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▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5986575
(24)【登録日】2016年8月12日
(45)【発行日】2016年9月6日
(54)【発明の名称】精神病状態の制御および特徴付け
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20060101AFI20160823BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20160823BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20160823BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20160823BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20160823BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20160823BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027ZNA
C12N5/10
C12Q1/02
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
!C12N15/00 A
【請求項の数】21
【全頁数】37
(21)【出願番号】特願2013-537878(P2013-537878)
(86)(22)【出願日】2011年11月4日
(65)【公表番号】特表2013-544091(P2013-544091A)
(43)【公表日】2013年12月12日
(86)【国際出願番号】US2011059383
(87)【国際公開番号】WO2012061741
(87)【国際公開日】20120510
【審査請求日】2014年10月31日
(31)【優先権主張番号】61/410,720
(32)【優先日】2010年11月5日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】61/410,725
(32)【優先日】2010年11月5日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100149294
【弁理士】
【氏名又は名称】内田 直人
(72)【発明者】
【氏名】ダイスロス，カール
(72)【発明者】
【氏名】ソハール，ヴィカス
(72)【発明者】
【氏名】ギュナイドゥン，リサ
【審査官】
太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１０／０５６９７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Neuron,2007 Apr 19,54(2),p.205-18
【文献】
Proc Natl Acad Sci U S A.,2007 May 8,104(19),p.8143-8,Epub 2007 May 1
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ０１Ｋ ６７／０２７
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＣｉＮｉｉ
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
精神病を治療するために有用である可能性のある化合物をスクリーニングする方法であって、非ヒト動物に化合物を投与する前および後に前記動物の精神病状態を測定することを含み、非ヒト動物は前頭前皮質におけるＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜に発現された光応答性オプシンを含み、前記精神病状態は光応答性オプシンの光活性化によって誘発され、前記オプシンの光活性化は前記膜の脱分極を誘発し、化合物の投与後の精神病状態の測定値のうちの１つ以上における改善が前記化合物が精神病を治療するために有用である可能性があることを示す、方法。
【請求項2】
光応答性オプシンが配列番号１〜７のいずれかに対して９０％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
光応答性オプシンが配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
光応答性オプシンが配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
光応答性オプシンが配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
光応答性オプシンが配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
光応答性オプシンが配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
光応答性オプシンが配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
光応答性オプシンが配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
光応答性オプシンがＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、およびＤＣｈＲからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
光応答性オプシンがＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
光応答性オプシンの発現がＴｈｙ１プロモーターによって制御される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
化合物を投与する前に動物にＤ２刺激薬を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
精神病状態の測定が行動測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
行動測定が社会的探索行動である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
精神病状態の測定が細胞測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
精神病を治療するための候補化合物を同定する方法であって、前頭前皮質におけるＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜に発現された光応答性オプシンを含む非ヒト動物から得られた前頭前皮質組織切片における細胞応答を、組織切片を前記化合物とインキュベートする前および後に測定することを含み、前記細胞応答が光応答性オプシンの活性化によって誘発されたニューロンの膜脱分極によって誘発され、化合物を用いてインキュベートした後の細胞応答の読み出し情報の改善が当該化合物が精神病の治療の候補化合物であることを示す、方法。
【請求項18】
細胞応答が活性依存性脱分極である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
