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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5982024
(24)【登録日】2016年8月5日
(45)【発行日】2016年8月31日
(54)【発明の名称】グリコシル化された免疫グロブリンの調製方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20160818BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20160818BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20160818BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 C
C12P21/08
C12N15/00 A
【請求項の数】11
【全頁数】22
(21)【出願番号】特願2015-36676(P2015-36676)
(22)【出願日】2015年2月26日
(62)【分割の表示】特願2012-535769(P2012-535769)の分割
【原出願日】2010年10月25日
(65)【公開番号】特開2015-128436(P2015-128436A)
(43)【公開日】2015年7月16日
【審査請求日】2015年3月10日
(31)【優先権主張番号】09013455.2
(32)【優先日】2009年10月26日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(73)【特許権者】
【識別番号】000003311
【氏名又は名称】中外製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100140109
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 新次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100075270
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 泰
(74)【代理人】
【識別番号】100101373
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 茂雄
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(72)【発明者】
【氏名】フランツェ，ラインハルト
(72)【発明者】
【氏名】平島 親
(72)【発明者】
【氏名】リンク，トマス
(72)【発明者】
【氏名】高木 良智
(72)【発明者】
【氏名】田熊 晋也
(72)【発明者】
【氏名】津田 祐理子
【審査官】
戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００６−５０７８２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０６−２９２５９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第０２／００２７９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００４／１０４１８６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｐ ２１／００−２１／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／
ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）免疫グロブリンをコードする核酸を含む真核細胞を、培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に維持され、かつ単位時間当たりその培地中でその細胞が最大限に利用できる量の８０％未満であって２０％を超える一定値に制限された培地中で培養し、そして
ｂ）培養物から免疫グロブリンを回収する
ことを含む、免疫グロブリンの調製方法。
ｂ）培養物から免疫グロブリンを回収する
ことを含む、免疫グロブリンの調製方法。
【請求項2】
培養がフェドバッチ培養であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
培養がフェドバッチ培養であり、その際、流加を培養２日目または３日目に開始することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
培養をｐＨ６．５から７．５までのｐＨ値で行なうことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
培養をｐＨ６．９から７．３までのｐＨ値で行なうことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
培養をｐＨ６．９５からｐＨ７．０５までのｐＨ値、またはｐＨ７．１５からｐＨ７．２５までのｐＨ値で行なうことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
免疫グロブリンがクラスＧまたはクラスＥの免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
真核宿主細胞がＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、昆虫細胞、およびＳｐ２／０細胞を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
宿主細胞の培養を６〜２０日間実施することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
免疫グロブリンが抗ＩＬ−６Ｒ抗体であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書には、細胞における免疫グロブリン調製の分野の方法であって、調製される免疫グロブリンのグリコシル化パターンを培養条件に基づいて改変できる方法を記述する。
【背景技術】
【0002】
近年、免疫グロブリンの生産は常に増加しており、近い将来に免疫グロブリンは各種疾患の処置に利用できる最大グループの療法薬となるであろうと思われる。免疫グロブリン
の影響はそれらの特異性から生じる；それには、それらの特異的な標的認識および結合の
機能、ならびに抗原／Ｆｃ受容体の結合と同時または結合後の特異的作用の活性化が含ま
れる。
【0003】
特異的な標的認識および結合は、免疫グロブリンの可変部により仲介される。作用が生じる他の免疫グロブリン分子部分は、翻訳後修飾、たとえばグリコシル化パターンである
。翻訳後修飾は実際に、免疫グロブリンの有効性、安定性、免疫原力潜在性、結合などに
対して影響をもつ。それに関連して、補体依存性細胞傷害性（complement-dependent cyt
otoxicity）（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞性細胞傷害性（antibody-dependent cellular c
ytotoxicity）（ＡＤＣＣ）、およびアポトーシス誘導に対処しなければならない。
【0004】
免疫グロブリンのグリコシル化パターン、すなわち結合した糖構造体の糖の組成および数が生物学的特性に強い影響をもつことが報告された(たとえば、Jefferis, R., Biotech
nol. Prog. 21 (2005) 11-16を参照)。哺乳動物細胞により産生される免疫グロブリンは
２〜３質量％の炭水化物を含有する(Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-
5557)。これは、たとえばクラスＧの免疫グロブリン（ＩｇＧ）において、マウス由来の
ＩｇＧにおける２．３個のオリゴ糖残基(Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophy
s. 257 (1987) 387-394)、およびヒト由来のＩｇＧにおける２．８個のオリゴ糖残基と同
等であり(Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457)、これらのうち一般に２
個はＦｃ領域、残りは可変部に位置する(Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (200
2) 16-31)。
【0005】
クラスＧの免疫グロブリンのＦｃ領域において、オリゴ糖残基はアミノ酸残基２９７、すなわちアスパラギン残基（Ａｓｎ２９７と表記される）にＮ−グリコシル化により導入
される可能性がある。Youingsらは、ポリクローナルＩｇＧ分子の１５％〜２０％でＦｃ
領域にさらに他のＮ−グリコシル化部位が存在することを示した(Youings, A., et al.,
Biochem. J., 314 (1996) 621-630;たとえば、Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (19
95) 931-940も参照)。不均一な、すなわち非対称的なオリゴ糖プロセシングのため、異な
るグリコシル化パターンをもつ多数のイソ形免疫グロブリンが存在する(Patel, T.P., et
al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845; Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys.
308 (1994) 387-399; Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748)。同時に、
オリゴ糖の構造および分布は高度に再現性があり（すなわち、非ランダム）、かつ部位特
異的である(Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292)。
【0006】
免疫グロブリンの幾つかの特性はＦｃ領域のグリコシル化に直接関連する(たとえば、Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292; Lund, J., et al., J. Immunol. 15
7 (1996) 4963-4969; Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Wright, A. and Morrison
, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402を参照)；たとえば、熱安定性および溶解性(
West, C.M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20)、抗原性(Turco, S.J., Arch. Bioch
em. Biophys. 205 (1980) 330-339)、免疫原性(Bradshaw, J.P., et al., Biochim. Biop
hys. Acta 847 (1985) 344-351; Feizi, T. and Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987)
1-11; Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72)、クリアランス速度／循
環半減期(Ashwell, G. and Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554; McFa
rlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135; Baenziger, J.U., Am. J. Path. 121 (19
85) 382-391; Chan, V.T. and Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62; Wright, A.,
et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355; Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2
000) 2171-2182; Zukier, L.S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908)、ならびに
特異的生物活性(Jefferis, R. and Lund, J., Antibody Engineering, ed. by Capra, J.
D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128)。
【0007】
グリコシル化パターンに影響を及ぼす要因が調べられた：たとえば、発酵培地中のウシ胎仔血清の存在(Gawlitzek, M., et al., J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131)、緩衝
作用条件(Muething, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334)、溶存酸素
濃度(Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31; Kunkel, J.P., et al.,
J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71; Lin, A.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993)
339-350)、オリゴ糖の位置およびコンホメーション、ならびに宿主細胞タイプおよび細
胞増殖状態(Hahn, T.J. and Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987;
Jenkins, N., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981)、細胞のヌクレオチド−糖
代謝(Hills, A.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251)、栄養素制限(Gaw
litzek, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544; Hayter, P.M., et al.,
Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335)、特にグルコース制限(Tachibana, H., et al
., Cytotechnology 16 (1994) 151-157)、ならびに細胞外ｐＨ(Borys, M.C., et al., Bi
o/Technology 11 (1993) 720-724)。
【0008】
たとえばＮＳ０骨髄腫細胞における免疫グロブリンの組換え発現により、オリゴマンノース構造体およびトランケート型オリゴ糖構造体の増加が観察された(Ip, C.C., et al.,
Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Robinson, D.K., et al., Biotechnol.
