〜１３日）（例えば、ヒト対象で測定した通り）。標的媒介による体内動態（ｔａｒｇｅｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＴＭＤ）の証拠はなく、抗体は齧歯類のＰＣＳＫ９と交差反応しないことが示された。各試験抗体１０ｍｇ／ｋｇを３匹のオスＬｅｗｉｓラットに注射した。０、１、６、２４時間後、２、４、８および１６日後に、血液２５０μｌを採取し、血漿を清澄にし、希釈し、回収したヒト全抗体を測定するために捕捉ＥＬＩＳＡ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ）で評価した。標準曲線も各試験抗体のために作成した。回収されたＩｇＧの量は、ラットにおける典型的なヒトＩｇＧの予測回収に対してグラフにした。

【発明を実施するための形態】

【0109】

１．導入
本発明の抗体および抗原結合分子は特異的にプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９ａ型（「ＰＣＳＫ９」）に結合する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９のＣ末端に結合し、ＰＣＳＫ９の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）への結合を妨害することなくＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬ−Ｒの分解を妨害するという予期せぬ特性を備えている。特に、抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子はＰＣＳＫ９の残基６８０〜６９２内のエピトープ、例えば、ＰＣＳＫ９のＣ末端に位置するアミノ酸配列ＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ（配列番号４９）内のエピトープに結合する。本発明の抗体および抗原結合分子は循環しているＰＣＳＫ９だけでなく細胞に結合している間のＰＣＳＫ９にも結合するので、患者におけるインビボ半減期は比較的長く、例えば、少なくとも約７日以上で、いくつかの実施形態では、投与後少なくとも２週間脂質低下効果を実現する。本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９のアンタゴニストで、ＬＤＬ−ＲのＰＣＳＫ９媒介による分解を低下および／または阻害し、それによって低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の取り込み増加を促進する。抗ＰＣＳＫ９抗体および抗原結合分子は、例えば、脂質代謝異常、高コレステロール血症、トリグリセリド血症およびその他のＰＣＳＫ９媒介による病的状態に罹患した対象の治療に用途が見出される。

【0110】

２．改善された抗ＰＣＳＫ９抗体一般論
抗ＰＣＳＫ９抗体断片は、限定はしないが、組換え発現、化学合成および抗体４量体の酵素的消化を含む当業界で公知の任意の手段によって生成することができる一方、完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生成によって得ることができる。組換え発現は、当業界で公知の適切な任意の宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などから行うことができる。存在するならば、抗ＰＣＳＫ９抗体の定常領域は任意の型または亜型であってもよく、適切ならば、本発明の方法によって処理した対象の種［例えば、ヒト、非ヒト霊長類またはその他の哺乳類、例えば、農業用哺乳類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）、家畜哺乳類（例えば、イヌ、ネコ）または齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ）］由来であるように選択することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体はヒト化またはＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）される。いくつかの実施形態では、定常領域アイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域は、細胞または補体のＣ１成分上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＦｃガンマＲ１などのエフェクターリガンドに対する結合親和性が低下するように変異させる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照のこと。このような変異を含有する抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の低下または欠如をもたらす。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５は、Ａｌａ２３４およびＡｌａ２３５に置換する。重鎖定常領域中の残基の番号は、ＥＵインデックスの番号である（Kabat, et al., (1983) “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. Dept. Health and Human Servicesを参照のこと）。例えば、Woodle, et al, Transplantation (1999) 68(5):608-616; Xu, et al., Cell Immunol (2000) 200(1):16-26; and Hezareh, et al., J Virol 75(24):12161-8も参照のこと。

【0111】

本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子には、ラクダ科の骨格を有する単一ドメイン抗原結合単位も含まれる。ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマおよびアルパカが含まれる。ラクダ科は軽鎖の欠如した機能的抗体を生成する。重鎖可変（Ｖ_Ｈ）ドメインは自動的に折り畳まれ、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面には、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の６個のＣＤＲと比較して、３個のみのＣＤＲが含まれる。ラクダ科抗体は、従来の抗体と同程度の結合親和性に達することができる。本明細書で例示した抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特異性を備えたラクダ科骨格をベースにした抗ＰＣＳＫ９分子は、当業界で周知の方法、例えば、Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11:500?515, 2002；Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521?526, 1997およびBond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003を使用して生成することができる。

【0112】

本発明の改善された抗ＰＣＳＫ９抗体は、参照抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒト生殖系列Ｖ領域配列と実質的にアミノ酸配列が同一なＶ領域配列を有する遺伝子操作されたヒト抗体である。いずれも本明細書に参考として組み込んだ米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号および米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号を参照のこと。改善のプロセスでは、参照抗体の可変領域から抗原結合特異性を決定するために必要な最小限の配列情報を確認し、その情報をヒトの部分的Ｖ領域遺伝子配列のライブラリーに移してヒト抗体Ｖ領域のエピトープを焦点に当てたライブラリーを作製する。微生物をベースにした分泌系を使用して、抗体Ｆａｂ断片としてライブラリーのメンバーを発現し、例えば、コロニーリフト結合アッセイを使用して、このライブラリーの抗原結合Ｆａｂをスクリーニングする。例えば、米国特許出願公開第２００７／００２０６８５号参照。陽性クローンはさらに、最高の親和性を有するものとして特徴付けることができる。遺伝子操作して得られたヒトＦａｂは、親、参照抗ＰＣＳＫ９抗体の結合特異性を保持しており、通常、親抗体と比較して抗原に対して同等またはより高い親和性を有し、ヒト生殖系列Ｖ領域に匹敵した高い程度の配列同一性を有するＶ領域を有する。

【0113】

エピトープを焦点とするライブラリーを作製するために必要な最小限の結合特異性決定基（ＢＳＤ）は通常、重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）内の配列、および軽鎖のＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）内の配列によって表される。ＢＳＤは、ＣＤＲ３の一部または完全長を含んでいてもよい。ＢＳＤは、連続または非連続アミノ酸残基から構成され得る。場合によっては、エピトープを焦点とするライブラリーは、ＢＳＤおよびヒト生殖系列Ｊセグメント配列を含有する参照抗体の特有のＣＤＲ３−ＦＲ４領域に結合したヒトＶセグメント配列から構成される（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号を参照のこと）。あるいは、ヒトＶセグメントライブラリーは、参照抗体Ｖセグメントの一部のみがヒト配列のライブラリーによって最初に置換される連続的カセット置換によって作製され得る。残存する参照抗体アミノ酸配列の場合に結合を支持する同定されたヒト「カセット」は、その後、完全なヒトＶセグメントを作製するために第２のライブラリースクリーンに再結合される（米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号を参照のこと）。

【0114】

いずれの場合においても、参照抗体の特異性決定基を含有する、対になった重鎖および軽鎖ＣＤＲ３セグメント、ＣＤＲ３−ＦＲ４セグメント、またはＪセグメントは、ライブラリーから得られた抗原結合部が参照抗体のエピトープ特異性を保持するように、結合特異性を制限するように使用される。最適な結合速度を備えた抗体を同定するために、ライブラリー構築中に各鎖のＣＤＲ３領域に、成熟した変化をさらに導入することができる。得られた遺伝子操作されたヒト抗体は、ヒト生殖系列ライブラリーから得られたＶセグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内の短いＢＳＤ配列を保持し、ヒト生殖系列フレームワーク４（ＦＲ４）領域を有する。

【0115】

したがって、いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、元の、または参照モノクローナル抗体から得られた重鎖および軽鎖のＣＤＲ３内の最小限の結合配列決定基（ＢＳＤ）を含有する。重鎖および軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびＦＲ）の残存する配列、例えば、ＶセグメントおよびＪセグメントは、対応するヒト生殖系列および親和性成熟したアミノ酸配列由来である。Ｖセグメントは、ヒトＶセグメントライブラリーから選択することができる。さらなる配列の改良は、親和性成熟によって達成することができる。

【0116】

他の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体の重鎖および軽鎖は、例えば、ヒトＶセグメントライブラリーから選択される、対応するヒト生殖系列配列のヒトＶセグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）および元のモノクローナル抗体のＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントを含有する。ＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントはさらに、配列セグメントを対応するヒト生殖系列配列で置換することによって、かつ／または親和性成熟によって改良することができる。例えば、ＦＲ４および／またはＢＳＤを取り囲むＣＤＲ３配列は、対応するヒト生殖系列配列で置換することができ、元のモノクローナル抗体のＣＤＲ３のＢＳＤは保持される。

【0117】

いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＶｈ１−０２である。いくつかの実施形態では、重鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＪＨ４である。いくつかの実施形態では、重鎖Ｊセグメントは、ヒト生殖系列ＪＨ４の部分的配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５０）を含む。ヒト生殖系列ＪＨ４の完全長Ｊセグメントは、ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５１）である。可変領域遺伝子は、イムノグロブリン可変領域遺伝子の標準的命名法を基準とする。現在のイムノグロブリン遺伝子情報は、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のワールドワイドウェブ、Ｖ−ｂａｓｅおよびＰｕｂＭｅｄデータベースから利用可能である。Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16；Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74；Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54およびGiudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61も参照のこと。

【0118】

いくつかの実施形態では、軽鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＶＫ３ Ｌ６である。いくつかの実施形態では、軽鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖系列配列はＪｋ２である。いくつかの実施形態では、軽鎖Ｊセグメントは、ヒト生殖系列Ｊｋ２の部分的配列ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５２）を含む。ヒト生殖系列Ｊｋ２の完全長Ｊセグメントは、ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５３）である。

【0119】

いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳ（Ｄ／Ｔ）ＭＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＡＮ（Ａ／Ｅ／Ｇ）ＨＴＮＹ（Ａ／Ｄ）（Ｐ／Ｑ）ＫＦＱ（Ａ／Ｇ）ＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２８）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＴＭＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＡＮＥＨＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２７）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0120】

いくつかの実施形態では、軽鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列（Ｅ／Ｑ）ＩＶ（Ｌ／Ｍ）ＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（Ｒ／Ｓ）ＡＳ（Ｑ／Ｓ）ＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（Ｇ／Ｌ）（Ｔ／Ｖ）Ｆ（Ｎ／Ｒ）（Ｌ／Ｒ）Ａ（Ｓ／Ｔ）ＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＧＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号３１）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＶＦＲＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＧＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号２９）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＶＦＲＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＧＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号３０）と少なくとも８５％、８９％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0121】

いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＹＹＹＹ（Ａ／Ｎ）ＭＤ（Ａ／Ｆ／Ｓ／Ｖ／Ｙ）（配列番号１４）を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域は、アミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸配列（Ｄ／Ｔ）ＭＹＭＳ（配列番号８）を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＩＤＰＡＮ（Ａ／Ｅ／Ｇ）ＨＴＮＹ（Ａ／Ｄ）（Ｐ／Ｑ）ＫＦＱ（Ａ／Ｇ）（配列番号１１）を含むＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＳＹＹＹＹ（Ａ／Ｎ）ＭＤ（Ａ／Ｆ／Ｓ／Ｖ／Ｙ）（配列番号１４）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸配列（Ｒ／Ｓ）ＡＳ（Ｑ／Ｓ）ＳＶＳＹＭＨ（配列番号２２）を含むＣＤＲ１、アミノ酸配列（Ｇ／Ｌ）（Ｔ／Ｖ）Ｆ（Ｎ／Ｒ）（Ｌ／Ｒ）Ａ（Ｓ／Ｔ）（配列番号２５）を含むＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＬＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号２６）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定したアミノ酸配列は、１個または複数の置換されたアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１個または２個の保存的に置換されたアミノ酸を有することができる。