光応答性オプシンが配列番号１〜７のいずれかに対して９０％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
光応答性オプシンがＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、およびＤＣｈＲからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
光応答性オプシンがＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照本出願は、２０１０年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，７２０号、および２０１０年１１月５日に出願された第６１／４１０，７２５号の優先権の利益を主張するものであり、それらの各々の内容は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本出願は、前頭前皮質におけるＶ層錐体ニューロンのサブセットの形質膜上に発現される光応答性オプシンタンパク質を使用して、非ヒト動物において精神病を誘発するための方法と、精神病を治療するために使用できる可能性のある化合物を同定またはスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
統合失調症は、世界中の人口の約１％に発症し、先進国における能力障害の原因の上位１０位を占めているが、現在の薬物療法は無効であることが多く、治療を制限する重篤な副作用を誘発する。前頭前皮質（ＰＦＣ）の機能不全は、統合失調症の最も消耗性の態様の多くの根底にあると広く考えられているが（１、２）、細胞生理の特定の態様を統合失調症における前頭前野の機能不全の原因として関連付けることができていない。統合失調症および関連する状態において観察される精神病的行動および認知障害の考えられる細胞的基盤を探求するために、（１）精神病的行動と関連性のあるニューロンにおいて起こり、（２）統合失調症と関連する複数の薬理学的または遺伝子操作によって生じ、（３）精神病についての細胞のエンドフェノタイプとしての表面的妥当性を有する、細胞行動のパターンを同定しようとした。
【0004】
統合失調症の多くの消耗性の態様は、前頭前皮質の機能不全によるものであると考えられているが、前頭前野のニューロンにおける活性の特定の病原性パターンが未知のままであるため、この機能不全の生理は謎である。ＰＦＣ領域内の精神病に関連する活性パターンと関係する神経路を同定および理解することは、統合失調症に罹患する患者を治療するための薬理学的療法を発見する上で役立つ可能性がある。しかしながら、これらの複雑な神経の病原性経路の同定を可能にする、統合失調症のための有用な動物モデル系の必要性が依然として存在する。そのような動物モデル系により、統合失調症の症状に寄与する神経活動の病原性パターンを改善する薬理学的療法のスクリーニングおよび同定が可能になる。
【発明の概要】
【0005】
いくつかの態様において、前頭前皮質においてＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に発現される光応答性オプシンを含む非ヒト動物であって、オプシンの光活性化は膜の脱分極を誘発し、光を用いたオプシンの照射は動物の精神病を誘発する、非ヒト動物が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットは、１本の太い尖端樹状突起を有する。いくつかの実施形態において、オプシンは、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、およびＤＣｈＲからなる群から選択される。別の実施形態において、オプシンは、ＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔからなる群から選択される。
【0006】
他の態様において、非ヒト動物において精神病を誘発する方法であって、動物の前頭前皮質においてＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に光応答性オプシンを発現させることであって、オプシンは光による膜の脱分極を誘発し、光を用いたオプシンの照射は動物の精神病を誘発する、発現させることを含む方法が、本明細書に提供される。他の態様において、非ヒト動物において精神病を誘発する方法であって、光によって光応答性オプシンを活性化することであって、光応答性オプシンは、動物の前頭前皮質においてＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に発現され、オプシンの光活性化は、細胞膜の脱分極を誘発し、かつ動物において精神病を誘発する、活性化することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットは、１本の太い尖端樹状突起を有する。いくつかの実施形態において、オプシンは、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、およびＤＣｈＲからなる群から選択される。別の実施形態において、オプシンは、ＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔからなる群から選択される。
【0007】
他の態様において、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットを含む前頭前皮質組織片であって、光応答性オプシンは、Ｖ層錐体ニューロンの尖端樹状突起の細胞膜上に発現され、光応答性オプシンの光活性化は膜の脱分極を誘発する、前頭前皮質組織片が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットは、１本の太い尖端樹状突起を有する。いくつかの実施形態において、オプシンは、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、およびＤＣｈＲからなる群から選択される。別の実施形態において、オプシンは、ＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔからなる群から選択される。
【0008】
さらに他の態様において、精神病を治療するために有用である可能性のある化合物をスクリーニングする方法であって、非ヒト動物の前頭前皮質に化合物を投与する前および後に動物の精神病状態を測定することであって、精神病状態は、動物においてＶ層錐体ニューロンの対象の細胞膜上に発現される光応答性オプシンの光活性化によって誘発され、オプシンの光活性化は膜の脱分極を誘発する、測定することを含み、化合物の投与後の精神病状態の測定値のうちの１つ以上における改善は、化合物が精神病を治療するために有用である可能性があることを示す、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、精神病状態の測定は、行動測定である。いくつかの実施形態において、精神病状態の測定は、細胞測定である。いくつかの実施形態において、本方法は、化合物の投与前に、動物にＤ２刺激薬を投与するステップをさらに含む。
【0009】
