特許 5985481 抗イディオタイプ抗体の迅速な産生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5985481

(24)【登録日】2016年8月12日

(45)【発行日】2016年9月6日

(54)【発明の名称】抗イディオタイプ抗体の迅速な産生

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/42 20060101AFI20160823BHJP

   C12N 15/02 20060101ALN20160823BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20160823BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20160823BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20160823BHJP

   A61P 37/04 20060101ALN20160823BHJP

   A61P 21/04 20060101ALN20160823BHJP

   A61P 37/06 20060101ALN20160823BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/42

   !C12N15/00 C

   !C12P21/08

   !A61K39/395 M

   !A61K39/395 N

   !A61P43/00 121

   !A61P37/04

   !A61P21/04

   !A61P37/06

【請求項の数】29

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2013-527272(P2013-527272)

(86)(22)【出願日】2011年8月31日

(65)【公表番号】特表2013-538812(P2013-538812A)

(43)【公表日】2013年10月17日

(86)【国際出願番号】US2011050001

(87)【国際公開番号】WO2012030982

(87)【国際公開日】20120308

【審査請求日】2014年8月29日

(31)【優先権主張番号】61/379,089

(32)【優先日】2010年9月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】398050098

【氏名又は名称】バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ダン， ロバート ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ケリー， マリリン アール．

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０５−２５２９８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−２９２９９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−０００４９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０７−５０７２０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５１８３４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１０２２６４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 K W BEKAR et al，ARTHRITIS & RHEUMATISM，２０１０年 ８月，Vol. 62, No. 8，p. 2443-2457

【文献】 M S CRAGG et al，BLOOD，２００４年１０月１５日，Vol. 104, No. 8，p. 2540-2542

【文献】 青塚 新一，抗イディオタイプ抗体による自己免疫疾患の治療，臨床免疫（下巻），株式会社日本臨牀社，１９９０年，１９９０年増刊号，p. 1109-1112

【文献】 R GRUBER et al，CANCER RESEARCH，２０００年 ４月 １日，Vol. 60，p. 1921-1926

【文献】 K HONG et al，JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS，２００４年１０月 ６日，Vol. 294，p. 189-197

【文献】 Keler et al，The Journal of Immunology，２０００年１２月１５日，Vol. 165, no. 12，p. 6738-6742

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／４２

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）非ヒト動物に、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有する第１の抗体、および、Ｂ細胞表面マーカーと結合しマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有する第２の抗体を共投与するステップであって、該Ｂ細胞表面マーカーはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩｇＭ、およびＩｇＤからなる群より選択され、第１および第２の抗体は異なる結合特異性を有する、ステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）の第１の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を単離するステップ
を含む抗イディオタイプ抗体を産生する方法。

【請求項2】

前記非ヒト動物が自己免疫疾患に罹患しやすい請求項１に記載の方法。

【請求項3】

さらに、前記非ヒト動物由来の脾臓細胞および骨髄腫融合パートナーのハイブリドーマ融合物を産生し、前記第１の抗体に特異的に結合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を単離することを含む請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記骨髄腫融合パートナーがＮＳ−１またはＳＰ２／０細胞のいずれかである請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記非ヒト動物がマウスである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記マウスがＩｇＧ２ａのＩｇｈ−１^ｂアレルを発現する請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記マウスが非肥満糖尿病（ＮＯＤ）、非肥満耐性（ＮＯＲ）、ＳＪＬ、Ｃ．Ｂ−１７およびＣ５７ＢＬ／６からなる群より選択される請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記マウスがＮＯＤマウスである請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記共投与が連続して行われる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記連続共投与がブースティング投与として行われる請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記共投与が一斉に行われる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記第１および第２の抗体が１：１の比で投与される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

前記第１および第２の抗体が１：２の比で投与される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

前記第１および第２の抗体が１：４の比で投与される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記第２の抗体が抗ｍＣＤ２０抗体１８Ｂ１２である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の抗体がα４−インテグリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、血管内皮成長因子、上皮成長因子、補体Ｃ５タンパク質、ＥｒｂＢ２、ＣＤ３受容体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４０、リンホトキシンα、リンホトキシンα_１β_２、ＬＩＧＨＴ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ１５４、ＶＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ１６９、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＢＤＣＡ−２、ＤＣＩＲ、ＤＲ６（細胞死受容体６）、ＬＩＮＧＯ−１、Ｔｙｒｏ３、ＲＯＮ受容体チロシンキナーゼ、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体１）、ＨＥＲ３、ＦＮ１４、ＶＥＧＦおよびＣＤ１０３からなる群から選択される抗原と特異的に結合する請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記第１の抗体はリツキシマブの可変ドメインを含む請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記抗イディオタイプ抗体が、治療抗体に特異的に結合する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記治療抗体がアブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブおよびトラスツズマブからなる群から選択される請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記治療抗体がナタリズマブである請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記治療抗体がリツキシマブである請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記治療抗体が被検体内の有害作用に関連する、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。

【請求項23】

前記有害作用が前記被検体内のＢ細胞の減少である請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記有害作用が進行性多病巣性白質脳症である請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記抗イディオタイプ抗体が、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を有する被検体によって産生される抗血小板自己抗体と特異的に結合する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

前記抗イディオタイプ抗体が、重症筋無力症を有する被検体によって産生される抗アセチルコリン受容体自己抗体と特異的に結合する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

前記抗イディオタイプ抗体が、自己免疫疾患を有する被検体によって産生される自己抗体に特異的に結合する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

前記自己免疫疾患がグレーヴス病、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、ＡＮＣＡ関連血管炎、ＩｇＡ腎症、アジソン病、筋萎縮性側索硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、ベルガー病、クローン病、クッシング症候群、グッドパスチャー病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、川崎病、ライター症候群、シェーグレン症候群、ヴェグナー肉芽腫症およびウィルソン症候群からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記被検体がヒトである、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗イディオタイプ抗体およびその抗体を含む組成物の産生方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

抗イディオタイプ抗体は、標的抗体に固有の別の抗体上の、同位体と呼ばれる特定のエピトープを標的とする抗体として定義される。所与の抗体の同位体の集まりがそのイディオタイプを定義し、一般に標的抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に見つかる。ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、１９５０年代以降実験的に使用されてきたが、自己産生した抗イディオタイプ抗体が、抗体産生を制御することにより免疫系の調節をどのように助けることができるかについての現代の理論が提案されたのは１９７０年代中期になってからであった（Ｊｅｒｎｅ， １９７４）。一年後のモノクローナル抗体の産生方法の発見（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５）が、特定の標的抗体にのみ見つかる固有の可変ドメインに特異性を有するモノクローナル抗イディオタイプ抗体の作製および単離への扉を開いた。イディオタイプ抗イディオタイプ免疫制御理論の裏付けとして、新生児マウスに周産期Ｂ細胞融合から得られた抗イディオタイプ抗体を投与することにより、自己反応性Ｂ細胞の発現または増殖をおそらく限定することによりＢ細胞レパートリーを大きく変化させることが実証された（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。

【0003】

モノクローナル抗イディオタイプ抗体の利用について多くの方法が示されてきた。今日、抗イディオタイプモノクローナル抗体の最も一般的な利用は、投与されたモノクローナル抗体の循環血清濃度を測定する薬物動態学的酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）の生体外での開発、または治療マウスモノクローナル抗体（ＨＡＭＡ）、キメラモノクローナル抗体（ＨＡＣＡ）またはヒトモノクローナル抗体（ＨＡＨＡ）に対する抗イディオタイプ免疫反応測定のための単なる陽性標準物質としてであった（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。抗イディオタイプ抗体の特異性により、内因性ポリクローナル循環抗体の存在下において、目的の抗体のみの検出が可能になる。循環治療抗体濃度の正確な定量化が、抗体薬開発の重要な、かつ多くの場合、課題点である。

【0004】

抗イディオタイプ抗体の別の使用には、抗イディオタイプの標的イディオトープの物理的「内部像」としての可変領域の活用がある。元の抗原に模倣エピトープが見つかったという点において、第１の抗イディオタイプ抗体に対する第２世代の抗イディオタイプ抗体の作製には、イディオトープを標的とする可能性を有している（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。これにより、同じまたは近位のエピトープに対して微妙に異なる結合特性を有する、元の抗原に対して新しい抗体を作製することが可能になる。

【0005】

この同じ主題にそって、抗イディオタイプモノクローナル抗体を、特に非タンパク質または潜在的に毒性の病原体に対するワクチンとして使用することができる。これは、インビボでマウスを抗リポ多糖（ＬＰＳ）抗体に対する抗イディオタイプモノクローナルで免疫化することにより、元のＬＰＳ抗原と結合し、それに続く、およびその他の致死的なＬＰＳ免疫投与中、マウスを保護することができる循環抗体を産生することで実証されている（Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。抗イディオタイプモノクローナル抗体の別の積極な使用には、Ｂ細胞リンパ腫の潜在的な治療としてがある（Ｌｅｖｙ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， １９９０）。抗イディオタイプ抗体の産生は困難であり、時間もかかるため、このような取り組みは、個別化治療を提供する上では注目されず、むしろ多数の患者由来のクローン的に異なるリンパ腫のＢ細胞受容体の共有イディオトープを認識した交差反応性抗イディオタイプ抗体を産生することにより注目された。抗リンパ腫治療のこの形態への関心は１９９０年代初期にピークに達し、最終的にはｐａｎ−Ｂ細胞選択性抗ＣＤ２０治療、リツキシマブの成功により薄れていった（Ｃｚｕｃｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。

【0006】

モノクローナル抗体産生のための、マウスの抗イディオタイプ血清力価の作製は、挑戦し続けることができ、長期の免疫化を必要とする。ラットまたはハムスターなどの非マウス種をマウス抗体で免疫化すると、多くの場合、抗原の優位性が重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）定常領域（Ｃ）のエピトープにより示されるため非抗イディオタイプ抗体が産生され、系統またはさらには種特異的であってよい、またはそうでなくてよいアイソタイプに対する抗体を生じる。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する抗体担持コンジュゲート（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６）またはあまり好ましくないＣＦＡ乳剤中の抗体（Ｙａｋｕｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９７２）を使用したマウスの同系免疫化は、抗イディオタイプ抗体の産生する場合に成功しているが、これらの手法は、数か月間にわたり複数回の免疫化を必要とする。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、抗イディオタイプ抗体を調製する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）動物に、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有する第１の抗体、および、Ｂ細胞を標的としマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有する第２の抗体を共投与し、この場合、第１および第２の抗体は、異なる結合特異性を有し、（ｂ）ステップ（ａ）の第１の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を単離することを含む、抗イディオタイプ抗体を産生する方法を提供する。一実施形態において、動物は、自己免疫疾患に罹患しやすい。さらなる実施形態において、動物はマウスである。

【0008】

一実施形態において、本方法はさらに免疫動物由来の脾臓細胞と骨髄腫融合パートナーのハイブリドーマ融合物を産生し、第１の抗体と特異的に結合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を単離することを含む。さらなる実施形態において、骨髄腫融合パートナーはＮＳ−１またはＳＰ２／０細胞のいずれかである。

