特許 5982810 試験片を含むキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5982810

(24)【登録日】2016年8月12日

(45)【発行日】2016年8月31日

(54)【発明の名称】試験片を含むキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20160818BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20160818BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160818BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12M1/00 A

   C12N15/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2011-278201(P2011-278201)

(22)【出願日】2011年12月20日

(65)【公開番号】特開2013-128423(P2013-128423A)

(43)【公開日】2013年7月4日

【審査請求日】2014年8月5日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000135036

【氏名又は名称】ニプロ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100163647

【弁理士】

【氏名又は名称】進藤 卓也

(72)【発明者】

【氏名】近藤 裕司

(72)【発明者】

【氏名】末竹 寿紀

【審査官】 水野 浩之

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−２６８３７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０７１１４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３５８９３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｍ

Ｃ１２Ｎ １５／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的遺伝子を検出するためのキットであって、
該キットは、試験片（マイクロアレイを除く）および標準遺伝子を含み、
該試験片には、Ｔ_ｍｉｎ℃からＴ_ｍａｘ℃の温度で該標的遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる検出用プローブ、ならびにハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プローブが固定されており、
該第１プローブは、Ｔ_ｍｉｎ℃よりも低い温度では該標準遺伝子とハイブリダイズするが、Ｔ_ｍｉｎ℃以上の温度では該標準遺伝子とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなり、
該第２プローブは、Ｔ_ｍａｘ℃以下の温度では該標準遺伝子とハイブリダイズするが、Ｔ_ｍａｘ℃よりも高い温度では該標準遺伝子とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなる、
キット。

【請求項2】

前記標準遺伝子の５’または３’末端のいずれか一方が、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質またはビオチンで修飾されている、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

さらに、前記標準遺伝子を含有する遺伝子変性用試薬を含む、請求項１または２に記載のキット。

【請求項4】

標的遺伝子を検出するための方法であって、
請求項１から３のいずれかの項に記載のキットを用い、
（１）前記第１プローブが前記標準遺伝子とハイブリダイズするが、前記第２プローブが前記標準遺伝子とハイブリダイズしない場合は、前記検出用プローブと前記標的遺伝子とのハイブリダイズ温度は適正であると判定し、
（２）前記第１プローブおよび前記第２プロ−ブがともに前記標準遺伝子とハイブリダイズする場合、または前記第１プローブおよび前記第２プロ−ブがともに前記標準遺伝子とハイブリダイズしない場合は、前記検出用プローブと前記標的遺伝子とのハイブリダイズ温度は適正でないと判定する、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試験片を含むキットに関する。

【背景技術】

【0002】

結核菌における薬剤感受性を検出するための試験片（特許文献１および２）、結核菌の薬剤耐性度を判定するための試験片（特許文献３）、結核菌および非結核性抗酸菌を検出するための試験片（特許文献４）などが報告されている。これらの試験片は、いずれも標的遺伝子とのハイブリダイズの有無を検出することによって、薬剤感受性などを迅速・簡便に判定するための手段であるが、ハイブリダイズ温度が適正でない場合、誤った判定に導く場合がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００８−１４２０７５号公報

【特許文献2】特開２００８−１４２０７６号公報

【特許文献3】特開２０１１−８７４６５号公報

【特許文献4】特開２００９−１８９２８３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止するための標的遺伝子検出用試験片を含むキットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ハイブリダイズ温度モニター用プローブを試験片に固定することによって、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止できることを見出し、本発明を完成させた。

【0006】

本発明は、標的遺伝子を検出するためのキットを提供し、該キットは、試験片および標準遺伝子を含み、該試験片には、Ｔ_ｍｉｎ℃からＴ_ｍａｘ℃の温度で該標的遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる検出用プローブ、ならびにハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プローブが固定されており、該第１プローブは、Ｔ_ｍｉｎ℃よりも低い温度では該標準遺伝子とハイブリダイズするが、Ｔ_ｍｉｎ℃以上の温度では該標準遺伝子とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなり、該第２プローブは、Ｔ_ｍａｘ℃以下の温度では該標準遺伝子とハイブリダイズするが、Ｔ_ｍａｘ℃よりも高い温度では該標準遺伝子とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなる。Ｔ_ｍｉｎ℃からＴ_ｍａｘ℃の温度範囲は、検出用プローブが標的遺伝子と適切にハイブリダイズし得る温度範囲である。