いくつかの態様において、精神病を治療するために有用である可能性のある化合物をスクリーニングする方法であって、化合物とともに前頭前皮質組織片をインキュベートする前および後に組織片の精神病状態を測定することであって、前頭前皮質組織片は、Ｖ層錐体ニューロンの対象を含み、光応答性オプシンは、Ｖ層錐体ニューロンの対象の細胞膜上に発現され、精神病状態は、光応答性オプシンの活性化によって誘発されるニューロンの膜脱分極によって誘発される、測定することを含み、化合物を用いたインキュベーションの後の精神病状態の読み出し情報のうちの１つ以上における改善は、化合物が精神病を治療するために有用である可能性があることを示す、測定することを含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、精神病状態の測定は、細胞測定である。いくつかの実施形態において、本方法は、化合物を用いたインキュベーションの前に、前頭前皮質組織片とともにＤ２刺激薬をインキュベートするステップをさらに含む。
【0010】
本開示は、本明細書に記載されるような種々の精神障害に関与する神経細胞集団を同定することに関する。本開示は、必ずしもこれらの状況に限定されるわけではないが、本発明の種々の態様は、これらのおよび他の前後関係を用いて、例の考察を通して理解されてもよい。
【0011】
本開示の態様は、種々の精神障害に関連する神経細胞集団を同定する方法を対象としている。本方法は、光応答性オプシンを発現する標的ニューロン集団に光刺激を提供することを含む。光刺激に応じた標的ニューロン細胞集団の第１の電気パターンが測定される。次いで、対象となる障害を誘発することが分かっている薬物が、標的ニューロン細胞集団に導入される。再び、標的ニューロン集団に光刺激が提供される。光刺激に応じた標的ニューロン細胞集団の後続の電気パターンが測定される。次いで、第１の電気パターンと後続の電気パターンが比較される。電気パターンの比較は、例えば、疾患様状態を形成するのにどのニューロンが関与しているかを判定するために使用することができる。特定のニューロン集団が同定された後、特定のニューロン集団において後続の潜在的治療薬を標的にすることができる。代替として、例えば、異常行動の背景にある機構を判定するために、特定のニューロン集団に関する追加の試験が行われてもよい。
【0012】
本開示の態様は、対象とする障害を誘発することが分かっている薬物の導入前および導入後に、対象とする標的ニューロン集団の電気的活性を比較することを対象としている。薬物の導入前および導入後の両方に刺激が提供され、薬物に対する電気的応答パターンが比較される。刺激は、例えば、光刺激、電気刺激、または磁気刺激であってもよい。
【0013】
特定の具体的な実施形態において、脳内の対象となる領域が選択される。この選択は、脳の機能、および精神障害を標的とする薬物が作用する機構に関する以前の知識に基づいて行われてもよい。例えば、Ｖ層錐体ニューロンは、以前に特定の形態の精神病と関連付けられた。本発明の態様は、光刺激と、異常行動を誘発することが以前に発見された物質を導入することによる対象における異常行動の誘発との組み合わせを用いてＶ層錐体ニューロンを調べることにより、精神病的行動と関連する錐体ニューロンのサブセットの同定を可能にした。
【0014】
この精神病的行動と関連するニューロン集団の同定により、種々の精神病的行動のための可能性のある治療薬の効率的な試験が可能になる。一旦、精神病を発症している間の特定のニューロンの反応が解明され、精神病が導入されていないときの反応と比較されると、治療薬がニューロンの反応をそのベースラインの状態に戻す能力に基づいて、種々の治療薬を試験することができる。
【0015】
本開示の特定の態様はまた、精神病の原因となる脳内の機構および特定のニューロン集団についてより深い理解を得ることを対象としている。具体的な対象となるニューロンが同定された後、ニューロン内のチャネル、およびニューロンを他のニューロンと接続する経路についてさらに詳細に調べることができる。これにより、種々の形態の精神病の原因に関する新たな知見をもたらすことができる。
【0016】
本開示はさらに、本明細書に記載されるような精神病（および／または精神病の症状）を含む種々の精神障害に関与する特定の神経細胞集団に関する。本開示は、必ずしもこれらの状況に限定されるわけではないが、本発明の種々の態様は、これらのおよび他の前後関係を用いて、例の考察を通して理解されてもよい。
【0017】
本開示の態様は、精神病（および／または精神病の症状）を含む種々の精神障害に関連する特定の神経細胞集団に関与する方法を対象としている。本方法は、光応答性オプシンを発現する標的ニューロン集団に光刺激を提供することを含む。光刺激に応じた標的ニューロン細胞集団の第１の電気パターンが測定される。次いで、精神病の症状を誘発することが分かっている薬物が、標的ニューロン細胞集団に導入される。再び、標的ニューロン集団に光刺激が提供される。光刺激に応じた標的ニューロン細胞集団の後続の電気パターンが測定される。次いで、第１の電気パターンと後続の電気パターンが比較される。電気パターンの比較は、例えば、疾患様状態を形成するのにどのニューロンが関与しているかを判定するために使用することができる。特定のニューロン集団が同定された後、特定のニューロン集団において後続の潜在的治療薬を標的とすることができる。代替として、例えば、異常行動の背景にある機構を判定するために、特定のニューロン集団に関する追加の試験が行われてもよい。特定の実施形態において、追加の試験は、光刺激、電気刺激、および／または磁気刺激を含む様々な刺激を使用して行われてもよい。
【0018】
本開示の態様は、精神病に関与することが分かっている標的ニューロン集団の特性を制御することによって病態を誘発することを対象としている。標的ニューロン集団のニューロンは、１本の太い尖端樹状突起を有する。標的ニューロン集団は、光応答性分子で修飾される。標的ニューロン集団に光が提供され、それによって光応答性分子を活性化する。標的ニューロン集団に薬物が導入され、光の除去後にニューロンの膜電位を上昇した状態に保つ。膜電位の上昇は、刺激に対する細胞応答の修飾をもたらし、また刺激が存在しない場合はニューロンの活性化をもたらす。実験の結果は、１本の太い尖端樹状突起を有する特定のニューロン集団において誘発されるこのニューロン活性を有する対象が、精神病と一致する行動を示すことを示している。
【0019】
より具体的な実施形態において、この修飾されたニューロン活性は、精神病のための可能性のある治療薬を決定する際の補助として使用される。病態は、種々の潜在的治療薬を試験する前に誘発されてもよい。試験は、ニューロンに治療薬を導入すること、ニューロンを刺激すること、および治療薬の存在下における応答を治療薬の非存在下における応答と比較することとを含むことができる。
【0020】
そのような方法および装置に関連するおよび／またはそれらを使用する種々の実施形態は、とりわけ、図面および／または以下の考察を考慮して、当業者によって理解されてもよい。上記概要は、例示される各実施形態または本開示のあらゆる実施について記載することを企図するものではない。本明細書の教示と様々な程度で組み合わせられてもよい他の実施形態、実験、および用途の詳細に関する情報については、本特許文書の一部を形成し、参照により本明細書に完全に組み込まれる、実施例に提供される教示および基本となる参考文献が参照されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0021】