Bioeng. 44 (1994) 727-735)。グルコース飢餓条件下で、グリコシル化の変動、たとえ
ばより小さな前駆オリゴ糖の結合またはオリゴ糖部分の完全な不存在が、ＣＨＯ細胞、ネ
ズミ３Ｔ３細胞、ラット肝癌細胞、ラット腎細胞およびネズミ骨髄腫細胞において観察さ
れた(Rearick, J.I., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 6255-6261; Davidson, S.K.
and Hunt, L.A., J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468; Gershman, H. and Robbins, P.
W., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780; Baumann, H. and Jahreis, G.P., J. Biol.
Chem. 258 (1983) 3942-3949; Strube, K.-H., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 37
62-3771; Stark, N.J. and Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609
)。低グルタミン／グルコース濃度に基づく方法がWong, D.C.F., et al., Biotechnol. B
ioeng. 89 (2005) 164-177により報告された。
【0009】
日本国特許出願JP 62-258252には哺乳動物細胞の潅流培養が記述され、一方、US 5,443,968にはタンパク質分泌細胞のフェドバッチ（fed-batch）培養法（流加培養法）が報告
されている。WO 98/41611には、低い乳酸産生を特徴とする代謝状態に細胞を適応させる
のに有効な細胞培養法が報告されている。物質を産生させるために細胞を培養する方法が
WO 2004/048556に報告されている。Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-5
34には、グルコースの不存在下でインキュベートした哺乳動物細胞はマンノース−９含有
構造体の代わりにマンノース−５含有構造体をタンパク質へ伝達することが報告されてい
る。ｐＣＯ２の依存性は、グルコース制限に際してＣＨＯ細胞の増殖、代謝およびＩｇＧ
産生に影響を及ぼすことがTakuma, S., et al. in Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479
-1488により報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】JP 62-258252
【特許文献2】US 5,443,968
【特許文献3】WO 98/41611
【特許文献4】WO 2004/048556
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16
【非特許文献2】Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557
【非特許文献3】Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394
【非特許文献4】Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457
【非特許文献5】Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31
【非特許文献6】Youings, A., et al., Biochem. J., 314 (1996) 621-630
【非特許文献7】Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940
【非特許文献8】Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845
【非特許文献9】Ip, C.C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399
【非特許文献10】Lund, J., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748
【非特許文献11】Dwek, R.A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292
【非特許文献12】Lund, J., et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969
【非特許文献13】Lund, J., FASEB J. 9 (1995) 115-119
【非特許文献14】Wright, A. and Morrison, S.L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402
【非特許文献15】West, C.M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20
【非特許文献16】Turco, S.J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339
【非特許文献17】Bradshaw, J.P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351
【非特許文献18】Feizi, T. and Childs, R.A., Biochem. J. 245 (1987) 1-11
【非特許文献19】Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72
【非特許文献20】Ashwell, G. and Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554
【非特許文献21】McFarlane, I.G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135
【非特許文献22】Baenziger, J.U., Am. J. Path. 121 (1985) 382-391
【非特許文献23】Chan, V.T. and Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62
【非特許文献24】Wright, A., et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355
【非特許文献25】Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182
【非特許文献26】Zukier, L.S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908
【非特許文献27】Jefferis, R. and Lund, J., Antibody Engineering, ed. by Capra, J.D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128
【非特許文献28】Gawlitzek, M., et al., J. Biotechnol. 42(2) (1995) 117-131
【非特許文献29】Muething, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 321-334
【非特許文献30】Kunkel, J.P., et al., J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71
【非特許文献31】Lin, A.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350
【非特許文献32】Hahn, T.J. and Goochee, C.F., J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987
【非特許文献33】Jenkins, N., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981
【非特許文献34】Hills, A.E., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 239-251
【非特許文献35】Gawlitzek, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544
【非特許文献36】Hayter, P.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335
【非特許文献37】Tachibana, H., et al., Cytotechnology 16 (1994) 151-157
【非特許文献38】Borys, M.C., et al., Bio/Technology 11 (1993) 720-724
【非特許文献39】Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735
【非特許文献40】Rearick, J.I., et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 6255-6261
