特許 5981428 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）発現の調整

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5981428

(24)【登録日】2016年8月5日

(45)【発行日】2016年8月31日

(54)【発明の名称】筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）発現の調整

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160818BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20160818BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160818BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20160818BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20160818BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N15/00 G

   A61K45/00

   A61P21/00

   A61K31/7088

【請求項の数】21

【全頁数】130

(21)【出願番号】特願2013-520815(P2013-520815)

(86)(22)【出願日】2011年7月19日

(65)【公表番号】特表2013-538560(P2013-538560A)

(43)【公表日】2013年10月17日

(86)【国際出願番号】US2011044555

(87)【国際公開番号】WO2012012443

(87)【国際公開日】20120126

【審査請求日】2014年7月14日

(31)【優先権主張番号】61/365,762

(32)【優先日】2010年7月19日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/478,021

(32)【優先日】2011年4月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/365,775

(32)【優先日】2010年7月19日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】595104323

【氏名又は名称】アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．

(73)【特許権者】

【識別番号】594072971

【氏名又は名称】ユニバ−シティ オブ ロチェスタ−

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100117813

【弁理士】

【氏名又は名称】深澤 憲広

(72)【発明者】

【氏名】シー・フランク・ベネット

(72)【発明者】

【氏名】スーザン・エム・フレアー

(72)【発明者】

【氏名】ロバート・エイ・マクロード

(72)【発明者】

【氏名】サンジェイ・ケイ・パンディ

(72)【発明者】

【氏名】チャールズ・エイ・ソーントン

(72)【発明者】

【氏名】サーマン・ウィーラー

(72)【発明者】

【氏名】スオン・エイチ・チュヨン

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー・レガー

(72)【発明者】

【氏名】ブルース・エム・ウェントワース

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０９３７８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５０００２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００１６２１５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 RNA & Oligonucleotide therapeutics, 2010 April, p.35

【文献】 Science, 2009, vol.325, no.5938, p.336-339

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

18〜30連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、そして配列番号85、109、12-18、20-55、57、59、60、63-65、72-84、89、91-95、97、98、102、104、106-108、110-114、118、120-124、127-133、135-138、140-143、145-149、152-156、161、162、166-199、202-207、211-225、227-229、240-263、265-268、271、272、275-285、294、296-300、302-315、317-366、368、370、372-376、378-467、469-486、488-491、499、501-512、518-520、527、530-533、535、538-541、544-546、551-555、557-565、568-628、630-642、644-648、654-663、665、670-673、675、676、679、681-688および691のいずれか１つで挙げられる配列の少なくとも18個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する化合物。

【請求項2】

以下の核酸塩基配列：
配列番号：85、109、12-18、20-55、57、59、60、63-65、72-84、89、91-95、97、98、102、104、106-108、110-114、118、120-124、127-133、135-138、140-143、145-149、152-156、161、162、166-199、202-207、211-225、227-229、240-263、265-268、271、272、275-285、294、296-300、302-315、317-366、368、370、372-376、378-467、469-486、488-491、499、501-512、518-520、527、530-533、535、538-541、544-546、551-555、557-565、568-628、630-642、644-648、654-663、665、670-673、675、676、679、681-688または691で挙げられる核酸塩基配列
を含むか、またはからなる、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項4】

前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号1〜8または793〜801と100％相補的である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。

【請求項5】

少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。

【請求項6】

各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。

【請求項8】

少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である、請求項７に記載の化合物。

【請求項9】

少なくとも１つの修飾糖が2'-O-メトキシエチルを含む、請求項８に記載の化合物。

【請求項10】

少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。

【請求項11】

前記修飾核酸塩基が5-メチルシトシンである、請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

前記修飾オリゴヌクレオチドが、以下の：
連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメント
を含む請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物であって、
前記ギャップセグメントが5'ウィングセグメントおよび3'ウィングセグメント間に配置され、そして各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、前記化合物。

【請求項13】

化合物の核酸塩基配列が配列番号85からなる、請求項１２に記載の化合物。

【請求項14】

前記修飾オリゴヌクレオチドが20連結ヌクレオシドからなり、そして以下の：
10の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
5つの連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
5つの連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメント
を含む請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物であって、
前記ギャップセグメントが5'ウィングセグメントおよび3'ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが2'-O-メトキシエチル糖を含み、そして各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、前記化合物。

【請求項15】

前記修飾オリゴヌクレオチドが20連結ヌクレオシドからなる、請求項１〜１４のいずれかに記載の化合物。

【請求項16】

化合物の核酸塩基配列が配列番号：109からなる、請求項１４または１５に記載の化合物。

【請求項17】

請求項１〜１６のいずれかに記載の化合物またはその塩、および医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物。

【請求項18】

動物体内におけるDMPK関連疾患またはその症候を、治療し、予防し、または改善する方法において使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の化合物または請求項１７に記載の組成物であって、前記動物に対して治療的有効量のこの化合物またはこの組成物を投与することを含む、前記組成物。

【請求項19】

DMPK関連疾患またはその症候が：
（a）筋緊張症、または
（b）スプライセオパシー、
である、請求項１８に記載の化合物または組成物。

【請求項20】

DMPK関連疾患またはその症候が1型筋緊張性ジストロフィーである、請求項１９に記載の化合物または組成物。

【請求項21】

DMPK関連疾患またはその症候がＭＢＮＬ依存性スプライセオパシーである、請求項１９に記載の化合物または組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表）
本出願は、電子フォーマットで配列表とともに出願されたものである。配列表は、表題ＢＩＯＬ０１３４ＵＳＬ２ＳＥＱ．ｔｘｔ（２０１１年７月１９日作成）のファイルとして提供されており、サイズは約２１６Ｍｂである。配列表の電子フォーマットでの情報は、参照により本明細書中で援用される。

【0002】

動物におけるＤＭＰＫ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低減するための方法、化合物および組成物が、本明細書中で提供される。動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減し、筋緊張症を低減し、またはスプライセオパシーを低減するための方法、化合物、およびＤＭＰＫ阻害剤を含む組成物も、本明細書中で提供される。このような方法、化合物および組成物は、例えば、動物における１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）を処置し、防止し、または改善するために有用である。

【背景技術】

【0003】

１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）は、７，５００分の１の概算頻度の成人における最も一般的な型の筋ジストロフィーである（Harper PS., Myotonic Dystrophy. London: W.B. Saunders Company; 2001）。ＤＭ１は、ＤＭＰＫ１における非コードＣＴＧ反復の伸長により引き起こされる常染色体優性障害である。ＤＭＰＫ１は、サイトゾル型セリン／トレオニンキナーゼをコードする遺伝子である（Brook JD, et al., Cell, 1992, 68(4):799-808）。このキナーゼの生理学的機能および基質は、十分に確定されているわけではない。伸長ＣＴＧ反復は、ＤＭＰＫ１の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中に配置される。この突然変異は、伸長ＣＵＧ反復（ＣＵＧｅｘｐ）を含有するＲＮＡの発現が細胞機能不全を誘導する過程であるＲＮＡ優性をもたらす（Osborne RJ and Thornton CA., Human Molecular Genetics., 2006, 75(2): R162-R169）。

【0004】

ＤＭＰＫ遺伝子は、常態では、３’非翻訳領域中に５〜３７のＣＴＧ反復を有する。Ｉ型筋緊張性ジストロフィーでは、この数は有意に増して、例えば、５０から３，５００超までの範囲である（Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, London, ed.3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol.20: 572, 2007）。

【0005】

ＣＵＧｅｘｐ路は、ＲＮＡ結合タンパク質、例えばmuscleblind様（ＭＢＮＬ）タンパク質（スプライシング因子）と相互作用し、変異転写産物を核内フォーカス中に保持させる。このＲＮＡの毒性は、ＲＮＡ結合タンパク質の隔離およびシグナル伝達経路の活性化に由来する。動物モデルにおける研究は、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの毒性が低減されると、ＤＭ１の表現型が逆転され得る、ということを示している（Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325(5938):336-339; Mulders SA, et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2009, 106(33):13915-1392O）。

【0006】

ＤＭ１では、骨格筋は最も重篤に影響を受ける組織であるが、しかしその疾患は、心筋および平滑筋、水晶体および脳に及ぼす重大な作用も有する。頭蓋筋、遠位肢筋および横隔膜筋は、優先的に影響を及ぼされる。手先の動作は早期に損なわれ、これが、長期間の重篤な能力障害を引き起こす。死亡年齢の中央値は５５歳で、通常は呼吸不全による（de Die-Smulders CE, et al., Brain., 1998, 72i(Pt 8): 1557-1563）。

【0007】

アンチセンス技術は、ある種の遺伝子産物の発現を調整するための有効な手段として明らかになりつつあり、したがって、ＤＭＰＫ１の調整のための多数の治療的、診断的および研究用途において比類なく有用であることを立証し得る。ＣＡＧ反復で標的にする完全修飾オリゴヌクレオチドの筋肉内注射は、マウスにおいて、ＣＵＧｅｘｐ−ＭＢＮＬ１複合体の形成を遮断し、ＣＵＧｅｘｐ転写物の核内フォーカスを分散させ、ＣＵＧｅｘｐ転写物の核細胞質間輸送および翻訳を増強し、ＭＢＮＬタンパク質を核質に放出し、ＭＢＮＬ依存性エキソンの選択的スプライシングを正常化し、そしてＣＵＧｅｘｐ発現トランスジェニックマウスにおける筋緊張症を排除することが示された（Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325(5938):336-339; WO2008/036406）。

【0008】

現在、ＤＭ１の経過を変更し得る処置はない。したがって、疾患の負担は著しい。したがって、ＤＭ１を処置するための化合物、組成物および方法を提供することが、本明細書における目的である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

ＤＭＰＫの発現を抑制するための、そしてＤＭＰＫ関連疾患および／またはその症候を処置し、防止し、遅延し、または改善するための方法、化合物および組成物が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、当該化合物および組成物は、突然変異体ＤＭＰＫまたはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫを抑制する。

【0010】

ある実施形態は、動物におけるＤＭＰＫ発現の低減方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化される本明細書中にさらに記載されるような修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを包含する方法を提供する。

【0011】

ある実施形態は、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫを優先的に低減し、筋緊張症を低減し、またはスプライセオパシーを低減する方法であって、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫに対して標的化される、本明細書中でさらに記載されるような、修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを包含する方法を提供する。ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ転写物は、核内リボヌクレアーゼによるアンチセンス・ノックダウンに特に感受性であると考えられるが、それは、それらの核内での長い滞留時間のためであり、この感受性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの組織取込みに対する体内分布バリアにもかかわらず、筋肉のような関連組織中でのＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ転写物の有効なアンチセンス抑制を可能にすると思われる。例えば、Wheeler TM, et al., Science., 2009, 325(5938):336-339 およびＷＯ２００８／０３６４０６に記載されるようなＣＡＧ反復ＡＳＯのような、核内リボヌクレアーゼによる切断を引き出さないアンチセンス機序は、同一の治療的利点を提供しない。

【0012】

ある実施形態は、１型筋ジストロフィーを有する動物の処置方法を提供する。ある実施形態では、当該方法は、ＤＭＰＫに対して標的化される、本明細書中でさらに記載されるような、修飾オリゴヌクレオチドを含む治療的有効量の化合物を動物に投与することを包含する。ある実施形態では、当該方法は、１型筋緊張性ジストロフィーを有する動物を同定することを包含する。

【0013】

ある実施形態は、ＤＭ１の発症に関連した症候および結果、例えば筋肉強直、筋緊張症、障害性遠位性衰弱、顔面および顎筋肉の衰弱、嚥下困難、眼瞼の垂れ下がり（眼瞼下垂）、首の筋肉の衰弱、腕および足の筋肉の衰弱、持続性筋肉痛、過眠症、筋消耗、嚥下障害、呼吸不全、不規則心拍、心筋損傷、無感動、インスリン抵抗性および白内障を、処置し、防止し、遅延し、または改善する方法を提供する。ある実施形態は、小児におけるＤＭ１の発症に関連した症候および結果、例えば発達遅延、学習問題、言語および発語問題、ならびに人格発達問題を処置し、防止し、遅延し、または改善する方法を提供する。

【0014】

ある実施形態は、病原性転写産物の切断を指示することにより、ＲＮＡ優性を相殺するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する方法を提供する。

【0015】

ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＭ＿００１０８１５６０．１で記述されるような配列を有する（配列番号１として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫはGenBank寄託番号ＮＴ＿０１１１０９．１５（ヌクレオチド１８５４０６９６から１８５５５１０６まで切頭化）で記述されるような配列を有する（配列番号２として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＴ＿０３９４１３．７（ヌクレオチド１６６６６００１から１６６８１０００まで切頭化）で記述されるような配列を有する（配列番号３として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫはGenBank寄託番号ＮＭ ０３２４１８．１で記述されるような配列を有する（配列番号４として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＡＩ００７１４８．１で記述されるような配列を有する（配列番号５として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＡＩ３０４０３３．１で記述されるような配列を有する（配列番号６として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＣ０２４１５０．１で記述されるような配列を有する（配列番号７として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＣ０５６６１５．１で記述されるような配列を有する（配列番号８として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＣ０７５７１５．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９３として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＵ５１９２４５．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９４として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＣＢ２４７９０９．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９５として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＣＸ２０８９０６．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９６として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＣＸ７３２０２２．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９７として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号Ｓ６０３１５．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９８として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号Ｓ６０３１６．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９９として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＭ ００１０８１５６２．１で記述されるような配列を有する（配列番号８００として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＭ＿００１１００．３で記述されるような配列を有する（配列番号８０１として本明細書中に組入れられる）。

【発明を実施するための形態】

【0016】

前記の一般的説明および以下の詳細な説明はともに、例示的且つ解説的であるに過ぎず、特許請求されるように、本発明を制限するものではない、と理解されるべきである。本明細書において、単数形の使用は、具体的に別記しない限り、複数を包含する。本明細書中では、「または」の使用は、別記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「〜を包含している」、ならびに他の形態、例えば「〜を包含する」および「〜を包含した」という用語の使用は、限定的なものではない。さらにまた、「要素」または「構成成分」のような用語は、具体的に別記しない限り、１つの単位を含む要素および構成成分、ならびに１つより多い亜単位を含む要素および構成成分の両方を包含する。

【0017】

本明細書中で用いられる節の表題は、構成目的だけのためであり、記載される対象物を限定するよう意図されない。本出願中で引用されるすべての文書または文書の部分、例えば特許、特許出願、記事、書物および論文（これらに限定されない）は、本明細書中で考察される文書の部分に関して、ならびにそれらの全体において、参照により本明細書中で援用される。

【0018】

定義
具体的な定義が提供されない限り、本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬学化学と結び付けて用いられる用語法、そしてその手順および技法は、当該技術分野で周知のものであり、一般に用いられる。標準技法は、化学合成および化学分析のために用いられ得る。許される場合、全ての特許、出願、公開出願およびその他の出版物、GenBank寄託番号、ならびに国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のようなデータベースおよび本明細書中の開示の全体を通して言及される他のデータにより得られる関連配列情報は、本明細書中で考察される文書の一部に関して、ならびにそれらの全体で、参照により本明細書中で援用される。

【0019】

別記しない限り、以下の用語は以下の意味を有する：

【0020】

「２’−０−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３とも呼ばれる）は、フラノシル環の２’位置のＯ−メトキシエチル修飾を指す。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は、修飾糖である。

【0021】

「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドを意味する。

【0022】

「５−メチルシトシン」は、位置５に結合されるメチル基で修飾されるシトシンを意味する。５−メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。

【0023】

「約」は、ある値の±７％以内を意味する。例えば、「化合物が、ＤＭＰＫの少なくとも７０％に影響を及ぼす」と記述される場合、それは、そのＤＭＰＫレベルが６３％および７７％の範囲内で抑制されることを意味する。

【0024】

「活性な薬学的作用物質」は、個体に投与された場合に治療効果を提供する薬学的組成物中の単数または複数の物質を意味する。例えば、ある実施形態では、ＤＭＰＫに対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性な薬学的作用物質である。

【0025】

「活性標的領域」または「標的領域」は、１つ以上の活性アンチセンス化合物が標的化される領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを低減するアンチセンス化合物を意味する。

【0026】

「同時に投与される」は、２つの作用物質の薬理学的作用が同時に患者において現れる任意の方法での両方の同時投与を指す。同時投与は、両作用物質が単一薬学的組成物中で、同一剤形中で、または同一投与経路により投与される必要はない。両作用物質の作用は、同時にそれ自体を発現する必要はない。その作用は、ある期間中に重複する必要があるだけで、同一の時間の広がりを持つ必要はない。

【0027】

「投与すること」は、動物に作用物質を提供することを意味し、例としては、医療専門家による投与および自己投与が挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

「作用物質」は、動物に投与された場合に、治療効果を提供し得る活性物質を意味する。「第一作用物質」は、本発明の治療用化合物を意味する。例えば、第一作用物質は、ＤＭＰＫを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。「第二作用物質」は、本発明の第二治療用化合物（例えば、ＤＭＰＫを標的化する第二アンチセンスオリゴヌクレオチド）および／または非ＤＭＰＫ治療用化合物を意味する。

【0029】

「改善」は、関連疾患、障害または症状の少なくとも１つの指標、徴候または症候の減少を指す。指標の重症度は、当業者に既知である主観的または客観的測定により確定され得る。

【0030】

「動物」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ（これらに限定されない）、ならびに非ヒト霊長類、例えばサルおよびチンパンジー（これらに限定されない）を指す。

【0031】

「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物とその標的核酸とのハイブリダイゼーションに起因し得る任意の検出可能なまたは測定可能な活性を意味する。ある実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸またはこのような標的核酸によりコードされるタンパク質の量または発現の低減である。

【0032】

「アンチセンス化合物」は、水素結合により標的核酸とのハイブリダイゼーションを受け得るオリゴマー化合物を意味する。アンチセンス化合物の例としては、一本鎖および二本鎖化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびサテライト反復配列が挙げられる。

【0033】

「アンチセンス抑制」は、アンチセンス化合物の非存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較して、標的核酸と相補的なアンチセンス化合物の存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの低減を意味する。

【0034】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントとのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。

【0035】

「二環式糖」は、２つの非ジェミナル炭素環原子の架橋により修飾されるフラノシル環を意味する。二環式糖は、修飾糖である。

【0036】

「二環式核酸」または「ＢＮＡ」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分が、フラノース環上の２つの炭素原子を連結し、それにより二環式環系を形成する架橋を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す。

【0037】

「キャップ構造」または「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組入れられている化学修飾を意味する。

【0038】

「化学的に別個の領域」は、同一アンチセンス化合物の別の領域と、何らかの点で、化学的に異なるアンチセンス化合物の領域を指す。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を伴わないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。

【0039】

「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に別個の領域を有するアンチセンス化合物を意味する。

【0040】

「同時投与」は、個体への２つ以上の作用物質の投与を意味する。２つ以上の作用物質は、単一薬学的組成物中であるか、または別個の薬学的組成物中であり得る。２つ以上の作用物質の各々は、同一投与経路または異なる投与経路により投与され得る。同時投与は、平行的または逐次的投与を包含する。

【0041】

「相補性」は、第一核酸および第二核酸の核酸塩基間の対合のための可能性を意味する。

【0042】

「連続核酸塩基」は、互いに直に隣接する核酸塩基を意味する。

【0043】

「ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ」は、伸長ＣＵＧ反復配列（ＣＵＧｅｘｐ）を含有する突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡを意味する。野生型ＤＭＰＫ遺伝子は、５〜３７個のＣＴＧ反復配列を３’非翻訳領域に有する。「ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ」において（例えば、１型筋緊張性ジストロフィー患者では）、この数は有意に増して、例えば５０〜３，５００超の範囲である（Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, London, ed.3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol.20: 572, 2007）。

【0044】

「希釈剤」は、薬理学的活性を欠くが、しかし薬学的に必要なまたは望ましい組成物中の成分を意味する。例えば、注射される組成物中の希釈剤は、液体、例えば生理学的食塩溶液であり得る。

【0045】

「ＤＭＰＫ」は、ＤＭＰＫの任意の核酸またはタンパク質を意味する。ＤＭＰＫは、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ核酸を含めた突然変異体ＤＭＰＫであり得る。

【0046】

「ＤＭＰＫ発現」は、ＤＭＰＫをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベル、またはそのｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質のレベルを意味する。ＤＭＰＫ発現は、当該技術分野で既知の方法、例えばノーザンまたはウエスタンブロットにより確定され得る。

【0047】

「ＤＭＰＫ核酸」は、ＤＭＰＫをコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸は、ＤＭＰＫをコードするＤＮＡ配列、ＤＭＰＫをコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ配列（例えば、イントロンおよびエキソンを含むゲノムＤＮＡ）、ならびにＤＭＰＫをコードするｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ配列を包含する。「ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ」は、ＤＭＰＫタンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。

【0048】

「用量」は、単一投与において、または指定時間で提供される薬学的作用物質の指定量を意味する。ある実施形態では、用量は、１、２または多数回の、ボーラス、錠剤または注射で投与され得る。例えば、皮下投与が所望されるある実施形態では、所望用量は、単一回注射によっては容易に適応されない用量を要し、したがって、所望用量を達成するためには２回以上の注射が用いられ得る。ある実施形態では、薬学的作用物質は、長期間に亘って、または継続的に、注入により投与される。用量は、時間、日、週または月当たりの薬学的作用物質の量として記述され得る。

【0049】

「有効量」または「治療的有効量」は、当該作用物質を必要とする個体における所望の生理学的結果をもたらすのに十分な活性薬学的作用物質の量を意味する。有効量は、処置されるべき個体の健康および身体条件、処置されるべき個体の分類群、組成物の処方、個体の医学的状態の査定、ならびに他の関連要素によって、個体間で変わり得る。

【0050】

「完全相補性」または「１００％相補性」は、第一核酸の核酸塩基配列の各核酸塩基が、第二核酸の第二核酸塩基配列中に相補的核酸塩基を有することを意味する。ある実施形態では、第一核酸はアンチセンス化合物であり、標的核酸が第二核酸である。