種々の例示的な実施形態は、添付の図面と関連して以下の詳細な説明を考慮すると、より完全に理解することができる。【図1】Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスの下辺縁Ｖ層錐体ニューロンの光刺激によって誘発された精神病様行動を示す。Ａ）下辺縁皮質の上の片側光ファイバの設置の略図。Ｂ）Ｖ層下辺縁皮質の上の光ファイバの設置（左パネル）、およびＶ層ニューロンにおけるＣｈＲ２−ＥＹＦＰの発現（右パネル）を示す、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰマウスにおける前頭前皮質の冠状切片の共焦点像。Ｃ）４７３ｎｍ青色光（１０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅）を用いたＶ層ニューロンの低周波光刺激は、試験を行った６頭のＴｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ動物のうちの６頭において新生幼獣の社会的探索行動を有意に低下させた（ｐ＝０．０３、光オン／光オフの時期を交互に用いた）。Ｄ）（Ａ）に示されるような１０Ｈｚの刺激が社会的探索行動に及ぼす影響についての要約データ。Ｅ）１０Ｈｚの光刺激がＴｈｙ１：：ＣｈＲ２動物の全体的な速度（左）またはトラック長（右）に影響を及ぼさなかったことを示す要約オープンフィールドデータ。Ｆ）４７３ｎｍ青色光（４０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅）を用いたＶ層ニューロンのγバンドの光刺激は、試験を行った６頭の動物のうちの６頭において新生幼獣の社会的探索行動をより強力に排除した（ｐ＜０．０１、光オン／光オフの時期を交互に用いた）。Ｇ）（Ｆ）に示されるような４０Ｈｚの刺激が社会的探索行動に及ぼす影響についての要約データ。Ｈ）４０Ｈｚの光刺激は、試験を行った６頭のマウスのうちの３頭において緊張病様硬直姿勢で過ごす時間を有意に増加させ（ｐ＜０．０５）、試験を行った６頭のマウスのうちの２頭において、反復性の頭部左右運動に執着して過ごす時間が増加する傾向が観察された（ｐ＝０．１３）。
【図2】Ｄ２刺激薬キンピロールは、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスにおけるＣｈＲ２の刺激に対するインビトロでの前頭前野ネットワークの応答を調節することを示す。Ａ）対照条件（上、黒色の波形）およびキンピロール（２０μＭ、紫色、下の波形）における一連の閃光（４７０ｎｍ、１ミリ秒）に対するＶ層錐体ニューロンの応答。キンピロールの適用後、以前にスパイクを誘起したいくつかの閃光はもはやスパイクを誘起せず（矢印）、閃光とは関係のないいくつかの新しいスパイクが生じ（「＋」）、プラトー電位（「ｐ」）が観察された。Ｂ）キンピロール（２０μＭ、紫色、中央の波形）の適用後、このＶ層錐体ニューロンは、光刺激の期間よりも長く持続する長期脱分極を示し、スパイクを生成する。キンピロールを洗い流してハロペリドールを適用した後、長期脱分極が消失した（１μＭ、緑色、下の波形）。Ｃ）キンピロールが活性依存性脱分極を誘発するＶ層錐体ニューロンにおいて、そのスパイクレートが伝達する閃光レートに関する情報の量（対照および２０μＭキンピロールではｎ＝８個の細胞、ハロペリドール０．２〜２μＭまたはスルピリド５μＭ中ではｎ＝４個の細胞）。Ｄ）キンピロールが（Ｂに示すような）活性依存性脱分極を誘発するＶ層錐体ニューロンの閃光レートの関数としてのスパイクレート（ｎ＝各条件につき４個の細胞、ハロペリドール０．２〜２μＭ、スルピリド５μＭ）。対照（（Ｄ）の右側部分で終わる上の波形）、キンピロール（（Ｄ）の右側部分で終わる中央の波形）、およびハロペリドール／スルピリドの波形（（Ｄ）の右側部分で終わる下の波形）を（Ｄ）に示す。Ｅ）Ｃに示されるのと同じ細胞のスパイク間間隔の関数としてのスパイクの数。対照（（Ｅ）の左側部分から始まる上の波形）、キンピロール（（Ｅ）の左側部分から始まる中央の波形）、およびハロペリドール／スルピリドの波形（（Ｅ）の左側部分から始まる下の波形）を（Ｅ）に示す。Ｆ）対照条件（黒色の波形、（Ｆ）の右側部分で終わる上の波形）、キンピロール（２０μＭ、紫色の波形、（Ｆ）の右側部分で終わる下の波形）、およびキンピロール＋スルピリド（５μＭ、緑色の波形、（Ｆ）の右側部分で終わる中央の波形）において、１回の１ミリ秒の閃光後にＣｈＲ２およびネットワークによって引き起こされる活性の組み合わせに対するＶ層錐体ニューロン（キンピロールが活性依存性脱分極を誘発する）の応答。矢印は、スパイクＡＨＰを意味する。
【図3】Ｄ２受容体の活性化が、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルによって媒介される活性依存性脱分極を誘発することを示す。Ａ、Ｃ、Ｇ）種々の薬理学的条件における過分極電流パルスおよび／または脱分極電流パルスに対するＶ層錐体ニューロンの応答。Ｂ）キンピロールにおける脱分極電流パルスに対する応答の間に活性依存性脱分極および後脱分極を誘発する（左）および誘発しない（右）Ｖ層錐体ニューロンの形態（各細胞の下の脱分極電流パルスおよび過分極電流パルスに対する応答）。Ｄ）上：対照条件（黒色、左のバー）またはキンピロール（紫色、右のバー）における２５０ｐＡの脱分極電流パルスの後に、ベースラインに向かって６３％または９０％減衰するための膜電位の時定数。キンピロールにおいて双安定となった（すなわち、膜電位が＞１秒でベースラインに戻ることができなかった）３個の細胞を除外したことに留意されたい。下：対照条件（黒色）またはキンピロール（紫色）における２５０ｐＡの脱分極電流パルスの停止から１０ミリ秒後の膜電位（ベースラインに対する）。Ｅ）２０μＭキンピロールの適用後に、脱分極電流の注入後の後脱分極（ＡＤＰ）、脱分極によるスパイクの阻止（脱分極遮断）、双安定性、または脱分極電流注入の期間よりも長く持続した持続的な発火を示した、顕著な凹形曲線およびリバウンド後脱分極を示したＶ層錐体ニューロンの割合。Ｆ）脱分極電流パルスの後にキンピロールにおいて観察された持続的な活性のパワースペクトル（パネルＡの波形から算出）。
【図4】フェンシクリジン（ＰＣＰ）もまた、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを介して活性依存性脱分極を誘発することを示す。Ａ）脱分極電流パルスに対するＶ層錐体ニューロンの応答。ＰＣＰ（５μＭ、中央の２つの波形）の適用後、ニューロンは、後脱分極および電流注入期間よりも長く持続する持続的な発火を示す。これらはＤ２拮抗薬スルピリド（５μＭ、緑色の波形）によって逆転されないが、Ｌ型Ｃａ２＋チャネル拮抗薬ニフェジピン（１０μＭ、灰色の波形）によって阻止される。Ｂ）５μＭ ＰＣＰの適用後に、脱分極電流の注入後の後脱分極（ＡＤＰ）、脱分極によるスパイクの阻止（脱分極遮断）、双安定性、または脱分極電流注入の期間よりも長く持続した持続的な発火を示した、顕著な凹形曲線およびリバウンド後脱分極を示したＶ層錐体ニューロンの割合。Ｃ）上：ニフェジピンによって社会的探索行動が用量依存様式で妨げられた（ｎ＝各群に８頭のマウス）。下：ＰＣＰによって社会的探索行動が妨げられたが、ＰＣＰで処理したマウスにおけるこの欠陥は、ニフェジピンによって用量依存様式で改善された（ｎ＝各群に８頭のマウス）。Ｄ）野生型マウスおよびＣＡＣＮＡ１Ｃ機能獲得型遺伝子として設計されたＴＳ２ｎｅｏノックインマウスにおける、過分極電流パルスおよび脱分極電流パルスに対するＶ層錐体ニューロンの応答（２０）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。４／４個の変異体細胞および０／５個の野生型細胞において効果が認められ、大きな凹形曲線と、過分極電流の注入に応じたリバウンド脱分極とを示した（フィッシャーの直接確率検定によるｐ＜０．０１）。
【図5】本開示の例示的な実施形態に従ったモデルを示す。
【図6】本開示の例示的な実施形態に従って、対象となる細胞を同定する方法を示す。
【図7】本開示の例示的な実施形態に従って、神経障害を特徴付けるためのモデルを示す。