【0126】

いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号３６のアミノ酸配列を含むＦＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＦＲ２、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＦＲ３および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定したアミノ酸配列は、１個または複数の置換されたアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１個または２個の保存的に置換されたアミノ酸を有することができる。

【0127】

完全長にわたって、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体の可変領域は一般的に、可変領域全体（例えば、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）が対応するヒト生殖系列可変領域アミノ酸配列と少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体の重鎖は、ヒト生殖系列可変領域Ｖｈ１−０２に対して少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。抗ＰＣＳＫ９抗体の軽鎖は、ヒト生殖系列可変領域ＶＫ３Ｌ６に対して少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域内のアミノ酸のみが添加、欠失または置換されている。いくつかの実施形態では、配列同一性の比較にはＣＤ３を除外する。

【0128】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号４０の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号４１の軽鎖可変領域（すなわち、コンセンサス配列）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号１の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号１５の軽鎖可変領域（すなわち、マウスＬＦＵ７２０）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号１６の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２０９）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号１８の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１０）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号４の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、配列番号１６の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１１）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号３の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペプチドを含み、配列番号１７の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２０９）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号３の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペプチドを含み、配列番号１９の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１０）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号５の重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペプチドを含み、配列番号１７の軽鎖可変領域（すなわち、ＬＧＴ−２１１）に対して少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを含む。

【0136】

アミノ酸の長さが２０個未満の同定されたアミノ酸配列では、１個または２個の保存的アミノ酸残基置換が許容得る一方、所望する特異的結合および／またはアンタゴニスト活性を依然として保持される。

【0137】

本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体は一般的にＰＣＳＫ９に結合し、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は約１０^−８Ｍまたは１０^−９Ｍ未満、例えば、約１０^−１０Ｍまたは１０^−１１Ｍ未満、いくつかの実施形態では、約１０^−１２Ｍまたは１０^−１３Ｍ未満である。

【0138】

抗ＰＣＳＫ９抗体は、所望により多量体化し、本発明の方法に従って使用することができる。抗ＰＣＳＫ９抗体は、完全長４量体抗体（すなわち、２本の軽鎖および２本の重鎖を有する）、１本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）または１個もしくは複数の抗原結合部位を形成し、ＰＣＳＫ９結合特異性を付与する抗体断片、例えば、重鎖および軽鎖可変領域（例えば、Ｆａｂ’またはその他の類似の断片）を含む分子であってもよい。

【0139】

本発明はさらに、本明細書で記載した抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、重鎖または軽鎖可変領域または本明細書で記載した相補性決定領域を含むセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４２、配列番号４３および配列番号５４からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４４、配列番号４５および配列番号５５からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。

【0140】

いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４２のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４５（すなわち、ＬＧＴ−２０９）のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。

【0141】

いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４２からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４４（すなわち、ＬＧＴ−２１０）からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。

【0142】

いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４３からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４５（すなわち、ＬＧＴ−２１１）からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。

【0143】

いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５（すなわち、マウスＬＦＵ７２０）のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。

【0144】

３．抗ＰＣＳＫ９抗体を同定するためのアッセイ
アンタゴニスト抗体は、抗ＰＣＳＫ９抗体を生成し、各抗体のＰＣＳＫ９媒介による現象、例えば、ＬＤＬＲへの結合、ＬＤＬＲ分解の促進を低下させるかまたは阻害する能力を試験することによって同定することができる。このアッセイは、インビボまたはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で実施することができる。好ましい抗体はＰＣＳＫ９に結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを防御せず、ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解を低下させるかまたは阻害する。

【0145】

抗体または抗原結合分子のＰＣＳＫ９への結合は、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅおよびウェスタンブロットを含む当業界で公知の任意の方法を使用して測定することができる。

【0146】

ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬＲの分解はまた、当業界で公知の任意の方法を使用して測定することができる。一実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子がＬＤＬＲ分解を阻害する能力は、注入マウスモデルを使用して測定する。抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子をマウスに静脈内注入し（例えば、３μｇ／時間）、肝臓膜調製物中のＬＤＬＲのレベルを、対照抗体（例えば、無関連の抗原に結合する）の静脈内注入を受けたマウスの肝臓膜調製物中のＬＤＬＲのレベルと比較して測定した。アンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体を受けたマウスは、対照抗体を受けたマウスと比較して、検出可能な高レベルの、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、１００％高いＬＤＬＲを有するだろう。

【0147】

抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体はまた、ＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロールの血漿レベルの低下における治療効果を試験することができる。抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子を哺乳類（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に静脈内注入し（例えば、３μｇ／時間）、ＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロールの血漿レベルを、処理前の同じ哺乳類または対照抗体（例えば、無関連の抗原に結合する）の静脈内注入を受けた哺乳類のＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロールの血漿レベルと比較して測定する。アンタゴニスト抗ＰＣＳＫ９抗体を受けた哺乳類は、例えば、処理前の哺乳類または対照抗体を受けた哺乳類と比較して、検出可能に低い、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、１００％低いＬＣＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび／または全コレステロールの血漿レベルを有するだろう。

【0148】

４．抗ＰＣＳＫ９抗体を含む組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化した本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、所与の障害を治療または予防するために適しているその他の治療薬をさらに含有することができる。薬学的担体は、組成物を増強するか、または安定化し、あるいは、組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合した溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。

【0149】

本発明の医薬組成物は、当業界で公知の様々な方法によって投与することができる。投与の経路および／または様式は、所望する結果に応じて変化する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下に投与するか、あるいは標的部位の近位に投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、鼻腔内、吸入、脊髄内または腸内投与（例えば、注射または注入による）に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二特異性および多特異性分子は、酸による作用および化合物を不活性化することができるその他の天然の状態から化合物を防御するための材料でコーティングしてもよい。

【0150】

抗体は、単独でまたはその他の適切な成分と組み合わせて、吸入によって投与するエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、例えば、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容できる加圧噴射剤に入れることができる。

【0151】

いくつかの実施形態では、組成物は滅菌されており、流体である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。多くの場合、組成物には等張化剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコールおよび塩化ナトリウムを含めることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることによって、注射可能な組成物を長期にわたって吸収させることができる。

【0152】

本発明の医薬組成物は、当業界で周知であり、日常的に実施されている方法によって調製することができる。薬学的に許容される担体は、投与する特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、本発明の医薬組成物の適切な製剤は多種多様である。抗体を製剤化するため、ならびに適切な用量および計画を決定するために適用できる方法は、例えば、それぞれ本明細書に参考として組み込んだRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005)およびMartindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.およびMartindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical AssnおよびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978に見出すことができる。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。通常、抗ＰＣＳＫ９抗体の治療有効量または効果用量を本発明の医薬組成物に使用する。抗ＰＣＳＫ９抗体は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化する。投与計画は、所望する応答（例えば、治療応答）を実現するために調節する。治療または予防有効用量の決定において、低用量を投与し、その後、所望する応答が、最小限の副作用で、または副作用なく実現するまで徐々に増加させることができる。例えば、１回で大量投与してもよく、数回に分けて徐々に投与してもよく、または、治療状況の緊急性によって必要に応じて用量を減少させるか、または増加させてもよい。投与を簡便にし、投薬を一定にするためには、非経口組成物を投与単位形態に製剤化すると特に有利である。本明細書で使用した投与単位形態とは、治療する対象のための単位製剤として適当な物理的に分離された単位のことで、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望する治療効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性化合物を含有する。

【0153】

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性を有さず、特定の患者、組成物および投与様式について所望する応答を実現するために有効な活性成分の量を得るために変化させることができる。選択した用量レベルは、使用した本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性を含む様々な薬物動態因子、投与経路、投与時間、使用した特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用した特定の組成物と併用したその他の薬剤、化合物および／または材料、治療する患者の年齢、性別、体重、症状、一般的健康状態および既往歴などの要素によって左右される。

【0154】

いくつかの実施形態では、薬理学的組成物には、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子および第２の薬理学的作用物質の混合物が含まれる。例えば、組成物には、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子およびＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび全コレステロールを含むコレステロールを低下させるため、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇させるために有益であることが知られている薬剤を含めてもよい。

【0155】

本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子と混合して含めるための第２の薬剤の例には、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（すなわち、スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびその類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン様物質（例えば、化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、二重ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニスト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、ニーマンピックＣ１様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸が含まれる。脂質低下剤は当業界では公知で、例えば、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, Lazo and Parker, Eds., McGraw-Hill (2006); 2009 Physicians’ Desk Reference (PDR)、例えば、63rd (2008) Eds., Thomson PDRに記載されている。

【0156】

本発明の組成物で使用する他の脂質低下剤は、例えば、Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70；Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47；Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38；Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50；Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89；Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53；Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248；Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8；Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7；Birch, et al, J Med Chem (2009) 52(6):1558-68およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320に記載および／または概説されている。

【0157】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子はスタチンとの混合物として形成される。スタチンの例には、限定はしないが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが含まれる。

【0158】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレステロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬理学的作用物質との混合物として提供される。例えば、第２の薬理学的作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダウラナビル、アバカビル−ラミブジン−ジドブジン（トリジビル）であってもよい。いくつかの実施形態では、この第２の薬理学的作用物質はタクロリムスである。

【0159】

５．抗ＰＣＳＫ９抗体の使用方法
ａ．抗ＰＣＳＫ９抗体による治療を受ける状態
本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９の活性または過剰活性によって媒介される任意の病的状態の治療において用途が見出される。

【0160】

例えば、様々な理由または病因のために脂質代謝異常または高コレステロール血症を発症する危険性を有するか、またはその危険性に瀕している個体は、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子の投与によって利益を得る可能性がある。例えば、個体は、機能的ＬＤＬ−Ｒが存在する家族的または遺伝的に伝達されたホモ接合的またはヘテロ接合的高コレステロール血症を有していてもよい。家族的または遺伝的に受け継がれた高コレステロール血症に関連した、および／または原因となる遺伝子変異は、例えば、Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26にまとめて記載されている。個体はまた、脂質代謝異常または高コレステロール血症を発症する危険性に関与するか、または危険性を増大させるその他の病的状態を有するか、または行動をとっていてもよい。例えば、個体は肥満であるか、または糖尿病もしくは代謝異常症候群に罹患していてもよい。個体は、喫煙者であってもよく、ほとんど体を動かさない生活を送っていていてもよく、またはコレステロールの高い食事をとっていてもよい。

【0161】

ＰＣＳＫ９の標的化は、脂質代謝異常、高コレステロール血症および食後トリグリセリド血症の軽減、回復、阻害または予防のために有用である。例えば、Le May, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29(5):684-90；Seidah, Expert Opin Ther Targets (2009) 13(1):19-28およびPoirier, et al., J Biol Chem (2009) PMID 19635789を参照のこと。したがって、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子の投与は、脂質代謝異常、高コレステロール血症および食後トリグリセリド血症の軽減、回復、阻害および予防を必要とする個体における脂質代謝異常、高コレステロール血症および食後トリグリセリド血症の軽減、回復、阻害および予防に用途が見出される。