【0051】

「ギャップマー」は、ＲＮアーゼＨ切断を支持する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、１つ以上のヌクレオシドを有する外部領域間に配置されるキメラアンチセンス化合物を意味するが、この場合、内部領域を含むヌクレオシドは外部領域を含む単数または複数のヌクレオシドとは化学的に異なる。内部領域は「ギャップセグメント」として言及され、外部領域は「ウィングセグメント」として言及され得る。

【0052】

「ギャップ拡大」は、１〜６つのヌクレオシドを有する、５’および３’ウィングセグメント間に且つ直に隣接して配置される１２以上の連続２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物を意味する。

【0053】

「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。ある実施形態では、相補的核酸分子としては、アンチセンス化合物および標的核酸が挙げられる。

【0054】

「１型筋緊張性ジストロフィーを有する動物を同定すること」は、１型筋緊張性ジストロフィー、障害もしくは症状を有すると診断された動物を同定すること、または１型筋緊張性ジストロフィー、障害もしくは症状を発症する素因を有する動物を同定することを意味する。例えば、家族歴を有する個体は、１型筋緊張性ジストロフィー、障害または症状に罹り易い。このような同定は、個体の医療歴および標準臨床試験または査定を評価することを含めた任意の方法により成し遂げられ得る。

【0055】

「直に隣接する」は、直隣接素子間に介入素子が存在しないことを意味する。

【0056】

「個体」は、処置または治療のために選択されるヒトまたは非ヒト動物を意味する。

【0057】

「ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシド間のキメラ結合を指す。

【0058】

「連結ヌクレオシド」は、ヌクレオシド間結合により一緒に結合されるかまたは連結される隣接ヌクレオシドを意味する。

【0059】

「不適正核酸塩基」または「非相補的核酸塩基」は、第一核酸の核酸塩基が、第二または標的核酸の対応する核酸塩基と対合しえない場合を指す。

【0060】

「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然ヌクレオシド間結合からの置換または任意の変化（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）を指す。

【0061】

「修飾核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。「非修飾核酸塩基」は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミジン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。

【0062】

「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」は、修飾糖部分または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。

【0063】

「修飾オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。

【0064】

「修飾糖」は、天然糖からの置換または変化を指す。

【0065】

「モチーフ」は、アンチセンス化合物中の化学的に別個の領域のパターンを意味する。

【0066】

「筋緊張症」は、随意収縮または電気刺激後の筋肉の異常に遅い弛緩を意味する。

【0067】

「核内リボヌクレアーゼ」は、核中に見出されるリボヌクレアーゼを意味する。核内リボヌクレアーゼとしては、ＲＮアーゼ Ｈ、例えばＲＮアーゼ Ｈ１およびＲＮアーゼ Ｈ２、二本鎖ＲＮアーゼ ｄｒｏｓｈａおよびその他の二本鎖ＲＮアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

「天然ヌクレオシド間結合」は、３’−５’ホスホジエステル結合を意味する。

【0069】

「天然糖部分」は、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）中に見出される糖を意味する。

【0070】

「核酸」は、単量体ヌクレオチドで構成される分子を指す。核酸としては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。核酸は、単一分子中にこれらの素子の組合せも含み得る。「核酸塩基」は、別の核酸の塩基と対合し得る複素環式部分を意味する。

【0071】

「核酸塩基」は、別の核酸の塩基と対をなすことができる複素環部式部分を意味する。

【0072】

「核酸塩基配列」は、任意の糖、連結、または核酸塩基修飾とは無関係の連続核酸塩基の順序を意味する。

【0073】

「ヌクレオシド」は、糖と連結した核酸塩基を意味する。

【0074】

「ヌクレオシド模倣物」としては、オリゴマー化合物の１つ以上の位置での糖または糖および塩基（必ずしも連結ではない）を取り替えるために用いられる構造物、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、ビシクロまたはトリシクロ糖模倣物、例えば非フラノース糖単位を有するヌクレオシド模倣物が挙げられる。

【0075】

「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分と共有結合されるリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。

【0076】

「ヌクレオチド模倣物」としては、オリゴマー化合物の１つ以上の位置でのヌクレオシドおよび連結を取り替えるために用いられる構造物、例えば、ペプチド核酸またはモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または他の非ホスホジエステルにより連結されるモルホリノ）が挙げられる。

【0077】

「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」は、少なくとも１つの核酸分子の領域とハイブリダイズし得る連結単量体サブユニットのポリマーを意味する。

【0078】

「オリゴヌクレオチド」は、その各々が、互いに無関係に、修飾され得るかまたは非修飾であり得る連結ヌクレオシドのポリマーを意味する。

【0079】

「非経口投与」は、注射または注入による投与を意味する。非経口投与としては、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与または頭蓋内投与、例えばくも膜下腔内投与または脳室内投与が挙げられる。投与は、連続的、または長期的、または短期的、または間欠的であり得る。

【0080】

「ペプチド」は、アミド結合により、少なくとも２つのアミノ酸を連結することにより生成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチドおよびタンパク質を指す。

【0081】

「薬学的組成物」は、個体に投与するのに適した物質の混合物を意味する。例えば、薬学的組成物は、１つ以上の活性作用物質および滅菌水溶液を含み得る。

【0082】

「製薬上許容可能な塩」は、アンチセンス化合物の生理学的に且つ薬学的に許容可能な塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持し、そこに望ましくない毒物学的作用を付与しない塩を意味する。

【0083】

「ホスホロチオエート結合」は、非架橋酸素原子の１つをイオウ原子で置き換えることにより、ホスホジエステル結合が修飾されるヌクレオシド間の連結を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。

【0084】

「部分」は、核酸の限定数の連続（すなわち連結）核酸塩基を意味する。ある実施形態では、一部分は、標的核酸の限定数の連続核酸塩基である。ある実施形態では、一部分は、アンチセンス化合物の限定数の連続核酸塩基である。

【0085】

「ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減する」は、正常ＤＭＰＫ対立遺伝子からのＲＮＡ転写物に比して、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ対立遺伝子からのＲＮＡ転写物の優先的低減を指す。

【0086】

「防止する」は、疾患、障害または症状の開始または発症を、数分間から無期限まで、遅延するかまたは未然に防ぐことを指す。防止するは、疾患、障害または症状を発症する危険を低減することも意味する。

【0087】

「プロドラッグ」は、不活性形態で調製され、内因性酵素または他の化学物質もしくは条件の作用により、身体またはその細胞内で活性形態に転化される治療薬を意味する。

【0088】

「副作用」は、所望の作用以外の処置に起因する生理学的応答を意味する。ある実施形態では、副作用としては、注射部位反応、肝機能試験異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパシーおよび倦怠が挙げられる。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼ増大は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビン増大は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。

【0089】

「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補的鎖とハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチドを意味する。

【0090】

「特異的にハイブリダイズ可能な」は、所望の作用を誘導するために十分な程度の相補性をアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的核酸間に有するが、一方、特異的結合が所望される条件下、すなわち、in vivo検定および治療的処置の場合の生理学的条件下で、非標的核酸に及ぼす作用が最小であるかまたは作用を全く示さないアンチセンス化合物を指す。

【0091】

「スプライセオパシー」は、特定組織において変更されたスプライス産物の発現をもたらす１つ以上のＲＮＡの選択的スプライシングの変化を意味する。

【0092】

「皮下投与」は、皮膚の真下の投与を意味する。

【0093】

「糖代用物」は、「ヌクレオシド模倣物」という少しだけ広範な用語と重複するが、しかし、糖単位（フラノース環）の取替えのみを示すよう意図される。本明細書中で提供されるテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系に取り替えられた糖の一例を示す。

【0094】

「ターゲッティング」または「標的化」は、標的核酸と特異的にハイブリダイズし、所望の作用を誘導するアンチセンス化合物の設計および選択の過程を意味する。

【0095】

「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」および「標的ＲＮＡ転写物」はすべて、アンチセンス化合物により標的化され得る核酸を指す。

【0096】

「標的セグメント」は、アンチセンス化合物が標的とする標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」は、標的セグメントの５’末端ヌクレオチドを指す。「３’標的部位」は、標的セグメントの３’末端ヌクレオチドを指す。

【0097】

「治療的有効量」は、個体に治療効果を提供する作用物質の量を意味する。

【0098】

「処置する」は、疾患、障害または症状の変更または改善を実行するために薬学的組成物を投与することを指す。

【0099】

「１型筋緊張性ジストロフィー」または「ＤＭ１」は、ＤＭＰＫにおける非コードＣＴＧ反復の伸長により引き起こされる常染色体優性障害を意味する。この突然変異は、伸長ＣＵＧ反復（ＣＵＧｅｘｐ）を含有するＲＮＡの発現が細胞機能障害を誘導する過程であるＲＮＡ優性をもたらす。ＣＵＧｅｘｐ路は、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用して、突然変異体転写産物を核内フォーカスに保持させる。このＲＮＡの毒性は、ＲＮＡ結合タンパク質の隔離およびシグナル伝達経路の活性化に由来する。

【0100】

「非修飾ヌクレオチド」は、天然核酸塩基、糖部分およびヌクレオシド間結合で構成されるヌクレオチドを意味する。ある実施形態では、非修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）またはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。

【0101】

実施形態例
ある実施形態は、ＤＭＰＫ発現を抑制するための方法、化合物および組成物を提供する。

【0102】

ある実施形態は、動物におけるＤＭＰＫ発現の低減方法であって、ＤＭＰＫをターゲッティングする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを包含する方法を提供する。

【0103】

ある実施形態は、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減し、筋緊張症を低減し、またはスプライセオパシーを低減する方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化される修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与すること（ここで、修飾オリゴヌクレオチドは、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減し、筋緊張症を低減するかまたはスプライセオパシーを低減する）を包含する方法を提供する。

【0104】

ある実施形態は、病原性転写産物の切断を指示することによるＲＮＡ優性を相殺するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与方法を提供する。

【0105】

ある実施形態は、Ｓｅｒｃａ１のスプライセオパシーを低減する方法を提供する。ある実施形態では、本明細書中で提供される方法は、エキソン２２包含を生じる。ある実施形態では、矯正スプライシングは、前脛骨、腓腹筋および四頭筋において生じる。

【0106】

ある実施形態は、ｍ−Ｔｉｔｉｎのスプライセオパシーの低減方法を提供する。ある実施形態では、本明細書中で提供される方法は、エキソン５包含を生じる。ある実施形態では、矯正スプライシングは、前脛骨、腓腹筋および四頭筋において生じる。

【0107】

ある実施形態は、Ｃｌｃｎ１のスプライセオパシーの低減方法を提供する。ある実施形態では、本明細書中で提供される方法は、エキソン７ａ包含を生じる。矯正スプライシングは、前脛骨、腓腹筋および四頭筋において生じる。

【0108】

ある実施形態は、Ｚａｓｐのスプライセオパシーの低減方法を提供する。ある実施形態では、本明細書中で提供される方法は、エキソン１１包含を生じる。ある実施形態では、矯正スプライシングは、前脛骨、腓腹筋および四頭筋において生じる。

【0109】

ある実施形態は、１型筋緊張性ジストロフィーを有する動物の処置方法であって、以下の：ａ）１型筋緊張性ジストロフィーを有する前記動物を同定すること；そしてｂ）ＤＭＰＫに対して標的化される修飾オリゴヌクレオチドを含む治療的有効量の化合物を前記動物に投与することを包含する方法を提供する。ある実施形態では、動物に投与される治療的有効量の化合物は、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減し、筋緊張症を低減するかまたはスプライセオパシーを低減する。

【0110】

ある実施形態は、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する方法であって、前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを、１型筋緊張性ジストロフィーを有すること、またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有することが疑われる対象に投与することを包含する方法を提供する。修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する。

【0111】

ある実施形態は、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する方法であって、１型筋緊張性ジストロフィーを有するか、またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有する対象を選択すること；そして前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な化学的に修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に投与することを包含する方法を提供する。修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、リボヌクレアーゼまたは核内リボヌクレアーゼを活性化し、それにより核中のＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する。

【0112】

ある実施形態は、ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する方法であって、１型筋緊張性ジストロフィーを有するか、またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有する対象を選択すること；そして前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に全身投与することを包含する方法を提供する。修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異体またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、突然変異体またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する。

【0113】

ある実施形態は、それを必要とする対象における筋緊張症の低減方法を提供する。当該方法は、ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に投与することを包含するが、この場合、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、リボヌクレアーゼまたは核内リボヌクレアーゼを活性化し、それにより筋緊張症を低減する。ある実施形態では、対象は、１型筋緊張性ジストロフィーを有するかもしくは有することが疑われ、または突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡもしくはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有することが疑われる。ある実施形態では、ＤＭＰＫ ＲＮＡは、核内保持される。

【0114】

ある実施形態は、それを必要とする対象におけるスプライセオパシーの低減方法を提供する。当該方法は、ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に投与することを包含するが、この場合、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、リボヌクレアーゼまたは核内リボヌクレアーゼを活性化し、それによりスプライセオパシーを低減する。ある実施形態では、対象は、１型筋緊張性ジストロフィーを有するかもしくは有することが疑われ、または突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡもしくはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有することが疑われる。ある実施形態では、ＤＭＰＫ ＲＮＡは、核内保持される。ある実施形態では、スプライセオパシーはＭＢＮＬ依存性スプライセオパシーである。

【0115】

ある実施形態では、当該方法の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドはキメラである。ある実施形態では、当該方法の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。

【0116】

本明細書中で提供される方法のある実施形態では、投与することは皮下である。ある実施形態では、投与することは静脈内である。

【0117】

ある実施形態では、当該方法の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域内の非コード配列を標的にする。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、突然変異ＤＭＰＫ ＲＮＡのコード領域、イントロン、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを標的にする。

【0118】

本明細書中で提供される方法のある実施形態では、核内リボヌクレアーゼはＲＮアーゼ Ｈ１である。

【0119】

当該方法のある実施形態では、ＤＭＰＫ ＲＮＡは、筋肉組織において低減される。ある実施形態では、突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡ ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡは優先的に低減される。

【0120】

ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＭ＿００１０８１５６０．１で記述されるような配列を有する（配列番号１として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫはGenBank寄託番号ＮＴ＿０１１１０９．１５（ヌクレオチド１８５４０６９６から１８５５５１０６まで切頭化）で記述されるような配列を有する（配列番号２として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＴ＿０３９４１３．７（ヌクレオチド１６６６６００１から１６６８１０００まで切頭化）で記述されるような配列を有する（配列番号３として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫはGenBank寄託番号ＮＭ ０３２４１８．１で記述されるような配列を有する（配列番号４として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＡＩ００７１４８．１で記述されるような配列を有する（配列番号５として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＡＩ３０４０３３．１で記述されるような配列を有する（配列番号６として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＣ０２４１５０．１で記述されるような配列を有する（配列番号７として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＣ０５６６１５．１で記述されるような配列を有する（配列番号８として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＣ０７５７１５．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９３として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＢＵ５１９２４５．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９４として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＣＢ２４７９０９．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９５として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＣＸ２０８９０６．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９６として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＣＸ７３２０２２．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９７として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号Ｓ６０３１５．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９８として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号Ｓ６０３１６．１で記述されるような配列を有する（配列番号７９９として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＭ ００１０８１５６２．１で記述されるような配列を有する（配列番号８００として本明細書中に組入れられる）。ある実施形態では、ＤＭＰＫは、GenBank寄託番号ＮＭ＿００１１００．３で記述されるような配列を有する（配列番号８０１として本明細書中に組入れられる）。

【0121】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも８連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも９、少なくとも１０または少なくとも１１連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0122】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも１３または少なくとも１４連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0123】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも１５連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも１６または少なくとも１７連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0124】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも１８連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも１９連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。

【0125】

ある実施形態では、本明細書中で提供される修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の以下の領域のうちのいずれか１つに対して標的化される：１１７８−１２０６、２１５９−２１８２、２１７４−２１９６、２４２６−２４４７、２４５０−２５１８、２６７９−２７０４または２６９７−２７２５。

【0126】

ある実施形態では、本明細書中で提供される修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の以下の領域のうちのいずれか１つに対して標的化される：１７８−２２３、２３２−２５３、２７９−２９９、３６６−３９９、５１９−５４１、９２３−９７５、１０７３−１１０５、１１７１−１１９６、１２１５−１２４６、１２６３−１３２４、１７０６−１７３４、１７４３−１７６３、１９３２−１９７９、１９８１−２００３、２０７７−２１０８または２１５２−２１７３。

【0127】

ある実施形態では、本明細書中で提供される修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２の以下の領域のうちのいずれか１つに対して標的化される：１２５１−１３０３、１３０５−１３２６、１３５２−１３７２、３７６２−３７９５、４１７０−４１９２、５８００−５８５２、６１２４−６１４９、６１６８−６１９９、６２１６−６２７７、１１９７９−１２００７、１２０１６−１２０３６、１２９９３−１３０４２、１３０４４−１３０６６、１３１４０−１３１７１または１３２１５−１３２３６。

【0128】

ある実施形態では、動物はヒトである。

【0129】

ある実施形態では、本発明の化合物または組成物は第一作用物質と呼ばれ、本発明の方法は、第二作用物質を投与することをさらに包含する。ある実施形態では、第一作用物質および第二作用物質は同時投与される。ある実施形態では、第一作用物質および第二作用物質は、逐次的にまたは同時に、併用投与される。

【0130】

ある実施形態では、投与は非経口投与を包含する。

【0131】

ある実施形態では、化合物は一本鎖修飾オリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に亘って測定した場合に配列番号１〜８および７９３〜８０１のいずれか１つと少なくとも９５％相補的である。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に亘って測定した場合に配列番号１〜８および７９３〜８０１のいずれか１つと１００％相補的である。

【0132】

ある実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0133】

ある実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は二環式糖である。ある実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は２’−Ｏ−メトキシエチルまたは４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１または２である）を含む。

【0134】

ある実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾核酸塩基を含む。ある実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。

【0135】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、以下の：ａ）連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；ｃ）連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、そして各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。

【0136】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、以下の：ａ）１０の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；ｃ）５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、そして前記修飾オリゴヌクレオチド中の各シトシンは５’−メチルシトシンである。

【0137】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０連結ヌクレオシドからなる。

【0138】

ある実施形態は、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減し、筋緊張症を低減し、またはスプライセオパシーを低減する方法であって、１０の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントおよび５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを包含する方法を提供する。ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、前記修飾オリゴヌクレオチド中の各シトシンは５’−メチルシトシンである。

【0139】

ある実施形態は、本明細書中に記載される治療方法のいずれかで用いるための医薬品の製造における本明細書中に記載されるような任意の化合物の使用を提供する。例えば、ある実施形態は、１型筋緊張性ジストロフィーを処置し、改善し、または防止するための医薬品の製造における本明細書中に記載されるような化合物の使用を提供する。ある実施形態は、ＤＭＰＫの発現を抑制し、そしてＤＭＰＫ関連疾患および／またはその症候を処置し、防止し、遅延しまたは改善するための医薬品の製造における、本明細書中に記載されるような化合物の使用を提供する。ある実施形態は、動物におけるＤＭＰＫ発現を低減するための医薬品の製造における、本明細書中に記載されるような化合物の使用を提供する。ある実施形態は、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫを優先的に低減し、筋緊張症を低減し、またはスプライセオパシーを低減するための医薬品の製造における、本明細書中に記載されるような化合物の使用を提供する。ある実施形態は、１型筋緊張性ジストロフィーを有する動物を処置するための医薬品の製造における本明細書中に記載されるような化合物の使用を提供する。ある実施形態は、ＤＭ１の発症に関連した症候および結果、例えば筋肉強直、筋緊張症、障害性遠位性衰弱、顔面および顎筋肉の衰弱、嚥下困難、眼瞼の垂れ下がり（眼瞼下垂）、首の筋肉の衰弱、腕および足の筋肉の衰弱、持続性筋肉痛、過眠症、筋消耗、嚥下障害、呼吸不全、不規則心拍、心筋損傷、無感動、インスリン抵抗性および白内障を、処置し、防止し、遅延し、または改善するための医薬品の製造における本明細書中に記載されるような化合物の使用を提供する。ある実施形態は、病原性転写産物の切断を指示することにより、ＲＮＡ優性を相殺するための医薬品の製造における本明細書中に記載されるような化合物の使用を提供する。

【0140】

ある実施形態は、本明細書中に記載されるような１型筋緊張性ジストロフィーを処置し、防止し、または改善するためのキットであって、ａ）本明細書中に記載されるような化合物；そして任意にｂ）本明細書中に記載されるような付加的作用物質または治療を包含するキットを提供する。キットは、１型筋緊張性ジストロフィーを処置し、防止しまたは改善するためのキットを用いるための機器またはラベルをさらに包含する。

【0141】

ある実施形態は、本明細書中に記載されるような治療方法のいずれかに用いるための、本明細書中に記載されるような任意の化合物または組成物を提供する。例えば、ある実施形態は、ＤＭＰＫの発現を抑制し、そしてＤＭＰＫ関連疾患および／またはその症候を処置し、防止し、遅延し、または改善するための、本明細書中に記載されるような化合物または組成物を提供する。ある実施形態は、動物におけるＤＭＰＫ発現を低減するのに用いるための、本明細書中に記載されるような化合物または組成物を提供する。ある実施形態は、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫを優先的に低減し、筋緊張症を低減し、またはスプライセオパシーを低減するのに用いるための、本明細書中に記載されるような化合物または組成物を提供する。ある実施形態は、１型筋緊張性ジストロフィーを有する動物を処置するのに用いるための、本明細書中に記載されるような化合物または組成物を提供する。ある実施形態は、ＤＭ１の発症に関連した症候および結果、例えば筋肉強直、筋緊張症、障害性遠位性衰弱、顔面および顎筋肉の衰弱、嚥下困難、眼瞼の垂れ下がり（眼瞼下垂）、首の筋肉の衰弱、腕および足の筋肉の衰弱、持続性筋肉痛、過眠症、筋消耗、嚥下障害、呼吸不全、不規則心拍、心筋損傷、無感動、インスリン抵抗性および白内障を、処置し、防止し、遅延し、または改善するのに用いるための、本明細書中に記載されるような化合物または組成物を提供する。ある実施形態は、病原性転写産物の切断を指示することにより、ＲＮＡ優性を相殺するのに用いるための、本明細書中に記載されるような化合物または組成物を提供する。ある実施形態は、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。