【非特許文献41】Davidson, S.K. and Hunt, L.A., J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468
【非特許文献42】Gershman, H. and Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780
【非特許文献43】Baumann, H. and Jahreis, G.P., J. Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949
【非特許文献44】Strube, K.-H., et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771
【非特許文献45】Stark, N.J. and Heath, E.C., Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609
【非特許文献46】Wong, D.C.F., et al., Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177
【非特許文献47】Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534
【非特許文献48】Takuma, S., et al. in Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488
【発明の概要】
【0012】
真核細胞が産生するポリペプチドのグリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量を、培養プロセスで細胞に流加するグルコースの量に基づいて改変できることが
見出された。利用できるグルコースの量を減らすことによって、たとえばＤＧＬ値を１．
０からより小さな、たとえば０．８、０．６、０．５、０．４または０．２の値に変化さ
せることによって、グリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量の改変を
達成できる。ＤＧＬ値またはそれぞれ単位時間当たり利用できるグルコースの量を、一定
にかつ単位時間当たり規定した低い値に維持しなければならない。
【0013】
本明細書に記述する第一観点は、真核細胞においてポリペプチド（一態様においては免疫グロブリン）を調製するための下記の工程を含む方法である：
ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を用意し、
ｂ）グルコース制限度（degree of glucose limitation）（ＤＧＬ）が一定に維持され
、かつＤＧＬが０．８未満である条件下で、その細胞を培養し、そして
ｃ）培養物からポリペプチドを回収する；
その際、マンノース−５糖構造体を含むポリペプチドの画分は、マンノース−５糖構造体
を含むポリペプチドの量、ポリペプチドＧ（０）イソ型の量、ポリペプチドＧ（１）イソ
型の量、およびポリペプチドＧ（２）イソ型の量を含めた合計の１０％以下である。
【0014】
一態様において、ＤＧＬを０．８から０．２までの範囲で一定に維持する。さらに他の態様において、ＤＧＬを０．６から０．４までの範囲で一定に維持する。他の態様におい
て、マンノース−５糖構造体を含むポリペプチドの画分は、マンノース−５糖構造体を含
むポリペプチド、ポリペプチドＧ（０）イソ型、ポリペプチドＧ（１）イソ型、およびポ
リペプチドＧ（２）イソ型を含めた合計の８％以下である。さらに他の態様においてポリ
ペプチドは免疫グロブリンであり、一態様においてクラスＧまたはＥの免疫グロブリンで
ある。
【0015】
本明細書に記述する他の観点は、免疫グロブリンを調製するための下記の工程を含む方法である：
ａ）免疫グロブリンをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を用意し、
ｂ）培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に維持され、かつ単位時
間当たりその培地中でその細胞が最大限に利用できる量の８０％未満に制限された培地中
で、前記の真核細胞を培養し、そして
ｃ）細胞または培地から免疫グロブリンを回収する。
【0016】
一態様において、培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量は一定に維持され、かつ８０％から２０％までの範囲の値に制限される。さらに他の態様において、この範
囲は６０％から４０％までである。他の態様において、培地中の細胞はその培地中で生存
可能な細胞である。
【0017】
本明細書に記述する観点の一態様において、真核細胞はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、昆虫細胞、
またはＳｐ２／０細胞から選択される。一態様において、真核細胞はチャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本明細書に記述する観点の他の態様において、培養は約
ｐＨ７．０から約ｐＨ７．２までの範囲のｐＨ値で行なわれる。
【0018】
本明細書に記述する観点のさらに他の態様において、培養は連続培養またはフェドバッチ培養である。本方法は、他の態様において、ポリペプチドを精製する最終工程を含むこ
とができる。さらに他の態様において、細胞を６〜２０日間、または６〜１５日間、培養
する。さらに他の態様において、細胞を６〜８日間培養する。
【0019】
本明細書に記述する他の観点は免疫グロブリンを含む組成物であり、その際、組成物は本明細書に記述する方法で調製されたものである。
一態様において、免疫グロブリンは抗ＩＬ−６Ｒ抗体である。さらに他の態様において
、抗ＩＬ−６Ｒ抗体はトシリズマブ（Tocilizumab）を含む。他の態様において、抗ＩＬ
−６Ｒ抗体に結合したマンノース−５糖構造体は８％以下である。さらに他の態様におい
て、マンノース−５糖構造体は６％以下である。他の態様において、マンノース−５糖構
造体は４％以下である。さらに他の態様において、抗ＩＬ−６Ｒ抗体に結合したＧ（０）
糖構造体は４０％から４６％までの範囲であり、抗ＩＬ−６Ｒ抗体に結合したＧ（２）糖
構造体は９％から１１％までの範囲である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は、ＤＧＬ制御を用いたフェドバッチ方式における生細胞密度（ａ）および細胞生存率プロフィール（ｂ）である；中空丸：初発細胞密度８×１０５細胞／ｍｌ；中実三角：初発細胞密度１０×１０５細胞／ｍｌ；中空四角：初発細胞密度１２×１０５細胞／ｍｌ。
【図2】図２は、免疫グロブリン産生におけるフェドバッチ方式でのＤＧＬの経時的変化である；丸：初発細胞密度８×１０５細胞／ｍｌ；三角：初発細胞密度１０×１０５細胞／ｍｌ；四角：初発細胞密度１２×１０５細胞／ｍｌ。
【図3】図３は、免疫グロブリン産生におけるフェドバッチ方式によるＤＧＬに基づく流加培地の流加プロフィールである；丸：初発細胞密度８×１０５細胞／ｍｌ；三角：初発細胞密度１０×１０５細胞／ｍｌ；四角：初発細胞密度１２×１０５細胞／ｍｌ
【発明を実施するための形態】
【0021】
本明細書には下記の工程を含む、免疫グロブリンの調製方法を記述する：ａ）免疫グロブリンをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、０．８未満の一定のＤＧ
Ｌ（すなわち、単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定であり、かつ単位時間当
たりその細胞が最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下である）の培地中で培養
し、そして
ｂ）細胞または培地から免疫グロブリンを回収する。
【0022】
本明細書に記述する方法で免疫グロブリンを得ることができ、その際、マンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量は調整したＤＧＬ値に依存し、その量はマンノース−
５糖構造体を含む免疫グロブリンの量、および免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、およ
び免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量の合計
のうちの画分である。一態様において、ＤＧＬは０．８から０．２までである。この態様
において、画分は１０％以下である。他の態様において、ＤＧＬは０．６から０．４まで
である。この態様において、画分は６％以下である。本明細書に記述する方法で、マンノ
ース−５糖構造体をもつ免疫グロブリンの画分が、マンノース−５糖構造体を含む免疫グ
ロブリンの量、免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量
、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量を含む合計の１０％以下である免疫グロブリ
ンを得ることができる。他の態様において、画分は液体クロマトグラフィー法で測定した
面積％画分である。一態様において、ＤＧＬは０．８から０．２までの範囲に維持される
。他の態様において、ＤＧＬは０．６から０．２までの範囲に維持される。さらに他の態
様において、ＤＧＬは０．６から０．４までの範囲に維持される。一態様において、単位