【図8】本開示の例示的な実施形態に従って、治療薬の有効性を決定する方法を示す。 本開示は、種々の修正例および変更形態を受けることができるが、それらの具体例が例として図面に示されており、また詳細に記載される。しかしながら、本開示を記載される特定の実施形態に限定することが企図されるものではないことを理解されたい。むしろ、特許請求の範囲に定義される態様を含む本開示の範囲内に属する全ての修正例、均等物、および変更例を包含することが企図される。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明は、非ヒト動物に、前頭前皮質のＶ層錐体ニューロンの対象の形質膜上に発現される光応答性オプシンを活性化することによって誘発される精神病を提供し、光応答性オプシンの活性化は、膜の脱分極を誘発する。非ヒト動物由来の前頭前皮質組織片もまた提供される。本発明はまた、非ヒト動物において精神病を誘発する方法と、本明細書に記載される非ヒト動物および組織片を使用して、精神病を治療するために使用できる可能性がある化合物を同定およびスクリーニングするための方法も提供する。
【0023】
本明細書で使用される場合、「動物」は哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、ヒト、家畜、競技用動物、ペット（例えば、イヌおよびネコ）、霊長類、マウス、ラット、および他のげっ歯類を含む。
【0024】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途指定のない限り、複数形を含む。一般的な技術
【0025】
本発明の実践は、別途指定のない限り、当業者に周知の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、免疫学、生理学、泌尿器科学、ならびに病態生理学の薬物中毒および報酬関連行動の従来の技術を用いる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）（本明細書では併せて「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称される）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，２００１までの付録を含む）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書では併せて「Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ」と称される）、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）、ならびにＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ベクター ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）等の文献に十分に説明されている。他の有用な参考文献は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ；Ｊ．Ｉｓｓｅｌｅａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）およびＡｄｄｉｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ，（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，２０１０；Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含む。光応答性オプシンタンパク質
【0026】
前頭前皮質のＶ層錐体ニューロンの対象を選択的に脱分極させるための光遺伝学に基づく組成物および方法であって、これらのニューロンの脱分極は動物の精神病を誘発する、組成物および方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、統合失調症が誘発される。光遺伝学とは、たとえ自由に運動する哺乳動物および他の動物内であっても、機能するインタクトな生物系に遅れを取らないために必要な時間精度（ミリ秒の時間尺度）で、生組織の標的細胞における特定の事象を制御するために使用される遺伝子学的方法と光学的方法の組み合わせを意味する。光遺伝学は、特定の標的機構の使用を通して細胞型の分解能を維持する一方で、ニューロンの膜電位の時間的に正確な操作を可能にする迅速な光応答性チャネルまたはポンプタンパク質を標的神経細胞の形質膜に導入することを必要とする。
【0027】
本発明において使用されてもよい光応答性オプシンは、光によってニューロンの細胞膜の脱分極を誘発するオプシンを含む。そのようなオプシンの例を下の表１に示す。表１は、可視スペクトルにわたって励起および調節のために同定されたオプシンを示す。
【表1】
【0028】
本明細書で使用される場合、光応答性オプシン（ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、ＤＣｈＲ、およびＣｈＥＴＡ等）は、自然発生タンパク質、および機能的変異体、断片、断片または完全長タンパク質を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドが除去されてもよい。変異体は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれかで自然発生タンパク質配列と同一なアミノ酸配列を有してもよい。機能的変異体は、自然発生タンパク質と同じかまたは同様の脱分極機能を有してもよい。アミノ酸モチーフの細胞内輸送の亢進
【0029】
本開示は、哺乳類細胞の形質膜への輸送を亢進する１つ以上のアミノ酸配列モチーフの付加によって、細胞内で発現される光応答性オプシンタンパク質の修飾を提供する。進化的に単純な生物に由来する構成要素を有する光応答性オプシンタンパク質は、哺乳類細胞によって発現されないかもしくは耐容性を示されない可能性があるか、または哺乳類細胞において高レベルで発現された場合に細胞内局在化障害を示す可能性がある。結果として、いくつかの実施形態において、細胞内で発現される光応答性オプシンタンパク質が、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）輸送シグナル、膜輸送シグナル、および／またはＮ末端ゴルジ体輸送シグナルからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合されてもよい。哺乳類細胞の形質膜への光応答性オプシンタンパク質の輸送を亢進する１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光応答性オプシンタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に融合されてもよい。任意選択的に、光応答性オプシンタンパク質および１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてもよい。いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は、細胞形質膜へのタンパク質の輸送を亢進する輸送シグナル（ｔｓ）の付加によって修飾されてもよい。いくつかの実施形態において、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来してもよい。他の実施形態において、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含んでもよい。
【0030】