【0142】

本明細書中に記載される方法で用いられ得る他の化合物も提供される。

【0143】

例えばある実施形態は、配列番号４１、４４、７６、１０９、１５３、３２０、３２１、３２２、３２５、３２９、３３５および６５７の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１０〜８０、１２〜５０、１２〜３０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、または２０の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。

【0144】

ある実施形態は、配列番号１５、７３、７７、７９、８３、８５、１３０、６０２、６４８、６５５、６７４および６８０のいずれかの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１０〜８０、１２〜５０、１２〜３０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、または２０の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。

【0145】

ある実施形態は、配列番号１の核酸塩基６６４−６８３、７７３−７９２、９２６−９４５、９２７−９４６、９２８−９４７、９３１−９５０、９３５−９５４、９４１−９６０、２０８９−２１０８、２１６３−２１８２、２４９０−２５０９、２４９９−２５１８、２６７６−２６９５、２６８５−２７０４、２６７６−２６９５、２６８８−２７０７、２６９７−２７１６、２７６４−２７８３および２７７０−２７８９の等長部分と相補的な少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９またはそれ以上の連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１０〜８０、１２〜５０、１２〜３０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、または２０の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する（ここで、核酸塩基配列は、配列番号１と相補的である）。

【0146】

ある実施形態は、配列番号２の核酸塩基８１２−８３１、３６２９−３６４８、４４４７−４４６６、４６１３−４６３２、５８０３−５８２２、５８０４−５８２３、５８０５−５８２４、５８０８−５８２７、５８１８−５８３７、６７９４−６８１３、１２４６３−１２４８２、１３１５２−１３１７１および１３５５３−１３５７２の等長部分と相補的な少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、または少なくとも１９またはそれ以上の連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１０〜８０、１２〜５０、１２〜３０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、または２０の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する（ここで、核酸塩基配列は、配列番号２と相補的である）。

【0147】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドである。

【0148】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１〜８および７９３〜８０１のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的である。

【0149】

ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。

【0150】

ある実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0151】

ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドは修飾糖を含む。

【0152】

ある実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は二環式糖である。

【0153】

ある実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチルを含む。

【0154】

ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドは修飾核酸塩基を含む。

【0155】

ある実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。

【0156】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、以下の：
連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含むが、この場合、ギャップセグメントは５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、そして各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。

【0157】

ある実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドは、以下の：
１０の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含むが、この場合、ギャップセグメントは５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、そして各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。

【0158】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは１４連結ヌクレオシドからなる。

【0159】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは１６連結ヌクレオシドからなる。

【0160】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０連結ヌクレオシドからなる。

【0161】

アンチセンス化合物
オリゴマー化合物としては、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡｓが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であり得るが、これは、水素結合を介して標的核酸とのハイブリダイゼーションを受け得ることを意味する。

【0162】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、５’−３’方向で記される場合、それが標的化される標的核酸の標的セグメントの逆相補配列を含む核酸塩基配列を有する。ある種のこのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−３’方向で記される場合、それが標的化される標的核酸の標的セグメントの逆相補配列を含む核酸塩基配列を有する。

【0163】

ある実施形態では、本明細書中に記載されるようなＤＭＰＫに対して標的化されるアンチセンス化合物は、１０〜３０ヌクレオチド長である。言い換えれば、アンチセンス化合物は、いくつかの実施形態では、１０〜３０連結核酸塩基である。他の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０、１０〜８０、１２〜３０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２または２０連結核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある種のこのような実施形態では、アンチセンス化合物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９もしくは８０連結核酸塩基長、または上記値のうちの任意の２つにより限定される範囲からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある実施形態では、これらの長さのうちのいずれかを有するアンチセンス化合物は、本明細書中に記載される例示的アンチセンス化合物のいずれかの核酸塩基配列を有する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８または少なくとも１９連続核酸塩基を含有する（例えば、配列番号１２−１５６、１６０−７７０および７７４−７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも８連続核酸塩基）。

【0164】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、短縮化または切頭化修飾オリゴヌクレオチドを含む。短縮化または切頭化修飾オリゴヌクレオチドは、５’末端から（５’切頭）、あるいは３’末端から（３’切頭）欠失される単一ヌクレオシドを有し得る。短縮化または切頭化オリゴヌクレオチドは、５’末端から欠失される２つのヌクレオシドを有し得るし、あるいは、３’末端から欠失される２つのサブユニットを有し得る。あるいは、例えば、５’末端から欠失される１つのヌクレオシドおよび３’末端から欠失される１つのヌクレオシドを有するアンチセンス化合物では、欠失ヌクレオシドは、修飾オリゴヌクレオチド全体に分散され得る。

【0165】

単一の付加的ヌクレオシドが延長オリゴヌクレオチド中に存在する場合、付加的ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に配置され得る。２つ以上の付加的ヌクレオシドが存在する場合、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端（５’付加）あるいは、３’末端（３’付加）に付加される２つのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドでは、付加ヌクレオシドは互いに隣接し得る。

【0166】

あるいは、例えば、５’末端に付加される１つのヌクレオシドおよび３’末端に付加される１つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチドでは、付加ヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体に分散され得る。

【0167】

活性を失うことなく、アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを増大し、または低減することが可能であるし、および／または不適正塩基を導入することができる。例えば、Woolfet al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)では、１３〜２５核酸塩基長の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、卵母細胞注射モデルにおいて、標的ＲＮＡの切断を誘導するそれらの能力に関して試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８または１１不適正塩基を有する２５核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも少程度にではあるが、標的ｍＲＮＡの特異的切断を指示することができた。同様に、標的特異的切断は、１または３つのミスマッチを有するものを含めて、１３核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成された。

【0168】

Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)は、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡとの１００％相補性を有する、ならびにｂｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡに対する３つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの、in vitroおよびin vivoでｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘＬの両方の発現を低減する能力を実証した。

【0169】

さらに、このオリゴヌクレオチドは、in vivoでの強力な抗腫瘍活性を実証した。

【0170】

Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988)は、一連のタンデム１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれ２または３つの前記タンデムアンチセンスオリゴヌクレオチド配列で構成される２８および４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ウサギ網状赤血球検定において、ヒトＤＨＦＲの翻訳を阻止するそれらの能力に関して試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドの各々は単独では、２８または４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドより控えめなレベルではあるが、翻訳を抑制し得た。

【0171】

アンチセンス化合物モチーフ
ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物は、抑制活性増大、標的核酸に対する結合親和性増大、またはin vivoヌクレアーゼによる分解に対する耐性といったような特性をアンチセンス化合物に付与する、パターンまたはモチーフに配列される化学修飾サブユニットを有する。

【0172】

キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する耐性増大、細胞取込み増大、標的核酸に対する結合親和性増大、および／または抑制活性増大を付与するよう修飾される少なくとも１つの領域を含有する。

【0173】

キメラアンチセンス化合物の第二の領域は、任意に、細胞エンドヌクレアーゼＲＮアーゼＨ（これは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する）のための基質として役立つ。

【0174】

ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物とみなされる。ギャップマーにおいて、ＲＮアーゼＨ切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内部領域は、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域間に配置される。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは、一般的に、エンドヌクレアーゼ切断のための基質として役立つが、一方、ウィングセグメントは、修飾ヌクレオシドを含む。ある実施形態では、ギャップマーの領域は、各々別個の領域を含む糖部分の型により区別される。ギャップマーの領域を区別するために用いられる糖部分の型は、いくつかの実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド２’−修飾ヌクレオシド（このような２’−修飾ヌクレオシドは２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ−ＣＨ_３を特に含み得る）、ならびに二環式糖修飾ヌクレオシド（このような二環式糖修飾ヌクレオシドは、４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２’架橋を有するものを包含し得る；ここで、ｎ＝１またはｎ＝２）を包含する。好ましくは、各々の別個の領域は、均一糖部分を含む。ウィング−ギャップ−ウィングモチーフは、しばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」として記載されるが、この場合、「Ｘ」は、５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」は、ギャップ領域の長さを表し、そして「Ｚ」は、３’ウィング領域の長さを表す。本明細書中で用いる場合、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」として記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメントの各々に直隣接して配置されるような立体配置を有する。したがって、５’ウィングセグメントおよびギャップセグメント間、またはギャップセグメントおよび３’ウィングセグメント間に介入ヌクレオチドは存在しない。本明細書中に記載されるアンチセンス化合物のいずれかは、ギャップマーモチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、ＸおよびＺは同一であり、他の実施形態では、それらは異なる。好ましい一実施形態では、Ｙは、８〜１５ヌクレオチドである。Ｘ、ＹまたはＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドのいずれかであり得る。したがって、ギャップマーとしては、例えば５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１、２−８−２、６−８−６、５−８−５、１−８−１または２−６−２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0175】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、ギャップマー立体配置に関して上記されたようなウィング−ギャップまたはギャップ−ウィング立体配置、すなわちＸ−ＹまたはＹ−Ｚ立体配置を有する「ウィングマー」モチーフを有する。したがって、ウィングマー立体配置としては、例えば５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３または５−１３が挙げられるが、これらに限定されない。

【0176】

ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物は、５−１０−５ギャップマーモチーフを保有する。

【0177】

ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物は、ギャップ拡大モチーフを有する。

【0178】

ある実施形態では、これらのギャップマーまたはウィングマーモチーフのいずれかのアンチセンス化合物は、本明細書中に記載される例示的アンチセンス化合物のいずれかの核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８または少なくとも１９連続核酸塩基（例えば、配列番号１２−１５６、１６０−７７０および７７４−７９２のいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも８連続核酸塩基）を含有する。

【0179】

標的核酸、標的領域およびヌクレオチド配列
ＤＭＰＫをコードするヌクレオチド配列としては、以下の配列が挙げられるが、これらに限定されない：GenBank寄託番号ＮＭ＿００１０８１５６０．１で記述されるような配列（配列番号１として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＮＴ＿０１１１０９．１５（ヌクレオチド１８５４０６９６から１８５５５１０６まで切頭化）で記述されるような配列（配列番号２として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＮＴ＿０３９４１３．７（ヌクレオチド１６６６６００１から１６６８１０００まで切頭化）で記述されるような配列（配列番号３として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＮＭ ０３２４１８．１で記述されるような配列（配列番号４として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＡＩ００７１４８．１で記述されるような配列（配列番号５として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＡＩ３０４０３３．１で記述されるような配列（配列番号６として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＢＣ０２４１５０．１で記述されるような配列（配列番号７として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＢＣ０５６６１５．１で記述されるような配列（配列番号８として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＢＣ０７５７１５．１で記述されるような配列（配列番号７９３として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＢＵ５１９２４５．１で記述されるような配列（配列番号７９４として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＣＢ２４７９０９．１で記述されるような配列（配列番号７９５として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＣＸ２０８９０６．１で記述されるような配列（配列番号７９６として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＣＸ７３２０２２．１で記述されるような配列（配列番号７９７として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号Ｓ６０３１５．１で記述されるような配列（配列番号７９８として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号Ｓ６０３１６．１で記述されるような配列（配列番号７９９として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＮＭ ００１０８１５６２．１で記述されるような配列（配列番号８００として本明細書中に組入れられる）、GenBank寄託番号ＮＭ＿００１１００．３で記述されるような配列（配列番号８０１として本明細書中に組入れられる）。本明細書中に含有される実施例において各配列番号で記述される配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合または核酸塩基に対する任意の修飾とは無関係である、と理解される。このようなものとして、配列番号により限定されるアンチセンス化合物は、独立して、糖部分、ヌクレオシド間結合または核酸塩基に対する１つ以上の修飾を含み得る。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ Ｎｏ）により記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列およびモチーフの組合せを示す。

【0180】

ある実施形態では、標的領域は、標的核酸の構造限定領域である。例えば、標的領域は、３’ ＵＴＲ、５’ ＵＴＲ、エキソン、イントロン、エキソン／イントロン接合、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、またはその他の限定核酸領域を包含し得る。ＤＭＰＫに関する構造限定領域は、ＮＣＢＩのような配列データベースからの寄託番号により得られ、このような情報は、参照により本明細書中に組入れられる。ある実施形態では、標的領域は、標的領域内の一標的セグメントの５’標的部位から、標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を包含し得る。

【0181】

ターゲッティングは、所望の作用が生じるよう、アンチセンス化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの標的セグメントの確定を包含する。ある実施形態では、所望の作用は、ｍＲＮＡ標的核酸レベルの低減である。ある実施形態では、所望の作用は、標的核酸によりコードされるタンパク質のレベルの低減、または標的核酸と関連した表現型変化である。

【0182】

標的領域は、１つ以上の標的セグメントを含有し得る。標的領域内の複数の標的セグメントは、重複している可能性がある。あるいは、それらは、非重複性であり得る。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、約３００以下のヌクレオチドにより分離される。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の約２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０もしくは１０ヌクレオチドであるか、およそその数値であるか、その数値以下であるか、およそその数値以下であるか、または前記の数値のうちの任意の２つにより限定される範囲である、多数のヌクレオチドにより分離される。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の５以下、または約５以下のヌクレオチドにより分離される。ある実施形態では、標的セグメントは連続している。本明細書中に列挙される５’標的部位または３’標的部位のいずれかである出発核酸を有する範囲により限定される標的領域が意図される。

【0183】

適切な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エキソンまたはエキソン／イントロン接合内に見出され得る。開始コドンまたは停止コドンを含有する標的セグメントも、適切な標的セグメントである。適切な標的セグメントは、ある種の構造限定領域、例えば開始コドンまたは停止コドンを特異的に排除し得る。

【0184】

適切な標的セグメントの確定は、ゲノム全体を通して、標的核酸の配列と他の配列とを比較することを包含し得る。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、異なる核酸間の類似性を有する領域を同定し得る。この比較は、非特異的な方法で、選択標的核酸以外の配列（すなわち、非標的または非特異的配列）とハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列の選択を防止する。

【0185】

活性標的領域内のアンチセンス化合物の（例えば、標的核酸レベルの低減％により示されるような）活性における変動が存在し得る。ある実施形態では、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルの低減は、ＤＭＰＫタンパク質発現の抑制を示す。ＤＭＰＫタンパク質のレベル低減も、標的ｍＲＮＡの抑制を示す。さらに、表現型変化、例えば筋緊張症を低減すること、またはスプライセオパシーを低減することは、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現の抑制を示し得る。

【0186】

ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは、本明細書中に開示されるアンチセンス化合物とＤＭＰＫ核酸との間に起きる。ハイブリダイゼーションの最も一般的な機序は、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合（例えば、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合）を伴う。

【0187】

ハイブリダイゼーションは、種々の条件下で起こり得る。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイズされるべき核酸分子の性質および組成により決定される。

【0188】

配列が標的核酸と特異的にハイブリダイズ可能であるか否かを確定する方法は、当該技術分野で周知である（Sambrooke and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rdEd., 2001）。ある実施形態では、本明細書中で提供されるアンチセンス化合物は、ＤＭＰＫ核酸と特異的にハイブリダイズ可能である。

【0189】

相補性
アンチセンス化合物および標的核酸は、所望の作用（例えば、ＤＭＰＫ核酸のような標的核酸のアンチセンス抑制）が生じるよう、アンチセンス化合物の十分数の核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、互いに相補的である。

【0190】

アンチセンス化合物は、介入または隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないよう、ＤＭＰＫ核酸の１つ以上のセグメントに亘ってハイブリダイズし得る（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）。

【0191】

ある実施形態では、本明細書中で提供されるアンチセンス化合物またはその特定部分は、ＤＭＰＫ核酸、標的領域、標的セグメントまたはその特定部分と７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または少なくとも上記数値）または１００％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、ＤＭＰＫ核酸、標的領域、標的セグメントまたはその特定部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相補的であり、そして本明細書中に記載される例示的アンチセンス化合物の核酸塩基配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８または少なくとも１９連続核酸塩基（例えば、配列番号１２−１５６、１６０−７７０および７７４−７９２のうちのいずれか１つで挙げられる核酸塩基配列の少なくとも８連続核酸塩基）を含有する。標的核酸とのアンチセンス化合物の相補性％は、慣例的方法を用いて確定され得るし、アンチセンス化合物の全体に亘って測定される。

【0192】

例えば、アンチセンス化合物の２０の核酸塩基のうちの１８が標的領域と相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス化合物は、９０％相補性を示すだろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター化していても、または相補的核酸塩基を挟まれていてもよく、互いとまたは相補的核酸塩基と連続である必要はない。このようなものとして、標的核酸と完全相補性の２つの領域が側面に位置する４つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、標的核酸と全体で７７．８％の相補性を有し、したがって、本発明の範囲内であろう。標的核酸の一領域とのアンチセンス化合物の相補性％は、当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所アラインメント検索ツール basic local alignment search tools）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて慣例的に確定され得る（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656）。相同性％、配列同一性または相補性は、例えばギャッププログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８、Unix, Genetics Computer Group， University Research Park, Madison Wis.）により、Smith and Waterman(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)のアルゴリズムを用いるデフォルト設定を用いて確定され得る。

【0193】

ある実施形態では、本明細書中で提供されるアンチセンス化合物またはその特定部分は、標的核酸またはその特定部分に対して、完全相補的（すなわち、１００％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は、ＤＭＰＫ核酸、または標的領域、または標的セグメント、またはその標的配列に対して完全相補的であり得る。本明細書中で用いる場合、「完全相補的」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合し得ることを意味する。例えば、２０核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物と完全相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在する限り、４００核酸塩基長である標的配列と完全相補的である。完全に相補的は、第一および／または第二核酸の特定部分に言及する場合にも用いられ得る。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長である標的配列と「完全に相補的」であり得る。３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は、各核酸塩基がアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分と相補的である対応する２０核酸塩基部分を標的配列が有する場合、標的配列と完全相補的である。同時に、全３０核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基も標的配列と相補的であるか否かによって、標的配列と完全相補的であり得る。

【0194】

非相補的核酸塩基の場所は、アンチセンス化合物の５’末端または３’末端であり得る。あるいは、単数または複数の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物の内部位置に存在し得る。２つ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは連続（すなわち、連結される）または非連続であり得る。一実施形態では、非相補的核酸塩基は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメント中に配置される。

【0195】

ある実施形態では、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０核酸塩基長または前記の値までの核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、標的核酸、例えばＤＭＰＫ核酸またはその特定部分に比して、４以下、３以下、２以下または１以下の非相補的核酸塩基（単数または複数）を含む。

【0196】

ある実施形態では、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０核酸塩基長または前記の値までの核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、標的核酸、例えばＤＭＰＫ核酸またはその特定部分に比して、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下または１以下の非相補的核酸塩基（単数または複数）を含む。

【0197】

本明細書中で提供されるアンチセンス化合物は、標的核酸の一部分と相補的であるものも包含する。本明細書中で用いる場合、「部分」は、標的核酸の領域またはセグメント内の限定数の連続（すなわち、連結された）核酸塩基を指す。「部分」は、アンチセンス化合物の限定数の連続核酸塩基も指し得る。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分と相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１０核酸塩基部分と相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分と相補的である。標的セグメントの標的セグメントの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０もしくはそれ以上の核酸塩基部分、またはこれらの値のうちの任意の２つにより限定される範囲と相補的であるアンチセンス化合物も意図される。

【0198】

同一性
本明細書中で提供されるアンチセンス化合物は、特定のヌクレオチド配列、配列番号、もしくは特定のＩｓｉｓ番号により表される化合物、またはその部分との限定％の同一性も有し得る。本明細書中で用いる場合、アンチセンス化合物は、それが同一核酸塩基対合能力を有する場合、本明細書中に開示される配列と同一である。例えば、開示ＤＮＡ配列中にチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、ウラシルおよびチミジンがともにアデニンと対合するため、ＤＮＡ配列と同一であるとみなされるだろう。本明細書中に記載されるアンチセンス化合物の短縮化および延長化バージョン、ならびに本明細書中で提供されるアンチセンス化合物に比して非同一塩基を有する化合物も意図される。非同一塩基は、互いと隣接し得るか、またはアンチセンス化合物全体に分散され得る。アンチセンス化合物の同一性％は、それが比較されている配列に比して、同一塩基対合を有する塩基の数によって算定される。

【0199】

ある実施形態では、アンチセンス化合物またはその部分は、本明細書中に開示される例示的アンチセンス化合物、または配列番号、またはその部分のうちの１つ以上と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である。

【0200】

修飾
ヌクレオシドは、塩基−糖組合せ物である。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても既知）部分は、普通は複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分と共有結合されるリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分と連結され得る。オリゴヌクレオチドは、隣接ヌクレオシドと互いに共有結合することにより形成されて、線状高分子オリゴヌクレオチドを生成する。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成すると言及される。

【0201】

アンチセンス化合物に対する修飾は、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に対する置換または変化を包含する。修飾アンチセンス化合物は、しばしば、天然型よりも望ましいが、それは、望ましい特性、例えば細胞取込み増強、核酸標的に対する親和性増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性増大、または抑制活性増大のためである。

【0202】

化学的に修飾されたヌクレオシドは、その標的核酸に対する短縮化または切頭化アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大するためにも用いられ得る。したがって、このような化学修飾ヌクレオシドを有するより短いアンチセンス化合物に匹敵する結果がしばしば得られ得る。

【0203】

修飾ヌクレオシド間結合
ＲＮＡおよびＤＮＡの天然ヌクレオシド間結合は、３’−５’ホスホジエステル結合である。１つ以上の修飾、すなわち非天然ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、しばしば、天然ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物を上回って選択されるが、それは、望ましい特性、例えば細胞取込み増強、核酸標的に対する親和性増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性増大、または抑制活性増大のためである。

【0204】

修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合、およびリン原子を有さないヌクレオシド間結合を包含する。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよびホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。リン含有および非リン含有結合の調製方法は、よく知られている。

【0205】

ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。ある実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