時間当たり細胞が最大限に利用できるグルコースの量は、すべての化合物が過剰にある（
すなわち、細胞の増殖を制限する化合物がない）培養に際して利用されるグルコースの平
均量であり、少なくとも５回の培養に基づいて決定される。一態様において、この画分は
培養７日目に測定される。
【0023】
本発明を実施するのに有用な、当業者に既知の方法および技術は、たとえば下記に記載されている：Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes
I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y. (2001); Glover, N.D. (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, Volu
mes I and II (1985); Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture (1986); Miller, J
.H. and Calos, M.P. (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987); Watson, J.D., et al
., Recombinant DNA, Second Edition, N.Y., W.H. Freeman and Co (1992); Winnacker,
E.L., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J. (ed.), Cell
Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Anima
l Cells: A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y.
(1987)。
【0024】
組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチドの多数の誘導体を製造することができる。そのような誘導体は、たとえば個々のまたは数個のアミノ酸位置において、置換、変更または
交換により修飾されたものであってもよい。誘導体化は、たとえば部位特異的変異誘発に
より実施できる。そのようなバリエーションは当業者が容易に実施できる(Sambrook, J.,
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harb
or Laboratory Press, New York, USA (2001); Hames, B.D. and Higgins, S.G., Nuclei
c acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England)。
【0025】
用語“核酸”は、天然に存在するか、または一部もしくは全体が天然に存在しない核酸分子であって、ポリペプチドをコードするものを表わす。核酸は、単離されるかあるいは
化学的手段で合成できるＤＮＡフラグメントの構築体（build up）であってもよい。核酸
は、たとえば発現プラスミドにおいて、または真核細胞のゲノム／染色体において、他の
核酸に組み込むことができる。用語“プラスミド”には、シャトルプラスミドおよび発現
プラスミドが含まれる。一般にプラスミドは、それぞれ原核細胞におけるプラスミドの複
製および選択のための複製起点（たとえば、ＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（
たとえば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性遺伝子）を含めた、原核細胞増殖ユ
ニットをも含むであろう。当業者には、たとえばポリペプチドのアミノ酸配列を、各アミ
ノ酸配列をコードする対応する核酸に変換するための手順および方法が周知である。した
がって核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によっても、またそれによりコ
ードされるポリペプチドのアミノ酸配列によっても特徴付けられる。
【0026】
用語“発現カセット”は、少なくとも含まれる構造遺伝子が細胞において発現し、場合により細胞から分泌されるのに必要なエレメント、たとえばプロモーター、ポリアデニル
化部位、ならびに３’側および５’側−非翻訳領域を含む核酸を表わす。
【0027】
用語“遺伝子”は、たとえば染色体上またはプラスミド上のセグメントであって、ポリペプチドの発現に必要なものを表わす。遺伝子は、コード領域のほかに、プロモーター、
イントロン、および１以上の転写ターミネーターを含めた、他の機能性エレメントを含む
。“構造遺伝子”は、遺伝子のシグナル配列を含まないコード領域を表わす。
【0028】
用語“発現”は、細胞内での構造遺伝子の転写および翻訳を表わす。細胞内での構造遺伝子の転写のレベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて測定できる。
たとえば、選択した核酸から転写されるｍＲＮＡは、ＰＣＲにより、またはノーザンハイ
ブリダイゼーションにより定量できる(たとえば、Sambrook et al. (前掲)を参照)。核酸
によりコードされるポリペプチドは、種々の方法により定量できる；たとえば、ＥＬＩＳ
Ａによるか、そのポリペプチドの生物活性の測定によるか、またはそのような活性とは無
関係な方法、たとえばウェスタンブロット法もしくはラジオイムノアッセイの使用、その
ポリペプチドを認識してそれに結合する抗体の使用による(たとえば、Sambrook et al. (
前掲)を参照)。
【0029】
用語“細胞”は、ポリペプチドをコードする核酸（一態様においては異種ポリペプチド）が導入された細胞を表わす。用語“細胞”は、プラスミド／ベクターの増殖のために用
いる原核細胞と、構造遺伝子の発現のために用いる真核細胞の両方を含む。一態様におい
て、免疫グロブリンの発現のための真核細胞は哺乳動物細胞である。他の態様において、
哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｂ
ＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、およびハイブリドーマ細胞から選択される。
真核細胞はさらに昆虫細胞、たとえば毛虫の細胞（ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）
、ｓｆ細胞）、ショウジョウバエの細胞（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanog
aster））、蚊の細胞（ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、セスジヤブカ（ヒトスジシマ
カ）（Aedes albopictus））、およびカイコの細胞（カイコガ（Bombyx Mori））などか
ら選択できる。
【0030】
用語“ポリペプチド”は、自然界または合成のいずれで生成したかにかかわらず、ペプチド結合により連結したアミノ酸残基のポリマーを表わす。約２０アミノ酸残基未満のポ
リペプチドを“ペプチド”と呼ぶことができる。１００アミノ酸残基を超えるポリペプチ
ド、または１より多いポリペプチドを含む共有結合および非共有結合した凝集物を“タン
パク質”と呼ぶことができる。ポリペプチドは非アミノ酸成分、たとえば炭水化物基を含
む場合がある。非アミノ酸成分はそのポリペプチドを産生する細胞によってポリペプチド
に付加される可能性があり、細胞のタイプに応じて異なる可能性がある。本明細書中でポ
リペプチドはそれらのアミノ酸配列によりＮ末端からＣ末端方向に規定される。それらへ
の炭水化物基などの付加物は一般に明記されないが、それにもかかわらず存在する可能性
がある。
【0031】
用語“異種ＤＮＡ”または“異種ポリペプチド”は、その細胞内に自然界では存在しないＤＮＡ分子もしくはポリペプチドまたはＤＮＡ分子の集団もしくはポリペプチドの集団
を表わす。細胞種に由来するＤＮＡ（すなわち内在性ＤＮＡ）が宿主のものではないＤＮ
Ａ（すなわち外来ＤＮＡ）と結合するならば、特定の細胞にとって異種であるＤＮＡ分子
はその細胞種に由来するＤＮＡを含む可能性がある。たとえば、細胞のものではないＤＮ
Ａセグメント（たとえば、ポリペプチドをコードするもの）が細胞のＤＮＡセグメント（
たとえば、プロモーターを含む）に作動可能な状態で連結したものを含むＤＮＡ分子は、
異種ＤＮＡ分子とみなすことができる。同様に、異種ＤＮＡ分子は外来プロモーターに作
動可能な状態で連結した内在性構造遺伝子を含むことができる。異種ＤＮＡ分子によりコ
ードされるポリペプチドは“異種”ポリペプチドである。
【0032】
用語“発現プラスミド”は、発現させるべきポリペプチドをコードする少なくとも１つの構造遺伝子を含む核酸を表わす。一般に、発現プラスミドは下記のものを含む；原核細
胞プラスミド増殖ユニット：これには、複製起点、および選択マーカー、たとえば大腸菌
（E. coli）については真核細胞選択マーカーが含まれる；ならびに目的とする構造遺伝
子（単数または複数）の発現のための１以上の発現カセット：これらはそれぞれ、プロモ
ーター、少なくとも１つの構造遺伝子、および転写ターミネーター（ポリアデニル化シグ
ナルを含む）を含む。遺伝子発現は通常はプロモーターの制御下に置かれ、そのような構
造遺伝子はプロモーターに“作動可能な状態で連結”しているべきである。同様に、調節
エレメントとコアプロモーターは、その調節エレメントがそのコアプロモーターの活性を