【0162】

本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子は、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の減少または低下を必要とする個体における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の減少または低下に用途が見出される。個体は、ＬＤＬ−Ｃのレベルが持続的に上昇していてもよい。いくつかの実施形態では、個体は、ＬＤＬ−Ｃ血漿レベルが一貫して８０ｍｇ／ｄＬを上回り、例えば、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬを上回る。本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子はまた、非高密度リポタンパク質コレステロール（非ＨＤＬ−Ｃ）または全コレステロールの減少または低下を必要とする個体における非高密度リポタンパク質コレステロール（非ＨＤＬ−Ｃ）または全コレステロールの減少または低下に用途が見出される。

【0163】

個体は、コレステロールを低下させるために別の薬理学的作用物質を既に摂取していて、この薬剤に耐性または不耐性であってもよい。例えば、個体は、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃまたは全コレステロールの許容されるレベルまでの低下においてこの個体では無効であることが証明されたスタチンの治療計画下に既にあってもよい。個体はまた、スタチンの投与に不耐性であってもよい。本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および抗原結合分子とＬＤＬ−Ｃまたは非ＨＤＬ−Ｃの低下および／またはＨＤＬ−Ｃの上昇に有用な第２の薬剤との併用投与は、例えば、投与する第２の薬剤の用量の低下を可能にすることによって、第２の薬剤の有効性および耐性を改善する。

【0164】

いくつかの実施形態では、個体は、例えば、ＬＤＬＲの分解の異常な増加を引き起こすＰＣＳＫ９遺伝子の機能獲得型変異を有する。

【0165】

いくつかの実施形態では、個体は、脂質代謝異常または高コレステロール血症を誘導する薬理学的作用物質を投与されており、すなわち、個体は薬剤誘導性の脂質代謝異常または高コレステロール血症である。例えば、個体は、例えば、ＨＩＶ感染を治療するためにプロテアーゼ阻害剤の治療計画を受けていてもよい。血漿トリグリセリドレベル上昇の原因となることが知られている別の薬理学的作用物質は、移植患者に投与される免疫抑制剤、タクロリムスである。シクロスポリンは、ＬＤＬを著しく増加させることが示されたことがある。例えば、Ballantyne, et al. (1996) 78(5):532-5を参照のこと。第２世代抗精神病薬（例えば、アリピプラゾール、クロザピン、オランザピン、クエチアピン、リスペリドンおよびジプラシドン）はまた、脂質代謝異常に関連している。例えば、Henderson, J Clin Psychiatry (2008) 69(2):e04 and Brooks, et al., Curr Psychiatry Rep (2009) 11(1):33-40を参照のこと。

【0166】

ｂ．抗ＰＣＳＫ９抗体の投与
医師または獣医師は、医薬組成物中において使用する本発明の抗体の用量を所望する治療効果を実現するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望する効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の有効用量は、治療する特定の疾患または症状、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、その他の投与された治療薬、および処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む多種多様な要素に応じて変化する。治療投薬は、安全性および効果を最適にするために用量設定する必要がある。抗体の投与については、投薬量は宿主体重当たり約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１から５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。投薬は、必要があれば、または所望であれば、毎日、毎週、２週間毎、毎月またはそれより多いかもしくは少なくてもよい。治療計画の例には、週１回、２週間に１回または月１回または３から６ヵ月に１回の投与が含まれる。

【0167】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを投与する。薬剤が核酸である実施形態では、典型的な投薬量は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重まで（約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む）の範囲、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ体重と約５０ｍｇ／ｋｇ体重の間であってもよい。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0168】

抗体は、１回または分割投与で投与することができる。抗体は通常、様々な場合に投与される。１回の投薬の間隔は、必要または所望により、１週間、２週間、１ヵ月または１年であってもよい。間隔はまた、患者における抗ＰＣＳＫ９抗体の血液レベルを測定することによって指示して、不規則であってもよい。いくつかの方法では、投薬量は、血漿抗体濃度１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの場合では２５〜３００μｇ／ｍｌを実現するように調節する。あるいは、抗体は、より少ない頻度での投与を必要とする場合では、徐放製剤として投与することができる。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化させる。一般的に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与の投薬量および頻度は、処置が予防であるか、または治療であるかに応じて変化させることができる。予防適用では、比較的低用量が比較的少ない頻度の間隔で、長期間にわたって投与される。患者によっては、残りの人生において治療を受け続ける。治療適用では、疾患の進行が抑えられるか、または停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされることが時々ある。その後、患者は予防的投与計画を受けることができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合剤は、患者の血漿ＬＤＬ−Ｃレベルが予め決定した閾値レベルを上回るとき、例えば、少なくとも約８０ｍｇ／ｄＬ、例えば、少なくとも約９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上のときに投与される。

【0169】

ｃ．第２の薬剤との同時投与
ＰＣＳＫ９抗体アンタゴニストは、ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび全コレステロールを含むコレステロールを低下させるため、および／またはＨＤＬ−Ｃを上昇させるために有益であることが知られている薬剤と組み合わせて使用することができる。

【0170】

活性薬剤は抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体と混合して一緒に投与することができるか、または各薬剤は別々に投与することができる。抗体薬剤およびその他の活性剤は同時に投与することができるが、同時に投与する必要はない。

【0171】

本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子との同時投与で使用するための第２の薬剤の例には、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（すなわち、スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびその類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン様物質（例えば、化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、二重ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニスト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、ニーマンピックＣ１様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸が含まれる。

【0172】

使用する他の脂質低下剤は、例えば、Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70；Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47；Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38；Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50；Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89；Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53；Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248；Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8；Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7；Birch, et al, J Med Chem (2009) 52(6):1558-68およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320に記載および／または概説されている。

【0173】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子はスタチンと同時投与される。スタチンの例には、限定はしないが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが含まれる。

【0174】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレステロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬理学的作用物質と同時投与される。例えば、第２の薬理学的作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダウラナビル、アバカビル−ラミブジン−ジドブジン（トリジビル）であってもよい。いくつかの実施形態では、この第２の薬理学的作用物質はタクロリムスである。

【0175】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９またはａｐｏＢ１００を特異的に標的とする阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス配列、リボザイム）と共に同時投与する。

【0176】

６．キット
本発明の医薬組成物はキットで提供することができる。ある実施形態では、本発明のキットは、本明細書で記載したように、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子を含む。抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は均一に、または様々な投薬量で提供することができる。

【0177】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で記載したように、１種または複数の第２の薬理学的作用物質を含む。第２の薬理学的作用物質は、同じ製剤中に、または抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子とは別の製剤中に提供することができる。第１および第２の薬剤の投薬量は、独立して均一であるか、または変化させてもよい。

【0178】

いくつかの実施形態では、キットは、ＰＣＳＫ９抗体アンタゴニストならびに（ａｎ）ＬＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃおよび全コレステロールを含むコレステロールを低下させ、かつ／またはＨＤＬ-Ｃを上昇させるために有益であることが知られている１種または複数の薬剤を含む。

【0179】

本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体または抗原結合分子を含むキットに含めるための第２の薬剤の例には、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（すなわち、スタチン）、フィブラート（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、シプロフィブラート、ベザフィブラート）、ナイアシンおよびその類似体、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸捕捉剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、回腸胆汁酸輸送体（ＩＢＡＴ）阻害剤、甲状腺ホルモン様物質（例えば、化合物ＫＢ２１１５）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、二重ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アルファおよびガンマアゴニスト、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、ニーマンピックＣ１様１（ＮＰＣ１−Ｌ１）阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質Ｇ５またはＧ８のアゴニスト、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害性核酸およびａｐｏＢ１００を標的とする阻害性核酸が含まれる。

【0180】

キットで使用する他の脂質低下剤は、例えば、Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70；Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47；Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38；Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50；Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89；Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53；Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248；Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8；Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7；Birch, et al, J Med Chem (2009) 52(6):1558-68およびBaxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320に記載および／または概説されている。

【0181】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子はスタチンと共にキットに供給した。スタチンの例には、限定はしないが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンが含まれる。

【0182】

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合分子は、高コレステロール血症またはトリグリセリド血症を誘導する薬理学的作用物質と共にキットに供給する。例えば、第２の薬理学的作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ダウラナビル、アバカビル−ラミブジン−ジドブジン（トリジビル）であってもよい。いくつかの実施形態では、この第２の薬理学的作用物質はタクロリムスである。

【実施例】

【0183】

以下の実施例は、限定はしないが請求した本発明を例示するために挙げる。

【実施例1】

【0184】

実施例１：Ｐｃｓｋ９アンタゴニストＮＶＰＬＦＵ７２０の生成および同定
概要
Ｐｃｓｋ９に対する機能的抗体アンタゴニストを作製するために研究を行った。タンパク質のＨｉｓタグ型に結合することができる抗体を分泌する多数のハイブリドーマを同定した。ハイブリドーマからの抗体は、ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬコレステロール取り込み能力を増加させるＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬ受容体のＰｃｓｋ９媒介による分解を阻害する能力で測定した機能的アンタゴニスト活性で評価した。潜在的な機能的マウス抗ヒトＰｃｓｋ９ ＩｇＧ１−カッパモノクローナル抗体を同定し、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０（ＬＦＵ７２０）と称した。

【0185】

方法
抗原およびその他のタンパク質
ヒトＰｃｓｋ９タンパク質を分泌する安定した発現細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）の形質移入によって作製した。簡単に説明すると、ＢｉｏＣｏａｔフラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％牛胎児血清中で接着させて培養した細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）形質移入試薬およびメリチンシグナル配列を特徴とする組換えプラスミド、成熟Ｐｃｓｋ９ ｃＤＮＡ（アミノ酸３１〜６９２）および配列のＣ末端のｈｉｓ６（配列番号５７）タグ（Ｅ．Ｈａｍｐｔｏｎ、ＧＮＦ、ＮＰＬ０１００５１によってクローニングされた）を使用して形質移入した。形質移入して４８時間後、ゼオシン１００μｇ／ｍｌを培養培地に添加することによって陽性形質移入体の選択を開始した。４週間後、Ｐｃｓｋ９産生細胞の４つの安定した収集物が出現した。最も産生が多いプール４をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で無血清懸濁条件に適応させ、その後、生成用量の規模が１０〜２０ＬのＷａｖｅ（商標）バイオリアクターを使用して、大量生成のために規模を拡大した。