【0206】

修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、任意に、糖基が修飾されている１つ以上のヌクレオシドを含有する。このような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性増強、結合親和性増大、またはいくつかの他の有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与し得る。ある実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例としては、置換基の付加（例えば、５’および２’置換基）、二環式核酸（ＢＮＡ）を生成するための非ジェミナル環の架橋、Ｓ、Ｎ（Ｒ）またはＣ（Ｒ_１）（Ｒ_２）（Ｒ、Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルまたは保護基である）によるリボシル環酸素原子の置換、ならびにその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。化学修飾糖の例としては、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（ＰＣＴ国際出願 ＷＯ２００８／１０１１５７、他の開示された５’，２’−ビス置換ヌクレオシドに関して２００８年８月２１に公開を参照）、または２’位置でのさらなる置換によるリボシル環酸素原子のＳとの置換に、（公開米国特許出願ＵＳ２００５／０１３０９２３、２００５年６月１６日公開を参照）、あるいは、ＢＮＡの５’−置換（ＰＣＴ国際出願 ＷＯ２００７／１３４１８１、２００７年１１月２２日公開を参照；この中で、ＬＮＡは、例えば、５’−メチルまたは５’−ビニル基で置換される）が挙げられる。

【0207】

修飾糖部分を有するヌクレオシドの例としては、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ_３、２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_３、２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｆおよび２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３置換基を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。２’位置での置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_２Ｆ、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）およびＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_１）−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）（ここで、Ｒ_１、Ｒ_ｍおよびＲ_ｎは、各々独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルである）からも選択され得る。

【0208】

二環式核酸（ＢＮＡ）の例としては、４’および２’リボシル環原子間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられるが、これに限定されない。ある実施形態では、本明細書中で提供されるアンチセンス化合物は、架橋が以下の式のうちの１つを含む１つ以上のＢＮＡヌクレオシドを包含する：４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ_２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’および４’−ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）−Ｏ−２’（ならびにその類似体；米国特許第７，３９９，８４５号、２００８年７月１５日発行を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）−Ｏ−２’（ならびにその類似体；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２（ＷＯ／２００９／００６４７８として公開された（２００９年１月８日公開））を参照）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（ＯＣＨ_３）−２’（ならびにその類似体；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１（ＷＯ／２００８／１５０７２９（２００８年１２月１１日公開)として公開された)を参照）；４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−２’（公開米国特許出願 ＵＳ２００４−０１７１５７０（２００４年９月２日公開）参照）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、ＲはＨ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、または保護基である（米国特許第７，４２７，６７２号（２００８年９月２３日発行）参照）；４’−ＣＨ_２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_３）−２’（Chattopadhyaya et al, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134参照）；ならびに４’−ＣＨ_２−Ｃ（＝ＣＨ_２）−２’（およびその類似体；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４（ＷＯ２００８／１５４４０１として公開された（２００８年１２月８日公開））参照）。

【0209】

さらに二環式ヌクレオシドは、発表済み文献中で報告されている（例えば：Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden et al, Nucleic Acids
Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al, Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Orum et al, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039;米国特許：７，３９９，８４５；７，０５３，２０７；７，０３４，１３３；６，７９４，４９９；６，７７０，７４８；６，６７０，４６１；６，５２５，１９１；６，２６８，４９０；米国特許公開番号：ＵＳ２００８−００３９６１８；ＵＳ２００７−０２８７８３１；ＵＳ２００４−０１７１５７０；米国特許出願：１２／１２９，１５４；６１／０９９，８４４；６１／０９７，７８７；６１／０８６，２３１；６１／０５６，５６４；６１／０２６，９９８；６１／０２６，９９５；６０／９８９，５７４；国際出願 ＷＯ２００７／１３４１８１；ＷＯ２００５／０２１５７０；ＷＯ２００４／１０６３５６；ＷＯ９４／１４２２６；ならびにＰＣＴ国際出願：ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４；およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１参照）。前記の二環式ヌクレオシドの各々は、１つ以上の立体化学的糖立体配置、例えば、α−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースを有して調製され得る（ＰＣＴ国際出願 ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３（ＷＯ９９／１４２２６として１９９９年３月２５日公開）参照）。

【0210】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、ペントフラノシル糖部分の４’および２’炭素原子間の架橋を含み、例としては、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｃ（Ｒ_ｂ）−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ_ａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ_ａ）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）_ｘ−および−Ｎ（Ｒ_ａ）−；ここで、：ｘは０、１または２であり；ｎは１、２、３または４であり；Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、各々独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、Ｃ_５〜Ｃ_７脂環式ラジカル、置換Ｃ_５〜Ｃ_７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＣＯＯＪ_１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｊ_１）またはスルホニル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ_１）から独立して選択される１または１〜４連結基を含む架橋が挙げられるが、これらに限定されず；
Ｊ_１およびＪ_２は、各々独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アミノアルキルまたは保護基である。

【0211】

ある実施形態では、二環式糖部分の架橋は、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−または−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある実施形態では、架橋は、４’−ＣＨ_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_３−２’、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’および４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、ここで、Ｒは、各々独立して、Ｈ、保護基またはＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである。

【0212】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、異性体立体配置によりさらに限定される。例えば、４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’架橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ立体配置で、またはβ−Ｄ立体配置で存在し得る。従来、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡは、アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチド中に組入れられている（Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372)。

【0213】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、４’−２’架橋を有するものを包含するが、この場合、このような架橋としては、α−Ｌ−４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’、β−Ｄ−４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’、４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’、４’−ＣＨ_２−Ｓ−２’、４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−２’および４’−（ＣＨ_２）_３−２’（ここで、Ｒは、Ｈ、保護基またはＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである)が挙げられるが、これらに限定されない。

【0214】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、次式を有する：

【化1】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
−Ｑ_ａ−Ｑ_ｂ−Ｑ_ｃ−は、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ_２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｃ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｃ）−、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_ｃ）−Ｏ−または−Ｎ（Ｒ_ｃ）−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２であり；
Ｒｃは、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルまたはアミノ保護基であり；そして
Ｔ_ａおよびＴ_ｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持体との共有結合である）。

【0215】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、次式を有する：

【化2】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ_ａおよびＴ_ｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持体との共有結合であり；
Ｚ_ａは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオールである）。

【0216】

一実施形態では、置換基は、各々独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ_ｃ、ＮＪ_ｃＪ_ｄ、ＳＪ_ｃ、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_ｃおよびＮＪ_ｅＣ（＝Ｘ）ＮＪ_ｃＪ_ｄ（ここで、Ｊ_ｃ、Ｊ_ｄおよびＪ_ｅは、各々独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルまたは置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、そしてＸはＯまたはＮＪ_Ｃである）から独立して選択される置換基で、一または多置換される。

【0217】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは次式を有する：

【化3】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ_ａおよびＴ_ｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持体との共有結合であり；
Ｚ_ｂは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルまたは置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である）。

【0218】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは次式を有する：

【化4】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ_ａおよびＴ_ｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持体との共有結合であり；
Ｒ_ｄは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルまたは置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルであり；
ｑ_ａ、ｑ_ｂ、ｑ_ｃおよびｑ_ｄは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルまたは置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アミノアルキルまたは置換Ｃ_１〜Ｃ_６アミノアルキルである）。

【0219】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは次式を有する：

【化5】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ_ａおよびＴ_ｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持体との共有結合であり；
ｑ_ａ、ｑ_ｂ、ｑ_ｅおよびｑ_ｆは、各々独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、ＯＪ_ｊ、ＳＪ_ｊ、ＳＯＪ_ｊ、Ｓ０_２Ｊ_ｊ、ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ_３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ_ｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ_ｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ_ｊＪ_ｋであり；
あるいはｑ_ｅおよびｑ_ｆは、一緒に、＝Ｃ（ｑ_ｇ）（ｑ_ｈ）であり；
ｑ_ｇおよびｑ_ｈは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルまたは置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルである）。

【0220】

４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’架橋を有するアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシル二環式ヌクレオシドの合成および調製は、それらのオリゴマー化、そして核酸認識特性とともに、記載されている（Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630）。二環式ヌクレオシドの合成は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６にも記載されている。

【0221】

４’−２’架橋基、例えば４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’および４’−ＣＨ_２−Ｓ−２’を有する種々の二環式ヌクレオシドの類似体も、調製されている（Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 1998, 8, 2219-2222）。核酸ポリメラーゼのための基質として用いるための二環式ヌクレオシドを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖の調製も、記載されている（Wengel等；ＷＯ９９／１４２２６）。さらに、２’−アミノ−ＢＮＡ（新規立体配座制限高親和性オリゴヌクレオチド類似体）の合成は、当該技術分野で記載されている(Singh et al., J Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039)。さらに、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＢＮＡが調製されており、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ鎖を有するそれらの二重鎖の熱安定性が、以前に報告されている。

【0222】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、次式を有する：

【化6】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ_ａおよびＴ_ｂは、各々独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持体との共有結合であり；
ｑ_ｉ、ｑ_ｊ、ｑ_ｋおよびｑ_ｌは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシル、ＯＪ_ｊ、ＳＪ_ｊ、ＳＯＪ_ｊ、ＳＯ_２Ｊ_ｊ、ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ_３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ_ｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ_ｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ_ｊＪ_ｋであり；そして
ｑ_ｉおよびｑ_ｊ又はｑｌおよびｑｋは、一緒に、＝Ｃ（ｑ_ｇ）（ｑ_ｈ）であり（ここで、ｑ_ｇおよびｑ_ｈは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルまたは置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルである）。

【0223】

４’−（ＣＨ_２）_３−２’架橋、およびアルケニル類似体架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−２’を有する１つの炭素環式二環式ヌクレオシドが記載されている（Frier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443およびAlbaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740）。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成および調製も、それらのオリゴマー化および生化学的研究とともに記載されている(Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379)。

【0224】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドとしては、以下で示されるような、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（束縛エチルまたはｃＥｃとしても言及される）、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ_２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−２’）ＢＮＡ、（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ_２）_３−２’）ＢＮＡおよび（Ｋ）ビニルＢＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【化7】

（式中、Ｂｘは、塩基部分であり；そしてＲは、独立して、Ｈ、保護基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルまたはＣ_１〜Ｃ_６アルコキシである）。

【0225】

ある実施形態では、ヌクレオシドは、リボシル環を糖代替物と置き換えることにより、修飾される。このような修飾としては、代替環系（時として、ＤＮＡ類似体として言及される）、例えばモルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロヘキシル環またはテトラヒドロピラニル環、例えば次式のうちの１つを有するものによるリボシル環の置換が挙げられるが、これらに限定されない：

【化8】

【0226】

ある実施形態では、糖代替物は、次式を有するものが選択される：

【化9】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ_３およびＴ_４は、各々独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をオリゴマー化合物と連結するヌクレオシド間結合基であり、あるいはＴ_３およびＴ_４のうちの一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をオリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチドと連結するヌクレオシド間結合基であり、Ｔ_３およびＴ_４のうちの他方は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結共役基または５’もしくは３’−末端基であり；
ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６およびｑ_７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルまたは置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルであり；そして
Ｒ_１およびＲ_２の一方は水素であり、他方は、ハロゲン、置換または非置換アルコキシ、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_ｌ、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２、ＮＪ_３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２およびＣＮ（ここで、ＸはＯ、ＳまたはＮＪ_１であり、Ｊ_ｌ、Ｊ_２およびＪ_３は、各々独立して、ＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される）。

【0227】

ある実施形態では、ｑ_ｌ、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６およびｑ_７は、各々、Ｈである。ある実施形態では、ｑ_ｌ、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６およびｑ_７のうちの少なくとも１つは、Ｈ以外である。ある実施形態では、ｑ_ｌ、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６およびｑ_７のうちの少なくとも１つは、メチルである。ある実施形態では、Ｒ_１およびＲ_２のうちの一方がＦであるＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある実施形態では、Ｒ_１はフルオロであり、Ｒ_２はＨであり；Ｒ_１はメトキシであり、Ｒ_２はＨであり、そしてＲ_１はメトキシエトキシであり、Ｒ_２はＨである。

【0228】

このような糖代替物としては、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）およびマンニトール核酸（ＭＮＡ）（Leumann,C. J.,Bioorg. & Med. Chem.,2002,10, 841-854参照）として当該技術分野で言及されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0229】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、１つ以上の修飾シクロヘキセニルヌクレオシドを含むが、これは、天然ヌクレオシドにおけるペントフラノシル残基の代わりに６員シクロヘキセニルを有するヌクレオシドである。修飾シクロヘキセニルヌクレオシドとしては、当該技術分野で記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、所有者が共通する、公開済みのＰＣＴ出願 ＷＯ２０１０／０３６６９６（２０１０年４月１０日公開）、Robeyns et al, J. Am. Chem. Soc, 2008, 130(6), 1979-1984; Horvath et al, Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al, Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographies Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al, J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al, J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al, J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602;公開ＰＣＴ出願 ＷＯ０６／０４７８４２；および公開ＰＣＴ出願 ＷＯ０１／０４９６８７参照；これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）。ある修飾シクロヘキセニルヌクレオシドは、次式を有する：

【化10】

（式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ_３およびＴ_４は、各々独立して、シクロヘキセニルヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物と連結するヌクレオシド間結合基であり、あるいはＴ_３およびＴ_４のうちの一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物と連結するヌクレオシド間結合基であり、Ｔ_３およびＴ_４のうちの他方は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結共役基または５’もしくは３’−末端基であり；そして
ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６、ｑ_７、ｑ_８およびｑ_９は、各々独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルまたは他の糖置換基である）。

【0230】

また、アンチセンス化合物中に組入れヌクレオシドを修飾するのに用いることができる多数の他の二環式および三環式糖代替環系が、当該技術分野で既知である（例えば、総説：Leumann, Christian J., Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854参照）。このような環系は、活性を増強するために種々の付加的置換を経る。

【0231】

修飾糖の調製方法は、当業者に周知である。このような修飾糖の調製を教示するいくつかの代表的米国特許としては、米国特許：第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第
５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６７０，６３３号；第５，７００，９２０号；第５，７９２，８４７号および第６，６００，０３２号、ならびに国際出願 ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１９２１９（２００５年６月２日出願、ならびにＷＯ２００５／１２１３７１として２００５年１２月２２日に公開）（これらの記載内容は各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0232】

修飾糖部分を有するヌクレオチドでは、核酸塩基部分（天然、修飾またはその組合せ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために保持される。

【0233】

ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物は、修飾糖部分を有する１つ以上のヌクレオチドを含む。ある実施形態では、修飾糖部分は２’−ＭＯＥである。ある実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフ中に配列される。
修飾核酸塩基

【0234】

核酸塩基（または塩基）修飾または置換は、天然または合成非修飾核酸塩基と、構造的に区別可能であるが、機能的には互換性がある。天然および修飾核酸塩基はともに、水素結合に関与し得る。このような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつかのその他の有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与し得る。修飾核酸塩基としては、合成および天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）が挙げられる。ある核酸塩基置換、例えば５−メチルシトシン置換は、標的核酸へのアンチセンス化合物の結合親和性を増大するために特に有用である。例えば、５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増大することが示されている（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）。

【0235】

さらなる非修飾核酸塩基としては、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基のその他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。

【0236】

複素環式塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２ピリドンで置き換えられているものも包含し得る。アンチセンス化合物の結合親和性を増大するために特に有用である核酸塩基としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。

【0237】

ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるギャップ拡大アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである。ある実施形態では、各シトシンは５−メチルシトシンである。

【0238】

組成物および薬学的組成物の処方方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物または処方物の調製のために、製薬上許容可能な活性または不活性物質と混合され得る。薬学的組成物の処方のための組成物および方法は、多数の判定基準、例えば投与経路、疾患の程度または投与されるべき用量によって決まるが、これらに限定されない。

【0239】

ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を適切な製薬上許容可能な希釈剤または担体と組合せることにより、薬学的組成物中で利用され得る。製薬上許容可能な希釈剤としては、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。ＰＢＳは、非経口的に送達されるべき組成物中で用いるのに適した希釈剤である。したがって、一実施形態では、本明細書中に記載される方法に用いられるのは、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物および製薬上許容可能な希釈剤を含む薬学的組成物である。ある実施形態では、製薬上許容可能な希釈剤はＰＢＳである。ある実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0240】

アンチセンス化合物を含む薬学的組成物は、動物、例えばヒトへの投与時に、生物学的に活性な代謝産物またはその残留物を（直接または間接的に）提供し得る任意のその製薬上許容可能な塩、エステルもしくはこのようなエステルの塩、またはその他のオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、例えば本開示は、アンチセンス化合物の製薬上許容可能な塩、プロドラッグ、このようなプロドラッグの製薬上許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物に対しても作成される。適切な製薬上許容可能な塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【0241】

プロドラッグは、活性アンチセンス化合物を生成するための、身体内の内因性ヌクレアーゼにより切断されるアンチセンス化合物の一端または両端での付加的ヌクレオシドの組入れを包含し得る。

【0242】

共役アンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、結果的に生じるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つ以上の部分または共役体と共有結合し得る。典型的共役基としては、コレステロール部分および脂質部分が挙げられる。さらなる共役基としては、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられる。

【0243】

アンチセンス化合物は、一般的にアンチセンス化合物の一端または両端に結合して、例えば、ヌクレアーゼ安定性といったような特性を増強する１つ以上の安定化基を有するようにも修飾され得る。安定化基に含まれるのは、キャップ構造である。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物がエキソヌクレアーゼ分解されるのを防ぎ、そして細胞内の送達および／または局在化を手助けし得る。キャップは、５’−末端（５’−キャップ）または３’−末端（３’−キャップ）に存在し得るか、あるいは両方の末端に存在し得る。キャップ構造は、当該技術分野で周知であり、例としては、逆位デオキシ脱塩基キャップが挙げられる。さらに、ヌクレアーゼ安定性を付与するためにアンチセンス化合物の一端または両端をキャップするために用いられ得る３’および５’−安定化基としては、ＷＯ０３／００４６０２（２００３年１月１６日公開）に開示されたものが挙げられる。

【0244】

細胞培養およびアンチセンス化合物処置
ＤＭＰＫ核酸のレベル、活性または発現に及ぼすアンチセンス化合物の作用は、種々の細胞型においてin vitroで試験され得る。このような分析に用いられる細胞型は、商業的供給業者（例えば、American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD）から入手可能であり、細胞は、供給業者の使用説明書に従って、市販の試薬（例えばInvitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて培養される。細胞型の例としては、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、初代培養肝細胞、Ａ５４９細胞、ＧＭ０４２８１繊維芽細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0245】

アンチオリゴヌクレオチドのin vitro試験
アンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処置するための方法が本明細書中に記載されるが、これは、他のアンチセンス化合物による処置のために適切に変更され得る。

【0246】

概して、細胞が培養液中で約６０〜８０％コンフルエントに達すると、細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置される。

【0247】

培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために一般に用いられる一試薬としては、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬 リポフェクチン（登録商標）(Invitrogen, Carlsbad, CA)が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１(Invitrogen, Carlsbad, CA)中のリポフェクチン（登録商標）と混合されて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度、ならびに典型的には２〜１２μｇ／ｍＬ／１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドの範囲であるリポフェクチン（登録商標）濃度を達成する。

【0248】

培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために用いられる別の試薬としては、リポフェクタミン２０００（登録商標）(Invitrogen, Carlsbad, CA)が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低減血清培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中のリポフェクタミン２０００（登録商標）と混合されて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度、ならびに典型的には２〜１２μｇ／ｍＬ／１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドの範囲であるリポフェクタミン（登録商標）濃度を達成する。

【0249】

培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために用いられる別の試薬としては、サイトフェクチン（登録商標）(Invitrogen, Carlsbad, CA)が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低減血清培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)中のサイトフェクチン（登録商標）と混合されて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度、ならびに典型的には２〜１２μｇ／ｍＬ／１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドの範囲であるサイトフェクチン（登録商標）濃度を達成する。

【0250】

培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために用いられる別の技法としては、電気穿孔が挙げられる。

【0251】

細胞は、慣例的方法でアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置される。細胞は、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置の１６〜２４時間後に収穫され、その時点で、標的核酸のＲＮＡまたはタンパク質レベルが、当該技術分野で既知の、そして本明細書中に記載される方法により測定される。概して、処置が多重反復実験で実施される場合、データは反復処置の平均として示される。

【0252】

用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株によって変化する。特定細胞株のための最適アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定するための方法は、当該技術分野で周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクタミン２０００（登録商標）、リポフェクチンまたはサイトフェクチンでトランスフェクトされる場合、典型的には１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、電気穿孔を用いてトランスフェクトされる場合、６２５〜２０，０００ｎＭの範囲のより高い濃度で用いられる。

【0253】

ＲＮＡ単離
ＲＮＡ解析は、総細胞内ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して実施され得る。ＲＮＡ単離の方法は、当該技術分野で周知である。ＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法を用いて、例えばメーカーの推奨プロトコールに従って、トリゾール（登録商標）試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて調製される。

【0254】

標的レベルまたは発現の抑制の分析
ＤＭＰＫ核酸のレベルまたは発現の抑制は、当該技術分野で既知の種々の方法で検定され得る。例えば、標的核酸レベルは、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または定量的実時間ＰＣＲにより定量され得る。ＲＮＡ解析は、総細胞内ＲＮＡまたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して実施され得る。ＲＮＡ単離の方法は、当該技術分野で周知である。ノーザンブロット分析も、当該技術分野で慣例的である。定量的実時間ＰＣＲは、メーカーの使用説明書に従って用いられる市販のＡＢＩ プリズム（登録商標）７６００、７７００または７９００配列検出系（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて、好都合に成し遂げられ得る。

【0255】

標的ＲＮＡレベルの定量的実時間ＰＣＲ解析
標的ＲＮＡレベルの定量は、メーカーの使用説明書に従って、ＡＢＩプリズム（登録商標）７６００、７７００または７９００配列検出系(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、定量的実時間ＰＣＲにより成し遂げられ得る。定量的実時間ＰＣＲの方法は、当該技術分野で周知である。

【0256】

実時間ＰＣＲの前に、単離ＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）反応に付され、これは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生じ、次いでこれは、実時間ＰＣＲ増幅のための基質として用いられる。ＲＴおよび実時間ＰＣＲ反応は、同一試料ウェル中で順次的に実施される。ＲＴおよび実時間ＰＣＲ試薬は、Invitrogen (Carlsbad, CA)から得られる。ＲＴ、実時間ＰＣＲ反応は、当業者に周知の方法により実行される。