調節するならば、作動可能な状態で連結している。
【0033】
用語“単離されたポリペプチド”は、付随する細胞成分、たとえばそのポリペプチドと共有結合していない炭水化物、脂質、または他のタンパク性もしくは非タンパク性の不純
物を本質的に含まないポリペプチドを表わす。一般に、単離されたポリペプチドの調製物
は、ある態様においてはそのポリペプチドを高純度形態で、すなわち少なくとも約８０％
の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、９５％を超える純度、
または９９％を超える純度で含有する。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチ
ドを含有することを示すための１方法は、調製物のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ｐａｇｅ）およびそのゲルのクーマシーブリリアントブ
ルー染色の後に単一バンドが出現することによる。しかし、用語“単離された”は、同じ
ポリペプチドが別の物理的形態、たとえば二量体で、または別のグリコシル化もしくは誘
導体化形態で存在するのを除外しない。
【0034】
免疫グロブリンは一般に５つの異なるクラスに配属される：ＩｇＡ（クラスＡの免疫グロブリン）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。これらのクラス間で、免疫グロブリ
ンはそれらの全体的構造および／またはアミノ酸配列が異なるが、同じ構築ブロックをも
つ。完全な免疫グロブリンは２対のポリペプチド鎖から構成される：それぞれ、免疫グロ
ブリン軽ポリペプチド鎖（短い：軽鎖）および免疫グロブリン重ポリペプチド鎖（短い：
重鎖）を含む。これらの鎖は可変部と定常部を含む。軽鎖においては両領域とも１ドメイ
ンからなり、これに対し重鎖においては可変部は１ドメインからなり、定常部は最高５つ
のドメインからなる（Ｎ末端からＣ末端方向へ）：ＣＨ１ドメイン、場合によりヒンジ部
ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および場合によりＣＨ４ドメイン。免疫グ
ロブリンはＦａｂ領域とＦｃ領域に分けることができる。軽鎖全体、重鎖可変ドメイン、
およびＣＨ１ドメインをＦａｂ領域（フラグメント抗原結合領域）と呼ぶ。Ｆｃ領域は、
ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および場合によりＣＨ４ドメインを含む。
【0035】
本明細書中で用いる用語“免疫グロブリン”は、１以上のポリペプチドからなるタンパク質を表わす。エンコーディング免疫グロブリン遺伝子は、種々の定常部遺伝子および無
数の免疫グロブリン可変部遺伝子を含む。“免疫グロブリン”には、一態様において、モ
ノクローナル抗体、およびそのフラグメント、たとえば単離された重鎖、または重鎖定常
部、ならびに融合ポリペプチドであって少なくとも免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインを
含むものが含まれる。本明細書に記述する方法の一態様において免疫グロブリンは完全な
免疫グロブリンであり、他の態様において免疫グロブリンは完全な免疫グロブリンのＦｃ
領域である。他の態様において、免疫グロブリンは免疫グロブリン、または免疫グロブリ
ンフラグメント、または免疫グロブリンコンジュゲートである。
【0036】
用語“免疫グロブリンフラグメント”は、少なくとも免疫グロブリン デルタ、イプシロンもしくはアルファ重鎖のＣＨ２ドメイン、および／または免疫グロブリン イプシロ
ンもしくはデルタ重鎖のＣＨ３ドメインを含む、ポリペプチドを表わす。その誘導体およ
びバリアントであって、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメイン中のＮ−グリコシル化モチ
ーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒが変化していないものも包含される。
【0037】
用語“免疫グロブリンコンジュゲート”は、少なくとも免疫グロブリン デルタ、イプシロンもしくはアルファ重鎖のＣＨ２ドメインおよび／または免疫グロブリン イプシロ
ンもしくはデルタ重鎖のＣＨ３ドメインが、非免疫グロブリンポリペプチドに融合したも
のを含むポリペプチドを表わす。それらにおいて、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメイン
中のＮ−グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒは変化していない。
【0038】
免疫グロブリン重鎖のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７（ＩｇＧ、ＩｇＥ）もしくはＡｓｎ２６３（ＩｇＡ）に、および／またはＣＨ３ドメインのＡｓｎ３９４、Ａｓｎ４４５、
またはＡｓｎ４９６（ＩｇＥ、ＩｇＤ）に結合したオリゴ糖は、二分岐（biantennary）
構造をもつ(Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394)、す
なわちそれらはコア構造
Man(α1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc→Asn
からなり、末端ＧｌｃＮＡｃ残基に任意選択的Ｆｕｃ（α１−６）結合をもつ。このコア
構造の末端マンノースに次式をもつ２つの外側アームが結合している：
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)→Man、および
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)→Man
これらにおいて末端ガラクトース残基は任意選択的である（Ｍａｎ＝マンノース、Ｇｌｃ
ＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコース、Ｇａｌ＝ガラクトース；Ｆｕｃ＝フコース）。
【0039】
【表1】
【0040】
用語“免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量”は、免疫グロブリンのアスパラギン（Ａｓｎ）に
Ｎ−結合した種々の異種二分岐オリゴ糖の量の合計を表わす。Ｇ（２）イソ型はオリゴ糖
構造体の外側アームそれぞれに末端ガラクトース残基をもち、Ｇ（１）イソ型は（α１−
６）または（α１−３）結合した外側アームのいずれかのみにガラクトース残基を保有し
、Ｇ（０）イソ型は両方の外側アームにガラクトース残基を保有しない。
【0041】
用語“マンノース−５糖構造体”は、ポリペプチドのＡｓｎ残基に連結して、５つのマンノース残基および２つのＮ−アセチルグルコースコア残基を含むかあるいはそれらから
なる三分岐（triantennary）構造を形成した、オリゴマンノース構造体を表わす。
【0042】
本明細書に記述する１観点は、下記の工程を含む免疫グロブリンの調製方法である：ａ）免疫グロブリンをコードする１以上の核酸を含む真核細胞、好ましくは哺乳動物細
胞を、培地中の単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に維持され、かつ単位時
間当たりその培地中でその細胞が最大限に利用できる量の８０％未満の値に制限された培
地中で培養し、そして
ｂ）細胞または培地から免疫グロブリンを回収し、これにより免疫グロブリンを調製す
る。
【0043】
この方法で、マンノース−糖５構造体を含む免疫グロブリンを最大で１０％含む免疫グロブリンが得られる。この１０％は、マンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量
、免疫グロブリンＧ（０）イソ型の量、免疫グロブリンＧ（１）イソ型の量、および免疫
グロブリンＧ（２）イソ型の量の合計に基づいて計算される。
【0044】
用語“グルコース制限度”とそれの略号“ＤＧＬ”は、本明細書中で互換性をもって使用でき、培養物中の単一細胞の現時点のグルコース比消費速度−対−その単一細胞または
同じ種類の単一細胞の既知の最大グルコース比消費速度の比を表わす。グルコース制限度
は下記のとおり定義される：
【0045】
【数1】
【0046】
ここで、ｑＧｌｃ＝単一細胞の現時点のグルコース比消費速度；
ｑＧｌｃｍａｘ＝その単一細胞または同じ種類の単一細胞について既知の最大グルコー
ス比消費速度。
【0047】
ＤＧＬはＤＧＬｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅと１の間で変動させることができ、ここでＤＧＬｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ（＜１および＞０）は完全な増殖制限を表わし、１は無制限ま
たは完全なグルコース過剰を表わす。
【0048】
ポリペプチド、たとえば免疫グロブリンへの糖構造体の導入は翻訳後修飾である。各細胞のグリコシル化操作は不完全であるため、発現した各ポリペプチドは、種々の糖構造体
を含むグリコシル化パターンで得られる。したがって、ポリペプチドはそれを発現する細
胞から、同一ポリペプチド、すなわち同一アミノ酸配列をもつものの、異なるグリコシル
化形態を含む組成物の形態で得られる。個々の糖構造体の合計はグリコシル化パターンと
して表わされ、これには糖構造体を全く含まないポリペプチド、異なるプロセシングを受
けた糖構造体および／または異なる組成の糖構造体を含むポリペプチドが含まれる。