【0007】

１つの実施態様では、上記標準遺伝子の５’または３’末端のいずれか一方は、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質またはビオチンで修飾されている。

【0008】

１つの実施態様では、上記キットはさらに、上記標準遺伝子を含有する遺伝子変性用試薬を含む。

【0009】

本発明はまた、標的遺伝子を検出するための方法を提供し、該方法では、上記キットを用い、（１）上記第１プローブが前記標準遺伝子とハイブリダイズするが、上記第２プローブが上記標準遺伝子とハイブリダイズしない場合は、上記検出用プローブと前記標的遺伝子とのハイブリダイズ温度は適正であると判定し、（２）上記第１プローブおよび上記第２プロ−ブがともに上記標準遺伝子とハイブリダイズする場合、または上記第１プローブおよび上記第２プロ−ブがともに上記標準遺伝子とハイブリダイズしない場合は、上記検出用プローブと上記標的遺伝子とのハイブリダイズ温度は適正でないと判定する。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止するための標的遺伝子検出用試験片を含むキットを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の試験片を模式的に示す概略図である。

【図2】本発明の標準遺伝子およびハイブリダイズモニター用プローブのオリゴヌクレオチドの塩基配列、ならびにハイブリダイズ結果を例示する図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、標的遺伝子を検出するためのキットを提供し、該キットは、試験片および標準遺伝子を含む。

【0013】

標的遺伝子としては、特に限定されず、例えば、微生物を同定するための遺伝子、微生物の薬剤感受性または耐性に関する遺伝子、野生型または変異型の遺伝子が挙げられる。

【0014】

（試験片）
試験片には、所定の温度（Ｔ℃）で標的遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる検出用プローブ、ならびにハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プローブがそれぞれ異なる位置に固定されている。好ましくは、各プローブは一定の間隔で固定されている。さらに、発色を確認するためのコントロールまたはマーカーが固定されていてもよい。

【0015】

試験片は、各プローブを担体表面上に物理的または化学的に固定して作製することができる。担体としては、特に限定されず、例えば、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料などが挙げられる。成形加工性が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。これらの担体は、発色法での検知において、その発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。

【0016】

担体表面にプローブを物理的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法があり、この方法によれば、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる。プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定化の効率を上げる方法もある。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液をディスペンサからニトロセルロース膜上に吐出して、紫外線を照射することによって、比較的容易に種々のプローブを固定化することができる。具体的には、各プローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５〜１．０μＬ／分の量を吐出させながら２．５〜８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが、一定の間隔で並んだ約１〜２ｍｍの幅のストライプとして塗布される。このプローブのストライプが塗布された担体に紫外線を照射することによって、プローブが担体上に固定される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に配置された多数の試験片を一挙に得ることができる。

【0017】

担体表面が金などの金属材料である場合には、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで担体表面を処理することによって、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を介して固定化の効率がよくなることも知られている。

【0018】

プローブに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、公知の種々の方法が用いられる。例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、プローブの末端をトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾する方法があり、修飾プローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによって試験片が得られる。あるいは、ガラス、シリコンなどの無機材料担体をアミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することによって、担体の表面をアミノ化し、次いで、末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させることによって、プローブを固定化する方法もある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、この修飾プローブを含む溶液に担体を２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによって固定化することができる。

【0019】

また、合成されたプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、所望の配列を有するプローブを担体表面上で直接合成する方法も知られている。

【0020】

（検出用プローブ）
検出用プローブは、標的遺伝子を検出するためのプローブであり、所定の温度（Ｔ℃）で標的遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる。好ましくは、標的遺伝子と任意の位置で１塩基異なる遺伝子とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなる。例えば、標的遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチド長は、特に限定されないが、好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１２〜２６ヌクレオチド長である。ハイブリダイズ温度（Ｔ℃）は、オリゴヌクレオチド長、オリゴヌクレオチドの塩基配列などにより、適宜設定される。検出用プローブは、標準遺伝子とはハイブリダイズしない。

【0021】

検出用プローブを構成するオリゴヌクレオチドは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社）を用いることによって、塩基配列を適宜設計することができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて適宜合成することができる。