【0257】

実時間ＰＣＲにより得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的量は、その発現が一定である遺伝子、例えばシクロフィリンＡの発現レベルを用いることにより、またはリボグリーン（登録商標）(Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA)を用いて総ＲＮＡを定量することにより、正規化される。シクロフィリンＡ発現は、実時間ＰＣＲにより、標的と同時に、多重的に、または別々に実行することにより、定量される。総ＲＮＡは、リボグリーン（登録商標）ＲＮＡ定量試薬(Invitrogen, Inc. Eugene,OR)を用いて定量される。リボグリーン（登録商標）によるＲＮＡ定量の方法は、Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)で教示されている。サイトフルオール（登録商標）４０００計器(PE Applied Biosystems)は、リボグリーン（登録商標）蛍光を測定するために用いられる。

【0258】

プローブおよびプライマーは、ＤＭＰＫ核酸とハイブリダイズするよう設計される。実時間ＰＣＲプローブおよびプライマーの設計方法は当該技術分野で周知であり、プライマーエキスプレス（登録商標）ソフトウェア(Applied Biosystems, Foster City, CA)のようなソフトウェアの使用を包含し得る。

【0259】

タンパク質レベルの解析
ＤＭＰＫ核酸のアンチセンス抑制は、ＤＭＰＫタンパク質レベルを測定することにより査定され得る。ＤＭＰＫのタンパク質レベルは、当該技術分野で周知の種々の方法で、例えば免疫沈降、ウエスタンブロット解析（免疫ブロッティング）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質検定、タンパク質活性検定(例えば、カスパーゼ活性検定)、免疫組織化学法、免疫細胞化学法または蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）で評価されるかまたは定量され得る。標的に対する抗体は、同定され、種々の供給元、例えば抗体のＭＳＲＳカタログ(Aerie Corporation, Birmingham, MI)から入手されるか、あるいは当該技術分野で周知の慣用的モノクローナルまたはポリクローナル抗体産生方法により調製され得る。

【0260】

アンチセンス化合物のin vivo試験
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＭＰＫの発現を抑制し、表現型変化を生じるそれらの能力を査定するために、動物において試験される。試験は、正常動物で、または実験的疾患モデル、例えば筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）のＨＳＡ^ＬＲマウスモデルで実施され得る。

【0261】

ＨＳＡ^ＬＲマウスモデルは、ＤＭ１に関して確立されたモデルである(Mankodi, A. et al. Science. 289: 1769, 2000)。そのマウスは、遺伝子の３’ＵＴＲ中に挿入された２２０ＣＴＧ反復を有するヒト骨格アクチン（ｈＡＣＴＡ１）導入遺伝子を保有する。ｈＡＣＴＡｌ−ＣＵＧｅｘｐ転写産物は、骨格筋の核内フォーカス中に蓄積し、ヒトＤＭ１の場合と同様の筋緊張症を生じる(Mankodi, A. et al. Mol. Cell 10: 35, 2002; Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006)。それゆえ、ｈＡＣＴＡ１導入遺伝子のアンチセンス抑制によるＨＳＡ^ＬＲマウスにおけるＤＭ１症候の改善が、ＤＭＰＫ転写産物のアンチセンス抑制によるヒト患者の同様の症候の改善を予測すると予期される。

【0262】

マウスにおけるＣＵＧ^ｅｘｐＲＮＡの発現は、筋肉トランスクリプトームの広範なリモデリングを引き起こし、その多くは、ＭＢＮＬ１の消失により再生される。それゆえ、ＨＳＡ^ＬＲマウスにおけるトランスクリプトームの正規化が、ＤＭＰＫ転写産物のアンチセンス抑圧によるＤＭ１患者におけるヒトトランスクリプトームの正規化を予測すると予期される。

【0263】

動物への投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製薬上許容可能な希釈剤、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水中に処方される。投与は、非経口経路の投与を包含する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置期間後、ＲＮＡは組織から単離され、ＤＭＰＫ核酸発現における変化が測定される。ＤＭＰＫタンパク質レベルの変化も測定される。

【0264】

スプライシング
筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧ反復伸長により引き起こされる(Brook, J.D. et al. Cell. 68: 799, 1992)。この突然変異は、伸長ＣＵＧ反復（ＣＵＧｅｘｐ）を含有するＲＮＡの発現が細胞機能不全を誘導する過程であるＲＮＡ優性をもたらす(Osborne RJ and Thornton CA., Human Molecular Genetics., 2006, 75(2): R162-R169)。このようなＣＵＧｅｘｐは、骨格筋の核内フォーカス中に保持される(Davis, B.M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:7388, 1997)。核内フォーカス中のＣＵＧｅｘｐの蓄積は、ポリ（ＣＵＧ）結合タンパク質、例えばMuscleblind様１（ＭＢＮＬ１）の隔離をもたらす(Miller, J. W. et al. EMBO J. 19: 4439, 2000)。ＭＢＬＮ１は、スプライシング因子であり、Ｓｅｒｃａ1、ＣＩＣ−１、ＴｉｔｉｎおよびＺａｓｐのような遺伝子のスプライシングを調節する。したがって、ＣＵＧｅｘｐによるＭＢＬＮ１の隔離は、ＭＢＬＮ１が通常制御する遺伝子のエキソンの誤調節的選択的スプライシングを誘発する(Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006)。このような無調節を表示する動物における、例えばＤＭ１患者およびＨＳＡＬＲマウスモデルにおける選択的スプライシングの補正は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置を含めて、処置の効力に関する有用な指標である。

【0265】

バイオマーカー例
マウスモデルにおけるＤＭ１重症度は、少なくとも一部は、核または核内フォーカス中のＣＵＧ^ｅｘｐ転写産物蓄積のレベルにより決定される。ＤＭ１重症度に関する有用な生理学的マーカーは、不随意性活動電位の高頻度実行の発症（筋緊張症）である。
指標例

【0266】

ある実施形態では、本明細書中に記載されるような１つ以上の薬学的組成物を投与することを包含する個体の処置方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、個体は、１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）を有する。

【0267】

したがって、処置を必要とする対象における１型筋緊張性ジストロフィーに関連した症候を改善するための方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、１型筋緊張性ジストロフィーに関連した症候の開始の比率を低減するための方法が提供される。ある実施形態では、１型筋緊張性ジストロフィーに関連した症候の重症度を低減するための方法が提供される。ある実施形態では、ＤＭ１に関連した症候としては、筋肉強直、筋緊張症、障害性遠位性衰弱、顔面および顎筋肉の衰弱、嚥下困難、眼瞼の垂れ下がり（眼瞼下垂）、首の筋肉の衰弱、腕および足の筋肉の衰弱、持続性筋肉痛、過眠症、筋消耗、嚥下障害、呼吸不全、不規則心拍、心筋損傷、無感動、インスリン抵抗性および白内障が挙げられる。小児においては、症候は、発達遅延、学習問題、言語および発語問題、ならびに人格発達問題でもあり得る。

【0268】

ある実施形態では、当該方法は、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化される治療的有効量の化合物を、それを必要とする個体に投与することを包含する。

【0269】

ある実施形態では、ＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンス化合物の投与は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９９％、またはこれらの値の任意の２つにより限定される範囲のＤＭＰＫ発現の低減を生じる。

【0270】

ある実施形態では、ＤＭＰＫに対して標的化されるアンチセンス化合物を含む薬学的組成物は、１型筋緊張性ジストロフィーに罹患しているかまたは罹患し易い患者のための医薬剤の調製のために用いられる。

【0271】

ある実施形態では、本明細書中に記載される方法は、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２で挙げられる配列の本明細書中に記載されるような連続核酸塩基部分を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する。

【0272】

投与
ある実施形態では、本明細書中に記載されるような化合物および組成物は、非経口的に投与される。

【0273】

ある実施形態では、非経口投与は、注入によるものである。注入は、長期的または連続的または短期的または間欠的であり得る。ある実施形態では、注入された薬学的作用物質は、ポンプで送達される。ある実施形態では、非経口投与は、注射（例えばボーラス注射）によるものである。注射は、注射器で送達され得る。

【0274】

非経口投与としては、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与または頭蓋内投与、例えばくも膜下腔内投与もしくは脳室内投与が挙げられる。投与は、連続的、または長期的または短期的、または間欠的であり得る。

【0275】

ある実施形態では、投与することは、皮下、静脈内、脳内、脳室内、くも膜下腔内、もしくはオリゴヌクレオチドの全身作用を生じる別の投与（全身投与は、全身作用、すなわち、１つ超の組織中での作用を特徴とする)、またはＣＮＳまたはＣＳＦへの送達である。

【0276】

ＤＭ１のＨＳＡ^ＬＲマウスモデルにおいてアルファ１アクチンの抑制および筋緊張症の低減により測定した場合の作用の持続時間は、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋を含めた筋組織において延長される（下記実施例参照）。アンチセンスオリゴヌクレオチドの４週間の皮下注射は、用量投与の終了後、少なくとも１１週（７７日）の間、ＨＳＡ^ＬＲマウスにおける四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋において、少なくとも７０％のアルファ１アクチンの抑制を生じる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの４週間の皮下注射は、用量投与の終了後、少なくとも１１週（７７日）の間、ＨＳＡ^ＬＲマウスにおける四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋において、筋緊張症の消失を生じる。

【0277】

ある実施形態では、本明細書中に記載されるような化合物または組成物の送達は、少なくとも７７日間、標的ｍＲＮＡおよび／または標的タンパク質の少なくとも７０％下方調節を生じる。ある実施形態では、本明細書中に記載されるような化合物または組成物の送達は、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも７６日、少なくとも７７日、少なくとも７８日、少なくとも７９日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、少なくとも１００日、少なくとも１０５日、少なくとも１１０日、少なくとも１１５日、少なくとも１２０日、少なくとも１年の間の、標的ｍＲＮＡおよび／または標的タンパク質の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％下方調節を生じる。

【0278】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７７日毎に１回、注射または注入により送達される。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、年２回または年１回、注射または注入により送達される。
併用療法例

【0279】

ある実施形態では、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む第一作用物質は、１つ以上の第二作用物質と同時投与される。ある実施形態では、このような第二作用物質は、本明細書中に記載される第一作用物質と同一の１型筋緊張性ジストロフィーを処置するよう設計される。ある実施形態では、このような第二作用物質は、本明細書中に記載される第一作用物質とは異なる疾患、障害または症状を処置するよう設計される。ある実施形態では、このような第二作用物質は、本明細書中に記載されるような１つ以上の薬学的組成物の望ましくない副作用を処置するよう設計される。ある実施形態では、第二作用物質は、第一作用物質の望ましくない作用を処置するために第一作用物質と同時投与される。ある実施形態では、第二作用物質は、組合せ作用を生じるために第一作用物質と同時投与される。ある実施形態では、第二作用物質は、相乗作用を生じるために第一作用物質と同時投与される。

【0280】

ある実施形態では、第一作用物質および１つ以上の第二作用物質は、同一時間に投与される。ある実施形態では、第一作用物質および１つ以上の第二作用物質は、異なる時間に投与される。ある実施形態では、第一作用物質および１つ以上の第二作用物質は、単一薬学的処方物中で一緒に調製される。ある実施形態では、第一作用物質および１つ以上の第二作用物質は、別々に調製される。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する方法であって、以下の：
ａ． １型筋緊張性ジストロフィーを有するか、またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有する対象を選択すること；そして
ｂ． 前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に投与すること
（ここで、前記化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、リボヌクレアーゼを活性化し、それにより前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する）
を包含する方法。
［態様２］ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する方法であって、以下の：
ａ． １型筋緊張性ジストロフィーを有するか、またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有する対象を選択すること；そして
ｂ． 前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に全身投与すること
（ここで、前記化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する）
を包含する方法。
［態様３］ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する方法であって、以下の：
前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、１型筋緊張性ジストロフィーを有すること、またはＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有することが疑われる対象に投与すること
（ここで、前記化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、前記ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの優先的低減を達成する）
を包含する方法。
［態様４］１型筋緊張性ジストロフィーを有すること、または核内保持ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有することが疑われる対象における筋緊張症の低減方法であって、以下の：
前記ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な化学的修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に投与すること
（ここで、前記化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、リボヌクレアーゼを活性化して、それにより筋緊張症を低減する）
を包含する方法。
［態様５］１型筋緊張性ジストロフィーを有すること、または核内保持ＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを有することが疑われる対象におけるスプライセオパシーの低減方法であって、以下の：
突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域と相補的な化学的修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを前記対象に投与すること
（ここで、前記化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡと結合されると、リボヌクレアーゼを活性化して、それによりスプライセオパシーを低減する）
を包含する方法。
［態様６］前記スプライセオパシーがＭＢＮＬ依存性スプライセオパシーである態様５記載の方法。
［態様７］前記オリゴヌクレオチドがキメラである前記態様のいずれかに記載の方法。
［態様８］前記オリゴヌクレオチドがギャップマーである態様７記載の方法。
［態様９］前記投与が皮下投与である態様１〜８のいずれか一に記載の方法。
［態様１０］前記投与が静脈内投与である態様１〜８のいずれか一に記載の方法。
［態様１１］前記ギャップマーオリゴヌクレオチドが突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡの非反復領域内の非コード配列を標的にする態様８記載の方法。
［態様１２］前記ギャップマーオリゴヌクレオチドが突然変異体ＤＭＰＫ ＲＮＡのコード配列、イントロン、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを標的にする態様８記載の方法。
［態様１３］前記リボヌクレアーゼがＲＮアーゼＨ１である前記態様のいずれかに記載の方法。
［態様１４］前記優先的低減が筋肉組織においてである態様１〜３のいずれかに記載の方法。
［態様１５］動物におけるＤＭＰＫ発現の低減方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化された１０〜３０連結ヌクレオシド長の修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与すること（ここで、ＤＭＰＫの発現は動物において低減される）を包含する方法。
［態様１６］動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減し、筋緊張症を低減し、またはスプライセオパシーを低減する方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化された１０〜３０連結ヌクレオシド長の修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与すること（ここで、修飾オリゴヌクレオチドは、動物におけるＤＭＰＫ発現を低減し、それにより動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減するか、筋緊張症を低減するかまたはスプライセオパシーを低減する）を包含する方法。
［態様１７］１型筋緊張性ジストロフィーを有する動物の処置方法であって、以下の：
ａ． １型筋緊張性ジストロフィーを有する前記動物を同定すること；そして
ｂ． ＤＭＰＫに対して標的化される１０〜３０連結ヌクレオシド長の修飾オリゴヌクレオチドを含む治療有効量の化合物を前記対象に投与すること
（ここで、１型筋緊張性ジストロフィーを有する前記動物が処置される）
を包含する方法。
［態様１８］ＤＭＰＫ発現の低減方法であって、１０〜３０連結ヌクレオシド長からなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に亘って測定した場合に、配列番号１〜８または７９３〜８０１と少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する化合物を動物に投与する（ここで、ＤＭＰＫの発現が低減される）ことを包含する方法。
［態様１９］ＤＭＰＫ発現を低減することが、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減するか、筋緊張症を低減するかまたはスプライセオパシーを低減する態様１８記載の方法。
［態様２０］動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減するか、筋緊張症を低減するかまたはスプライセオパシーを低減する方法であって、テトラトリコペプチド反復ドメイン３９Ｂの発現を低減する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与すること(ここで、修飾オリゴヌクレオチドは、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に亘って測定した場合に、配列番号１〜８または７９３〜８０１と少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する１０〜３０連結ヌクレオシドからなり、そしてＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡの前記低減は、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減するか、筋緊張症を低減するかまたはスプライセオパシーを低減する）ことを包含する方法。
［態様２１］１型筋緊張性ジストロフィーを有する動物の処置方法であって、以下の：
ｃ． １型筋緊張性ジストロフィーを有する前記動物を同定すること；そして
ｄ． １０〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に亘って測定した場合に、配列番号１〜８または７９３〜８０１と少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する治療的有効量の化合物を前記動物に投与すること
（ここで、１型筋緊張性ジストロフィーを有する前記動物が処置される）
を包含する方法。
［態様２２］動物に投与された治療的有効量の化合物が、動物におけるＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫ ＲＮＡを優先的に低減するか、筋緊張症を低減するかまたはスプライセオパシーを低減する態様２１記載の方法。
［態様２３］前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる配列の少なくとも８連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する態様１５〜２２のいずれか一に記載の方法。
［態様２４］前記動物がヒトである態様１５〜２３のいずれか一に記載の方法。
［態様２５］前記化合物が第一作用物質である態様１５〜２４のいずれか一に記載の方法であって、第二作用物質を投与することをさらに包含する方法。
［態様２６］前記第一作用物質および第二作用物質が同時投与される態様２５記載の方法。
［態様２７］投与が非経口投与を包含する態様１５〜２４のいずれか一に記載の方法。
［態様２８］前記化合物が一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる態様１５〜２７のいずれか一に記載の方法。
［態様２９］前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に亘って測定した場合に配列番号１〜８または７９３〜８０１のいずれか１つと少なくとも９５％相補的である態様１５〜２８のいずれか一に記載の方法。
［態様３０］前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に亘って測定した場合に配列番号１〜８または７９３〜８０１のいずれか１つと１００％相補的である態様１５〜２８のいずれか一に記載の方法。
［態様３１］前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である態様１５〜３０のいずれか一に記載の方法。
［態様３２］各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である態様３１記載の方法。
［態様３３］前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む態様１５〜３２のいずれか一に記載の方法。
［態様３４］少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である態様３３記載の方法。
［態様３５］少なくとも１つの修飾糖が２’−Ｏ−メトキシエチルまたは４’−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１または２である）を含む態様３３記載の方法。
［態様３６］前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む態様１５〜３５のいずれか一に記載の方法。
［態様３７］前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである態様３６記載の方法。
［態様３８］前記修飾オリゴヌクレオチドが、以下の：
ａ． 連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ． 連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
ｃ． 連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様１５〜３７のいずれか一に記載の方法であって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、そして各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む方法。
［態様３９］前記修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなり、そして以下の：
ａ． １０の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
ｂ． ５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
ｃ． ５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様１５〜３８のいずれか一に記載の方法であって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、そして前記修飾オリゴヌクレオチド中の各シトシンが５’−メチルシトシンである方法。
［態様４０］前記修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなる態様１５〜３９のいずれか一に記載の方法。
［態様４１］１０〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、そして配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２で挙げられる配列の少なくとも８連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する化合物。
［態様４２］前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである態様４１記載の化合物。
［態様４３］前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１〜８または７９３〜８０１と１００％相補的である態様４１または態様４２記載の化合物。
［態様４４］少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である態様４１〜４３のいずれかに記載の化合物。
［態様４５］各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である態様４４記載の化合物。
［態様４６］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む態様４１〜４５のいずれかに記載の化合物。
［態様４７］少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である態様４６記載の化合物。
［態様４８］少なくとも１つの修飾糖が２’−Ｏ−メトキシエチルを含む態様４６記載の化合物。
［態様４９］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む態様４１〜４８のいずれかに記載の化合物。
［態様５０］前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである態様４９記載の化合物。
［態様５１］前記修飾オリゴヌクレオチドが、以下の：
連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様４１〜５０のいずれかに記載の化合物であって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、そして各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む化合物。
［態様５２］前記修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなり、そして以下の：
１０の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様４１〜５１のいずれかに記載の化合物であって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、そして各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である化合物。
［態様５３］前記修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなる態様４１〜５２のいずれかに記載の化合物。
［態様５４］１０〜３０連結ヌクレオシドからなり、そして配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２のいずれか１つで挙げられる配列から選択される核酸塩基配列の少なくとも８連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドまたはその塩並びに製薬上許容可能な担体または希釈剤を含む組成物。
［態様５５］前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである態様５４記載の組成物。
［態様５６］前記修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなる態様５４または態様５５記載の組成物。
［態様５７］１２〜３０連結ヌクレオシドからなり、そして配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２で挙げられる核酸塩基配列の中から選択される核酸塩基配列の少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様５８］一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる態様５７記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様５９］前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１〜８または７９３〜８０１と１００％相補的である態様５７または態様５８記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６０］少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である態様５７〜５９のいずれかに記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６１］各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である態様６０記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６２］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む態様５７〜６１のいずれかに記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６３］少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である態様６２記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６４］少なくとも１つの修飾糖が２’−Ｏ−メトキシエチルを含む態様６２記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６５］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む態様５７〜６４のいずれかに記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６６］前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである態様６５記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６７］前記修飾オリゴヌクレオチドが、以下の：
連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様５７〜６６のいずれかに記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、そして各ウィングセグメントの６８の各ヌクレオシドが修飾糖を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６８］前記修飾オリゴヌクレオチドが、以下の：
１０の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様５７〜６７のいずれかに記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各シトシンが５−メチルシトシンであり；そして各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様６９］前記修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなる態様５７〜６８のいずれかに記載の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド。
［態様７０］配列番号１の核酸塩基１１７８−１２０６、２１５９−２１８２、２１７４−２１９６、２４２６−２４４７、２４５０−２５１８、２６７９−２７０４または２６９７−２７２５の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が配列番号１と相補的である化合物。
［態様７１］核酸塩基１７８−２２３、２３２−２５３、２７９−２９９、３６６−３９９、５１９−５４１、９２３−９７５、１０７３−１１０５、１１７１−１１９６、１２１５−１２４６、１２６３−１３２４、１７０６−１７３４、１７４３−１７６３、１９３２−１９７９、１９８１−２００３、２０７７−２１０８または２１５２−２１７３の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が配列番号１と相補的である化合物。
［態様７２］核酸塩基１２５１−１３０３、１３０５−１３２６、１３５２−１３７２、３７６２−３７９５、４１７０−４１９２、５８００−５８５２、６１２４−６１４９、６１６８−６１９９、６２１６−６２７７、１１９７９−１２００７、１２０１６−１２０３６、１２９９３−１３０４２、１３０４４−１３０６６、１３１４０−１３１７１または１３２１５−１３２３６の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が配列番号２と相補的である化合物。
［態様７３］Ｓｅｒｃａ１のスプライセオパシーの低減を、それを必要とする動物において行う方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化される１０〜３０連結ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、それによりＳｅｒｃａ１エキソン２２包含を引き起こすことによる方法。
［態様７４］ｍ−Ｔｉｔｉｎのスプライセオパシーの低減を、それを必要とする動物において行う方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化される１０〜３０連結ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、それによりｍ−Ｔｉｔｉｎエキソン５包含を引き起こすことによる方法。
［態様７５］Ｃｌｃｎ１のスプライセオパシーの低減を、それを必要とする動物において行う方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化される１０〜３０連結ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、それによりＣｌｃｎ１エキソン７ａ包含を引き起こすことによる方法。
［態様７６］Ｚａｓｐのスプライセオパシーの低減を、それを必要とする動物において行う方法であって、ＤＭＰＫに対して標的化される１０〜３０連結ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与し、それによりＺａｓｐエキソン１１包含を引き起こすことによる方法。
［態様７７］配列番号１２−１５６、１６０−７７０および７７４−７９２の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
［態様７８］配列番号４１、４４、７６、１０９、１５３、３２０、３２１、３２２、３２５、３２９、３３５および６５７の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
［態様７９］配列番号１５、７３、７７、７９、８３、８５、１３０、６０２、６４８、６５５、６７４および６８０の核酸塩基配列のいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
［態様８０］配列番号１の核酸塩基６６４−６８３、７７３−７９２、９２６−９４５、９２７−９４６、９２８−９４７、９３１−９５０、９３５−９５４、９４１−９６０、２０８９−２１０８、２１６３−２１８２、２４９０−２５０９、２４９９−２５１８、２６７６−２６９５、２６８５−２７０４、２６７６−２６９５、２６８８−２７０７、２６９７−２７１６、２７６４−２７８３および２７７０−２７８９の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記核酸塩基配列が配列番号１と相補的である化合物。
［態様８１］配列番号２の核酸塩基８１２−８３１、３６２９−３６４８、４４４７−４４６６、４６１３−４６３２、５８０３−５８２２、５８０４−５８２３、５８０５−５８２４、５８０８−５８２７、５８１８−５８３７、６７９４−６８１３、１２４６３−１２４８２、１３１５２−１３１７１および１３５５３−１３５７２の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記核酸塩基配列が配列番号２と相補的である化合物。
［態様８２］前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである態様７７〜８１記載の化合物。
［態様８３］前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１〜８または７９３〜８０１と１００％相補的である態様７７〜８２のいずれかに記載の化合物。
［態様８４］少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である態様７７〜８３のいずれかに記載の化合物。
［態様８５］各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である態様８４記載の化合物。
［態様８６］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む態様７７〜８５のいずれかに記載の化合物。
［態様８７］少なくとも１つの修飾糖が二環式糖である態様８６記載の化合物。
［態様８８］少なくとも１つの修飾糖が２’−Ｏ−メトキシエチルを含む態様８６記載の化合物。
［態様８９］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む態様７７〜８８のいずれかに記載の化合物。
［態様９０］前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである態様８９記載の化合物。
［態様９１］前記修飾オリゴヌクレオチドが、以下の：
連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様７７〜９０記載の化合物であって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、そして各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む化合物。
［態様９２］前記修飾オリゴヌクレオチドが、以下の：
１０の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
５つの連結ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント
を含む態様７７〜９１のいずれかに記載の化合物であって、前記ギャップセグメントが５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメント間に配置され、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、そして各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である化合物。
［態様９３］前記修飾オリゴヌクレオチドが１４連結ヌクレオシドからなる態様７７〜９２のいずれかに記載の化合物。
［態様９４］前記修飾オリゴヌクレオチドが１６連結ヌクレオシドからなる態様７７〜９３のいずれかに記載の化合物。
［態様９５］前記修飾オリゴヌクレオチドが２０連結ヌクレオシドからなる態様７７〜９４のいずれかに記載の化合物。
［態様９６］態様４１〜５３、５７〜７２および７７〜９５のいずれか一に記載の化合物を含む薬学的組成物。
［態様９７］動物におけるＤＭ１の処置方法であって、それを必要とする動物に、態様４１〜５３、５７〜７２および７７〜９５のいずれかに記載の化合物、または態様５４〜５６および９６のいずれか一に記載の組成物を投与することを包含する方法。
［態様９８］動物におけるＤＭ１の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法。
［態様９９］動物におけるＤＭ１の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号４１、４４、７６、１０９、１５３、３２０、３２１、３２２、３２５、３２９、３３５および６５７の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法。
［態様１００］動物におけるＤＭ１の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号１５、７３、７７、７９、８３、８５、１３０、６０２、６４８、６５５、６７４および６８０の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法。
［態様１０１］動物におけるＤＭ１の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号１の核酸塩基６６４−６８３、７７３−７９２、９２６−９４５、９２７−９４６、９２８−９４７、９３１−９５０、９３５−９５４、９４１−９６０、２０８９−２１０８、２１６３−２１８２、２４９０−２５０９、２４９９−２５１８、２６７６−２６９５、２６８５−２７０４、２６７６−２６９５、２６８８−２７０７、２６９７−２７１６、２７６４−２７８３および２７７０−２７８９の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物（ここで、前記核酸塩基配列は配列番号１と相補的である）を投与することを包含する方法。
［態様１０２］動物におけるＤＭ１の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号２の核酸塩基８１２−８３１、３６２９−３６４８、４４４７−４４６６、４６１３−４６３２、５８０３−５８２２、５８０４−５８２３、５８０５−５８２４、５８０８−５８２７、５８１８−５８３７、６７９４−６８１３、１２４６３−１２４８２、１３１５２−１３１７１および１３５５３−１３５７２の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物（ここで、前記核酸塩基配列は配列番号２と相補的である）を投与することを包含する方法。
［態様１０３］前記修飾オリゴヌクレオチドがＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルを低減する態様９８〜１０２のいずれかに記載の方法。
［態様１０４］前記修飾オリゴヌクレオチドがＤＭＰＫタンパク質発現を低減する態様９８〜１０３のいずれかに記載の方法。
［態様１０５］前記修飾オリゴヌクレオチドがＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫを低減する態様９８〜１０４のいずれかに記載の方法。
［態様１０６］前記修飾オリゴヌクレオチドがＣＵＧｅｘｐ ＤＭＰＫを優先的に低減する態様１０５記載の方法。
［態様１０７］ＣＵＧｅｘｐの選択的低減が筋肉組織においてである態様１０６記載の方法。
［態様１０８］動物における筋緊張症の処置方法であって、それを必要とする動物に、態様４１〜５３、５７〜７２および７７〜９５のいずれかに記載の化合物、または態様５４〜５６および９６のいずれか一に記載の組成物を投与することを包含する方法。
［態様１０９］動物における筋緊張症の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法。
［態様１１０］動物における筋緊張症の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号４１、４４、７６、１０９、１５３、３２０、３２１、３２２、３２５、３２９、３３５および６５７の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法。
［態様１１１］動物における筋緊張症の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号１５、７３、７７、７９、８３、８５、１３０、６０２、６４８、６５５、６７４および６８０の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法。
［態様１１２］動物における筋緊張症の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号１の核酸塩基６６４−６８３、７７３−７９２、９２６−９４５、９２７−９４６、９２８−９４７、９３１−９５０、９３５−９５４、９４１−９６０、２０８９−２１０８、２１６３−２１８２、２４９０−２５０９、２４９９−２５１８、２６７６−２６９５、２６８５−２７０４、２６７６−２６９５、２６８８−２７０７、２６９７−２７１６、２７６４−２７８３および２７７０−２７８９の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物（ここで、前記核酸塩基配列は配列番号１と相補的である）を投与することを包含する方法。
［態様１１３］動物における筋緊張症の処置方法であって、それを必要とする動物に、配列番号２の核酸塩基８１２−８３１、３６２９−３６４８、４４４７−４４６６、４６１３−４６３２、５８０３−５８２２、５８０４−５８２３、５８０５−５８２４、５８０８−５８２７、５８１８−５８３７、６７９４−６８１３、１２４６３−１２４８２、１３１５２−１３１７１および１３５５３−１３５７２の等長部分と相補的な少なくとも１２連続核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物（ここで、前記核酸塩基配列は配列番号２と相補的である）を投与することを包含する方法。
［態様１１４］動物におけるＭＢＬＮ依存性スプライセオパシーの低減方法であって、それを必要とする動物に、態様４１〜５３、５７〜７２および７７〜９５のいずれかに記載の化合物、または態様５４〜５６および９６のいずれか一に記載の組成物を投与することを包含する方法。
［態様１１５］動物におけるＭＢＬＮ依存性スプライセオパシーの低減方法であって、それを必要とする動物に、配列番号１２〜１５６、１６０〜７７０および７７４〜７９２の核酸塩基配列のうちのいずれかの少なくとも１２連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１２〜３０連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与することを包含する方法。
［態様１１６］Ｓｅｒｃａ１、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、Ｃｌｃｎ１およびＺａｓｐのいずれかのスプライシングが補正される態様１１５記載の方法。
［態様１１７］投与することが全身投与である態様９８〜１１６のいずれかに記載の方法。
［態様１１８］投与することが非経口投与である態様９８〜１１７のいずれかに記載の方法。
［態様１１９］前記全身投与が皮下投与、静脈内投与、脳室内投与およびくも膜下腔内投与である態様１１８記載の方法。
［態様１２０］前記投与が筋肉内投与でない態様９８〜１９のいずれかに記載の方法。
［態様１２１］前記動物がヒトである態様９８〜１２０のいずれかに記載の方法。
［態様１２２］動物におけるＤＭ１を処置するのに用いるための、態様４１〜５３、５７〜７２および７７〜９５のいずれかに記載の化合物。
［態様１２３］動物における筋緊張症を低減するのに用いるための、態様４１〜５３、５７〜７２および７７〜９５のいずれかに記載の化合物。
［態様１２４］動物におけるＭＢＬＮ依存性スプライセオパシーを低減するのに用いるための、態様４１〜５３、５７〜７２および７７〜９５のいずれかに記載の化合物。