【0049】
糖構造体のひとつはマンノース−５糖構造体（高マンノース、Ｍａｎ５、Ｍ５、またはオリゴ−マンノースとも表記される）である。培養時間の長期化に伴って、またはグルコ
ース飢餓状態で、マンノース−５糖構造体を含む組換え産生されたポリペプチドの画分が
増加すると報告されている(Robinson, D.K., et al., Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 7
27-735; Elbein, A.D., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534)。
【0050】
真核細胞が産生するポリペプチドのグリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量を、培養プロセスで細胞に流加するグルコースの量に基づいて改変できることが
見出された。グルコースの量を減らすことによって、すなわちＤＧＬ値を１．０からより
小さな、たとえば０．８、０．６、０．５、０．４または０．２の値に変化させることに
よって、グリコシル化パターンにおけるマンノース−５糖構造体の量の改変を達成できる
ことが見出された。一態様において、ＤＧＬ値は０．８から０．２まで、または０．６か
ら０．４までの範囲内の値で一定に維持される。すなわち、ポリペプチド、一態様におい
て免疫グロブリンの調製は、グリコシル化パターンにおいて規定量のマンノース−５糖構
造体を含むポリペプチドを得るために、培養細胞が利用できるグルコースの量を制限した
条件下で実施できる。細胞が（一態様においては、対数増殖している細胞が）単位時間当
たり最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下の量のグルコースを単位時間当たり
利用できる（すなわち、０．８以下のＤＧＬをもつ）培養により、１．０のＤＧＬをもつ
培養と比較してマンノース−５糖構造体の量が変化したグリコシル化パターンをもつポリ
ペプチドが得られることが見出された。一態様において、細胞密度は生細胞密度である。
さらに、得られるポリペプチド収率が増大する。
【0051】
用語“細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量”は、単一細胞が最適増殖条件下で対数増殖期に何ら栄養素制限のない培養において単位時間当たり最大限に消
費または利用または代謝できるグルコースの量を表わす。したがって、細胞が単位時間当
たり最大限に利用できるグルコースの量は、何ら栄養素制限のない培養において細胞が最
適増殖条件下で対数増殖期に単位時間当たり代謝するグルコースの量を測定することによ
り決定できる。利用できるグルコースの量をそれ以上増加させても、細胞が単位時間当た
り最大限に利用できるグルコースの量はそれ以上は増加しない、すなわち変化しないであ
ろう。この量が単一細胞の最大グルコース消費レベルを規定する。これは、遺伝子修飾し
た形の細胞がよりいっそう高い最大グルコース消費レベルをもつ可能性がないことを意味
するものではない。あるいは、細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量
は、これまでの培養およびモニターされたデータに基づいて決定できる。
【0052】
本明細書に記述する方法は、測定および制御のための努力が最小限に抑えられることに関連して特に実施するのが簡単であり、特に経済的である。
限定ではないが、たとえば栄養素供給が不十分であると、培養細胞は不経済な状態で増
殖して栄養素を最大速度で消費する。消費される培地栄養素のひとつはグルコースであり
、これは培養細胞が細胞の代謝のためのエネルギーおよび構築ブロックを産生するために
代謝する。過剰のグルコースの存在下では、細胞の代謝はグルコースについて最大の代謝
回転速度で進行している。細胞が単位時間当たり最大限に利用できるグルコースの量は、
たとえば、制限されたグルコースでの、すなわちその細胞が単位時間当たり利用できる量
より少ないグルコース量での培養にも用いられる同じ培養条件を用いてまたは同じ培養条
件下で培養された、過剰のグルコースの存在下で対数増殖している細胞のグルコース消費
量から決定できる。この最大量は、固定した時間範囲の最初と最後の細胞密度およびグル
コース濃度を測定することによって、容易に計算できる。この値は、普通は０．００６か
ら１９０ｍｍｏｌ／時間／１０９細胞までの範囲にある(Baker, K.N., et al., Biotechn
ol. Bioeng. 73 (2001) 188-202; WO 98/41611; Muething, J., et al., Biotechnol. Bi
oeng. 83 (2003) 321-334; WO 2004/048556)。一態様において、標準的なプロセス条件下
にｐＨ７．０で、ｑＧｌｃｍａｘは約０．１４２ｍｍｏｌ／時間／１０９細胞である。
【0053】
本明細書に記述する方法は、一態様において、単位時間当たり利用できるグルコースの量が一定に、かつ単位時間当たりその細胞が最大限に利用できるグルコースの量の８０％
以下（０．８≧ＤＧＬ＞０）に維持される条件下で実施され、一態様においては利用でき
るグルコースの量は一定に、かつ６０％以下（０．６≧ＤＧＬ＞０）に、他の態様におい
ては５０％以下（０．５≧ＤＧＬ＞０）に、さらに他の態様においては約４０％に維持さ
れる。本出願で用いる用語“約”は、その数値が厳密な数値ではなく、それはある範囲の
中央点にすぎないことを表わし、その際、その数値は最大１０％変動できる；すなわち、
用語“約４０％”は４４％から３６％までの範囲（ＤＧＬ＝０．４４〜０．３６）を表わ
す。
【0054】
一態様において、培養は、単位時間当たりその細胞が最大限に利用できるグルコースの量の８０％〜１０％の範囲で一定に維持される量のグルコースを単位時間当たり利用でき
る状態で行なわれる（０．８≧ＤＧＬ≧０．１）。他の態様において、利用できるグルコ
ースの量は６０％〜１０％の範囲で一定に維持される（０．６≧ＤＧＬ≧０．１）。さら
に他の態様において、利用できるグルコースの量は５０％〜１０％の範囲で一定に維持さ
れる（０．５≧ＤＧＬ≧０．１）。他の態様において、利用できるグルコースの量は４５
％〜２０％の範囲で一定に維持される（０．４５≧ＤＧＬ≧０．２）。同様に、ある態様
において、利用できるグルコースの量は８０％〜６０％の範囲で一定に維持される（０．
８≧ＤＧＬ≧０．６）。
【0055】
一態様において本方法は、ＤＧＬが一定に約０．４の値に維持される条件下で細胞を培養する工程を含み、これによれば培養は１．０〜０．５のＤＧＬで開始され、ＤＧＬを約
０．４の値に低下させ、その後はこのＤＧＬを一定に維持することを含む。一態様におい
て、ＤＧＬの低下は１００時間以内の期間である。用語“ＤＧＬを一定に維持する”およ
び文法的にそれの均等物は、そのＤＧＬ値がある期間維持されること、すなわちＤＧＬ値
の変動がその数値の１０％以内であることを表わす（たとえば、図２を参照）。
【0056】
免疫グロブリンは、産生後に、直接または細胞を破壊した後に回収される。回収された免疫グロブリンは、一態様において、当業者に既知の方法で精製される。タンパク質精製
のために種々の方法が十分に確立され、広く使用されている；たとえば、微生物タンパク
質によるアフィニティークロマトグラフィー（たとえば、プロテインＡまたはプロテイン
Ｇアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、陽
イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混合型
交換）、チオ親和性（thiophilic）吸着（たとえば、ベータ−メルカプトエタノールその
他のＳＨリガンドによる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（たと
えば、フェニル−セファロース、アザ−アレン親和性（aza-arenophiliｃ）樹脂、または
ｍ−アミノフェニルボロン酸による）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー
（たとえば、Ｎｉ（ＩＩ）−およびＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー材料による）、サイズ
排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（たとえば、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動
）(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。
【0057】
たとえば、免疫グロブリンの精製法は一般に多工程クロマトグラフィー部分を含む。第１工程で、たとえば、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグ
ラフィーにより、免疫グロブリンではないポリペプチドを免疫グロブリン画分から分離す
る。その後、たとえばイオン交換クロマトグラフィーを実施して、個々のクラスの免疫グ
ロブリンを分離し、かつ第１カラムから共溶出した痕跡量のプロテインＡを除去する。最
後に、クロマトグラフィー工程を用いて免疫グロブリン単量体を同じクラスの多量体およ
びフラグメントから分離する。
【0058】
一般的なクロマトグラフィー法およびそれらの使用は当業者に既知である。たとえば下記を参照：Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals
