特許 5981421 組織修復用の高密度フィブリル状コラーゲンマトリックスおよびその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5981421

(24)【登録日】2016年8月5日

(45)【発行日】2016年8月31日

(54)【発明の名称】組織修復用の高密度フィブリル状コラーゲンマトリックスおよびその調製方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/00 20060101AFI20160818BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20160818BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/00 V

   C07K14/78

【請求項の数】10

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2013-512978(P2013-512978)

(86)(22)【出願日】2011年5月30日

(65)【公表番号】特表2013-529964(P2013-529964A)

(43)【公表日】2013年7月25日

(86)【国際出願番号】FR2011051234

(87)【国際公開番号】WO2011151587

(87)【国際公開日】20111208

【審査請求日】2014年5月23日

(31)【優先権主張番号】1054194

(32)【優先日】2010年5月31日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】505003159

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ピエール エ マリー キュリー（パリ シス）

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＩＥＲＲＥ ＥＴ ＭＡＲＩＥ ＣＵＲＩＥ （ＰＡＲＩＳ ＶＩ）

(73)【特許権者】

【識別番号】311016455

【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】512311395

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ドゥ ヴェルサイユ サン カンタン アン イヴリーヌ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＶＥＲＳＡＩＬＬＥＳ ＳＡＩＮＴ ＱＵＥＮＴＩＮ ＥＮ ＹＶＥＬＩＮＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】ジロー−ギル マリー−マドレーヌ

(72)【発明者】

【氏名】ナシ ナディーヌ

(72)【発明者】

【氏名】ワン ヤン

(72)【発明者】

【氏名】エラリー クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ペル アンヌ

【審査官】 菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】 特許第３２２１６９０（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表平１１−５０８７８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／００４１８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０１９６２５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ ２７／００

Ｃ０７Ｋ １４／７８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

コラーゲン溶液の濃縮により均一なコラーゲンベースの材料を調製する方法であって：ａ）コラーゲン溶液を制御圧力手段により連続注入することにより浸透性要素と接触させること、ここで、前記浸透性要素自体は濃縮剤と接触しているものとし、
ｂ）前記コラーゲン溶液、浸透性要素および濃縮剤を、水性コラーゲン溶液中に含有された溶媒の選択的物質移動を可能とする条件下で接触させて保持して前記均一コラーゲン材料の形成を前記浸透性要素内側で、または前記浸透性要素の表面上で得ること
を含む方法。

【請求項2】

前記濃縮剤が、ポリマー溶液である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記浸透性要素が透析セルであることを特徴とする請求項２に記載の均一なコラーゲンベースの材料を調製する方法であって：
以下の段階：
ａ）純粋コラーゲンの水性溶媒中酸溶液を調製する段階、
ｂ）前記純粋コラーゲン溶液を制御圧力手段により透析セル中に連続注入する段階であって、ここで、前記透析セルの端部の少なくとも一方は、前記溶媒ならびに前記酸のみが膜を拡散するように多孔度が固定された透析膜により密封されており、前記膜は、濃度が最終コラーゲン濃度に適合されたポリマー溶液と接触しているものとし、
ｃ）前記コラーゲン溶液、透析セルおよびポリマーを、前記水性コラーゲン溶液中に含有された前記溶媒の選択的物質移動を可能とする条件下で保持して純粋で均一な濃縮コラーゲン溶液の形成を前記透析セル中で、または前記透析膜の表面上で得る段階、
ｄ）前記材料が含有されたモールドまたは表面上に前記均一な純粋コラーゲン材料が固定された膜を回収する段階
を含む方法。

【請求項4】

前記透析セルの端部の少なくとも一方が、前記溶媒ならびに前記酸およびイオンのみが膜を拡散するように多孔度が固定された透析膜により密封されている、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

段階ｄ）の前または後に、前記純粋コラーゲン材料中でのフィブリルの形成の段階も含むことを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

段階ａ）において使用される前記溶液の濃度が、０．０１から５ｍｇ／ｍＬの間であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

段階ａ）において使用される前記溶液の濃度が、０．５から３ｍｇ／ｍＬの間である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記イオンが、カルシウムおよびリン酸塩からなる群から選択されたミネラル相前駆体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記ポリマーが、分子量が３０００Ｄａよりも大きいポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項２〜５及び８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記フィブリルを、塩基性である気相または中性若しくは塩基性である液相による均一で純粋なコラーゲンをベースとする材料の処理により形成させることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明の対象は、高密度フィブリル状コラーゲンマトリックスを調製する方法、そうして得られたマトリックスおよび組織修復のためのその使用である。

