特許 5986518 抗アクチビンＡ抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5986518

(24)【登録日】2016年8月12日

(45)【発行日】2016年9月6日

(54)【発明の名称】抗アクチビンＡ抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/24 20060101AFI20160823BHJP

   C12N 15/00 20060101ALI20160823BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160823BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160823BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160823BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20160823BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20160823BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20160823BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20160823BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/24ZNA

   C12N15/00

   C12N5/10

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61P7/00

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   !C12P21/08

【請求項の数】14

【外国語出願】

【全頁数】96

(21)【出願番号】特願2013-30740(P2013-30740)

(22)【出願日】2013年2月20日

(62)【分割の表示】特願2009-527594(P2009-527594)の分割

【原出願日】2007年9月7日

(65)【公開番号】特開2013-107899(P2013-107899A)

(43)【公開日】2013年6月6日

【審査請求日】2013年2月20日

(31)【優先権主張番号】60/843,430

(32)【優先日】2006年9月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/956,653

(32)【優先日】2007年8月17日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】エイチキュー ハン

(72)【発明者】

【氏名】チン チェン

(72)【発明者】

【氏名】キース スー−ニュン クワク

(72)【発明者】

【氏名】シャオラン チョウ

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM，１９９２年，Vol.75, No.2，p.571-576

【文献】 HYBRIDOMA，１９９１年，Vol.10, No.2，p.309-316

【文献】 [ONLINE]，R&D SYSTEMS,INC，２００４年１０月１２日，ＵＲＬ，http://www.rndsystems.com/pdf/mab3381.pdf

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，１９９４年，Vol.91，p.8817-8821

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトアクチビンＡのシステインノット領域と特異的に結合する、単離された抗体であって、
少なくとも1本の軽鎖と少なくとも1本の重鎖とを含み、前記軽鎖が、定常領域と、3つの相補性決定領域(CDR)を含む可変領域とを含み、かつ前記重鎖が、定常領域と、3つのCDRを含む可変領域とを含み；
前記3つの軽鎖CDRのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：１１、１２、および１３のアミノ酸配列であり；ならびに
前記3つの重鎖CDRのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：６２、６３、および６４のアミノ酸配列である、
前記単離された抗体。

【請求項2】

配列番号：２２５のアミノ酸１１−３３、およびアミノ酸８１−１１１内の領域に結合し、ならびにヒトアクチビンＡと結合すると、ヒトアクチビンＡのヒトアクチビンＡ受容体への結合を阻害する、請求項1記載の単離された抗体。

【請求項3】

前記単離された抗体が、悪液質の減弱、結腸腫瘍を持ったマウスにおける悪液質の減弱、結腸腫瘍を持ったマウスにおける体重減少の回復、関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける体重減少の回復、関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける筋肉量の減少の回復、および関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける脂肪量の減少の回復からなる群より選択されるいずれかの生物活性を有する、請求項1または2記載の単離された抗体。

【請求項4】

完全ヒト単離抗体である、請求項1〜3のいずれか一項記載の単離された抗体。

【請求項5】

ａ）ヒトアクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１−Ｓ３３およびアミノ酸Ｃ８１−Ｅ１１１）と特異的に結合し、かつ前記抗体が、生体外でヒトアクチビンＡ受容体とのヒトアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト単離抗体であるか；または
ｂ）ヒトアクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１−Ｓ３３およびアミノ酸Ｃ８１−Ｅ１１１）と特異的に結合し、かつ前記抗体が、生体内でヒトアクチビンＡ受容体とのヒトアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト単離抗体である、
請求項4に規定される完全ヒト単離抗体。

【請求項6】

請求項1〜5のいずれか一項記載の単離された抗体をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項7】

請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項8】

プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、および、組み換え発現ベクターからなる群より選択される、請求項7記載のベクター。

【請求項9】

請求項6に記載のポリヌクレオチドを含むか、または、請求項8に記載の組み換え発現ベクターが導入された、単離された細胞。

【請求項10】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項9記載の単離された細胞。

【請求項11】

請求項1〜5のいずれか１項記載の単離された抗体を含む、医薬組成物。

【請求項12】

緩衝液、抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、安定剤および賦形剤からなる群より選択される１つ以上の物質をさらに含む、請求項11記載の医薬組成物。

【請求項13】

医療における使用のための、請求項11または12記載の医薬組成物。

【請求項14】

癌性疾患の治療における使用のための、請求項13記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（技術分野）
本発明は概して、アクチビンＡのシステインノットドメイン、およびアクチビンＡまたはその断片と結合することが可能な抗原結合剤に関する。

【背景技術】

【0002】

（背景技術）
多くの深刻な病状は、悪液質として知られる病態を伴い、体細胞量の低下に関係する。体細胞量（ＢＣＭ）は、筋肉量、内臓量、および免疫細胞量から成る。ＢＣＭは、すべての代謝活性の９５パーセントを数える、人体の最も活性な体成分である。ＢＣＭの５パーセントの低下は、罹患率の変化、筋力の低下、代謝の変化、および感染リスクの増加をもたらす。４０パーセントの低下は、死亡をもたらし得る。

【0003】

悪液質が、基礎疾病の転帰の確定に影響を及ぼす病態の例は、今日の様々な主要な健康問題にわたる。リウマチ性悪液質では、関節リウマチ（ＲＡ）患者は、ＢＣＭの１３から１５パーセントを失う。ＲＡ患者の３分の２は、悪液質を有し、これは、２から５倍高い死亡率をもたらす。他の関連病態は、リウマチ性悪液質の肥満、およびサイトカイン血症性悪液質を含む。癌関連悪液質は、罹患率および死亡率の大きな一因となり、また潜在的な救命治療に耐える患者の能力に影響を及ぼす。

【0004】

すべてが高い死亡率を有する多数の広範な疾病における、アクチビンＡの一般的な役割により、疾病関連悪液質を予防または改善するための組成物および方法に対して、当技術分野において長年にわたる必要性がある。そのような組成物および方法が、本明細書に提供される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

（発明の概要）
一実施形態においては、本発明は、ａ．ｉ．Ｌ１−Ｌ１４の軽鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択されるＣＤＲ３配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｉｉ．Ｘ_７３ＱＸ_７４Ｘ_７５Ｘ_７６Ｘ_７７Ｘ_７８Ｘ_７９Ｘ_８０（配列番号１３２）；ｉｉｉ．ＬＱＨＮＸ_８１ＹＸ_８２Ｘ_８３Ｔ（配列番号１３１）；およびｉｖ．ＱＡＷＤＸ_８４ＳＴＸ_８５Ｘ_８６（配列番号２４８）から成る群から選択される配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３；ｂ．ｉ．Ｈ１−Ｈ１４の重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択されるＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；ｉｉ．Ｘ_８７Ｘ_８８Ｘ_８９Ｘ_９０Ｘ_９１Ｘ_９２Ｘ_９３Ｘ_９４ＦＤＹ（配列番号１８７）；ｉｉｉ．Ｘ_９５Ｘ_９６Ｘ_９７ＹＸ_９８ＤＸ_９９Ｘ_１００ＧＷＸ_１０１Ｘ_１０２Ｘ_１０３（配列番号１８８）；ｉｖ．Ｘ_１０４Ｘ_１０５Ｘ_１０６Ｘ_１０７Ｘ_１０８Ｘ_１０９ＹＸ_１１０Ｘ_１１１Ｘ_１１２Ｘ_１１３Ｘ_１１４Ｘ_１１５Ｘ_１１６Ｘ_１１７Ｘ_１１８（配列番号２４９）から成る群から選択される配列を含む、重鎖ＣＤＲ３；またはｃ．（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列、のいずれかを含む、単離した抗原結合タンパク質を提供し、Ｘ_７３は、メチオニン残基、グルタミン残基、またはアルギニン残基であり、Ｘ_７４は、アラニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、またはセリン残基であり、Ｘ_７５は、ロイシン残基、チロシン残基、またはアスパラギン残基であり、Ｘ_７６は、グルタミン残基、セリン残基、またはトレオニン残基であり、Ｘ_７７は、トレオニン残基、チロシン残基、またはイソロイシン残基であり、Ｘ_７８は、プロリン残基またはセリン残基であり、Ｘ_７９は、システイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、またはプロリン残基であり、Ｘ_８０は、セリン残基またはトレオニン残基であり、Ｘ_８１は、トレオニン残基またはセリン残基であり、Ｘ_８２は、プロリン残基またはトレオニン残基であり、Ｘ_８３は、フェニルアラニン残基またはトリプトファン残基であり、Ｘ_８４は、アルギニン残基またはセリン残基であり、Ｘ_８５は、バリン残基またはアラニン残基であり、Ｘ_８６は、バリン残基または残基なしであり、Ｘ_８７は、バリン残基または残基なしであり、Ｘ_８８は、グルタミン残基または残基なしであり、Ｘ_８９は、アスパラギン酸塩残基、トリプトファン残基、または残基なしであり、Ｘ_９０は、セリン残基、ロイシン残基、または残基なしであり、Ｘ_９１は、イソロイシン残基、グルタミン酸残基、またはグルタミン残基であり、Ｘ_９２は、アラニン残基、ロイシン残基、またはグリシン残基であり、Ｘ_９３は、アラニン残基またはロイシン残基であり、Ｘ_９４は、プロリン残基、チロシン残基、またはグリシン残基であり、Ｘ_９５は、アスパラギン酸塩残基または残基なしであり、Ｘ_９６は、グルタミン残基または残基なしであり、Ｘ_９７は、アスパラギン酸塩残基またはアラニン残基であり、Ｘ_９８は、チロシン残基またはグリシン残基であり、Ｘ_９９は、セリン残基またはチロシン残基であり、Ｘ_１００は、セリン残基またはアルギニン残基であり、Ｘ_１０１は、フェニルアラニン残基または残基なしであり、Ｘ_１０２は、グリシン残基またはアスパラギン酸塩残基であり、Ｘ_１０３は、ヒスチジン残基またはプロリン残基であり、Ｘ_１０４は、グリシン残基または残基なしであり、Ｘ_１０５は、セリン残基、グルタミン酸残基、または残基なしであり、Ｘ_１０６は、アルギニン残基、セリン残基、または残基なしであり、Ｘ_１０７は、アスパラギン酸塩残基、アスパラギン残基、セリン残基、またはグルタミン残基であり、Ｘ_１０８は、セリン残基、アルギニン残基、またはトリプトファン残基であり、Ｘ_１０９は、グリシン残基、アスパラギン酸塩残基、アスパラギン残基、チロシン残基、またはロイシン残基であり、Ｘ_１１０は、セリン残基、グリシン残基、アスパラギン酸塩残基、または残基なしであり、Ｘ_１１１は、セリン残基、バリン残基、アスパラギン残基、またはチロシン残基であり、Ｘ_１１２は、セリン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、またはヒスチジン残基であり、Ｘ_１１３は、トリプトファン残基、チロシン残基、またはグルタミン残基であり、Ｘ_１１４は、ヒスチジン残基、アスパラギン酸塩残基、チロシン残基、または残基なしであり、Ｘ_１１５は、フェニルアラニン残基、アラニン残基、またはグリシン残基であり、Ｘ_１１６は、アスパラギン酸塩残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、またはメチオニン残基であり、Ｘ_１１７は、チロシン残基またはアスパラギン酸塩残基であり、Ｘ_１１８は、イソロイシン残基、バリン残基、または残基なしであり、抗原結合タンパク質は、ヒトアクチビンＡと特異的と結合する。

【0006】

他の側面においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計６つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列からの、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＤＲ２配列から、合計５つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択される、アミノ酸配列を含む。

【0007】

さらなる実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計５つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計１つ以下のアミノ酸添加、置換、または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計１つ以下のアミノ酸添加、置換、または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択される、アミノ酸配列を含む。

【0008】

さらなる実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４の軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計１つ以下のアミノ酸添加、置換、または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４の重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0009】

さらなる実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４の軽鎖ＣＤＲ３配列；ｃ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計１つ以下のアミノ酸添加、置換、または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

他の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計１つ以下のアミノ酸添加、置換、または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｃ．Ｈ１−Ｈ１４の重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0011】

さらに別の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計１つ以下のアミノ酸添加、置換、または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；およびｂ．Ｈ１−Ｈ１４の重鎖ＣＤＲ２配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

さらに別の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列を含む。

【0013】

単離した抗原結合タンパク質は、ａ．ｉ．（Ｒ／Ｋ）ＳＳＱＳ（Ｌ／Ｉ）Ｌ（Ｈ／Ｙ）Ｓ（Ｔ／Ｓ）（Ｇ／Ｎ）（Ｙ／Ｎ）（Ｎ／Ｋ）（−／Ｋ）ＹＬ（Ｄ／Ｖ）（配列番号１１５）；ｉｉ．ＲＡ（Ｓ／Ｇ）ＱＧＩ（Ｓ／Ｒ）Ｎ（Ｄ／Ｎ）Ｌ−（Ｖ／Ｇ）（配列番号２５０）；ｉｉｉ．ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮＴ（配列番号２５１）；およびｉｖ．ＳＧ（Ｄ／Ｅ）Ｋ（Ｌ／Ｗ）Ｇ（Ｄ／Ｅ）Ｋ（Ｆ／Ｙ）（Ａ／Ｖ）（Ｆ／Ｃ）（配列番号１２３）から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．ｉ．（Ｈ／Ｑ／Ｌ）Ｄ（Ｔ／Ｎ／Ｓ）ＫＲＰＳ（配列番号１２８）；およびｉｉ．Ｘ_４０Ｘ_４１ＳＸ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｓ（配列番号１２４）から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列であって、Ｘ_４０は、アラニン残基、トリプトファン残基、またはロイシン残基であり、Ｘ_４１は、トレオニン残基、アラニン残基、またはグリシン残基であり、Ｘ_４２は、セリン残基、メチオニン残基、またはフェニルアラニン残基であり、Ｘ_４３は、ロイシン残基またはアルギニン残基であり、Ｘ_４４は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、またはアラニン残基である、軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．ｉ．ＧＧＳ（Ｉ／Ｆ）（Ｎ／Ｓ）（Ｓ／Ａ）（−／Ｇ）（−／Ｇ）（Ｆ／Ｙ）ＹＷＳ（配列番号２５２）；ｉｉ．ＧＸ_２７Ｘ_２８ＦＸ_２９Ｘ_３０ＹＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３（配列番号１３９）であって、Ｘ_２７は、チロシン残基またはフェニルアラニン残基であり、Ｘ_２８は、トレオニン残基またはセリン残基であり、Ｘ_２９は、トレオニン残基、セリン残基、またはイソロイシン残基であり、Ｘ_３０は、グリシン残基またはセリン残基であり、Ｘ_３１は、チロシン残基、グリシン残基、またはトリプトファン残基であり、Ｘ_３２は、イソロイシン残基またはメチオニン残基であり、Ｘ_３３は、ヒスチジン残基またはグリシン残基である、ＧＸ_２７Ｘ_２８ＦＸ_２９Ｘ_３０ＹＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３（配列番号１３９）；およびｉｉｉ．Ｇ（Ｙ／Ｆ）ＴＦ（Ｔ／Ｓ）−（Ｓ／Ａ）Ｙ（Ｇ／Ｗ）（Ｌ／Ｍ／Ｉ）（Ｓ／Ｈ）（配列番号１４０）から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｄ．ｉ．（Ｙ／Ｅ）Ｉ（Ｓ／Ｙ／Ｎ）（Ｙ／Ｈ）ＳＧ（Ｓ／Ｇ）Ｔ（Ｙ／Ｎ）ＹＮＰＳＬＫ（Ｓ／Ｒ）（配列番号１４２）；ｉｉ．（Ｖ／Ｎ）Ｉ（Ｋ／Ｗ）（Ｙ／Ｑ）ＤＧＳ（Ｎ／Ｅ／Ｔ）−（Ｋ／Ｅ）Ｙ（Ｈ／Ｙ）（Ａ／Ｖ）ＤＳＶＫＧ（配列番号１７９）；およびｉｉｉ．Ｘ_６０ＩＸ_６１Ｘ_６２Ｘ_６３Ｘ_６４Ｘ_６５Ｘ_６６ＴＸ_６７Ｘ_６８Ｘ_６９Ｘ_７０Ｘ_７１Ｘ_７２ＱＧ（配列番号１８０）であって、Ｘ_６０は、トリプトファン残基またはイソロイシン残基であり、Ｘ_６１は、アスパラギン残基、イソロイシン残基、セリン残基、またはチロシン残基であり、Ｘ_６２は、プロリン残基またはアラニン残基であり、Ｘ_６３は、アスパラギン残基、チロシン残基、またはグリシン残基であり、Ｘ_６４は、セリン残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸塩残基であり、Ｘ_６５は、グリシン残基またはセリン残基であり、Ｘ_６６は、グリシン残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸塩残基であり、Ｘ_６７は、アスパラギン残基またはアルギニン残基であり、Ｘ_６８は、チロシン残基またはセリン残基であり、Ｘ_６９は、アラニン残基またはセリン残基であり、Ｘ_７０は、グルタミン残基またはプロリン残基であり、Ｘ_７１は、リジン残基またはセリン残基であり、Ｘ_７２は、フェニルアラニン残基またはロイシン残基である、Ｘ_６０ＩＸ_６１Ｘ_６２Ｘ_６３Ｘ_６４Ｘ_６５Ｘ_６６ＴＸ_６７Ｘ_６８Ｘ_６９Ｘ_７０Ｘ_７１Ｘ_７２から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、から成る群から選択される配列を含み得て、括弧で囲まれたアミノ酸残基記号は、配列内の同一位置に対する代替残基を識別する。

【0014】

特定の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる、重鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0015】

さらなる実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計１つ以下のアミノ酸添加、置換、または欠失により異なる、重鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0016】

さらに別の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、Ｈ１−Ｈ１４の重鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0017】

他の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計６つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計５つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択される、２つのアミノ酸配列を含む。

【0018】

さらなる実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計６つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計５つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択される、３つのアミノ酸配列を含む。

【0019】

他の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計６つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる、重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計５つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択される、４つのアミノ酸配列を含む。

【0020】

他の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計６つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計５つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択される、５つのアミノ酸配列を含む。

【0021】

さらに別の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計６つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計５つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ．Ｈ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計４つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0022】

他の実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．ｉ．軽鎖ＣＤＲ１配列；ｉｉ．軽鎖ＣＤＲ２配列；およびｉｉｉ．軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変ドメイン；ｂ．ｉ．重鎖ＣＤＲ１配列；ｉｉ．重鎖ＣＤＲ２配列；およびｉｉｉ．重鎖ＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変ドメイン；またはｃ．（ａ）の軽鎖可変ドメインおよび（ｂ）の重鎖可変ドメイン、のいずれかを含む。

【0023】

一実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、およびＬ１４Ｈ１４から成る組み合わせの群から選択される、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの組み合わせを含む。

【0024】

一実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、配列番号：８４、１００もしくは１０８のカッパ軽鎖定常配列、および／または配列番号：２１４、２１５、もしくは２２１の重鎖定常配列をさらに含む。

【0025】

一実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、アクチビンＡと結合すると、ａ．アクチビンＡを阻害する；ｂ．アクチビンＡと結合するための基準抗体とクロス競合する；ｃ．該基準抗体と同一の、アクチビンＡのエピトープと結合する；ｄ．該基準抗体と実質的に同一のＫｄで、アクチビンＡと結合する；またはｅ．該基準抗体と実質的に同一の解離速度で、アクチビンＡと結合し、基準抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、およびＬ１４Ｈ１４から成る組み合わせの群から選択される、軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含む。

【0026】

一実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ヒトアクチビンＡと結合すると、ヒトアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害する；結腸腫瘍を持ったマウスにおける悪液質を減弱させる；結腸腫瘍を持ったマウスにおける体重の低下を回復させる；関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、体重の低下を回復させる；関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、筋肉量の低下を回復させる；関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、脂肪量の低下を回復させる；および／またはＡＡＶ−アクチビンＡ形質転換動物モデルにおける、体重の低下を回復させる。

【0027】

一実施形態においては、単離した抗原結合タンパク質は、ａ．ヒト抗体；ｂ．ヒト化抗体；ｃ．キメラ抗体；ｄ．モノクローナル抗体；ｅ．ポリクローナル抗体；ｆ．組み換え抗体；ｇ．抗原結合抗体断片；ｈ．１本鎖抗体；ｉ．二重抗体；ｊ．三重抗体；ｋ．四重抗体；ｌ．Ｆａｂ断片；Ｆ（ａｂ’）_２断片；ｎ．ドメイン抗体；ｏ．ＩｇＤ抗体；ｐ．ＩｇＥ抗体；ｑ．ＩｇＭ抗体；ｒ．ＩｇＧ１抗体；ｓ．ＩｇＧ２抗体；ｔ．ＩｇＧ３抗体；ｕ．ＩｇＧ４抗体；またはｖ．Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減する、ヒンジ領域内の少なくとも１つの変異を有するＩｇＧ４抗体を含む。

【0028】

アクチビンＡに対して特異的なヒト抗原結合タンパク質もまた提供され、抗原結合タンパク質は、悪液質の減弱等の、ヒト抗アクチビンＡ抗体の少なくとも１つの生体内生物活性を保有する。

【0029】

結腸腫瘍を持ったマウスにおける体重の低下を回復させるか、または関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、体重の低下を回復させるヒト抗原結合タンパク質が、さらに提供される。

【0030】

関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、筋肉量の低下を回復させるか、関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、脂肪量の低下を回復させるか、またはＡＡＶ−アクチビンＡ形質転換動物モデルにおける、体重の低下を回復させるヒト抗原結合タンパク質もまた、提供される。

【0031】

アクチビンＡに対して特異的なヒト抗原結合タンパク質が、さらに提供され、抗原結合タンパク質は、アクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの生体外結合を阻害する。

【0032】

アクチビンＡに対して特異的なヒト抗原結合タンパク質もまた提供され、抗原結合タンパク質は、アクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの生体内結合を阻害する。

【0033】

他の実施形態においては、本発明の抗原結合タンパク質の軽鎖、重鎖、または両方をコードする配列を含む、単離したポリヌクレオチドが提供され、ポリヌクレオチドは、配列番号：１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、もしくは２０９の軽鎖可変ドメインの核酸配列、および／または配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、もしくは２１０の重鎖可変ドメインの核酸配列を含み得る。

【0034】

単離したポリヌクレオチドを含むプラスミドもまた提供され、プラスミドは、発現ベクターであり得る。ポリヌクレオチドを含む単離した細胞が提供され、単離した細胞はハイブリドーマであり得て、該細胞はＣＨＯ細胞であり得る。

【0035】

ヒトアクチビンＡと結合する抗原結合タンパク質を作製する方法が、さらに提供され、該抗原結合タンパク質を発現させることを可能にする条件下で、単離した細胞を培養するステップを含む。

【0036】

本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物もまた提供され、対象における病態を治療する方法は、対象に医薬組成物を投与するステップを含み、病態は、該対象におけるアクチビンＡの活性を減少させることにより、治療可能である。対象は、ヒトであり得、病態は、腫瘍に関連した悪液質であり得、腫瘍は、卵巣癌等の生殖器腫瘍、良性前立腺過形成、前立腺上皮内腫瘍、もしくは前立腺癌であるか、または腫瘍は、膀胱癌、ウィルムス腫瘍、膵臓癌、乳癌、骨肉腫、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、血管活性腸管ペプチド分泌腫瘍、膠芽細胞腫、髄芽腫、頭頸部扁平上皮癌、口腔癌、口腔白板症、肛門癌、食道癌、胃癌、骨肉腫、もしくは転移性癌である。病態は、関節リウマチに関連した悪液質であり得るか、または病態は、対象におけるアクチビンＡ活性を減少させる必要があり得る。