【実施例】

【0281】

非限定的開示および参照による援用
本明細書中に記載されるある化合物、組成物および方法はある実施形態に従って具体性を伴って記載されているが、以下の実施例は、本明細書中に記載される化合物を例証するためだけに役立つものであって、それらを限定するものではない。本出願中で引用される参考文献は、各々、参照によりその全体が本明細書中で援用される。

【0282】

実施例１：ヒト骨格筋細胞（ｈＳＫＭＣ）におけるヒト筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）のアンチセンス抑制
ヒトＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vitroでのＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物に及ぼすそれらの作用に関して試験した。２０，０００細胞／ウェルの密度での培養ｈＳＫＭ細胞を、電気穿孔を用いて１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより、ヒトプライマープローブ組ＲＴＳ３１６４（順向配列 ＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧ、本明細書中では配列番号９として示される；逆向配列 ＧＣＧＴＡＧＴＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＡＧＴＴ、本明細書中では配列番号１０として示される；プローブ配列 ＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＡＡＣＣＸ、本明細書中では配列番号１１として示される）で測定した。ＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量により調整した。結果は、非処理対照細胞に比して、ｈＤＭＰＫの抑制％として示される。

【0283】

表１および２におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは５−１０−５ギャップマーであって、この場合、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして各ウィングセグメントは５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全体に亘るヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体に亘る全シトシン残基は、５−メチルシトシンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化される５’末端ヌクレオシドを示す。「標的終止部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化される３’末端ヌクレオシドを示す。表１に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、配列番号１（GenBank寄託番号 ＮＭ＿００１０８１５６０．１）を標的にする。表２に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、配列番号２（ヌクレオチド１８５４０６９６〜１８５５５１０６から切頭化されたGenBank寄託番号 ＮＴ ０１１１０９．１５の相補体）を標的にする。

【0284】

いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記条件下でのヒトＤＭＰＫｍＲＮＡレベルの有意の抑制を実証した。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表2】

【0285】

表１および２からのアンチセンスオリゴヌクレオチドも、上記と同様の条件を用いて検定で試験し、ｍＲＮＡレベルをヒトプライマープローブ ＲＴＳ３１６２（順向配列 ＣＧＧＧＣＣＧＴＣＣＧＴＧＴＴ、本明細書中では配列番号１５７として示される；逆向配列 ＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＡＣＣＡＡ、本明細書中では配列番号１５８として示される；プローブ配列 ＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＸ、本明細書中では、配列番号１５９として示される）。結果を、表３に示す。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現も、３’ＵＴＲの近くのＤＭＰＫ遺伝子を標的にするＲＴＳ３１６２により査定した。第二プライマープローブを用いて、全ＤＭＰＫ遺伝子の発現が抑制されていたことを確認した。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【0286】

実施例２：ＣＵＧ反復をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
多重ＣＵＧ反復配列を含有するｍＲＮＡ転写産物をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドの化学的性質およびそれらの配列を、表４に示す。糖型を示す記号を、塩基の後に下付文字で示しており、例を以下に示す：ｂ＝２’−Ｏ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アセトアミドリボース；ｄ＝２’−デオキシリボース；ｅ＝２−Ｏ−メトキシエチルリボース；ｆ＝２’−アルファ−フルオロ−２’−デオキシリボース；ｇ＝２’−Ｏ−２［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチルリボース；ｈ＝３’−フルオロ−ＨＮＡ；ｋ＝（Ｓ）−ｃＥｔ；１＝ＬＮＡ（ロックド核酸）；ｎ＝２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）リボース；ｏ＝２’−Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル（ＤＭＡＯＥ）リボース；ｐ＝ＰＮＡ；ｒ＝プロピルリボース；およびｘ＝アミノ酸コア。複素環名は、アデニン、シトシン、チミンおよびグアニンに関する標準記号で、５−メチルシトシンに関しては「ｍＣ」、ならびにリシン側鎖に関しては「Ｋ」で明記される。リンカーは、糖型の後に下付きで示されており、以下の記号を用いて示される：ｇ＝富ＰＮＡ−グリシン；ａ＝アミノ酸；およびｓ＝チオエートエステル。

【表4】

【0287】

実施例３：ヒト骨格筋細胞におけるヒトＤＭＰＫの用量依存的アンチセンス抑制
ｈＳＫＭＣにおけるＤＭＰＫのin vitro抑制を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１参照）のうちのいくつかを、種々の用量で試験した。細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、電気穿孔を用いて、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、１０，０００ｎＭおよび２０，０００ｎＭ濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより、本明細書中に上記のプライマープローブ組ＲＴＳ３１６４を用いて測定した。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量に対して正規化した。結果を、非処理細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として表５に示す。

【0288】

試験アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記条件下でのＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルの用量依存的抑制を実証した。

【表5-1】

【表5-2】

【0289】

表５からのアンチセンスオリゴヌクレオチドも、本明細書中上記のプライマープローブ組ＲＴＳ３１６２で試験した。結果を、表６に示す。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ発現も、３’ＵＴＲの近くのＤＭＰＫ遺伝子を標的にするＲＴＳ３１６２により査定した。第二プライマープローブを用いて、全ＤＭＰＫ遺伝子の発現が抑制されていたことを確認した。

【表6-1】

【表6-2】

【0290】

実施例４：ヒト骨格筋細胞におけるヒトＤＭＰＫの用量依存的アンチセンス抑制
ｈＳＫＭＣにおけるＤＭＰＫのin vitro抑制を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例３参照）のうちのいくつかを、種々の用量で試験した。細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、電気穿孔を用いて、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、１０，０００ｎＭおよび２０，０００ｎＭ濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより、本明細書中に上記のプライマープローブ組ＲＴＳ３１６４を用いて測定した。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量に対して正規化した。結果を、非処理細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として表７に示す。

【0291】

試験アンチセンスオリゴヌクレオチドの大多数は、上記条件下でのＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルの用量依存的抑制を実証した。

【表7-1】

【表7-2】

【0292】

実施例５：ヒト骨格筋細胞におけるヒトＤＭＰＫの用量依存的アンチセンス抑制
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドをヒトＤＭＰＫｍＲＮＡを標的にするよう設計して、ｈＳＫＭＣにおいて種々の用量で試験した。いくつかの他のアンチセンスオリゴヌクレオチドをヒトアクチンｍＲＮＡを標的にするよう設計して、これも、ｈＳＫＭＣにおいて種々の用量で試験した。新規設計ギャップマーは、２−１０−２ ＭＯＥまたは３−１０−３ ＭＯＥギャップマーである。２−１０−２ ＭＯＥギャップマーは、１４ヌクレオシド長であって、この場合、ギャプセグメントは１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウィングセグメントは２つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。３−１０−３ ＭＯＥギャップマーは、１６ヌクレオシド長であって、この場合、ギャップセグメントは１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウィングセグメントは３つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全体に亘るヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体に亘る全シトシン残基は、５−メチルシトシンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化される５’末端ヌクレオシドを示す。「標的終止部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化される３’末端ヌクレオシドを示す。表８に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２（ヌクレオチド１８５４０６９６〜１８５５５１０６から切頭化されたGenBank寄託番号 ＮＴ ０１１１０９．１５の相補体）として本明細書中で示されるヒトＤＭＰＫゲノム配列、または配列番号８０１（GenBank寄託番号 ＮＭ＿００１１００．３）として本明細書中で示されるヒトアクチン配列を標的にする。

【0293】

細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、電気穿孔を用いて、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、１０，０００ｎＭおよび２０，０００ｎＭ濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより、本明細書中に上記のプライマープローブ組ＲＴＳ３１６２を用いて測定した。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量に対して正規化した。結果を、非処理対照細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として表８に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、同様の条件下でＲＴＳ３１６４を用いても試験した。結果を、表９に示す。

【0294】

試験アンチセンスオリゴヌクレオチドの多くは、上記条件下でのＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルの用量依存的抑制を実証した。

【表8】

【表9】

【0295】

実施例６：ＤＭ１繊維芽細胞におけるヒト筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた用量応答試験
大型ＣＵＧ反復を保有する突然変異型のＤＭＰＫ ｍＲＮＡは完全に転写され、ポリアデニル化されるが、しかし、核内に閉じ込められたままとなる（Davis et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 7388-7393）。これらの突然変異核保持ｍＲＮＡは、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の最も重要な病理学的特徴の１つである。ＤＭ１繊維芽細胞における突然変異ＤＭＰＫ ｍＲＮＡのアンチセンス抑制を、試験した。

【0296】

ＤＭＰＫ遺伝子は、正常では、３’非翻訳領域中に５〜３７のＣＴＧ反復を有する。Ｉ型筋緊張性ジストロフィーでは、この数は有意に拡大され、５０〜３，５００超の範囲であり得る（Harper, Myotonic Dystrophy (Saunders, London, ed.3, 2001); Annu. Rev. Neurosci. 29: 259, 2006; EMBO J. 19: 4439, 2000; Curr Opin Neurol. 20: 572, 2007）。ＤＭ１繊維芽細胞を、４，５００細胞／ウェルの密度で播種し、サイトフェクチン試薬を、９．４ｎＭ、１８．８ｎＭ、３７．５ｎＭ、７５．０ｎＭ、１５０．０ｎＭおよび３００．０ｎＭ濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドとともに用いてトランスフェクトした。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより、本明細書中に上記のプライマープローブ組ＲＴＳ３１６４を用いて測定した。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量に対して正規化した。結果を、非処理対照細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として表１０に示す。

【0297】

同様の条件での検定を、ＤＭＰＫ転写産物の３’末端を標的にする、本明細書中に上記のＲＴＳ３１６２を用いても実施した。結果を、非処理対照細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として表１１に示す。

【0298】

試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記条件下でのＤＭＰＫ ｍＲＮＡの用量依存的抑制を実証した。

【表10】

【表11】

【0299】

実施例７：ヒト骨格筋細胞（ｈＳＫＭｃ）におけるヒトＤＭＰＫのアンチセンス抑制
ヒトＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vitroでのＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物に及ぼすそれらの作用に関して試験した。２０，０００細胞／ウェルの密度での培養ｈＳＫＭ細胞を、電気穿孔を用いて１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより測定した。ＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量により調整した。結果は、非処理対照細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として示される。

【0300】

表１２および１３におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは５−１０−５ギャップマーであって、この場合、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして各ウィングセグメントは５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全体に亘るヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体に亘る全シトシン残基は、５−メチルシトシンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがヒトゲノム遺伝子配列において標的化される５’末端ヌクレオシドを示す。「標的終止部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがヒトゲノム配列において標的化される３’末端ヌクレオシドを示す。表１２に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、配列番号１（GenBank寄託番号 ＮＭ＿００１０８１５６０．１）を標的にする。表１３に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、配列番号２（ヌクレオチド１８５４０６９６から１８５５５１０６まで切頭化されたGenBank寄託番号 ＮＴ ０１１１０９．１５の相補体）を標的にする。

【0301】

アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかは、上記条件下でのＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルの有意の抑制を実証した。

【表12-1】

【表12-2】

【表12-3】

【表12-4】

【表12-5】

【表12-6】

【表12-7】

【表12-8】

【表12-9】

【表12-10】

【表12-11】

【表12-12】

【表12-13】

【表12-14】

【表13-1】

【表13-2】

【表13-3】

【表13-4】

【表13-5】

【表13-6】

【表13-7】

【表13-8】

【表13-9】

【表13-10】

【表13-11】

【表13-12】

【表13-13】

【表13-14】

【表13-15】

【0302】

実施例８：マウス初代培養肝細胞におけるマウスＤＭＰＫのアンチセンス抑制
マウスＤＭＰＫ核酸に対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vitroでのＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物に及ぼすそれらの作用に関して試験した。３５，０００細胞／ウェルの密度での培養マウス初代培養肝細胞を、電気穿孔を用いて８，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより測定した。ＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量により調整した。結果は、非処理対照細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として示される。