【0009】

一実施形態において、マウスは、ＩｇＧ２ａのＩｇｈ−１^ｂアレルを発現する。別の実施形態において、マウスは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）、非肥満抵抗性（ＮＯＲ）、ＳＪＬ、Ｃ．Ｂ−１７またはＣ５７ＢＬ／６である。さらなる実施形態において、マウスはＮＯＤマウスである。

【0010】

本発明の一実施形態において、共投与を連続して行う。別の実施形態において、連続共投与をブースティング投与として行う。さらなる実施形態において、共投与は一斉に行われる。

【0011】

本発明の一実施形態において、第１および第２の抗体を約１：１の比で投与する。本発明の一実施形態において、第１および第２の抗体を約１：２の比で投与する。本発明の一実施形態において、第１および第２の抗体を約１：４の比で投与する。

【0012】

本発明の一実施形態において、第２の抗体はＢ細胞表面マーカーと結合する。別の実施形態において、Ｂ細胞表面マーカーはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩｇＭまたはＩｇＤである。さらに別の実施形態において、第２の抗体は抗ｍＣＤ２０抗体１８Ｂ１２である。

【0013】

本発明の一実施形態において、第１の抗体は、α４−インテグリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、血管内皮成長因子、上皮成長因子、補体Ｃ５タンパク質、ＥｒｂＢ２、ＣＤ３受容体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４０、リンホトキシンα、リンホトキシンα_１β_２、ＬＩＧＨＴ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ１５４、ＶＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ１６９、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＢＤＣＡ−２、ＤＣＩＲ、ＤＲ６（細胞死受容体６）、ＬＩＮＧＯ−１、Ｔｙｒｏ３、ＲＯＮ受容体チロシンキナーゼ、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体１）、ＨＥＲ３、ＦＮ１４、ＶＥＧＦおよびＣＤ１０３からなる群から選択される抗原と特異的に結合する。別の実施形態において、第１の抗体は、リツキシマブの可変ドメインを含む。

【0014】

本発明はまた、本明細書に記載の方法により産生された抗イディオタイプ抗体を提供する。

【0015】

一実施形態において、本発明は、本発明の抗イディオタイプ抗体および薬学的に許容される希釈剤、担体、塩または補助剤を含む医薬組成物を提供する。

【0016】

一実施形態において、本発明は、被検体に有効量の本発明の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の治療抗体の半減期を減少させる方法を提供し、この場合、抗イディオタイプ抗体は、治療抗体と特異的に結合する。一実施形態において、本発明は、被検体に有効量の本発明の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の治療抗体の有害作用を最小限にする方法を提供し、この場合、抗イディオタイプ抗体は治療抗体と特異的に結合する。一実施形態において、被検体はヒトである。別の実施形態において、治療抗体は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブまたはトラスツズマブである。さらなる実施形態において、治療抗体はリツキシマブである。

【0017】

本発明の別の実施形態において、有害作用は、被検体内のＢ細胞の減少である。さらなる実施形態において、第１の抗体はナタリズマブである。

【0018】

本発明の別の実施形態において、有害作用は進行性多病巣性白質脳症である。

【0019】

一実施形態において、本発明は、治療抗体と特異的に結合する有効量の本発明の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の治療抗体の免疫原性を無力化する方法を提供する。

【0020】

一実施形態において、本発明は、１つ以上の抗血小板自己抗体と特異的に結合する有効量の本発明の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を処置する方法を提供する。

【0021】

一実施形態において、本発明は、１つ以上の抗アセチルコリン受容体自己抗体と特異的に結合する有効量の本発明の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の重症筋無力症を処置する方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、被検体により産生された１つ以上の自己抗体と特異的に結合する有効量の本発明の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の自己免疫疾患を処置する方法を提供する。一実施形態において、自己免疫疾患は、グレーヴス病、実験的自己免疫性脳脊髄炎、アジソン病、筋萎縮性側索硬化症、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、ベルガー病、クローン病、クッシング症候群、グッドパスチャー病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、川崎病、ライター症候群、シェーグレン症候群、ヴェグナー肉芽腫症またはウィルソン症候群である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）動物に、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有する第１の抗体、および、Ｂ細胞を標的としマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有する第２の抗体を共投与し、第１および第２の抗体は異なる結合特異性を有し、
（ｂ）ステップ（ａ）の第１の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を単離することを含む抗イディオタイプ抗体を産生する方法。
（項目２）
前記動物が自己免疫疾患に罹患しやすい項目１に記載の方法。
（項目３）
さらに、前記免疫動物由来の脾臓細胞および骨髄腫融合パートナーのハイブリドーマ融合物を産生し、前記第１の抗体に特異的に結合するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を単離することを含む項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記骨髄腫融合パートナーがＮＳ−１またはＳＰ２／０細胞である項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記動物がマウスである項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記マウスがＩｇＧ２ａのＩｇｈ−１^ｂアレルを発現する項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記マウスが非肥満糖尿病（ＮＯＤ）、非肥満耐性（ＮＯＲ）、ＳＪＬ、Ｃ．Ｂ−１７およびＣ５７ＢＬ／６からなる群より選択される項目６に記載の方法。
（項目８）
前記マウスがＮＯＤマウスである項目７に記載の方法。
（項目９）
前記共投与が連続して行われる項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記連続共投与がブースティング投与として行われる項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記共投与が一斉に行われる項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記第１および第２の抗体が約１：１の比で投与される項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記第１および第２の抗体が約１：２の比で投与される項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記第１および第２の抗体が約１：４の比で投与される項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記第２の抗体がＢ細胞表面マーカーと結合する項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記Ｂ細胞表面マーカーがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩｇＭまたはＩｇＤである項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第２の抗体が抗ｍＣＤ２０抗体１８Ｂ１２である項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の抗体がα４−インテグリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、血管内皮成長因子、上皮成長因子、補体Ｃ５タンパク質、ＥｒｂＢ２、ＣＤ３受容体、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４０、リンホトキシンα、リンホトキシンα_１β_２、ＬＩＧＨＴ、ＴＷＥＡＫ、ＣＤ１５４、ＶＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ１６９、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＢＤＣＡ−２、ＤＣＩＲ、ＤＲ６（細胞死受容体６）、ＬＩＮＧＯ−１、Ｔｙｒｏ３、ＲＯＮ受容体チロシンキナーゼ、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体１）、ＨＥＲ３、ＦＮ１４、ＶＥＧＦおよびＣＤ１０３からなる群から選択される抗原と特異的に結合する項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記第１の抗体はリツキシマブの可変ドメインを含む項目１８に記載の方法。
（項目２０）
項目１〜１９のいずれかに記載の方法により産生される抗イディオタイプ抗体。
（項目２１）
項目２０に記載の抗体および薬理学的に許容される希釈剤、担体、塩または補助剤を含む医薬組成物。
（項目２２）
被検体に項目１〜１９のいずれかに記載の方法により作製された有効量の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、前記被検体内の治療抗体の半減期を減少させる方法であって、前記抗イディオタイプ抗体が前記治療抗体に特異的に結合する方法。
（項目２３）
被検体に項目１〜１９のいずれかに記載の方法により作製された有効量の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、前記被検体内の治療抗体の有害作用を最小限にする方法であって、前記抗イディオタイプ抗体が前記治療抗体に特異的に結合する方法。
（項目２４）
前記被検体がヒトである項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
前記治療抗体がアブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブおよびトラスツズマブからなる群から選択される項目２２〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記治療抗体がリツキシマブである項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記有害作用が前記被検体内のＢ細胞の減少である項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記第１の抗体がナタリズマブである項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記有害作用が進行性多病巣性白質脳症である項目２３に記載の方法。
（項目３０）
治療抗体と特異的に結合する有効量の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の前記治療抗体の免疫原性を無効化する方法であって、前記抗イディオタイプ抗体が項目１〜１９のいずれかに記載の方法により産生された方法。
（項目３１）
抗血小板自己抗体と特異的に結合する有効量の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を処置する方法であって、前記抗イディオタイプ抗体が項目１〜１９のいずれかに記載の方法により産生される方法。
（項目３２）
抗アセチルコリン受容体自己抗体と特異的に結合する有効量の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、被検体内の重症筋無力症を処置する方法であって、前記抗イディオタイプ抗体が項目１〜１９のいずれかに記載の方法により産生される方法。
（項目３３）
被検体により産生された自己抗体と特異的に結合する有効量の抗イディオタイプ抗体を投与することを含む、前記被検体内の自己免疫疾患を処置する方法であって、前記抗イディオタイプ抗体が項目１〜１９のいずれかの方法により産生される方法。
（項目３４）
前記自己免疫疾患がグレーヴス病、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、ＡＮＣＡ関連血管炎、ＩｇＡ腎症、アジソン病、筋萎縮性側索硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、ベルガー病、クローン病、クッシング症候群、グッドパスチャー病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、川崎病、ライター症候群、シェーグレン症候群、ヴェグナー肉芽腫症およびウィルソン病からなる群から選択される項目３３に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、抗イディオタイプ産生フローチャートを示す。ＮＯＤマウスを、生理緩衝液中の抗原（ＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体）および抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａで一斉に免疫化する（腹腔内投与または静脈内投与）。血清中の抗イディオタイプ抗体価を１０日目に評価する。２１日目に抗原のみ（ＩｇＧ２ａ）をブーストし、２４日目に従来のハイブリドーマ融合を行う。

【図2】図２は、ＮＯＤマウスにおける抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａの投与により抗ｍＣＤ２０に対する抗イディオタイプ抗体反応および共投与されたマウスＩｇＧ２ａが産生されることを示す。（Ａ）ＮＯＤマウス（５匹／群）に抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａまたはアフコシル（ａＦｕｃ）ＩｇＧ２ａを投与した（ＰＢＳ中１００μｇ、腹腔内投与）。１１１０日目に血清を採取し、種々の血清希釈にて１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａに対する抗イディオタイプ抗体の存在について、ＥＬＩＳＡ法によりを評価した。２Ｂ８ ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１ａ抗体はヒトＣＤ２０を認識し（マウスＣＤ２０は認識しない）、これらの抗体をγ２ａおよびγ１アイソタイプに対するＩｇＧ反応を検出するためにコントロールとして使用した。バーは、実施例１で定義されるように、各群当たり平均ＩｇＧ力価±標準誤差を表す。１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを注射された動物のみが強力な抗イディオタイプ反応を生じた。１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ｃを注射したマウスにおいて抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２に対する抗イディオタイプ反応が弱かった。（Ｂ）ＮＯＤマウス（４匹／群）に２Ｂ８ ＩｇＧ２ａと抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａまたは抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ１ｂのいずれかを投与した（各抗体においてＰＢＳ中１００μｇ／マウス、腹腔内投与）。１１日目に血清を採取し、抗イディオタイプ抗体（１／１００または１／２００血清希釈液）の存在について、ＥＬＩＳＡ法により評価した。バーは各群当たり平均反応±標準誤差を表す。水平の点線は試験血清の非存在下におけるアッセイのバックグランド信号を示す。２Ｂ８に対する抗イディオタイプ抗体は、２Ｂ８抗体のＩｇＧ１ａおよびＩｇＧ２ａアイソタイプ両方と同様に結合した。