【0037】

他の実施形態においては、本発明は、対象の筋肉量を維持する方法を提供し、該対象に該医薬組成物を投与するステップを含む。

【0038】

他の実施形態においては、本発明は、それを必要とする対象において、アクチビンＡ活性を減少させる方法を提供し、該対象に該医薬組成物を投与するステップを含む。

【0039】

他の実施形態においては、本発明は、生体外または生体内で、アクチビンＡのアミノ酸Ｋ１３−Ｙ３９と特異的に結合することが可能な、抗体を提供する。他の実施形態においては、本発明は、生体外または生体内で、アミノ酸Ｖ８２−Ｎ１０７と特異的に結合することが可能な、抗体を提供する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
単離された抗原結合タンパク質であって、
ａ．
ｉ．配列番号：１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、および２０５の軽鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択されるＣＤＲ３配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｉｉ．Ｘ_７３ Ｑ Ｘ_７４ Ｘ_７５ Ｘ_７６ Ｘ_７７ Ｘ_７８ Ｘ_７９ Ｘ_８０、
ｉｉｉ．Ｌ Ｑ Ｈ Ｎ Ｘ_８１ Ｙ Ｘ_８２ Ｘ_８３ Ｔ、および
ｉｖ．Ｑ Ａ Ｗ Ｄ Ｘ_８４ Ｓ Ｔ Ｘ_８５ Ｘ_８６からなる群から選択される配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、または
ｂ．
ｉ．配列番号：１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１４４、１６０、１７６、２０８、および２２４のＨ１−Ｈ１４の重鎖ＣＤＲ３配列から成る群から選択されるＣＤＲ３配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列、
ｉｉ．Ｘ_８７ Ｘ_８８ Ｘ_８９ Ｘ_９０ Ｘ_９１ Ｘ_９２ Ｘ_９３ Ｘ_９４ Ｆ Ｄ
Ｙ、
ｉｉｉ．Ｘ_９５ Ｘ_９６ Ｘ_９７ Ｙ Ｘ_９８ Ｄ Ｘ_９９ Ｘ_１００ Ｇ Ｗ Ｘ_１０１ Ｘ１_０２ Ｘ_１０３、
ｉｖ．Ｘ_１０４ Ｘ_１０５ Ｘ_１０６ Ｘ_１０７ Ｘ_１０８ Ｘ_１０９ Ｙ Ｘ_１１０ Ｘ_１１１ Ｘ_１１２ Ｘ_１１３ Ｘ_１１４ Ｘ_１１５ Ｘ_１１６ Ｘ_１１７ Ｘ_１１８から成る群から選択される配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
または
ｃ．（ａ）の軽鎖ＣＤＲ３配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ３配列、
のうちのいずれかを含み、
Ｘ_７３は、メチオニン残基、グルタミン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘ_７４は、アラニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、またはセリン残基であり、
Ｘ_７５は、ロイシン残基、チロシン残基、またはアスパラギン残基であり、
Ｘ_７６は、グルタミン残基、セリン残基、またはスレオニン残基であり、
Ｘ_７７は、スレオニン残基、チロシン残基、またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_７８は、プロリン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_７９は、システイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、またはプロリン残基であり、
Ｘ_８０は、セリン残基またはスレオニン残基であり、
Ｘ_８１は、スレオニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_８２は、プロリン残基またはスレオニン残基であり、
Ｘ_８３は、フェニルアラニン残基またはトリプトファン残基であり、
Ｘ_８４は、アルギニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_８５は、バリン残基またはアラニン残基であり、
Ｘ_８６は、バリン残基または残基なしであり、
Ｘ_８７は、バリン残基または残基なしであり、
Ｘ_８８は、グルタミン残基または残基なしであり、
Ｘ_８９は、アスパラギン酸塩残基、トリプトファン残基、または残基なしであり、
Ｘ_９０は、セリン残基、ロイシン残基または残基なしであり、
Ｘ_９１は、イソロイシン残基、グルタミン酸残基、またはグルタミン残基であり、
Ｘ_９２は、アラニン残基、ロイシン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_９３は、アラニン残基またはロイシン残基であり、
Ｘ_９４は、プロリン残基、チロシン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_９５は、アスパラギン酸塩残基または残基なしであり、
Ｘ_９６は、グルタミン残基または残基なしであり、
Ｘ_９７は、アスパラギン酸塩残基またはアラニン残基であり、
Ｘ_９８は、チロシン残基またはグリシン残基であり、
Ｘ_９９は、セリン残基またはチロシン残基であり、
Ｘ_１００は、セリン残基またはアルギニン残基であり、
Ｘ_１０１は、フェニルアラニン残基または残基なしであり、
Ｘ_１０２は、グリシン残基またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_１０３は、ヒスチジン残基またはプロリン残基であり、
Ｘ_１０４は、グリシン残基または残基なしであり、
Ｘ_１０５は、セリン残基、グルタミン酸残基、または残基なしであり、
Ｘ_１０６は、アルギニン残基、セリン残基、または残基なしであり、
Ｘ_１０７は、アスパラギン酸塩残基、アスパラギン残基、セリン残基、またはグルタミン残基であり、
Ｘ_１０８は、セリン残基、アルギニン残基、またはトリプトファン残基であり、
Ｘ_１０９は、グリシン残基、アスパラギン酸塩残基、アスパラギン残基、チロシン残基、またはロイシン残基であり、
Ｘ_１１０は、セリン残基、グリシン残基、アスパラギン酸塩残基、または残基なしであり、
Ｘ_１１１は、セリン残基、バリン残基、アスパラギン残基、またはチロシン残基であり、
Ｘ_１１２は、セリン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、またはヒスチジン残基であり、
Ｘ_１１３は、トリプトファン残基、チロシン残基、またはグルタミン残基であり、
Ｘ_１１４は、ヒスチジン残基、アスパラギン酸塩残基、チロシン残基、または残基なしであり、
Ｘ_１１５は、フェニルアラニン残基、アラニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_１１６は、アスパラギン酸塩残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、またはメチオニン残基であり、
Ｘ_１１７は、チロシン残基、またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_１１８は、イソロイシン残基、バリン残基、または残基なしであり、
上記抗原結合タンパク質は、ヒトアクチビンＡと特異的に結合することを特徴とする単離された抗原結合タンパク質。
（項目２）
ａ．配列番号：１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１５５、１７１、２０３、および２１９のＬ１−Ｌ１４のＣＤＲ１配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｂ．配列番号：１２、２８、４４、６０、７６、１５６、１７２、２０４、および２２０のＬ１−Ｌ１４のＣＤＲ２配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列、
ｃ．配列番号：１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、および２０５のＬ１−Ｌ１４のＣＤＲ３配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列、
ｄ．配列番号：１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１５８、１７４、１９０、２０６、および２２２のＨ１−Ｈ１４のＣＤＲ１配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列、
ｅ．配列番号：１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１５９、１７５、２０７、および２２３のＨ１−Ｈ１４のＣＤＲ２配列から、合計３つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列、および
ｆ．配列番号：１６、２２、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、および２４４のＨ１−Ｈ１４のＣＤＲ３配列から、合計２つ以下のアミノ酸添加、置換、および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする項目１に記載の単離された抗体結合タンパク質。
（項目３）
ａ．
ｉ．（Ｒ／Ｋ）ＳＳＱＳ（Ｌ／Ｉ）Ｌ（Ｈ／Ｙ）Ｓ（Ｔ／Ｓ）（Ｇ／Ｎ）（Ｙ／Ｎ）（Ｎ／Ｋ）（−／Ｋ）ＹＬ（Ｄ／Ｖ）、
ｉｉ．ＲＡ（Ｓ／Ｇ）ＱＧＩ（Ｓ／Ｒ）Ｎ（Ｄ／Ｎ）Ｌ（Ｖ／Ｇ）、
ｉｉｉ．ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮＴ、および
ｉｖ．ＳＧ（Ｄ／Ｅ）Ｋ（Ｌ／Ｗ）Ｇ（Ｄ／Ｅ）Ｋ（Ｆ／Ｙ）（Ａ／Ｖ）（Ｆ／Ｃ）から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｂ．
ｉ．（Ｈ／Ｑ／Ｌ）Ｄ（Ｔ／Ｎ／Ｓ）ＫＲＰＳ、および
ｉｉ．
Ｘ_４０は、アラニン残基、トリプトファン残基、またはロイシン残基であり、
Ｘ_４１は、スレオニン残基、アラニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_４２は、セリン残基、メチオニン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘ_４３は、ロイシン残基またはアルギニン残基であり、
Ｘ_４４は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、またはアラニン残基である、Ｘ_４０ Ｘ_４１ ＳＸ_４２ Ｘ_４３ Ｘ_４４ Ｓから成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列、
ｃ．
ｉ． ＧＧＳ（Ｉ／Ｆ）（Ｎ／Ｓ）（Ｓ／Ａ）（−／Ｇ）（−／Ｇ）（Ｆ／Ｙ）ＹＷＳ、
ｉｉ．
Ｘ_２７は、チロシン残基またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘ_２８は、スレオニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_２９は、スレオニン残基，セリン残基、またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_３０は、グリシン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_３１は、チロシン残基、グリシン残基、またはトリプトファン残基であり、
Ｘ_３２は、イソロイシン残基またはメチオニン残基であり、
Ｘ_３３は、ヒスチジン残基またはグリシン残基である、Ｇ Ｘ_２７ Ｘ_２８ Ｆ Ｘ_２９ Ｘ_３０ Ｙ Ｘ_３１ Ｘ_３２ Ｘ_３および
ｉｉｉ．Ｇ（Ｙ／Ｆ）ＴＦ（Ｔ／Ｓ）（Ｓ／Ａ）Ｙ（Ｇ／Ｗ）（Ｌ／Ｍ／Ｉ）（Ｓ／Ｈ）から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１配列と、
ｄ．
ｉ．（Ｙ／Ｅ）Ｉ（Ｓ／Ｙ／Ｎ）（Ｙ／Ｈ）ＳＧ（Ｓ／Ｇ）Ｔ（Ｙ／Ｎ）ＹＮＰＳＬＫ（Ｓ／Ｒ）、
ｉｉ．（Ｖ／Ｎ）Ｉ（Ｋ／Ｗ）（Ｙ／Ｑ）ＤＧＳ（Ｎ／Ｅ／Ｔ）（Ｋ／Ｅ）Ｙ（Ｈ／Ｙ）（Ａ／Ｖ）ＤＳＶＫＧ、および
ｉｉｉ．
Ｘ_６０は、トリプトファン残基またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_６１は、アスパラギン残基、イソロイシン残基、セリン残基、またはチロシン残基であり、
Ｘ_６２は、プロリン残基またはアラニン残基であり、
Ｘ_６３は、アスパラギン残基、チロシン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_６４は、セリン残基、アスパラギン残基であり、またはアスパラギン酸塩残基であり、Ｘ_６５は、グリシン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_６６は、グリシン残基、アスパラギン残基であり、またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_６７は、アスパラギン残基またはアルギニン残基であり、
Ｘ_６８は、チロシン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_６９は、アラニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_７０は、グルタミン残基またはプロリン残基であり、
Ｘ_７１は、リジン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_７２は、フェニルアラニン残基またはロイシン残基である、Ｘ_６０ Ｉ Ｘ_６１ Ｘ_６２ Ｘ_６３ Ｘ_６４ Ｘ_６５ Ｘ_６６ Ｔ Ｘ_６７ Ｘ_６８ Ｘ_６９ Ｘ_７０ Ｘ_７１ Ｘ_７２ ＱＧ
から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２配列、
から成る群から選択される配列を含み、
括弧で囲まれたアミノ酸残基記号は、配列内の同じ位置への代替的な残基を同定することを特徴とする項目１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目４）
ａ．
ｉ．配列番号：１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１５５、１７１、２０３、および２１９の軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｉｉ．配列番号：１２、２８、４４、６０、７６、１５６、１７２、２０４、および２２０の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
ｉｉｉ．配列番号：１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、および２０５の軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む軽鎖可変ドメイン、
ｂ．
ｉ．配列番号：１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１５８、１７４、１９０、２０６、および２２２の重鎖ＣＤＲ１配列、
ｉｉ．配列番号：１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１５９、１７５、１９１、２０７、および２２３の重鎖ＣＤＲ２配列、ならびに
ｉｉｉ．配列番号：１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１４４、１６０、１７６、２０８、および２２４の重鎖ＣＤＲ３配列、を含む重鎖可変ドメイン、または
ｃ．（ａ）の軽鎖可変ドメインおよび（ｂ）の重鎖可変ドメイン、
のうちのいずれかを含むことを特徴とする項目１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目５）
単離された抗原結合タンパク質であって、
ａ．
ｉ．配列番号：９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、および２１７のＬ１−Ｌ１４の軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列、
ｉｉ．配列番号：９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３ １６９、１８５、２０１、および２１７のＬ１−Ｌ１４の軽鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列、および
ｉｉｉ．配列番号：１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、および２０９のＬ１−Ｌ１４の軽鎖可変ドメイン配列から成るポリヌクレオチドの補体と、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列、から成る群から選択される軽鎖可変ドメイン配列、
ｂ．
ｉ．配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、および２１８のＨ１−Ｈ１４の重鎖可変ドメイン配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列、
ｉｉ．配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、および２１８のＨ１−Ｈ１４の重鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列、および
ｉｉｉ．配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、および２１０のＨ１−Ｈ１４の重鎖可変ドメイン配列から成るポリヌクレオチドの補体と、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列、から成る群から選択される重鎖可変ドメイン配列、
ｃ．（ａ）の軽鎖可変ドメインおよび（ｂ）の重鎖可変ドメイン、
のうちのいずれかを含み、
上記抗原結合タンパク質は、ヒトアクチビンＡと結合することを特徴とする
単離された抗原結合タンパク質。
（項目６）
ａ．配列番号：９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、および２１７のＬ１−Ｌ１４から成る群から選択される軽鎖可変ドメイン配列、
ｂ．配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、および２１８のＨ１−Ｈ１４から成る群から選択される重鎖可変ドメイン配列、または
ｃ．（ａ）の軽鎖可変ドメインおよび（ｂ）の重鎖可変ドメイン、
のうちのいずれかを含むことを特徴とする項目５に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目７）
アクチビンＡと結合すると、
ａ．アクチビンＡを阻害するか、
ｂ．アクチビンＡと結合するために基準抗体とクロス競合するか、
ｃ．上記基準抗体と同じアクチビンＡのエピトープと結合するか、
ｄ．上記基準抗体と実質的に同じＫｄでアクチビンＡと結合するか、または
ｅ．上記基準抗体と実質的に同じオフ率でアクチビンと結合し、
上記基準抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、およびＬ１４Ｈ１４から成る組み合わせの群から選択される軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含むことを特徴とする項目１または項目５に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目８）
ヒトアクチビンＡと結合する時に、ヒトアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする項目１または項目５に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目９）
上記抗原結合タンパク質は、ヒト抗アクチビンＡ抗体の少なくとも１つの生体内生物活性を保有することを特徴とする項目１または項目５に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１０）
生物活性は、悪液質の減弱であることを特徴とする項目９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１１）
結腸腫瘍を持ったマウスにおける悪液質を減弱させることを特徴とする項目９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１２）
結腸腫瘍を持ったマウスにおける体重減少を回復させることを特徴とする項目９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１３）
関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける体重減少を回復させることを特徴とする項目９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１４）
関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける筋肉量の減少を回復させる、項目９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１５）
関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける脂肪量の減少を回復させることを特徴とする項目９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１６）
ＡＡＶ−アクチビンＡを形質移入された動物モデルにおける体重減少を回復させることを特徴とする項目９に記載の単離された抗原結合タンパク質。
（項目１７）
アクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１−Ｓ３３および／またはアミノ酸Ｃ８１−Ｅ１１１）と特異的に結合する単離された完全ヒト抗体であって、上記抗原結合タンパク質は、ヒト抗アクチビンＡ抗体の少なくとも１つの生体内生物活性を保有することを特徴とする単離された完全ヒト抗体。
（項目１８）
生物活性は、悪液質の減弱であることを特徴とする項目１７に記載の単離された抗体。
（項目１９）
結腸腫瘍を持ったマウスにおける悪液質を減弱させることを特徴とする項目１７に記載の単離された抗体。
（項目２０）
結腸腫瘍を持ったマウスにおける体重減少を回復させることを特徴とする項目１７に記載の単離された抗体。
（項目２１）
関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける体重減少を回復させることを特徴とする項目１７に記載の単離された抗体。
（項目２２）
関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける筋肉量の減少を回復させることを特徴とする項目１７に記載の単離された抗体。
（項目２３）
関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける脂肪量の減少を回復させることを特徴とする項目１７に記載の単離された抗体。
（項目２４）
ＡＡＶ−アクチビンＡを形質移入された動物モデルにおける体重減少を回復させることを特徴とする項目１７に記載の単離された抗体。
（項目２５）
アクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１−Ｓ３３および／またはアミノ酸Ｃ８１−Ｅ１１１）と特異的に結合する完全ヒト抗体であって、上記抗原結合タンパク質は、生体外のアクチビンＡ受容体とのアクチビンの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト抗体。
（項目２６）
アクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１−Ｓ３３および／またはアミノ酸Ｃ８１−Ｅ１１１）と特異的に結合する完全ヒト単離抗体であって、上記抗原結合タンパク質は、生体内のアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト単離抗体。
（項目２７）
アクチビンＡのアミノ酸Ｋ１３-Ｙ３９と特異的に結合する完全ヒト単離抗体であって、
上記抗原結合タンパク質は、生体外のアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト単離抗体。
（項目２８）
アクチビンＡのアミノ酸Ｖ８２-Ｎ１０７と特異的に結合する完全ヒト単離抗体であって
、上記抗原結合タンパク質は、生体外のアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト単離抗体。
（項目２９）
アクチビンＡのアミノ酸Ｋ１３-Ｙ３９と特異的に結合する完全ヒト単離抗体であって、
上記抗原結合タンパク質は、生体内のアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト単離抗体。
（項目３０）
アクチビンＡのアミノ酸Ｖ８２-Ｎ１０７と特異的に結合する完全ヒト単離抗体であって
、上記抗原結合タンパク質は、生体内のアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害することを特徴とする完全ヒト単離抗体。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】図１は、抗アクチビンＡ抗体Ａ１で治療される、コラーゲン誘発関節炎マウスに対する筋肉量の変化を示す図である。

【図2】図２は、抗アクチビンＡ抗体Ａ１で治療される、コラーゲン誘発関節炎マウスに対する脂肪量の変化を示す図である。

【図3】図３は、抗体Ａ１、Ａ２、およびＡ３を使用した抗アクチビンＡ治療が、筋肉内ＣＨＯ／アクチビン異種移植片を有する若年ヌードマウスにおける、体重の低下を予防することを示す、データを示す図である。

【図4】図４は、抗アクチビンＡ治療が、筋肉内ＣＨＯ／アクチビン異種移植片を有する若年ヌードマウスにおいて、除脂肪体重の低下を予防することを示す、ＮＭＲデータを示す図である。

【図5】図５は、ＡＡＶ−アクチビンＡ形質導入マウスにおける、体重変化への抗アクチビンＡ抗体Ａ１の影響を示す図である。

【図6】図６は、腫瘍接種後１８日目の、抗アクチビンＡ抗体Ａ１での治療を受けた、および受けていないＣＤＦ１マウスＣｏｌｏｎ−２６癌悪液質モデルにおける、腓腹筋の筋肉量を示す図である。

【図7】図７は、抗体結合の領域が円で囲まれた、アクチビンＡのモデルを示す図である。Ｋ２１、Ｋ１０３、およびＸ９４は、位置２１および１０３におけるリジン残基、ならびに位置９４におけるチロシン残基を意味する。

【図8】図８は、ＫｉｎＥｘＡを使用して確定されるような、抗体Ａ１、Ａ２、およびＡ３の結合親和性を示す図である。ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使用した、双対曲線、１サイト同種結合モデルを使用した、競合曲線の非線形回帰から、平衡解離定数が得られた。

【図9】図９は、抗体Ａ１、Ａ２、またはＡ３の結合による分解から保護されなかった、エピトープ領域を示す図である。

【図10】図１０は、無傷アクチビンＡ（ロット５５により示される）、およびアミノ酸位置番号９４におけるチロシン残基において切断される、アクチビンＡ（ロット３８により示される）に対する、抗体Ａ１、Ａ２、およびＡ３の結合親和性を示す図である。

【図11】図１１は、固定化抗体表面上のアクチビンＡまたはアクチビンＢに対する、抗体Ａ１、Ａ２、およびＡ３、ならびに２つの市販の抗体の結合親和性を示す図である。

【図12】図１２は、抗体Ａ１およびＡ２、ならびに２つの市販のアクチビンＡ抗体により、アクチビンＡ／アクチビンＢキメラと結合する抗体を示す図である。

【図13】図１３は、図１１に記載される抗体試験に用いられる、アクチビンＡ／アクチビンＢキメラのアミノ酸配列を示す図である。

【図14】図１４は、アクチビンＡの異なるエピトープとの、Ａ１、Ａ２、およびＡ３を含むいくつかの抗体の結合を示す図である。また、２つの市販のアクチビンＡ抗体も試験した。

【発明を実施するための形態】

【0041】

（発明を実施するための形態）
本発明は、全長アクチビンＡとも結合する抗体により認識されるシステインノットドメインを含む、ヒトアクチビンＡの領域、および／またはアクチビンＡのシステインノット領域に重複する、もしくは該領域を包含するアクチビンＡの領域、ならびにこれらのシステインノットドメインを作製および使用する方法に関する。本発明は、アクチビンＡまたはアクチビンＡの一部と特異的に結合する、抗体を含む抗原結合剤、ならびにそのような結合剤を使用するための方法も提供する。結合剤は、１つ以上の配位子とのヒトアクチビンＡの結合を阻止する、または低下させるために有用である。

【0042】

うっ血性心不全（ＣＨＦ）による死亡率は、悪液質に関連している。一研究（Ａｎｋｅｒ，Ｓ．Ｄ．ａｎｄ Ｃｏａｔｓ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈｅｓｔ １１５：８３６−８４７，１９９９）においては、患者集団から任意抽出されたＣＨＦの１６パーセントが、悪液質であった。この状態は、年齢、機能的疾患分類、左心室駆出分画率、および最大酸素消費量に左右されない、予後の低下を予測した。悪液質コホートにおける死亡率は、１８ヶ月で５０パーセントであった。

【0043】

悪液質が要因である、癌、関節リウマチ、慢性腎不全、うっ血性心不全、および他の病態における疾病進行に共通している１つの経路は、アクチビンＡ経路である。筋萎縮および筋脱力は、老化、癌悪液質、敗血症、除神経、廃用、不活発、火傷、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、慢性腎不全もしくは慢性心不全、後肢懸垂／微小重力、および筋ジストロフィーを含む、多くの病状および病態において、共通している。アクチビンおよびインヒビンは、ＴＧＦベータスーパーファミリーの一員である。アクチビンおよびインヒビンは、それぞれ、下垂体卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌および生合成の、刺激剤および阻害剤として機能する。アクチビンＡは、アクチビンの優勢型である。生殖生物学において、アクチビンおよびインヒビンは、卵巣周期および排卵プロセスの重要な調節剤であり、胚着床および／または妊娠維持に影響を与え得る。（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｖ．１４，Ｎｏ．３，８２７−８３２，Ｍａｒｃｈ １９９９；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，Ｖ．１３８，Ｎｏ．７：３０４２−３０４６；Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｖ．１４７，Ｎｏ．２：７２４−７３２，Ｆｅｂ．２００６）。幅広い種類の組織におけるインヒビンおよびアクチビンの識別は、これらの要因が、ＦＳＨ分泌の制御よりもはるかに大きい役割を果たすことを示唆する。

【0044】

アクチビンは、２つの構造的に関連があるクラスのセリン／スレオニンキナーゼ受容体（Ｉ型およびＩＩ型）と相互作用する。プロテオグリカン、ベタグリカンと結合し、ＩＩ型アクチビン受容体と安定複合体を形成することにより、Ｉ型受容体を排除する一方でＩＩ型アクチビン受容体を封鎖することにより、インヒビンはアクチビンを拮抗する。２つの主要な型のアクチビンが存在する。アクチビンＡは、β_Ａ−サブユニットのホモ二量体であり、アクチビンＢは、β_Ｂ−サブユニットのホモ二量体である。（Ｖａｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ Ｈｏｒｍ Ｒｅｓ Ｖ．４４：１−３４，１９８８）。どのβ−サブユニットとも異なる、α−サブユニットのヘテロ二量体は、機能的アンタゴニストインヒビンをもたらす。

【0045】

文献は、アクチビンＡが、癌組織において過剰発現された、および／または限局したことを示している。例えば、子宮内膜癌および子宮頸癌を有する女性において、高濃度の血中アクチビンＡが見つかった（Ｐｅｔｒａｇｌｉａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．８３：１１９４−１２００，１９９８）。アクチビンＡは、病期ＩＶ期の結腸直腸癌において過剰発現された（Ｗｉｌｄｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ４９：４０９−４１７，２００１）。卵巣癌におけるアクチビンＡの役割が報告された（Ｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：５０−６１，２００５）。

【0046】

文献は、アクチビンＡを腎疾患に関連付けている。（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１５：９１−１０１，２００４）。健常者および疾病を有する患者における、血中免疫反応性アクチビンＡ濃度が、Ｈａｒａｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．ａｎｄ Ｍｅｔａｂ．８１：２１２５−２１３０，１９９６により報告された。アクチビンＡは、腎間質線維芽細胞の強力な活性剤である（Ｈａｒａｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１５：９１−１０１，２００４）。糸球体のアクチビンＡの過剰発現は、抗Ｔｈｙ１糸球体腎炎における線維症と関係がある（Ｇａｅｄｅｋｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌ．２０：３１９−３２８，２００５）。

【0047】

心不全患者の血中アクチビンＡ濃度は、疾病重症度に従い増加した（Ｙｎｄｅｓｔａｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：１３７９−１３８５，２００４）。心不全のラットモデルにおいて、血中アクチビンＡは、心筋梗塞の直後に上昇し、６ヶ月間持続し、アクチビンＡ免疫染色は、心筋細胞のみに限局した（Ｙｎｄｅｓｔａｄ ｅｔ
ａｌ．，２００４）。心不全において、アクチビンＡ濃度の上昇が報告された（Ｙｎｄｅｓｔａｄ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：１３７９−１３８５，２００４）。

【0048】

本発明は、例えば、拮抗性抗アクチビンＡ抗体、抗体断片、または抗体誘導体等の、抗アクチビンＡ抗体、抗体断片、および抗体誘導体等の、アクチビンＡを作動または拮抗する分子を含む、アクチビンＡと結合する分子に関する組成物、キット、および方法を提供する。アクチビンＡのアミノ酸Ｒ１３−Ｙ３９、またはアミノ酸Ｖ８２−Ｎ１０７等の、アクチビンＡの一部と特異的に結合する分子に関する組成物、キット、および方法もまた提供される。そのような分子は、抗体、抗体断片、および抗体誘導体を含み得る。アクチビンＡと結合するポリペプチドのすべてまたは一部をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸ならびにその誘導体および断片、例えば、抗アクチビンＡ抗体、抗体断片、抗体変異形、または抗体誘導体のすべてまたは一部をコードする核酸、そのような核酸を含むプラスミドおよびベクター、ならびにそのような核酸および／またはベクターおよびプラスミドを含む細胞もしくは細胞株もまた提供される。提供された方法は、例えば、抗アクチビンＡ抗体等のアクチビンＡと結合する分子を作製、識別、または単離する方法、分子がアクチビンＡと結合するかどうかを確定する方法、アクチビンＡと結合する分子を含む、医薬組成物等の組成物を作製する方法、ならびに例えば、アクチビンＡにより媒介される病態を治療するための方法、および生体内または生体外でアクチビンＡの生物活性を調節するための方法等の、アクチビンＡと結合する分子を対象に投与するための方法を含む。

【0049】

ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、標準的な１または３文字の略号を使用して示される。別段に示されない限り、ポリペプチド配列は、左にそれらのアミノ末端、および右にそれらのカルボキシ末端を有し、１本鎖核酸配列、および２本鎖核酸配列のトップ鎖は、左にそれらの５’末端、右にそれらの３’末端を有する。また、特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、それが参照配列とどのように異なるのかを説明することにより、表現され得る。別段に示されない限り、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、それぞれ、記載される各核酸またはアミノ酸、および介在核酸またはアミノ酸を含むことが理解される。例えば、ポリペプチド配列Ｒ１３−Ｙ３９は、アミノ酸Ｒ１３およびＹ３９、ならびにポリペプチド配列内のＲ１３とＹ３９との間に見られるアミノ酸を含む、ポリペプチド配列を説明する。同様に、ポリヌクレオチド配列Ｃ１−Ｔ５は、核酸Ｃ１およびＴ５、ならびに配列の位置２、３および４における核酸を含む、ポリヌクレオチド配列を説明する。したがって、配列番号：１−５の表示は、同様に、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５の包括的な群を示す。最後に、別段に指定されない限り、アミノ酸分類もまた、包括的であることが意図される。例えば、「配列番号：２８のアミノ酸１−５」という語句は、配列番号：２８の位置１、２、３、４、および５におけるアミノ酸を含む。

【0050】

特定の軽鎖および重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が、以下に示される。軽鎖および重鎖を含む抗体は、軽鎖の名前、および重鎖可変ドメインの名前を組み合わせることにより、示される。例えば、「Ｌ４Ｈ７，」は、Ｌ４の軽鎖可変ドメイン、およびＨ７の重鎖可変ドメインを含む抗体を示す。

【0051】

カッパ軽鎖定常配列は、配列番号：８４、１００、および１０８に示され、重鎖定常配列は、配列番号：２１４、２１５、および２２１に示される。これらの配列をコードするポリヌクレオチドは、軽鎖に対しては、それぞれ、配列番号：２２２、２２３、および２３９に、および重鎖に対しては、それぞれ、配列番号：２４０、２４１、および２４２に示される。したがって、本明細書に開示されるような可変配列に加えて、抗体は、配列番号：８４および２１４；または配列番号：２１５および２２３；または配列番号：１０８および２２１、のうちの１つもしくは両方を含み得る。

【0052】

他の実施形態においては、相補的軽鎖または重鎖可変ドメインが、特定されていないままである一方で、抗体は、特異的重鎖または軽鎖を含み得る。特に、相補的重鎖または軽鎖が、無差別または無関係でさえあり得るが、例えば組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより確定され得るように、本明細書の特定の実施形態は、特異的軽鎖または重鎖を介して、特異的抗原（アクチビンＡ等）と結合する抗体を含む。Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖ．１５０（３），ｐｐ．８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｖ．３５２ ｐｐ．６２４−６２８（１９９１）。

【0053】

本明細書に別段に定義されない限り、本明細書に関連して使用される科学および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。本発明の方法および技術は、別段に示されない限り、概して、当技術分野で周知であり、かつ本明細書にわたって引用および考察される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されるような、従来の方法に従い実行される。例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照。酵素反応および精製法は、当技術分野で一般的に遂行されるような、または本明細書に記載されるような、作製者の仕様書に従い実行される。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して使用される術語、ならびにその検査法および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬品調製、処方、および送達、ならびに患者の治療に対して、標準的な技術が使用され得る。

【0054】

以下の用語は、別段に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。

【0055】

「単離した分子」という用語（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）は、その誘導元または誘導源により、（１）その自然な状態においてそれに付随する、自然的に関連した構成要素と関連しない、（２）同種からの他の分子を実質的に含まない、（３）異種からの細胞により発現される、または（４）自然に発生しない、分子である。したがって、化学的に合成された、またはそれが自然に発生する細胞と異なる細胞系において合成された分子は、その自然的に関連した構成要素から「単離」される。また、分子は、当技術分野で周知の精製法を使用した単離により、自然的に関連した構成要素を実質的に含まない状態にされ得る。分子の純度または均一性は、当技術分野で周知の多数の手段により分析され得る。例えば、ポリペプチドサンプルの純度は、当技術分野で周知の技術を使用してポリペプチドを視覚化するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲル染色を使用して、分析され得る。特定の目的で、ＨＰＬＣまたは精製に関して当技術分野で周知の他の手段により、より高い分解能が提供され得る。

【0056】

「アクチビンＡ阻害剤」および「アクチビンＡアンタゴニスト」という用語は、交互に用いられる。それぞれは、アクチビンＡの少なくとも１つの機能を検出可能な程度に阻害する分子である。逆に、「アクチビンＡ作動薬」は、アクチビンＡの少なくとも１つの機能を検出可能な程度に増加させる分子である。アクチビンＡ阻害剤によりもたらされる阻害は、アッセイを使用して検出可能である限り、完全である必要はない。アクチビンＡの機能のいかなるアッセイも使用され得て、それらの例は、本明細書に提供される。アクチビンＡ阻害剤により阻害され得る、またはアクチビンＡ作動薬により増加され得る、アクチビンＡの機能の例は、アクチビンＡとの結合を含む。アクチビンＡ阻害剤およびアクチビンＡ作動薬の種類の例は、抗原結合タンパク質（例えば、アクチビンＡ阻害抗原結合タンパク質）等のアクチビンＡ結合ポリペプチド、抗体、抗体断片、および抗体誘導体を含むがこれらに限定されない。

【0057】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語のそれぞれは、ペプチド結合により互いに連結した２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を意味する。これらの用語は、例えば、天然および人工タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチドアナログ（突然変異タンパク質、変異形、および融合タンパク質等）、ならびに翻訳後に、または別様に共有結合的もしくは非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、単量体または重合体であり得る。

【0058】

本明細書に使用されるような「ポリペプチド断片」という用語は、対応する全長タンパク質と比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有する、ポリペプチドを意味する。断片は、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０、または２００アミノ酸の長さであり得る。また、断片は、例えば、最大で１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸の長さであり得る。断片は、その末端のどちらか一方または両方において、１つ以上の追加アミノ酸、例えば、異なる自然に発生するタンパク質からのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）を、さらに含み得る。

【0059】

本発明のポリペプチドは、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させるため、（２）酸化に対する感受性を減少させるため、（３）タンパク質複合体の形成に対する結合親和性を変化させるため、（４）結合親和性を変化させるため、および（４）他の物理化学的または機能的特性を付与または修飾するために、あらゆる方法で、かつあらゆる理由で修飾されたポリペプチドを含む。アナログは、ポリペプチドの突然変異タンパク質を含む。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存アミノ酸置換）は、自然に発生する配列において（例えば、分子間接触を形成するドメインの外側にある、ポリペプチドの部分において）、行われ得る。「保存アミノ酸置換」は、親配列の構造特性を実質的に変化させない置換である（例えば、置換アミノ酸は、親配列において発生するヘリックスを破壊するか、または親配列を特徴付けるか、もしくはその官能性に必要な他の種類の二次構造を崩壊させる傾向を有するべきではない）。当技術分野において承認されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載され、そのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0060】