【0002】

Ｉ−現在の状況および期待：
生体材料は、西洋諸国における平均寿命の顕著な増加によりもたらされる経済的および社会的変化、ならびに関連する病変に合致させることが重要である。

【0003】

合成質（金属、セラミックス、ポリマー）または天然（キトサン、デキストラン、プルラン）、グリコアミノグリカン（ＧＡＧ）またはコラーゲンの多数の代替材料が文献に提案されている。生体材料の品質基準は、それらの使用容易性、それらの機械的特性およびそれらの生物内での動態（拒絶または分解、接着および細胞コロニー化、リモデリング）により決定される。

【0004】

従って、本文中において、種々のタイプのコラーゲンベースの代替物が産業用途レベルにおいて既に提案されているが、それらは外科医および患者の期待に依然として十分に合致していない。

【0005】

産業用途をもたらした第１のコラーゲンベースの生体材料は、皮膚代替物に関するものであった。市販の製品は、重度の火傷患者用の移植物または慢性創傷および潰瘍用のドレッシングとして提案されている。Ｉｎｔｅｇｒａ（商標）の名称で販売されている第１の真皮代替物は、グルタルアルデヒドにより架橋されたコラーゲンおよびプロテオグリカンの無細胞スポンジである。Ｅｐｉｃｅｌ（商標）の名称で市販されているケラチノサイトシートと組み合わせると、真皮等価物が皮膚代替物になる。

【0006】

他の用途において、代替物は合成由来のポリマーを含み、または細胞を取り込み、それらの成功は細胞／マトリックス相互関係に依存する。凍結乾燥されたコラーゲンスポンジ（Ｏｒｃｅｌ（商標）またはＩｎｔｅｇｒａ（商標））内の大きい孔中での細胞の接着は、それらの細胞を担体が２次元である状況に配置し、この場合、表現型は細胞が３次元接触を有するインビボ状況とは異なる。このことは、接着および細胞コロニー化の促進における天然由来の分子、特にコラーゲンの利点を強化する。繊維芽細胞が３次元接触で見出される唯一の系は、合衆国において開発されたコラーゲンヒドロゲルである。次いでケラチノサイトシートと組み合わされたそれらのヒドロゲルは、皮膚修復材料（Ａｐｌｉｇｒａｆ（商標））になる。それらの生体材料の主な欠点は、それらの機械的特性が不十分であることである。

【0007】

現在移植することができるコラーゲンベースの材料は、スポンジまたはヒドロゲルをもたらす２種の生成プロセスから誘導される。次いで、それらの基礎材料を、化学分子（団結）、細胞（繊維芽細胞）または保護フィルム（シリコーン）と組み合わせることにより市販製品の品質を強化する処理に付す。酸溶性コラーゲン溶液の凍結乾燥により得られたコラーゲンスポンジは、多孔性３次元系である。直径１５から１５０μｍの細孔のサイズは、凍結乾燥前の凍結の基準に従って変動する。スポンジ構造により、播種された繊維芽細胞が支持体全体をコロニー化することにより増殖し、次いでフィブリル状コラーゲンを分泌することが可能となる。細胞または遺伝子療法におけるそれらの系の使用は、それらの生体適合性および生分解性担体特性と結びついている。しかしながら、スポンジの脆弱性および生物内でのそれらの短い寿命は、化学的薬剤（アルデヒド、カルボジイミド）による架橋を要求し、その毒性が問題を引き起こす。コラーゲンヒドロゲルは、コラーゲンモノマーを沈殿させてフィブリルを酸溶性溶液内で形成させることにより得られる。繊維芽細胞を出発溶液および培養培地と組み合わせると、弱く濃縮（約１ｍｇ／ｍＬ）され、構造がランダムであるフィブリル状ゲルが細胞を捕捉する。次いで、ゲルの顕著な収縮が次の数日間にわたり観察され（培養下１４日後に初期表面の約３％）、真皮等価物として公知のものをもたらす。この再構成された組織は、増殖し、その構造を被覆する表皮の細胞、ケラチノサイトにより二次的に播種されると皮膚等価物になる。ヒトにおけるグラフト化試験はそれらの代替物の生物学的品質を実証したが、緩いフィブリル状ネットワークの収縮現象は、材料の取扱の間またはそれらの移植後に明らかな脆弱性の問題を引き起こす。それらのヒドロゲルは、多数のリモデリング（コラーゲンおよびメタロプロテイナーゼの合成）および細胞増殖研究の対象である。ヒドロゲルは有用な細胞培養モデルである一方、それらは組織修復用の支持体としては不適切であることが証明された。ヒドロゲルの機械的特性は、それらの濃度を圧縮（§ＩＩ．４参照）により増加させることにより改善されており、その結果、容易に脱水された脆性フィルムがもたらされ；４０μｍのオーダーであるそれらの厚さは多くの用途において微細すぎる。