【図3】図３は、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａに対する抗イディオタイプ反応が抗ｍＣＤ２０の非存在下においてブースティングにより増幅されることを示す。ＮＯＤマウスを２Ｂ８ ＩｇＧ２ａのみ（▲）または抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ（□）を併用して免疫化した。抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ処置した動物を３週間後に２Ｂ８ ＩｇＧ２ａのみでブーストした（●）。全ての抗体は腹腔内投与された（ＰＢＳ中１００μｇ／マウス）。各免疫後１０日目に血清を採取した。２Ｂ８ ＩｇＧ１ａ被覆プレートの２Ｂ８イディオタイプに特異的な力価をＥＬＩＳＡ法により評価した。１群ｎ＝４のデータ点は平均＋標準誤差を表す。

【図4】図４は、ＮＯＤマウスにおける抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを共投与した抗原の免疫原性の増強がＩｇＧ２ａ抗体の可変ドメイン（イディオタイプ）に限定されることを示す。ＮＯＤマウス（３〜４匹／群）を抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａの有無に関わらず記載の抗原で免疫化した（ＰＢＳ中各１００μｇ／マウス、腹腔内投与）。１０日目にマウスを採血し、ＴＮＰ−Ｏｖａ（ＴＮＰ−フィコールまたはＴＮＰ−ＫＬＨ免疫動物）または免疫原（ＢＤＣＡ−２、Ｍ２９０、２Ｂ８または１８Ｂ１２免疫動物）が異なるＦｃを含有する抗原に結合するＩｇＧ抗体について、血清をＥＬＩＳＡ法により試験した。各バーは平均血清力価±標準誤差を表す。

【図5】図５は、抗マウスＣＤ２０ ＩｇＧ２ａとヒトＩｇＧ１抗体の共投与は抗イディオタイプ反応を生じないことを示す。ＮＯＤマウス（３匹／群）を抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａの有無に関わらず、ｈＩｇＧ１野生型またはｈＩｇＧ１アフコシル（ａＦｕｃ）リツキシマブまたはルミリキシマブ（各抗体１００μｇ／マウス、腹腔内投与）を併用して免疫化した。１０日目に血清を採取し、記載の抗原に対する力価をＥＬＩＳＡ法により評価した。非イディオタイプ抗ｈＩｇＧ１抗体を吸収するため、血清をＣＥ９．１（ｈＩｇＧ１抗ヒトＣＤ４、１００μｇ／ｍｌ）と４５分間プレインキュベーションした後、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。バーは平均力価±標準誤差を示す。リツキシマブまたはルミリキシマブに特異的な抗イディオタイプ抗体価は、それぞれ２Ｂ８ ｍＩｇＧ１（黒バー）またはルミリキシマブ ｈＩｇＧ４（白バー）に対する反応として明らかとなっている。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを共投与されていない動物における低いｃ２Ｂ８ ｈＩｇＧ１力価またはルミリキシマブ ｈＩｇＧ１力価は、ヒトＩｇＧ１に対する主要な免疫反応のＣＥ９．１による吸収が不完全であることを反映する。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２を投与された動物における同様な力価の欠失は、抗ｍＣＤ２０媒介型Ｂ細胞減少によるｈＩｇＧ１に対する一次免疫反応の抑制を反映する。

【図6】図６は、抗イディオタイプ抗体をブロッキングまたは非ブロッキングできることを示す。ビオチン化抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ１ｂの希釈液を記載の抗イディオタイプ抗体のそれぞれとプレインキュベーションした（５μｇ／ｍｌ、４５分）。次いで、混合物をｍＣＤ２０トランスフェクト細胞（３００．１８）とインキュベーションした。細胞結合ビオチン抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２をストレプトアビジン−ＡＰＣを用いて検出し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにおいてフローサイトメトリーにより定量化した。ＭＦＩは、ＣＤ２０＋染色細胞の平均蛍光強度である。ここに示された１８Ｂ１２に対する３つの抗イディオタイプ抗体のうち、５Ａ７抗体のみがビオチン−１８Ｂ１２のｍＣＤ２０への結合をブロックした。

【図7】図７は、抗イディオタイプ抗体が関連性の高いモノクローナル抗体の共有エピトープに結合することができることを示す。結合特異性について、Ｃ１２抗ヒトＢＣＭＡに対する３つの抗イディオタイプ抗体、２Ａ１１、２Ｃ１２および７Ｄ１０をＥＬＩＳＡ法により試験した。９６ウェルプレートのウェルを抗ヒトＢＣＭＡ（Ｃ１１ ｍＩｇＧ１、Ｃ１２ ｍＩｇＧ１、Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ、Ｃ１３ ｍＩｇＧ１、Ａ２ ｍＩｇＧ２ｂまたはＶｉｃｋｙ−１ラットＩｇＧ１）、抗マウスＢＣＭＡ（Ｖｉｃｋｙ−２ラットＩｇＧ２ａ、ＩＸ０７ラットＩｇＧ１またはＹＤ０７ラットＩｇＧ２ａ）またはアイソタイプコントロール抗体（２Ｂ８ ｍＩｇＧ２ａまたは１８Ｂ１２ ｍＩｇＧ２ａ）のいずれかで被覆した。被覆したウェルへの結合について、Ｃ１２に対する精製抗イディオタイプ抗体を試験し（各抗体１μｇ／ｍｌ）、ビオチンマウス抗マウスＩｇＧ１ｂ（クローンＢ６８−２）およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼで検出した。バーは各抗原に対する平均反応を示す。Ｃ１２に対する各抗イディオタイプ抗体は、非常に関連のある抗体Ｃ１１、Ｃ１２およびＣ１３への検出可能な結合を示したが、他の試験した抗体へは示さなかった。

【図8】図８は、抗ｍＣＤ２０：抗原の最適比の決定を示す。ＮＯＤマウス（５匹／群）を記載の量の抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよび２Ｂ８ ＩｇＧ２ａで免疫化した（ＰＢＳ中、腹腔内投与）。１０日目にマウスを採血し、２Ｂ８ ＩｇＧ１ａへの結合について、血清をＥＬＩＳＡ法により評価した。各点は５匹のマウスの平均反応±標準誤差である。四角で囲われた抗原比（抗ｍＣＤ２０ １００μｇ：２Ｂ８ １００μｇ）を全ての免疫前として使用した。

【図9】図９は、抗イディオタイプ抗体反応が１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを投与したＮＯＲマウスおよびＳＪＬマウスに生じることを示す。示された系統のマウスを抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中１００μｇ、腹腔内投与）、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中１００μｇ、腹腔内投与）または抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよび２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ両方（ＰＢＳ中各１００μｇ、腹腔内投与）で免疫化し、１０日目に採血し、１８Ｂ１２ ＩｇＧ１ａ、２Ｂ８ ＩｇＧ１ａまたはコントロール ｍＩｇＧ２ａへの結合について、血清をＥＬＩＳＡ法により評価した。各バーは、５匹のマウス／群の平均血清ＩｇＧ力価±標準誤差である。

【図10】図１０は、ブロッキング抗イディオタイプ５Ａ７の抗ｍＣＤ２０処置マウスへの投与が抗ｍＣＤ２０を無力化し、Ｂ細胞の再集合を開始させることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（４匹／群）に抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与）またはＰＢＳを投与した。７日後、抗イディオタイプ抗体５Ａ７（２５０μｇ／マウス、腹腔内投与）またはＰＢＳを投与した。マウスを抗イディオタイプ投与後１、３および７日目に屠殺し、ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞について、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をフローサイトメトリーにより分析した。各バーは総リンパ球（ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋）のＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合を表す（平均±標準誤差）。割合をＰＢＳコントロール群に対して正規化した（１００％）。

【図11】図１１は、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２がＢ細胞に予備被覆された場合または可溶性投与によってのみ抗イディオタイプ抗体反応を誘発することを示す。Ａ．脾臓細胞（５×１０７、Ｔ細胞およびＢ細胞）および胸腺細胞（５×１０７、Ｔ細胞）を生体外で１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａまたは抗Ｈ−２Ｄｂ ＩｇＧ２ａ（クローン２７−１１−１３Ｓ）で被覆し、洗浄し、可溶性２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ（５０μｇ）の有無に関わらずＮＯＤマウスに腹腔内注射した。１０日後に血清を採取し、２Ｂ８または１８Ｂ１２に対するＩｇＧ反応をＥＬＩＳＡ法により評価した（１／１００血清希釈液）。バーはマウス５匹／群当たりの平均血清ＩｇＧ力価＋標準誤差を表す。Ｂ．ＮＯＤマウス（５匹／群）に、可溶性抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａまたは抗ｍＣＤ１０３ Ｍ２９０ ＩｇＧ２ａの有無に関わらず未処置のＳＫＷ６．４細胞または抗ヒトＣＤ２０ ２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ処置ＳＫＷ６．４細胞（ヒトＣＤ２０＋バーキットリンパ腫、細胞１×１０７個／マウス）を腹腔内投与した。１０日目に血清を採取し、抗２Ｂ８または抗１８Ｂ１２抗イディオタイプまたは抗ＩｇＧ２ａアイソタイプＩｇＧ反応の存在について、ＥＬＩＳＡ法により評価した。バーは平均血清ＩｇＧ力価＋標準誤差を表す。ＳＫＷ６．４細胞＋Ｍ２９０ ＩｇＧ２ａまたは２Ｂ８ ＩｇＧ２ａおよびＭ２９０ ＩｇＧ２ａで免疫化したマウスのＩｇＧ反応が小さいのは、ＩｇＧ２ａ Ｆｃに対する反応を表しており、抗イディオタイプＩｇＧ反応ではなかった。２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ抗体は、ヒトＢリンパ腫細胞に結合した場合の抗イディオタイプ抗体反応を引き出すことができなかった。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、抗イディオタイプ抗体の産生方法およびその抗体を含有する組成物を提供する。本発明は、収率の高い抗イディオタイプモノクローナル抗体の産生を可能にする。方法および組成物の詳細を本明細書に記載する。

【0024】

「抗イディオタイプ抗体」とは、別の抗体の抗原結合部位に特異的に結合する抗体を意味し、そのため、他の抗体により特異的に結合される。抗イディオタイプ抗体は、通常別の抗体により認識されたエピトープを模倣することができる。イディオタイプは、免疫グロブリンの可変領域において遺伝的に決定された構造のばらつきである。イディオタイプのばらつきの正確な遺伝的根拠について部分的に説明されてきたにすぎない。しかしイディオタイプのばらつきは、アミノ酸配列およびタンパク質構造（いわゆる決定基）に関与し、特に抗原結合部位の領域においては、イディオトープとも呼ばれる。用語「イディオタイプ」は、抗体分子の可変領域の完全な決定基のセットを指す。

【0025】

本明細書において使用される用語「抗体」および「免疫グロブリン」は最も広い意味で交互に用いられ、本明細書に記載のモノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を呈する限り二重特異性抗体）および抗体断片を含む。用語「二重特異性抗体」は２つの異なる結合特異性を有する任意の抗体を含むことを意図し、すなわち、抗体は同じ標的抗原またはより一般的には異なる標的抗原に位置することができる２つの異なるエピトープと結合する。