ポリペプチドの「変異形」（例えば、抗体）は、１つ以上のアミノ酸残基が、天然ポリペプチド配列に対して、アミノ酸配列に挿入、アミノ酸配列から除去、および／またはアミノ酸配列に置換される、アミノ酸配列を含み、天然ポリペプチドと本質的に同一の生物活性を保持する。ポリペプチドの生物活性は、当技術分野で標準的な技術を使用して測定され得る（例えば、変異形が抗体である場合、その活性は、本明細書に記載されるような結合アッセイにより、試験され得る）。本発明の変異形は、断片、アナログ、組み換えポリペプチド、合成ポリペプチド、および／または融合タンパク質を含む。ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、リン酸化、およびグリコシル化等の、他の化学部分への結合を介して、化学修飾されているポリペプチド（例えば、抗体）である。別段に示されない限り、「抗体」という用語は、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異形、断片、および突然変異タンパク質を含み、これらの例は、以下に記載される。

【0061】

「抗原結合タンパク質」は、抗原と結合する部分、および任意に、抗原結合部分が、抗原との抗原結合タンパク質の結合を促進する立体構造を取ることを可能にする、骨格またはフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗原結合タンパク質の例は、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体アナログを含む。抗原結合タンパク質は、例えば、グラフトされたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する、代替タンパク質骨格または人工骨格を含み得る。そのような骨格は、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定させるために導入される変異を含む、抗体由来の骨格、および例えば、生体適合性ポリマーを含む、完全合成骨格を含むがこれらに限定されない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ５３，Ｉｓｓｕｅ １：１２１−１２９；Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４を参照。さらに、ペプチド抗体模倣剤（「ＰＡＭ」）が、骨格として、フィブロネクチン構成要素を用いる抗体模倣剤に基づく骨格と同様に、使用され得る。

【0062】

抗原結合タンパク質は、例えば、自然発生の免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。自然発生の免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一の対のポリペプチド鎖から成り、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）、および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関与する、約１００から１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に主に関与する、定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖内において、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（すべての目的で、全体として参照することにより組み込まれる）を一般に参照。各軽／重鎖の対の可変領域は、無傷免疫グロブリンが２つの結合部位を有するような、抗体結合部位を形成する。

【0063】

自然発生の免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域により連結される、比較的に保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）と同一の全体構造を示す。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２，１９９１の定義に従う。

【0064】

「抗体」は、別段に指定されない限り、特異的結合に対する無傷抗体と競合する、無傷免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を意味する。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術により、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断により、生成され得る。抗原結合部分は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重抗体、三重抗体、四重抗体、ならびにポリペプチドとの特異的抗原結合を付与するに十分な、免疫グロブリンの少なくとも一部を含む、ポリペプチドを含む。

【0065】

Ｆａｂ断片は、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、およびＣ_Ｈ１ドメインを有する、一価断片であり、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結される、２つのＦａｂ断片を有する、二価断片であり、Ｆｄ断片は、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインを有し、Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインを有し、ｄＡｂ断片は、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、またはＶ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインの抗原結合性断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、第６，６９６，２４５号、米国出願公開第０５／０２０２５１２号、第０４／０２０２９９５号、第０４／００３８２９１号、第０４／０００９５０７号、第０３／００３９９５８号、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）。

【0066】

１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が、連続タンパク質鎖を形成するために、リンカーを（例えば、アミノ酸残基の合成配列）介して結合される抗体であり、リンカーは、タンパク質鎖が、それ自体に折り重なり、一価抗原結合部位を形成することを可能にするのに十分長い（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照）。二重抗体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同一の鎖上の２つのドメイン間の組み合わせを可能にするにはあまりに短く、したがって、各ドメインが、他のポリペプチド鎖上で、相補的ドメインと組み合わせることを可能にするリンカーにより結合される、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−２３を参照）。二重抗体の２つのポリペプチド鎖が、同一である場合、それらの組み合わせから得られる二重抗体は、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有する二重抗体を作製するために、使用され得る。同様に、三重抗体および四重抗体は、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を有し、それぞれ３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体であり、それらは同一であり得るか、または異なり得る。

【0067】

所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２，１９９１により記載されるシステムを使用して、識別され得る。１つ以上のＣＤＲは、共有結合的に、あるいは非共有結合的に分子に組み込まれ得て、それを抗原結合タンパク質にする。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲをより大きいポリペプチド鎖の一部として組み込み得るか、ＣＤＲを他のポリペプチド鎖と共有結合的に連結させ得るか、またはＣＤＲを非共有結合的に組み込み得る。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が、対象となる特定の抗原と特異的に結合することを可能にする。

【0068】

抗原結合タンパク質は、１つ以上の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であり得るか、または異なり得る。例えば、自然発生のヒト免疫グロブリンは、典型的に、２つの同一の結合部位を有するが、「二重特異性」または「二官能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。

【0069】

「ヒト抗体」という用語は、「完全ヒト抗体」とも呼ばれるが、ヒト免疫グロブリン配列に由来する、１つ以上の可変および定常領域を有するすべての抗体を含む。一実施形態においては、可変および定常ドメインのすべては、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、様々な方法で調製され得て、ヒト重鎖および／または軽鎖をコードしている遺伝子に由来する抗体を発現するために、遺伝子組み換えされたマウスの、対象となる抗原での免疫によるものを含む、それらの例が以下に記載される。

【0070】

非ヒト種抗体と比較して、ヒト対象に投与される場合、ヒト化抗体が、免疫反応を誘発する可能性が低い、および／または比較的軽い免疫反応を誘発するように、ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または添加により、非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有する。一実施形態においては、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメインにおける、特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を生成するために突然変異する。他の実施形態では、ヒト抗体からの定常ドメインは、非ヒト種の可変ドメインと融合する。他の実施形態では、非ヒト抗体の１つ以上のＣＤＲ配列における、１つ以上のアミノ酸残基は、ヒト対象に投与される場合、非ヒト抗体の予想される免疫原性を減少させるために変化し、抗原とのヒト化抗体の結合が、抗原との非ヒト抗体の結合よりも大幅に劣らないように、変化したアミノ酸残基は、抗体のその抗原との免疫特異的結合に重要ではないか、あるいはアミノ酸配列のなされる変化は、保存的変化である。ヒト化抗体の作製方法の実施例は、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、および５，８７７，２９３号に見ることができる。

【0071】

「キメラ抗体」という用語は、１つの抗体からの１つ以上の領域、および１つ以上の他の抗体からの１つ以上の領域を含む、抗体を意味する。一実施形態においては、ＣＤＲの１つ以上は、ヒト抗アクチビンＡ抗体に由来する。他の実施形態では、ＣＤＲのすべては、ヒト抗アクチビンＡ抗体に由来する。他の実施形態では、２つ以上のヒト抗アクチビンＡ抗体からのＣＤＲは、キメラ抗体に混合および適合される。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗アクチビンＡ抗体の軽鎖からのＣＤＲ１、第２のヒト抗アクチビンＡ抗体の軽鎖からのＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗アクチビンＡ抗体からの重鎖のＣＤＲを含み得る。さらに、フレームワーク領域は、同一の抗アクチビンＡ抗体のうちの１つ、ヒト抗体等の１つ以上の異なる抗体、またはヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の一例において、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種からの抗体と同一であるか、同種であるか、またはそれに由来する、もしくは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する一方で、残りの鎖は、他の種からの抗体と同一であるか、同種であるか、またはそれに由来する、もしくは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する。また、望ましい生物活性（すなわち、アクチビンＡと特異的に結合する能力）を呈する、このような抗体の断片も含まれる。

【0072】

抗体の断片またはアナログは、本明細書の内容に従い、当技術分野で周知の技術を使用して、当業者により容易に調製され得る。断片またはアナログの好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近傍に発現する。構造および機能ドメインは、公開または非公開配列データベースとの、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データの比較により識別され得る。既知の構造および／または機能を有する他のタンパク質において発現する、配列モチーフまたは予測タンパク質立体構造ドメインを識別するために、コンピュータ化された比較方法が使用され得る。既知の三次元構造に折り畳まれる、タンパク質配列を識別するための方法は、既知である。例えば、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４を参照。

【0073】

さらに、抗原特異的（すなわち、アクチビンＡ特異的）抗体は、相補的可変ドメインのライブラリーをスクリーニングするために、特異的ＶＬまたはＶＨドメインを使用することにより、当技術分野で既知の方法により生成され得る。抗体を生成するそのような方法は、当技術分野で既知である。例えば、微量コートタンパク質等の他のタンパク質と融合する抗体断片は、抗原を有するファージを濃縮するために使用され得る。次いで、マウス免疫から抗原（例えば、アクチビンＡ）への、再配列重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖のランダム組み合わせライブラリーを使用して、抗体断片の種々のライブラリーは、ファージ表面に表示される。これらのライブラリーは、相補的可変ドメインに対してスクリーニングされ得て、ドメインは、例えば、アフィニティーカラムにより精製される。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖ．３５２ ｐｐ．６２４−６２８（１９９１）を参照。

【0074】

他の実施例においては、抗体（すなわち、アクチビンＡ抗体）からの個々のＶＬまたはＶＨ鎖は、同一の特異性を有する、抗原結合性断片（またはＦａｂ）を形成し得る、他のＶＨまたはＶＬ鎖を検索するために使用され得る。したがって、ＶＨおよびＶＬ鎖Ｉｇ遺伝子のランダム組み合わせは、バクテリオファージライブラリー（ｆｄまたはラムダファージ等）において、抗原結合性断片として発現され得る。例えば、組み合わせライブラリーは、それぞれ抗原結合特異的ＶＬまたはＶＨ鎖ライブラリーと組み合わされる、親ＶＬまたはＶＨ鎖ライブラリーを用いることにより、生成され得る。次いで、組み合わせライブラリーは、従来の技術により、例えば、放射活性物質で標識したプローブ（放射活性物質で標識したアクチビンＡ等）を使用することにより、スクリーニングされ得る。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖ．１５０（３）ｐｐ．８８０−８８７（１９９３）を参照。

【0075】

「ＣＤＲグラフトされた抗体」は、特定の種もしくはイソタイプの抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ、および同一の、もしくは異なる種もしくはイソタイプの他の抗体のフレームワークを含む抗体である。

【0076】

「多特異的抗体」は、１つ以上の抗原上に、２つ以上のエピトープを認識する抗体である。この種類の抗体のサブクラスは、同一の、または異なる抗原上に、２つの異なるエピトープを認識する「二重特異的抗体」である。

【0077】

「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性の一因となる、アミノ酸残基（または他の部分）を含む、抗原結合タンパク質の一部である。その抗原と特異的に結合する抗体に対して、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。

【0078】

「エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により結合される分子の部分である。エピトープは、分子の非連続部分を含み得て（例えば、ポリペプチドの一次配列において連続的ではないが、ポリペプチドの三次および四次構造の文脈において、抗原結合タンパク質により結合されるために、互いに十分に近傍である、ポリペプチド、アミノ酸残基において）、記載される末端配列アミノ酸を含む。例えば、ポリペプチド配列Ｒ１３−Ｙ３９は、アミノ酸Ｒ１３およびＹ３９、ならびに配列においてＲ１３とＹ３９との間に見られるアミノ酸を含む。エピトープが、分子の非連続部分を含む実施形態においては、配列はそれに応じて記載される。

【0079】

２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性」は、そのデフォルトパラメータを使用する、ＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３の一部（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して、配列を比較することにより確定される。

【0080】

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、始めから終わりまで交互に用いられて、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ（例えば、ペプチド核酸および非自然発生のヌクレオチドアナログ）、およびそのハイブリッドを含む。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得る。一実施形態においては、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、またはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、もしくは変異形をコードする、連続的オープンリーディングフレームを含む。

【0081】

２つの１本鎖ポリヌクレオチドは、１つのポリヌクレオチドにおけるすべてのヌクレオチドが、ギャップの導入なしで、かついずれの配列の５’または３’末端における、不対ヌクレオチドなしで、他のポリヌクレオチドにおける、その相補的ヌクレオチドの反対側にあるように、それらの配列が、逆平行方向に並べられた場合、互いの「相補体」である。ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチドが、適度に厳しい条件下で互いにハイブリタイズし得る場合、他のポリヌクレオチドに対して「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、その相補体になることなく、他のポリヌクレオチドに対して相補的であり得る。

【0082】

「ベクター」は、それに連結される他の核酸を細胞に導入するために使用され得る、核酸である。一種類のベクターは、「プラスミド」であり、追加の核酸セグメントが結紮され得る、線状または環状２本鎖ＤＮＡ分子を意味する。他の種類のベクターは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連性ウイルス）であり、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに導入され得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において、自己複製が可能である（例えば、複製の細菌起源を含む細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入により、宿主細胞のゲノムに統合され、それにより、宿主ゲノムともに複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を制御することができる種類のベクターである。

【0083】

ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現レベル、タイミング、または位置）に影響を与える場合、調節配列に「動作可能に連結」される。「調節配列」は、それが動作可能に連結される核酸の発現（例えば、発現レベル、タイミング、または位置）に影響を与える核酸である。調節配列は、例えば、調節核酸への直接の、または１つ以上の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸と結合するポリペプチド）の作用を通じた、その効果を示し得る。調節配列の例は、プロモータ、エンハンサ、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含む。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ａｎｄ Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６に記載される。

【0084】

「宿主細胞」は、核酸、例えば、本発明の核酸を発現するために使用され得る細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌であり得るか、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、イースト、または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマトの植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）、またはハイブリドーマであり得る。本明細書の実施例３は、ＣＳ−９細胞の使用を記載する。他の宿主細胞の例は、サル腎細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、もしくは無血清培地内で成長するベジタリアンＣＨＯおよび関連細胞株等のそれらの誘導体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１を参照）、２９３、２９３ＥＢＮＡ、もしくはＭＳＲ ２９３等のヒト胎児腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常２倍体細胞、一次組織の体外培養に由来する細胞株、一次移植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞を含む。一般的に、宿主細胞は、ポリペプチドをコードしている核酸で形質転換または形質移入され得る、培養細胞である。「組み換え宿主細胞」という語句は、発現されるための、核酸で形質転換または形質移入されている宿主細胞を表すために、使用され得る。また、宿主細胞は、調節配列が、核酸と動作可能に連結されるように、宿主細胞に導入されない限り、核酸を含むが、望ましいレベルでそれを発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫もしくは潜在的子孫も意味することが、理解される。例えば、変異または環境の影響により、特定の一時変異が、後の生成で起こるため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでもなお、本明細書に使用されるような用語の範囲内に含まれる。

【0085】

抗原結合タンパク質
一実施形態においては、本発明は、アクチビンＡ、例えば、ヒトアクチビンＡと結合する、抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体突然変異タンパク質、および抗体変異形）を提供する。

【0086】

本発明に従った抗原結合タンパク質は、アクチビンＡの生物活性を阻害する抗原結合タンパク質を含む。例えば、抗原結合タンパク質は、悪液質を減弱させ得て、この活性は、抗原結合タンパク質が、完全ヒト抗体等の完全ヒトである場合、存在し得る。

【0087】

異なる抗原結合タンパク質は、アクチビンＡの異なるドメインもしくはシステインノットドメインと結合し得るか、または異なる作用機構により作用し得る。実施例は、配列番号：１のおよそアミノ酸４−１２、アミノ酸１１−８１、アミノ酸１１−３３、アミノ酸１３−３９、アミノ酸４０−１１３、アミノ酸４４−１１５、アミノ酸８１−１１１、および／またはアミノ酸８２−１０７をスパンする領域を含む、ジスルフィド結合間に散在する、１つ以上の特定のシステインノットドメインまたは領域と特異的に結合する、抗原結合タンパク質を含むがこれに限定されない。とりわけ本明細書に示されるように、ドメイン領域は、別段に示されない限り、例えば群を含めるように指定される。例えば、アミノ酸４−１２は、９つのアミノ酸、位置４および１２におけるアミノ酸、ならびに配列における７つの介在アミノ酸を意味する。他の例は、アクチビンＡのその受容体との結合を阻害する、抗原結合タンパク質を含む。抗原結合タンパク質は、本発明における使用を見い出すために、アクチビンＡ誘発活性を完全に阻害する必要はなく、むしろ、アクチビンＡの特定の活性を減少させる抗原結合タンパク質が、同様に使用に関して検討される。（特定の疾病の治療における、アクチビンＡ結合抗原結合タンパク質に対する特定の作用機構に関する、本明細書での考察は、例示的にすぎず、本明細書に示される方法は、それにより束縛されない。）
他の実施形態においては、本発明は、Ａ１−Ａ１４から成る群から選択される軽鎖可変領域、またはＡ１−Ａ１４から成る群から選択される重鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質、ならびにその断片、誘導体、突然変異タンパク質、および変異形を提供する。そのような抗原結合タンパク質は、「ＬｘＨｙ」という用語を使用して表わされ得て、以下の配列で標識されるように、「ｘ」は、軽鎖可変領域の数に相当し、「ｙ」は、重鎖可変領域の数に相当する。つまり、例えば、「Ａ１ＨＣ」は、抗体Ａ１の重鎖可変領域を表し、「Ａ１ＬＣ」は、抗体Ａ１の軽鎖可変領域を表す等である。より一般的に言えば、「Ｌ２Ｈ１」は、Ｌ２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、およびＨ１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、抗原結合タンパク質を意味する。明確にするために、少なくとも２つのメンバーの群により表わされるすべての範囲は、範囲の端のメンバー間の、かつ範囲の端のメンバーを含む、すべてのメンバーを含む。したがって、群の範囲Ａ１−Ａ１４は、Ａ１とＡ１４との間のすべてのメンバー、ならびにＡ１およびＡ１４それら自体も含む。群の範囲Ａ４−Ａ６は、Ａ４、Ａ５、およびＡ６のメンバーを含む等である。

【0088】

フレームワーク領域（ＦＲ）が、これらの可変ドメイン配列の介在セグメントである一方で、抗原結合部位の一部を生成する、ＣＤＲの位置、または相補性決定領域（影付きおよび下線あり）も、以下に示される。軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方において、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１−３）および４つのＦＲ（ＦＲ１−４）がある。各軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域もまた、抗体の種類によりグループ化される（Ａ１、Ａ２、Ａ３等）。本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、Ｌ１Ｈ１（抗体Ａ１）、Ｌ２Ｈ２（抗体Ａ２）、Ｌ３Ｈ３（抗体Ａ３）、Ｌ４Ｈ４（抗体Ａ４）、Ｌ５Ｈ５（抗体Ａ５）、Ｌ６Ｈ６（抗体Ａ６）、Ｌ７Ｈ７（抗体Ａ７）、Ｌ８Ｈ８（抗体Ａ８）、Ｌ９Ｈ９（抗体Ａ９）、Ｌ１０Ｈ１０（抗体Ａ１０）、Ｌ１１Ｈ１１（抗体Ａ１１）、Ｌ１２Ｈ１２（抗体Ａ１２）、Ｌ１３Ｈ１３（抗体Ａ１３）、およびＬ１４Ｈ１４（抗体Ａ１４）から成る組み合わせの群から選択される、軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせを有する、抗原結合タンパク質を含む。

【0089】

抗体Ａ１−Ａ１４重鎖および軽鎖可変領域ポリヌクレオチド（本明細書では、Ｈ１―Ｈ１４およびＬ１−Ｌ１４とも呼ばれる）。

【0090】

Ａ１ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡＣＧＧＴＧＴＣＡＡＴＴＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡ（配列番号：２）

Ａ１ ＬＣ

ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号：１）


Ａ２ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧ（配列番号：１８）


Ａ２ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１７）


Ａ３ ＨＣ

ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＡＡＣＡＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：３４）


Ａ３ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＧＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号：３３）

Ａ４ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＴＣＧＧＧＧＴＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：５０）

Ａ４ ＬＣ

ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＣＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号：４９）


Ａ５ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴ（配列番号：６６）

Ａ５ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＡＧＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧＧＧＡＡＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：６５）

Ａ６ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＧＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＣＴＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：８２）

Ａ６ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＣＧＣＣＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＡ（配列番号：８１）

Ａ７ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：９８）

Ａ７ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＴＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ（配列番号：９７）

Ａ８ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＧＴＴＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＴＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：１１４）

Ａ８ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＡＧＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＴＴＧＡＴＣＡＴＴＴＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧＧＧＡＡＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１１３）

Ａ９ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＧＡＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：１３０）

Ａ９ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１２９）

Ａ１０ ＨＣ

ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴ
ＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：１４６）

Ａ１０ ＬＣ

ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号：１４５）

Ａ１１ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＡＣＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＴＡＣＧＧＴＧＡＣＴＡＴＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：１６２）

Ａ１１ ＬＣ

ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＡＣＴＴＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号：１６１）

Ａ１２ ＨＬ

ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＧＡＣＴＣＣＴＡＣＣＡＡＴＡＣＧＧＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：１７８）

Ａ１２ ＬＣ

ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１７７）

Ａ１３ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：１９４）

Ａ１３ ＬＣ

ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＧ（配列番号：１９３）

Ａ１４ ＨＣ

ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＴＡＴＧＡＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＧＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧ（配列番号：２１０）

Ａ１４ ＬＣ

ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＣ（配列番号：２０９）

抗体Ａ１〜Ａ１４アミノ酸配列、軽鎖可変領域。ＣＤＲ領域は、網掛けされ、下線を引かれ、介在する部分または領域は、本明細書ではフレームワーク（ＦＲ）として言及される。

【0091】

Ａ１
ＳＹＥＶＴＱＡＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＳＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＡＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号：９）


Ａ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＴＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２５）

Ａ３
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＲＱＱＮＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：４１）


Ａ４
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＴＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＦＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＣＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：５７）

Ａ５
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＴＣＫＳＳＱＳＩＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＶＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＩＩＹＷＴＳＭＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：７３）

Ａ６
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＶＳＹＹＣＱＱＳＹＳＩＳＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＮＫ（配列番号：８９）

Ａ７
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＧＱＧＩＲＮＤＬＶＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＴＹＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号：１０５）

Ａ８
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＴＣＫＳＳＱＳＩＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＶＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＩＩＹＷＴＳＭＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：１２１）

Ａ９
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＴＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：１３７）

Ａ１０
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＥＫＷＧＥＫＹＡＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＩＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＲＳＴＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号：１５３）

Ａ１１
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＫＦＡＦＷＹＱＬＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＡＡＤＦＹＣＱＡＷＤＳＳＴＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号：１６９）

Ａ１２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＣＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＴＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：１８５）

Ａ１３
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＫＹＶＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＥＬＶＩＹＬＤＮＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号：２０１）

Ａ１４
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＦＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＦＹＨＤＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＨＣＱＡＷＤＳＳＴＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号：２１７）

抗体Ａ１〜Ａ１４、重鎖可変領域のアミノ酸配列。ＣＤＲ領域は、網掛けされ、下線を引かれ、他の領域は本明細書ではフレームワーク（ＦＲ）として言及される。

【0092】

Ａ１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＬＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＩＰＹＮＧＮＴＮＳＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＤＲＤＹＧＶＮＹＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号：１０）

Ａ２
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＨＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＳＲＮＷＮＹＤＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号：２６）

Ａ３
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＣＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＥＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＳＳＷＹＹＹＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号：４２）

Ａ４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＤＳＧＹＳＳＳＷＨＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５８）

Ａ５
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＳＦＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＩＡＡＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：７４）

Ａ６
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＡＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＧＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＱＷＬＥＬＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：９０）

Ａ７
ＱＶＱＬＶＤＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＩＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＴＥＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＱＷＬＹＨＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号：１０６）

Ａ８
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＳＦＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＲＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＳＩＡＡＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１２２）

Ａ９
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＨＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＳＲＮＷＮＹＤＮＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号：１３８）

Ａ１０
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＱＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＱＧＬＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１５４）

Ａ１１
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＧＹＹＷＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＹＧＤＹＲＧＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１７０）

Ａ１２
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＡＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＲＮＷＮＹＤＳＹＱＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号：１８６）

Ａ１３
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＲＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＴＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＤＹＹＤＳＳＧＷＧＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２０２）

Ａ１４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＰＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＴＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＤＹＹＤＳＳＧＷＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：２１８）


抗体Ａ１〜Ａ１４のＣＤＲコンセンサス配列。

【0093】

軽鎖 ＣＤＲ１配列

Ｌ４ ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＴＧＹＮ−ＹＬＤ（配列番号：２５３）
Ｌ５、Ｌ８ ＫＳＳＱＳＩＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＶ（配列番号：７５）
コンセンサス： Ｘ_１ＳＳＱＳＸ_２ＬＸ_３ＳＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＹＬＸ_９（配列番号：１１５）

Ｘ_１は、アルギニン残基またはリジン残基であり、
Ｘ_２は、ロイシン残基またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_３は、ヒスチジン残基またはチロシン残基であり、
Ｘ_４は、トレオニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_５は、グリシン残基またはアスパラギン残基であり、
Ｘ_６は、チロシン残基またはアスパラギン残基であり、
Ｘ_７は、アスパラギン残基またはリジン残基であり、
Ｘ_８は、リジン残基または残基なしであり、
Ｘ_９は、アスパラギン酸塩残基またはバリン残基である

Ｌ２、Ｌ９ ＲＡＳＱＧＩＲＮＮＬＧ（配列番号：２７）
Ｌ３、Ｌ１２ ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号：４３）
Ｌ６ ＲＡＳＱＳＩＳＮＹＬＮ（配列番号：９１）
Ｌ７ ＲＡＧＱＧＩＲＮＤＬＶ（配列番号：１０７）
コンセンサス： ＲＡＸ_１０ＱＸ_１１ＩＸ_１２ＮＸ_１３ＬＸ_１４（配列番号：１１６）

Ｘ_１０は、セリン残基またはグリシン残基であり、
Ｘ_１１は、セリン残基またはグリシン残基であり、
Ｘ_１２は、セリン残基またはアルギニン残基であり、
Ｘ_１３は、チロシン残基、アスパラギン酸塩残基、またはアスパラギン残基であり
Ｘ_１４は、アスパラギン酸残基、バリン残基、またはグリシン残基である

Ｌ１ ＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＣ（配列番号：１１）
Ｌ１０ ＳＧＥＫＷＧＥＫＹＡＣ（配列番号：１５５）
Ｌ１１ ＳＧＤＫＬＧＤＫＦＡＦ（配列番号：１７１）
Ｌ１３ ＳＧＤＫＬＧＤＫＹＶＣ（配列番号：２０３）
Ｌ１４ ＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＦ（配列番号：２１９）
コンセンサス： ＳＧＸ_１５ＫＸ_１６ＧＸ_１７ＫＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０（配列番号：１２３）

Ｘ_１５は、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_１６は、トリプトファン残基またはロイシン残基であり、
Ｘ_１７は、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_１８は、チロシン残基またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘ_１９は、アラニン残基またはバリン残基であり、
Ｘ_２０は、システイン残基またはフェニルアラニン残基である


軽鎖 ＣＤＲ２配列

Ｌ２ ＡＴＳＳＬＱＳ（配列番号：９２）
Ｌ３、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ９、Ｌ１２ ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号：４４）
Ｌ５、Ｌ８ ＷＴＳＭＲＥＳ（配列番号：７６）
Ｌ４ ＬＧＳＦＲＡＳ（配列番号：２５４）
コンセンサス： Ｘ_４０Ｘ_４１ＳＸ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｓ（配列番号：１２４）

Ｘ_４０は、アラニン残基、トリプトファン残基、またはロイシン残基であり、
Ｘ_４１は、トレオニン残基、アラニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_４２は、セリン残基、メチオニン残基、またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘ_４３は、ロイシン残基またはアルギニン残基であり、
Ｘ_４４は、グルタミン残基、グルタミン酸残基、またはアラニン残基である
Ｌ１０ ＱＤＴＫＲＰＳ（配列番号：１５６）
Ｌ１１ ＱＤＮＫＲＰＳ（配列番号：１７２）
Ｌ１ ＱＤＳＫＲＰＳ（配列番号：１２）
Ｌ１３ ＬＤＮＫＲＰＳ（配列番号：２０４）
Ｌ１４ ＨＤＴＫＲＰＳ（配列番号：２２０）
コンセンサス： Ｘ_４５ＤＸ_４６ＫＲＰＳ（配列番号：１２８）
Ｘ_４５は、グルタミン残基、ロイシン残基、またはヒスチジン残基であり、
Ｘ_４６は、トレオニン残基、アスパラギン残基、またはセリン残基である