【0008】

並行して、他の構成成分と組み合わされた動物由来の脱細胞化生物組織（ウシまたはブタ由来の心臓弁、血管、真皮、結合組織）が市場に置かれている。このタイプのアプローチにおいて、調製方法に結びつく合併症（残留細胞片または架橋剤に結びつく細胞毒性）は顕著な炎症反応を示し、疾病率および致死率に関して深刻な結果を有する。

【0009】

従って、医療従事者および患者の期待により良好に対応する新規生体材料、特に種々の形態の毒性を有さない生体材料または細胞によりコロニー化させ、宿主組織中に取り込ませることができる被覆材料が必要とされている。

【0010】

本発明者らは、高濃度におけるコラーゲンを用いて、その濃度に結びつく超分子オーダーの確立を制御することおよびゾル／ゲル転移の間安定化することにより作業して高密度フィブリル状マトリックスをもたらすことを可能とする技術を開発した。本発明者らは、４０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを有するマトリックスがそれらの細胞および機械的応答に関して特に有用な特性を有することも実証した。それらのマトリックスは、メタロプロテイナーゼによるコラーゲンの加水分解後にそれらの表面において播種された繊維芽細胞によりインビトロでコロニー化される。２８日間の培養後、増殖とアポトーシスとの間の平衡から生じるマトリックス内に存在する細胞の数は、生存組織のものと同様である（Ｈｅｌａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，（２００５），２６ ｐ．１５３３−１５４３；Ｈｅｌａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００６）２７：４４４３−４４５４）。単軸圧縮下での機械的応答はラット真皮の対照試料と等価の結果を生成し、そのことはそれらの材料を組織修復において使用することができることを示唆する（Ｒａｍｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＪＭＭＢ，２０１０）。

【0011】

本発明者らの名義の国際公開第２０１０／００４１８２号パンフレットは、骨代替物の分野において使用される、より高濃度範囲（８０ｍｇ／ｍＬから出発）におけるそれらの高密度フィブリル状コラーゲンマトリックスのミネラル化に関する。

【0012】

従来の研究において、本発明者らは、高密度フィブリル状コラーゲンマトリックスを得る目的でコラーゲンを濃縮する種々の方法を使用した。

【0013】

ＩＩ−高密度マトリックスを得る従来の方法：
１）蒸発
方法−初期濃度が５ｍｇ／ｍＬ未満であるコラーゲンの初期酸溶液を結晶皿（または任意の他の幅広開口容器）中に無菌環境においてフード下で装入する。溶液を所望濃度に到達するまで蒸発させておく（Ｈｅｌａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００５）。

限界−この技術は、極めて高い濃度および高い容量に好適ではない。実際、３００ｍｇ／ｍＬ溶液を得るために１ｍｇ／ｍＬの初期溶液を用いて出発すると、試料を回収するために顕著な時間待つ必要のないように、極めて大きく、上記のとおり極めて幅広の容器が要求される。更に、乾燥コラーゲンのフィルムが表面上に形成し得る。更に、ｐＨの上昇による沈殿後、コラーゲンフィブリルはサイズが均一であるとは限らない。この技術は、産業に容易に適合／移行させることができない。それというのも、この技術は開口槽の使用に起因して大きい無菌領域を要求するからである。更に、極めて高い濃度においてまたは大容量の場合には尚更そうであるが、濃度勾配が形成し（表面、すなわち空気／溶液界面におけるより濃縮された領域）、平衡に到達させることが困難であると思われる。この勾配の存在は、コラーゲンフィブリルのサイズが均一であるとは限らないことを部分的に説明する。

【0014】

２）透析
方法−初期濃度が５ｍｇ／ｍＬ未満であるコラーゲンの酸溶液を透析チューブ中に装入する。膜の多孔度は、分子量が細孔のサイズ未満である溶媒、塩および分子が壁部を拡散するがコラーゲンが拡散しないように固定する。全体を、濃度が所望濃度に等しい／または所望濃度よりもわずかに大きいポリマー溶液（一般にポリエチレングリコールまたはＰＥＧ）中で浸漬する（Ｇｏｂｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８）。