【0022】

検出用プローブは、試験片に固定するために、好ましくは５’または３’末端のいずれか一方が修飾されている。

【0023】

（標準遺伝子ならびにハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プローブ）
標準遺伝子ならびにハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プローブを構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド長および塩基配列は、特に限定されず、標的遺伝子を検出するための検出用プローブがＴ_ｍｉｎ℃からＴ_ｍａｘ℃の温度で標的遺伝子とハイブリダイズする場合、該第１プローブは、Ｔ_ｍｉｎ℃よりも低い温度では該標準遺伝子とハイブリダイズするが、Ｔ_ｍｉｎ℃以上の温度では該標準遺伝子とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなり、そして該第２プローブは、Ｔ_ｍａｘ℃以下の温度では該標準遺伝子とハイブリダイズするが、Ｔ_ｍａｘ℃よりも高い温度では該標準遺伝子とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドからなる。Ｔ_ｍｉｎ℃からＴ_ｍａｘ℃の温度範囲は、検出用プローブが標的遺伝子と適切にハイブリダイズし得る限り、特に限定されず、例えば２〜４℃、好ましくは２℃である。

【0024】

標準遺伝子ならびにハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プローブを構成するオリゴヌクレオチドは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express（Perkin Elmer社）を用いることによって、塩基配列を適宜設計することができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて適宜合成することができる。

【0025】

ハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プローブは、試験片に固定するために、好ましくは５’または３’末端のいずれか一方が修飾されている。

【0026】

標準遺伝子は、ハイブリダイズモニター用プローブとのハイブリダイズを検出するために、好ましくは５’または３’末端のいずれか一方が放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチンなどで修飾されている。

【0027】

（キット）
本発明のキットは、上記試験片および上記標準遺伝子を含む。さらに、例えば、検体から遺伝子ＤＮＡを抽出するための試薬、遺伝子増幅用試薬、遺伝子変性用試薬、ハイブリダイズ用試薬、プローブと遺伝子のハイブリダイズを検出するための試薬を含む。遺伝子ＤＮＡを抽出するための試薬としては、特に限定されず、例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法などに基づく試薬が挙げられる。遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅用プライマー対を含み、遺伝子増幅用プライマーは、プローブと遺伝子のハイブリダイズを検出するために、好ましくは放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチンなどで修飾されている。遺伝子増幅法としては、特に限定されず、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法が挙げられる。遺伝子変性用試薬としては、遺伝子を１本鎖ＤＮＡに変性する限り、特に限定されない。好ましくは、上記標準遺伝子を含む。ハイブリダイズ用試薬は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするように塩濃度、界面活性剤およびその濃度が適宜設定される。プローブと遺伝子のハイブリダイズを検出するための試薬としては、特に限定されず、例えば、遺伝子増幅用プライマーがアルカリホスファターゼで修飾される場合は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色試薬が挙げられる。

【0028】

（標的遺伝子を検出するための方法）
（１．検体）
検体としては、特に限定されず、例えば、喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物および／または組織生検物などの体液、ならびにこれらから培養して得られた培養物などが挙げられる。

【0029】

（２．遺伝子ＤＮＡの抽出）
上記検体から遺伝子ＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法が挙げられる。この工程は省略してもよい。

【0030】

（３．標的遺伝子の増幅）
遺伝子増幅法としては、特に限定されず、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法が挙げられる。遺伝子増幅用プライマーは、プローブと遺伝子のハイブリダイズを検出するために、好ましくは放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチンなどで修飾されている。検体から遺伝子ＤＮＡを抽出することなく、検体から直接標的遺伝子を増幅してもよい。検出感度を上げるために、例えば、検体から直接標的遺伝子を増幅する場合、ＰＣＲ法の前にNestedＰＣＲ法（特公平６−８１６００号公報）などで標的遺伝子を増幅してもよい。NestedＰＣＲ法におけるプライマーには、通常、ＰＣＲ法で用いるプライマーよりも標的遺伝子の外側に位置する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる。

【0031】

（４．標的遺伝子の検出）
増幅した標的遺伝子を１本鎖ＤＮＡに変性し、試験片とのハイブリダイズ処理を行う。ハイブリダイズ処理の温度などの条件、時間は適宜設定される。ハイブリダイズ処理の結果、例えば、標的遺伝子の遺伝子増幅用プライマーがビオチンで修飾されている場合、増幅したビオチン標識標的遺伝子は、試験片に固定された検出用プローブとハイブリダイズすると、試験片にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを反応させ、次いでＮＢＴ／ＢＣＩＰを反応させることによって、試験片上のプローブにアルカリホスファターゼが結合し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰにより発色する。