【0026】

天然の抗体および免疫グロブリンは通常、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合し、その一方で、ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間に変動する。各重鎖および軽鎖はまた規則的な間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、多くの定常ドメインに続いている。各軽鎖は、一端（ＶＬ）に可変ドメインおよびそのもう一端に定常ドメインを有する。折りたたまれた抗体では、軽鎖の定常ドメインを重鎖の第１の定常ドメインと整列させ、軽鎖可変ドメインを重鎖の可変ドメインと整列させる。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界を形成すると考えられている（Ｃｌｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８６， ６５１−６６， １９８５； Ｎｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ４５９２−４５９６ （１９８５））。重鎖定常ドメイン組成に基づいて５つのヒト免疫グロブリンのクラスが定義され、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤと名付けられている。ヒトにおいて、ＩｇＧクラスおよびＩｇＡクラスの抗体をさらにサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に細分される。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体の重鎖は、３つの定常領域ドメインを有し、これはＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を指し、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体の重鎖は４つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を有する。従って、重鎖は１つの可変領域と３つまたは４つの定常領域を有する。免疫グロブリンの構造および機能を例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｈａｐｔｅｒ １４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８８）で総括する。

【0027】

「抗体断片」は無傷の抗体の一部のみを含み、この場合、その一部が、無傷の抗体に存在する場合のその部分と通常関連がある機能の少なくとも１つ、好ましいはほとんどまたは全てを保有することが好ましい。

【0028】

本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体、すなわち、少ない量で存在し得るおそらく自然に発生する突然変異を除き、同一のアミノ酸配列のものである集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、かなり特異的であり、単一の抗原に結合する。さらに、典型的には様々な決定基（エピトープ）に対して指向される様々な抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対して指向される。抗体が「選択的に結合」または「特異的に結合」することは、抗体がより頻繁に、より迅速に、より長い期間、より高い親和性でまたは上記のいずれかの組み合わせで、関連しないタンパク質などの代替物質に比べエピトープと反応し、または関連することを意味する。「選択的に結合」または「特異的に結合」することは、例えば、抗体が少なくとも約０．１ｍＭであるがより通常として少なくとも約１μＭのＫＤのタンパク質に結合することを意味する。「選択的に結合」または「特異的に結合」することは、ある時には抗体が少なくとも約０．１μＭ以上、またある時には少なくとも約０．０１μＭ以上のＫＤを有するタンパク質に結合することも意味する。例えば、抗イディオタイプ抗体は、関連する抗原などの等量の任意の他の抗原のものに比べ、少なくとも２倍、５倍、１０倍、３０倍または１００倍高い抗原との親和性を有することが望ましい。ポリペプチドの別のポリペプチドへの結合は、本明細書に記載のようにおよび当技術分野においてかなり多数の標準的な方法、例えばウェスタン分析、ＥＬＩＳＡ法、蛍光偏光法、表面プラズモン共鳴または共免疫沈降法により決定されることができる。

【0029】

用語「エピトープ」または「抗原決定基」は本明細書において交互に使用され、特定の抗体により認識され、特異的に結合されることができる抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープを、隣接するアミノ酸および３つに折りたたまれたタンパク質により並べられた隣接していないアミノ酸の両方から形成することができる。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは、タンパク質が変性する場合に典型的に保有される一方で、３つに折りたたまれることにより形成されたエピトープは、タンパク質が変性する場合に典型的に失われる。エピトープは典型的に少なくとも３個およびより通常として、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を独自の空間的立体構造に含む。

【0030】

「薬理学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の監督機関により承認もしくは認可され、または米国薬局方あるいは他の一般に認識された、ヒトを含む動物に使用のための薬局方に記載されることを指す。

【0031】

「薬理学的に許容されるベヒクル」は、本開示の少なくとも１つの抗体と合わせて投与される希釈剤、補助剤、賦形剤または担体を指す。

【0032】

本明細書において使用される用語「被検体」は、特定の処置のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むが、それらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳類）を指す。典型的に、用語「被検体」および「患者」は本明細書においてヒト被検体に関し交互に使用される。

【0033】

本発明の抗体を種々の障害を処置するために使用することができる。「障害」は、本発明の抗体または方法を用いた処置により効果を得られる任意の状態である。これは、哺乳類が当該障害に罹患しやすい病的状態を含む慢性および急性の障害または疾患を含む。本明細書において処置される障害の非限定的例として、自己免疫疾患、炎症、細胞増殖性疾患、Ｂ細胞リンパ腫、非白血病腫瘍およびリンパ系腫瘍、神経性の、グリア細胞の、星状細胞の、視床下部のおよび他の腺の、マクロファージの、上皮の、間質のおよび割腔の障害ならびに炎症性、免疫学的または感染性疾患がある。用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、ある程度の異常細胞増殖に関連した障害を指す。一実施形態において、細胞増殖障害はがんである。

【0034】

本明細書において使用される用語「自己免疫疾患」は一般に、自己認識の要素を有するとして特徴づけられる疾患を指す。自己免疫疾患の例として、自己免疫肝炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、橋本甲状腺炎、グレーヴス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、ＣＲＥＳＴ症候群、強皮症、ＩｇＡ腎症、水疱性類天疱、尋常性天疱瘡、ＡＮＣＡ関連血管炎、抗リン脂質症候群およびさらに多くのものがあるがそれらに限定されない。ほとんどの自己免疫疾患は慢性炎症性疾患でもある。これは、炎症細胞（白血球）の長期活性（６ヵ月以上）と関連する疾患過程として定義される。慢性炎症は、患者の器官または組織の損傷を生じる。多くの疾患が慢性炎症性障害であるが、自己免疫の素因を有することは知られていない。例えば、アテローム性動脈硬化、うっ血性心不全、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性多発動脈炎、ウィップル病、原発性硬化性胆管炎およびさらに多くのものがある。

【0035】

本明細書において使用される「処置」は、処置される個体または細胞の自然経過を変更しようと試みる臨床的介入を指し、予防または臨床的病態の経過中のいずれかにおいて行われることができる。処置の望ましい効果として、疾患の発症または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病態の結果の縮減、転移の防止、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または軽減および予後の寛解または改善がある。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を使用し、疾患または障害の発症を遅延させる。

【0036】

「有効量」は、望ましい治療結果または予防結果を得るために必要な用量および期間に有効な量を指す。本発明の抗体の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの因子ならびに個体の望ましい反応を引き出す抗体の能力に従い変化させることができる。治療有効量はまた、抗体の任意の毒性作用または有害作用を治療的に有益な作用が上回るものである。

【0037】

一実施形態において、本発明は、多様なマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体パネルの迅速産生のための生体内での方法を提供する。特定の実施形態において、本方法をマウスに行う。さらなる実施形態において、マウスは自己免疫疾患（例えば、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）系マウス）に罹患しやすい。Ｃ５７ＢＬ／６、１２９およびＳＪＬ系などのＮＯＤマウスは、γ２ｃとしても知られているγ２ａのＩｇｈ−１ｂアレルを発現し、このＩｇｈ−１座の珍しい例であるこのアレルは、Ｉｇｈ−１ａ遺伝子とともに差次的に発現するＩｇｈ−１ａアレルとは別の遺伝子によりコードされる（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。他のＨ鎖アレルとは異なり、これは１個または数個のアミノ酸のみが互いに異なり、Ｉｇｈ−１ａおよびＩｇｈ−１ｂ遺伝子産物であるγ２ａおよびγ２ｃはそれぞれ、それらのＨ鎖Ｃ領域において８５％のみ同一である（Ｍｏｒｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。本発明の方法に有用なマウスの系統は、市販の供給源から得ることができる（例えば、ジャクソン・ラボラトリー、メイン州、バーハーバー）。

【0038】

一実施形態において、本発明は、Ｂ細胞表面抗原と結合する抗体の投与を必要とする抗イディオタイプ抗体を産生する方法を提供する。Ｂ細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１およびＣＤ２３を含むがそれらに限定されない。一実施形態において、標的抗体はＢ細胞表面抗原と結合し、γ２ａＨ鎖Ｃ領域を含有する。一実施形態において、本発明は、標的抗体（抗原）がγ２ａＨ鎖Ｃ領域を含有し、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａと同時に投与されることを必要とするマウスの抗イディオタイプ抗体を産生する方法を提供し、マウス抗ｍＣＤ２０抗体もγ２ａＨ鎖Ｃ領域を含有する。１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａの生理緩衝液の単回投与を行ったマウスは、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２抗体に対して強力な抗イディオタイプ反応を生じた。１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａと抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２とは異なるＩｇＧ２ａ抗体の共投与は、両タンパク質に対する抗イディオタイプ抗体反応を生じた。いくつかの実施形態において、両抗体に対する抗イディオタイプ反応は迅速に生じ、一次免疫の１０〜１１日以内に現れる。第２のＩｇＧ２ａ抗体に対する力価は、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２抗体の非存在下においてＩｇＧ２ａ抗原で続けて免疫化することで増加させることができる。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよび免疫ＩｇＧ２ａ抗原の最適量を確立し、最もよい抗イディオタイプ力価を得た。ＮＯＤにかなり関連のある数種の自己免疫傾向性Ｉｇｈ−１ｂマウス系統に、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよび免疫ＩｇＧ２ａ抗原に対する同様の抗イディオタイプ抗体を産生することも認められた。標準的なハイブリドーマ融合プロトコールを使用して、標的抗体に対する多様なモノクローナル抗イディオタイプ抗体パネルを産生した。

【0039】

本発明の別の態様において、抗体は、検出可能なシグナル生成剤に化学的または生合成的に結合することができる。検出可能なシグナル生成剤は診断目的において生体内および生体外で有用であり、さらに、試料に残る第１の治療抗体の量を検出するために使用することができる。シグナル生成剤は、外部手段、通常、電磁放射の測定法により検出可能である測定可能なシグナルを生成する。大部分において、シグナル生成剤は酵素もしくは発色団であり、または蛍光、リン光または化学発光により光を放射する。発色団は、紫外線または可視領域の光を吸収する染料を含み、酵素触媒反応の基質または分解生成物であってよい。

【0040】

副作用の緩和
治療抗体は、多様な副作用または有害作用を有する恐れがある。有害作用の可能性として、高血圧、白質脳症、免疫監視機構の低下およびＢ細胞の減少があるがそれらに限定されない。

【0041】

本発明は、治療抗体処置と関連のある副作用を低減し、または排除する抗イディオタイプ抗体を利用する組成物および方法を提供する。いかなる理論に制限されることなく、有害作用を排除する１つの考えられる機構は、抗イディオタイプ抗体が治療抗体と結合し、治療抗体がその抗原に結合することを阻害し、または抗体を用いて複雑化することにより阻害し、血液循環からそのクリアランスを促進する。このように、抗イディオタイプ抗体の調節作用は投与依存性であってよい。

【0042】

特定の実施形態において、抗イディオタイプ抗体が治療抗体に特異的に結合するため、抗イディオタイプ抗体を使用し、治療薬または薬物コンジュゲートの半減期を短縮することができる。特定の実施形態において、被検体に治療薬のボーラス投与を行う。規定の期間後に、次いで抗イディオタイプ抗体を投与する。抗イディオタイプ抗体の投与により、クリアランスが速まることにより、治療薬の半減期を減少させる。特定の実施形態において、治療薬のクリアランスの速さが特定の細胞型の再集合または特定の生物学的機能、例えば、新生抗原に対する液性応答の回復を生じる。