限界−この技術を用いて、３００ｍｇ／ｍＬ溶液を得るために１ｍｇ／ｍＬの初期濃度から出発すると、１ｍＬの最終容量の濃縮溶液を得るために少なくとも３００ｍＬに等しい膜の容量が要求され、そのことは実験的に明らかでない。また、抽出を可能とするために一般により小さい容量の透析膜を、コラーゲンを定期的に再充填させてかなり一致する容量の溶液が得られるまで使用する。この段階も問題を引き起こす。それというのも、次いで剪断に起因してこの濃度において結晶−液体タイプの組織化特性を有するコラーゲンの組織化を改変するリスクのある膜の内側全体に薄く拡散した濃縮コラーゲンを「擦り取る」ことが必要であるからである。従って、最終的な組織化を制御することが困難である。このため、ｐＨの上昇による沈殿後、コラーゲンフィブリルはサイズが均一でない。更に、回収された濃縮コラーゲン溶液は、肉眼的に均一でなく（図１Ｂ参照）、従って、最終材料の機械的特性は全ての材料について一定でない。

【0015】

３）マイクロセル
方法−コラーゲンの初期酸溶液を実験室において生成されたガラスマイクロチャンバ中に注入し、漸次濃縮する。原理は、希釈コラーゲンをスライドとスリップカバーとの間に注入し、そのコラーゲンが空気との界面に対するマイクロチャンバの端部に向かって拡散することにより、溶液の蒸発により徐々に濃縮されるものである。マイクロチャンバの端部に向かって（空気／溶液界面に向かって）近ければ近いほど、コラーゲンがより濃縮される。コラーゲンの極めて顕著な濃度勾配（約５から１０００ｍｇ／ｍＬ）が、最終濃縮溶液中で形成する（Ｇ．Ｍｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．２００６）。

限界−従って、濃度が制御されない。この方法は、相図を研究するために有用であり、小容量（０．５ｍＬ未満）に好適である。しかしながら、空気／溶液界面における第１層は、実際には希釈層である。それというのも、コラーゲンは後続の層とは異なり、濃縮され、従って組織化される時間を有さないからである。従って、ｐＨの上昇による沈殿後、コラーゲンフィブリルはこの場合サイズが均一でない。

【0016】

４）圧縮
方法−この方法は、高密度マトリックスを得るための水和フィブリル状コラーゲンゲルの圧縮を提案する。フィブリル状ネットワークは等方性のままであるが、機械的特性は初期ゲルの機械的特性よりもかなり優れている。圧延シートの形態のそのようなマトリックス内に挿入された細胞の生存力が立証されている（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。

限界−本方法は超高速であり、コラーゲン濃度は１７０ｍｇ／ｍＬに到達し得る。しかしながら、ヒドロゲルは強力な剪断に付され、その利用に起因して、極端に脱水され、このことにより脆弱になり、移植されると感染しやすくなる。

【0017】

それらの従来の方法の限界は、濃度、フィブリル直径に関して肉眼的に均一であり、オーダーが制御されたコラーゲンマトリックスを得ることを可能とする方法を有することの組織エンジニアリング用途についての主な利益を実証する。

【0018】

ＩＩＩ−高密度均一コラーゲンマトリックスを得る新規方法
従って、本発明者らは、標準的なヒドロゲルよりも５から６０倍高い濃度または更に高い濃度において得られ、機械的特性を強化することを目的とする添加剤を含有しないが、炎症、毒性および拒絶現象を回避する、フィブリルおよび高密度フィルビルネットワークの形態の再構成された純粋コラーゲンのみを含有する高密度フィブリル状コラーゲンマトリックスを得ることを可能とする方法を開発した。得られたマトリックスは結合組織の細胞によりコロニー化させることができ、それらの機械的特性は生物組織のものと同様である。

【0019】

本発明の対象はまた、酸溶性コラーゲン溶液の濃縮から出発して均一なコラーゲンベースの材料を調製する方法であって：
ａ）コラーゲン溶液を制御圧力手段により連続注入することにより浸透性要素と接触させること（前記浸透性要素自体は濃縮剤、例えばポリマー溶液と接触している）、
ｂ）前記コラーゲン溶液、浸透性要素およびポリマー溶液を、コラーゲンの水溶液中に含有された溶媒の選択的物質移動を可能とする条件下で接触させて保持して均一コラーゲンのより濃縮された溶液の形成を前記浸透性要素内側で、または前記浸透性要素の表面上で得ること
を含む方法である。