【0186】

時間をかけて数回培養を実施し、組換えタンパク質は１２および３０ｍｇ／Ｌの間の生成率で生成した。細胞上清を収集し、クロスフロー濾過によって濃縮した。得られた濃縮物を２５ｍｌ ＮｉＮＴＡ Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ／ＮａＣｌ ３００ｍＭ／ＣａＣｌ_２ １ｍＭ／β−メルカプトエタノール ２ｍＭ、ｐＨ７．４で平衡化）に０．５ｍｌ／分で添加した。ベースラインに達した後、Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ／ＮａＣｌ ３００ｍＭ／イミダゾール ２０ｍＭ、ｐＨ７．４で洗浄して、結合した物質はＴｒｉｓ ５０ｍＭ／ＮａＣｌ ３００ｍＭ／イミダゾール ２５０ｍＭ、ｐＨ７．４で溶出した。得られた溶出液をＰＢＳ、ｐＨ７．３で透析し、滅菌濾過して分取した。重合化を測定するため、分析用分子ふるいクロマトグラフィーによって試料を分析した。精製したタンパク質から得られたＨＰＬＣクロマトグラムは、２本のピークを示し、主要なピークが８５％を占める。完全長タンパク質のＨＰＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ分析によって、質量は５８１７６．０Ｄａで、全システイン残基が酸化したメリチン−ｈｓＰｃｓｋ９アミノ酸３１〜６９２−Ｈｉｓから予測された質量に一致していることが明らかである。試料の一部はさらにＮグリコシル化されている。混入する質量約１３ｋＤのタンパク質は、おそらくタンパク質の遊離プロドメインに類似している。マウスおよびカニクイザルの対応するＰｃｓｋ９相同体は、Ｆｒｅｅｓｔｕｌｅ培地中の無血清懸濁液中で培養したＨＥＫ２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を再度使用して、大規模一時発現法で生成した。組換えプラスミド、天然のリーダー配列およびＣ末端のｈｉｓ_６（配列番号５７）タグを特徴とするマウスＰｃｓｋ９ ｃＤＮＡならびにＣＤ３３リーダー配列およびＣ末端ｈｉｓ_６（配列番号５７）タグを特徴とするｃｙｎｏ Ｐｃｓｋ９を、プラスミドＤＮＡの担体としてポリエチレンイミンを１：３（μｇ／ｍｌ：μｇ／ｍｌ ＤＮＡ：ＰＥＩ）の比で使用して、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に形質移入した。生成操作は、Ｗａｖｅ（商標）バイオリアクターにおいて１０リットルの規模で実施し、タンパク質精製および特徴付けは、ヒトＰｃｓｋ９タンパク質で前述したプロトコールと同様に実施した。マウスＰｃｓｋ９タンパク質の収率は０．７と２．７ｍｇ／Ｌ培養物の間であり、ｃｙｎｏ Ｐｃｓｋ９は３．１ｍｇ／Ｌで得られた。

【0187】

ハイブリドーマ作製
マウスの免疫およびハイブリドーマの生成
Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇｎ（ｂｃｌ−２）２２ｗｅｈｉ種）を免疫する前に、精製Ｐｃｓｋ９をフロイント完全アジュバントで１：１に希釈した。マウスは、複数部位での反復免疫（ＲＩＭＭＳ）を必要とする方法を使用して免疫した。簡単に説明すると、マウスの末梢リンパ節（ＰＬＮ）の近位の特定部位８ヵ所に抗原１〜３μｇを注射した。この方法を１２日間にわたり６回反復した。１２日目に試験血を収集し、血清抗体力価をＥＬＩＳＡによって分析した。力価の高いマウスから１５日目にＰＬＮを取り出し収集した。リンパ球を採取するために、ＰＬＮを基本ＤＭＥＭで２回洗浄し、次に、２２ミクロンの篩い（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５２３５０）に通すことによって分離した。得られたリンパ球を融合前にさらに２回洗浄した。ＮＳＯ／Ｂｃｌ−２骨髄腫細胞をリンパ球と、リンパ球２．５対ＮＳＯ細胞１の比で混合した。細胞混合物を遠心し、その後細胞ペレットにＰＥＧ１５００ １ｍＬを１分間かけて滴下した。３０秒後、ＤＭＥＭ １ｍｌをゆっくり添加し、１分後、ＤＭＥＭ １９ｍｌを５分間かけて添加した。融合した細胞をペレットにし、ＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ+２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、１×ＨＡＴ、０．５×ＨＦＣＳ）中に２×１０^５細胞／ｍＬの密度で再懸濁し、３７℃で１時間置いた。その後、細胞を３８４−ウェルプレートに６０μｌ／ウェルで接種した。

【0188】

Ｐｃｓｋ９に対する機能的抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニング
融合して１０日後、ハイブリドーマプレートのＰｃｓｋ９特異的抗体の存在をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡスクリーニングのため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ＃４６４７１８）をＰｃｓｋ９ ５０μｌでコーティングし（ＰＢＳで１５ｎｇ／ウェルに希釈）、一晩４℃でインキュベートした。残存するタンパク質を吸引し、ウェルをＰＢＳに溶かした１％ＢＳＡで遮断した。室温で３０分間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳ+０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。ハイブリドーマ上清１５μｌをＥＬＩＳＡプレートに移した。ＰＬＮを取り出す時に採取したマウス血清１５μｌをＰＢＳで１：１０００に希釈し、陽性対照として追加した。２次抗体５０μｌ（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１１５−０３５−０７１）、ＰＢＳで１：５０００に希釈）をＥＬＩＳＡプレートの全ウェルに添加した。室温で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで８回洗浄した。ＴＭＢ（ＫＰＬ＃５０−７６−０５）２５μｌを添加し、室温で３０分インキュベーションした後、プレートを６０５ｎｍの吸収で読み取った。陽性ウェルの細胞を２４−ウェルプレートでＨＴ培地（ＤＭＥＭ+２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１×ＮＥＡＡ、１×ＨＴ、０．５×ＨＦＣＳ）中で増殖させた。

【0189】

抗体精製
ＬＦＵ７２０を含有する上清をタンパク質Ｇ（Ｕｐｓｔａｔｅ＃１６−２６６（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））を使用して精製した。上清を添加する前に、樹脂を１０カラム容量のＰＢＳで平衡化した。試料を結合させた後、カラムを１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、次いで抗体を５カラム容量のグリシン０．１Ｍ、ｐＨ２．０で溶出した。カラム画分は１／１０容量のＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ９．０ですぐに中和した。画分のＯＤ２８０を測定し、陽性画分を収集し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して一晩透析した。

【0190】

結合反応速度およびＢｉａｃｏｒｅアッセイ
動力学的結合パラメータの測定は、光学的バイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ Ｓ５１を使用して、表面プラズモン共鳴測定によって実施した。この技術によって、標識を用いない受容体に対するリガンドの結合（Ｋａ）および解離（Ｋｄ）の顕微鏡的速度定数の測定が可能である。したがって、抗体−抗原相互反応を特徴付けるために特に適している。

【0191】

Ｐｃｓｋ９のＬＦＵ７２０（２μｇ／ｍｌ）への結合の研究は、予めシリーズＳ ＣＭ−５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ（認定）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００５−３０）に固定されたウサギ抗マウスＦｃγ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００５−１４）でマウス抗体を捕捉することによって実施した。Ｆｃγ捕捉抗体の共有結合は、「アミン結合キット」（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１０００−５０）で実施した。捕捉抗体（ウサギ抗マウス）は、酢酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ５に溶かした抗Ｆｃγ抗体溶液（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００３−５１）５０μｇ／ｍｌを流速１０μｌ／分でＥＤＣ活性化デキストラン表面に結合させた。Ｐｃｓｋ９を０．５μＭから７．８ｎＭ（２倍希釈系列）の濃度範囲で、ＰＢＳおよびＮａＣｌ １００ｍＭ、０．００５％Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−５４）中での捕捉ＬＦＵ７２０チップ上に流した。得られたセンサーグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ５１評価ソフトウェアを使用して分析した。全濃度のデータは全体的に１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに適合させた。

【0192】

ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、浅い３８４ウェル白色プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６００８２８０）で実施した。ｈＰｃｓｋ９−ＡＦ（１０．７ｎＭ）を標識していないｈＰｃｓｋ９タンパク質、ＥＧＦ−ＡペプチドまたはＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１抗体の希釈系列とアッセイ緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．２、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＣａＣｌ_２ １ｍＭ、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ）１５μｌ中で室温で３０分間インキュベートした。この後、アッセイ緩衝液に溶かした５μｌのｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ（４ｎＭ）を予めインキュベートしたｈＰｃｓｋ９およびＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１の複合体に添加し、室温で９０分間インキュベートした。これらの標識タンパク質の最終濃度は、ｈＰｃｓｋ９−ＡＦ ８ｎＭおよびｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ １ｎＭであった。ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１００マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて励起３３０ｎｍおよび放射６６５ｎｍで測定した。データは、以下の式：［（６６５ｎｍの値×１０，０００）／（６１５ｎｍの値）］を使用して正規化した値に変換した。パーセント阻害は、以下の式：１００−［（処理試料の正規化した値／未処理試料の正規化した値の平均値）×１００］で計算した。パーセント阻害用量反応曲線はＰｒｉｓｍ バージョン５を使用して、式Ｙ＝最小結合度（Ｂｏｔｔｏｍ）＋（最大結合度（Ｔｏｐ）−最小結合度）／（１+１０^（（ＬｏｇＩＣ_５０−Ｘ）＊傾き（ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてプロットした。

【0193】

ＬＤＬ−Ｒ代謝回転アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、予め１％ ｖ／ｖコラーゲンでコーティングした平底９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９５）で、培養培地１００μｌにウェル当たり６×１０^４細胞を接種し、その後３７℃で５％ＣＯ_２中で２４時間インキュベートした。一般的に、細胞は、ｈＰｃｓｋ９タンパク質、ＥＧＦ−Ａペプチドおよび／またはＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１抗体のいずれかを含有する無血清培地１００μｌで処理した。処理後、培地を廃棄し、細胞をＰＢＳ１００μｌで洗浄した。細胞を採取するために、Ｖｅｒｓｉｎｅ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、１７−７７１Ｅ）１００μｌを添加し、３７℃で５％ＣＯ_２中で１時間インキュベートし、次いでＦＡＣＳ緩衝液１００μｌを添加した。細胞をＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３８９４）に移し、１２００ｒｐＭで５分間遠心して細胞をペレットにした。細胞上の非特異的結合部位を遮断するため、ＦＡＣＳ緩衝液に溶かした正常ウサギＩｇＧ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、５５９４４）およびマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、I５３８１）１００μｇ／ｍｌの５０μｌを各ウェルに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐＭで５分間遠心して、プレートをはじくことによって緩衝液を除去した。細胞を標識するために、ＦＡＣＳ緩衝液に溶かしたウサギ抗ｈＬＤＬ−Ｒ−Ａｌｅｘａ６４７ＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）１０μｌおよびマウス抗トランスフェリン−Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）ＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）（ＣＤ７１、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６２４０４８）標識抗体１０μｌを各ウェルに添加し、氷上で６０分間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐＭで５分間遠心して、プレートをはじくことによって緩衝液を除去した。結合していない抗体は、ＦＡＣＳ緩衝液ウェル当たり２００μｌで細胞を２回洗浄することによって除去した。細胞は、ＰＢＳに溶かした１％パラホルムアルデヒドで固定し、生細胞をゲーティングし（５０００）、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＰＥ蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および５７５ｎｍの放射で測定した。Ａｌｅｘａ６４７蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および６３３ｎｍの放射で測定した。ＨｅｐＧ２細胞上の表面ｈＬＤＬ−ＲのＦＡＣＳ検出のために、特注のウサギ抗ｈＬＤＬ−ＲポリクローナルＩｇＧ５８３はＣｏｖａｎｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）によって注文生産された。ウサギ抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３は、正常なウサギＩｇＧと比較して、ＨｅｐＧ２細胞表面上のｈＬＤＬ−Ｒの検出について約７倍のウインドウを示した。抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３のＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬ−Ｒに対する特異性を測定するために、このＩｇＧの結合の競合相手としてｈＬＤＬ−Ｒタンパク質を使用して実験を実施した。ＨｅｐＧ２細胞に対する抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３の平均培地蛍光の用量依存減少が、ｈＬＤＬ−Ｒタンパク質の濃度増加につれて認められた。このことは、ＦＡＣＳによって測定されたように、抗ｈＬＤＬ−Ｒ ＩｇＧ５８３がＨｅｐＧ細胞表面上のＬＤＬ−Ｒを特異的に認識することを示唆した。その後の研究では、ＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬ−ＲのＦＡＣＳ定量のために、直接標識した抗ｈＬＤＬ−Ｒ−５８３−Ａｌｅｘａ６４７ＩｇＧを使用した。