【0043】

有害作用は、急性または慢性であってよい。作用は、生化学的、細胞の、組織レベルの、器官レベルの、多臓器レベルの、または生体全体のレベルであってよい。作用を１つ以上の客観的または主観的方法において現すことができ、そのいずれかを使用して作用を測定することができる。作用を客観的または主観的に測定する場合、客観的または主観的作用の評価に適切な任意の方法を使用することができる。例として、個体による評価について視覚的および数値によるスケールなどを含む。

【0044】

本発明の抗体を、自己免疫疾患などの障害の処置に有用な他の化合物と併用して投与することができる。他の化合物、例えば治療抗体を同時に投与することができる。本明細書において使用される用語「同時に」は、併用効果を生じるのに十分に時間的に近いことを意味する（すなわち、同時には、一斉にであってよく、または２つ以上の事象がそれぞれの前後の短時間に生じることであってよい）。

【0045】

本明細書において使用される「同時に」または「併用して」２つ以上の抗体を投与することは、この２つの抗体が一方の存在がもう一方の生物学的作用を変化させるのに十分に時間的に近い状態で投与されることを意味する。２つの抗体を一斉にまたは連続して投与することができる。一斉の投与は、投与前に抗体を混合し、または同じ時点であるが異なる解剖学的部位に化合物を投与し、あるいは異なる投与経路を使用して実施することができる。

【0046】

抗イディオタイプ抗体を投与し、障害に苦しむ患者に対する一次治療の処置の副作用を中和させることができる。特定の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、治療として治療抗体または抗体断片を受容している患者に投与される。抗イディオタイプ抗体を一次治療の副作用を中和させるのに十分な量で投与する。これを達成するのに十分な量は、治療有効用量として定義される。この使用に有効な量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の一般状態に依存する。投与計画も疾患状態および患者の状態とともに変化し、典型的には単回ボーラス投与または連続注入（例えば、４〜６時間毎）から１日当たりの複数回投与の範囲であり、あるいは処置する医師および患者の状態により示される範囲となるだろう。本発明の抗体を４０ｍｇ／体重ｋｇ以上の同じだけの単回投与で投与することができる。より好ましくは、抗体を０．２ｍｇ／体重ｋｇ〜２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲の用量で投与する。しかし、本発明はいかなる特定の用量に制限されないものとする。

【0047】

抗イディオタイプ抗体の配合物を、貯蔵および使用のために本発明の精製抗体と薬理学的に許容されるベヒクル（例えば、担体、賦形剤）と組み合わせて調製する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０００）。適切な薬理学的に許容されるベヒクルは、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの非毒性緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０未満のアミノ酸残基）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質錯体）およびツイーンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むがそれらに限定されない。

【0048】

本発明の医薬組成物を単位剤形で配合し、局所または全身のいずれかの処置のための多くの方法で投与することができる。投与は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ剤、座剤、スプレー、液体および粉末などの局所（例えば、膣送達および直腸送達を含む粘膜への）投与；肺（例えば、ネブライザーによるなどの粉末またはエアロゾルの吸入または送気による；気管内、鼻腔内、上皮および経皮）投与；または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入を含む非経口投与；あるいは頭蓋内（例えば、髄腔内または心室内）投与であってよい。

【0049】

疾患の処置において、本発明の抗イディオタイプ抗体の適切な用量は、中和される有害作用、作用の重症度および経過、疾患の反応性、抗イディオタイプ抗体を治療目的または予防目的で投与するか、事前治療、患者の既往歴など処置する医師の判断において全てに依存する。抗イディオタイプ抗体を一回または数日から数カ月続く一連の処置にわたり、あるいは治癒がもたらされ、または疾患状態の減少が得られるまで投与することができる。最適投与計画を患者の体内の薬剤蓄積の測定から算出し、個々の抗体の相対的効力に応じて変化させる。投与する医師は、最適用量、投与方法および繰返し率を容易に決定することができる。一般に、用量は体重ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｍｇであり、一日、一週間、一か月または一年に１回以上与えることができる。処置する医師は、体液または組織中の薬剤の滞留時間および濃度の測定値に基づき投与の繰返し率を評価することができる。

【0050】

生体外の診断アッセイ
本発明の抗イディオタイプ抗体を、被検体が抗イディオタイプ抗体と特異的に結合する抗体または抗原を発現するかを決定する種々の診断アッセイに使用することができる。抗イディオタイプ抗体が、新生細胞により発現した抗原を模倣することができ、かつ非新生細胞によっては模倣することができないとして、抗イディオタイプ抗体を、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法または組織試料中の腫瘍細胞のその場での検出のためのコントロール抗原として使用することができる。さらに、当業者であれば、患者が抗イディオタイプ抗体と特異的に結合する抗体を発現するかを決定するために抗イディオタイプ抗体を使用することができる。別のアッセイにおいて、抗イディオタイプ抗体を使用して、処置される被検体の血清中に残存する第１の治療抗体の量を測定することができる。本発明の抗イディオタイプ抗体を使用することができる他のアッセイとして、免疫組織化学的染色および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）がある。

【0051】

ＥＬＩＳＡアッセイは典型的に抗イディオタイプ抗体などの、生物学的試料、例えば、がん患者由来の抗体を含有するものに結合する固体支持体に固定されるポリペプチドの使用を含む。生物学的試料由来の抗体が抗イディオタイプ抗体と結合する場合、その後、結合した抗体を、レポーター群を含有し、抗体／抗イディオタイプ抗体の複合体と特異的に結合する検出試薬を使用して検出することができる。このような検出試薬として、例えば、抗体と特異的に結合する任意の結合剤、例えば、抗免疫グロブリン、Ｇタンパク質、Ａタンパク質またはレクチンがある。別法として、抗イディオタイプ抗体と特異的に結合する抗体をレポーター群で標識し、抗イディオタイプ抗体と生物学的試料をインキュベーション後、固定した抗イディオタイプ抗体に結合させる競合アッセイを利用することができる。試料の要素が標識された抗体の抗イディオタイプ抗体への結合を阻害する範囲が、試料の要素と固定された抗イディオタイプ抗体との反応性を示す。

【0052】

レポーター群の検出に使用する方法は、レポーター群の性質に依存する。放射活性群において、シンチレーション計測、ＰＥＴスキャンまたはオートラジオグラフィー法を使用することができる。分光法を染料、発光群および蛍光群を検出するために使用することができる。ビオチンは、異なるレポーター群（通常、放射活性群または蛍光群あるいは酵素）に結合したアビジンを使用して検出することができる。一般に、酵素レポーター群を、（一般に定義された時間）基質を添加後、反応生成物の分光解析などにより検出することができる。

【0053】

一態様において、本発明は、被検体内の第１の抗体濃度をモニタリングし、または被検体が自己免疫疾患を発症する危険があるかを同定するために有用な生体外診断アッセイを提供する。診断アッセイは、（１）処置される被検体からある量の血清を得、（２）第１の抗体濃度のレベルを決定し、または任意の既知の方法を使用して被検体の血清試料中の別の自己免疫疾患マーカーのレベルを決定し、（３）被検体の血清中で測定された抗体または疾患マーカーと年齢適合および性別適合させた正常な健常被検体から採取した血清試料に存在する各決定因子のレベルを比較し、（４）試験される被検体から測定されたレベルが健常被検体のものに比べ高いまたは低いかを同定し、それにより被検体内の自己免疫疾患の状態をモニタリングし、または自己免疫疾患を発症する被検体の危険を評価するステップを含む。

【0054】

本発明はまた、（１）被検体から血清試料を得、（２）第１の抗体濃度のレベル、または任意の既知の方法を使用して被検体の血清試料中の別の自己免疫疾患マーカーのレベルを定量化し、（３）被検体の血清中で測定された抗体または疾患マーカーと年齢適合および性別適合させた正常な健常被検体から採取した血清試料に存在する各決定因子のレベルを比較し、（４）試験される被検体から測定されたレベルが健常被検体のものに比べ高いまたは低いかを同定することを含む自己免疫疾患を発症する被検体の危険を決定する生体外アッセイに関する。自己免疫疾患を発症する危険が高いのは、上記のステップ（２）の量により示され、自己免疫疾患の患者において測定された量の３０％の範囲内である。量が正常の２０％である場合、この危険は増大する。本発明の別の態様において、被検体は年齢適合させることができる。

【0055】

本発明はまた、自己免疫疾患を発症する被検体の危険を決定するための、または被検体の自己免疫疾患の状態をモニタリングするためのキットに関し、本キットは、被検体由来の生物学的試料中の第１の抗体または自己免疫疾患マーカーと特定的に結合し、検出可能である組成物を含む。検出可能なマーカーは、蛍光マーカー、放射活性マーカー、酵素マーカー、比色マーカー、化学発光マーカーまたはそのいずれかの組み合わせを含むが、それらに限定されない。

【0056】

本発明の一実施形態において、生物学的試料は血液試料または血清試料である。本発明の別の実施形態において、キットはさらに、生物学的試料に結合する組成物の量と自己免疫疾患を発症する相対的危険または自己免疫疾患の相対的状態を相関させる要素を含む。本発明の別の実施形態において、組成物は検出可能なマーカーで標識される。検出可能なマーカーは、蛍光マーカー、放射活性マーカー、酵素マーカー、比色マーカー、化学発光マーカーまたはそのいずれかの組み合わせであってよいが、それらに限定されない。キットはまた、診断アッセイが相対的等しい細胞数または血清量を比較することを確実にするため試料間の標準化または正規化のための要素を含む。

【0057】

さらに、本発明は、（ａ）被検体から血清試料を得、（ｂ）単球分化に適切な状態下において、生体外で血清と単球を混合し、（ｃ）単球の、抗原を提示することができる樹状細胞への分化を誘発させる被検体の血清の能力を測定し、（ｄ）ステップ（ｃ）で測定された能力と（ｉ）健常被検体から採取した血清の能力および（ｉｉ）自己免疫疾患に苦しむ被検体から採取した血清の能力を比較し、それにより自己免疫疾患を発症する被検体の危険を決定することを含む自己免疫疾患を発症する被検体の危険を決定するための生体外アッセイを提供する。

【0058】

別の態様において、本発明は、自己免疫疾患を発症する被検体の危険を決定し、モニタリングすることができる生体外診断アッセイである。この診断アッセイは、患者が自己免疫疾患を発症する危険を評価するために生体外で樹状細胞への単球分化を誘発させる患者の血清の能力を測定する。これに関し、患者の血清が（数例の年齢適合、性別適合させた健常な個体由来の血清を使用することにより決定することができる）既知の正常な標準物質に比べ、より効果的に単球の、樹状細胞への分化を誘発させる場合、自己免疫疾患の患者の疾患再発を予測し、かつ／または患者に自己免疫疾患を発症する危険があるかを詳細に診断評価するための必要性を示す。さらに、診断アッセイは、患者の疾患状態をモニタリングするために有用であり、患者が自己免疫疾患と既に診断されている場合、患者は本発明の診断アッセイを利用し、自己免疫疾患の進行または改善をモニタリングし、それに従い患者の処置計画を調整することができる。