and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl, Z.
(ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Els
evier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Poole, C. F. and Poole, S.
K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991);
Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J
., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001);またはAusubel, F.
M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, In
c., New York (1990)。
【0059】
一態様において、回収した免疫グロブリンを、集団の量、すなわちマンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリン、免疫グロブリンＧ（０）イソ型、免疫グロブリンＧ（１）イ
ソ型、および免疫グロブリンＧ（２）イソ型の量の合計に対する、マンノース−５糖構造
体を含む免疫グロブリンの量により特性分析する。本明細書に記述する方法によれば、マ
ンノース−５糖構造体を含む免疫グロブリンの量は集団の１０％以下であり、他の態様に
おいては集団の８％以下であり、さらに他の態様においては集団の６％以下である。
【0060】
本明細書に記述する方法は、ある態様において、連続培養として、フェドバッチ培養として、またはその組合わせとして、たとえばフェドバッチ培養として開始した後に連続培
養に切り換えて、実施できる。さらに、本明細書に記述する方法は種々の様式で実施でき
る。たとえば一態様においては、ＤＧＬ値が１．０未満の条件下で、すなわちたとえば利
用できるグルコースの量が単位時間当たりその細胞がその培養で最大限に利用できるグル
コースの量の８０％以下である条件下で培養する前に、過剰のグルコース、すなわちＤＧ
Ｌ値が１．０の状態で培養する。他の態様において、たとえば前規定した細胞密度（たと
えば、一態様において１０５細胞／ｍｌ）を得るために、標準培地に含有される量のグル
コース、たとえば１〜１０ｇ／ｌ（培地）で培養を開始する。さらに他の態様において、
培養の開始を過剰量のグルコースの存在下で、すなわち１．０のＤＧＬで行ない、そして
単位時間当たりある量のグルコースを添加する；これは単位時間当たりその細胞がその培
養で最大限に利用できるグルコースの量の８０％以下である。他の態様においては、培地
中に存在するグルコースの量がその培養に際して前設定した値以下に低下した時点で流加
を開始する。最後の２例では、培養に際して利用できるグルコースの量は培養における細
胞の代謝によって減少する。
【0061】
一態様において、本明細書に記述する方法では単位時間当たり利用できるグルコースの量または添加するグルコースの量（最大限に利用できるグルコースの量より少ない）を同
じ値に、すなわち一定に維持する。たとえば、単位時間当たり最大限に利用できるグルコ
ースの量の５０％の量を利用できるように制御する場合、この制御量（ＤＧＬ値に基づく
）はグルコース制限流加を実施しているすべての期間に適用される。ただし、この数値は
生細胞の絶対密度に依存した相対値であるので、生細胞密度が培養中に変化する（すなわ
ち、それは初期に増加し、最大に達し、その後、再び低下する）のに伴って、利用できる
グルコースの絶対量は変化する。相対値は一定に（すなわち、たとえば８０％に）維持さ
れるけれども絶対基準値が変化する（すなわち、生細胞密度が増大する）ので、相対的な
絶対値も変化する（すなわち、増加する数値の８０％も増加する）。
【0062】
用語“単位時間当たり”は、固定した時間範囲、たとえば１分、１時間、６時間、１２時間、または２４時間を表わす。一態様において、単位時間は１２時間または２４時間で
ある。本出願で用いる用語“単位時間当たり利用できるグルコースの量”は、下記のもの
の合計を表わす：１）固定した時間範囲の開始時の培養の培地中に含有されるグルコース
の量、および２）その単位時間中に添加した、すなわち流加したグルコースの量。したが
って、ある量のグルコースを細胞培養培地に、たとえば培養容器に添加すると、これは固
定した時間範囲の開始時の培地中のグルコースの量を前決定量まで増加させる。この量の
グルコースは、固体として、水に溶解して、緩衝液に溶解して、または栄養培地に溶解し
て添加することができ、その際、水および緩衝液はグルコースを含有すべきではない。添
加されるグルコースの量は、利用できるグルコースの量から培養容器内の培地中に存在す
るグルコースの量を差し引いたものに相当する。この量のグルコースを添加するプロセス
は、前記の単位時間中に１回添加として、少量の等分の多数回添加として、または連続添
加として実施できる。
【0063】
本明細書に記述する方法はいかなる種類の培養にも、またいかなる培養規模にも適切である。たとえば、一態様において、この方法は連続法またはフェドバッチ法に用いられる
；他の態様において培養容量は１００ｍｌから５０，０００ｌまでであり、他の態様にお
いては１００ｌから１０，０００ｌまでである。本明細書に記述する方法は、マンノース
−５糖構造体をもつ免疫グロブリンが１０％以下、または８％以下、または６％以下であ
る免疫グロブリンの調製に有用である。一態様において、免疫グロブリンは免疫グロブリ
ンＧまたはＥである。本明細書に記述する方法は真核細胞を含み、この細胞は免疫グロブ
リンの重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸、および免疫グロブリンの軽鎖また
はそのフラグメントをコードする核酸を含む。真核細胞は、一態様においてＣＨＯ細胞、
ＮＳ０細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、Ｓｐ２
／０細胞、ＨＥＫ細胞、および昆虫細胞から選択される。
【0064】
当業者はグルコースの量のほか、種々の細胞が最適増殖のために要求する培地の組成および成分ならびに栄養素濃度を周知しており、その細胞の培養に適切な培地を選択するで
あろう(たとえば、Mather, J.P., et al., Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fe
rmentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2 (1999) 777-785を参照)。
【0065】
一態様において、本明細書に記述する方法に従った培養に際して細胞が利用できるはずのグルコースの量は、培養容器内において特定の培養時点でその容量の培養容器および最
大限に利用できるグルコースの量で普通に達成できる生細胞密度に、単位時間当たりの対
数増殖中の細胞数、および意図するＤＧＬを掛けることにより計算される。より詳細には
、その実際の時点以前の培養中のグルコース濃度の経過および培養中の細胞密度の経過か
ら、将来のグルコース濃度および細胞密度の経過を推定する。この推定を用いて、意図す
るＤＧＬを達成するために添加しなければならないグルコースの量を、次式により計算す
る：
(グルコース添加量[グルコースpg/ml/時間])＝
(現時点の細胞密度[細胞/ml])×(細胞の最大グルコース消費速度[グルコースpg/細胞/時
間])×(DGL値)−培養容器内の培地中に存在するグルコースの量
一態様において、培養のｐＨ値はｐＨ６．５〜ｐＨ７．８である。他の態様において、
ｐＨ値はｐＨ６．９〜ｐＨ７．３である。さらに態様において、ｐＨ値はｐＨ７．０〜７
．２である。実施例１に概説するように、一定流加法で制限グルコース流加とｐＨ値７．
０を組み合わせると、ｐＨ値７．２と比較してＭ５含量を規定値、すなわち８％未満に効
率的に調節できることが見出された。それぞれ７．０または７．２のｐＨ値でフェドバッ
チ法での培養に際して、ＤＧＬ制御法を用いるとＭ５含量を５．５％未満に調節できるこ
とが見出された。培養のｐＨ値を低下させるとＤＧＬ値の低下によるＭ５量の増加に対抗
できることが見出された。
【0066】
培養は、一態様において２７℃〜３９℃で、他の態様において３５℃〜３７．５℃で実施される。
本明細書に記述する方法では、糖構造体を含むいずれかのポリペプチド、たとえば免疫
グロブリン、インターフェロン、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、プラスミノーゲン
アクチベーター、エリスロポエチンなどを調製できる。
【0067】
本明細書に記述する方法における培養は、哺乳動物細胞培養のためのいずれかの撹拌式または振とう式装置、たとえば発酵槽タイプのタンク培養装置、エアリフト（air lift）
タイプの培養装置、培養フラスコタイプの培養装置、スピナーフラスコタイプの培養装置
、マイクロキャリヤータイプの培養装置、流動床タイプの培養装置、中空繊維タイプの培
養装置、ローラーボトルタイプの培養装置、または充填床タイプの培養装置を用いて実施
できる。
【0068】
本明細書に記述する方法は、一態様において最高１５日間実施される。他の態様において、培養は６〜１５日間行なわれる。一態様において、免疫グロブリンは抗ＩＬ−６Ｒ抗
体である。
【0069】