【0032】

例えば、５’または３’末端がビオチンで修飾されている標準遺伝子は、試験片に固定されたハイブリダイズモニター用プローブとハイブリダイズすると、試験片にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを反応させ、次いでＮＢＴ／ＢＣＩＰを反応させることによって、試験片上のプローブにアルカリホスファターゼが結合し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰにより発色する。

【0033】

ここで、標的遺伝子を検出するための検出用プローブがＴ℃で標的遺伝子とハイブリダイズする場合、ハイブリダイズモニター用第１プローブが標準遺伝子とハイブリダイズするが、ハイブリダイズモニター用第２プローブが標準遺伝子とハイブリダイズしないときは、検出用プローブと標的遺伝子とのハイブリダイズ温度は適正であると判定し、ハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プロ−ブがともに標準遺伝子とハイブリダイズするとき、またはハイブリダイズモニター用第１プローブおよび第２プロ−ブがともに標準遺伝子とハイブリダイズしないときは、検出用プローブと標的遺伝子とのハイブリダイズ温度は適正でないと判定する。

【0034】

ハイブリダイズ温度が適正でないと判定した場合、検出用プローブと標的遺伝子とのハイブリダイズの結果に基づく判定は誤判定である可能性が高いので、再検出を行う。

【実施例】

【0035】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

【0036】

（実施例１：適正温度における試験片を用いるＲＦＰ感受性の検出）
（１．試験片の作製）
ハイブリダイズモニター用プローブとして、以下の配列番号１および２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる第１プローブおよび第２プローブをそれぞれ調製する。また、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のリファンピシン（ＲＦＰ）感受性を検出するためにプローブとして、以下の配列番号３〜７で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブＳ１〜Ｓ５をそれぞれ調製する。さらに、結核菌のＲＦＰ耐性を検出するためのプローブとして、以下の配列番号８〜１１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプローブＲ２、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂおよびＲ５をそれぞれ調製する。これらのプローブは、６１〜６３℃の温度範囲で標的遺伝子とハイブリダイズするように設計されている。すなわち、Ｔ_ｍｉｎ＝６１℃およびＴ_ｍａｘ＝６３℃である。

【0037】

第１プローブ：5'-atgcatggatgcatgc-3'（配列番号１）
第２プローブ：5'-atgcatgaatgcatgc-3'（配列番号２）
プローブＳ１：5'-gccagctgagccaattcat-3'（配列番号３）
プローブＳ２：5'-ttcatggaccagaacaacccg-3'（配列番号４）
プローブＳ３：5'-ccgctgtcggggttgacc-3'（配列番号５）
プローブＳ４：5'-gacccacaagcgccgact-3'（配列番号６）
プローブＳ５：5'-cgactgtcggcgctgggg-3'（配列番号７）
プローブＲ２：5'-aattcatggtccagaacaaccc-3'（配列番号８）
プローブＲ４ａ：5'-gttgacctacaagcgccga-3'（配列番号９）
プローブＲ４ｂ：5'-ttgaccgacaagcgccgact-3'（配列番号１０）
プローブＲ５：5'-cgactgttggcgctggg-3'（配列番号１１）

【0038】

上記各プローブを構成するオリゴヌクレオチドの５’末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社）を用いてポリチミンの付加を行う。具体的には、上記各プローブ（５０ｍＭ）２μＬ、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ）０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ、ターミナルトランスフェラーゼに添付の反応緩衝液２μＬ、および精製水３．６μＬを混合して反応溶液を調製し、３７℃にて４時間反応させた後、１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを反応溶液に加えることによって、ポリチミン付加されたオリゴヌクレオチドプローブ（１ｐｍｏｌ／μＬ）を得る。

【0039】

次いで、ポリチミン付加されたプローブをそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．７μＬ／分の量で吐出させながら２．５ｍｍ／秒の塗布速度で、２ｍｍの幅のストライプになるようにニトロセルロース膜（縦７５ｍｍ×横１５０ｍｍ：Whatman社）上に２ｍｍ間隔で縦方向に塗布する。その後、ニトロセルロース膜に３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して、プローブを固定化する。次いで、ニトロセルロース膜を、全てのストライプを含むように切断して、５ｍｍ×１５０ｍｍの試験片を作製する。図１に試験片を模式的に示す。