【0059】

本発明は、本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体を含むキットおよび本明細書に記載の方法を行うために使用することができるキットを提供する。特定の実施形態において、キットは１つ以上の容器に治療抗体に対して少なくとも１つの精製抗イディオタイプ抗体を含む。当業者であれば、本発明の記載の抗体が当技術分野で公知の確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込まれることができることを容易に認識できるだろう。

【0060】

本開示の実施形態は、本開示の抗イディオタイプ抗体を使用するための製剤および方法を詳細に記載する以下の実施例を参照にさらに定義することができる。材料および方法はともに多くの変更が本開示の範囲を逸脱することなく実施することができることは当業者には明白であるだろう。可能な限り、同じまたは同様の部分を指すために図全体にわたり同じ参照番号を使用する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「不定冠詞（ａ）」、「または」および「定冠詞（ｔｈｅ）」は、文脈上、他に明確に記載されていない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「抗体」を参照すると、複数の上記の抗体、または１つ以上の抗体および当業者が公知のその等価物を含む。さらに、明細書で使用される、成分、反応条件、純度、ポリペプチド長およびポリヌクレオチド長などの量を表す全ての数字は、他に示されていない限り、用語「約」により修飾される。それに応じて、本明細書および特許請求の範囲に記載の数字のパラメーターは、本発明の所望の特性に応じて変化することができる近似値である。

【0061】

本明細書に記載の種々の実施形態または選択肢の全てを任意のおよび全てのばらつきと組み合わせることができる。

【実施例】

【0062】

実施例１
実験方法
マウス抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２の産生。マウス抗ｍＣＤ２０ハイブリドーマ１８Ｂ１２およびそのアイソタイプ変異体の産生を、参照により本明細書に組み込まれる、特許出願米国特許第２００７／０１３６８２６ Ａ１号に記載のように行った。

【0063】

マウス。ＮＯＤ（雌雄）、雌ＳＪＬ、雄ＳＷＲ、雄ＮＯＲ、雄Ｃ．Ｂ−１７、雄Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃ（雌雄）マウスをジャクソン・ラボラトリー（メイン州、バーハーバー）から購入し、バイオジェン・アイデック社にて動物施設で飼育した。ＮＯＤ、ＮＯＲ、ＳＪＬおよびＣ．Ｂ−１７マウスは、ＩｇＧ２ａ（ＩｇＧ２ｃ）のＩｇｈ−１ｂアレルを発現し、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｉｇｈ−１ａアレル（ＩｇＧ２ａ）を発現し、ＳＷＲマウスはＩｇｈ−１ｃ遺伝子を発現する。ＮＯＲマウスは、糖尿病関連遺伝子をマップするために、ＮＯＤゲノムの制限領域（約１５％）がＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ系統由来のゲノムにより置換されているリコンビナントコンジェニック系統である（Ｓｅｒｒｅｚｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。マウスは全ての試験開始時に８〜１２週齢であった。ＮＯＤマウスを、記載した以外の全ての抗イディオタイプ抗体産生試験に使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを抗イディオタイプモノクローナル抗体５Ａ７による１８Ｂ１２抗体の生体内での無力化の効果を評価するために使用した。全ての動物プロトコールは、バイオジェン・アイデック動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により再考され、承認された。

【0064】

【表1】

【0065】

免疫化およびハイブリドーマ産生。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａと組み合わせた免疫化およびハイブリドーマスクリーニングのための抗原として使用した抗体およびタンパク質を表１に記載する。１８Ｂ１２抗体に対する抗イディオタイプ抗体の産生において、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ＩｇＧ２ａのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の単回投与がＮＯＤマウス１０匹に行われた（１００μｇ、腹腔内投与（ｉ．ｐ．））。７日目に、マウスを採血し、１８Ｂ１２ ＩｇＧ１^ａに結合する抗イディオタイプ抗体について、血清をＥＬＩＳＡ法により評価した。次の日に、最も高い力価を有するマウスをハイブリドーマ融合のために選択した（８日目、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５）。２Ｂ８、Ｃ１２およびＭ２９０抗体に対する抗イディオタイプ抗体の産生において、ＮＯＤマウス５匹をはじめに各抗原：１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよび２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中各１００μｇ、腹腔内投与）、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよびＣ１２ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａは１００μｇおよびＣ１２ ＩｇＧ２ａは２５μｇ、それぞれ腹腔内投与）または１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよびＭ２９０ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中各１００μｇ、腹腔内投与）で免疫化した。１０日目にマウスを採血し、２Ｂ８、Ｃ１２またはＭ２９０抗体の可変ドメインと特異的に結合する抗体について、血清をＥＬＩＳＡ法により評価した。マウスを休ませた後、２１日目に２Ｂ８ ＩｇＧ２ａまたはＭ２９０ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中各１００μｇ、腹腔内投与）のいずれかで、または１７日目にＣ１２ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中５０μｇ、腹腔内投与）でブーストした。３日後にハイブリドーマ融合を行った（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５）。抗イディオタイプ抗体産生の一般的スキームを図１に示す。

【0066】

各ハイブリドーマ融合に、ＰＥＧ１５００（シグマ・ケミカル社、ミズーリ州、セントルイス）およびＮＳ−１骨髄腫融合パートナーまたはＳＰ２／０骨髄腫融合パートナーのいずれかを用いた標準的なプロトコールを利用した（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５）。ＮＳ−１融合パートナー（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８の非分泌型クローン、アメリカ培養細胞系統保存機関、バージニア州、マナサス）を抗１８Ｂ１２および抗Ｃ１２融合に使用した。抗２Ｂ８において、脾臓細胞を等しく２分に分け、ＳＰ２／０骨髄腫融合パートナー（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４；アメリカ培養細胞系統保存機関）またはＮＳ−１骨髄腫融合パートナーのいずれかを使用した。ＳＰ２／０融合パートナーを抗Ｍ２９０融合に使用した。ハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（ジブコ−ＢＲＬ、メリーランド州、ベセスダ）、非必須アミノ酸（シグマ・ケミカル社）、ピルビン酸ナトリウム（シグマ・ケミカル社）、ゲンタマイシン（ジブコ−ＢＲＬ）およびハイブリドーマ融合クローニング添加剤（ロッシュ・ダイアグノスティックス、ドイツ、マンハイム）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（メディアテック、バージニア州、マナサス）に入れた。全ての免疫原アイソタイプに結合するが、アイソタイプコントロール抗体に結合しないスクリーニング基準を満たすハイブリドーマを限界希釈によりサブクローン化し、拡大させ、抗体がＡタンパク質クロマトグラフィーを使用して培養上清液から精製された。

【0067】

フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ試薬。ビオチン抗マウスＩｇＧ１ｂ（Ｂ６８−２）、ビオチン抗マウスＩｇＧ２ａｂ（５．７）、ビオチン抗ＩｇＧ２ａａ（８．３）、ＦＩＴＣ抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＰＥ抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、非共役型ＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２）、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびストレプトアビジン−ＡＰＣをＢＤ−ファーミンゲン（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した。ビオチン抗ＩｇＧ２ｂ（ＬＯ−ＭＧ２ｂ）をサザン・バイオテクノロジーズ（アラバマ州、バーミンガム）から購入した。７ＡＡＤはモレキュラー・プローブス（オレゴン州、ユージーン）製であった。ＴＮＰ−ＫＬＨ、ＴＮＰ−フィコールおよびＴＮＰ−Ｏｖａは、バイオサーチ・テクノロジーズ社（カリフォルニア州、ノバト）から得た。ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために使用した抗体を表１に記載する。

【0068】

細胞染色およびフローサイトメトリー分析。全ての染色方法を、ＦＡＣＳ緩衝液（カルシウムおよびマグネシウム非含有の２％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、１０％正常ヤギ血清（熱不活性化）補充のダルベッコＰＢＳ）およびマウス細胞を使用した場合は２．４Ｇ２抗体（５〜１０μｇ／ｍｌ）を含む丸底９６ウェルプレート（コーニング３７９９）で行った。細胞（試料当たり０．１×１０６〜１×１０６個）を一次抗体または二次抗体と氷上で４５分間インキュベーションし、インキュベーション中２回洗浄し、分析用のＦＡＣＳ緩衝液中細胞３〜５×１０６個／ｍｌにて再懸濁した。蛍光度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤバイオサイエンス、カリフォルニア州、サンノゼ）で測定し、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａＴＭまたはＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス）で分析した。

【0069】

ＥＬＩＳＡアッセイ。ＩｇＧ２ａ免疫原と異なる免疫抗原の他のアイソタイプへの結合およびアイソタイプコントロール抗体パネルへの結合について、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。つまり、マイクロタイターウェル（イムロン２ ＨＢ９６ウェルプレート、テルモ・ラボシステムズ、マサチューセッツ州、フランクリン）を適切な抗原またはアイソタイプコントロール抗体（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム中２μｇ／ｍｌ、ｐＨ９．６、１００μｌ／ウェル、４℃にて一晩）で被覆した。結合したハイブリドーマ抗体をＮＯＤマウスが発現した主な３つのＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ）を認識する３つのビオチン化抗ＩｇＧ試薬のプールを用いて検出した。この方法を使用した場合、ＥＬＩＳＡプレートウェルを被覆するために使用される抗体は検出されなかった。ビオチン化試薬はストレプトアビジン−ＨＲＰを用い、その後ＴＭＢ基質（ＫＰＬ、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を添加することにより検出された。室温にて５分間展開後、反応を４Ｎ硫酸の等量でクエンチし、プレートを参照値６５０ｎｍの４５０ｎｍにてＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（モレキュラー・デバイス、カリフォルニア州、パロアルト）で読み取った。血清力価は、ＯＤ_{４５０−６５０}値が０．５となる１／血清希釈液として定義される。

【0070】

実施例２
抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａアイソタイプがＮＯＤマウスにおける増幅可能な抗イディオタイプ抗体反応を生じさせる
抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａに対するＮＯＤマウスにおける抗イディオタイプ抗体反応が必要であったかを試験するため、ＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＮＯＤマウスに抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ａまたは抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２アフコシル ＩｇＧ２ａのいずれかを投与し、１８Ｂ１２可変ドメインに対する抗体価について、血清を試験した。抗イディオタイプ免疫化中によく使用される補助剤を含有しないＰＢＳに抗体を投与した。投与後１０日目の血清力価の評価として、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａまたは１８Ｂ１２アフコシル ＩｇＧ２ａを投与したマウスの抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２可変ドメインに対して産生された抗イディオタイプＩｇＧ抗体の抗体価が高いことが同定されたが、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂまたはＩｇＧ２ｂを投与したマウスでは同定されなかった（図２Ａ）。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２可変ドメインに対する弱い抗イディオタイプＩｇＧ反応が、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ｃを投与したマウスにおいて認められた。