【0303】

表１４，１５および１６におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは５−１０−５ギャップマーであって、この場合、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして各ウィングセグメントは５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全体に亘るヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体に亘る全シトシン残基は、５−メチルシトシンである。「マウス標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがマウス遺伝子配列において標的化される５’末端ヌクレオシドを示す。「マウス標的終止部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがマウス遺伝子配列において標的化される３’末端ヌクレオシドを示す。表１２に列挙されたアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、配列番号３（ヌクレオチド１６６６６００１から１６６８１０００まで切頭化されたGenBank寄託番号 ＮＴ ０３９４１３．７）を標的にする。表１３のアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、配列番号４（GenBank寄託番号 ＮＭ＿０３２４１８．１）を標的にする。表１４のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５（GenBank寄託番号 ＡＩ００７１４８．１）、配列番号６（GenBank寄託番号 ＡＩ３０４０３３．１）、配列番号７（GenBank寄託番号 ＢＣ０２４１５０．１）、配列番号８（GenBank寄託番号 ＢＣ０５６６１５．１）、配列番号７９３（GenBank寄託番号 ＢＣ０７５７１５．１）、配列番号７９４（GenBank寄託番号 ＢＵ５１９２４５．１）、配列番号７９５（GenBank寄託番号 ＣＢ２４７９０９．１）、配列番号７９６（GenBank寄託番号 ＣＸ２０８９０６．１ ）、配列番号７９７（GenBank寄託番号 ＣＸ７３２０２２．１）、配列番号７９８（GenBank寄託番号 Ｓ６０３１５．１）または配列番号７９９（GenBank寄託番号 Ｓ６０３１６．１）を標的にする。さらに、配列番号８００（GenBank寄託番号 ＮＭ＿００１０８１５６２．１）をターゲッティングするヒトアンチセンスオリゴヌクレオチド ＩＳＩＳ ４５１４２１も、この検定に含まれたが、それは表１４に列挙されている。

【0304】

表１４、１５および１６のマウスオリゴヌクレオチドは、ヒト遺伝子配列とも交差反応性であり得る。「ミスマッチ」は、マウスオリゴヌクレオチドがヒト遺伝子配列とミス対合している核酸塩基の数を示す。マウスオリゴヌクレオチドとヒト配列との間の相補性が大きいほど、マウスオリゴヌクレオチドはヒト配列とより高い可能性で交差反応し得る。表１４、１５および１６のマウスオリゴヌクレオチドを、配列番号８００（GenBank寄託番号 ＮＭ＿００１０８１５６２．１）と比較した。「ヒト標的開始部位」は、ギャップマーがヒト遺伝子配列において標的化される５’末端ヌクレオシドを示す。「ヒト標的終止部位」は、ギャップマーがヒト遺伝子配列において標的化される３’末端ヌクレオシドを示す。

【0305】

試験アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかは、上記条件下でのＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルの有意の抑制を実証した。試験アンチセンスオリゴヌクレオチドのうちのあるものは、ヒト遺伝子配列と交差反応性である。

【表14-1】

【表14-2】

【表15】

【表16】

【0306】

実施例９：マウス初代培養肝細胞におけるマウスＤＭＰＫの用量依存的アンチセンス抑制
マウス初代培養肝細胞におけるＤＭＰＫのin vitro抑制を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例８参照）のうちのいくつかを、種々の用量で試験した。細胞を、３５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、電気穿孔を用いて、１，０００ｎＭ、２，０００ｎＭ、４，０００ｎＭ、８，０００ｎＭおよび１６，０００ｎＭ濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＤＭＰＫ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより、プライマープローブ組ＲＴＳ３１８１（順向配列 ＧＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡＣＴＡ、配列番号７７１として本明細書中で示される；逆向配列 ＣＡＣＧＡＡＴＧＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴ、配列番号７７２として本明細書中で示される；プローブ配列 ＡＡＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＸ、配列番号７７３として本明細書中で示される）を用いて測定した。ＤＭＰＫ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量に対して正規化した。結果を、非処理対照細胞に比して、ＤＭＰＫの抑制％として表１７に示す。

【0307】

試験アンチセンスオリゴヌクレオチドの大多数は、上記条件下でのＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルの用量依存的抑制を実証した。

【表17】

【0308】

実施例１０：ＨｅｐＧ２におけるヒトアルファ１骨格アクチンのアンチセンス抑制
マウスモデル中に挿入された場合に、ＤＭ１の症候を引き起こし得る伸長ＣＴＧ反復配列を保有し得る遺伝子であるヒトアルファ１骨格アクチン核酸に対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vitroでのアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物に及ぼすそれらの作用に関して試験した。２０，０００細胞／ウェルの密度での培養ＨｅｐＧ２細胞を、電気穿孔を用いて１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、α１アクチンＲＮＡ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより測定した。アルファ１アクチンＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量により調整した。結果は、非処理対照細胞に比して、α１アクチンの抑制％として示される。

【0309】

表１８におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは５−１０−５ギャップマーであって、この場合、ギャップセグメントは、１０の２’−デオキシヌクレオシドを含み、そして各ウィングセグメントは５つの２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。各ギャップマー全体に亘るヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体に亘る全シトシン残基は、５−メチルシトシンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化される５’末端ヌクレオシドを示す。「標的終止部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化される３’末端ヌクレオシドを示す。表１８に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、配列番号８０１（GenBank寄託番号 ＮＭ＿００１１００．３）を標的にする。

【0310】

試験アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、上記条件下でのアルファ１アクチン ｍＲＮＡレベルの用量依存的抑制を実証した。

【表18】

【0311】

実施例１１：
ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトアルファ１アクチンの用量依存的アンチセンス抑制
ＨｅｐＧ２細胞におけるアルファ１アクチンのin vitro抑制を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例８参照）のうちのいくつかを、種々の用量で試験した。細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、電気穿孔を用いて、６２５ｎＭ、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、１０，０００ｎＭおよび２０，０００ｎＭ濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間後、ＲＮＡを細胞から単離し、アルファ１アクチンＲＮＡ転写産物レベルを、定量的実時間ＰＣＲにより、プライマープローブ組ＲＴＳ３１５４（順向配列 ＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣ、配列番号７８５として本明細書中で示される；逆向配列 ＣＣＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＣ、配列番号７８６として本明細書中で示される；プローブ配列 ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＸ、配列番号７８７として本明細書中で示される）を用いて測定した。アルファ１アクチンＲＮＡ転写産物レベルを、リボグリーン（登録商標）により測定した場合の総ＲＮＡ含量に対して正規化した。結果を、非処理対照細胞に比して、アルファ１アクチンの抑制％として表１９に示す。

【0312】

アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかは、上記条件下でのアルファ１アクチン ｍＲＮＡレベルの用量依存的抑制を実証した。

【表19】

【0313】

実施例１２：トランスジェニックマウスにおける筋肉内投与によるヒトアルファ１アクチンのin vivoアンチセンス抑制
筋緊張性ジストロフィーの処置のためのアンチセンス抑制の作用を試験するために、適切なマウスモデルが必要であった。ＨＳＡ^ＬＲマウスモデルは、ＤＭ１に関して確立されたモデルである(Mankodi, A. et al. Science. 289: 1769, 2000)。そのマウスは、遺伝子の３’ＵＴＲ中に挿入された２２０ＣＴＧ反復を有するヒト骨格アクチン（ｈＡＣＴＡ１）導入遺伝子を保有する。ｈＡＣＴＡｌ−ＣＵＧｅｘｐ転写産物は、骨格筋の核内フォーカス中に蓄積し、ヒトＤＭ１の場合と同様の筋緊張症を生じる(Mankodi, A. et al. Mol. Cell 10: 35, 2002; Lin, X. et al. Hum. Mol. Genet. 15: 2087, 2006)。それゆえ、ｈＡＣＴＡ１導入遺伝子のアンチセンス抑制によるＨＳＡ^ＬＲマウスにおけるＤＭ１症候の改善が、ＤＭＰＫ転写産物のアンチセンス抑制によるヒト患者の同様の症候の改善を予測すると予期される。

【0314】

ヒト骨格アクチンの３’ＵＴＲ中に２５０ＣＵＧ反復を有する導入遺伝子をＦＶＢ／Ｎマウスに挿入することにより、ＨＳＡ（ヒト骨格アクチン）^ＬＲ（長反復）ＤＭ１マウスを生じた。導入遺伝子は、ＣＵＧ反復ＲＮＡとしてマウスにおいて発現されるが、これは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）を有する患者のヒト組織試料で観察されるものと同様に、核中に保持されて、核内含有物またはフォーカスを形成する。

【0315】

in vitroでの統計学的に有意の用量依存的抑制を実証したＩＳＩＳ １９０４０３およびＩＳＩＳ ４４５２３８（実施例１１参照）を、in vivoでヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物を低減するそれらの能力に関して評価した。

【0316】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、１２時間明暗周期で保持して、通常のPurinaマウス用固形飼料を自由に摂取させた。動物を少なくとも７日間研究施設中で馴化させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0317】

マウスを２つの処置群に分けた。２群には、片側の前脛骨筋中に、０．８ｎＭの用量でＩＳＩＳ １９０４０３またはＩＳＩＳ ４４５２３８の直接筋肉内注射を施した。各マウスの対側性前脛骨筋には、ＰＢＳの筋肉内注射を１回投与した。ＰＢＳを注射した筋肉は、対照として働いた。

【0318】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、両側の前脛骨筋からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表２０に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0319】

結果は、ＩＳＩＳ １９０４０３およびＩＳＩＳ ４４５２３８による処置がマウスにおけるアルファ１アクチンＲＮＡの抑制を生じたことを示す。

【表20】

【0320】

実施例１３：トランスジェニックマウスにおける筋肉内投与によるヒトアルファ１アクチンの用量依存的アンチセンス抑制
in vitroでの統計学的に有意の用量依存的抑制を実証したＩＳＩＳ ４４５２３６（実施例１１参照）を、in vivoでヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物を低減するその能力に関して評価した。

【0321】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、１２時間明暗周期で保持して、通常のPurinaマウス用固形飼料を自由に摂取させた。動物を少なくとも７日間研究施設中で馴化させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0322】

マウスを３つの処置群に分けた。その群には、片側の前脛骨筋中に、０．２ｎＭ、０．４ｎＭまたは０．８ｎＭの用量でＩＳＩＳ ４４５２３６の直接筋肉内注射を施した。各マウスの対側性前脛骨筋には、ＰＢＳの筋肉内注射を１回投与した。ＰＢＳを注射した筋肉は、対照として働いた。

【0323】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、両側の前脛骨筋からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表２１に示すように、ＩＳＩＳ ４４５２３６による処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を、すべての投与量で低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0324】

結果は、ＩＳＩＳ ４４５２３６による処置が、上記条件下でのアルファ１アクチンｍＲＮＡレベルの有意の抑制を生じたことを示す。

【表21】

【0325】

筋電図検査による筋緊張症の査定
筋緊張症は、筋繊維の弛緩遅延のためである反復性活動電位を指す。この現象は、筋緊張性ジストロフィーの患者において、ならびにＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて観察される。ＥＭＧ針を筋緊張性筋肉中に挿入すると、挿入による活性が普通では終結する時間を過ぎて数秒まで、電気的活動が延長される。筋緊張性放電の周波数は５０〜１００インパルス／秒の範囲である。

【0326】

筋電図検査により筋緊張を測定し、以下のように等級分けした：等級０は、任意の針挿入により引き出される筋緊張がないことを指す（０％）；等級１は、５０％未満の針挿入により引き出される筋緊張を指す；等級２は、５０％より多くの針挿入により引き出される筋緊張を指す；そして等級３は、１００％針挿入により引き出される筋緊張を指す。

【0327】

筋電図検査の前に、１００ｍｇ／ｋｇのケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジンおよび３ｍｇ／ｋｇアセプロマジンのカクテルを腹腔内注射により、マウスを麻酔した。左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に対して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表２２に示す。これは、ＩＳＩＳ ４４５２３６で処置したマウスにおける筋緊張の有意の低減を実証する。

【表22】

【0328】

選択的スプライシングの補正
ＤＭ１／ＨＳＡ^ＬＲマウスモデルにおいて、核内の伸長ＣＵＧ ＲＮＡの蓄積は、ポリ（ＣＵＧ）結合タンパク質、例えばMuscleblind様１（ＭＢＬＮ１）の隔離をもたらす(Miller, J. W. et al. EMBO J. 19: 4439, 2000)。Ｓｅｒｃａ1遺伝子の選択的スプライシングを制御する、スプライシング因子ＭＢＬＮ１は、伸長ＣＵＧフォーカス中に隔離される。これは、この遺伝子の選択的スプライシングの調節不全を誘発する。このような選択的スプライシングに及ぼすヒトアルファ１アクチンのアンチセンス抑制の作用を評価するために、メーカーの使用説明書に従って、ＲＮイージー脂質組織ミニキット（Qiagen）を用いて、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋から総ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅のための遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲ系およびプラチナＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen）で、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｓｅｒｃａ−１のための順向および逆向プライマーは、Bennett and Swayze (Annu. Rev. Pharmacol. 2010; 50: 259-93)に記載されている。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｉ核酸ゲル染色（Invitrogen）で染色し、フジフィルム ＬＡＳ−３０００ インテリジェントダークボックスを用いて画像処理した。

【0329】

ＰＢＳ中でのＳｅｒｃａ１スプライシングのＰＣＲ産物は、ＭＢＬＮ１の誤調節の結果として、エキソン２２消失を実証した。ＩＳＩＳ ４４５２３６による処置は、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋におけるエキソン２２含入ならびにＳｅｒｃａ１遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0330】

したがって、アルファ１アクチンのアンチセンス抑制はＳｅｒｃａ１スプライシング誤調節を補正したが、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置が核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積を低減したことを示す。核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積低減は、ＭＢＬＮ１隔離を補正し、それにより正常スプライシングを起こさせる。

【0331】

実施例１４：トランスジェニックマウスにおける皮下投与によるヒトアルファ１アクチンのin vivoアンチセンス抑制
ＩＳＩＳ １９０４０３、ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８を、in vivoでのヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物を低減するそれらの能力に関して評価した。

【0332】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、１２時間明暗周期で保持して、通常のPurinaマウス用固形飼料を自由に摂取させた。動物を少なくとも７日間研究施設中で馴化させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0333】

マウスを４つの処置群に分けた。最初の３群には、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ １９０４０３、ＩＳＩＳ ４４５２３６またはＩＳＩＳ ４４５２３８の皮下注射を施した。第４群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳの皮下注射を施した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。

【0334】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋（左右）、腓腹筋（左右）および前脛骨筋（左右）からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表２３に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0335】

ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４５２３８はともに、上記条件下でのアルファ１アクチンｍＲＮＡレベルの有意の抑制を実証した。

【表23】

筋肉中のアルファ１アクチンの蛍光in situハイブリダイゼーション

【0336】

凍結筋肉組織切片を、ＰＢＳ溶液中の新鮮な３％パラホルムアルデヒド中で１５〜２０分間固定し、その後、それらをＰＢＳで５分間、２回すすいだ。０．５％トリトンＸ−１００で５分間、核を透過処理して、その後、組織を正常ヤギ血清で３０分間ブロッキングした。切片を、テキサスレッド（Integrated DNA Technologies）で５’−標識化した、アルファ１アクチンに対して標的化される２’−Ｏ−メチルＲＮＡとともにインキュベートした。切片をＤＡＰＩで対比染色して、核を標識した。切片を封入し、標準蛍光顕微鏡で観察した。Metavueソフトウェアにより画像を得て、Autoquantソフトウェアにより逆重畳積分を達成した。

【0337】

ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ 4４５２３８で処置したマウスからの筋肉組織切片はすべて、リボ核内フォーカスでアルファ１アクチンシグナルの蛍光強度低減を示したが、これは、ヒトアルファ１アクチン ｍＲＮＡのアンチセンス抑制ならびに核内フォーカスにおけるＲＮＡの低減を示している。

【0338】

筋電図検査による筋緊張症の査定
筋緊張症は、筋繊維の弛緩遅延のためである反復性活動電位を指す。この現象は、筋緊張性ジストロフィーの患者において、およびＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて観察される。ＥＭＧ針を筋緊張性筋肉中に挿入すると、挿入による活性が普通では終結する時間を過ぎて数秒まで、電気的活動が延長される。筋緊張性放電の周波数は５０〜１００インパルス／秒の範囲である。

【0339】

筋電図検査により筋緊張を測定し、以下のように等級分けした：等級０は、任意の針挿入により引き出される筋緊張がないことを指す（０％）；等級１は、５０％未満の針挿入により引き出される筋緊張を指す；等級２は、５０％より多くの針挿入により引き出される筋緊張を指す；そして等級３は、１００％針挿入により引き出される筋緊張を指す。

【0340】

筋電図検査の前に、腹腔内への１００ｍｇ／ｋｇのケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジンおよび３ｍｇ／ｋｇアセプロマジンまたは２５０ｍｇ／ｋｇの２，２，２−トリブロモエタノールを用いて、マウスを麻酔した。左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表２４に示す。これは、ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８で処置したマウスにおける筋緊張の有意の低減を実証する。

【表24】

【0341】

選択的スプライシングの補正
Ｓｅｒｃａ1スプライシング、ｍ−Ｔｉｔｉｎスプライシング、ＣＩＣ−１塩化物チャンネル遺伝子（Ｃｌｃｎ１）スプライシングおよびＺａｓｐスプライシングを制御するスプライシング因子ＭＢＬＮ１は、伸長ＣＵＧフォーカス中に隔離される。ＭＢＮＬ１隔離は、これらの遺伝子の各々の調節不全スプライシングを誘発する。スプライシングに及ぼすヒトアルファ１アクチンのアンチセンス抑制の作用を評価するために、実施例１３に記載した通りに、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋から総ＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｓｅｒｃａ−１、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、Ｃｌｃｎ１およびＺａｓｐのための順向および逆向プライマーは、Bennett and Swayze (Annu. Rev. Pharmacol. 2010; 50: 259-93)に記載されている。

【0342】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて、Ｓｅｒｃａ１スプライシングは、エキソン２２消失により実証されるように、誤調節される。ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８の各々による処置は、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋におけるエキソン２２含入ならびにＳｅｒｃａ１遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0343】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて、ｍ−Ｔｉｔｉｎスプライシングは、エキソン５含入により実証されるように、誤調節される。ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８の各々による処置は、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋におけるエキソン５のスキッピングならびにｍ−Ｔｉｔｉｎ遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0344】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて、Ｃｌｃｎ１スプライシングは、エキソン７ａ含入により実証されるように、誤調節される。ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８の各々による処置は、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋におけるエキソン７ａのスキッピングならびにＣｌｃｎ１遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0345】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて、Ｚａｓｐスプライシングは、エキソン１１含入により実証されるように、誤調節される。ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８の各々による処置は、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋におけるエキソン１１のスキッピングならびにＺａｓｐ遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0346】

したがって、アルファ１アクチンのアンチセンス抑制はＳｅｒｃａ１、ｍ−Ｔｉｔｉｎ、Ｃｌｃｎ１およびＺａｓｐスプライシング誤調節を補正したが、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置が核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積を低減したことを示す。核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積低減は、ＭＢＬＮ１隔離を補正し、それにより正常スプライシングを起こさせる。

【0347】

実施例１５：トランスジェニックマウスにおけるヒトアルファ１アクチンのin vivoアンチセンス抑制
ＨＳＡ^ＬＲマウスにおける筋緊張症に関するＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８によるヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物のアンチセンス抑制を、さらに評価した。

【0348】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、３つの処置群に分けた。最初の２群には、２週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ ４４５２３６またはＩＳＩＳ ４４５２３８の皮下注射を施した。第３群には、２週間の間、週２回、ＰＢＳの皮下注射を施した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。

【0349】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表２５に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0350】

ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４５２３８はともに、上記条件下でのアルファ１アクチンｍＲＮＡレベルの有意の抑制を実証した。

【表25】

【0351】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表２６に示す。これは、ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ４４５２３８で処置したマウスにおける筋緊張の有意の低減を実証する。

【表26】

【0352】

選択的スプライシングの補正
Ｓｅｒｃａ１の選択的スプライシングに及ぼすＩＳＩＳ１９０４０１の作用を評価するために、実施例１３に記載したものと同様の手順で、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋から精製した総ＲＮＡを分析した。

【0353】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスでは、Ｓｅｒｃａ１スプライシングは、ＭＢＬＮ１の誤調節の結果として、エキソン２２消失により実証されるように、誤調節される。ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ４４５２３８の各々による処置は、前脛骨筋および四頭筋におけるエキソン２２のほぼ完全な含入ならびにＳｅｒｃａ１遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0354】

したがって、アルファ１アクチンのアンチセンス抑制はＳｅｒｃａ１スプライシング誤調節を補正したが、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置が核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積を低減したことを示す。核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積低減は、ＭＢＬＮ１隔離を補正し、それにより正常スプライシングを起こさせる。

【0355】

実施例１６：トランスジェニックマウスにおけるヒトアルファ１アクチンの用量依存的アンチセンス抑制
ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ ４４５２３８によるヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物の用量依存的抑制を、評価した。

【0356】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスに、４週間の間、週２回、２．５ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇまたは２５．０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ ４４５２３６またはＩＳＩＳ ４４５２３８を皮下注射した。対照群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳを皮下注射した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。

【0357】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋（Ｑｕａｄ）、腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃ）および前脛骨筋（ＴＡ）からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表２７に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0358】

両アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記条件下での、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋におけるアルファ１アクチンｍＲＮＡレベルの用量依存的抑制を実証した。

【表27】

【0359】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋（Ｑｕａｄ）、左右の腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃ）、左右の前脛骨筋（ＴＡ）および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表２８に示す。これは、ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ４４５２３８で処置したマウスにおける筋緊張の有意の用量依存的低減を実証する。

【表28】

【0360】

選択的スプライシングの補正
Ｓｅｒｃａ１の選択的スプライシングに及ぼすＩＳＩＳ１９０４０１の作用を評価するために、実施例１３に記載したものと同様の手順で、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋から精製した総ＲＮＡを分析した。

【0361】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスでは、Ｓｅｒｃａ１スプライシングは、ＭＢＬＮ１の誤調節の結果として、エキソン２２消失により実証されるように、誤調節される。８．５ｍｇ／ｋｇまたは２５．０ｍｇ／ｋｇの用量で、週２回（または１７．０ｍｇ／ｋｇ／週および５０．０ｍｇ／ｋｇ／週）での、ＩＳＩＳ ４４５２３６およびＩＳＩＳ４４５２３８の各々による処置は、３つの筋肉型すべてにおけるエキソン２２の完全な含入ならびにＳｅｒｃａ１遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0362】

したがって、アルファ１アクチンのアンチセンス抑制はＳｅｒｃａ１スプライシング誤調節を補正したが、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置が核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積を低減したことを示す。核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積低減は、ＭＢＬＮ１隔離を補正し、それにより正常スプライシングを起こさせる。