【0020】

本発明によれば、一方ではコラーゲンの分子量未満、他方では外部ポリマーの分子量未満の分子量（ＭＷ）の細孔サイズを有する浸透性要素が選択される。コラーゲン溶液を浸透性要素によりポリマー溶液から分離して接触させて保持することにより、溶媒が内部コラーゲン溶液を外部ポリマー溶液に向かって拡散することが可能となる。このことにより、均一なコラーゲンのより濃縮された溶液の形成を、この溶媒の選択的移動により浸透性要素内側で、または浸透性要素の表面上で得ることが可能となる。本発明の有利な実施形態において、水性コラーゲン溶液中に含有された溶媒の選択的物質移動を可能とするため、ポリマー溶液の浸透圧はコラーゲン溶液の浸透圧よりも大きい。

【0021】

制御手段による連続注入は、このタイプの注入を可能とすることができる当業者に公知の任意の系、特に電気シリンジポンプまたはポンプにより実施することができる。注入速度は、膜の両面上の圧力が同一になるように適合させ；従って、流れは、当業者が膜の穿刺まで膜の収縮またはその膨張を回避する速度を見出すようにポリマーおよびその粘度に応じて適合させる。速度は、使用されるポリマーのタイプおよび膜の細孔よりも大きいその分子量に依存する。速度の適合は、当業者の一般的知識の範囲内である。３５ＫＤａの分子量のＰＥＧについての例として、１から１５μＬ／分の間の速度を使用することが可能であり、その速度は、１ｍｇ／ｍＬ溶液を２８ｍＬ注入した場合において１５日後に材料の形成を終結させることが可能である。注入を中断してより迅速に平衡に到達させ（すなわち、次いでコラーゲン濃度がモールド全体で均一になる場合）、従って濃度勾配をより迅速に低減させることができ、再開して制御濃度およびフレキシブルな組織化の多層系を発現させることができる。平衡を待たずに注入を中断することも可能であり、それにより連続濃度勾配を有することが可能となる。

【0022】

本発明の方法を履行するために使用することができるデバイスの例を図３に説明する。

【0023】

本発明の方法の有利な実施形態において、浸透性要素は透析セルであり、前記方法は、以下の段階：
ａ）純粋コラーゲンの水性溶媒中酸溶液を調製する段階、
ｂ）前記純粋コラーゲン溶液を制御圧力手段により透析セル中に連続注入する段階（前記透析セルの端部の少なくとも一方は、前記溶媒ならびに前記酸および任意の添加剤（例えば種々のタイプのコラーゲン、イオン、ミネラル相前駆体（カルシウム、リン酸塩等）、グリコサミノグリカンまたは有機分子）（存在する場合）のみが膜を拡散するように多孔度が固定された透析膜により密封されており、前記膜は、濃度が最終コラーゲン濃度に適合されたポリマー溶液と接触している）、
ｃ）前記コラーゲン溶液、透析セルおよびポリマーを、前記水性コラーゲン溶液中に含有された前記溶媒の選択的物質移動を可能とする条件下で保持して純粋で均一な濃縮コラーゲン溶液の形成を前記透析セル中で、または前記透析膜の表面上で得る段階、
ｄ）前記材料が含有されたモールドまたは表面上に前記均一な純粋コラーゲン材料が固定された膜を回収する段階
を含む。

【0024】

本発明の意味の範囲内で、純粋コラーゲン溶液は、材料の最終機械的特性を強化する目的のためだけに添加される化合物を含有しない溶液を意味し；その溶液は、特に架橋剤、例えばアルデヒドおよび合成強化ポリマー、例えばポリエステルまたは天然強化ポリマー、例えばキトサンを有さない。他方、目的分子等の添加剤、例えばその多孔度を改変することを可能とする薬剤またはコラーゲンの表面充填剤を材料に添加することができる。

【0025】

本発明において使用されるコラーゲンは、天然または組換え由来のものであり得る。そのコラーゲンは、特に、当業者に公知の技術に従って酸または酵素的経路により抽出された皮膚または腱に由来し得る。

【0026】

本発明の意味の範囲内で、端部の少なくとも一方が透析膜により密封された透析セルは、透析膜により全体的に構成されたモールドであってもよい。大量注入してモールドを充填する場合、コラーゲンマトリックスは端部に配置された膜上だけでなくモールドの表面全体にわたり生成される。従って、透析要素の形態は材料が完全に充填される場合に材料の最終形態を決定する。従って、生成物は、厚さおよび濃度に応じてフィルム、フレキシブルな膜、チューブの形態で配合することができ、またはその目的のために成形することができる。

【0027】

段階ａ）において使用されるコラーゲンの酸溶液は、当業者に公知の技術により、天然または組換えコラーゲンから調製する。水性溶媒、有利には１７から５００ｍＭの間である濃度における酢酸は、種々の添加剤、例えば無機塩等、他のタイプのコラーゲンまたはグリコサミノグリカン、例えば硫酸化ヘパリンを含有することができる。