軽鎖 ＣＤＲ３配列

Ｌ１ ＱＡＷＤＳＳＴＡＶ（配列番号：１３）
Ｌ１０ ＱＡＷＤＲＳＴ−Ｖ（配列番号：１５７）
Ｌ１１ ＱＡＷＤＳＳＴＶＶ（配列番号：１７３）
Ｌ１３、Ｌ１４ ＱＡＷＤＳＳＴＶ−（配列番号：２０５）

Ｌ２ ＬＱＨＮＳＹＰＷＴ（配列番号：２９）
Ｌ７ ＬＱＨＮＴＹＰＦＴ（配列番号：１０９）
Ｌ９ ＬＱＨＮＳＹＰＷＴ（配列番号：１４１）
Ｌ１２ ＬＱＨＮＳＹＴＷＴ（配列番号：１８９）
コンセンサス： ＬＱＨＮＸ_８１ＹＸ_８２Ｘ_８３Ｔ（配列番号：１３１）

Ｘ_８１は、トレオニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_８２は、プロリン残基またはトレオニン残基であり、
Ｘ_８３は、フェニルアラニン残基またはトリプトファン残基である

Ｌ３ ＲＱＱＮＴＹＰＬＴ（配列番号：４５）
Ｌ４ ＭＱＡＬＱＴＰＣＳ（配列番号：２５５）
Ｌ５ ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：７７）
Ｌ６ ＱＱＳＹＳＩＳＰＴ（配列番号：９３）
Ｌ８ ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：１２５）
コンセンサス： Ｘ_７３ＱＸ_７４Ｘ_７５Ｘ_７６Ｘ_７７Ｘ_７８Ｘ_７９Ｘ_８０（配列番号：１３２）

Ｘ_７３は、メチオニン残基、グルタミン残基、またはアルギニン残基であり、
Ｘ_７４は、アラニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、またはセリン残基であり、
Ｘ_７５は、ロイシン残基、チロシン残基、またはアスパラギン残基であり、
Ｘ_７６は、グルタミン残基、セリン残基、またはトレオニン残基であり、
Ｘ_７７は、トレオニン残基、チロシン残基、またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_７８は、プロリン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_７９は、システイン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、またはプロリン残基であり、
Ｘ_８０は、セリン残基またはトレオニン残基である

重鎖 ＣＤＲ１配列

Ｈ５ ＧＧＳＩＮＳ−−ＦＹＷＳ（配列番号：７８）
Ｈ６ ＧＧＳＦＳＡ−−ＹＹＷＳ（配列番号：９４）
Ｈ８ ＧＧＳＩＮＳ−−ＦＹＷＳ（配列番号：１２６）
Ｈ１１ ＧＧＳＩＳＳＧＧＹＹＷＳ（配列番号：１７４）
コンセンサス： ＧＧＳＸ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６ＹＷＳ（配列番号：２５２）

Ｘ_２１は、イソロイシン残基またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘ_２２は、アスパラギン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_２３は、セリン残基またはアラニン残基であり、
Ｘ_２４は、グリシン残基または残基なしであり、
Ｘ_２５は、グリシン残基または残基なしあり、
Ｘ_２６は、フェニルアラニン残基またはチロシン残基である

Ｈ７ ＧＦＴＦＩＳＹＧＭＨ（配列番号：１１０）
Ｈ４ ＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨ（配列番号：２５６）
Ｈ２、Ｈ９ ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号：３０）
Ｈ１０ ＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧ（配列番号：１５８）
コンセンサス： ＧＸ_２７Ｘ_２８ＦＸ_２９Ｘ_３０ＹＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３（配列番号：２５７）

Ｘ_２７は、チロシン残基またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘ_２８は、トレオニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_２９は、トレオニン残基、セリン残基、またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_３０は、グリシン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_３１は、チロシン残基、グリシン残基、またはトリプトファン残基であり、
Ｘ_３２は、イソロイシン残基またはメチオニン残基であり、
Ｘ_３３は、ヒスチジン残基またはグリシン残基である


Ｈ１３ ＧＹＴＦＴＳＹＧＬＳ（配列番号：６２）
Ｈ１２ ＧＦＴＦＳＡＹＧＭＨ（配列番号：１９０）
Ｈ３ ＧＦＴＦＳＳＹＷＭＳ（配列番号：４６）
Ｈ１、Ｈ１４ ＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号：２０６）
コンセンサス： ＧＸ_３４ＴＦＸ_３５Ｘ_３６ＹＸ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９（配列番号：１４０）

Ｘ_３４は、チロシン残基またはフェニルアラニン残基であり、
Ｘ_３５は、トレオニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_３６は、セリン残基またはアラニン残基であり、
Ｘ_３７は、グリシン残基またはトリプトファン残基であり、
Ｘ_３８は、ロイシン残基、メチオニン残基、またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_３９は、セリン残基またはヒスチジン残基である




重鎖 ＣＤＲ２配列

Ｈ１１ ＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：１７５）
Ｈ５ ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：７９）
Ｈ６ ＥＩＮＨＳＧＧＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：９５）
Ｈ８ ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＲ（配列番号：１２７）
コンセンサス： Ｘ_４７ＩＸ_４８Ｘ_４９ＳＧＸ_５０ＴＸ_５１ＹＮＰＳＬＫＸ_５２（配列番号：１４２）

Ｘ_４７は、チロシン残基またはグルタミン酸残基であり、
Ｘ_４８は、セリン残基、チロシン残基、またはアスパラギン残基であり、
Ｘ_４９は、チロシン残基またはヒスチジン残基であり、
Ｘ_５０は、セリン残基またはグリシン残基であり、
Ｘ_５１は、チロシン残基またはアスパラギン残基であり、
Ｘ_５２は、セリン残基またはアルギニン残基である


Ｈ２、Ｈ９ ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＨＡＤＳＶＫＧ（配列番号：３１）
Ｈ１２ ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：１９１）
Ｈ３ ＮＩＫＱＤＧＳＥＥＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号：４７）
Ｈ７ ＶＩＷＹＤＧＳＴＥＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：１１１）
コンセンサス： Ｘ_５３ＩＸ_５４Ｘ_５５ＤＧＳＸ_５６Ｘ_５７ＹＸ_５８Ｘ_５９ＤＳＶＫＧ（配列番号：１７９）

Ｘ_５３は、アスパラギン残基またはバリン残基であり、
Ｘ_５４は、トリプトファン残基またはリジン残基であり、
Ｘ_５５は、チロシン残基またはグルタミン残基であり、
Ｘ_５６は、アスパラギン残基、グルタミン酸残基、またはセリン残基であり、
Ｘ_５７は、リジン残基、またはグルタミン酸残基であり、
Ｘ_５８は、ヒスチジン残基、またはチロシン残基であり、
Ｘ_５９は、アラニン残基またはバリン残基である

Ｈ４ ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号：２５８）
Ｈ１ ＷＩＩＰＹＮＧＮＴＮＳＡＱＫＬＱＧ（配列番号：６３）
Ｈ１３ ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号：２０７）
Ｈ１４ ＷＩＳＰＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号：２５９）
Ｈ１０ ＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号：１５９）
コンセンサス： Ｘ_６０ＩＸ_６１Ｘ_６２Ｘ_６３Ｘ_６４Ｘ_６５Ｘ_６６ＴＸ_６７Ｘ_６８Ｘ_６９Ｘ_７０Ｘ_７１Ｘ_７２ＱＧ（配列番号：１８０）

Ｘ_６０は、トリプトファン残基またはイソロイシン残基であり、
Ｘ_６１は、アスパラギン残基、イソロイシン残基、セリン残基、またはチロシン残基であり、
Ｘ_６２は、プロリン残基またはアラニン残基であり、
Ｘ_６３は、アスパラギン残基、チロシン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_６４は、セリン残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_６５は、グリシン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_６６は、グリシン残基、アスパラギン残基、またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_６７は、アスパラギン残基またはアルギニン残基であり、
Ｘ_６８は、チロシン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_６９は、アラニン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_７０は、グルタミン残基またはプロリン残基であり、
Ｘ_７１は、リジン残基またはセリン残基であり、
Ｘ_７２は、フェニルアラニン残基またはロイシン残基である



重鎖 ＣＤＲ３配列
Ｈ５、Ｈ８ −−ＤＳＩＡＡＰＦＤＹ（配列番号：８０）
Ｈ６ ＶＱＷＬＥＬＡＹＦＤＹ（配列番号：９６）
Ｈ１０ −−−−ＱＧＬＧＦＤＹ（配列番号：１６０）
コンセンサス： Ｘ_８７Ｘ_８８Ｘ_８９Ｘ_９０Ｘ_９１Ｘ_９２Ｘ_９３Ｘ_９４ＦＤＹ（配列番号：１８７）

Ｘ_８７は、バリン残基または残基なしであり、
Ｘ_８８は、グルタミン残基または残基なしであり、
Ｘ_８９は、アスパラギン酸塩残基、トリプトファン残基、または残基なしであり、
Ｘ_９０は、セリン残基、ロイシン残基、または残基なしであり、
Ｘ_９１は、イソロイシン残基、グルタミン酸残基、またはグルタミン残基であり、
Ｘ_９２は、アラニン残基、ロイシン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_９３は、アラニン残基またはロイシン残基であり、
Ｘ_９４は、プロリン残基、チロシン残基、またはグリシン残基である


Ｈ１３ ＤＱＤＹＹＤＳＳＧＷ−ＧＨ（配列番号：２０８）
Ｈ１４ ＤＱＤＹＹＤＳＳＧＷ−ＤＰ（配列番号：２２４）
Ｈ１１ −−ＡＹＧＤＹＲＧＷＦＤＰ（配列番号：１７６）
コンセンサス： Ｘ_９５Ｘ_９６Ｘ_９７ＹＸ_９８ＤＸ_９９Ｘ_１００ＧＷＸ_１０１Ｘ_１０２Ｘ_１０３（配列番号：１８８）

Ｘ_９５は、アスパラギン酸塩残基または残基なしであり、
Ｘ_９６は、グルタミン残基または残基なしであり、
Ｘ_９７は、アスパラギン酸塩残基またはアラニン残基であり、
Ｘ_９８は、チロシン残基またはグリシン残基であり、
Ｘ_９９は、セリン残基またはチロシン残基であり、
Ｘ_１００は、セリン残基またはアルギニン残基であり、
Ｘ_１０１は、フェニルアラニン残基または残基なしであり、
Ｘ_１０２は、グリシン残基またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_１０３は、ヒスチジン残基またはプロリン残基である



Ｈ４ −−−ＤＳＧＹＳＳＳＷＨＦＤＹ−（配列番号：２６０）
Ｈ１ −−−ＤＲＤＹＧＶＮＹＤＡＦＤＩ（配列番号：６４）
Ｈ２ −ＳＲＮＷＮＹＤＮＹＹＹＧＬＤＶ（配列番号：３２）
Ｈ１２ −ＳＲＮＷＮＹＤＳＹＱＹＧＬＤＶ（配列番号：１９２）
Ｈ９ −ＳＲＮＷＮＹＤＮＹＹＹＧＬＤＶ（配列番号：１４４）
Ｈ３ ＧＳＳＳＷＹＹ−ＹＮＧＭＤＶ−（配列番号：２６１）
Ｈ７ −ＥＲＱＷＬＹ−−ＨＹＧＭＤＶ（配列番号：１１２）

コンセンサス： Ｘ_１０４Ｘ_１０５Ｘ_１０６Ｘ_１０７Ｘ_１０８Ｘ_１０９ＹＸ_１１０Ｘ_１１１Ｘ_１１２Ｘ_１１３Ｘ_１１４Ｘ_１１５Ｘ_１１６Ｘ_１１７Ｘ_１１８（配列番号：２４９）

Ｘ_１０４は、グリシン残基または残基なしであり、
Ｘ_１０５は、セリン残基、グルタミン酸残基、または残基なしであり、
Ｘ_１０６は、アルギニン残基、セリン残基、または残基なしであり、
Ｘ_１０７は、アスパラギン酸塩残基、アスパラギン残基、セリン残基、またはグルタミン残基であり、
Ｘ_１０８は、セリン残基、アルギニン残基、またはトリプトファン残基であり、
Ｘ_１０９は、グリシン残基、アスパラギン酸塩残基、アスパラギン残基、チロシン残基、またはロイシン残基であり、
Ｘ_１１０は、セリン残基、グリシン残基、アスパラギン酸塩残基、または残基なしであり、
Ｘ_１１１は、セリン残基、バリン残基、アスパラギン残基、またはチロシン残基であり、Ｘ_１１２は、セリン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、またはヒスチジン残基であり、
Ｘ_１１３は、トリプトファン残基、チロシン残基、またはグルタミン残基であり、
Ｘ_１１４は、ヒスチジン残基、アスパラギン酸塩残基、チロシン残基、または残基なしであり、
Ｘ_１１５は、フェニルアラニン残基、アラニン残基、またはグリシン残基であり、
Ｘ_１１６は、アスパラギン塩酸残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、またはメチオニン残基であり、
Ｘ_１１７は、チロシン残基、またはアスパラギン酸塩残基であり、
Ｘ_１１８は、イソロイシン残基、バリン残基、または残基なしである

一実施形態においては、本発明は１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１の残基のみにおいて、Ｌ１からＬ１４から成る群から選択された、軽鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供し、それぞれのそのような配列の違いは、独立して１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである。他の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ１４から成る群から選択された軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ１４（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、およびＬ１４を含む）から成る群から選択された軽鎖可変ドメインをコードする、ヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ１４から成る群から選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体へ、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ１４から成る群から選択される軽鎖可変ドメインをコードする、ポリヌクレオチドの補体へ、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ１４の軽鎖ポリヌクレオチドの補体へ、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。

【0094】

他の実施形態では、本発明は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１の残基のみにおいて、Ｈ１〜Ｈ１４から成る群から選択された重鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質を提供し、それぞれのそのような配列の違いは、独立したアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかである。他の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ１４から成る群から選択される重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ１４から成る群から選択される重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％，または９９％同一であるヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ１４から成る群から選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体へ、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ１４から成る群から選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体へ、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３６、１５４、１７０、１８６、２０２、および２１８から選択される重鎖ポリヌクレオチドの補体へ、適度に厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。

【0095】

本発明の抗原結合たんぱく質の特定の実施形態は、例えば、１つ以上の配列番号、９〜１６、２２、２５〜３２、３６、４１〜４８〜５７〜６２、６４、７３〜８０、８９〜９１、９３〜９６、１０５〜１０７、１０９〜１１２、１１５、１１６、１２１〜１２８、１３１、１３２、１３４、１３７〜１４２、１４４、１５３〜１６０、１６９〜１７６、１７９、１８０、１８５〜１９２、２０１〜２０８、２１７〜２２０、および２２３からの１つ以上のＣＤＲまたはＦＲである、本明細書で言及される１つ以上のＣＤＲおよび／またはＦＲのアミノ酸配列と同一である、１つ以上のアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、抗原結合タンパク質は、上に説明される軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される重鎖ＣＤＲ１配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される重鎖ＣＤＲ２配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される軽鎖ＦＲ１配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される軽鎖ＦＲ２配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される軽鎖ＦＲ３配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される軽鎖ＦＲ４配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される重鎖ＦＲ１配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される重鎖ＦＲ２配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される重鎖ＦＲ３配列を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明される重鎖ＦＲ４配列を含む。

【0096】

一実施形態においては、本発明は、５、４、３、２、または１以下のアミノ酸残基によって上に示されるＣＤＲ配列とは異なる１つ以上のＣＤＲ配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。

【0097】

他の実施形態では、少なくとも１つの抗原結合タンパク質のＣＤＲ３配列は、表１または表２に示されるように、Ａ１〜Ａ１４からのＣＤＲ３配列である。他の実施形態では、抗原結合タンパク質の軽鎖ＣＤＲ３配列は、表１に示されるＡ１〜Ａ１４からの軽鎖ＣＤＲ３配列であり、抗原結合タンパク質の重鎖ＣＤＲ３配列は、表２に示されるＡ１〜Ａ１４からの重鎖配列である。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ａ１〜Ａ１４のＣＤＲ配列から６、５、４、３、２、１、または０の単一アミノ酸添加、置換、および／または欠失によってそれぞれ単独で異なる１、２、３、４、または５のＣＤＲ配列を含み、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲ配列から６、５、４、３、２、１、または０の単一アミノ酸添加、置換、および／または欠失によってそれぞれ単独で異なる１、２、３、４、または５のＣＤＲ配列をさらに含む。

【0098】

抗体Ａ１〜Ａ１４の軽鎖ＣＤＲは、以下の表１に示され、抗体Ａ１〜Ａ１４の重鎖ＣＤＲは、以下の表２に示される。

【0099】

【表1-1】

【0100】

【表1-2】

【0101】

【表2-1】

【0102】

【表2-2】

Ａ１〜Ａ１４のヌクレオチド配列、またはＡ１〜Ａ１４のアミノ酸配列は、非突然変異ポリヌクレオチドと比べた際、１つ以上の特定のヌクレオチド置換、欠失、または挿入を含む改変ポリヌクレオチドを作るために、例えば、ランダム突然変異によって、または部位特異的突然変異（例えば、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発）によって、改変されることが可能である。そのような改変を行うための技術の例は、Ｗａｌｄｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４２：１３３；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８５，Ｇｅｎｅ ３７：７３；Ｃｒａｉｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ
１９８５，１２−１９；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；および米国特許番号第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に記載される。これらおよび他の方法は、例えば、誘導体化されない抗体と比べた際、アクチビンＡに対する親和性、結合力、または特異性の増加、体内外での活性または安定性の増加、または体外での副作用の減少等の所望の特性を有する、例えば、抗アクチビンＡ抗体の誘導体を製造するために使用することが可能である。

【0103】

本発明の範囲内の他の抗アクチビンＡ抗体の誘導体は、抗アクチビンＡ抗体ポリペプチドのＮ末端、またはＣ末端と融合する相同ペプチドを含む組み換え融合タンパク質の発現等による、他のタンパク質またはポリペプチドを伴う、抗アクチビンＡ抗体の他のタンパク質またはポリペプチドとの共有性または集合性共役、またはこれらの断片を含む。例えば、共役ペプチドは、相同シグナル（または、リーダー）ポリペプチド、例えば、イーストα因子のリーダー、またはエピトープタグ等のペプチドであってもよい。抗原結合タンパク質含有融合タンパク質は、抗原結合タンパク質（例えば、ポリＨｉｓ）の精製または同定を促進するために添加されるペプチドを含むことが可能である。また、抗原結合タンパク質はＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８、および米国特許番号第５，０１１，９１２号に記載されるように、ＦＬＡＧペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号：２２６）と連結されることが可能である。該ＦＬＡＧペプチドは、著しい抗原性があり、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合するエピトープを提供し、これにより発現組み換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所定のポリペプチドへ融合される、融合タンパク質を調製するために有用な試薬は、市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。

【0104】

１つ以上の抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーは、アクチビンＡアンタゴニストとして用いられてもよい。オリゴマーは、共有結合的、または非共有結合的二量体、三量体、またはより高いオリゴマーの形態であってもよい。２つ以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーは、ホモ二量体の例としてのの使用が想定される。他のオリゴマーは、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等を含む。

【0105】

一実施形態は、抗原結合タンパク質と融合する、ペプチド部分との間の共有結合、または非共有結合の相互作用を介して結び付く複数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーを対象とする。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。ロイシンジッパーおよび特定の抗体に由来するポリペプチドは、以下にさらに詳しく記載するように、ペプチドに付着する抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進することが可能であるペプチドの１つである。

【0106】

特定の実施形態において、該オリゴマーは、２つから４つの抗原結合タンパク質を含む。該オリゴマーの抗原結合タンパク質は、例えば変異形または断片等の、上に記載のあらゆる形態等の、任意の形態であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、アクチビンＡ結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。

【0107】

一実施形態においては、オリゴマーは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用して調製される。融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２
Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１−１０．１９．１１により記載される抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分と融合する、特定の相同ポリペプチドを含む。

【0108】

本発明の一実施形態は、抗アクチビンＡ抗体のアクチビンＡ結合断片を抗体のＦｃ領域へ融合することによって作られた、２つの融合タンパク質を含む二量体を対象とする。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を適切な発現ベクターへ挿入し、組み換え発現ベクターで転換された宿主細胞で遺伝子融合を発現し、発現融合タンパク質が酷似の抗体分子を組み立てることを可能にするステップにより、二量体を生じるためにＦｃ部分間において鎖間ジスルフィド結合を形成することで製造されることが可能である。

【0109】

「Ｆｃポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然および突然変異タンパク質形態を含む。二量化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの切断型も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（および、これらから形成されるオリゴマー）はタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラム上の親和性クロマトグラフィーによる容易な精製の利点を発揮する。

【0110】

ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（本明細書に、参照により組み込まれる）に記載される１つの適したＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然Ｃ末端へ延在する単鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許番号第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。該突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａへ変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕへ変化し、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａへ変化していることを除き、ＷＯ９３／１０１５１に示される天然のＦｃ配列と同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体のための親和性の減少を示す。

【0111】

他の実施形態において、抗アクチビンＡ抗体の重鎖および／または軽鎖の様々な部分は、抗体重鎖および／または軽鎖の様々な部分のために置換されてもよい。

【0112】

代替として、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を備えるまたは備えない、複数の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質である。適したペプチドリンカーには、米国特許番号第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。

【0113】

オリゴマー抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、ロイシンジッパーの中に見つかるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、本来いくつかのＤＮＡ結合タンパク質内に確認されており（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、以来様々な異なるタンパク質内で見つかっている。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する自然発生的なペプチドおよびこれらの誘導体がある。溶解性オリゴマータンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載され、肺表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載され、参照によって本明細書に組み込まれる。改変されたロイシンジッパーへ融合する相同タンパク質の適した三量化を可能にする改変されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載される。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドと融合した抗アクチビンＡ抗体断片または誘導体を含む組み換え融合タンパク質は、適した宿主細胞内、および組み換え形態が培養上清から回収される溶解オリゴマー抗アクチビンＡ抗体断片または誘導体で発現する。

【0114】

一実施形態において、本発明は、アクチビンＡ受容体へのアクチビンＡの結合を妨げる抗原結合タンパク質を提供する。そのような抗原結合タンパク質は、アクチビンＡ、または断片、変異形またはこれらの誘導体に対して製造され、アクチビンＡ受容体へのアクチビンＡの結合を妨げる能力に関する従来のアッセイで検査されることが可能である。適したアッセイの例は、抗原結合タンパク質の、アクチビンＡ受容体を発現する細胞に対し、アクチビンの結合を阻害する能力について試験する、または抗原結合タンパク質の、細胞表面アクチビンＡ受容体へのアクチビンＡの結合の結果による生物学的反応、または細胞応答を減少する能力について試験するアッセイである。例えば、図１０、および以下の実施例に説明するように、抗体は、固定化した抗体表面（アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ）と結合するその能力に従い、検査されることが可能である。

【0115】

本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合断片は、従来の技術により生成されてもよい。そのような断片の例は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片を含むが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって生成された抗体断片および誘導体も、想定される。

【0116】

追加の実施形態は、キメラ抗体、例えば、非ヒト（例えば、ネズミ科）モノクローナル抗体のヒト化型を含む。そのようなヒト化抗体は、既知の技術によって調製されてもよく、抗体がヒトに投与される際に、免疫原性の減少という利点を発揮する。一実施形態においては、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ科抗体の様々なドメイン（またはこれらの抗原結合部位のすべて、または一部）およびヒト抗体由来の定常ドメインを含む。代替として、ヒト化抗体断片は、ネズミ科モノクローナル抗体の抗原結合部位、およびヒト抗体由来の様々なドメイン断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。キメラおよびさらに工学的なモノクローナル抗体の生成のための手順は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９，Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，およびＷｉｎｔｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９３，ＴＩＰＳ １４：１３９に記載されるものを含む。一実施形態においては、キメラ抗体はＣＤＲ移植抗体である。ヒト化抗体の技術は、例えば、米国特許番号第５，８６９，６１９号、第５，２２５，５３９号、第５，８２１，３３７号、第５，８５９，２０５号、第６，８８１，５５７号、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−３９、およびＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１４３２−４１に説明される。

【0117】

非ヒト動物において、ヒトまたは部分的ヒト抗体の産出のために手順を開発してきた。例えば、１つ以上の内在性免疫グロブリン遺伝子が様々な手段によって不活性化されたネズミを用意した。ヒトの免疫グロブリン遺伝子を、不活性化されたネズミの遺伝子と交換するためにネズミに導入した。動物内で生成された抗体は、動物に導入されたヒトの遺伝物質によってコードされたヒトの免疫グロブリンポリペプチド鎖と合体する。一実施形態においては、アクチビンＡポリペプチドに対する抗体が動物内で産出されるように、遺伝子導入マウス等の非ヒト動物に、アクチビンＡポリペプチドで免疫力を与える。

【0118】

適した免疫原の一例は、配列番号：２２５のタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチド、または配列番号：２２５のタンパク質の他の免疫原断片等の、溶解性ヒトアクチビンＡを含む。生成のための技術の例、およびヒトまたは部分的ヒト抗体の生成のための遺伝子導入動物の使用は、米国特許番号第５，８１４，３１８号、第５，５６９，８２５号、および第５，５４５，８０６号、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｎ Ｌｏ，ｅｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ：１９１−２００，Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−９７，Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６８：１８２０−２６，Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４−４０，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１８：４２１−２５，Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１：１１−２３，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：３３−４２，Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ．７：６０７−１４，Ｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４２：４１３−２１，Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９４，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．４：７６１−６３，Ａｒｂｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１：２４７−６０，Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ．３６２：２５５−５８，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ．９０：２５５１−５５．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｍ．Ｔｒｏｕｎｓｔｉｎｅ，Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｋｕｒａｈａｒａ，Ｊ．Ｌｏｒｉｎｇ，Ｄ．Ｈｕｓｚａｒ．Ｉｎｔｅｒ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１９９３）：６４７−６５６，Ｃｈｏｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−２３，Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：８４５−５１，Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−５９，Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１，Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３：６５−９３，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６，Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−９５，Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒ’ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５７９−９１，Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：１３３−４３，Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２−２７，Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−２４，およびＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２０に記載される。

【0119】

別の実施形態において、本発明は、アクチビンＡと結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、例えば、免疫化スケジュールの完了後に遺伝子導入動物から採取された脾臓細胞を不死化すること等による、当分野に既知のあらゆる技術を使用して生成されてもよい。脾臓細胞は、例えば、ハイブリドーマを生成するために脾臓細胞を骨髄腫と融合すること等による、当分野に既知のあらゆる技術を使用して不死化されることが可能である。ハイブリドーマ生成融合手順に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体生成であり、高い融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地で成長不可能にする酵素欠損を有する。マウス融合に使用するための適した細胞株の例は、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌを含み、ラット融合に使用された細胞株の例は、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を含む。細胞融合の使用に有用な他の細胞株はＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。

【0120】

一実施形態においては、ハイブリドーマ細胞株は、アクチビンＡ免疫原で動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する遺伝子導入動物）に免疫力を与えることと、該免疫動物から脾臓細胞を採取することと、採取された脾臓細胞を、骨髄腫細胞株と融合し、これによりハイブリドーマ細胞を産出することと、該ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、アクチビンＡポリペプチドを結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定することによって、生成される。そのようなハイブリドーマ細胞株、およびこれらによって生成された抗アクチビンＡモノクローナル抗体は本発明によって包含される。

【0121】

ハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体は、当技術分野で既知のいかなる技術も使用して、精製され得る。ハイブリドーマまたはｍＡｂは、アクチビンＡ誘発活性を阻止する能力等の、特定の特性を有するｍＡｂを識別するために、さらにスクリーニングされ得る。そのようなスクリーニングの例は、以下の実施例に提供される。

【0122】

増加した親和性を有する抗体、例えば、Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１により記載されるような、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する増加した親和性を有する抗体を単離するために、抗体結合部位の中央における、相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化もまた、使用されてきた。したがって、そのような技術は、アクチビンＡに対する抗体の調製に有用である。

【0123】

アクチビンＡに対する抗原結合タンパク質は、例えば、生体外または生体内のいずれかで、アクチビンＡポリペプチドの存在を検出するためのアッセイに使用され得る。また、抗原結合タンパク質は、免疫親和性クロマトグラフィーによる、アクチビンＡタンパク質の精製に用いられ得る。アクチビンＡの結合をさらに阻止できる抗原結合タンパク質は、そのような結合に起因する生物活性を阻害するために使用され得る。阻止抗原結合タンパク質は、本発明の方法で使用され得る。アクチビンＡアンタゴニストとして機能する抗原結合タンパク質は、悪液質を含むがこれに限定されない、いかなるアクチビンＡ関連病態の治療にも用いられ得る。一実施形態においては、トランスジェニックマウスの免疫を伴う手順により生成される、ヒト抗アクチビンＡモノクローナル抗体は、そのような病態の治療に用いられる。