【0363】

実施例１７：トランスジェニックマウスにおけるヒトアルファ１アクチンのＨＳＡコード領域をターゲッティングするオリゴヌクレオチドによるin vivoアンチセンス抑制
ＨＳＡ^ＬＲマウスにおける筋緊張症に関するＩＳＩＳ １９０４０１（５’−ＧＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＴＣＣＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号７８８）、配列番号１の標的開始部位１０２８）によるヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物のアンチセンス抑制を、評価した。

【0364】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスに、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ １９０４０１を皮下注射した。対照群には、２週間の間、週２回、ＰＢＳを皮下注射した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。

【0365】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表２９に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0366】

ＩＳＩＳ １９０４０１による処置は、上記条件下での、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋におけるアルファ１アクチンｍＲＮＡレベルの有意の抑制を生じた。

【表29】

【0367】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表３０に示す。これは、ＩＳＩＳ １９０４０１で処置したマウスにおける筋緊張の有意の低減を実証する。

【表30】

【0368】

選択的スプライシングの補正
Ｓｅｒｃａ１の選択的スプライシングに及ぼすＩＳＩＳ１９０４０１の作用を評価するために、実施例１３に記載したものと同様の手順で、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋から精製した総ＲＮＡを分析した。

【0369】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスでは、Ｓｅｒｃａ１スプライシングは、ＭＢＬＮ１の誤調節の結果として、エキソン２２消失により実証されるように、誤調節される。ＩＳＩＳ １９０４０１による処置は、３つの筋肉型すべてにおけるエキソン２２の完全な含入ならびにＳｅｒｃａ１遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じた。

【0370】

したがって、アルファ１アクチンのアンチセンス抑制はＳｅｒｃａ１スプライシング誤調節を補正したが、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置が核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積を低減したことを示す。核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積低減は、ＭＢＬＮ１隔離を補正し、それにより正常スプライシングを起こさせる。

【0371】

実施例１８：トランスジェニックマウスにおけるヒトアルファ１アクチンをターゲッティングするオリゴヌクレオチドによるアンチセンス抑制の作用の持続時間
ＨＳＡ^ＬＲマウスにおけるＩＳＩＳ ４４５２３６によるヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物のアンチセンス抑制の作用の持続時間を評価した。

【0372】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスに、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ ４４５２３６を皮下注射した。対照群には、２週間の間、週２回、ＰＢＳを皮下注射した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。最終用量投与の６週間後に、マウスを分析した。

【0373】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の６週間後、動物を屠殺し、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表３１に示すように、ＩＳＩＳ ４４５２３６による処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減し、この作用は少なくとも６週間持続した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0374】

ＩＳＩＳ ４４５２３６による処置は、上記条件下での、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋におけるアルファ１アクチンｍＲＮＡレベルの有意の抑制を生じた。

【表31】

【0375】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表３２に示す。これは、ＩＳＩＳ ４４５２３６で処置したマウスにおける筋緊張の有意の低減を実証する。したがって、ＩＳＩＳ ４４５２３６によるアルファアクチンのアンチセンス抑制の作用は、少なくとも６週間持続された。

【表32】

【0376】

実施例１９：トランスジェニックマウスにおける筋肉内投与によるＣＵＧ反復を有するｍＲＮＡのアンチセンス抑制のin vivo作用
ＨＳＡ^ＬＲマウスにおける筋緊張に及ぼす多重ＣＵＧ反復を含有するｍＲＮＡ転写産物のアンチセンス抑制の作用を、評価した。ＣＵＧ反復をターゲッティングする、そして種々の長さを有する３つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスにおける筋緊張を抑制するに際してのそれらの有効性に関して検定した。ＩＳＩＳ ４４４７４５（ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ（配列番号７８９））は、均一２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドであり、２５ヌクレオチド長で、ホスホロチオエート主鎖を有する。ＩＳＩＳ ４４４７４６（ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号７９０））は、均一２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドであり、２０ヌクレオチド長で、ホスホロチオエート主鎖を有する。ＩＳＩＳ ４４４７４９（ＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ（配列番号７９１））は、均一２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドであり、１５ヌクレオチド長で、ホスホロチオエート主鎖を有する。ＩＳＩＳ ４４５２３６は、陽性対照として検定に含まれた。

【0377】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、３つの処置群に分けた。群には、前脛骨筋中に、０．４ｎＭの用量で、ＩＳＩＳ ４４４７４５、ＩＳＩＳ ４４４７４６またはＩＳＩＳ ４４４７４９の直接筋肉内注射を施した。各マウスの対側性前脛骨筋には、ＰＢＳの筋肉内注射を１回投与した。ＰＢＳ注射筋肉は、対照として働いた。

【0378】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、前脛骨筋（左右）からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表３３に示すように、ＩＳＩＳ ４４４７４５による処置のみが、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【表33】

実施例２０：トランスジェニックマウスにおける筋肉内投与によるＣＵＧ反復を有するｍＲＮＡのin vivo用量依存的抑制

【0379】

ＩＳＩＳ ４４４７４５およびＩＳＩＳ ４４４７４６を、in vivoでヒトアルファ１アクチン ｍＲＮＡを低減するその能力に関してさらに評価した。

【0380】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、１２時間明暗周期で保持して、通常のPurinaマウス用固形飼料を自由に摂取させた。動物を少なくとも７日間研究施設中で馴化させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0381】

マウスを６つの処置群に分けた。その群のうちの３つには、片側の前脛骨筋中に、０．２ｎＭ、０．５ｎＭまたは１．０ｎＭの用量でＩＳＩＳ ４４４７４５の直接筋肉内注射を施した。別の３郡には、片側の前脛骨筋中に、０．２ｎＭ、０．５ｎＭまたは１．０ｎＭの用量でＩＳＩＳ ４４４７４６の直接筋肉内注射を施した。各マウスの対側性前脛骨筋には、ＰＢＳの筋肉内注射を１回投与した。ＰＢＳ注射筋肉は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドで処置した対応するマウスに対する対照として働いた。

【0382】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表３４に示す。これは、ＩＳＩＳ ４４４７４５またはＩＳＩＳ ４４４７４６で処置したマウスにおける筋緊張の有意の低減を実証する。ＩＳＩＳ ４４４７４５およびＩＳＩＳ ４４４７４６によるアルファアクチンのアンチセンス抑制の作用は、少なくとも６週間持続した。

【表34】

【0383】

実施例２１：トランスジェニックマウスにおける筋肉内投与によるＣＵＧ反復を有するｍＲＮＡのアンチセンス抑制のin vivo作用
ＨＳＡ^ＬＲマウスにおける筋緊張に及ぼす多重ＣＵＧ反復を含有するｍＲＮＡ転写産物のアンチセンス抑制の作用を、評価した。ＩＳＩＳ ４４５２３６は、陽性対照として検定に含まれた。

【0384】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、５つの処置群に分けた。最初の３群には、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ ４４４７４５、ＩＳＩＳ ４４４７４６またはＩＳＩＳ ４４４７４９の皮下注射を施した。第４群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳの皮下注射を施した。第５群には、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ ４４５２３６の皮下注射を施した。ＰＢＳ注射群は対照として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。

【0385】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表３５に示す。

【0386】

ＩＳＩＳ ４４５２３６による処置は、筋緊張症における有意の低減をもたらした。ＩＳＩＳ ４４４７４５およびＩＳＩＳ ４４４７４６による処置も、試験した組織のいくつかで、筋緊張の低減を生じた。

【表35】

【0387】

実施例２２：トランスジェニックマウスにおける皮下投与による長いＣＵＧ反復 ｍＲＮＡ（ＨＳＡ^ＬＲマウス）および短いＣＵＧ反復（ＨＳＡ^ＳＲマウス）の用量依存的抑制
長いＣＵＧ反復（ＨＳＡ^ＬＲマウス）を含有するｍＲＮＡ転写産物および短いＣＵＧ反復（ＨＳＡ^ＳＲマウス）を含有するｍＲＮＡ転写産物の用量依存的抑制を、評価した。ＨＳＡ−短反復（ＨＳＡ^ＳＲ）マウスは、ＨＳＡ^ＬＲマウスと同一の導入遺伝子を発現するが、但し、２５０でなく５つのＣＵＧ反復が３’ＵＴＲ中に挿入される。ＨＳＡ^ＳＲマウスは、筋緊張症、スプライシング変化、または任意の他の観察可能な筋緊張症表現型を有さない。ＩＳＩＳ ４４５２３６を、この検定に用いた。

【0388】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスを、４つの処置群に分けた。最初の３群には、４週間の間、週２回、２．５ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇまたは２５．０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ ４４５２３６を皮下注射した。第４群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳを皮下注射した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。ＨＳＡ^ＳＲマウスも４群に分けて、同様に処置した。

【0389】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋（左右）、腓腹筋（左右）および前脛骨筋（左右）からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。結果を表３６および３７に示したが、これは、対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わされる。ＨＳＡ^ＬＲマウスの筋肉中の核保持長反復の抑制は、ＨＳＡ^ＳＲマウスの筋肉中の非核保持短反復と比較して、より大きかった。

【表36】

【表37】

実施例２３：トランスジェニックマウスにおけるヒトＤＭＰＫのin vivoアンチセンス抑制

【0390】

ＬＣ１５マウス、系統Ａは、全ヒトＤＭＰＫ ３’ＵＴＲを含有するトランスジェニックマウスである（ロチェスター大学のWheeler等により開発された）。当該マウスは、ＦＶＢバックグラウンドと戻し交配されたマウスの第二世代である。導入遺伝子は、ＣＵＧ反復ＲＮＡとしてマウスで発現され、これは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）を有する患者のヒト組織試料で観察されるものと同様に、核中に保持されて、核封入体またはフォーカスを形成する。ＤＭＰＫ導入遺伝子中に、３５０〜４００のＣＵＧ反復が存在する。これらのマウスは、ＤＭ１の早期徴候を表示し、それらの筋肉中にいかなる筋緊張も示さない。

【0391】

in vitroでの統計学的に有意の用量依存的抑制を実証したＩＳＩＳ ４４５５６９、ＩＳＩＳ ４４４４０４、ＩＳＩＳ ４４４４３６およびＩＳＩＳ ４７３８１０（実施例５参照）を、in vivoでヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物を低減するその能力に関して評価した。

【0392】

処置
ＬＣ１５、系統Ａマウスを、１２時間明暗周期で保持して、通常のPurinaマウス用固形飼料を自由に摂取させた。動物を少なくとも７日間研究施設中で馴化させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0393】

マウスを５つの処置群に分けた。最初の３群には、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ ４４５５６９、ＩＳＩＳ ４４４４０４またはＩＳＩＳ ４４４４３６の皮下注射を施した。第４群には、４週間の間、週２回、１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ ４７３８１０の皮下注射を施した。第５群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳの皮下注射を施した。ＰＢＳ注射群は対照として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。

【0394】

ＤＭＰＫ ＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋からの組織を単離した。ＤＭＰＫの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表３８に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、ＤＭＰＫ転写産物の抑制％として表わす。

【表38】

【0395】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。ＬＣ１５は筋緊張症を有さないため、対照群も処置群も、試験したいかなる筋肉においてもいかなる筋緊張も表示しなかった。

【0396】

実施例２４：トランスジェニックマウスにおけるヒトＤＭＰＫのin vivoアンチセンス抑制
ＬＣ１５マウス、系統Ｄは、全ヒトＤＭＰＫ ３’ＵＴＲを含有するトランスジェニックマウスである（ロチェスター大学のWheeler等により開発された）。当該マウスは、ＦＶＢバックグラウンドと戻し交配されたマウスの第三世代である。導入遺伝子は、ＣＵＧ反復ＲＮＡとしてマウスで発現され、これは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）を有する患者のヒト組織試料で観察されるものと同様に、核中に保持されて、核封入体またはフォーカスを形成する。ＤＭＰＫ導入遺伝子中に、３５０〜４００のＣＵＧ反復が存在する。これらのマウスは、ＤＭ１の早期徴候を表示し、それらの筋肉中にいかなる筋緊張も示さない。

【0397】

ＩＳＩＳ ４４５５６９、ＩＳＩＳ ４４４４０４、ＩＳＩＳ ４４４４３６およびＩＳＩＳ ４７３８１０を、in vivoでヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物を低減するその能力に関してさらに評価した。

【0398】

処置
ＬＣ１５、系統Ｄマウスを、１２時間明暗周期で保持して、通常のPurinaマウス用固形飼料を自由に摂取させた。動物を少なくとも７日間研究施設中で馴化させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をＰＢＳ中で調製し、０．２ミクロンフィルターを通して濾過することにより滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳ中に溶解した。

【0399】

マウスを６つの処置群に分けた。最初の３群には、４週間の間、週２回、２５．００ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ ４４５５６９、ＩＳＩＳ ４４４４０４またはＩＳＩＳ ４４４４３６の皮下注射を施した。第４群には、４週間の間、週２回、１２．５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ ４７３８１０の皮下注射を施した。第５群には、４週間の間、週２回、６．２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＳＩＳ ４７３８１０の皮下注射を施した。第６群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳの皮下注射を施した。ＰＢＳ注射群は対照として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。

【0400】

ＤＭＰＫ ＲＮＡの抑制
最終用量投与の２４時間後、動物を屠殺し、四頭筋からの組織を単離した。ＤＭＰＫの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表３９に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、ヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ転写産物発現を低減した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、ＤＭＰＫ転写産物の抑制％として表わす。

【0401】

結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置がマウスにおけるＤＭＰＫ ｍＲＮＡの抑制を生じたことを示す。

【表39】

【0402】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。ＬＣ１５は筋緊張症を有さないため、対照群も処置群も、試験したいかなる筋肉においてもいかなる筋緊張も表示しなかった。

【0403】

実施例２５：ＳＸＬトランスジェニックマウスモデルにおけるヒトＤＭＰＫのin vivoアンチセンス抑制
ｈＤＭＰＫターゲッティングＡＳＯ ４４４４０１および２９９４７１を用いて、ヒラメ筋における標的ノックダウンをＳＸＬマウスで測定した。ＳＸＬマウスは、全ＤＭＰＫ遺伝子およびプロモーターに関する遺伝子導入動物であり、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲ中に１０００のＣＵＧ反復配列を含有する。マウスに、４週間の間に、週２回、５０ｍｇ／ｋｇを用量投与した（ｎ＝３匹／群、但し、生理食塩水注射対照に関しては、ｎ＝２）。Ｔａｑｍａｎ検定の結果は、ＩＳＩＳ ４４４４０１またはＩＳＩＳ ２９９４７１による処置がｍｕｔ−ｈＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルを有意に低減したが、しかし内因性マウスＤｍｐｋ ｍＲＮＡレベルに及ぼす作用は無視可能であった。

【0404】

したがって、ＩＳＩＳ ４４４４０１およびＩＳＩＳ ２９９４７１は、ヒトＤＭＰＫｍＲＮＡ転写産物を選択的に標的にする。

【0405】

実施例２６：トランスジェニックマウスにおけるヒトアルファ１アクチンをターゲッティングするオリゴヌクレオチドによるアンチセンス抑制の作用の持続時間
ＨＳＡ^ＬＲマウスにおけるＩＳＩＳ １９０４０１によるヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物のアンチセンス抑制の作用の持続時間を評価した。

【0406】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスに、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ １９０４０１を皮下注射した。対照群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳを皮下注射した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群とを比較した。最終用量投与の１５週間後に、マウスを分析した。

【0407】

アルファ１アクチンＲＮＡの抑制
最終用量投与の１５週間後、動物を屠殺し、四頭筋、腓腹筋および前脛骨筋からの組織を単離した。アルファ１アクチンの実時間ＰＣＲ解析のためにＲＮＡを単離し、１８ｓＲＮＡに対して正規化した。表４０に示すように、ＩＳＩＳ １９０４０１による処置は、ヒトアルファ１アクチンＲＮＡ転写産物発現を低減し、この作用は少なくとも１５週間持続した。結果を、ＰＢＳ対照に比して、アルファ１アクチン転写産物の抑制％として表わす。

【0408】

ＩＳＩＳ １９０４０１による処置は、上記条件下でのアルファ１アクチンｍＲＮＡレベルの有意の抑制を生じた。

【表40】

【0409】

筋電図検査による筋緊張症の査定
左右の四頭筋、左右の腓腹筋、左右の前脛骨筋および腰部傍脊柱筋に関する筋電図検査を、３０ゲージ同心針電極を用いて、各筋肉に関して最低１０回の針挿入により、以前に記載されたように（Kanadia et al, 2003, Science, 302: 1978-1980）実施した。各群の４匹のマウスで観察された平均筋緊張等級として、データを表４１に示す。これは、ＩＳＩＳ １９０４０１で処置したマウスにおける筋緊張の有意の低減を実証する。したがって、ＩＳＩＳ １９０４０１によるアルファアクチンのアンチセンス抑制の作用は、少なくとも１５週間持続された。

【表41】

【0410】

選択的スプライシングの補正
Ｓｅｒｃａ１の選択的スプライシングに及ぼすＩＳＩＳ１９０４０１の作用を評価するために、実施例１３に記載したものと同様の手順で、前脛骨筋、腓腹筋および四頭筋から精製した総ＲＮＡを分析した。

【0411】

ＰＢＳ処置ＨＳＡ^ＬＲマウスでは、Ｓｅｒｃａ１スプライシングは、エキソン２２消失により実証されるように、誤調節される。ＩＳＩＳ １９０４０１による処置は、３つの筋肉型すべてにおけるエキソン２２のほぼ完全な含入ならびにＳｅｒｃａ１遺伝子の選択的スプライシングの正常化を生じ、これは、１５週間後でさえ持続された。

【0412】

したがって、アルファ１アクチンのアンチセンス抑制はＳｅｒｃａ１スプライシング誤調節を補正したが、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置が核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積を低減したことを示す。核内フォーカスにおけるＣＵＧｅｘｐの蓄積低減は、ＭＢＬＮ１隔離を補正し、それにより正常スプライシングを起こさせる。

【0413】

実施例２７：ヒトアクチンのアンチセンス抑制のトランスクリプトーム作用のマイクロアレイ解析
伸長ＣＵＧ反復を有するアクチンｍＲＮＡの発現は、筋肉トランスクリプトームの広範なリモデリングを引き起こす。ＩＳＩＳ １９０４０１およびＩＳＩＳ ４４５２３６の全体的トランスクリプトーム作用を評価するために、マイクロアレイ解析をＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて利用した。

【0414】

処置
ＨＳＡ^ＬＲマウスに、４週間の間、週２回、２５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＳＩＳ １９０４０１またはＩＳＩＳ ４４５２３６を皮下注射した。対照群には、４週間の間、週２回、ＰＢＳを皮下注射した。ＰＢＳ注射群は対照群として機能し、これと、オリゴヌクレオチド処置群と比較した。

【0415】

マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析
野生型またはＨＳＡ^ＬＲマウスの四頭筋から、ＲＮＡを単離した。Agilentバイオアナライザーを用いて、ＲＮＡ完全性を立証した（ＲＮＡ完全性数＞７．５）。ＭｏｕｓｅＲｅｆ−８ ｖ２．０発現ビーズチップキット（Illumina, San Diego）を用いて、メーカーの推奨に従って、ＲＮＡを相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）にプロセシングして、マイクロビーズ上でハイブリダイズした。ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Illumina）を用いて、画像データを定量化した。シグナル強度を、変位値正規化した。列特異的オフセットを用いて、正規化前に２未満のあらゆる値を回避した。ＣＵＧ、ＵＧＣまたはＧＣＵ反復の６以上のヌクレオチドを有するすべてのプローブ組からのデータを削除して、ハイブリダイゼーション混合物中の伸長反復（ｍＲＮＡ中のＣＵＧ反復由来のｃＲＮＡ中のＣＡＧ反復）が当該プローブ中の反復配列と交差ハイブリダイズし得る可能性を排除した。その発現がアレイで容易に定量されない遺伝子を排除するために、＜０．１の検出可能性に関するＰ値を示すプローブを、全試料で削除した。群間の比較を要約し、平均発現レベルの倍率変化およびｔ検定により等級順位を付けた。ソフトウェアパッケージＲ（Butler et al. Diabetes. 2002; 51: 1028-34）を用いて、野生型、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド処理およびＰＢＳ処置マイクロアレイ試料に関して、主成分分析を実施した（Levin et al. In Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, Ed. (CRC Press, Boca Raton, 2008), pp 183-215; Geary et al. DrugMetab. Dispos. 2003; 31: 1419-28）。主成分は、三次元内の各試料における発現変動の大多数の捕捉を可能にした。各試料の最初の３つの主成分を、プロットした。

【0416】

非処置野生型およびＨＳＡ^ＬＲマウスの主成分分析は、広範に分離されたクラスターにおける野生型マウスからのＨＳＡ^ＬＲの分離を実証した。これに対比して、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置ＨＳＡ^ＬＲマウスは野生型により近くに群をなしたが、これは、トランスクリプトーム正規化に関する全体的傾向を示唆している。ＨＳＡ^ＬＲトランスジェニックマウスと野生型マウスとの比較は、下記の表４２に示すように、その発現レベルが２倍以上変更された９３の転写産物を同定した（Ｐ＜０．０００１）。これらの転写産物に関する誤調節の程度は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して低減されるかまたは正規化された（８８％誤調節転写産物はＩＳＩＳ ４４５２３６に応答した（Ｐ＜０．０５；ＩＳＩＳ ４４５２３６対ＰＢＳ対照）が、一方、９０％はＩＳＩＳ １９０４０１に応答した）。

【0417】

オフ−ターゲットノックダウンを有する転写産物を考察するために、その発現がアンチセンスオリゴヌクレオチド処置ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて低減されるすべての転写産物を同定した（いずれかのオリゴヌクレオチドにより＞２倍低減、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝４１転写産物）。これらの判定基準により下方調節された転写産物はすべて、ＨＳＡ^ＬＲマウスにおいて上方調節を実証した。唯一の例外であるコラーゲン６アルファ２は、オフ−ターゲット切断に起因するとは思われないが、それは、非重複配列を有する２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドにより下方調節されたためであった。

【0418】

これらの結果は、４週間のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置が、オフ−ターゲット作用を伴わずに筋肉トランスクリプトームの全般的改善を生じた、ということを示す。

【表42-1】

【表42-2】

【表42-3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]