細胞の形質膜への光応答性オプシンタンパク質の輸送を亢進することができるさらなるタンパク質モチーフは、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／０４１，６２８号に記載されている。いくつかの実施形態において、タンパク質中のシグナルペプチド配列は、欠失していてもよいか、または異なるタンパク質由来のシグナルペプチド配列で置換されてもよい。光応答性チャネルタンパク質
【0031】
いくつかの態様において、光応答性オプシンタンパク質は、光応答性チャネルタンパク質である。本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、光応答性イオンチャネルのチャネルロドプシンファミリーの１つ以上のメンバーが、前頭前皮質においてＶ層錐体ニューロンのサブセットの形質膜上に発現される。
【0032】
いくつかの態様において、光応答性陽イオンチャネルタンパク質は、クラミドモナスラインハルディに由来してもよく、陽イオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射されると、細胞中の脱分極電流を媒介することができる可能性がある。別の実施形態において、光応答性陽イオンチャネルタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。クラミドモナスラインハルディに由来する光応答性陽イオンチャネルタンパク質を活性化するために使用される光は、約４６０〜約４９５ｎｍの波長を有することができるか、または約４７０ｎｍの波長を有することができる。さらに、光は、少なくとも約１００Ｈｚの強度を有することができる。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの強度を有する光を用いたクラミドモナスラインハルディに由来する光応答性陽イオンチャネルの活性化は、光応答性陽イオンチャネルを発現するニューロンの脱分極誘発性のシナプス喪失を引き起こす可能性がある。光応答性陽イオンチャネルタンパク質は、光に対する感度を増加もしくは減少させるため、光の特定の波長に対する感度を増加もしくは減少させるため、および／または光応答性陽イオンチャネルタンパク質が細胞の形質膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を付加的に含むことができる。また、光応答性陽イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存アミノ酸置換および／または１つ以上の非保存アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含む光応答性陽イオンチャネルタンパク質は、光に応じて神経細胞の形質膜を脱分極させる能力を好適に保持する。
【0033】
他の実施形態において、光応答性陽イオンチャネルタンパク質は、タンパク質のレチナール結合ポケットにわたる重要な位置に特異的アミノ酸置換を有することができる階段関数オプシン（ｓｔｅｐ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｐｓｉｎ：ＳＦＯ）タンパク質または安定化階段関数オプシン（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｓｔｅｐ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｐｓｉｎ：ＳＳＦＯ）タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基Ｃ１２８に変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号１にＣ１２８Ａの変異を有する。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号１にＣ１２８Ｓの変異を有する。別の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号１にＣ１２８Ｔの変異を有する。いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基Ｃ１２８およびＤ１５６に変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号１にＣ１２８Ｓの変異およびＤ１５６Ａの変異を有する。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号２または配列番号３に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含むことができる。
【0034】
他の実施形態において、光応答性陽イオンチャネルタンパク質は、ボルボックスカルテリのＶＣｈＲ１タンパク質に由来するＣ１Ｖ１キメラタンパク質、およびクラミドモナスラインハルディ由来のＣｈＲ１タンパク質であってもよく、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換された少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、光応答性であり、細胞が光で照射されると細胞内で脱分極電流を媒介することができる。さらに、いくつかの実施形態において、本発明は、置換されたかまたは変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができ、変異ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光応答性の性質を保持するが、いくつかの特定の態様においては変化した特性を保有する可能性がある。例えば、本明細書に記載される変異光応答性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞の形質膜上の両方における発現レベルの増加；異なる波長の光、とりわけ赤色光に暴露された場合の応答変化；および／または、形質の組み合わせを示すことができ、それによって、キメラＣ１Ｖ１ポリペプチドは、低い脱感作、急速な不活性化、他の光応答性陽イオンチャネルとの最小限の相互活性化のための紫色光による低活性化、および／または動物細胞における強力な発現といった特性を保有する。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号４、５、６、または７に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含むことができる。
【0035】
光応答性陽イオンチャネルタンパク質に関する更なる開示は、米国特許出願第２００７／００５４３１９号ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３１８３７号および第ＷＯ２００７／０２４３９１号に見出すことができる。ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関するさらなる開示は、国際特許出願公開第２０１０／０５６９７０号ならびに米国仮特許出願第６１／４１０，７０４号および第６１／５１１，９０５号に見出すことができる。Ｃ１Ｖ１キメラ陽イオンチャネルおよびその変異体に関する更なる開示は、米国仮特許出願第６１／４１０，７３６号、第６１／４１０，７４４号、および第６１／５１１，９１２号に見出すことができる。特定の光応答性オプシンタンパク質に関する上記参考文献の各々の開示は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【0036】