【0028】

本発明の有利な実施形態において、段階ａ）において使用される初期溶液のコラーゲン濃度は、０．０１から５ｍｇ／ｍＬの間であり、有利には０．５から３ｍｇ／ｍＬの間である。

【0029】

本発明によれば、使用されるポリマーは、分子量が浸透性要素の細孔のサイズよりも大きい、酸媒体中の任意の水溶性ポリマーであり得る。そのポリマーは、特にＤｅｘｔｒａｎ（商標）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む群から選択される。有利には、ポリマーは、分子量がコラーゲンの分子量よりも大きい、従って３０００Ｄａよりも大きいポリエチレングリコールである。

【0030】

ポリマー溶液の濃度は場合に従って変動し得、その調整は当業者の能力の範囲内である。ポリマー溶液の容量が極めて大きい場合、コラーゲン溶液に由来する溶媒の容量は無視可能であり、ポリマー溶液を無視可能に希釈する。この場合、初期ポリマーの濃度は最終コラーゲン濃度に等しい。ポリマー溶液の容量が大きくなく、初期ポリマー濃度が最終コラーゲン濃度に等しい場合、ポリマー溶液は拡散を減速させないように定期的に交換する。ポリマー溶液の容量が大きくなく、初期ポリマー濃度が最終コラーゲン濃度よりも大きい場合、初期ポリマー濃度は、コラーゲン溶液に由来する溶媒の容量による希釈後にそれが所望の最終コラーゲン濃度に等しくなるように計算する。

【0031】

ＩＶ−濃縮溶液のフィブリル生成
本発明によれば、段階ｄ）の前または後に、本方法は純粋コラーゲン材料中でのフィブリルの形成の段階を更に含むことができる。それらのフィブリルの形成により、生物組織のコラーゲンのフィブリル状構造を模倣することが可能となる。

【0032】

フィブリルの形成は、当業者に公知の任意の技術により、特に気相（塩基性）または液相（塩基性または中性）による均一な純粋コラーゲンをベースとする溶液の中和により実施する。この中和は、ポリマーを、フィブリル状コラーゲンの「ワンポット」調製を可能とする気相または液相により置き換えることにより、またはコラーゲン材料を気相または液相中で浸漬することにより現場で行うことができる。

【0033】

本発明の方法は、注入を中断することにより多層生成物を生成させるために履行することもできる。注入を中断してより迅速に平衡に到達させ、再開して種々の非連続濃度層を作製することができる。注入を停止させ、平衡を待たずに種々の連続濃度層を有することも可能である。

【0034】

本発明の対象はまた、上記定義の方法により得ることができる純粋コラーゲンをベースとする均一材料である。

【0035】

本発明により得られた生成物は、裂けることなく容易に取り扱うことができ、更に架橋することなく縫合することができる。本生成物は均一であり、濃度の変動を有さない。

【0036】

本組成物は移植部位においていかなる炎症反応も誘起せず、組織中に取り込まれる。

【0037】

本発明によれば、濃度が約５から約１０００ｍｇ／ｍＬ、特に５、１０、２０、３０、４０および２５０ｍｇ／ｍＬである材料が得られる。５ｍｇ／ｍＬの濃度について、弾性モジュラスは約９７４±２３９Ｐａであり、粘性モジュラスは約１４５±４０Ｐａである。１０ｍｇ／ｍＬの濃度について、弾性モジュラスは約１２８７±１５８Ｐａであり、粘性モジュラスは約１２４±１２Ｐａである。２０ｍｇ／ｍＬの濃度について、弾性モジュラスは約２８０９±３３６Ｐａであり、粘性モジュラスは約２６３±４８Ｐａである。４０ｍｇ／ｍＬの濃度について、弾性モジュラスは約９２５４±１０３２Ｐａであり、粘性モジュラスは約７８６±４６Ｐａである。弾性および粘性モジュラス値は、１Ｈｚおよび２％歪において計測する。

【0038】

従って、本発明による材料のコラーゲン濃度および厚さに応じて、材料を組織代替物、特にプロテーゼ生成用の壁部強化材として、軟組織代替物としてまたは充填材料として使用することができる。

【0039】

従って、本発明の対象はまた、本発明による材料を含むことを特徴とする移植用医療デバイスである。

【0040】

本発明は、それを説明する実施例１から３および図１から１２を踏まえてより良好に理解される。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】Ａ：５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度における酸溶性コラーゲン溶液、Ｂ：透析後の濃縮コラーゲン溶液、Ｃ：本発明の方法による濃縮コラーゲン溶液、を示す図である。