本明細書に記述する方法を、たとえばEP 0 409 607、EP 0 628 639、US 5,670,373、またはUS 5,795,965（本明細書にそれらの全体を援用する）に記述されたヒトインターロイ
キン−６受容体に対する抗体について例示する；この抗体およびそれを発現する細胞系は
本発明の時点で我々の実験室において十分な量で入手できたからである。これは本発明の
範囲を限定するものではない。
【0070】
以下の実施例および図面は本発明の理解を補助するために示すものであり、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に示される。ここに示す方法において本発明の精神から逸脱する
ことなく改変をなしうることを理解すべきである。
【実施例】
【0071】
材料および方法細胞系：
組換え産生される免疫グロブリンのマンノース−５糖構造体の量を改変できるＣＨＯ細
胞系の例は、EP 0 409 607およびUS 5,795,965による抗ＩＬ−６Ｒ抗体をコードする核酸
を含むＣＨＯ細胞系である。この組換えＣＨＯ細胞の培養のためには、本発明の方法によ
るグルコース補給を実施できる限り、いかなる培地も使用できる。培地の例はＩＭＤＭ、
ＤＭＥＭもしくはＨａｍのＦ１２培地、またはその組合わせであり、それらを培地成分と
グルコースの質量比が受け継がれるように本明細書に記述する方法に適合させた。培地か
らグルコースを排除し、それを別個に培養に添加することもできる。
【0072】
培養：抗ＩＬ−６Ｒ抗体を発現するＣＨＯ細胞を１ｌまたは２ｌの発酵容器で培養した。流加
培地は１５〜４０ｇ／ｌのグルコースを含有していた。グルコースは、たとえば４００ｇ
／ｌのグルコースを含有する別個の濃厚溶液で流加することができた。ｐＨ７．０から７
．２までの範囲のｐＨ値で培養を実施した。
【0073】
糖構造体の決定：ＩｇＧグリコシル化パターンの分析のために、Kondoらによる方法(Kondo, A., et al.,
Agric. Biol. Chem. 54 (1990) 2169-2170)を用いた。ＩｇＧを、培地の遠心上清から小
規模プロテインＡカラムを用いて精製した。精製ＩｇＧのオリゴ糖をＮ−グリコシダーゼ
Ｆ(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)により放出させ、還元末端を２−アミ
ノピリジンで標識した。標識したオリゴ糖を逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
分析した。質量分析およびオリゴ糖の標準品の両方により、各ピークの帰属を判定した。
【0074】
グルコースの測定：YSI 2700 SELECT（商標）分析計(YSI, Yellow Springs, OH, USA)を用い、製造業者の
マニュアルに従った方法でグルコース濃度を測定した。
【0075】
生細胞密度の測定：自動イメージプロセシングおよび分析システム(CEDEX（登録商標）; Innovatis, Germa
ny)、ならびにトリパンブルー色素排除法を用いて、生細胞密度を測定した。
【0076】
実施例１ＤＧＬ制御およびｐＨが抗体産生およびマンノース−５糖構造体（Ｍ５）含量に及ぼす
影響
ヒト化した抗ＩＬ−６受容体抗体（トシリズマブ(Tocilizumab）, RoACTEMRA（登録商
標）)を産生するＣＨＯ細胞株を用いて試験を実施した；これは、日本国公開特許公報第9
9902/1996の参考例２に記載された方法に従い、国際特許出願公開No. WO 92/19759 (US 5
,795,965、US 5,817,790、およびUS 7,479,543に対応する)の例１０に記述されたヒト伸
長因子Ｉαプロモーターを用いて調製された。
【0077】
定速流加法で、ｐＨ制御が免疫グロブリン産生に及ぼす影響を観察した。表２は、定速流加法でｐＨ制御が抗体オリゴ糖産生およびＭ５含量に及ぼす影響を示す。
【0078】
【表2】
【0079】
ｐＨ７．０では、マンノース−５糖構造体（Ｍ５）の量は５．５％未満に調節された。ＤＧＬ値は細胞密度の変化のため０．８０から０．２１まで低下した。他方、ｐＨ７．２
ではＭ５の量は８．７％と２５．２％の間で変動し、ｐＨ７．０の場合より高かった。ｐ
Ｈ７．２におけるＤＧＬ値は０．７３から０．２５までの範囲であった。さらに、この場
合、ｐＨ７．２での免疫グロブリン産生は１２０％を超えた（ｐＨ７．０に比較した相対
値）。定速流加法で免疫グロブリン産生がより高いと、より高い８％を超えるＭ５含量が
誘導される。したがって、定速流加法でｐＨ７．０に制御して、ｐＨ７．２に制御した方
法と比較してＭ５含量をより低い値、すなわち８％未満に効率的に調節できた。
【0080】
種々のｐＨでのフェドバッチ方式による免疫グロブリン産生のために、ＤＧＬ制御法（＝一定相対量流加法）も採用し、Ｍ５含量を分析した。表３は、流加開始後２〜３日目の
ＤＧＬ制御およびｐＨが免疫グロブリン産生およびＭ５含量に及ぼす影響を示す。
【0081】
【表3】
【0082】
ｐＨ７．０において、０．２から０．８までの範囲のＤＧＬでＤＧＬ制御法を適用した。その結果、Ｍ５含量は４．０％以下に調節された。他方、ｐＨ７．２ではＤＧＬ値を０
．４から０．６までの範囲で操作した。この場合、Ｍ５含量を５．５％未満に制御できた
。
【0083】
実施例２種々のＤＧＬ値での培養
抗ＩＬ−６Ｒ抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞の培養を種々のＤＧＬ値で実施し
た。結果を下記の表４にまとめる。
【0084】
【表4】
【0085】
定速流加法と比較して、ＤＧＬ値０．４〜０．６での制御ＤＧＬ法はマンノース−５含量の低下を示す。
実施例３
種々の流加法での培養
抗ＩＬ−６Ｒ抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞の培養を１種類のＤＧＬ値で、た
だし種々の流加法を用いて実施した。結果を下記の表５にまとめる。
【0086】
【表5】
【0087】
単一流加培地流加実験では、すべての栄養素およびグルコースを含有する単一の流加物を用いた。二種培地流加実験では、すべての栄養素およびグルコースを含有する２種類の
流加物を用いた：第１流加物はすべての栄養素および１５ｇ／ｌの低濃度のグルコースを
含有し、第２流加物は高濃度のグルコースを含有する。これらの種々の流加実験を、一方
の設定では流加速度を毎日調整して実施し、他方の設定では以前の培養における生細胞密
度変化記録計に基づく前決定プロフィールに従って実施した。表５から分かるように、生
存率および生細胞密度は採用した流加法とは無関係に類似する。
【0088】
実施例４フェドバッチ方式による免疫グロブリン調製のためのグルコース制限度（ＤＧＬ）制御
ＣＨＯ細胞（８．０〜１２×１０５細胞／ｍｌ）を前記の無血清培地に接種した。細胞
を３７℃、９８％相対湿度、および１０％ ＣＯ２の雰囲気で増殖させた。フェドバッチ
培養で、主発酵槽へ培養開始から２日目または３日目に流加するように、グルコースを含
有する培地の流加を開始した。流加法はグルコース制限度（ＤＧＬ）を制御するための米
国特許出願公開公報 US 2006/0127975 A1による方法に従った。ＤＧＬは、観察されたグ
ルコース比消費速度−対−これらの細胞が自由にグルコースを利用できる場合の既知の最
大グルコース比消費速度の比として定義できる（ＤＧＬ＝Ｑ（ｇｌｃ）／Ｑ（ｇｌｃ）ｍ
ａｘ，ここで、Ｑ（ｇｌｃ）＝現時点で観察されたグルコース比消費速度；Ｑ（ｇｌｃ）
ｍａｘ＝これらの細胞についての既知の最大グルコース比消費速度）。
【0089】
図１は、この培養の生細胞密度および細胞生存率プロフィールを示す。図２に示すように、種々の細胞密度でＤＧＬを０．４〜０．５の値になるように制御した。その時点の細
胞密度に応じて流加速度を１日１回または２回変化させた。図３は、フェドバッチ方式に
よるＤＧＬに基づく流加プロフィールを示す。細胞密度に応じて流加速度を０．８〜１．
６ｍｌ／時間で変化させた。この流加法を適用して、図４に示す免疫グロブリン産生プロ
フィールが得られた。表６に示すように１０×１０５細胞／ｍｌおよび１２×１０５細胞
／ｍｌの接種サイズを用いると、７日目に免疫グロブリン産生はほぼ同じであり、一定流
加法（グルコース０．０２ｇ／時間の流加速度）での免疫グロブリン産生の１２０％を超
えた。初期細胞密度の差２０％にもかかわらず、ＤＧＬ制御法ではほぼ同等の免疫グロブ
リン力価を得ることができた。さらに、接種サイズを８．０×１０５細胞／ｍｌに設定し
た場合、流加開始点の２０時間の遅れにもかかわらず、得られた免疫グロブリンは７日目
に１１０％（相対値）を超えた。これらの結果において、ＤＧＬ制御法は種々の接種サイ
ズで安定な免疫グロブリン産生を達成できた。
【0090】
実施例５ＤＧＬ制御がオリゴ糖のマンノース−５糖構造体およびガラクトシル化に及ぼす影響
ＤＧＬ制御を用いるフェドバッチ培養により産生された免疫グロブリンについて、グリ
コシル化パターンを分析した。表６は、ＤＧＬ制御フェドバッチ培養から得られた免疫グ
ロブリンについてのオリゴ糖分析の結果を、一定流加法（流加速度：グルコース０．０２
ｇ／時間）と比較して示す。８．０×１０５細胞／ｍｌの接種サイズでは、マンノース−
５糖構造体（Ｍ５）の含量は２．８％であった。１０×１０５細胞／ｍｌおよび１２×１
０５細胞／ｍｌの接種サイズでは、Ｍ５含量はそれぞれ４．１％および３．８％であった
。すべての培養条件で、ＤＧＬ制御法はＭ５含量を５．０％未満に調節できた。
【0091】
一方、各条件で、免疫グロブリンＧ（０）イソ型および免疫グロブリンＧ（２）イソ型は、それぞれ４０％から４６％まで、および９．０％から１１％までの範囲で制御された
。
【0092】
【表6】