【0124】

ヒト、部分的ヒト、またはヒト化抗体は、多くの用途、特にヒト対象への抗体の投与を伴う用途に好適であるが、他の種類の抗原結合タンパク質は、特定の用途に好適である。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長動物（サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、または類人猿（例えば、チンパンジー））等の、いかなる抗体産生動物に由来し得る。本発明の非ヒト抗体は、例えば、生体外および細胞培養に基づく用途、または本発明の抗体への免疫反応が発生しない、わずかである、防止され得る、懸念事項ではない、または所望に応じた、他のいかなる用途にも使用され得る。一実施形態においては、本発明の非ヒト抗体は、非ヒト対象に投与される。他の実施形態では、非ヒト抗体は、非ヒト対象における免疫反応を引き出さない。他の実施形態では、非ヒト抗体は、非ヒト対象と同一の種からであり、例えば、本発明のマウス抗体は、マウスに投与される。特定の種からの抗体は、例えば、その種の動物を望ましい免疫原で免疫させるか（例えば、可溶性アクチビンＡポリペプチド）、もしくはその種の抗体を生成するための人工システム（例えば、特定の種の抗体を生成するための細菌もしくはファージディスプレイベースシステム）を使用することにより、または例えば、抗体の定常領域を他の種からの定常領域と置き換えることにより、もしくは他の種からの抗体の配列により類似するように、抗体の１つ以上のアミノ酸残基を置き換えることにより、１つの種からの抗体を他の種に変換することにより、作製され得る。一実施形態においては、抗体は、２つ以上の異なる種からの抗体に由来するアミノ酸配列を含む、キメラ抗体である。

【0125】

抗原結合タンパク質は、多数の従来の技術のいずれかにより調製され得る。例えば、それらは、それらを自然に発現する細胞から精製され得る（例えば、抗体は、それを生成するハイブリドーマから精製され得る）か、または当技術分野で既知のいかなる技術を使用して、組み換え発現システムにおいて生成され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）を参照。

【0126】

当技術分野で既知のいかなる発現システムも、本発明の組み換えポリペプチドを作製するために使用され得る。概して、宿主細胞は、望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターで、形質転換される。用いられ得る宿主細胞としては、原核生物、イースト、または高等真核細胞が挙げられる。原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または桿菌を含む。高等真核細胞は、昆虫細胞、および哺乳動物起源の樹立細胞株を含む。好適な哺乳類宿主細胞株の例は、サル腎細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ
２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１により記載されるような、アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶＩに由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）を含む。細菌、真菌、イースト、および哺乳類細胞宿主での使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）により記載される。

【0127】

形質転換細胞は、ポリペプチド、および従来のタンパク質精製手順により回収されるポリペプチドの発現を促進する条件下で、培養され得る。１つのそのような精製手順は、例えば、それに結合されるアクチビンＡのすべてまたは一部を有するマトリックス（例えば、細胞外ドメイン）の親和性クロマトグラフィーの使用を含む。本明細書での使用が検討されるポリペプチドは、内因性汚染物質を実質的に含まない、実質的に均一の組み換え哺乳類抗アクチビンＡ抗体ポリペプチドを含む。

【0128】

抗原結合タンパク質は、多数の既知の技術のいずれかにより、調製、および望ましい特性に関してスクリーニングされ得る。技術のいくつかは、対象となる抗原結合タンパク質（例えば、抗アクチビンＡ抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部）をコードする核酸を単離するステップ、および組み換えＤＮＡ技術により、核酸を操作するステップを伴う。核酸は、対象となる他の核酸と融合し得るか、または例えば、１つ以上のアミノ酸残基を添加、除去、または置換するために変化し得る（例えば、突然変異生成または他の従来の技術により）。

【0129】

一実施形態においては、本発明は、本発明の抗アクチビンＡ抗体の抗原結合性断片を提供する。そのような断片は、すべて抗体由来の配列から成り得るか、または追加の配列を含み得る。抗原結合性断片の例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖抗体、二重抗体、三重抗体、四重抗体、およびドメイン抗体を含む。他の例は、Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００−０６に提供される。

【0130】

１本鎖抗体は、アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を介して、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結することにより形成され得て、単一ポリペプチド鎖をもたらす。そのような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することにより、調製されている。得られるポリペプチドは、抗原結合単量体を形成するためにそれ自体に折り重なり得るか、またはそれらは、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成し得る（Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔ ｅｔ
ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５―１０８）。異なるＶ_ＬおよびＶ_Ｈを含むポリペプチドを組み合わせることにより、異なるエピトープと結合する多量体のｓｃＦｖを形成し得る（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１―４０）。１本鎖抗体の生成のために開発された技術は、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４，ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １７８：３７９―８７に記載される技術を含む。本明細書に提供される抗体に由来する１本鎖抗体は、本発明により包含される、可変ドメインの組み合わせ、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、およびＬ１４Ｈ１４を含むｓｃＦｖを含むがこれらに限定されない。

【0131】

本発明の抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、および抗体誘導体）は、当技術分野で既知のいかなる定常領域も含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域であり得る。一実施形態においては、軽鎖または重鎖定常領域は、自然発生の定常領域の断片、誘導体、変異形、または突然変異タンパク質である。

【0132】

対象となる抗体から、異なるサブクラスまたはイソタイプの抗体を抽出するための技術、すなわち、サブクラススイッチが既知である。したがって、ＩｇＧ抗体は、例えばＩｇＭ抗体に由来し得て、逆もまた同様である。そのような技術は、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を保有する新しい抗体の調製を可能にするが、親抗体とは異なる抗体イソタイプまたはサブクラスに関連する、生物学的特性も示す。組み換えＤＮＡ技術が用いられ得る。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ、例えば、望ましいイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡが、そのような手順に用いられ得る。Ｌａｎｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３―１６も参照。

【0133】

一実施形態においては、本発明の抗原結合タンパク質は、Ａ１―Ａ１４のいずれかのＩｇＧ１重鎖ドメイン（Ｈ１―Ｈ１４）、またはＡ１―Ａ１４のいずれかのＩｇＧ１重鎖ドメインの断片（Ｈ１―Ｈ１４）を含む。他の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、Ａ１―Ａ１４のカッパ軽鎖定常鎖領域（Ｌ１―Ｌ１４）、またはＡ１―Ａ１４のカッパ軽鎖定常領域の断片（Ｌ１―Ｌ１４）を含む。他の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、Ａ１―Ａ１４のＩｇＧ１重鎖ドメインもしくはその断片（Ｌ１―Ｌ１４）、およびＡ１―Ａ１４のカッパ軽鎖ドメインもしくはその断片（Ｌ１―Ｌ１４）の両方を含む。

【0134】

したがって、本発明の抗原結合タンパク質は、望ましいイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）を有する、可変ドメインの組み合わせ、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、およびＬ１４Ｈ１４、ならびにそのＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）_２断片を含む、抗原結合タンパク質を含む。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合は、ＩｇＧ４抗体において不均質をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するために、Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ヒンジ領域に点変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入することも望ましい場合がある。

【0135】

一実施形態においては、抗原結合タンパク質は、１ｘ１０^−４ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆを有する。他の実施形態では、Ｋ_ｏｆｆは、５ｘ１０^−５ｓ^−１以下である。他の実施形態では、Ｋ_ｏｆｆは、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、およびＬ１４Ｈ１４から成る組み合わせの群から選択される、軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを有する抗体と実質的に同一である。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、およびＬ１４Ｈ１４から成る組み合わせの群から選択される、軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを有する抗体からの、１つ以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同一のＫ_ｏｆｆで、アクチビンＡと結合する。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明されるアミノ酸配列のうちの１つを含む抗体と実質的に同一のＫ_ｏｆｆで、アクチビンＡと結合する。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、上に説明されるアミノ酸配列のうちの１つを含む抗体からの、１つ以上のＣＤＲを含む抗体と実質的に同一のＫ_ｏｆｆで、アクチビンＡと結合する。

【0136】

本明細書に使用されるように、ヒトアクチビンＡという用語は、配列番号：１のタンパク質、およびその対立遺伝子変異形を含むよう意図される。アクチビンＡは、塩勾配を使用するＨｅｐａｒｉｎ ＨＰカラムを使用して、宿主細胞培養液の濾過された上清の溶出により、アクチビンＡをコードする遺伝子により形質移入されている、宿主細胞から精製され得る。

【0137】

「抗体」という用語は、無傷抗体またはその結合性断片を意味する。抗体は、完全抗体分子（全長重鎖および／または軽鎖を有する、多クローン、単クローン、キメラ、ヒト化、またはヒト型を含む）を含み得るか、またはその抗原結合断片を含み得る。抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、およびＦｄ断片を含み、単一ドメイン抗体、１本鎖抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、二重抗体、三重抗体、四重抗体、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３，９，１１２６―１１３６を参照）。また、フィブロネクチンポリペプチドモノボディを含む、抗体ポリペプチドが、米国特許第６，７０３，１９９号に開示される。他の抗体ポリペプチドは、米国特許公開第２００５／０２３８６４６号に開示され、それは、一本鎖ポリペプチドである。

【0138】

抗体に由来する抗原結合断片は、例えば、抗体のタンパク質加水分解、例えば、従来の方法に従った抗体全体のペプシンまたはパパイン消化により得られ得る。一例として、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）_２と呼ばれる５Ｓ断片を提供するために、ペプシンによる抗体の酵素的切断により生成され得る。この断片は、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生成するために、チオール還元剤を使用してさらに切断され得る。任意に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断によりもたらされるスルフヒドリル基のための保護基を使用して、実行され得る。代替方法として、パパインを使用する酵素的切断は、２つの一価Ｆａｂ断片、および１つのＦｃ断片を直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，米国特許第４，３３１，６４７号，Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）；およびＡｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００３），ｐａｇｅｓ２．８．１―２．８．１０ ａｎｄ ２．１０Ａ．１―２．１０Ａ．５により記載される。一価軽−重鎖断片（Ｆｄ）を形成するために重鎖を分離する等の、抗体を切断するための他の方法、断片のさらなる切断、または他の酵素的、科学的、もしくは遺伝子的技術もまた、断片が、無傷抗体により認識される抗原と結合する限り、使用され得る。

【0139】

また、抗体断片は、いかなる合成または遺伝子組み換えタンパク質でもあり得る。例えば、抗体断片は、軽鎖可変領域から成る単離した断片、重鎖および軽鎖の可変領域から成る「Ｆｖ」断片、軽および重可変領域が、ペプチドリンカーにより接続される、組み換え１本鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）を含む。

【0140】

他の型の抗体断片は、抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲ（「最小認識単位」または「超可変領域」とも呼ばれる）は、対象となるＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することにより得られ得る。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、鋳型として抗体生成細胞のｍＲＮＡを使用して、可変領域を合成するために、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６，１９９１；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５））を参照。

【0141】

したがって、一実施形態においては、結合剤は、本明細書に記載されるような、少なくとも１つのＣＤＲを含む。結合剤は、本明細書に記載されるような、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲを含み得る。結合剤は、本明細書に記載される抗体の、少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含み得る。可変領域ドメインは、いかなるサイズ、またはアミノ酸組成物であり得て、例えば、本明細書に具体的に記載されるＣＤＲ―Ｈ１、ＣＤＲ―Ｈ２、ＣＤＲ―Ｈ３および／または軽鎖ＣＤＲ等の、１つ以上のフレームワーク配列に隣接する、もしくは該配列とフレーム状態にある、ヒトアクチビンＡとの結合に関与する少なくとも１つのＣＤＲ配列を概して含む。一般用語において、可変（Ｖ）領域ドメインは、免疫グロブリン重（Ｖ_Ｈ）鎖および／または軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変ドメインのいかなる好適な配列であり得る。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは、単量体であり、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインであり得て、以下に記載されるような、少なくとも１ｘ１０^―７Ｍ以下に等しい親和性で、ヒトアクチビンＡと独立して結合することが可能である。代替として、Ｖ領域ドメインは、二量体であり、Ｖ_Ｈ―Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ―Ｖ_Ｌ、またはＶ_Ｌ―Ｖ_Ｌの二量体を含み得る。Ｖ領域二量体は、非共有結合的に関連し得る、少なくとも１つのＶＨおよび少なくとも１つのＶＬ鎖を含む（以下、Ｆ_Ｖという）。所望に応じて、鎖は、直接、例えば２つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介して、あるいは１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦ_Ｖ）を形成するために、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを通じて、共有結合的に連結され得る。

【0142】

可変領域ドメインは、いかなる自然発生の可変ドメイン、またはその改変型であり得る。改変型とは、組み換えＤＮＡ工学技術を使用して生成された、可変領域ドメインを意味する。そのような改変型は、例えば、特異的抗体のアミノ酸配列における、または該配列に対する挿入、欠失、または変化により、特異的抗体可変領域から生成される改変型を含む。特定の例は、第１の抗体からの少なくとも１つのＣＤＲおよび任意に１つ以上のフレームワークアミノ酸を含む、改変可変領域ドメイン、ならびに第２の抗体からの残りの可変領域ドメインを含む。

【0143】

可変領域ドメインは、少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはその断片に、Ｃ末端アミノ酸において共有結合的に付着し得る。したがって、例えば、可変領域ドメイン内に存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはその断片と連結され得る。同様に、Ｖ_Ｌドメインは、Ｃ_Ｋドメインまたはその断片と連結され得る。このように、例えば、抗体は、Ｆａｂ断片であり得て、抗原結合ドメインは、それぞれＣＨ１およびＣ_Ｋドメインに、それらのＣ末端において共有結合的に連結される、関連したＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、例えば、Ｆａｂ’断片に見られるような、ヒンジ領域もしくはヒンジ領域ドメインの一部を提供するために、または抗体ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン等のさらなるドメインを提供するために、さらなるアミノ酸で拡張され得る。

【0144】

本明細書に記載されるように、抗体は、これらのＣＤＲの少なくとも１つを含む。例えば、１つ以上のＣＤＲは、既知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）に組み込まれ得るか、またはその半減期を増進するために、好適なビヒクルに接合され得る。好適なビヒクルは、Ｆｃ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、トランスフェリン等を含むがこれらに限定されない。これらのビヒクルおよび他の好適な賦形剤は、当技術分野で既知である。そのような接合ＣＤＲペプチドは、単量体、二量体、四量体、または他の型であり得る。一実施形態においては、１つ以上の水溶性ポリマーは、結合剤の１つ以上の特異的位置、例えば、アミノ末端において結合される。

【0145】

特定の好ましい実施形態においては、抗体は、ポリエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない、１つ以上の水溶性ポリマー付着を含む。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、および第４，１７９，３３７号を参照。ある実施形態においては、誘導体の結合剤は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、もしくは他の炭水化物を基材としたポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコールのうちの１つ以上、ならびにそのようなポリマーの混合物を含む。ある実施形態においては、１つ以上の水溶性ポリマーは、１つ以上の側鎖に無作為に付着する。ある実施形態においては、ＰＥＧは、抗体等の結合剤の治療能力を改善する役割を果たす。特定のそのような方法は、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号で考察され、いかなる目的で参照することにより、本明細書により組み込まれる。

【0146】

本発明の抗体は、抗体が結合特異性を保持するという条件で、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得ることは、十分理解されるであろう。したがって、抗体構造の修飾は、本発明の範囲内に包含される。これらは、抗体のアクチビンＡ結合能力を破壊しない、保存または非保存であり得るアミノ酸置換を含み得る。保存アミノ酸置換は、非自然発生のアミノ酸残基を包含し得て、典型的に、生物系における合成によるよりも、化学的ペプチド合成により組み込まれる。これらは、ペプチド模倣薬、および逆または反転型のアミノ酸部分を含む。また、保存アミノ酸置換は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷への影響がほとんど、または全くないように、標準残基による天然アミノ酸残基の置換を伴い得る。

【0147】

非保存置換は、異なる物理的特性を有する他のクラスからのメンバーとの、アミノ酸またはアミノ酸模倣剤の１クラスのメンバーの交換を伴い得る（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）。そのような置換残基は、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域、または分子の非相同領域に導入され得る。

【0148】

さらに、当業者は、それぞれの望ましいアミノ酸残基において、単一アミノ酸置換を含む、試験変異形を生成し得る。次いで、変異形は、当業者に既知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。そのような変異形は、好適な変異形に関する情報を収集するために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された活性、所望せずに減少した活性、または不適切な活性を生じたことが発見された場合、そのような変化を有する変異形は、回避され得る。つまり、そのような慣用的な実験から収集される情報に基づき、当業者は、アミノ酸を容易に確定し得て、さらなる置換は、単独で、あるいは他の変異と組み合わせて、回避されるべきである。

【0149】

当業者は、周知の技術を使用して、本明細書に記載れるような、ポリペプチドの好適な変異形を確定することができる。ある実施形態においては、当業者は、活性に重要ではないと考えられる領域を標的にすることにより、活性を破壊することなく変化し得る分子の好適な範囲を識別し得る。ある実施形態においては、同様のポリペプチドのうちで、保存されている分子の残基および部分を識別し得る。ある実施形態においては、生物活性または構造に重要であり得る範囲でさえ、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存アミノ酸置換の対象となり得る。

【0150】

さらに、当業者は、活性または構造に重要である同様のポリペプチドにおける残基を識別する、構造機能研究を検討し得る。そのような比較を考慮して、同様のタンパク質における活性または構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に同様のアミノ酸置換を選択し得る。

【0151】

また、当業者は、同様のポリペプチドにおけるその構造との関連で、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。そのような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基の配置を予測し得る。ある実施形態においては、当業者は、そのような残基が、他の分子との重要な相互作用に関与し得るため、タンパク質の表面にあると予測されるアミノ酸残基に、根本的な変化を加えないことを選択し得る。

【0152】

多数の科学出版物が、二次構造の予測を記述してきた。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２―４２７（１９９６），Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３（２）：２２２―２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３（２）：２１１―２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５―１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１―２７６、およびＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７―３８４（１９７９）を参照。さらに、二次構造の予測を補助するために、コンピュータープログラムが、現在利用可能である。二次構造を予測する一方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きい配列同一性、または４０％より大きい類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、同様の構造トポロジーを有する場合が多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチドまたはタンパク質の構造における、見込まれる数の折り畳みを含む、改善された二次構造の予測可能性を提供している。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４―２４７（１９９９）を参照。所与のポリペプチドまたはタンパク質において、制限された数の折り畳みが存在すること、および、一度臨界数の構造が分解されると、構造的予測は劇的により正確になることが、示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９―３７６（１９９７））。

【0153】

二次構造を予測するさらなる方法は、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７―８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル解析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６―１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５―４３５８（１９８７））、および「進化的連鎖」（Ｈｏｌｍ（上記を参照）（１９９９）およびＢｒｅｎｎｅｒ（上記を参照）（１９９７）を参照）を含む。

【0154】

ある実施形態においては、抗体の変異形は、グリコシル化変異形を含み、グリコシル化部位の数および／または種類は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変化している。ある実施形態においては、変異形は、天然タンパク質よりも多い、または少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、Ｘとして表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のいかなるアミノ酸残基でもあり得る。この配列を生成するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖の添加のための潜在的に新たな部位を提供する。代替として、この配列を除外する置換は、現存のＮ結合型炭水化物鎖を除去する。また、Ｎ結合型炭水化物鎖の再配列が提供され、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的に、自然に発生する部位）は除外され、１つ以上の新たなＮ結合型部位が生成される。さらなる好ましい抗体変異形は、システイン変異形を含み、１つ以上のシステイン残基は、親アミノ酸配列と比較して、他のアミノ酸（例えば、セリン）から除去されるか、または他のアミノ酸に置換される。システイン変異形は、不溶性封入体の単離後等に、抗体が生物学的に活性な立体構造にリフォールディングされなければならない場合、有用であり得る。システイン変異形は、概して、天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、一般的に、不対システインによる相互作用を最小限に抑えるために、偶数を有する。

【0155】

望ましいアミノ酸置換（保存、非保存にかかわらず）は、そのような置換が望ましい時点で、当業者により確定され得る。ある実施形態においては、アミノ酸置換は、アクチビンＡに対する抗体の重要な残基を識別するために、または本明細書に記載されるアクチビンＡに対する抗体の親和性を増加もしくは減少させるために、使用され得る。

【0156】

特定の実施形態に従い、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解への感受性を減少させる、（２）酸化への感受性を減少させる、（３）タンパク質複合体を形成するために、結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および／または（４）そのようなポリペプチドに他の物理化学的または機能的特性を付与または修飾する、アミノ酸置換である。特定の実施形態に従い、単一または複数のアミノ酸置換（ある実施形態においては、保存アミノ酸置換）は、自然発生的な配列において行われ得る（ある実施形態においては、分子間接触を形成するドメインの外側にある、ポリペプチドの部分において）。ある実施形態においては、保存アミノ酸置換は、一般的に、親配列の構造特性を実質的に変化させ得ない（例えば、置換アミノ酸は、親配列において発生するヘリックスを破壊するか、または親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を崩壊させる傾向を有するべきではない）。当技術分野において承認されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３５４：１０５（１９９１）に記載され、それぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0157】

ある実施形態においては、本発明の抗体は、ポリマー、脂質、または他の部分と化学的に結合され得る。

【0158】

結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれる、本明細書に記載されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。一実施例においては、生体適合性フレームワーク構造は、立体構造的に安定した構造支持体、またはフレームワーク、または骨格を形成するために十分である、ポリペプチドまたはその一部を含み、局所的な表面領域において抗原と結合するアミノ酸の１つ以上の配列（例えば、ＣＤＲ、可変領域等）を表示することが可能である。そのような構造は、自然発生のポリペプチドもしくはポリペプチドの「折り畳み」（構造モチーフ）であり得るか、または自然発生のポリペプチドもしくは折り畳みに対して、アミノ酸の添加、欠失、もしくは置換等の１つ以上の修飾を有し得る。これらの骨格は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌、またはウイルス等のいかなる種（または２つ以上の種）のポリペプチドに由来し得る。

【0159】

一般的に、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質骨格または骨組に基づく。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイン、およびテンダミスタットドメインに基づくものが使用され得る（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７，４６３―４６９を参照）。

【0160】

本発明の抗体が、本明細書に記載されるヒト化抗体を含むことは、十分理解されるであろう。本明細書に記載されるようなヒト化抗体は、当業者には既知の技術を使用して、生成され得る（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．４２（１２）：１４４５―１４５１，２００５；Ｈｗａｎｇ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６（１）：３５−４２，２００５；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：４３―６０，２００５；およびＣｌａｒｋ，Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ．２１（８）：３９７―４０２，２０００）。

【0161】

さらに、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に開示されるような、ＣＤＲ―Ｈ１、ＣＤＲ―Ｈ２、ＣＤＲ―Ｈ３、ＣＤＲ―Ｌ１、ＣＤＲ―Ｌ２、およびＣＤＲ―Ｌ３のうちの１つ以上等の、これらの抗体の一部を含むことを認識するであろう。ＣＤＲ―Ｈ１、ＣＤＲ―Ｈ２、ＣＤＲ―Ｈ３、ＣＤＲ―Ｌ１、ＣＤＲ―Ｌ２、およびＣＤＲ―Ｌ３の領域の少なくとも１つは、抗体が、非置換ＣＤＲの結合特異性を保持することを条件として、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であり得て、結合剤は、アクチビンＡとの本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、および／またはアクチビンＡを中和させる。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク質分子であり得て、抗体は、抗体Ａ１―Ａ１４のうちの少なくとも１つにより示されるパターンと、競合結合アッセイにおいてヒトアクチビンＡペプチドに対する同様の結合パターンを示し、および／またはアクチビンＡを中和させる。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から成り得て、抗体は、組み換え結合タンパク質または合成ペプチドであり、組み換え結合タンパク質は、アクチビンＡとの本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、および／またはアクチビンＡを中和させる。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から成り得て、抗体は、組み換え抗体であり、組み換え抗体は、抗体Ａ１―Ａ１４のうちの少なくとも１つにより示されるパターンと、ヒトアクチビンＡペプチドエピトープ競合結合アッセイ（後述される）においてヒトアクチビンＡペプチドに対する同様の結合パターンを示し、および／またはアクチビンＡを中和させる。

【0162】

抗体が、上に記載されるような、ＣＤＲ―Ｈ１、ＣＤＲ―Ｈ２、ＣＤＲ―Ｈ３、ＣＤＲ―Ｌ１、ＣＤＲ―Ｌ２、およびＣＤＲ―Ｌ３のうちの１つ以上を含む場合、それは、これらの配列に対するＤＮＡコードを含む、宿主細胞からの発現により得られ得る。各ＣＤＲ配列に対するＤＮＡコードは、ＣＤＲのアミノ酸配列に基づき確定され得て、必要に応じて、オリゴヌクレオチド合成技術、部位特異的突然変異生成、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、いかなる望ましい抗体可変領域フレームワークおよび定常領域ＤＮＡ配列とともに合成され得る。可変領域フレームワークおよび定常領域に対するＤＮＡコードは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）等の遺伝子配列データベースから、当業者に広く利用可能である。

【0163】

一度合成されると、本発明の抗体またはその断片をコードするＤＮＡは、任意の数の既知の発現ベクターを使用した、核の切除、形質転換、および形質移入のための様々な周知の手順のいずれかに従い、増殖および発現され得る。したがって、ある実施形態においては、抗体断片の発現は、大腸菌等の原核宿主において好ましくあり得る（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７―５１５を参照）。特定の他の実施形態においては、抗体またはその断片の発現は、イーストを含む真核宿主細胞（例えば、サッカロマイセスセレヴィシエ、シゾサッカロミセスポンベ、およびピキアパストリス）、動物細胞（哺乳類動物の細胞を含む）または植物細胞において、好ましい場合がある。好適な動物細胞の例は、骨髄腫（マウスＮＳＯ株等）、ＣＯＳ、ＣＨＯ、またはハイブリドーマ細胞を含むがこれらに限定されない。植物細胞の例は、タバコ、トウモロコシ、大豆、および米細胞を含む。

【0164】

抗体可変および／または定常領域をコードするＤＮＡを含む、１つ以上の複製可能な発現ベクターは、適切な細胞株、例えば、マウスＮＳＯ株等の非産生骨髄腫細胞株、または大腸菌等の細菌を形質転換するために、調製および使用され得て、そこで抗体の生成が発生する。効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクターにおけるＤＮＡ配列は、適切な調節配列、特に、可変ドメイン配列に動作可能に連結されるプロモータおよびリーダー配列を含むべきである。このようにして抗体を生成するための特定の方法は、一般的に周知であり、慣用的に使用される。例えば、基本的な分子生物学的手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００１）も参照）により記載される。ＤＮＡシークエンシングは、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ＰＮＡＳ ７４：５４６３，（１９７７））およびｔｈｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されるように実行され得て、部位特異的突然変異生成は、当技術分野で既知の方法に従い実行され得る（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１，（１９８４）；Ｋｕｎｋｅｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８―９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７―８２（１９８７）；ｔｈｅ Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．ｈａｎｄｂｏｏｋ）。さらに、多数の出版物が、ＤＮＡの操作、発現ベクターの生成、ならびに適切な細胞の形質転換および培養による抗体の調製に好適な技術を記載する（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａ ａｎｄ Ａｄａｉｒ，Ｊ Ｒ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ（ｅｄ．Ｔｏｍｂｓ，Ｍ Ｐ，１０，Ｃｈａｐｔｅｒ １，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

【0165】

所望により、上記のＣＤＲの１つ以上を含む、本発明に従った抗体の親和性の改善は、ＣＤＲの維持（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２―４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９―７８３，１９９２）、大腸菌の変異系統の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５０−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４―７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７―８８，１９９６）、およびセクシュアルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８―２９１，１９９８）を含む、多数の親和性成熟プロトコルにより、得られ得る。親和性成熟のこれらの方法のすべては、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６，５３５―５３９，１９９８）により考察される。

【0166】

本発明に従った他の抗体は、本明細書に記載され、当技術分野で既知の、従来の免疫および細胞融合手順により得られ得る。本発明のモノクローナル抗体は、様々な既知の技術を使用して生成され得る。概して、特異的抗原と結合するモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法により得られ得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）；米国特許第ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号、および第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ， ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｐｉｃｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，”ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ ９３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照）。抗体断片は、タンパク質消化等の好適な標準的技術を使用して、または任意に、タンパク質消化（例えば、パパインまたはペプシンを使用して）、続いて、ジスルフィド結合の軽度減少およびアルキル化により、そこから得られ得る。また、代替として、そのような断片は、本明細書に記載されるような、組み換え遺伝子工学技術により生成され得る。

【0167】

モノクローナル抗体は、例えば、当技術分野で既知のようなトランスジェニックまたはノックアウト動物を含む動物、例えば、ラット、ハムスター、ウサギ、または好ましくはマウスに、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載される方法に従い、配列番号：２２５のヒトアクチビンＡを含む免疫原、またはその断片を注射することにより得られ得る。特異的抗体生成の存在は、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載される、いくつかの免疫検出法のいずれか１つを使用して、血清サンプルを得て、ヒトアクチビンＡと結合する抗体またはペプチドの存在を検出することにより、最初の注射後および／またはブースター注射後に、モニタリングされ得る。望ましい抗体を生成する動物から、通常、脾臓もしくはリンパ節からの細胞である、リンパ細胞が、Ｂリンパ球を得るために採取される。次いで、Ｂリンパ球は、好ましくは、免疫動物と同系であり、任意に他の望ましい特性（例えば、内因性Ｉｇ遺伝子産物、例えば、Ｐ３Ｘ６３―Ａｇ ８．６５３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５８０）；ＮＳＯ、ＳＰ２０を発現することが不可能であること）を有する、薬物感作骨髄腫細胞融合パートナーと融合し、不死の真核細胞株であるハイブリドーマを生成しようとする。