【図2】肉眼的に不均一である透析により得られたコラーゲン（酸溶性）（最終濃度約２００ｍｇ／ｍＬ）を示す図である（図２Ａ）。中和後、走査型電子顕微鏡により観察された繊維のサイズは不均一である（図２Ｂ〜２Ｄ）。初期酸溶性コラーゲン濃度は約３ｍｇ／ｍＬである。

【図3】本発明により使用されるデバイスの例を示す図である。第１の場合においては、透析セルの全容量を充填し、均一に濃縮し、第２の場合においては、セル中に存在する全ての溶液が均一に濃縮されるように注入を時間Ｔにわたり停止させる。

【図4】肉眼的に均一である本発明の技術により得られたコラーゲン（酸溶性）（最終濃度約２５０ｍｇ／ｍＬ）を示す図である（図４Ａ）。中和後、走査型電子顕微鏡により観察された繊維のサイズは均一であり（図４Ｂ〜４Ｄ）、大規模な構造の均一性を有して組織化されている（コレステリック形状）（図Ｂ）。初期酸溶性コラーゲン濃度は約１ｍｇ／ｍＬである。

【図5】３００ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（dense matrices）の、筋肉内移植（Ａ）および皮下移植（Ｂ）を説明する図である。

【図6】筋肉内移植１５日後の、２０ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ２０ 図６Ａ）および４０ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ４０ 図６Ｂ）の、肉眼による外観を説明する図である。

【図7】３００ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ３００）の移植１５日後および３０日後の肉眼による外観を示す図である。

【図8】皮下移植１５日後の、２０ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ２０ 図８Ａ）および４０ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ４０ 図８Ｂ）の、顕微鏡による外観を示す図である。

【図9】３００ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ３００）の皮下移植１５日後の４倍の倍率における顕微鏡による外観を示す図である。矢印は、ゲル内側で遊走／コロニー化する細胞を表す。

【図10】３００ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ３００）の皮下移植１５日後の１０倍の倍率における顕微鏡による外観を示す図である。矢印は、ゲル内側で遊走する細胞を表す。

【図11】３００ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ３００）の筋肉内移植１５日後の４倍の倍率における顕微鏡による外観を示す図である。矢印は、ゲル内側で遊走する細胞を表す。

【図12】３００ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ３００）の筋肉内移植１５日後の１０倍の倍率における顕微鏡による外観を示す図である。矢印は、ゲル内側で遊走する細胞を表す。

【0042】

《実施例１：本発明による材料の調製および特性決定》
１．１．初期コラーゲン溶液の調製
タイプＩコラーゲンを以下の手順に従って若年Ｗｉｓｔａｒラットの尾部から調製する。ラット尾腱を無菌層流フード中で切除し、次いで１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、８．０７ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、および１．４７ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液中で洗浄して細胞および微量の血液を除去する。次いで腱を４Ｍ ＮａＣｌ溶液中で浸して残存するインタクトな細胞を除去し、高分子量を有するタンパク質の一部を沈殿させる。緩衝生理食塩水溶液により新たに洗浄した後、腱を５００ｍＭ水性酢酸溶液中で溶解させる。そうして得られた溶液を４１０００ｇにおいて２時間遠心分離により清澄化する。タイプＩコラーゲン以外のタンパク質を３００ｍＭ水性ＮａＣｌ溶液中で選択的に沈殿させ、次いで４１０００ｇにおいて３時間遠心分離により除去する。コラーゲンを６００ｍＭ水性ＮａＣｌ溶液中で沈殿させることにより上澄みから回収し、次いで３０００ｇにおいて４５分間遠心分離する。そうして得られたペレットを５００ｍＭ水性酢酸溶液中で溶解させ、次いで同一溶媒中で慎重に透析してＮａＣｌを完全に除去する。溶液を４℃において保持し、使用前に４１０００ｇにおいて４時間遠心分離する。

【0043】

１．２．均一材料の調製
３．２ｍｇ／ｍＬの濃度における１８ｍＬのコラーゲン溶液を、図１に記載の電気シリンジポンプを備える透析要素中に導入する。注入速度は２μＬ／分において固定する。透析は、５００ｍＭ水性酢酸溶液中で溶解させた３５ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコールの１５０ｍＬの５００ｍｇ／ｍＬ溶液の存在下で１９℃において実施する。注入時間は８日間であり、次いで４日間停止させて平衡に到達させる。ヒドロキシプロリンの量の測定によりフィブリル生成前に測定された酸溶液のコラーゲン濃度は、約２５０ｍｇ／ｍＬである。