【0194】

ＬＤＬ−Ｃ取り込み
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、平底９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９５、予め１％ ｖ／ｖコラーゲンでコーティング中の培養培地１００μｌにウェル当たり６×１０^４細胞を接種し、その後３７℃で５％ＣＯ_２中で２４時間インキュベートした。特に記載しない限り、細胞は、ｈＰｃｓｋ９タンパク質、ＥＧＦ−Ａペプチドおよび／またはＮＶＰ−ＬＦＵ７２０−ＡＸ−１抗体のいずれかを含有する無血清培地１００μｌで処理した。処理後、無血清培地に溶かした３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニン標識低密度リポタンパク質（ＤｉＩ−ＬＤＬ）（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ、ＲＰ−０７７−１７５）３０μｇ／ｍｌ、２０μｌを各ウェルに入れ、３７℃で５％ＣＯ_２中で２時間インキュベートした。プレートをはじくことによって培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１４１９０−１４４）１００μｌで洗浄した。プレートをはじくことによってＰＢＳを除去し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で５％ＣＯ_２中で５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳ、ＥＤＴＡ ２ｍＭおよび０．２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）１００μｌを各ウェルに添加し、１２００ｒｐｍで５分間遠心することによって細胞をペレットにした。プレートをはじくことによって培地を廃棄し、ＰＢＳに溶かした１％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１０）をウェル当たり５０μｌ添加することによって細胞を固定した。生細胞をゲーティングし、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＤｉＩ−ＬＤＬ蛍光の中央値は、４８８ｎｍの励起および５７５ｎｍの放射で測定し、５０００個の細胞を分析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して棒グラフを作成した。活性化のパーセントは以下の通りに算出した、％活性化＝［１−（Ｘ÷Ａ）］×１００、式中、Ｘ＝試料ウェルから読み取った培地蛍光およびＡ＝ｈＰｃｓｋ９処理のみのウェルから読み取った培地蛍光。

【0195】

式Ｙ＝最小結合度＋（最大結合度−最小結合度）／（１+１０^（（ＬｏｇＥＣ’_５０−Ｘ）×傾き））およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して作成した用量反応曲線からＥＣ_５０を決定するために、活性化のパーセントを処理に対してプロットした。

【0196】

結果
抗ヒトＰｃｓｋ９モノクローナル抗体の作製
Ｂ細胞は、Ｐｃｓｋ９タンパク質で免疫した動物の一次リンパ節から採取した。ハイブリドーマは、標準的ＰＥＧ媒介融合を使用して作製した。得られた融合物は、ＥＬＩＳＡによってアッセイし、ヒトＰｃｓｋ９に陽性結合するものを同定し、上清を生成するために増殖させた。ＥＬＩＳＡ陽性クローンが多数同定され、その後の機能アッセイによって選別された。主要な候補として同定されたクローンは、ＬＦＵ７２０であった。我々の主要な候補、ＬＦＵ７２０に加えて、Ｐｃｓｋ９に結合してＰｃｓｋ９がＬＤＬｒ分解を媒介する能力を遮断することはできても（ＬＤＬｃ取り込みによって測定した通り）、Ｐｃｓｋ９とＬＤＬｒの相互作用は遮断することはできない（ＦＲＥＴによって測定した通り）、クローン２１Ｄ６、５Ａ４−Ｃ１および１３Ｆ１を含む多数のその他のクローンが同定された。クローン２１Ｄ６はまた、インビボにおいてＰｃｓｋ９によるＬＤＬｒの分解を遮断する能力を示した。

【0197】

Ｐｃｓｋ９に特異的に結合するＬＦＵ７２０のスクリーニング
ＬＦＵ７２０の特異性は、一連のその他のタンパク質に対する結合をＥＬＩＳＡで評価することによって調べた。ＨＩＳでタグ付けした３種類のその他のタンパク質に対するＬＦＵ７２０の結合をＰｃｓｋ９−ＨＩＳに対する結合と比較した。これによって、Ｐｃｓｋ９に対する結合が特異的で、この抗体はＨＩＳタグには結合しないことが示された。

【0198】

ＬＦＵ７２０のカニクイザルＰｃｓｋ９に対する結合の評価
ＬＦＵ７２０のＰｃｓｋ９のカニクイザル相同体に対する結合を測定した。このアッセイのために、ＨＩＳでタグ付けしたカニクイザルＰｃｓｋ９を発現する細胞の上清をＮｉ捕捉プレートと共に利用し、材料を精製する必要性を省いた。ヒトＰｃｓｋ９を希釈し、そのＨＩＳタグを介してまた捕捉した。ＬＦＵ７２０は、ヒトおよびカニクイザル両方のＰｃｓｋ９に結合することができた。５Ｐ２０はまた、ＥＬＩＳＡではヒトＬＤＬ−ＲにもマウスＰｃｓｋ９にも結合しなかった。

【0199】

ＬＦＵ７２０の結合速度
光学的バイオセンサー技術（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用することによって、ヒトＰｃｓｋ９タンパク質を認識するマウス抗体ＬＦＵ７２０の結合親和性を分析した。ＬＦＵ７２０は、組換えヒトＰｃｓｋ９にナノモル以下の高い親和性（ＫＤ ＝２００ｐＭ）で結合することが見出された。

【0200】

ＬＦＵ７２０のＰｃｓｋ９／ＬＤＬ−Ｒ相互作用遮断のスクリーニング
抗ｈＰｃｓｋ９抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０がｈＰｃｓｋ９−ＡＦとｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕ標識タンパク質との間の相互作用を中断させることができるかどうかを測定するために、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを使用した。ｈＬＤＬ−Ｒ−ＥｕとｈＰｃｓｋ９−ＡＦ標識タンパク質の相互作用によって生じたＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの中断をアッセイが検出できることを示すために、標識していないｈＰｃｓｋ９タンパク質またはＥＧＦ−Ａペプチドを評価した。標識していないｈＰｃｓｋ９の濃度を増加させると、ｈＬＤＬ−Ｒ−Ｅｕへの結合をｈＰｃｓｋ９−ＡＦと競合し、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの減少が生じた。ＥＧＦ−Ａペプチドは、ｈＬＤＬ−Ｒ−ＥｕとｈＰｃｓｋ９−ＡＦの相互作用をＩＣ_５０２．５μＭで中断させた。対照的に、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０はｈＰｃｓｋ９−ＥｕとｈＬＤＬ−Ｒ−ＡＦの間のＴＲ−ＦＲＥＴシグナルをあまり中断させず、ＩＣ_５０は１０００ｎＭを上回り、低い抗体濃度ではＵ型の応答を示した。

【0201】

Ｐｃｓｋ９媒介によるＬＤＬ−Ｒ分解のＬＦＵ７２０による阻害のスクリーニング
ＬＤＬ−ＲへのＰｃｓｋ９の結合は、ＬＤＬ−Ｒ分解を引き起こすことが示され、このことはＨｅｐＧ２細胞および組換えヒトＰｃｓｋ９を使用して確かめられた。ＬＦＵ７２０がＰｃｓｋ９に結合し、この効果を遮断する能力を測定した。ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０は外来性Ｐｃｓｋ９で処理したＨｅｐＧ２細胞を阻害し、細胞表面ＬＤＬ−Ｒの増加を引き起こした。

【0202】

ＬＦＵ７２０のＰｃｓｋ９阻害およびＬＤＬ取り込み回復のスクリーニング
ＬＤＬ−ＲのＰｃｓｋ９分解の阻害は、ＨｅｐＧ２細胞がＬＤＬ−Ｃを内部移行させる能力を回復させる。ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０は、外来性ｈＰｃｓｋ９で処理したＨｅｐＧ２細胞でのＰｃｓｋ９媒介によるＬＤＬ−Ｒ分解を妨害し、ＤｉＩ−ＬＤＬ取り込みをＥＣ_５０ ９９ｎＭで増加させた。

【実施例2】

【0203】

実施例２：ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の生成
導入
この実施例では、マウスＰＣＳＫ９アンタゴニストモノクローナル抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０のヒト生殖系列抗体に対する配列相同性が高くなるように遺伝子操作することによって、ヒト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１を作製することを説明する。ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１は、親マウス抗体、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０のエピトープ特異性、親和性およびカニクイザルマカクＰＣＳＫ９交差反応性を保持している。ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１は、元のマウス抗体よりもヒト生殖系列配列により高い相同性を有し、したがってヒト免疫系により耐性であろう。

【0204】

マウスモノクローナル抗体ＬＦＵ７２０は、そのタンパク質配列がヒト生殖系列配列により近く、その免疫原性が減少するように、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）した。Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）技術は、南サンフランシスコのＫａｌｏＢｉｏｓ（ワールドワイドウェブｋａｌｏｂｉｏｓ．ｃｏｍ）から入手可能である。抗体のＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）によって、ヒト生殖系列配列と高い相同性を有する一方、親または参照抗体の特異性および親和性をなお維持しているＶ領域配列を有する遺伝子操作されたヒト抗体が作製される（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号および第２００６／０１３４０９８号）。このプロセスではまず、参照Ｆａｂの重鎖および軽鎖可変領域における最小抗原結合特異性決定基（ＢＳＤ）（通常は重鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ３内の配列）を同定する。これらの重鎖および軽鎖ＢＳＤは、Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）プロセス中に構築された全ライブラリー中に維持されるので、各ライブラリーはエピトープに注目し、最終的な完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持する。

【0205】

次に、完全長ライブラリー（軽鎖または重鎖可変領域全体がヒト配列のライブラリーで置換されている）および／またはカセットライブラリー（マウスＦａｂの重鎖または軽鎖可変領域の一部がヒト配列のライブラリーで置換されている）を作製する。抗体Ｆａｂ断片としてライブラリーのメンバーを発現させるために細菌分泌系を使用して、コロニーリフト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）を使用してこのライブラリーの抗原に結合するＦａｂをスクリーニングする。陽性クローンはさらに特徴を明らかにして、最高の親和性を有するものを同定する。残存するマウス配列において結合を支持することが同定されたヒト「カセット」は次に、完全なヒトＶ領域を作製するための最終的なライブラリースクリーンにおいて一緒にする。