【0168】

リンパ（例えば、脾臓）細胞および骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール等の膜融合促進剤、または非イオン洗剤と数分間混合され得て、次いで、未融合骨髄腫細胞ではなく、ハイブリドーマ細胞の成長を支持する、選択培地に低密度でめっきされる。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間で、通常、約１から２週間後、細胞のコロニーが認められる。単一コロニーは単離され、細胞により生成される抗体は、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載される様々な免疫測定法のいずれか１つを使用して、ヒトアクチビンＡとの結合活性に関して試験され得る。ハイブリドーマは、クローン化され（例えば、限界希釈クローニングまたは軟寒天プラーク単離により）、アクチビンＡに特異的な抗体を生成する陽性クローンが、選択および培養される。ハイブリドーマ培養物からのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。

【0169】

マウスモノクローナル抗体の生成のための代替方法は、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進するために、同種マウス、例えば、処置されているマウス（例えば、プリスタン感作）の腹膜腔内に、ハイブリドーマ細胞を注射することである。モノクローナル抗体は、様々な確立した技術により単離および精製され得る。そのような単離技術は、タンパク質Ａセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含む（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ２．７．１―２．７．１２ ａｎｄ ｐａｇｅｓ２．９．１―２．９．３；Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９―１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖または軽鎖イソタイプ、結合特異性等）に基づき選択される適切な配位子を使用する、親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。固体支持体上に固定化される好適な配位子の例は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、およびＴＧＦベータ結合タンパク質、またはその断片もしくは変異形を含む。

【0170】

また、本発明の抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体であり得る。アクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１―Ｓ３３および／またはアミノ酸Ｃ８１―Ｅ１１１）と特異的に結合する、単離した完全ヒト抗体が提供され、抗原結合タンパク質は、ヒト抗アクチビンＡ抗体の少なくとも１つの生体内生物活性を保有する。生物活性は、例えば、本明細書に記載される結腸癌のマウスモデル等の、結腸癌における悪液質の減弱であり得る。そのような治療に適している悪液質は、体重の低下、筋肉量の低下、および／または脂肪量の低下に関連する。悪液質は、関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデル等の、関節リウマチに関連し得る。本明細書に記載される完全ヒト抗体による治療は、関節リウマチのコラーゲン誘発動物モデルにおける、生体内の体重の低下、筋肉量の低下、および／または脂肪量の低下を回復させる。本明細書に記載される完全ヒト抗体は、ＡＡＶ−アクチビンＡ形質転換動物モデルにおける体重の低下を回復させる。アクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１―Ｓ３３および／またはアミノ酸Ｃ８１―Ｅ１１１）と特異的に結合する、本明細書に記載される完全ヒト抗体は、生体外のアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害する。アクチビンＡのシステインノット領域（アミノ酸Ｃ１１―Ｓ３３および／またはアミノ酸Ｃ８１―Ｅ１１１）と特異的に結合する、単離した完全ヒト抗体は、生体内のアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合を阻害する。

【0171】

完全ヒトモノクローナル抗体は、当業者には周知のあらゆる技術により、生成され得る。そのような方法は、ヒト末梢血液細胞（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ−細胞の生体外免疫、挿入ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する、免疫されたトランスジェニックマウスからの脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリーからの単離、または当技術分野で既知であり、かつ本明細書の本開示に基づく他の手順を含むがこれらに限定されない。例えば、完全ヒトモノクローナル抗体は、抗原投与に反応して特異的ヒト抗体を生成するために改変されている、トランスジェニックマウスから得られ得るトランスジェニックマウスから完全ヒト抗体を得るための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６，１９９４；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４；米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ
ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５―３５により記載される。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚幹細胞株に由来する系統のマウスに導入される（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５―５８（１９９７）も参照）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、酵母人工染色体上のミニ遺伝子構築物または導入遺伝子座であり得て、マウスリンパ系組織におけるＢ−細胞特異的ＤＮＡの再配列および超変異を受ける。完全ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスに免疫を与えることにより得られ得て、次いで、アクチビンＡに対して特異的なヒト抗体を生成し得る。免疫されたトランスジェニックマウスのリンパ細胞は、本明細書に記載される方法に従い、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成するために、使用され得る。また、完全ヒト抗体を含むポリクローナル血清が、免疫動物の血液から得られ得る。

【0172】

本発明のヒト抗体を生成するための他の方法は、ＥＢＶ形質転換によりヒト末梢血液細胞を不死化するステップを含む。例えば、米国特許第４，４６４，４５６号を参照。アクチビンＡと特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する、そのような不死化Ｂ−細胞株（またはリンパ芽球様細胞）は、本明細書に提供されるような免疫検出法、例えば、ＥＬＩＳＡにより識別され得て、次いで、標準的なクローニング技術により単離され得る。抗アクチビンＡ抗体を生成するリンパ芽球様細胞の安定性は、当技術分野で既知の方法に従い、マウス−ヒトハイブリッド細胞株を生成するために、マウス骨髄腫と形質転換細胞株を融合させることにより、改善され得る（例えば、Ｇｌａｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８：３７７―８９（１９８９）を参照）。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのさらに別の方法は、生体外免疫であり、ヒトアクチビンＡを有するヒト脾臓Ｂ−細胞を感作するステップ、続いて、感作Ｂ−細胞のヘテロハイブリッド融合パートナーとの融合を含む。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６―９５を参照。

【0173】

ある実施形態においては、抗ヒトアクチビンＡ抗体を生成しているＢ−細胞が選択され、軽鎖および重鎖可変領域は、当技術分野で既知であり（ＷＯ９２／０２５５１；米国特許第５，６２７，０５２号；Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７８４３−４８（１９９６））、かつ本明細書に記載される分子生物学的技術に従い、Ｂ−細胞からクローン化される。免疫動物からのＢ−細胞は、アクチビンＡと特異的に結合する抗体を生成している細胞を選択することにより、脾臓、リンパ節、または末梢血サンプルから単離され得る。また、Ｂ−細胞は、ヒトから、例えば、末梢血サンプルから単離され得る。例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞選別、生体外刺激、続いて、特異的抗体の検出等による、望ましい特異性を有する抗体を生成している単一Ｂ−細胞を検出するための方法は、当技術分野で周知である。特異的抗体生成Ｂ−細胞の選択方法は、例えば、ヒトアクチビンＡを含む軟寒天における、Ｂ−細胞の単一細胞懸濁液を調製するステップを含む。Ｂ−細胞により生成される特異的抗体の抗原との結合は、複合体の形成をもたらし、免疫沈降物として可視であり得る。望ましい抗体を生成するＢ−細胞が選択された後、特異的抗体遺伝子は、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載される方法に従い、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離および増幅することにより、クローン化され得る。

【0174】

本発明の抗体を得るためのさらなる方法は、ファージディスプレイによる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１―２８０を参照。ヒトまたはマウス免疫グロブリンの可変領域遺伝子組み合わせライブラリーは、ＴＧＦベータ結合タンパク質またはその変異形もしくは断片と特異的に結合する、Ｉｇ断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、またはその多量体）を選択するためにスクリーニングされ得る、ファージベクターにおいて生成され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５―８１；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：５７２８―３２（１９８９）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１―９（１９９０）；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６３―６６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２２７：３８１―３８８；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：４７―５２、およびそれらに挙げられる参考文献を参照。例えば、Ｉｇ可変領域断片をコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーは、ファージコートタンパク質をコードする配列とフレーム状態にある、Ｍ１３またはその変異形等の糸状バクテリオファージのゲノムに挿入され得る。融合タンパク質は、軽鎖可変領域ドメインおよび／または重鎖可変領域ドメインとの、コートタンパク質の融合であり得る。また、特定の実施形態に従い、免疫グロブリンＦａｂ断片は、ファージ粒子上にディスプレイされ得る（例えば、米国特許第５，６９８，４２６号を参照）。

【0175】

また、重鎖および軽鎖免疫グロブリンのｃＤＮＡ発現ライブラリーは、例えば、λｌｍｍｕｎｏＺａｐ（登録商標）（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（登録商標）（Ｌ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用するラムダファージにおいて、調製され得る。手短に言えば、ｍＲＮＡは、細胞集団から単離され、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクターにおいて、重鎖および軽鎖免疫グロブリンのｃＤＮＡ発現ライブラリーを作成するために使用される。これらのベクターは、Ｆａｂ断片または抗体を形成するために、個々にスクリーニングされ得るか、または共発現し得る（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（上記を参照）を参照；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，（上記を参照）も参照）。続いて、陽性プラークは、大腸菌からのモノクローナル抗体断片の高レベル発現を可能にする、非溶菌プラスミドに変換され得る。

【0176】

一実施形態においては、ハイブリドーマにおいて、対象となるモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者により合成され得るか、または市販の源から購入され得る。（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照し、それは、Ｖ_Ｈａ、ＶＨ_ｂ、Ｖ_Ｈｃ、Ｖ_Ｈｄ、Ｃ_Ｈ１、Ｖ_Ｌ、およびＣ_Ｌ領域に対するプライマーを含む、マウスおよびヒト可変領域に対するプライマーを販売する。）これらのプライマーは、重鎖または軽鎖可変領域を増幅するために使用され得て、次いで、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（登録商標）ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（登録商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にそれぞれ挿入され得る。次いで、これらのベクターは、発現のために、大腸菌、イースト、または哺乳動物系に導入され得る。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインの融合を含む、大量の１本鎖タンパク質は、これらの方法を使用して生成され得る（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３―４２６，１９８８を参照）。

【0177】

一度本発明に従った抗体を生成する細胞が、上記の免疫および他の技術のいずれかを使用して得られると、特異的抗体遺伝子は、本明細書に記載されるような標準的な手順に従い、そこからＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離および増幅することにより、クローン化され得る。そこから生成される抗体は、配列され得て、ＣＤＲは、識別され、ＣＤＲに対するＤＮＡコードは、本発明に従った他の抗体を生成するために、前述のように操作され得る。

【0178】

本発明のアクチビンＡ結合剤は、好ましくは、本明細書に記載される細胞に基づいたアッセイ、および／もしくは本明細書に記載される生体内アッセイにおいて、アクチビンＡ作用を調整し、および／または本明細書に記載されるシステインノットドメインのうちの１つ以上と結合し、および／または本出願に記載される抗体のうちの１つの結合をクロスブロックし、および／または本出願に記載される抗体のうちの１つにより、アクチビンＡを結合することからクロスブロックされる。したがって、そのような結合剤は、本明細書に記載されるアッセイを使用して識別され得る。

【0179】

ある実施形態においては、抗体は、最初に、本明細書に提供されるシステインノットドメインの１つ以上と結合する抗体を識別することにより生成され、および／または本明細書に記載される細胞に基づいた、および／もしくは本出願に記載される生体内アッセイにおいて中和し、および／または本出願に記載される抗体をクロスブロックし、および／または本出願に記載される抗体のうちの１つにより、アクチビンＡを結合することからクロスブロックされる。次いで、これらの抗体からのＣＤＲ領域は、アクチビンＡ結合剤を生成するために、適切な生体適合性フレームワークに挿入するために使用される。結合剤の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から成り得るか、または非タンパク質分子であり得る。本明細書に記載されるアッセイは、結合剤の特徴付けを可能にする。好ましくは、本発明の結合剤は、本明細書に定義されるような抗体である。

【0180】

抗体等の一部のタンパク質が、様々な翻訳後修飾を受け得ることは、当業者には理解されるであろう。これらの修飾の種類および程度は、タンパク質を発現するために使用される宿主細胞株、ならびに培養条件による場合が多い。そのような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸塩異性化、およびアスパラギン脱アミドの変化を含み得る。よく見られる修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用による、カルボキシ末端塩基性残基（リジンまたはアルギニン等）の損失である（Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９―１３４，１９９５に記載されるような）。

【0181】

核酸
一実施形態において、本発明は、単離された核酸分子を提供する。核酸は、例えば、抗原結合タンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチド、例えば、本発明の抗体の１つの鎖または両方の鎖、もしくは断片、誘導体、変異タンパク質、またはそれらの変異形、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、解析、変異または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマまたは配列決定プライマとしての使用に十分なポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸と、上記の相補的配列とを含む。核酸は、任意の長さであることができる。それらは、例えば、長さが５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００ヌクレオチド以上であることができ、および／または１つ以上の付加的配列、例えば、調節配列を含むことができ、および／またはより大きな核酸、例えば、ベクターの一部であることができる。核酸は、１本鎖または２本鎖であることができ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにそれらの人工変異形（例えば、ペプチド核酸）を含むことができる。

【0182】

抗体ポリペプチド（例えば、重もしくは軽鎖、可変ドメインのみ、または全長）をコードする核酸は、アクチビンＡで免疫されたマウスのＢ細胞から単離されてもよい。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）等の従来の手順によって単離されてもよい。

【0183】

重および軽鎖可変領域の可変領域をコードする核酸を上に示す。当業者は、遺伝暗号の縮退のために、本明細書に開示したそれぞれのポリペプチド配列が、多数の他の核酸配列によってコードされることを理解されたい。本発明は、本発明の各抗原結合タンパク質をコードするそれぞれの縮退したヌクレオチド配列を提供する。

【0184】

本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸（例えば、Ａ１−Ａ１４のいずれからのヌクレオチド配列を含む核酸）とハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズする方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照。本明細書で定義するように、適度に厳密なハイブリダイゼーション条件は、５Ｘナトリウム塩化物／ナトリウムクエン酸塩（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％ホルムアミド、６Ｘ ＳＳＣ、および５５℃のハイブリダイゼーション温度のハイブリダイゼーション緩衝液（または４２℃のハイブリダイゼーション温度で、約５０％ホルムアミドを含有するもの等の他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、ならびに０．１％ＳＤＳ、０．５Ｘ ＳＳＣ中６０℃の洗浄条件を使用する。厳密なハイブリダイゼーション条件は、４５℃の６Ｘ ＳＳＣ中でハイブリダイズし、続いて、６８℃の０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する。さらに、当業者は、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、一般的には互いにハイブリダイズされたままとなるように、ハイブリダイゼーションの厳密性を減少または増加させるために、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件および好適な条件を考案するための指針の選択に影響する基本パラメータは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；およびＣｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３−６．４）に記載され、例えば、ＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定されることができる。

【0185】

変化は、核酸への変異によって導入されることができ、それによって、コードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列において変化を引き起こす。変異は、当技術分野においては既知の任意の技術を使用して導入されることができる。一実施形態において、１つ以上の特定のアミノ酸残基は、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを使用して変化する。別の実施形態において、１つ以上のランダムに選択した残基は、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを使用して変化する。しかしながら、変異体ポリペプチドは、所望の特性（例えば、アクチビンＡと結合する）に対して発現またはスクリーニングされることができるものとする。

【0186】

変異は、コードするポリペプチドの生物活性を著しく変化させることなく、核酸に導入されることができる。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換に繋がるヌクレオチド置換をもたらすことができる。一実施形態において、Ａ１〜Ａ１４に関して本明細書で提供したヌクレオチド配列、もしくは所望の断片、変異形、またはそれらの誘導体は、２つ以上の配列が異なる残基であるＡ１〜Ａ１４に関して本明細書で示すアミノ酸残基の１つ以上の欠失または置換を含むアミノ酸配列をコードするように変異する。とりわけ、本明細書で記述するＡ１〜Ａ１４は、１４の配列、Ａ１、およびＡ１４、ならびに１２の介在アミノ酸残基を言う。別の実施形態において、突然変異誘発は、２つ以上の配列が異なる残基であるＡ１〜Ａ１４に関して本明細書で示す１つ以上のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸を挿入する。あるいは、１つ以上の変異は、コードするポリペプチドの生物活性（例えば、アクチビンＡの結合）を選択的に変化させる核酸に導入されることができる。例えば、変異は、生物活性を量的にまたは質的に変化させることができる。量的変化の例は、活性を増加させる、減少させるまたは除去することを含む。質的変化の実施形態は、抗原結合タンパク質の抗原特異性を変化させることを含む。

【0187】

別の実施形態において、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみを、例えば、プローブもしくはプライマとして使用することができる断片または本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、アクチビンＡ結合部分）をコードする断片を含むことができる。

【0188】

本発明の核酸の配列に基づくプローブは、核酸または類似核酸、例えば、本発明のポリペプチドをコードする転写物を検出するために使用することができる。プローブは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子等の標識群を含むことができる。そのようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用することができる。

【0189】

別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクター、および発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターを含むがこれらに限定されない。

【0190】

本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形で本発明の核酸を含むことができる。組み換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これは発現される核酸配列に操作可能に連結する。調節配列は、多くの種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を制御するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサ、ラウス肉腫ウイルスプロモータおよびサイトメガロウイルスプロモータ）、特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の構成的発現を制御するもの（例えば、組織特異的調節配列。参照によりそれら全体が本願明細書に組み込まれる、Ｖｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７，Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照のこと。）、および特定の治療または状態に応じて、ヌクレオチド配列の誘導性発現を制御するもの（例えば、哺乳類細胞におけるメタロチオニンプロモータならびに原核細胞および真核細胞系の両方におけるｔｅｔ−応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモータ（同上参照）を含む。当業者は、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等というかかる要因に依存し得ることを理解されたい。本発明の発現ベクターは、それによって、本明細書に記述するような核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを生成するために、宿主細胞に導入することができる。

【0191】

別の実施形態において、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、もしくは哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であることができる。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を介して、原核または真核細胞に導入されることができる。哺乳類細胞の安定な形質移入では、発現ベクターおよび使用する形質移入技術に応じて、ごくわずかな細胞が外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組み込みを同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性のための）は、概して、関心遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好適な選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート等の薬物耐性を与えるものを含む。核酸を安定に形質移入された細胞は、他の方法の中でも特に、薬物選択（例えば、他の細胞は死滅するが、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存する）によって同定することができる。

【0192】

効能
一実施形態において、本発明は、対象を治療する方法を提供する。例えば、方法は、概して、対象の健康に有益な効果があり、例えば、対象の予期される寿命を増加させる。あるいは、方法は、例えば、疾病、疾患、状態、または病気（「状態」）を治療、予防、治癒、軽減、または回復（「治療する」）することができる。本発明に従って治療される状態は、不適切な発現またはアクチビンＡの活性を特徴とする。一部のかかる状態においては、発現または活性レベルが高過ぎ、治療には、本明細書に記述するようなアクチビンＡアンタゴニストを投与することを含む。

【0193】

本発明の方法および組成物を使用して治療されることができる状態の種類の一例は、細胞増殖、例えば、悪液質を伴う癌性状態に関わる状態である。したがって、一実施形態において、本発明は、癌性状態を治療するための組成物および方法を提供する。具体的には、癌性状態は、卵巣および精巣の腫瘍を含む生殖腺癌である。（Ｆｕｊｉｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．，２８６：Ｅ９２７−Ｅ９３１，２００４；Ｒｅｉｓ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．８７：２２７７−２２８２，２００５）。アクチビンＡは、脳下垂体においてＦＳＨ生合成および分泌を刺激するその作用で知られており、ならびに生殖腺機能の調節において生理的役割を有する。アクチビンＡは、多くの種類のヒト癌と、具体的には、生殖器系の腫瘍と関連している。特に、アクチビンＡの過剰発現または調節解除は、卵巣癌（Ｍｅｎｏｎ Ｕ，ｅｔ ａｌ．，ＢＪＯＧ：Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ＆Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ；１０７（９）：１０６９−７４，２０００．Ｃｈｏｉ ＫＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１７４（１−２）：９９−１１０，２００１；Ｚｈｅｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．４４（２）：１０４−１３，２０００；Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｍｅｓｓｅｒｌｉａｎ ＧＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．７４（１）：９３−７，１９９９；Ｓｔｅｌｌｅｒ ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＭＣＲ．３（１）：５０−６１，２００５；Ｃｏｒｂｅｌｌｉｓ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１１（４）：２０３−６，２００４；Ｗｅｌｔ ＣＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．８２（１１）：３７２０−７，１９９７；およびＨａｒａｄａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．８１（６）：２１２５−３０，１９９６，ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｏｔａｎｉ，Ｔ，ｅｔ ａ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．８３（１）：３１−８，２００１；Ｔａｎａｋａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２３（３）：６５７−６３，２００３および前立腺癌（Ｔｈｏｍａｓ ＴＺ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．８２（１１）：３８５１−８，１９９７；Ｚｈａｎｇ，Ｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２３４（２）：３６２−５，１９９７；およびＲｉｓｂｒｉｄｇｅｒ ＧＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１８０（１−２）：１４９−５３，２００１に関与している。

【0194】

癌性状態は、本明細書に含まれる組成物、例えば、抗アクチビンＡ抗体、抗体断片、または抗体誘導体等のアクチビンＡ抗原結合タンパク質を使用して治療されることができる任意の癌性状態であることができる。癌性状態の例としては、例えば、急性リンパ性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫骨癌、脳腫瘍（例えば、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発不明細胞腫、原発性中枢神経系、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング腫瘍，頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞性腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、および卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（例えば、成人、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視覚路および視床下部）、ヘアリー細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路神経膠腫、眼球内黒色腫、膵島細胞腫（膵島）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌，喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ性、急性骨髄性、慢性リンパ性、慢性骨髄性、およびヘアリー細胞）、口唇および口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫（例えば、エイズ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞性、ホジキン、非ホジキン、および原発性中枢神経系）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵島細胞癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫，胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂および尿管移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌，軟部肉腫、扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性絨毛腫瘍、原発部位不明細胞腫、原発部位不明の癌、尿道癌、子宮内膜子宮癌，子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。

【0195】

オリゴペプチドまたはポリペプチドは、ＣＤＲの抗体Ａ１〜Ａ１４の少なくとも１つと、および／またはアクチビンＡとの少なくとも１つの抗体Ａ１〜Ａ１４の結合をクロスブロックし、および／または少なくとも１つの抗体Ａ１〜Ａ１４によって、アクチビンＡとの結合からクロスブロックされるアクチビンＡ結合剤のＣＤＲと、および／または結合剤がアクチビンＡ受容体とのアクチビンＡの結合をブロックすることができるアクチビンＡ結合剤のＣＤＲと、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する場合には、本発明の範囲内にある。

【0196】

アクチビンＡ結合剤ポリペプチドおよび抗体は、少なくとも１つの抗体Ａ１〜Ａ１４の可変領域と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、およびアクチビンＡとの少なくとも１つの抗体Ａ１〜Ａ１４の結合をクロスブロックする、および／または少なくとも１つの抗体Ａ１〜Ａ１４によって、アクチビンＡとの結合からクロスブロックされる、および／またはアクチビンＡ受容体へのアクチビンＡの抑制効果をブロックすることができる、アミノ酸配列を有する場合には、本発明の範囲内にある。

【0197】

約Ｃ１１〜Ｓ３３（第１のループ）および約Ｃ８１〜Ｅ１１１（第２のループ）の領域内の配列が、未変性アクチビンＡの立体構造を保持する無傷アクチビンＡと特異的に結合する治療抗体が使用されてもよい。かかるマッピングおよび結合を、下記の実施例６に記述する。

【0198】

本発明による抗体は、１ｘ１０^−７Ｍ以下、１ｘ１０^−８Ｍ以下、１ｘ１０^−９Ｍ以下、１ｘ１０^−１０Ｍ以下、１ｘ１０^−１１Ｍ以下、１ｘ１０^−１２Ｍ以下のヒトアクチビンＡへの結合親和性を有してもよい。

【0199】

抗体または結合パートナの親和性、ならびに抗体が結合を抑制する程度は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２（１９４９））または表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に記載されるもの等の従来の技術を使用して、当業者により判定されることができる。表面プラズモン共鳴では、標的分子は、固相上に固定化され、フローセルに沿って移動する移動相中のリガンドに暴露される。固定化された標的と結合する配位子が生じる場合、局所屈折率は変化して、ＳＰＲ角度における変化を導き、これは反射光の輝度における変化を検出することによって、リアルタイムで監視することができる。ＳＰＲシグナルの変化率は、結合反応の会合および解離相の明らかな速度定数を産出するために、解析することができる。これらの値の割合により、明らかな平衡定数（親和性）（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−６５（１９９３）を参照）がもたらされる。

【0200】

本発明による抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＡ等の任意の免疫グロビンクラスに属してもよい。これは、動物、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）およびマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、もしくは他のげっ歯類、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、または他の霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳類から得られてもよく、またはこれらに由来してもよい。抗体は、内在性抗体であってもよい。抗体の生成は、概して、米国特許公開第２００４／０１４６８８８Ａ１号に開示される。

【0201】

特徴付けアッセイ
新しいフレームワークおよび／または定常領域内への特異的Ａ１〜Ａ１４ＣＤＲの操作を含む、本発明による抗体を産生する上記の方法において、所望の抗体を選択するために、適切なアッセイが利用可能である（つまり、アクチビンＡへの結合親和性を決定するためのアッセイ、クロスブロッキングアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅに基づく競合結合アッセイ、生体内アッセイ）。

【0202】

治療方法および抗原結合タンパク質の投与
本明細書に提供した特定の方法は、対象にアクチビンＡ結合抗原結合タンパク質を投与し、それによって、特定の状態に影響するアクチビンＡ誘発の生物学的反応を減少させることを含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、例えば、対象への投与または体外手順を介して、内在性アクチビンＡを、アクチビンＡ結合抗原結合タンパク質と接触させることを含む。

【0203】

「治療」という用語は、少なくとも１つの症状もしくは疾患の他の側面の軽減もしくは予防、または疾患重症度の減少等を包含する。さらに、「治療」は、それを必要としている対象における少なくとも１つの症状または疾患の他の側面を予防するまたは軽減するための、本明細書に記述した治療薬を投与することにさらに関する。抗原結合タンパク質は、実行可能な治療薬を構成するために、全治を達成する必要がなく、またはあらゆる症状または疾病の徴候を根絶する必要はない。関連分野において認識されるように、治療薬として用いられる薬物は、一定の病状の重症度を減少させ得るが、有用な治療薬と見なさられるように疾病のあらゆる徴候をなくす必要はない。同様に、予防的に投与された治療は、実行可能な予防薬を構成するために、状態の発症を予防するのに完全に有効である必要はない。単に疾病の影響を減少させること（例えば、その症状の数もしくは重症度を減少させることによって、または別の治療の有効性を増加させることによって、あるいは別の有益な効果を生成することによって）、または疾病が、対象において生じるもしくは悪化する可能性を減少させることで十分である。本発明の一実施形態は、特定の疾患の重症度に反映する指標のベースラインにわたって持続的改善を誘発するのに十分な量および時間で、アクチビンＡアンタゴニストを患者に投与することを含む方法に関する。

【0204】

関連分野において理解されるように、本発明の分子を含む医薬組成物は、効能に適切である方法で、それを必要としている対象に投与される。医薬組成物は、非経口的に、局所的に、または吸入によるものを含むがこれらに限定されない好適な技術により投与されてもよい。注射される場合、医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内もしくは皮下経路、ボーラス注入により、または持続点滴を介して投与することができる。例えば、疾病または傷害の部位での限局性投与は、移植片からの経皮的送達および徐放として検討する。吸入による送達は、例えば、鼻孔もしくは経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態でのアンタゴニストの吸入等を含む。他の代替案は、点眼と、丸剤、シロップ、トローチ剤またはチューインガムを含む経口用剤と、ローション、ゲル、噴霧、および軟膏等の局所用製剤と、を含む。

【0205】

また、体外手順における抗原結合タンパク質の使用も検討する。例えば、患者の血液または他の体液は、全長アクチビンＡ、１つ以上のアクチビンＡアイソフォーム、または体外の他の部分長アクチビンＡを結合する抗原結合タンパク質と接触してもよい。抗原結合タンパク質は、好適な不溶性マトリックスまたは固形支持材料と結合されてもよい。

【0206】

効果があるように、抗原結合タンパク質は、生理学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈液等の１つ以上の付加的な構成要素を含む組成物の形で投与される。任意で、組成物は、例えば、第２のアクチビンＡ受容体阻害物質、抗血管新生物質、化学療法物質、鎮痛物質等の１つ以上の生理学的に活性な薬剤を付加的に含み、それらの非排他的な実施例を本明細書に提供する。種々の特定の実施形態において、組成物は、アクチビンＡ結合抗原結合タンパク質に加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの生理学的に活性な薬剤を含む。

【0207】

一実施形態において、医薬組成物は、緩衝液、アスコルビン酸等の抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（１０未満のアミノ酸を有するもの等）、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリン等の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート薬、グルタチオン、安定剤、および賦形剤から成る群から選択される１つ以上の物質と一緒に、本発明の抗原結合タンパク質を含む。中性緩衝生理食塩水または同種血清アルブミンと混合された生理食塩水は、適切な希釈液の例である。適切な業界標準に従って、ベンジルアルコール等の保存料が添加されてもよい。組成物は、希釈液としての適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を使用して、凍結乾燥物として処方されてもよい。好適な構成要素は、用いられる投与量および濃度で受取人に無害である。製剤処方において用いられてもよい構成要素のさらなる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６^ｔｈ Ｅｄ．（１９８０）ａｎｄ ２０^ｔｈ Ｅｄ．（２０００），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに提示する。

【0208】

医療施術者によって使用されるキットは、本発明の抗原結合タンパク質および本明細書で検討される任意の状態を治療するために用いる標識または他の指示を含む。一実施形態において、キットは、上記のような組成物の形であってもよく、１つ以上のバイアル中にあってもよい１つ以上の抗原結合タンパク質の無菌調製品を含む。