本開示はまた、本明細書に記載される光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、上述の核酸を含むベクターである。いくつかの実施形態において、本開示の光応答性オプシンタンパク質をコードする核酸は、プロモーターに動作可能に結合する。プロモーターは、当該技術分野において周知である。コリン作動性介在ニューロンにおいて機能する任意のプロモーターを、本開示の光応答性タンパク質および／またはその任意の変異体の発現のために使用することができる。特定の哺乳類細胞において光応答性オプシンタンパク質またはその変異体の発現を駆動するために有用である開始制御領域またはプロモーターは非常に多く、当業者によく知られている。これらの核酸を駆動することができる実質的にあらゆるプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態において、光応答性タンパク質の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、前頭前皮質の錐体ニューロンにおいて導入遺伝子の強い発現を駆動することができる胸腺細胞抗原１（Ｔｈｙ１）プロモーターであってもよい（例えば、Ａｒｅｎｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５４，２０５（Ａｐｒ １９，２００７）を参照）。
【0037】
本明細書に記載される光応答性オプシンタンパク質またはその任意の変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターもまた本明細書に提供される。本発明に従って投与することのできるベクターはまた、ベクターのポリヌクレオチドから転写されると、標的動物細胞の形質膜上に光応答性タンパク質の蓄積をもたらすＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも含む。使用されてもよいベクターは、レンチウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターを含むが、これらに限定されない。レンチウイルスは、限定されないが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶを含む。レンチウイルスは、限定されないが、ＶＳＶ、狂犬病、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルス、およびエボラを含む他のウイルスのエンベロープタンパク質を有する偽型であってもよい。そのようなベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製されてもよい。
【0038】
いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、それらが感染する細胞のゲノム内に安定した部位特異的な様式で組み込むことができる、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスである。これらは、細胞の成長、形態、または分化に対するいずれの影響も誘発することなく幅広い細胞に感染することができ、またこれらはヒトの病理には関与していないと考えられる。ＡＡＶゲノムは、クローン化され、配列決定され、特徴付けられてきた。該ゲノムは、約４７００塩基を包含し、ウイルスの複製開始点としての役割を果たす約１４５塩基の末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を各末端に含む。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成の機能を担う２つの必須領域に分割される：ウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含む、ゲノムの左側部分、ならびにウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む、ゲノムの右側部分。
【0039】
ＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製されてもよい。いずれの血清型のアデノ随伴ウイルスも好適である（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ”（ｐｐ．１６５−１７４）Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）、Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１，１９７４、Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ “Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ”Ｉｎ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ Ｋｅｒｒ，ＳＦ Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ５−１４，Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）、およびＤＥ Ｂｏｗｌｅｓ，ＪＥ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ“Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ”（ＪＲ Ｋｅｒｒ，ＳＦ Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ１５−２３，Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）を参照。それらの各々の開示は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、第６，９８９，２６４号、および第６，９９５，００６号、ならびにＷＯ／１９９９／０１１７６４号（標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ」）に見出すことができ、それらの開示は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、その開示は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。インビトロおよびインビボで遺伝子を移動させるためのＡＡＶに由来するベクターの使用が記載されている（例えば、国際特許出願公開第９１／１８０８８号および第ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、第６，５９６，５３５号、および第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照。それらの全ては、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠失し、対象となる遺伝子によって置換された種々のＡＡＶ由来構築物、ならびにインビトロで（培養細胞内）またはインビボで（生物内で直接的に）対象となる遺伝子を移動させるためのこれらの構築物の使用について記載している。本発明に従う複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）領域によって隣接された対象となる核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞株内に同時導入することによって調製することができる。生成されたＡＡＶ組換え体は、次いで、標準的な技術によって精製される。