【0040】

（２．ｒｐｏＢ遺伝子の増幅）
本実施例では、結核菌の培養物を検体とし、これらの菌の同定ならびに結核菌のＲＦＰ感受性を検出する例を示す。検体の結核菌はすべて野生型とする。ＲＦＰ感受性を検出するために、検体中に存在し得るＲＮＡポリメラーゼβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子を増幅する必要がある。以下の配列番号１２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる結核菌用プライマーＦ、配列番号１３で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドでかつ５’末端にビオチンを結合させたオリゴヌクレオチドからなる結核菌用プライマーＲ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いるＰＣＲ法により、検体中のｒｐｏＢ遺伝子を増幅する。

【0041】

結核菌用プライマーＦ：5'-ggatggagcgggtggtccggga-3'（配列番号１２）
結核菌用プライマーＲ：5'-gcacgtcgcggacctccagc-3'（配列番号１３）

【0042】

ＰＣＲの反応条件は、変性工程を９４℃にて３０秒、アニール工程を５５℃にて２０秒、鎖伸長工程を７２℃にて２０秒とし、これらの工程を３０サイクル行って、ｒｐｏＢ遺伝子を増幅する。これにより増幅されたＤＮＡの５’末端にはビオチンが結合している。

【0043】

（３．ＲＦＰ感受性の検出）
増幅したＤＮＡ溶液１０μＬに、以下の配列番号１４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドでかつ５’末端にビオチンを結合させたオリゴヌクレオチドからなる標準遺伝子（１０ｎＭ〜１００ｎＭ）、水酸化ナトリウム（０．４Ｍ）およびエチレンジアミン四酢酸（１０ｍＭ）を含有する溶液１０μＬを加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを１本鎖に変性する。この試料溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）およびクエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）を含有する溶液１ｍＬを加えてよく攪拌し、この溶液中で、上記実施例１で作製した試験片を、Ｔ_ｍｉｎ（＝６１）℃とＴ_ｍａｘ（＝６３）℃との中間値である６２℃にて３０分間振とうする。次いで、試験片にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、試験片上の各プローブと結合している遺伝子の５’末端に存在するビオチンに結合させる。さらに、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、試験片上の各プローブに結合しているアルカリホスファターゼを発色により検出する。図１および２にハイブリダイズ結果を例示する。

【0044】

標準遺伝子：5'-gcatgcatgcatgcatgcatgcat-3'（配列番号１４）

【0045】

この結果によれば、第１プローブを塗布した領域は発色するが、第２プローブを塗布した領域は発色しない。これにより、ハイブリダイズ温度が適正であったと判定できる。

【0046】

（比較例１：低い温度における試験片を用いるＲＦＰ感受性の検出）
ＲＦＰ感受性の検出におけるハイブリダイズ温度をＴ_ｍｉｎ（＝６１）℃よりも低い温度である６０℃とした以外は全て実施例１と同様に実施する。図１および２にハイブリダイズ結果を例示する。

【0047】

この結果によれば、検出用プローブを塗布した領域に適正な温度では見られない発色が認められるが、第１プローブを塗布した領域および第２プローブを塗布した領域がともに発色しているため、ハイブリダイズ温度が低かったと判定できる。

【0048】

（比較例２：高い温度における試験片を用いるＲＦＰ感受性の検出）
ＲＦＰ感受性の検出におけるハイブリダイズ温度をＴ_ｍａｘ（＝６３）℃よりも高い温度である６４℃とした以外は全て実施例１と同様に実施する。図１および２にハイブリダイズ結果を例示する。

【0049】

この結果によれば、検出用プローブを塗布した領域に適正な温度では見られる発色が認められない（無発色または弱発色）が、第１プローブを塗布した領域および第２プローブを塗布した領域がともに発色していないため、ハイブリダイズ温度が高かったと判定できる。

【産業上の利用可能性】

【0050】

本発明によれば、ハイブリダイズ温度が不適正であることによって生じる誤判定を防止するための標的遺伝子検出用試験片を含むキットを提供することができる。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]