【0209】

投与量および投与頻度は、投与経路、用いられる特定の抗原結合タンパク質、治療される疾病の性質および重症度、状態が急性または慢性であるかどうか、ならびに対象のサイズおよび全身症状等の要因に従って異なってもよい。適切な投与量は、関連技術、例えば、用量増加研究を伴い得る臨床治験においては既知の手順によって決定されることができる。

【0210】

例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、１回または１回より多く、例えば、長期にわたり一定の間隔で投与されてもよい。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１ヶ月以上の期間にわたって、例えば、１ヶ月、２ヶ月、もしくは３ヶ月、またはさらに無期限の間投与される。慢性症状を治療するためには、長期治療が、概して最も効果的である。しかしながら、急性症状を治療するためには、より短い期間、例えば、１から６週間の投与が十分であり得る。概して、抗原結合タンパク質は、患者が、選択した指標に関するベースラインにわたって、医学的に関連性のある程度の改善を顕在化するまで投与される。

【0211】

本発明の特定の実施形態は、１日当たりおよび対象の体重のｋｇ当たり約１ｎｇの抗原結合タンパク質（「１ｎｇ／ｋｇ／日」）から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約５００ｎｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは５μｇ／ｋｇ／日から約２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で、抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む。付加的な実施形態において、抗原結合タンパク質は、アクチビンＡ介在性疾病、状態または疾患、例えば、本明細書に開示した内科的疾患を治療するために、週１回、週２回、または週３回以上成人に投与される。注射される場合、成人用量当たりの有効量の抗原結合タンパク質は、１〜２０ｍｇ／ｍ^２の範囲であってもよく、好ましくは約５〜１２ｍｇ／ｍ^２である。あるいは、固定用量が投与されてもよく、量は５〜１００ｍｇ／用量の範囲であってもよい。固定用量の一範囲は、用量当たり約２０〜３０ｍｇである。本発明の一実施形態において、２５ｍｇ／用量の固定用量は、注射によって繰り返し投与される。注射以外の投与経路が使用される場合、用量は、標準医療行為に従って調整される。治療投与計画の一例は、所望の程度の改善を誘発するためには、より長い期間の治療が必要な場合があるが、少なくとも３週間の期間にわたって、約２０〜３０ｍｇの用量の抗原結合タンパク質を注射することを含む。小児対象（年齢４〜１７歳）では、１つの例示的かつ好適な計画は、週２または３回投与される、最大用量２５ｍｇまでの０．４ｍｇ／ｋｇの抗原結合タンパク質の皮下注射を含む。

【0212】

本明細書に提供した方法の特定の実施形態は、週１または２回、０．５ｍｇから１０ｍ、好ましくは３から５ｍｇの抗原結合タンパク質の皮下注射を含む。別の実施形態は、週１回３ｍｇ以上の抗原結合タンパク質の肺内投与（例えば、噴霧器により）に関する。

【0213】

本明細書に提供した治療投与計画の例は、アクチビンＡシグナル伝達が影響を与える状態を治療するために、週１回１．５から３ｍｇの用量での抗原結合タンパク質の皮下注射を含む。そのような状態の例を本明細書に提供し、例えば、悪液質、癌、関節リウマチ、および体重、体質量、体脂肪の減少、または体重、体質量、体脂肪を維持できないことが影響を及ぼす全ての状態を含む。抗原結合タンパク質の毎週の投与は、所望の結果が達成されるまで、例えば、対象の症状が鎮静するまで継続される。治療は必要に応じて再開されてもよく、または、代替的に、維持量が投与されてもよい。

【0214】

本明細書に提供した治療投与計画の他の例は、対象のキログラム体質量当たり１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、または２０ミリグラムの用量の本発明のアクチビンＡ阻害剤の皮下または静脈内投与を含む（ｍｇ／ｋｇ）。用量は、対象に１回、または一定の間隔で、例えば、１日１回、週３回、週２回、週１回、月３回、月２回、月１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、もしくは年１回投与されることができる。治療の持続時間、ならびに治療の用量および／または頻度への任意の変化は、対象の特定のニーズを満たすために、治療経過中に変更される、または異なることができる。

【0215】

別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、治療されている疾患の重症度を反映する少なくとも１つの指標において改善を、好ましくは持続性改善を誘発するのに十分な量または時間で対象に投与される。対象の病気、疾病または状態の程度を反映する種々の指標は、治療の量および時間が十分であるかどうかを判定するために評価されてもよい。そのような指標は、例えば、問題の疾患の疾患重症度、症状、または徴候の臨床的に認識される指標を含む。一実施形態において、改善は、対象が、２週から４週で区切られる少なくとも２回の機会で改善を呈する場合に、持続性であると見なされる。改善の程度は、概して、兆候、症状、生検、または他の試験結果に基づいて決定を下すことができ、また、所定の疾病のために開発された生活の質アンケート等の、対象に投与されるアンケートを用いることができる医師によって決定される。

【0216】

アクチビンＡの対象のレベルは、もしあれば、それらのレベルの変化を検出するために、抗原結合タンパク質での治療前、その間および／またはその後に監視されてもよい。一部の疾患では、アクチビンＡレベルの上昇の発生率は、疾病の段階または疾病の特定の形等の要因に従って異なってもよい。既知の技術は、例えば、対象の血清におけるアクチビンＡレベルを測定するために用いられてもよい。血液試料中のアクチビンＡレベルは、任意の好適な技術、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して測定されてもよい。

【0217】

本発明の方法および組成物の特定の実施形態は、抗原結合タンパク質の使用および１つ以上の付加的なアクチビンＡアンタゴニスト、例えば、２つ以上の本発明の抗原結合タンパク質、または本発明の抗原結合タンパク質および１つ以上の他のアクチビンＡアンタゴニストを含む。さらなる実施形態において、抗原結合タンパク質は、単独でまたは患者が苦しんでいる状態を治療するのに有用な他の薬剤との組み合わせで投与される。そのような薬剤の例は、タンパク質性および非タンパク質性薬物の両方を含む。多数の治療法が同時投与される場合、投与量は、関連技術において認識されるように、それに応じて調整されてもよい。「同時投与」および併用療法は、同時に行う投与に限定されず、抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの他の治療薬を患者に投与することを含む治療経過中に少なくとも１回投与される治療投与計画もまた含む。

【0218】

抗原結合タンパク質とともに同時投与されてもよい他の薬剤の例は、治療される特定の状態に従って選択される他の抗原結合タンパク質または治療的ポリペプチドである。あるいは、上記の特定の状態のうちの１つを治療するのに有用な非タンパク質性薬物は、アクチビンＡアンタゴニストとともに同時投与されてもよい。

【0219】

併用療法
別の実施形態において、本発明は、アクチビンＡ阻害抗原結合タンパク質および１つ以上の他の治療で対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、そのような併用療法は、例えば、多部位または腫瘍中の分子標的を攻撃することによって、相乗作用または相加効果を達成する。本発明に関連して使用することができる併用療法の種類は、単一の疾患関連経路内の多数の結節、標的細胞内の複数の経路、および標的組織（例えば、腫瘍内）内の複数の細胞型を阻害または活性化（必要に応じて）することを含む。例えば、本発明のアクチビンＡ阻害剤は、アポトーシスを促進または血管新生を阻害する治療と組み合わせることができる。別の実施形態において、標的薬剤は、単独で治療的に所望の効果を引き出すことができない場合、例えば、癌細胞を感作するまたは他の薬剤の治療効果を増大させるために使用され得る。別の実施形態において、本発明によるアクチビンＡ阻害剤は、細胞障害性薬物またはアポトーシスを誘発する他の標的薬剤との組み合わせで使用される。別の実施形態において、アクチビンＡ阻害剤は、細胞生存（例えば、ＰＫＢ、ｍＴＯＲ）に関与する異なる標的、異なる受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ｋｉｔ）、または異なる細胞型（例えば、ＫＤＲ阻害剤、ｃ−ｆｍｓ）を阻害する１つ以上の薬剤との組み合わせで使用される。別の実施形態において、本発明のアクチビンＡ阻害剤は、特定の状態をケアする既存の基準に加えられる。治療薬の例は、ゲムシタビン、タキソール、タキソテール、およびＣＰＴ−１１を含むがこれらに限定されない。

【0220】

別の実施形態において、該方法は、本明細書に記述した１つ以上のアクチビンＡアンタゴニストおよび１つ以上の他の治療（例えば、治療または緩和療法）、例えば、抗癌治療（手術、超音波、放射線療法、化学療法、または別の抗癌剤での治療等）を投与することを含む。方法が１つより多い治療を対象に投与することを含む場合、投与の順序、タイミング、数、濃度、および量は、医学的要求および治療の制限によってのみ制限される、つまり、２つの治療は、例えば同時に、継続的に、交互に、または任意の他の投与計画に従って対象に投与することができることを理解されたい。本明細書に記述したアクチビンＡアンタゴニストとの組み合わせで投与することができる薬剤の例は、好中球増加剤、イリノテカン、ＳＮ−３８、ゲムシタビン、ハースタチン、もしくはアクチビンＡ結合ハースタチン誘導体（例えば、米国特許出願第０５／０２７２６３７号に記載）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＢＭＳ−３５４８２５（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、パニツムマブ（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ／Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、およびデノスマブ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）を含むがこれらに限定されない。

【0221】

例えば、皮下、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内投与ならびに処方を含む、好適な投薬の開発および本明細書に記述した特定の組成物を使用するための治療投与計画は、当技術分野においては既知であり、それらの一部を、例証の一般的目的のために以下に簡潔に説明する。

【0222】

特定の用途において、本明細書に開示した医薬組成物は、経口投与を介して動物に送達されてもよい。したがって、これらの組成物は、不活性希釈液とともに、もしくは吸収可能な食用担体とともに処方されてもよく、またはそれらは殻の硬いもしくは殻の柔らかいゼラチンカプセル内に封入されてもよく、またはそれらは錠剤に圧縮されてもよく、またはそれらは食事の食物とともに直接取り入れられてもよい。

【0223】

特定の状況において、本明細書に開示した医薬組成物を、皮下に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、またはさらに腹腔内に送達することが所望される。そのようなアプローチは当業者には既知であり、それらの一部は、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号、米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号においてさらに説明される。特定の実施形態において、遊離塩基としての活性化合物の溶液または薬理学的に許容可能な塩は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性物質と好適に混合された水中で調製されてもよい。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中ならびに油中で調製されてもよい。保存および使用の通常の状態下で、これらの調剤は、微生物の増殖を防ぐために、一般的に特定の保存料を含有する。

【0224】

注入可能な使用に好適な例証的医薬品形態は、無菌水溶液もしくは分散液ならびに無菌の注入可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末を含む（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照）。全ての場合において、該形態は、容易な注入可能性が存在する程度まで、無菌でなければならず、流体でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定性がなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならいない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、好適なそれらの混合物、および／または植物油を含有する溶剤もしくは分散媒であることができる。適した流動性は、例えば、レシチン等の被覆の使用によって、分散の場合に必要な粒径を維持することによって、および／または界面活性物質の使用によって、維持されてもよい。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって促進されることができる。多くの場合において、例えば、糖またはナトリウム塩化物等の等張剤を含むことが好適である。注入可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン中の使用によりもたらすことができる。

【0225】

一実施形態において、水溶液中の非経口投与では、溶液は、必要な場合に好適に緩衝されるべきであり、液体希釈液は、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて、まず等張の状態にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、用いることができる無菌水媒体は、本開示の観点から当業者には既知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解されてもよく、および１０００ｍｌの皮下注入流体に添加されるか、または点滴が提案される部位で注入されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ ｅｄ．，ｐｐ．１０３５−１０３８ ａｎｄ １５７０−１５８０を参照）。投与量のいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に生じる。さらに、ヒト投与では、調製は当然ながら、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準によって定められているような無菌、発熱性、ならびに一般的安全性および純度基準を好適に満たす。

【0226】

本発明の別の実施形態において、本明細書に開示した組成物は、中性または塩形態で処方されてもよい。例証的な薬剤的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から派生することもできる。処方後、溶液は、投与量処方に適合する方法でおよび治療的に有効な量等で投与される。

【0227】

担体は、任意のまたは全ての溶剤、分散媒、ビヒクル、被覆、希釈液、抗細菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延薬剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等をさらに含むことができる。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において既知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である限りを除いて、治療的組成物におけるその使用が検討される。また、補充性活性成分は、組成物に取り込むこともできる。「薬剤的に許容可能」という語句は、ヒトに投与される時に、アレルギーまたは同様の有害反応を生成しない分子的実体および組成物を言う。

【0228】

特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、脂質粒子、小胞等は、好適な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用される。具体的には、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ球体、またはナノ粒子等に被包された送達のために処方されてもよい。あるいは、本発明の組成物は、そのような担体ビヒクルの表面と共有結合的にまたは非共有結合的に結合することができる。

【0229】

可能な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様製剤の処方および使用は、概して、当技術分野において既知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：３０７−２１，１９９８；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ５６（３）：６９１−９５，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３５（８）：８０１−０９，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１２（２−３）：２３３−６１，１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号、米国特許第５，５５２，１５７号、米国特許第５，５６５，２１３号、米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号を参照のこと。それぞれ参照することによりそれら全体が本願明細書に明確に組み込まれる。）。リポソームの使用は、全身性送達後の自己免疫反応または容認できない毒性と関連しないようである。特定の実施形態において、リポソームは、水媒体中に分散されるリン脂質から形成され、および多重膜同心円性二分子膜小胞（多重膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ）とも称される）を自発的に形成する。

【0230】

あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬剤的に許容可能なナノカプセル処方を提供する。ナノカプセルは、概して、好適および再現性のある方法で化合物を封入することができる（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２４（１２）：１１１３−２８，１９９８を参照）。細胞内重合体過負荷による副作用を回避するために、そのような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、生体内分解することができるポリマーを使用して設計されてもよい。そのような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．５（１）：１−２０，１９８８；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４５（２）：１４９−５５，１９９８；Ｚａｍｂａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５０（１−３）：３１−４０，１９９８；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるように生成することができる。

【0231】

さらに、本発明の医薬組成物は、かかる医薬組成物の使用に関する指示を提供する包装材料とともに容器内に配置されてもよい。概して、かかる指示は、試薬濃度、ならびに特定の実施形態においては、医薬組成物を再構成するために必要であり得る賦形剤成分または希釈液（例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）の相対量を説明する有形の表現を含む。

【0232】

投与される用量は、体重の０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及んでもよい。当業者には明らかなように、投与の量および頻度は、当然ながら、治療される兆候の性質および重症度、所望の反応、患者の状態等の要因によって異なる。一般的には、組成物は、上述のような種々の技術により投与されてもよい。

【0233】

本発明は、本発明による少なくとも１つの抗アクチビンＡ結合剤を含む診断キットもまた提供する。結合剤は抗体であってもよい。さらに、そのようなキットは、以下の１つ以上を任意で含んでもよい。

【0234】

（１）スクリーニング、診断、予後、治療モニタリングまたはこれらの用途の任意の組み合わせに対して１つ以上の結合剤を使用するための指示、
（２）抗アクチビンＡ結合剤への標識結合パートナ、
（３）抗アクチビンＡ結合剤が固定化される固相（試薬紙等）、および
（４）スクリーニング、診断、予後、もしくは治療的使用またはそれらの任意の組み合わせに対する規制認可を示す標識または挿入。
結合剤への標識結合パートナが提供されない場合、結合剤自体を、１つ以上の検出可能なマーカー、例えば、化学発光、酵素、蛍光、または放射性部分で標識することができる。

【0235】

以下の実施例は、例証として提供し、限定を意図しない。

【実施例1】

【0236】

（実施例）
（実施例１）
アクチビンＡの組み換え発現
馴化培地の限界濾過および透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）。Ｒ−ＨｕＡｃｔｉｖｉｎＡは、チャイニーズハムスター卵巣（ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ）細胞内で発現した。活性かつ精製材料を産生するために、一連のステップを展開した。精製工程は、Ａｍｉｃｏｎ Ｓ１０Ｙ１０螺旋カートリッジを使用して１５から２０倍の間で馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ：Ｃ．Ｍ．）を濃縮（透析濾過）することによって開始した。次いで、５倍の１０ｍＭトリス緩衝液Ｐｈ７．０を使用して、緩衝液交換（ダイアフィルター）を行い、濾過して保存した。

【0237】

陽イオン交換クロマトグラフィ。ｒ−ＨｕアクチビンＡを、１０ｍＭトリス緩衝液Ｐｈ７．０中で平衡化した２．６Ｘ７ｃｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに、４〜８０℃、５ｍｌ／分で加えた。カラムを平衡緩衝液で洗浄した。ｒ−ＨｕアクチビンＡを、１０ＭｍのトリスＰｈ７．０で緩衝した２０カラム体積にわたって、０．４Ｍまでのナトリウム塩化物の増加濃度の勾配でカラムから溶出した。適切な画分をプールし、４〜８０℃で保存した。

【0238】

逆相ＨＰＬＣ Ｃ４クロマトグラフィ。Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムプールｐＨをトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＴＦＡ）で２．０に調整した。プールを、７５％Ａ緩衝液（水中０．１％ＴＦＡ）、および２５％Ｂ緩衝液（９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、９．９％水）で平衡化した室温の１Ｘ２５ｃｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムに加えた。次いで、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。Ｒ−ＨｕアクチビンＡを、５ｍｌ／分の流速で５０分間、２５％Ｂ緩衝液から２５％Ｂ緩衝液の勾配で溶出した。適切な画分をプールし、凍結乾燥した。

【0239】

高速陽イオン交換クロマトグラフィ。５ｍｌのＳ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラムを、室温で８Ｍ尿素、１０ｍＭナトリウムリン酸塩、Ｐｈ７．０（Ａ緩衝液）で平衡化した。凍結乾燥したＣ４プールをＡ緩衝液中で再懸濁して５ｍｌ／分加え、Ａ緩衝液で洗浄した。ｒ−ＨｕＡｃｔｉｖｉｎ Ａを、８Ｍ尿素、１０ｍＭナトリウムリン酸塩、ｐＨ７．０で緩衝した３０カラム容積にわたって、０．１５Ｍまでのナトリウム塩化物の増加濃度の勾配でカラムから溶出した。適切な画分をプールし、４〜８０℃で保存した。

【0240】

逆相ＨＰＬＣ Ｃ４クロマトグラフィ。Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムプールｐＨをトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＴＦＡ）で２．０に調整した。プールを、７５％Ａ緩衝液（水中０．１％ＴＦＡ）、および２５％Ｂ緩衝液（９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、９．９％水）で平衡化した室温の１Ｘ２５ｃｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムを加えた。次いで、尿素および塩を除去するために、カラムを平衡緩衝液で広範に洗浄した。Ｒ−ＨｕアクチビンＡを、５ｍｌ／分の流速で５０分間、２５％Ｂ緩衝液から５０％Ｂ緩衝液の勾配で溶出した。適切な画分をプールし、最終的な精製ｒ−ＨｕアクチビンＡを凍結乾燥して、一定分量において−８０℃で保存した。配列番号：２２５はアクチビンＡへのアミノ酸配列を提供する。

【実施例2】

【0241】

（実施例２）
抗アクチビンＡ雑種細胞の産生
アクチビンＡに対する抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスである、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）中で育てた。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統ＸＭＧ２は、完全ヒトＩｇＧ２カッパ抗体を生成するために使用した。第２の系統は完全ヒトＩｇＧ４カッパ抗体を生成するために使用した。マウスをアクチビンＡで免疫化した。

【0242】

標準プロトコルマウス（ＵＳ２００５／０１１８６４３、ＷＯ２００５／６９４８７９）に従って、マウスの後足蹠（足蹠当たり５μｇ）に抗原（アクチビンＡ）を注射した。初回注射は、アジュバントＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標） Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ２６８４）を含有した。その後の注射において、各マウスに、アジュバントアルミニウムゲル（アルミニウムリン酸塩ゲルアジュバント、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ ａ／ｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓａｒｇｅｎｔ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ Ｎ．Ｊ．，にて頒布、カタログ番号１４５２−２５０）中、合計５μｇの抗原を注射した。最終の注射は、マウス当たり合計１０μｇの抗原を含有し、アジュバントは含有しなかった。

【0243】

各マウスは、６回目の注射から２日後に出血した。それらの出血からの血液試料を、アクチビンＡに対する抗体の力価を判定するためにＥＬＩＳＡでアッセイした。最終の注射から４日後、マウスを屠殺し、それらの流入領域リンパ節を採取して、リンパ球を回収させた。それぞれ３つのグループのマウスからのリンパ球を別々にプールした。Ｂ細胞のリンパ球試料を濃縮するため、抗ＣＤ９０電磁ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号４９１−０１）を加えることによってＴ細胞を枯渇させ、次いで、リンパ球をＬＳ^＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号４２４−０１）に通した。

【0244】

Ｂ細胞を濃縮したリンパ球の各試料を、次いで、エレクトロセル融合装置（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ＥＣＭ ２００１）を使用してＰ３骨髄腫細胞と融合し、雑種細胞を生じた。次いで、融合した雑種細胞株の３つのグループは、当技術分野において既知の他の培地が使用され得るが、記載（ＷＯ２００５／０９４８７９）のように９６ウェルプレート雑種細胞培地内に蒔いた。雑種細胞株を、１５％ＣＯ_２中１４日間３７℃で培養した。

【0245】

１４日後、アクチビンＡに対するヒトＩｇＧ抗体の存在を検出するために、培養上清をＥＬＩＳＡでアッセイした。そのＥＬＩＳＡで陽性反応を示した培養上清を、第２のＥＬＩＳＡにおいて、ヒトカッパ鎖の存在に対して検査した。その第２のＥＬＩＳＡにおいて、２次抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役したヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体であったことを除いて、条件は第１のＥＬＩＳＡと同一であった。両ＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性反応を示した雑種細胞は、その後の試験に対して５ｍｌの上清を生成するために、さらに伸長させた。

【0246】

異種マウスに由来する合計１６０の抗アクチビンＡ雑種細胞試料は、以下の実施例に記述するような細胞に基づく機能アッセイおよびＢＩＡｃｏｒｅ結合解析を使用してスクリーニングした。２３の雑種細胞は、発現、精製、細胞に基づくアッセイ、結合解析、配列解析、ＭＳ、およびＳＥＣに関連するそれらの特性にさらに特徴付けられる。これらにより、３つの強力な単クローン抗体であるＡ１、Ａ２、およびＡ３を、以下に記述するようなさらなる試験のために同定した。これらの抗体に対するアミノ酸配列は、以下の通りである。Ａ１：配列番号：９（軽鎖可変）、配列番号：８４（軽鎖定数）、配列番号：１０（重鎖可変）、および配列番号：２１４（重鎖定数）。Ａ２は、配列番号：２５（軽鎖可変）、配列番号：１００（軽鎖定数）、配列番号：２６（重鎖可変）、および配列番号：２１５（重鎖定数）。Ａ３は、配列番号：４１（軽鎖可変）、配列番号：１０８（軽鎖定数）、配列番号：４２（重鎖可変）、および配列番号：２２１（重鎖定数）。

【実施例3】

【0247】

（実施例３）
ＣＨＯ細胞中ヒト−ｈｕアクチビンＡ抗体の発現および精製

抗ｈｕアクチビンＡ発現プラスミドの形質移入に使用したＣＳ−９細胞は、無血清懸濁液ＣＨＯ細胞株であった。ＣＳ−９クローンは、組み換えタンパク質の発現のために、宿主細胞株として選択し、無血清培地に貯蔵した。貯蔵所は、外来性因子および無菌性に関して試験され、ウイルス性、マイコプラズマおよび微生物因子がないことが分かった。

【0248】

抗ｈｕアクチビンＡ発現細胞株は、典型的な流加工程を使用して増加させた。細胞を、増殖後、Ｗａｖｅバイオリアクタに接種した。培養物は、ボーラス投与で約３日目、５日目および９日目に３回補給し、１１日目に採取した。細胞を沈降させ、馴化培地を、１０インチの０．４５／０．２ミクロン前置フィルタで濾過し、続いて６インチの０．２ミクロンフィルタで濾過した。

【0249】

雑種細胞馴化培地（Ｃ．Ｍ．）からの単クローン抗体の精製：
７から１０ｍｌのＣ．Ｍ．に、ＰＢＳ中で平衡化された単クローン抗体Ｓｅｌｅｃｔ樹脂の１００μｌの１：２スラリーを加えた。チューブを４〜８℃で一晩回転板上に配置した。チューブを５分間１，０００Ｘｇで遠心分離し、非結合画分をデカントした。樹脂を５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、上記のようにデカントした。次いで、樹脂をＳＰＩＮ−Ｘ、０．４５ｕｍ、２ｍｌチューブに移した。樹脂を０．５ｍｌのＰＢＳでさらに２回洗浄し、遠心分離した。単クローン抗体は、１０分間時折混合するとともに、室温でインキュベートすることによって、０．２ｍｌの０．１Ｍ酢酸で溶出した。チューブを遠心分離し、３０ｕｌの１Ｍトリス緩衝液Ｐｈ８．０を溶出液に加えた。精製した単クローン抗体を４〜８℃で保存した。

【実施例4】

【0250】

（実施例４）
Ｃ２Ｃ１２細胞に基づくアクチビン活性アッセイ
このアッセイは、アクチビンＡのその受容体との結合が阻害される程度を測定することによって試験される抗体の中和能力を立証する。アクチビン応答性レポーター細胞株は、ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃコンストラクトでのＣ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７７２）の形質移入によって産生した。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃコンストラクトを、１２の繰り返しのＣＡＧＡ配列をクローニングすることによって生成し、ＴＡＴＡボックスのｐＬｕｃ−ＭＣＳレポーターベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２１９０８７）上流内へのアクチビン応答エレメント（Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ１７：３０９１−３１００（１９９８））を表した。筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２は、細胞表面上でアクチビンＩＩＢ受容体（ａｃｔＲＩＩＢ）を天然に発現させる。アクチビンが細胞受容体を結合する時、Ｓｍａｄ経路が活性化され、リン酸化されたＳｍａｄは、応答エレメント（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ８７：１２１５（１９９６））と結合し、ルシフェラーゼ細胞をもたらす。次いで、ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコルに従って、市販のルシフェラーゼレポーターアッセイキット（カタログ番号Ｅ４５５０、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定する。

【0251】

ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥクローン＃４４）を形質移入されたＣ２Ｃ１２細胞の安定なラインは、以下の手順に従ってアクチビン活性を測定するために使用した。

【0252】

等しい数のレポーター細胞（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥクローン＃４４）を９６ウェル培養に蒔いた。抗体を含有する２倍希釈の馴化培地を使用した１回目のスクリーニングは、４ｎＭで固定したアクチビンＡ濃度で行った。組み換え成熟アクチビンＡは、それぞれ２倍および５倍希釈での馴化培地を用いて、１時間室温で前インキュベートした。レポーター細胞培養物は、抗体の有無にかかわらずアクチビンで６時間処置した。アクチビンＡ活性は、処置した培養物中のルシフェラーゼ活性を判定することによって測定した。このアッセイは、レポーターアッセイにおいてアクチビンＡシグナル伝達活性を阻害した抗体を最初に同定するために使用した。その後、９点滴定曲線を４ｎＭで固定したアクチビンＡ濃度で産生した。アクチビンＡは、レポーター細胞培養物に混合物を加える前に１時間、０．００４ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．４ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭおよび２μＭの９つの濃度の各精製抗体で前インキュベートした。多数の抗体Ａ１、Ａ２およびＡ３に対するＩＣ_５０値を表３に提供する。

【0253】

【表3】

【実施例5】

【0254】

（実施例５）
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ
アクチビンＡ抗体Ａ１、Ａ２およびＡ３の親和性解析は、センサチップＣＭ５、および流動的緩衝液としての０．００５パーセントＰ２０界面活性物質（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用する装置、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で行った。組み換え成熟アクチビンＡタンパク質は、製造業者の推奨プロトコルに従ってＡｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、１級アミン基を介してリサーチグレードＣＭ５センサチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）に固定化した。

【0255】

直接結合アッセイは、固定化されたアクチビンＡと結合するそれらの能力の順に抗体をスクリーニングするために使用した。結合アッセイは、３分間５０μｌ／分の流速で、固定化されたアクチビンＡ表面に対する２つの濃度（４０および４００ｎＭ）の候補抗体それぞれを注入することによって行った。３分間の解離時間後、表面が再生された。結合曲線は、結合シグナル強度ならびに解離速度を質的に比較した。ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）およびＫＤ（解離平衡定数）を含む抗体結合キネティクスパラメータは、ＢＩＡ評価３．１コンピュータプログラム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して決定した。解離平衡定数（ｎＭで表す）が下がるほど、アクチビンＡに対する抗体の親和性が向上する。

【実施例6】

【0256】

（実施例６）
単クローン抗体に対するアクチビンＡ結合領域マッピング
アクチビンＡ上の抗体結合領域は、還元または非還元条件下のウエスタン、ＬｙｓＣを使用した制限プロテアーゼ消化、ＭＳによるペプチド解析、およびＢＩＡｃｏｒｅを使用したペプチド競合を含む、多数の生化学的方法を使用して決定した。