【0206】

得られたＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂは、ヒトライブラリーから得られたＶセグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内で同定された短いＢＳＤ配列を保持しており、ヒト生殖系列フレームワーク４領域を有する。これらのＦａｂは、重鎖および軽鎖の可変領域をＩｇＧ発現ベクターにクローニングすることによって、完全なＩｇＧに変換する。この方法で作製された完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は、親、マウス抗体の結合特異性を保持しており、通常、親抗体よりも抗原に対して同等またはより高い親和性を有し、タンパク質レベルでヒト生殖系列抗体遺伝子に匹敵する高い程度の配列同一性のＶ領域を有する。

【0207】

方法
マウスＶ領域のクローニング
マウスモノクローナルＮＶＰ−ＬＦＵ７２０のＶ領域ＤＮＡは、標準的方法を使用してハイブリドーマ細胞株から単離されたＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ハイブリドーマｃＤＮＡの重鎖可変領域のＰＣＲ増幅での使用に成功したプライマーは、Ｖ_Ｈ１４（５’−ＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴ−３’、配列番号５８）（Chardes T, et al 1999, FEBS Letters; 452(3):386-94）およびＨＣ定常部（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＲＲＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ−３’、配列番号５９）であった。ハイブリドーマｃＤＮＡの軽（カッパ）鎖可変領域のＰＣＲ増幅での使用に成功したプライマーは、Ｖκ４／５（５’−ＴＣＡＧＣＴＴＣＹＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧ−３’、配列番号６０）（Chardes T, et al., 1999、前述）およびＬＣ定常部（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’、配列番号６１）であった。増幅された重鎖および軽鎖の可変領域の配列を決定した。次に、ＰＣＲを使用してＶ遺伝子を増幅し、クローニング用の制限酵素部位をＫａｌｏＢｉｏｓベクターに組み込んだ。すなわち、ＶｈをＫＢ１２９２−Ｈｉｓ（Ｃ末端可動性リンカーおよびＣＨ１上のアミノ酸配列ＡＡＧＡＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２）の６−Ｈｉｓ（配列番号５７）タグをコードするＫＢ１２９２の改変変種）のＮｃｏＩ（５’）およびＮｈｅＩ（３’）に組み込み、ＶｋをＫＢ１２９６のＮｃｏＩ（５’）およびＢｓｉＷＩ（３’）に組み込んだ。これらの個々の重鎖および軽鎖ベクターは次に、ＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩによる制限消化および連結によって単一のジシストロニックＫａｌｏＢｉｏｓ Ｆａｂ発現ベクターに結合させた。Ｆａｂ断片は、このベクターによってイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた。このＦａｂのＰＣＳＫ９−抗原結合を試験し、参照Ｆａｂ ＳＲ０３２と称した。

【0208】

Ｆａｂ精製
Ｆａｂ断片は、ＫａｌｏＢｉｏｓ発現ベクターを使用してイー・コリから分泌させることによって発現させた。細胞は、２×ＹＴ培地で、ＯＤ６００が約０．６になるまで増殖させた。発現は、ＩＰＴＧを１００μＭまで添加し、３３℃で４時間振盪することによって誘導した。アセンブルされたＦａｂは、浸透圧溶解によって周辺質画分から得られ、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−５２４７−０１）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって標準的方法に従って精製した。Ｆａｂは、イミダゾール５００ｍＭを含有する緩衝液中に溶出し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ ｐＨ７．４で徹底的に透析した。

【0209】

ライブラリー構築
ライブラリー構築の最初の工程では、ＫａｌｏＢｉｏｓヒトＶセグメントライブラリー配列をＰＣＲ増幅することによって、エピトープを特徴とする完全なヒトＶ領域ライブラリーを作製した。これらの完全鎖ライブラリーの作製においては、最適化した参照Ｆａｂ ＳＲ０３８のＢＳＤおよびヒト生殖系列Ｊセグメント配列を含有する特有のＣＤＲ３−ＦＲ４領域を、重複ＰＣＲを使用してヒトＶセグメントライブラリーに結合させた。これらの完全なＶ領域ライブラリーは、直接スクリーニングせず、むしろＶｈおよびＶｋ中間ライブラリー構築のための鋳型として使用した。完全鎖ライブラリー構築のために使用したＫａｌｏＢｉｏｓヒトＶセグメントライブラリーは、ＣＤＲ領域における元のマウスのＶｈおよびＶｋ’に最も近いヒト生殖系列配列をベースにして選択した。元のマウスＮＶＰ−ＬＦＵ７２０ Ｖｈは、ＣＤＲがヒト生殖系列配列Ｖｈ１−０２に最も近いので、Ｖｈ１亜群のメンバーを含有する２種類のＫａｌｏＢｉｏｓライブラリー（ＫＢ１４１０およびＫＢ１４１１）の混合物を、完全なＶｈライブラリーの作製において使用した。同様に、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０Ｖｋは、そのＣＤＲがＶｋ３ Ｌ６ヒト生殖系列配列に最も近いので、Ｖｋ３亜群のメンバーを含有する２種類のＫａｌｏＢｉｏｓヒトＶセグメントライブラリー（ＫＢ１４２３およびＫＢ１４２４）の混合物を、完全なＶｋライブラリーの作製において使用した。次に、これらの完全長ＶｈおよびＶｋライブラリーを、親マウスＶセグメントの一部のみがヒト配列のライブラリーによって置換されているカセットライブラリーの構築のための鋳型として使用した。２種類のカセットは、ブリッジＰＣＲによって構築し、ＦＲ１、ＣＤＲ１およびＦＲ２の最初の部分にヒト配列を含有するフロントエンドカセットは鋳型として前述したＶｈ１ライブラリー（ＫＢ１４１０およびＫＢ１４１１）の混合物またはＶｋ３ライブラリー（ＫＢ１４２３およびＫＢ１４２４）の混合物から増幅した。ＦＲ２の最後の部分、ＣＤＲ２およびＦＲ３にヒト配列を含有するミドルカセットは、鋳型として前述した完全なヒトＶｈまたはＶｋ領域ライブラリーを使用して増幅した。ＶｈカセットはＦ２におけるアミノ酸４５〜４９位（Ｋａｂａｔによる番号付け）に重複する共通配列を有し、ＶｋカセットはＦＲ２においてアミノ酸残基３５〜３９（Ｋａｂａｔによる番号付け）に重複する共通配列を有していた。このように、フロントエンドおよびミドルヒトカセットライブラリーは、ヒトＶ重鎖１およびＶカッパ３アイソタイプについてＰＣＲによって構築した。各Ｖｈカセットライブラリーは、ベクターＫＢ１２９２−Ｈｉｓ ａｔ ＮｃｏＩ（５’）およびＫｐｎＩ（３’）にクローニングし、各Ｖｋカセットライブラリーは、ベクターＫＢ１２９６−Ｂ（ＦＲ４にサイレントＨｉｎｄＩＩＩ部位を添加したＫａｌｏＢｉｏｓベクターＫＢ１２９６の改変変種）のＮｃｏＩ （５’）およびＨｉｎｄＩＩＩ（３’）にクローニングした。次に、得られたＶｈまたはＶｋプラスミドライブラリーは、ＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩで消化し、その後連結して完全なＦａｂを発現するジシストロニックベクターのライブラリーを生成することによって、最適化した参照Ｆａｂ ＳＲ０３８の相補鎖と結合させた（例えば、Ｖｈフロントエンドライブラリーは最適化した参照Ｖｋベクターと結合させた）。

【0210】

一般的ＥＬＩＳＡ
組換えヒトまたはカニクイザルマカクＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原をＥＬＩＳＡアッセイ全てに使用した。通常、ＰＢＳｐＨ７．４で希釈したＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原を９６ウェルマイクロタイタープレートに３００ｎｇ／ウェルで一晩４℃でインキュベートすることによって結合させた。プレートをＰＢＳに溶かした３％ＢＳＡ溶液で３７℃で１時間遮断し、次いでＰＢＳＴで１回濯いだ。その後、Ｆａｂを含有する誘導細胞培地または希釈した精製Ｆａｂ（５０μｌ）を各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回濯いだ。ＰＢＳで１：５０００に希釈した抗ヒトカッパ鎖ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ７１６４）（５０μｌ）を各ウェルに添加し、このプレートを室温で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ基質（ＫＰＬ ＃５２−００−０３）１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを室温で約１０分間インキュベートした。プレートを分光光度計によって６５０ｎｍで読み取った。

【0211】

精製したヒトおよびマウスＩｇＧに対する特異的なＥＬＩＳＡのために、３８４ウェルプレートを一群の精製したヒトおよびマウス抗原によってウェル当たり８８ｎｇでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを前述のように遮断して洗浄し、次いでＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈した精製したマウスまたはヒト抗ＰＣＳＫ９抗体２２μｌを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰに結合させた抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ＃１１５−０３５−０７１）または抗ヒトカッパ抗体（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ７１６４）をＰＢＳで１：５０００に希釈し（２５μｌ）、各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後洗浄して、前述のように発色させた。

【0212】

コロニーリフト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）
Ｆａｂ断片のＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ライブラリーのスクリーニングは、ＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６ ６μｇ／ｍｌでコーティングしたニトロセルロースフィルターを使用して、本質的に（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号および第２００６／０１３４０９８号）で記載されたように実施した。抗原をコーティングしたフィルターに結合したＦａｂは、ＰＢＳＴで１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ヒトカッパ軽鎖抗体（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ３８１３）を使用して検出し、ブロットはアルカリホスファターゼのＤｕｏＬｕｘ化学ルミネセンス基質で発色させた（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＃ＳＫ−６６０５）。

【0213】

ビオチン化組換えＰＣＳＫ９の作製および親和性測定
ｐＲＳ５ａ／ＰＣＳＫ９プラスミドのＰＣＳＫ９およびＨｉｓ６（配列番号５７）タグをコードする遺伝子の間にＥｃｏＲＩ制限部位を挿入することによってＣ末端にＡｖｉ（部位特異的ビオチン化のため）およびＨｉｓ６（配列番号５７）タグ（ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６）を有するＰＣＳＫ９を作製し、Ｃ末端Ｈｉｓ６（配列番号５７）タグを有するＰＣＳＫ９ Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｑ８ＮＢＰ７のアミノ酸３１〜６９２を発現する。Ａｖｉタグ（アミノ酸配列ＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号６３）をコードし、ＥｃｏＲＩオーバーハングが隣接するオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でリン酸化し、アニーリングし、その後新たに挿入されたＥｃｏＲＩ部位を使用してｐＲＳ５ａ／ＰＣＳＫ９に連結した。Ａｖｉタグを含有するクローンを配列分析によって確認した。ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６の発現は、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施し、分泌した組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。精製後、ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６タンパク質は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、ＮａＣｌ ５０ｍＭに対して透析した。タンパク質は、製造者のプロトコールに従ってビオチン−タンパク質リガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ）によってインビトロでビオチン化した。完了後、反応物をＰＢＳ ｐＨ７．２に対して透析し、ビオチン化はウェスタンブロットでＨＲＰ結合ストレプトアビジンで探索することによって確認した。