【0044】

フィブリル生成は、コラーゲン材料をアンモニア蒸気下で２４時間浸漬することにより実施する。

【0045】

１．３．得られた材料の均一性の計測
走査型電子顕微鏡を使用し、酸溶性コラーゲンの初期濃度約１ｍｇ／ｍＬを有する溶液から得られた材料の試料（図３）、または標準的逆透析技術もしくは初期酸溶性コラーゲン濃度約３ｍｇ／ｍＬを有する本発明の方法による材料の試料（図２）を観察する。

【0046】

透析により得られたコラーゲン（酸溶性）は肉眼的に不均一であり（図２Ａ）、繊維のサイズは不均一である（図２Ｂから２Ｄ）。他方、本発明による方法により得られたフィブリル化コラーゲンは、肉眼的に均一であり（図４Ａ）、繊維のサイズも均一である（図４Ｂから４Ｄ）。

【0047】

《実施例２：移植試験》
２．１．手順
２．１．１．高密度マトリックスの移植
使用する全ての手順は、ＩＮＳＥＲＭ動物実験規則および倫理委員会（Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．００６２３５，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）に従う。

【0048】

体重２５０ｇのＷｉｓｔａｒラット（Ｗｉ／Ｗｉ，Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒｓ Ｆｒａｎｃｅ）に、ペントバルビタールナトリウム溶液（３０ｍｇ／ｋｇ，Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ Ｆｒａｎｃｅ）を使用して麻酔をかける。腹部を剃り、消毒し、正中線開腹を実施する。２つのポケットを正中線の両側に作出し：一方を皮下、他方は筋肉内に作出する。次いで、４０から３００ｍｇ／ｍＬで変動する濃度の高密度コラーゲンマトリックスを移植する。筋肉内のポケットを再度閉じ、次いで皮膚中のポケットを再度閉じる（Ｖｉｃｒｙｌ（商標）４／０）。図５参照。移植１５、３０または６０日後、過剰のペントバルビタールナトリウムを使用してラットを安楽死させ、ＤＭを外植し、４％パラホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ Ｆｒａｎｃｅ）中で固定する。次いで試料をパラフィン中に包埋する。

【0049】

マトリックスは、裂けることなく容易に取り扱うことができる。

【0050】

２．１．２．組織学的分析
次いで、一連の７μｍ切片を作出し、ヘマトキシリン−エオシンまたはＭａｓｓｏｎトリクロームにより染色する。切片の観察（Ｎｉｋｏｎ Ｅ６００ ＰＯＬ顕微鏡）および分析後、写真を撮影する（ＣＣＤカメラ、Ｎｉｋｏｎ）。

【0051】

免疫組織学的実験をそれらの切片に対して実施し、種々の組織リモデリング要素が実証された（マクロファージ、炎症制御、内皮細胞、新血管形成または血管新生）。

【0052】

２．２．結果
結果を図６から１２に挙げる。

【0053】

高密度マトリックスの移植は、２０および４０ｍｇ／ｍＬにおけるマトリックスの移植の１５日後に異物に対して重度の反応をもたらさない（図６Ａおよび６Ｂ）。

【0054】

３００ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックスの皮下移植１５および３０日後、試料のサイズは変動しなかった。筋肉内移植３０日後、試料の容積は全体的に同様である。差異を可視化するためには移植から６０日間待つ必要がある（図示せず）。３００ｍｇ／ｍＬにおけるマトリックスの移植の部位における炎症反応の不存在も留意される（図７）。

【0055】

インビボでの細胞による移植物のコロニー化の速度は、コラーゲン濃度に依存する。濃度が高ければ高いほど、速度が遅くなる。マトリックスが厚ければ厚いほど、材料内でのコロニー化がより時間を要する。

【0056】

移植１５日後、２０ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ２０）は繊維芽細胞によりコロニー化される（図８Ａ）。４０ｍｇ／ｍＬにおける高密度マトリックス（ＤＭ４０）については、外部端部のレベルにおいて、いくつかの対面する細胞が観察され、ゲル内側で遊走し始める（図８Ｂ）。

【0057】

皮下的に、および一般に３００ｍｇ／ｍＬ（ＤＭ３００）の濃度については、細胞コロニー化が筋膜に向かうよりも皮膚表面に向かって生じる。ＤＭ３００は微細カプセルにより包囲される。外部端部においていくつかの対面する細胞が観察され、ゲル内側で遊走し始める（図９および１０）。

【0058】

皮下および筋肉内移植後の結果間のずれは、正常である。筋肉内瘢痕形成は、局所血管新生に起因してより急速である（図１１および１２）。

【0059】

従って、選択された高密度マトリックスのタイプおよび移植部位に応じて用途を極端に変えることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】