【0257】

システインノットは、ＴＧＦ−βファミリーメンバーへの重要な構造特性である。還元剤でＳ−Ｓを破壊することは、アクチビンＡ構造を劣化させ、Ａ−１を含む中和抗体とのアクチビンＡ結合を減少させた。
このデータは、システインノットが、アクチビンＢと比較して、アクチビンＡと特異的に結合するこれらの中和抗体に結合するアクチビンＡにとって重要であることを示した。システインノットは、互いに構造的に隣接する配列の２つの遠位ループを生成する。これらの２つの領域は、約Ｃ１１−Ｓ３３（第１のループ）および約Ｃ８１−Ｅ１１１（第２のループ）アクチビンＡ（図７）の領域内の配列である。制限ＬｙｓＣ消化は、これらの２つの領域が抗体Ａ−１によって保護されたことを明らかにし、それらが、中和抗体と直接相互作用することを示した。中和抗体は、アクチビンＡの立体構造的変化に感受性があり、それらが、抗原の非線形エピトープと結合することが示唆される。さらなるペプチド解析は、アクチビンＡにおける断片Ｇ−１からＫ７およびＳ５７〜Ｆ７４が、中和抗体とのその結合に直接必要とされないことを示した。アクチビンＢとアクチビンＡの配列の比較によって、いくつかの配列差異がこの領域で発生することが示される。

【実施例7】

【0258】

（実施例７）
選択性アッセイ
これらのアッセイは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、インヒビンＡ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−３、およびＢＭＰ４（全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）を含む種々のアクチビンおよび他のＴＧＦ−βファミリーメンバーとの、抗体Ａ１、Ａ２およびＡ３の結合の選択性を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）技術を使用して行った。ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃを、製造業者の推奨プロトコルに従って、リサーチグレードセンサチップに共有結合的に連結した。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイは屈折率の変化を検出するので、任意の抗体が存在しない場合における制御面上の注入で検出される反応に比べて、固定化された受容体表面上への注入で検出される反応間の差は、受容体との、種々のリガンドの実際の結合を表す。抗体およびアクチビンならびにＴＧＦ−β分子の前インキュベーションとともに、結合反応の変化（増加または減少）は、分子のＴＧＦβファミリーとの抗体結合を示す。抗体は、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−３、およびＢＭＰ４とではなく、全てアクチビンＡと結合するため、アクチビンＡの特異性が示唆される。

【実施例8】

【0259】

（実施例８）
キネックスＡ（登録商標）平衡アッセイ
ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）技術（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用する溶液ベースの平衡結合アッセイは、抗体分子と結合するアクチビンＡの解離平衡（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ：ＫＤ）を判定するために使用した。この溶液ベースのアッセイは、一部の例においてＢＩＡｃｏｒｅアッセイよりもより感受性があると考えられる。Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ（登録商標）６Ｘを、一晩約５０μｇ／ｍｌのアクチビンＡで前被覆し、次いでＢＳＡでブロックした。３０ｐＭおよび１００ｐＭの抗体試料を、アクチビンＡ被覆ビーズに通す前に、８時間室温で種々の濃度の（０．５ｐＭから５ｎＭ）アクチビンＡとともにインキュベートした。ビーズ結合抗体の量は、スーパーブロック中１ｍｇ／ｍｌで、蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体によって定量化した。所与のアクチビンＡ濃度では、結合シグナルは、平衡で遊離抗体の濃度と比例した。ＫＤは、ＫｉｎＥｘ Ａ（登録商標）ソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）に提供される双対曲線一部位均一結合モデルを使用して、競合曲線の非線形回帰から取得した。結果を図８に示す。Ａ１は、アクチビンＡ（Ｋ_Ｄ〜３ｐＭ）に対する最大結合親和性を示す。Ａ２およびＡ３は、それぞれ〜１５ｐＭおよび〜８ｐＭでアクチビンＡと結合した。

【実施例9】

【0260】

（実施例９）
コラーゲン誘発関節炎モデルにおける体重および筋肉量減少への抗アクチビンの保護効果
この実施例は、アクチビン阻害剤が、コラーゲン誘発関節炎で見られる筋肉疲労状態を回復できるかどうかを試験するために設計した。コラーゲン誘発関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＩＡ）は、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）といくつかの臨床的および病理学的特徴を共有する、広く利用されるマウスモデルである。ＣＩＡの正確な機構は知られていないが、ＣＩＡがＴｈ−１媒介の炎症性疾患であることを示す多大な証拠がある。関節リウマチは、関節炎、および進行性軟骨／骨侵食に繋がる一般的な自己免疫疾患である。たとえＲＡ進行が制御されているとしても、ＢＣＭの減少は、付加的かつ直接的な介入なしでは矯正されない。

【0261】

コラーゲン誘発関節炎モデルを以下の通りに調製した。生後８週間（２０〜２３ｇ）のＤＢＡ／１Ｊ雄のマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を使用した。免疫化は、１００μｌのＣＦＡまたはＩＣＦＡ中で乳化された１０００ｇ Ｂｏｖｉｎｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を、尾基底部で皮内に注射することによって、１日目および２１日目に行った。それぞれが１０匹のマウスからなる３つのグループを使用した。グループ１（対照）はビヒクルのみを受けた。グループ２（実験用、コラーゲン注射）は、処置としてのみビヒクルを受けた。グループ３は、コラーゲンを注射し、抗アクチビンＡ抗体Ａ１で処置した。

【0262】

以下は、使用した関節炎の臨床的指標である。

【0263】

０＝関節炎の兆候のない正常関節
１＝１本の指の腫脹および／または発赤
２＝病変のある２関節
３＝３つ以上の関節
４＝足および指全体の重症関節炎
処置は、８日目に開始するアクチビン抗体注射（ｓ．ｃ．）、週２回５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．で構成される。測定したエンドポイントは、体重、筋肉／脂肪量、食物摂取量および炎症性サイトカインであった。

【0264】

体重。未処置ＣＩＡ動物は、正常の動物に比べて、それらの体重および筋肉量の２５パーセントが減少し、リウマチ悪液質が明らかとなった。抗アクチビンＡ（Ａ−１）処置は、正常の対照動物とではなく、ＣＩＡ対照と比べて体重を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。

【0265】

筋肉量。単クローン抗体Ａ１での処置は、未処置ＣＩＡ動物と比べて、ＣＩＡ動物における筋肉量を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。ＣＩＡ対照において、９５日目の筋肉量は１．５ｇであり、一方、抗体処置のＣＩＡ動物において、９５日目の筋肉量は２．５ｇであった。結果を図１に示す。

【0266】

脂肪量。抗アクチビンＡ抗体は、ＣＩＡ動物の脂肪減少を逆戻りさせなかった。結果を図２に示す。

【0267】

処置した動物における体重および筋肉量の維持は、生活の質を改善し、関節リウマチ罹患者の死亡率を低下させるための治療として、アクチビンＡ抗体に対する支持を提供する。

【実施例10】

【0268】

（実施例１０）
若年生体ヌードマウスにおける筋肉内ＣＨＯ／アクチビン異種移植
アクチビンＡ（ＣＨＯ／アクチビン）を安定に形質移入されたＣＨＯ細胞は、１ｘ１０^６、５ｘ１０^６、および１０ｘ１０^６の種々の用量で、筋肉内注射を介して若年生体ＣＤ１ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。形質移入されていないＣＨＯ細胞の同じ用量を、対照としてマウスの別々のグループに注射した。ＣＨＯ／アクチビン移植は、対照と比較して急速かつ大幅な体重減少を誘発した。

【0269】

１２日目で、１ｘ１０^６細胞のためのＣＨＯ／対照グループは、１０％の体重減少があり、一方、ＣＨＯ／抗アクチビンＡグループは、体重の１０％増加があった。また、５ｘ１０^６および１０ｘ１０^６細胞抗アクチビンＡグループは、約１０％の体重増加を示し、一方、対照５ｘ１０^６および１０ｘ１０^６細胞グループは、２５〜３０％の体重が減少した。

【0270】

マウスにおける血清アクチビンＡレベルを、異種移植の移植後１２日目に測定した。対照マウスを移植した親ＣＨＯにおける血清アクチビンＡのレベルは、２ｎｇ／ｍｌ未満であった。対照的に、ＣＨＯ／アクチビ異種移植を持つマウスは、血清アクチビンＡの劇的な上昇を示した。統計解析により示されるように、血清アクチビンＡレベルと体重減少の重症度との間には有意な相関関係があり、アクチビンＡ過剰発現は、ＣＨＯ／アクチビン異種移植マウスに見られる体重減少に関与することを示した。

【0271】

マウス（グループ当たりｎ＝１４）にＣＨＯ／アクチビン異種移植を移植し、その後、ビヒクルまたはＡ１、Ａ２およびＡ３の３つの抗アクチビンＡ単クローン抗体それぞれのいずれか一方を注射した。ビヒクルグループ中の１４匹マウスのうち１２匹は、ＣＨＯ／アクチビン移植後２５日目に死亡し、一方、抗アクチビンＡ単クローン抗体処置グループにおいては、４２匹のＣＨＯ／アクチビン移植マウスのうち１匹のみがその時点で死亡した。３８日目まででは、単クローン抗体処置グループの大部分のマウスは良好に生存し、生存率は以下の通りである。Ａ１グループでは１４匹のうち１３匹、Ａ２またはＡ３グループのいずれか一方では１４匹のうち１０匹であった。

【0272】

体重データは、抗アクチビンＡ単クローン抗体、Ａ１またはＡ２での処置は、ＣＨＯ／アクチビン異種移植を持つマウスの体重減少を完全に防止したことを示し、抗アクチビンＡ単クローン抗体が生体内中和アクチビンＡ活性に有効であったことが示される。図３に示すように、ＮＭＲデータは、抗アクチビンＡ単クローン抗体、Ａ１での処置が、ＣＨＯ／アクチビンを持つマウスに見られる進行性の除脂肪体重の減少を防止したことを明らかにした。この抗体での処置は、食物摂取量の増加もまた生じさせた。

【0273】

剖検データは、抗アクチビンＡ単クローン抗体、Ａ１およびＡ２での処置が、ＣＨＯ／アクチビンを持つマウスに見られる除脂肪屠体重量の重度の減少を防止したことを示す（表５）。末期剖検データは、抗アクチビンＡ単クローン抗体、Ａ１およびＡ２での処置が、ＣＨＯ／アクチビン異種移植を持つマウスに見られる脂肪量の重度の減少を防止したことを示す（表５）。

【0274】

異種移植部位に可視の腫瘍を持つ動物の割合は、ＣＨＯ／アクチビン移植後１２日目の末期剖検時に解析した。表５に示すように、データは、ビヒクルグループの８０％のマウスが、注射部位で視覚的に同定可能な異種移植腫瘍を発生したことを明らかにした。抗アクチビンＡ単クローン抗体処置グループにおいて、可視の腫瘍形成率の有意な減少を観察した。

【0275】

剖検後、ＣＨＯ／アクチビン異種移植部位の全ての視覚的に同定可能な腫瘍を、動物から解離し、秤量した。ビヒクルグループと比べて、腫瘍量の優位な減少がアクチビンＡ単クローン抗体処置グループにおいて観察された（表５）。

【0276】

【表5】

異種移植腫瘍発生に関する上記の実験は、癌からの生存を促進させるための抗アクチビンＡ抗体の使用に関して、いくつかの結論を導いた。アクチビンＡは、ＣＨＯ／アクチビン異種移植を持つヌードマウスにおいて、悪液質症候群の発生に因果的役割を果たした。体重減少は、このモデルにおける血清アクチビンレベルの減少と良好な相関関係を持った。抗アクチビンＡ単クローン抗体は、ＣＨＯ／アクチビン異種移植腫瘍を持つマウスに見られる体重減少および悪液質症候群を防止した。抗アクチビンＡ単クローン抗体は、異種移植増殖を抑制し、それによって、可視の異種移植腫瘍を持つマウスの割合を有意に低下させ、異種移植腫瘍のサイズを減少させた。抗アクチビンＡ単クローン抗体は、ＣＨＯ／アクチビン異種移植に起因する死亡を防止し、動物の生存を顕著に促進させた。

【実施例11】

【0277】

（実施例１１）
ＡＡＶアクチビンマウスにおける抗アクチビン単クローン抗体Ａ１

アクチビンＡの生後過剰発現は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて重度の悪液質様の消耗症候群をもたらした。体重は、１日目、４日目、９日目および１１日目にわたって、１６グラムから１４、１２．５に、１１日目には最終的に１０．５グラムにまで減少した。また、脂肪重量、除脂肪屠体重量および腓腹筋重量の減少もあった。

【0278】

アクチビンＡに対して作られた抗体が、アクチビンＡの効果を軽減または防止するかどうかを判定するため、以下の実験を行った。ＡＡＶアクチビンまたは空ＡＡＶベクター（対照）を、尾静脈を介して８週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝１０−１２）に、１ｘ１０^１３ｐｆｕ／マウスで注射した。図５は、１日目、５日目、８日目および１２日目の形質導入マウスにおける体重変化に対する抗アクチビンＡ単クローン抗体Ａ１の効果を示す。抗体は、対照マウスに観察された体重の変化を防止した。抗体処置は、この動物モデルにおける食物摂取量を促進させた。

【実施例12】

【0279】

（実施例１２）
結腸２６癌悪質液モデルにおける体重および除脂肪体重減少に対する抗アクチビンＡ単クローン抗体Ａ１の保護効果

この実施例は、マウス癌悪液質モデルにおける抗アクチビンＡ単クローン抗体Ａ−１の効果を防止する筋肉を実証する。癌悪液質のモデルは、０日目に８．５週齢の雄のＣＤＦ１マウス（０．５ｘ１０^６細胞／マウス）において、同質遺伝子的マウス結腸２６腺癌細胞接種を使用して確立した。抗アクチビンＡ単クローン抗体Ａ−１処置（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）は、４日目に開始し、１８日間週３回行った。ナトリウム酢酸塩緩衝液（１０ｎｍナトリウム酢酸塩、５％スクロース、ｐＨ５．０）は、腫瘍を持つ対照グループマウスにおいてビヒクルとして使用した。年齢および体重を適合させた腫瘍を有さない正常ＣＤＦ１マウスの１グループを、対応するベースライン対照として使用した。体重および食物摂取量は、毎週３回監視した。腫瘍サイズは、デジタル測径器で週３回測定した。体組成は、除脂肪量および脂肪量の変化を監視するために、研究の始めおよび最後にＮＭＲを使用して測定した。実験の最後に、マウスをＣＯ_２チャンバ内で安楽死させた。末期ブロック試料を収集し、血清アクチビンＡレベルをＥＬＩＳＡで解析した。除脂肪屠体を秤量および記録し、腓腹筋および腫瘍を秤量し、適切に保存した。

【0280】

全ての結果は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。対応のないｔ−検定を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェアを使用することによって、グループ間の統計的差異を決定するために行った。ビヒクルからの統計的有意性は、０．０５未満のｐ値で表した。

【0281】

データは、Ａ−１処置マウスが、ビヒクル処置マウスよりも有意に高い体重を有したことを示す（２１．３０±０．５４ｇ対１９．２１±０．３８ｇ、Ｐ＜０．０５、１５日目および１９．６６±０．２２ｇ対１８．１１±０．１９ｇ、Ｐ＜０．０５、１８日目）。年齢を適合させた腫瘍を持たないマウスと比べて、ビヒクルで処置した腫瘍を持つマウスは、有意な体重減少があった（２５．４８±０．３５ｇ対１８．１１±０．１９ｇ、ｐ＜０．００５）。したがって、アクチビンＡ抗体処置は、体重の維持に役立った。

【0282】

腫瘍増殖は、デジタル化測径器測定で監視し、腫瘍サイズは、腫瘍寸法（ｍｍ^３＝Ｌ（ｍｍ）＊Ｗ（ｍｍ）＊Ｗ（ｍｍ）＊０．５の方程式で計算した。腫瘍サイズは、抗体Ａ１処置およびビヒクル処置の２つのグループ間で異ならなかった。

【0283】

Ｃ−２６腫瘍細胞接種の後、ビヒクル処置グループのマウスは、腫瘍を持たないマウスと比べて劇的な体重減少を有した（２５．４８±０．３５ｇ対１８．１１±０．１９ｇ、ｐ＜０．０１）。しかしながら、Ａ−１処置は、平均の体重減少を減弱させた（１９．６６±０．２２ｇ対１８．１１±０．１９ｇ、Ｐ＜０．０５）。

【0284】

Ａ−１処置は、骨格筋肉量の有意な維持に繋がった。Ａ−１処置マウスは、Ｃ２６ビヒクル処置グループにおけるものよりも、多い重量の腓腹筋量（０．０９９±０．００２ｇ対０．０９±０．００１、ｐ＜０．０５）を有した。

【0285】

実験の最後に、末期組織解離を行った。対照Ｃ−２６腫瘍を持つマウスは、抗体Ａ１処置マウスのものよりも、著しく低い除脂肪屠体重量（６．７５±０．１１ｇ）を有した（７．２０±０．１６ｇ、ｐ＜０．０５対Ｃ−２６＋ビヒクルグループ）。

【0286】

除脂肪体重は、Ｃ−２６ビヒクル処置グループにおいて顕著に減少した（それらの初期除脂肪体重と比べて、−１．８５±０．２４ｇ）。Ｃ−２６腫瘍を持つマウスにおけるＡ−１での処置は、除脂肪体重の減少を有意に減弱させた（−０．６０±０．２６ｇ、ｐ＜０．０５対Ｃ２６−ビヒクルグループ）。

【0287】

抗アクチビンＡ単クローン抗体Ａ１処置は、癌悪液質誘発の全体重減少の減弱に効果的である。抗体Ａ１の保護効果は、十分に確立されたマウス癌悪液質動物モデルにおいて骨格筋肉量、除脂肪屠体体重および総除脂肪体重を保つことに関連する。

【0288】

本研究は、アクチビンＡの中和が、単クローン抗体Ａ１を使用して、有意に体重減少を減弱させ、骨格筋肉および除脂肪体重を維持した前臨床根拠を提供する。

【実施例13】

【0289】

（実施例１３）
アクチビンＡ ＥＬＩＳＡ
アクチビンＡに対する抗体は、生体試料等の試料中のアクチビンＡをアッセイおよび定量化するために使用することができる。組み換えヒトアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ、カタログ番号１０−８５１０６）およびアッセイ希釈緩衝液（０ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号１０−８５１０１）をＤＳＬａｂｓ（Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｔｅｘａｓ）から購入し、４℃で保存した。標準物質は、アッセイ緩衝液に希釈することによって実験前に新たに調製した。

【0290】

ヒト血清は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から取得した。アクチビンＡ測定のための血清は、凍結融解に起因する変動を最小化するために、１１０μｌに分注した。試料は、アッセイ緩衝液で１／３に希釈し、ＥＬＩＳＡで測定した。

【0291】

以下のステップを使用して、アクチビンＡＥＬＩＳＡ（一段階ＥＬＩＳＡ）を行う。

【0292】

Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ３５９０ ９６ウェルプレートは、５００〜６００ｒｐｍで徐々に振盪させながら、１００μｌの４μｇ／ｍＬ抗アクチビンＡ単クローン抗体（Ａ２）で、一晩室温で被覆した。ウェル（４００μｌ／ウェル）は、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。ウェルを３００μｌのブロッキング緩衝液において、室温で２時間ブロックし、次いで、ブロッキング緩衝液を除去した。

【0293】

１００μｌの標準アクチビンＡ／または１００μｌの希釈試料を加え、２５μｌの０．５μｇ／ｍＬ抗アクチビンＡ単クローン抗体−ＨＲＰ標識（Ａ１／ＨＲＰ）をアッセイ緩衝液に加えた。遊離アクチビンＡ測定のために、血清をアッセイ緩衝液で１／３に希釈した。総アクチビンＡ測定のために、血清を、（１）２０％ＨＣＬ（１１０μｌ血清ごとに２μｌ）で酸性化（ｐＨ４−５）し、（２）室温で１５分間インキュベートし、（３）２μｌの５Ｎ ＮａＯＨ（１１０μｌ血清ごとに２μｌ）を加えることによって中和し、（４）アッセイ緩衝液で１／３に希釈した。

【0294】

インキュベーションを、６００〜７００ｒｐｍで振盪させながら、室温で２時間行った。ウェル（４００μｌ／ウェル）は、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を加え、続いて、室温で２０分間インキュベーションを行った。５０μｌの停止液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を加えた。ＯＤ測定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５で４５０ｎｍを使用して行った。

【0295】

標準曲線は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅの対数−対数（または５パラメータロジスティック）曲線適合プログラムを使用することによって、４５０ｎｍでの吸光度対ｒｈアクチビン濃度の対数をプロットして生成した。試料濃度に対する値は、標準からのそれらの吸光度の補間によって取得した。

【0296】

捕獲抗体は、Ａ−３抗アクチビンＡ単クローン抗体、２０．７８ｍｇ／ｍｌであった。検出抗体は、Ａ−１抗アクチビンＡ単クローン抗体−ＨＲＰ、０．６５ＨＲＰ／Ａｂ、１２．０５ｍｇ／ｍｌであった。ブロッキング緩衝液は、Ｉブロッキング緩衝液であった。洗浄緩衝液は、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０であった。アッセイ緩衝液（Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｌｕｅｎｔ）は、０ｍｇ／ｍｌアクチビンＡ緩衝液であった。

【実施例14】

【0297】

（実施例１４）
アクチビンＡプロテアーゼ保護解析
プロテアーゼ保護アッセイを、アクチビンＡ抗体のエピトープ結合を同定するために行った。組み換えヒトアクチビンＡ分解製剤を３つの方法で解析した。第１の方法は、精製時に分解されたアクチビンＡ製剤を検査した。第２の方法は、リジンＣ、キモトリプシン、ペプシンおよびサーモリシンを用いたアクチビンＡ製剤のタンパク質分解を含んだ。第３の方法は、臭化シアンする製剤の化学分解を含んだ。

【0298】

したがって、ヒトアクチビンおよび抗体複合体のタンパク質分解のために、５マイクログラムのアクチビンＡおよび９０マイクログラムの抗体を１００マイクロリットルの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）中で混合し、重量で２％の特定の選択プロテアーゼで処置する前に約２０分間室温に保った。タンパク質の消化は、摂氏３７度で９０分間進行することができた。アクチビンＡ単独または抗体単独を含有する対照試料を、同一の方法で行った。試料をＲＰ−ＨＰＬＣ解析の前に酸性化した。

【0299】

アクチビンＡの臭化シアン消化のために、アクチビンＡのＣＮＢｒ断片は、１００マイクロリットルの９０％ＴＦＡ中ＣＮＢｒで、１０マイクログラムのタンパク質を一晩室温でインキュベートすることによって産生した。試料は、インキュベーションの間中、暗闇の状態に保ち、ＲＰ−ＨＰＬＣ解析の前に真空下で乾燥させた。

【0300】

ＲＰ−ＨＰＬＣは、上記のように産生された断片を解析するために利用した。簡潔に言えば、カラムは、溶剤で平衡化し、試料を注射して、カラムは、線形勾配を適用する前に溶剤で洗浄した。カラム流出液を２１５ｎｍにおける吸光で監視した。溶出した試料は、手で収集し、Ｅｄｍａｎ分解および質量分析法で解析した。

【0301】

精製時に分解された製剤は、以下の種を含有した。
１．Ｇｌｙ^１−Ｈｉｓ^５９（６，４５６．２Ｄａ）
２．Ｓｅｒ^６０−Ｔｙｒ^９４（４，１０２．９Ｄａ）
３．Ａｓｐ^９５−Ｓｅｒ^１１６（２，４５２．８Ｄａ）
４．Ｇｌｙ^１−Ｔｙｒ^９４（１０，５４１．１Ｄａ）
キモトリプシン様の活性により分解された製剤は、配列番号：２２５で示す位置で開裂される以下の種を有した。

【0302】

１．_１ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＩＣＣＫＫＱＦＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩ^３０（配列番号２６２）
２．_３１ＡＰＳＧＹＨＡＮＹＣＥＧＥＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨ↓Ｓ_６０（配列番号２６３）
３．_６１ＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＬＫＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳ_９０（配列番号２６４）
４．_９１ＭＬＹＹ↓ＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ_１１６（配列番号２６５）

図９に記載する種は、アクチビンＡ製剤がキモトリプシン、リジンＣ（ＬｙｓＣ）、または臭化シアン（ＣＮＢｒ）によって分解される時の開裂部位の位置を示す。

【実施例15】

【0303】

（実施例１５）
アクチビンＡ結合アッセイ
単クローン抗体Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、表６にリストした結合親和性によれば、アクチビンＢではなくアクチビンＡと結合する。したがって、アクチビンＡ抗体Ａ１、Ａ２、およびＡ３の親和性解析を、中和抗体結合に必要とされる領域または構造を決定するために行った。ＡｃｔＲＩＩ（Ａ／Ｂ）、ＡｃｔＲＩ（Ａ／Ｂ）（Ａｌｔ４）、フォリスタチン、およびフォリスタチン関連遺伝子（ＦＬＲＧ）を含む、いくつかのアクチビンＡ結合タンパク質が既知である。

【0304】

結合アッセイは、固定化抗体表面（アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ）と結合するためのそれらの能力を評価するため、抗体をスクリーニングするために行った。結合アッセイは、２ｎＭ ｒｈアクチビンＡおよび２０ｎＭの表面に固定化された各抗体を利用して行った。以下の抗体を表面に固定化して、試験を行った。ＡＫＡ１（市販）、ＡＫＡ２（市販）、Ａ１、およびＡ３。抗体アッセイの結果を図１０に示す。

【0305】

【表6】

【実施例16】

【0306】

（実施例１６）
アクチビンＡ結合アッセイ領域マッピング（Ｂｉａｃｏｒｅ）
ブロッキングアッセイは、実施例５に記述したように、固定化した組み換えヒトアクチビンＲＩＢ−Ｆｃキメラ表面、組み換えヒトアクチビンＲＩＩＢ−Ｆｃキメラ表面、および組み換えヒトＲＩＩＡ−Ｆｃキメラ組み換え表面上で行った。各キメラ表面上の単クローン抗体Ａ１、Ａ２、ＡＫＡ１、およびＡＫＡ２を１ｎＭアクチビンＡでインキュベートし、相対結合反応（％）を測定した。抗体の存在下における結合反応の増加は、アクチビンＡが、固定化された受容体表面と溶液中の抗体とに同時に結合できることを示し、これを「キャリーオン」と称す。結果を表７および図１１に示すが、ＥＣ５０は、５０％結合を産出する有効な濃度を意味する。

【0307】

【表7】

【実施例17】

【0308】

（実施例１７）
アクチビンＡ／Ｂキメラ
アクチビンＡ／Ｂキメラを、実施例５および１６に記述したように、単クローン抗体Ａ１、Ａ２、およびＡ３のエピトープ結合能力をさらに評価するために産生した。図１２に示すように、２つのキメラを試験した。アクチビンＡ１３／３９Ｂ（アクチビンＡの位置３〜３９でのアミノ酸が、アクチビンＢの位置１３〜３９にある対応するアミノ酸で置換される点を除き、アクチビンＡのアミノ酸１〜１１６を含有する−配列番号：２４３）、およびアクチビンＡ８２／１０７Ｂ（アクチビンＡの位置８２〜１０７でのアミノ酸が、アクチビンＢの位置８２−１０７での対応するアミノ酸で置換される点を除き、アクチビンＡのアミノ酸１〜１１６を含有する−配列番号：２４４）。

【0309】

簡潔に言えば、全長アクチビンＡクローンは、成熟タンパク質配列の始めで、Ｐｆｕ ｕｌｔｒａポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマ（配列番号：２４５および配列番号：２４６）を使用するＰＣＲによる増幅のために、鋳型として使用した。結果として生じるＰＣＲ産物をカラム精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、ＳａｌＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化させ（Ｒｏｃｈｅ）、ゲル単離した（Ｑｉａｇｅｎ）。修飾された成熟タンパク質配列を含有する合成遺伝子カセットは、Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０．４，ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．）（ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７：２８５（２００６））を使用することによって、全長アクチビンＡおよびアクチビンＢからのアミノ酸配列を利用し、哺乳類宿主細胞内の発現に最適化されたＤＮＡ配列コドンに翻訳し戻すことによって設計した。配列をＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル単離した。アクチビンＡＰＣＲ産物は、１３〜３９合成遺伝子断片（配列番号：２４７）または８２〜１０７合成遺伝子断片（配列番号：２１３）のいずれか一方を有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）およびＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化された発現ベクター（ｐＤＲＳａｌｐｈａ２４）を使用して、標準の反応条件化で連結し、全長発現コンストラクトを生じた。アクチビンＢ配列（配列番号：２４７）で交換されたアミノ酸１３〜３９を有するアクチビンＡの合成遺伝子コンストラクトおよびアクチビンＢ配列（配列番号：２４８）で交換されたアミノ酸８２〜１０７を有するアクチビンＡの合成遺伝子コンストラクトを、次いで、エピトープマッピング実験に利用した（結果を図１２に示す）。

【0310】

前述から、本発明の特定の実施形態は、例証の目的で本明細書に記述したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除き限定されない。本明細書に開示した全ての公報、公開特許出願、および特許文書は、参照により本願明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]