【0071】

さらに、抗イディオタイプ抗体反応が１８Ｂ１２自体に制限され、またはマウスＣＤ２０に結合しない「バイスタンダー」マウスＩｇＧ２ａ抗体により産生されることができたのか、あるいはこれにより伸長されることができたのかを検討した。ＮＯＤマウスに別のマウスのＩｇＧ２ａ（２Ｂ８、マウス抗ｈＣＤ２０）と併用して抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２（ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ１ｂ）を投与した。２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ抗体および抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを共投与したマウスは、１８Ｂ１２抗体（図示せず）および２Ｂ８抗体（図２Ｂ）の両方に対して抗イディオタイプ反応を生じた。対照的に、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ抗体と抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ１ｂを共投与したマウスはいずれかの抗体に対する検出可能な抗イディオタイプ反応を生じなかった（図２Ｂ）。

【0072】

ＮＯＤマウスにおけるこれらの抗イディオタイプ抗体反応が、典型的には親和性の低い一次抗体反応を表したため、この一次抗イディオタイプ反応が増幅可能な液性記憶を生じるかについて試験することを必要とした。１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ抗体のＮＯＤマウスへの２回以上の注射の後に生じるアナフィラキシーを避けるため、２Ｂ８に対する二次抗イディオタイプ抗体反応を続けた。予測した通り、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａを抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａと共投与した場合、２Ｂ８に対する一次抗イディオタイプ抗体価は１０日目に産生された（図３、□）。２Ｂ８ ＩｇＧ２ａのみ（図３、▲）を投与または２Ｂ８ ＩｇＧ２ａおよび抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ１を投与（図示せず、図２参照）したマウスにおいては、抗イディオタイプ抗体反応は認められなかった。３週間後（３１日目）に、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａおよび抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを予め投与したマウスを２Ｂ８ ＩｇＧ２ａのみでブーストした。２Ｂ８可変ドメインに対するＩｇＧ抗イディオタイプ抗体について、二次免疫後１０日目に採取した血清をアッセイした。２Ｂ８に対する抗イディオタイプ血清力価において一次反応と比較した場合、約３２倍増加したことで、液性記憶反応は明白であった（図３、□と●の比較）。

【0073】

実施例３
ＮＯＤマウスにおける抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａを共投与した抗原の免疫原性の増強はウスＩｇＧ２ａ抗体の可変ドメインに制限される
抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ処置の後、ＮＯＤマウスにおいて認められたイディオタイプ免疫原性の増強を、無傷の抗体ではない抗原に広げることができるかについて試験するため、マウスを抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ共投与の有無に関わらずトリニトロフェニル（ＴＮＰ）−ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）およびＴＮＰ−フィコール（それぞれ、Ｔ依存型およびＴ非依存型抗原）で免疫化した。さらに、ｍＩｇＧ２ａ Ｆｃに結合するヒトＢＤＣＡ２の細胞外ドメインおよびキメラマウスＩｇＧ２ａ抗体として遺伝子操作されたラット抗マウスＣＤ１０３抗体からなる融合タンパク質を、抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａの共投与に選択した。予測した通り、ＴＮＰコンジュゲートおよびヒトＢＤＣＡ２は抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ処置しない場合において免疫原性であった（図４）。抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａの共投与では、免疫原性を有意に増加させなかったが（図４）、抗ｍＣＤ２０処置動物の力価を高い方へとする（有意ではない）傾向があった。これまでに２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ抗体と１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ抗体の共投与において認められたように、抗イディオタイプ反応は、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを共投与した場合にのみマウスγ２ａＦｃ領域を有する抗体に生じた（図４）。

【0074】

抗イディオタイプ抗体反応がマウスＩｇＧ２ａ抗原に制限されたため、抗原の取り込み／プロセッシングにおけるマウスＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の役割の可能性について、ＮＯＤマウスをアフコシルヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）で免疫化することにより探索した。主としてマウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに結合するＦｃγＲであるマウスＦｃγＲＩＶへのアフコシルｈＩｇＧ１の結合親和性（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ， ２００６）は、ＦｃγＲＩＶへのマウスＩｇＧ２ａの結合親和性に類似しているようである。アフコシルｈＩｇＧ１標的抗原がマウスＩｇＧ２ａと同様に挙動し得る可能性について、ＮＯＤマウスにｃ２Ｂ８のｈＩｇＧ１もしくはアフコシルｈＩｇＧ１変異体（リツキシマブ、抗ヒトＣＤ２０）またはルミリキシマブ（抗ヒトＣＤ２３、５Ｅ４カニクイザルモノクローナル抗体由来のプリマタイズド（登録商標））のみ、あるいは抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａと併用して投与することにより試験した。バックグランドが高いと予測される、ｈＩｇＧ１に対する反応を最小限にし、実際の抗イディオタイプ反応の検出を可能にするため、免疫化したＮＯＤマウス由来の血清を希釈（１／１００）し、異なるｈＩｇＧ１抗体、ＣＥ９．１（抗ヒトＣＤ４、１００μｇ／ｍｌ）を用いて吸収した。抗イディオタイプ反応は、免疫抗原の異なるＦｃ領域アイソタイプを含有するｃ２Ｂ８およびルミリキシマブ（それぞれマウスＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４）への結合について、血清を試験することにより特異的に検出された。１０日目に採血したＮＯＤマウス由来の血清は、動物に抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを共投与したかに関わらず、ｃ２Ｂ８またはルミリキシマブのいずれかに結合する検出可能な抗イディオタイプ抗体を示さなかった（図５）。アフコシルｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域は野生型ｈＩｇＣ１対応物に比べより免疫原性であるようであり、ＣＥ９．１ ｈＩｇＧ１ １００μｇ／ｍｌで吸収されない可能性が最も高い抗ｈＩｇＧ１抗体を産生したことは興味深い（図５、リツキシマブアフコシルおよびルミリキシマブアフコシル）。これまでに認められるように、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａで処置したＮＯＤマウスの各群は、１８Ｂ１２ ＩｇＧ１と強く結合することにより検出された１８Ｂ１２の可変ドメインに対する抗イディオタイプＩｇＧ反応を強く生じた（図５）。

【0075】

実施例４
抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ免疫化ＮＯＤマウスから産生された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、多様なエピトープを認識し、異なるアイソタイプを有する
異なる標的抗原に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体を産生するための４つのハイブリドーマ融合が、ＩｇＧ２ａ抗原および抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ免疫化ＮＯＤマウスの脾臓細胞を使用して行われた。各融合は、広範囲の結合特性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマパネルを生じた（表２に要約）。１８Ｂ１２抗ｍＣＤ２０に対する抗イディオタイプ抗体を産生する融合は、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中１００μｇ）の単回腹腔内投与後８日目に行われた。２Ｂ８、Ｃ１２およびＭ２９０に対する抗イディオタイプ抗体を産生させる方法は、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ（２Ｂ８ ＩｇＧ２ａおよびＭ２９０ ＩｇＧ２ａ抗原においてＰＢＳ中各１００μｇ、腹腔内投与）と共投与した抗原（ＩｇＧ２ａ）で一次免疫化を行った後、抗原のみ（それぞれＰＢＳ中２Ｂ８ ＩｇＧ２ａまたはＭ２９０ ＩｇＧ２ａ１００μｇ）で２１日後または抗原のみ（ＰＢＳ中Ｃ１２ ＩｇＧ２ａ ５０μｇ）で１７日後に腹腔内にブーストした。融合はブースト後３日目に行われた。Ｍ２９０ ＩｇＧ２ａ融合は、２匹の血清学的陽性のマウスからプールされた脾臓細胞を利用したため、より多くのハイブリドーマを産生した（表２）。抗原に利用可能な全てのアイソタイプ変異体に結合するが、アイソタイプ適合コントール抗体パネルに結合しないＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ｃ抗体を産生するハイブリドーマについて、各融合をスクリーニングした。

【0076】

【表2】

表２．抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ免疫化ＮＯＤマウスから産生された多様性抗イディオタイプ産生ハイブリドーマ。４つの独立した融合物由来のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体は、主にＩｇＧ１／κであり、約１０％がＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ｃであった。標的抗体（抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２、抗ｈＣＤ２０ ２Ｂ８、抗ｈＢＣＭＡ Ｃ１２または抗ｍＣＤ１０３ Ｍ２９０）が抗原陽性細胞（それぞれｍＣＤ２０トランスフェクト３００．１８、Ｒａｍｏｓ、Ｈ９２９またはＣ５７Ｂ１／６ ＣＤ８^＋脾臓細胞）と結合することを防ぐ能力について、モノクローナル抗体をフローサイトメトリーにより試験した。抗原結合阻害９０％以上を示す抗体は「＋」と採点し、阻害７０％〜９０％のものを「＋／−」と採点し、阻害７０％以下のものを「−」と採点した。

【0077】

各融合物由来のハイブリドーマにより産生された主要なアイソタイプは、ＩｇＧ１であり、ハイブリドーマのおよそ１０％がＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ｃを産生した（表２）。可溶性標的抗体が細胞上の抗原（ｍＣＤ２０、ｈＣＤ２０、ｈＢＣＭＡまたはｍＣＤ１０３）に結合することを防ぐ能力について、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２、リツキシマブ２Ｂ８、抗ｈＢＣＭＡ Ｃ１２および抗ｍＣＤ１０３ Ｍ２９０に対して確認された抗イディオタイプ抗体を試験した。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２に対して抗イディオタイプ抗体をブロッキングおよび非ブロッキングする例を図６に示す。アッセイした抗体の１つは５Ａ７ハイブリドーマにより産生され、マウスＣＤ２０でトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞株（３００．１８）への１８Ｂ１２の結合をブロックした（図６、△）。異なるアイソタイプの抗イディオタイプ抗体も交差競合実験においてアッセイし、クロスブロッキングおよびエピトープ多様性を調べた。異なるエピトープを認識し、ＥＬＩＳＡサンドイッチ捕捉アッセイに適した抗イディオタイプモノクローナル抗体を各融合物に認めた。マウス血清の１８Ｂ１２またはＭ２９０抗体の定量のためのＥＬＩＳＡアッセイを開発し、動物疾患モデルにおいて抗体投与後の生体内の薬物動態の決定に利用した。

【0078】

実施例５
抗イディオタイプ抗体は関連性の高いモノクローナル抗体の共有エピトープと結合することができる
一般に、抗体イディオタイプは相補決定領域内の同位体の違いにより定義されるが、個別の、または関連の抗体の可変領域内に類似または同一のエピトープがなお生じ得る。免疫抗原に対する特異性について、抗イディオタイプ抗体パネルを試験する場合、抗イディオタイプ抗体は、免疫原ＩｇＧ２ａ抗体または同一の可変ドメインを有するクラススイッチしたアイソタイプにのみ結合し、他の抗原を認識する同じまたは異なるアイソタイプの抗体パネルには結合しないことが実証された。表２に示される抗ヒトＢＣＭＡ Ｃ１２に対して産生された３つの抗イディオタイプ抗体も（ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列により）２つの関連の高い抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ｃ１１およびＣ１３）と結合することが認められた（図７）。抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１、Ｃ１２およびＣ１３は可変ドメインのアミノ酸数個のみが異なり、ヒトＢＣＭＡのオーバーラップエピトープと結合する。Ｃ１２に対する抗イディオタイプ抗体は、ヒトＢＣＭＡの非オーバーラップエピトープおよび個別のエピトープに結合する他の２つの抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ａ７およびＶｉｃｋｙ−１）に結合しなかった。さらに、Ｃ１２に対するこれら３つの抗イディオタイプ抗体は、抗マウスＢＣＭＡ抗体パネルに結合せず、抗ヒトＣＤ２０ ２Ｂ８または抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２抗体にも結合しなかった（図７）。