【0214】

ＩｇＧおよびＦａｂ断片の結合速度は、溶液平衡滴定（「ＳＥＴ」）アッセイを使用して分析した。簡単に説明すると、ｈＰＣＳＫ９の希釈系列をＩｇＧ ６０ｐＭまたはＦａｂに添加し、一晩インキュベートした。９６−ウェル標準結合マイクロタイタープレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）にｈＰＣＳＫ９ １μｇ／ｍｌをコーティングし、一晩インキュベートして、ＰＢＳ／０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ／５％（w／ｖ）ＢＳＡで遮断し、再度洗浄した。抗体−抗原調製物をＰＣＳＫ９コーティング標準結合プレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。さらに３回洗浄工程を経た後、スルホ−タグ標識ヤギ抗ヒト検出抗体（Ｒ３２ＡＪ−５、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、室温で一時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、読み取り緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）シグナルをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって測定した。ＥＣＬデータは、Piehler, et al., (1997) J Immunol Methods 201:189-206に記載された抗体に適用可能な適当なモデルを使用して、ｅｘｃｅｌアドインＸＬｆｉｔ４．３．２（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で処理した。溶液中において、ヒトＰＣＳＫ９と抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１の間で親和性の高い結合が認められ、それぞれについて算出されたＫＤ値は１５０〜１９０ｐＭであった。

【0215】

抗体産生および精製
完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１抗体（サイレントＩｇＧ１カッパ）は、２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃５１−００３１）を使用して、製造者のプロトコールに従って、以下の通りにベクターを２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に同時形質移入することによって生成した。
ＬＧＴ−２０９−ｐＪＧ０４（Ｖｈ）＋ｐＪＧ１０（Ｖｋ）
ＬＧＴ−２１０−ｐＪＧ０４（Ｖｈ）＋ｐＪＧ０１（Ｖｋ）
ＬＧＴ−２１１−ｐＳＲ７４（Ｖｈ）＋ｐＪＧ１０（Ｖｋ）

【0216】

抗体は、５ｍＬのＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃１７−０４０３−０３）を使用して、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞上清から精製した。抗体は、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ ＃２１００４）を使用して溶出し、透析によって緩衝液をＰＢＳに交換した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、ＡＫＴＡＦＰＬＣ液体クロマトグラフィー系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。

【0217】

エピトープ競合アッセイ
元のマウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０とそのＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）誘導体化ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９の間のＰＣＳＫ９上のエピトープへの結合の競合は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＱＫシステムおよびビオチン化ＰＣＳＫ９−Ａｖｉ−Ｈｉｓ６でコーティングしたストレプトアビジン高結合バイオセンサーを使用してアッセイした。次に、３種類の異なる抗体、マウスＬＦＵ７２０、完全ヒトＬＧＴ２０９または対照マウス抗体７Ｄ１６（ＬＦＵ７２０とは別のエピトープを有することが知られている）を別々のＰＣＳＫ９コーティングセンサーに飽和するまで結合させた。次に、センサーを全て、ＬＦＵ７２０マウス抗体を含有するウェルに浸漬し、第１抗体がＬＦＵ７２０の結合を遮断できるかどうかを測定した。

【0218】

結果
マウスおよび参照Ｖ領域アミノ酸配列
ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０を発現するハイブリドーマ細胞からのＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し、この配列はＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ 質量スペクトル分析を使用してタンパク質レベルでほとんど（９５％以上）確認された。次に、参照Ｆａｂ ＳＲ０３２を作製するために、ＬＦＵ７２０の重鎖および軽鎖可変領域をＫａｌｏＢｉｏｓベクターにクローニングした。参照Ｆａｂ ＳＲ０３２作製用のＫａｌｏＢｉｏｓベクターへのクローニングを可能にするために、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０ Ｖｋの最初のアミノ酸はグルタミン（Ｑ）からグルタミン酸（Ｅ）に変化させなければならなかったので、ＳＲ ０３２Ｖｋは最初のＶｋ位置にグルタミン酸を有する。Ｆａｂ ＳＲ０３２には、ヒト定常領域に融合したＮＶＰ−ＬＦＵ７２０由来の完全なマウスＶ領域が有り、イー・コリから精製された。ＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ６抗原結合の希釈ＥＬＩＳＡ試験において、クローニングされたＳＲ０３２参照Ｆａｂは、Ｆａｂ濃度に応じた結合曲線を生じた。参照Ｆａｂ（ＳＲ０３２）に加えて、最適化した参照Ｆａｂ、ＳＲ０３８を構築した。ＳＲ０３８では、ＳＲ０３２のいくつかのフレームワークアミノ酸残基をヒト生殖系列に変化させた。

【0219】

参照および最適化した参照Ｆａｂの親和性分析
ＦＲ１およびＦＲ３中の最適化した参照ＦａｂＳＲ０３８に組み込まれたヒト生殖系列残基は、ヒトＶセグメントレパートリーを増幅するために使用されたＰＣＲプライマーによって特定されたものであり、したがって、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｖ領域ライブラリーの全メンバー中に存在する。最適化した参照Ｆａｂは、ヒト生殖系列への変化のいずれかがＦａｂ結合の特性を変化させるかさせないかを評価するために構築する。精製したＦａｂを使用した希釈ＥＬＩＳＡによって、組換えＰＣＳＫ９抗原に対するＳＲ０３２およびＳＲ０３８の親和性は同一であることが測定され、ＳＲ０３８中のアミノ酸変化には耐性があることが示唆された。

【0220】

ライブラリー構築および完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂの選択
Ｖｈ１またはＶｋ３に限定された重鎖および軽鎖フロントエンドおよびミドルカセットライブラリー亜群を作製し、ＣＬＢＡによってスクリーニングした。Ｖｈについては、ＰＣＳＫ９抗原への結合を支持するフロントエンドカセットはコロニーリフト結合アッセイによって同定されたが、Ｖｈミドルカセットは同定されなかった。Ｖｋについては、フロントエンドカセットおよびミドルカセットの両方がコロニーリフトによって同定され、さらに、いくつかの完全なＶｋクローンが同定された（Ｖｋフロントエンドライブラリーに完全鎖Ｖｋクローンが混入したため）。各ライブラリーの多くの結合物がＦａｂ含有細胞上清におけるＥＬＩＳＡアッセイで再確認され、各ライブラリーのいくつかのＦａｂが周辺質画分から精製され、Ｆｏｒｔｅ分析を使用して親和性によって順位付けされた。

【0221】

ＰＣＳＫ９結合を支持するＶ−重鎖ミドルカセットは同定されなかったので、重鎖ＣＤＲ２またはＦＲ３内の全位置で親のマウス残基またはヒト生殖系列に最も近い残基のいずれかをコードする２種類の突然変異誘発ライブラリーを構築した。こうして、遺伝子操作されたヒトミドルカセットライブラリーを構築し、スクリーニングし、抗原結合クローンを同定した。その後、個々のクローンにおいて結合を支持した、Ｖｈミドル内におけるヒト生殖系列への変化を一緒にして最終的に１個のミドルカセットを作り出し、最適化した参照Ｆａｂにおいてこのカセットを含有するＦａｂの結合の親和性を確認し、最適化した参照ＦａｂをＦｏｒｔｅ分析した。

【0222】

作り出したライブラリーから、ＣＬＢＡによって重鎖および軽鎖両方についてＰＣＳＫ９抗原への結合を支持するフロントエンドおよびミドルヒトカセットを同定することに成功した。これらの結合物は全てＥＬＩＳＡによって確認し、次いでＦａｂを精製し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して順位付けした。重鎖および軽鎖について高く順位付けされたカセットをブリッジＰＣＲによって最終的な１個のライブラリーに一緒にし、ＰＣＳＫ９への結合を支持する完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＦａｂをＣＬＢＡによってこのライブラリーから選択した。これと並行して、上位にランク付けされたカセットまたは鎖全て（最良のＶｈフロントエンド、遺伝子操作されたＶｈミドル、および最良の完全な軽鎖）を一緒にして、親和性の高い結合を支持することが予測される１個のＦａｂ ＳＲ０６６を作り出した。

【0223】

親マウスｍＡｂ ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０およびＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ａｂ ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれ図１〜４に示す。

【0224】

ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分析を使用した完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＦａｂのＰＣＳＫ９抗原に対する親和性試験
Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＳＲ０６６ Ｆａｂおよび最終的なコンビナトリアルライブラリーから引き出された３個のＦａｂ（＃１−２、＃３−２および＃４−２）を発現させ、精製した。その後、これら４種類のヒトＦａｂの結合速度は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して最適化した参照Ｆａｂ ＳＲ０３８の速度と比較した（数値データは表１にまとめて示した）。

【表1】

【0225】

これらのＦａｂのタンパク質濃度の決定は困難で、そのため解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｄ）データは結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋａ）およびＫＤデータよりもずっと信頼性が高い（解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）のみが濃度依存的である）。試験したＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂ４種は全て、最適化した参照Ｆａｂよりも３から４倍「劣る」（すなわち、速い）解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有するように見える。元の重鎖フロントエンドカセットライブラリーから選択されるＦａｂ結合物の全ては、最適化した参照Ｆａｂよりも「劣る」解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有するように見えたので（データは示さず）親和性のこの減少は、これらのクローンにおける重鎖フロントエンドによるものと考えられる。重鎖フロントエンドは、ＣＤＲ１を含有するので、Ｖｈフロントエンドカセット中のこのＣＤＲに生じた変化は、最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂの親和性の減少の原因である可能性があった。完全なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂ、ＳＲ０６６は、最高の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有し（表１）、重鎖ＣＤＲ１中のＳＲ０６６と参照（マウス）配列の間には３つの違いがある。ＣＤＲＨ１に生じた変化がＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂ全てに認められる親和性の減少に関連することを試験するために、ＳＲ０６６のＣＤＲＨ１に同時に２個の残基を元のマウス残基に一致するように変化させて戻し、発現させ、Ｆｏｒｔｅ速度分析のためにこれらの変化したＦａｂを精製した。

【0226】

ＣＤＲＨ１（ＳＲ０７９）に２つの変化を同時に有する１個のＦａｂは(表２)、ＳＲ０６６の結合速度が著しく改善された（数値データは表３にまとめて示す）。実際に、ＳＲ０７９ Ｆａｂは最適化した参照（マウス）Ｆａｂ ＳＲ０３８と同等の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有するように見えた。

【表2】

【表3】

【0227】

Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）Ｆａｂ ＳＲ０６６、＃１−２、＃３−２および＃４−２は、ＣＤＲＨ２中に「Ａｓｎ−Ｇｌｙ」（「ＮＧ」）アミノ酸配列を含有しており、これは元のマウス抗体由来であった。この配列は、生成に望ましくない特性である脱アミド化を受ける可能性があることが知られている。したがって、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＳＲ０６６ Ｆａｂの親和性を改善するように努力すると同時に、２種類の突然変異誘発ライブラリーをＳＲ０６６について構築し、「Ｎ」または「Ｇ」を元のアミノ酸以外の可能性のあるアミノ酸全てによって置換した（例えば、「Ｎ除去ライブラリー」では、「Ｎ」は「Ｎ」以外の全アミノ酸で置換した）。次に、「ＮＧ」配列はもう有さないが、ＳＲ０６６の結合レベルをまだ保持している（最適化した参照Ｆａｂ ＳＲ０３８よりは少ない）クローンを同定するために、このライブラリーからのＦａｂ含有細胞上清をＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。「Ｎ除去ライブラリー」は、ＳＲ０６６と同程度に結合するＦａｂを生じないが、「Ｇ除去ライブラリー」は、「Ｇ」位置にいくつかの異なる置換を有し、十分な結合レベルを備えたＦａｂを生じた。そのうち、「ＮＧ」から「ＮＥ」、「ＮＡ」および「ＮＭ」への変化を有するＦａｂを精製およびＦｏｒｔｅ速度分析のために選択し、親Ｆａｂ ＳＲ０６６と類似の反応速度を有することを見出した。

【0228】

親和性を改善するための７４７２個のヒトＩｇＧの遺伝子操作
Ｖｋ操作
完全なヒトＩｇＧを作り出すために、ＳＲ０７９のＶｈ配列（親和性を改善したＳＲ０６６の改変変種）のＣＤＲＨ２までを増幅し、ブリッジＰＣＲによってＣＤＲＨ２からＦＲ４のほとんどの「Ｇ除去ライブラリー」クローンの配列（ＣＤＲＨ２中に「ＮＥ」を含有する）に付着させた（ｓｔｉｔｃｈ）。このＶｈ配列をｐＲＳ５ａ−ｈＩｇＧ１ＬＡＬＡ+ ＫｐｎＩ（Ｖｈのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ＦＲ４にＫｐｎＩ部位を添加するために改変されたサイレントＩｇＧ１クローニングベクター）のＮｒｕＩ（５’）およびＫｐｎＩ（３’）にクローニングし、ｐＳＲ０７４を作り出した。ＳＲ０６６からのＶｋ（ＦＲ１からＦＲ４を通る経路まで）を増幅して、ｐＲＳ５ａ−ｈカッパのＡｇｅＩおよびＢｓｉＷＩにクローニングし、ｐＳＲ０７２を作り出した。これらのベクターは配列決定によって確認し、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞に同時形質移入した。このＩｇＧ（「７４７２」と称する）を抗体含有細胞培地から精製した。驚くべきことに、抗体７４７２は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析では親マウス抗体ＬＦＵ７２０よりも結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）が著しく遅かった（示さず）。各ヒト鎖を相補的なマウス鎖で交換することによって、この結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）の不足は、ヒト軽鎖に関する問題によることが決定された。親和性を回復させるためにｐＳＲ０７２ヒト軽鎖に改変を起こさせ（表４）、軽鎖の最初の４残基をマウス配列に戻すように変換し、ＣＤＲ１の後半の残基をマウスに戻すように変換した。この軽鎖を前述のようにｐＲＳ５ａ−ｈカッパにクローニングして、ｐＪＧ１０およびｐＪＧ０１を作製し、ｐＳＲ０７４（Ｈｃベクター）およびｐＪＧ１０（Ｌｃベクター）またはｐＪＧ０１（Ｌｃベクター）を同時形質移入することによって完全なＩｇＧを作製した。総合すると、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたように、これらの変化は部分的にＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体の親和性を回復させた。

【表4】

【0229】

表４は、ヒト抗体７４７２、親マウス抗体ＬＦＵ７２０の軽鎖の一部およびｐＪＧ１０によってコードされた軽鎖のアラインメントを示している。この部分はｐＪＧ０１によってコードされた軽鎖と同一である。軽鎖ベクターは、最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ−２１１の発現のために使用した。

【0230】

ＣＤＲＨ３の親和性成熟
軽鎖の改変と並行して、ｐＳＲ０７４重鎖のＣＤＲ３の親和性成熟のためにＦａｂライブラリーを構築した。このライブラリーでは、ＣＤＲ３残基は、元の残基を除くその他の全アミノ酸で１つずつ置換した。このライブラリーはＣＬＢＡによってスクリーニングし、結合物はＥＬＩＳＡによって確認し、得られたＦａｂは精製して、親ヒトＦａｂと比較して結合速度が改善したかどうかを決定するためにバイオレイヤーインターフェロメトリによって試験した。

【0231】

親和性が著しく改善されたＣＤＲＨ３置換、ＡからＮへの変化を同定した（表５）。この変化はその後、ｐＳＲ０７４重鎖ＩｇＧ発現プラスミドの場合にも行い、この新たなコンストラクトをｐＪＧ０４と呼んだ。最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９（ＬＧＴ２０９）は、ｐＪＧ０４（Ｈｃ）およびｐＪＧ１０を同時形質移入し、その後精製することによって作製した。最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０（ＬＧＴ２１０）は、ｐＪＧ０４（Ｈｃ）およびｐＪＧ０１を同時形質移入し、その後精製することによって作製した。この変化は、抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２１１（ＬＧＴ２１１）には導入しなかった。

【表5】

【0232】

表５は、ヒト抗体７４７２、親マウス抗体ＬＦＵ７２０の重鎖ＣＤＲ３およびｐＪＧ０４によってコードされた重鎖（最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１０の発現のために使用された重鎖ベクター）のアラインメントを示している。ＡからＮの置換には下線を引いてある。

【0233】

溶液平衡滴定（ＳＥＴ）システムを使用したＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１の結合速度の分析
ＳＥＴアッセイを使用して、ヒトＰＣＳＫ９に対するＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰ−ＬＧＴ２１１抗体の結合親和性は表６に示したように１５０〜１９０ｐＭの間であることを測定した。このことは、溶液中における抗体とＰＣＳＫ９の間の高い親和性相互作用を示唆している。

【表6】

【0234】

ＥＬＩＳＡによるＮＶＰ−ＬＧＴ２０９の抗原特異性の分析
親マウス抗体ＬＦＵ７２０の抗原特異性が最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＩｇＧ、ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１で保持されているかどうかを試験するために、一群のヒトおよびマウス抗原（ならびにヒトＰＣＳＫ９）に対する抗体の結合をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。このアッセイの結果（図５Ａ−Ｃ）は、ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１が、マウス抗体ＬＦＵ７２０と同様にＰＣＳＫ９に対して高い特異性を保持していることを示している。

【0235】

ＥＬＩＳＡにおいてヒトおよびカニクイザルマカクＰｃｓｋ９タンパク質に結合する抗体
ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１のヒトおよびカニクイザルマカク（ｃｙｎｏ）Ｐｃｓｋ９への特異的結合を評価した。このＥＬＩＳＡアッセイは、親マウス抗体ＬＦＵ７２０のように、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１が同様の様式でヒトおよびｃｙｎｏ Ｐｃｓｋ９の両方に結合できることを示している（図６Ａ〜Ｃ）。

【0236】

バイオレイヤーインターフェロメトリをベースにしたエピトープ競合アッセイ
親マウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０のエピトープ特異性が最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１で保持されているかどうかを試験するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用した競合アッセイを開発した。Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１は親マウス抗体ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０の結合を遮断し、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体が元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持していることを示唆している。抗体の添加の順番を変えると、すなわち、ＮＶＰ−ＬＦＵ７２０を最初に結合させ、次にＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体を結合させても類似の結果が得られた。

【0237】

Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１のアミノ酸配列ならびにヒト生殖系列配列に対するパーセント同一性
最終的なＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）ＩｇＧ ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１の可変領域アミノ酸配列をそれぞれ、図２〜４に示す。ＣＤＲは下線を引いた太字である。ヌクレオチド配列も配列リストに含める。

【0238】

ヒト生殖系列配列に対する抗体ＬＧＴ２０９、ＬＧＴ２１０およびＬＧＴ２１１のパーセント同一性は、単一のヒト生殖系列配列（それぞれ、Ｖｈ１ １−０２およびＶｋ３ Ａ２７、表７）に対してＶｈおよびＶｋアミノ酸配列をアラインメントさせることによって測定した。ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３の残基は、各鎖の計算から除外した。

【表7】

【0239】

ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ抗体の機能的特徴に関する追加情報は、図８〜１４の説明に記載されている。

【実施例3】

【0240】

実施例３：ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰＬＧＴ２１１の突然変異分析
ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体ＮＶＰ−ＬＧＴ２０９、ＮＶＰ−ＬＧＴ２１０およびＮＶＰＬＧＴ２１１の変異体のＰＣＳＫ９に結合する能力について評価した。結果を以下にまとめて示す。

【0241】

重鎖ＣＤＲ１、

【表8】

（配列番号６６）に関して、元のマウス残基（太字）を含有するクローンのみがマウスＡｂの結合速度を保持している（バイオレイヤーインターフェロメトリ分析によって測定された通り）。したがって、重鎖ＣＤＲ１内のこれらの残基は結合において役割を果たしている。

【0242】

重鎖ＣＤＲ２、

【表9】

（配列番号７４）に関して、太字の残基は、元の（マウス）残基または各位置において最も近いヒト生殖系列配列の対応する残基のいずれかをコードするライブラリーから取り出した抗体結合体中では変化しなかった（ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした）。したがって、太字の残基は結合において役割を果たしている。保存的置換は、下線を引いたＧｌｕ残基によって示された位置では耐性があり、例えば、この位置は、ＥＬＩＳＡによって測定され、バイオレイヤーインターフェロメトリによって確認されたように、Ａ、ＥまたはＤであってもよい。

【0243】

重鎖ＣＤＲ３、

【表10】

（配列番号７５）に関して、太字の残基は、各位置において可能性のある全アミノ酸をコードする（元のアミノ酸は除く）親和性成熟ライブラリーから取り出したクローンでは変化しなかった。したがって、太字の残基は結合において役割を果たしている。保存的置換は、下線を引いたＡｌａまたはＡｓｎ残基によって示された位置では耐性があり、例えば、この位置は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたように、Ａ、ＮまたはＱであってもよい。保存的置換は、下線を引いたＴｒｙ残基によって示された位置では耐性があり、例えば、この位置は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定されたように、Ａ、Ｆ、Ｓ、ＶまたはＹであってもよい。

【0244】

軽鎖ＦＲ１に関して、

【表11】

（配列番号７６）、保存的置換は、Ｂｉｏｃｏｒｅによって測定されたように、下線を引いた位置１および４において耐性がある。例えば、位置１のアミノ酸はＡ、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱであってもよい。位置４のアミノ酸はＶ、Ｉ、ＬまたはＭであってもよい。ＱＩＶＬとしての位置１〜４（配列番号６９）（マウス親ＬＦＵ７２０、ＬＧＴ２０９およびＬＧＴ２１１Ｖｋにおけるように）は、Ｂｉｏｃｏｒｅによって測定されたように、ＥＩＶＭとして位置１〜４（配列番号６７）にわたって結合を改善した（ＬＧＴ２１０Ｖｋにおけるように）。

【0245】

軽鎖ＣＤＲ１、

【表12】

（配列番号７１）に関して、太字の残基の空間的配置は、Ｌｃ ＣＤＲ１のこの位置に２つの他のアミノ酸を有するヒトクローンの親和性が損なわれたように、結合について影響を及ぼした。したがって、太字の残基は結合において役割を果たしている。

【0246】

軽鎖ＣＤＲ３、

【表13】

（配列番号２６）に関して、これらの位置のヒト生殖系列への変化は、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、耐性はない。したがって、太字の残基は結合において役割を果たしている。

【0247】

本明細書で記載された実施例および実施形態は、例示した目的のためだけのものであって、それらに関する様々な変更または変化は当業者に示唆されており、本出願の精神および範囲内ならびに特許請求の範囲内に含まれるものである。本明細書で引用した全出版物、特許、特許出願および配列受入記録は、全目的のために全体を参考として本明細書に組み込む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]