【0079】

宿主が自己免疫寛容を破壊し、自己抗原に対する液性反応を産生する自己免疫疾患では、特定の抗原に対する自己抗体が単一のエピトープまたはいくつかの限定されたエピトープと結合することができる。この自己抗体により認識されたエピトープの多様性の欠如は、１つの自己抗体に対して産生された抗イディオタイプ抗体が、同じエピトープを標的とする関連のある自己抗体と交差反応することを可能にし得る。それゆえ、自己抗体の抗イディオタイプ処置および自己抗体の診断薬は、示唆される「１つの自己抗体に対する１つの抗イディオタイプ抗体」のパラダイムに比べ、より効果的であり、または広く適用可能である可能性がある。

【0080】

実施例６
抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ：抗原ＩｇＧ２ａの最適比が高力価の抗イディオタイプ液性反応を生じる
抗イディオタイプ免疫化プロトコールを最適化するため、抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ：抗原 ＩｇＧ２ａの比を免疫化に使用するＩｇＧ２ａ抗体の量を増減させることで変更した（図８に記載）。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを共投与した場合、抗イディオタイプ抗体反応を引き出すことが知られているため、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ抗体を試験抗原として使用した（図４参照）。ＮＯＤマウスに抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ １００μｇおよびＩｇＧ２ａ抗原１００μｇを投与することにより予め行われた免疫化は、相対的に低いが一貫した一次抗イディオタイプＩｇＧ血清力化反応を生じた（５００〜３０００の力価、図３〜５参照）。図８の試験した５つの異なる抗ｍＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ：抗原ＩｇＧ２ａの比のうち、これまでに使用されたものと異なる比、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ １００μｇおよび２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ２５μｇは、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａに対する最も強い一次抗イディオタイプ血清力価反応を生じた（図８）。これらの量に対していずれかの抗体を増加させると、低い一次抗イディオタイプ抗体反応を生じた（図８）。

【0081】

実施例７
抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａに対する抗イディオタイプ反応は、ＩｇＧ２ａのＩｇｈ−１^ｂアレルを発現するＮＯＤ関連マウス系統に制限される
ＮＯＤにかなり関連のあるいくつかのマウス系統を、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａまたは抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２および２Ｂ８ ＩｇＧ２ａの両方の抗体での免疫化に選択し、ＮＯＤマウスに発現したＩｇｈ−１アレルおよび／またはＮＯＤマウスに検出された抗体レパートリーおよび免疫系が抗イディオタイプ抗体産生に重要であるかを試験した。マウス系統、関連表現型および抗イディオタイプ抗体反応を産生する能力を表３に要約した。

【0082】

【表3】

【0083】

表３．抗イディオタイプ抗体反応について試験したマウス系統。マウス（５匹／群）を２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中１００μｇ、腹腔内投与）、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ（ＰＢＳ中１００μｇ、腹腔内投与）または抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよび２Ｂ８ ＩｇＧ２ａの両方（ＰＢＳ中各１００μｇ、腹腔内投与）で免疫化し、１０日目に採血し、１８Ｂ１２ ＩｇＧ１ａ、２Ｂ８ ＩｇＧ１ａまたはコントロールＩｇＧ２ａへの結合について、血清をＥＬＩＳＡ法により評価した。^＊＋＋、平均抗イディオタイプ力価が５００以上であるが、５０００以下；＋、平均抗イディオタイプ力価が１００以上であるが５００以下；−、平均抗イディオタイプ力価が１００以下。各群（ＮＯＲ、ＳＪＬおよびＳＷＲのみ）の平均力価を図９に示す。

【0084】

ＮＯＤの最も関連のあるＮＯＲマウス系統（Ｓｅｒｒｅｚｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）は、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａのみに対して強い抗イディオタイプ抗体反応を生じ、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａ投与しない場合において２Ｂ８ ＩｇＧ２ａに対して反応しなかった（図９）。ＳＪＬマウスはＮＯＲマウス系統と同様に反応した。ＮＯＲマウスおよびＳＪＬマウスに抗イディオタイプ反応を生じる１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａおよび２Ｂ８ ＩｇＧ２ａをともに投与したが、両抗原に対する抗イディオタイプ抗体価が１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａのみを投与した同じ系統のマウスに比べ低かった（図９）。ＳＷＲマウスは注射した抗体のいずれに対する検出可能な抗イディオタイプ反応がなかった（図９）。これらの試験は、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａがＩｇｈ−１^ｂアロタイプを発現する自己免疫傾向性マウス系統において抗イディオタイプ反応を引き出すことで一致している。

【0085】

実施例８
抗ＣＤ２０抗体を無効化するための抗イディオタイプ抗体の使用
抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａで処置したＮＯＤマウスに産生される抗イディオタイプ抗体は、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２抗体の可変ドメインのみに結合する固有の能力を有する。生体外で抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２のｍＣＤ２０への結合をブロッキングさした抗イディオタイプ抗体のうち（表２、図６）、３つの抗体を選択し、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａと生体内で結合し、機能的に無効化する能力について試験した。マウスを抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａの単回投与で処置し、７日後に、等量の抗イディオタイプ抗体（クローン４Ｅ８、５Ａ７または５０Ｆ１）を投与した。末梢血Ｂ細胞および血清抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２抗体の濃度をさらに１、３および７日後にモニタリングした。試験した３つ全ての抗イディオタイプ抗体は、投与２４時間以内に血液循環から検出可能な抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２を除去したようであった（データは図示せず）。４Ｅ８抗イディオタイプ抗体で処置後７日目に、マウスは、抗イディオタイプ抗体で処置しなかった動物とあまり違いのないＢ細胞の回復をごくわずかに示した。５Ａ７および５０Ｆ１抗イディオタイプ抗体（ともにＩｇＧ１／κ）のいずれかで処置したマウスは、抗イディオタイプ処置後７日目にＢ細胞のかなりの再集合を示した。Ｂ細胞の再集合は、５Ａ７抗イディオタイプ抗体の投与後のマウスにおいて最も高く、その後、Ｂ細胞の再集合はこの抗イディオタイプ抗体とともに経時的に変化した（図１０）。全身のＢ細胞の再集合が開始され、それは５Ａ７抗イディオタイプ抗体の投与後１日目で明らかであった（図１０）。血中のＣＤ１９^＋Ｂ細胞は、５Ａ７抗イディオタイプ抗体が投与された後１週間以内に通常の濃度の６０％に達したが、５Ａ７抗体を投与しなかった、抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２処置マウスでは、Ｂ細胞が減少したままであった（図１０）。５Ａ７抗イディオタイプ抗体の投与後、マウスの健康に対する副作用は見られず、抗ｍＣＤ２０抗体の無効化を生じた。

【0086】

実施例９
ＮＯＤマウスの細胞系抗ＣＤ２０抗体免疫化
任意の細胞結合ＩｇＧ２ａが抗イディオタイプ抗体反応を誘発するか、かつＢ細胞が抗イディオタイプ抗体産生に必要であるかを決定するため、脾臓細胞（ＴおよびＢ細胞）および胸腺細胞（未熟Ｔ細胞；ＣＤ２０⁻）を生体外で１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａまたは抗Ｈ−２Ｄ^ｂ ＩｇＧ２ａ（クローン２７−１１−１３Ｓ）で被覆し、洗浄し、可溶性２Ｂ８ ＩｇＧ２ａの有無に関わらずＮＯＤマウスに腹腔内注射した。１０日目に血清を採取し、２Ｂ８または１８Ｂ１２に対する抗イディオタイプＩｇＧ反応について試験した。抗ｍＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａは、脾臓細胞（Ｂ細胞）に前被覆された場合、または細胞非含有もしくは胸腺細胞含有のＰＢＳに可溶性に投与された場合に抗イディオタイプ抗体反応を誘発することができた（図１１Ａ）。抗Ｈ−２Ｄ^ｂ ＩｇＧ２ａ処置マウスは、軽度の抗ＩｇＧ２ａアイソタイプ反応を生じ、かつ抗Ｈ−２Ｄ^ｂ ＩｇＧ２ａが脾臓細胞とともに投与された場合にのみ生じたが、２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ処置マウスは何ら抗体反応を生じなかった。さらに抗Ｈ−２Ｄ^ｂ ＩｇＧ２ａを投与したマウスにおいて２Ｂ８ ＩｇＧ２ａに対する抗イディオタイプ抗体は認められなかった（図１１Ａ）。可溶性抗原２Ｂ８ ＩｇＧ２ａは、脾臓細胞結合１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａによる抗イディオタイプ抗体産生を低レベルに低下させたようであった。これは、注射した抗体の比が最適未満であり（この場合、１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａが約２０μｇおよび２Ｂ８ ＩｇＧ２ａが５０μｇ）、過剰な２Ｂ８ ＩｇＧ２ａが１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａと競合したことによる可能性があった。

【0087】

抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａで前被覆されたマウスＢ細胞を使用してＮＯＤマウスを免疫化し、抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２に対する抗イディオタイプ抗体反応を生じるという図１１Ａの所見を抗ヒトＣＤ２０ ２Ｂ８ ＩｇＧ２ａで前被覆したヒトＢ細胞に広げることができるかを試験するため、ヒトＳＫＷ６．４バーキットリンパ種細胞株を抗ヒトＣＤ２０ ２Ｂ８ ＩｇＧ２ａで前被覆し、洗浄し、ＮＯＤマウスに注射した。前被覆した細胞を単一でまたは可溶性抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａまたは抗マウスＣＤ１０３ Ｍ２９０ ＩｇＧ２ａとともに注射した。１８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａを使用してＮＯＤマウスを免疫化した場合はいつでも、抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａに対する抗イディオタイプ反応を生じたが、この抗体をヒトＢリンパ腫細胞で被覆した場合は、可溶性抗マウスＣＤ２０ １８Ｂ１２ ＩｇＧ２ａの存在下においてでも、抗ヒトＣＤ２０ ２Ｂ８ ＩｇＧ２ａ抗体に対する抗イディオタイプ反応を生じなかった（図１１Ｂ）。これは、抗イディオタイプ抗体反応を生じるのに必要とされる共投与した抗原ＩｇＧ２ａが可溶性で、細胞結合ではないことが必要であることを示唆する。この実験において、抗ＣＤ１０３ Ｍ２９０ ＩｇＧ２ａもヒトＢリンパ腫細胞結合２Ｂ８ ＩｇＧ２ａを共投与したＩｇＧ２ａ抗体として使用した。２Ｂ８ ＩｇＧ２ａまたはＭ２９０ ＩｇＧ２ａに対して抗イディオタイプ抗体反応は生じなかったが、この抗原の組み合わせにおいて、Ｍ２９０ ＩｇＧ２ａは測定可能な抗ＩｇＧ２ａアイソタイプ特異反応（図１１Ｂ）を引き出し、これはこれまでに、抗原として脾臓細胞に結合した抗Ｈ−２Ｄｂ ＩｇＧ２ａを使用して認められたものと同様であった（図１１Ａ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】