【0040】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用するためのベクター（複数可）は、ウイルス粒子（例えば、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、およびＡＡＶ１６を含むＡＡＶウイルス粒子）中でキャプシド形成される。したがって、本発明は、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかを含む組換えウイルス粒子（組換えポリヌクレオチドを含むため、組換え体である）を含む。そのような粒子を生成する方法は、当該技術分野において既知であり、米国特許第６，５９６，５３５号に記載され、その開示は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。光応答性オプシンタンパク質の送達
【0041】
いくつかの態様において、本明細書に開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、定位的注入（例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７３：３４２４３４２９，１９９９、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７：３４２８−３４３２，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３，１９９３、およびＡｌｉｓｋｙ＆Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２３１５−２３２９，２０００を参照。それらの各々の内容は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）または蛍光透視法等による当該技術分野において既知の神経外科的な技法を用いて、針、カテーテル、または関連デバイスを使用して、動物の前頭前皮質の錐体ニューロンに直接送達することができる。
【0042】
いくつかの態様において、光応答性オプシンタンパク質は、トランスジェニック動物の前頭前皮質の錐体ニューロンにおいて発現されてもよい。例えば、胸腺細胞抗原１（Ｔｈｙ１）プロモーターの制御下でＣｒｅ−リコンビナーゼを使用して、トランスジェニックマウス株が用いられてもよい。次いで、光応答性オプシン遺伝子を担持するＣｒｅ誘導性のアデノ随伴ウイスル（ＡＡＶ）ベクターが、前頭前皮質内に定位的に注入されてもよい。
【0043】
他の態様において、いずれの光応答性オプシンタンパク質が、トランスジェニック動物の前頭前皮質の錐体ニューロンにおいて発現されてもよい。例えば、胸腺細胞抗原１（Ｔｈｙ１）プロモーターの制御下でＣｈＲ２を使用して、トランスジェニックマウス株が用いられてもよい。トランスジェニックマウスは、標準的な前核注入法（例えば、Ａｒｅｎｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５４，２０５（Ａｐｒ １９，２００７）を参照）を使用して作製することができる。
【0044】
限定されないが、イオン性脂質もしくはポリマーを用いた遺伝子導入、電気穿孔、光学的遺伝子導入、刺入による遺伝子導入（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、または遺伝子銃を用いる等の、光応答性タンパク質を錐体ニューロンに送達するための他の方法が使用されてもよい。
【0045】
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載される任意の方法によって作製される非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、動物の前頭前皮質のＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に発現される光応答性オプシンタンパク質を含み、オプシンは、光によって膜の脱分極を誘発し、光によるオプシンの照射は動物の精神病を誘発する。いくつかの態様において、本発明は、非ヒト動物由来の前頭前皮質のＶ層錐体ニューロンのサブセットを含む前頭前皮質組織片を提供し、光応答性オプシンは、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に発言され、光によるオプシンの活性化は膜の脱分極を誘発する。光源
【0046】
ニューロンにおいて発現される光応答性タンパク質を活性化するための波長を有する光を適用することができる任意のデバイスが、ニューロンを脱分極させるために使用されてもよい。例えば、１つ以上のニューロンの膜電圧に影響を及ぼすために光応答性オプシンタンパク質を活性化させるための光送達デバイスが使用されてもよい。光送達デバイスは、脳の標的領域に光刺激を提供するように構成されてもよい。光送達デバイスは、基部、基部に取り付けられたカニューレガイド、およびカニューレガイドを介して基部に取り付けられた１つ以上の光導管を備えてもよい。基部は、光導管から前頭前皮質内の錐体ニューロン等の標的組織領域に光を送達するように位置付けられた１つ以上の光送達ポートを備えてもよい。光導管は光ファイバであってもよく、ファイバの近位端は光学的光源に取り付けられ、遠位端は光送達ポートと連通している。光学的光源は、連続光および／またはパルス光を提供することが可能であってもよく、所定のパルス周期で光を提供するようにプログラム可能であってもよい。光送達デバイスは、所望されるように、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０個等の任意の数の光導管を有してもよい。光導管は、各々が、同じかまたは異なる波長の光を運んでもよい。送達された光は、黄色、緑色、または青色光等の４５０ｎｍ〜６００ｎｍの波長を有してもよい。光送達デバイスは、所望されるように、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０個等の任意の数の光送達ポートを有してもよい。いくつかの変形例において、光導管と同じ数の光送達ポートが存在してもよく、一方、他の変形例において、異なる数の光導管および光送達ポートが存在してもよい。例えば、２つ以上の光送達ポートに光を伝達する単一の光導管が存在してもよい。代替として、または付加的に、単一の光導管が、単一の光送達ポートに接続されてもよい。カニューレガイドは、光導管を光送達ポートに固定して揃えるのを補助するように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、光送達デバイスは、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に発現されるオプシンタンパク質の脱分極を誘発するために、前頭前皮質のＶ層錐体ニューロンのサブセットに光を送達するように構成される。光送達デバイスはまた、神経活動を測定するために構成されてもよい１つ以上の測定電極を備えてもよい。例えば、測定電極は、ニューロンが刺激に応答するときに、膜電位（例えば、活動電位）および／または１つ以上のニューロンの膜を横切る電流における変化を記録してもよい。いくつかの変形例において、測定電極は、１つ以上のニューロンの光刺激に対する電気的応答を測定してもよい。測定電極は、細胞外電極または細胞内電極であってもよい。
【0047】
他の態様において、光送達デバイスは、外部電源への物理的な繋留を必要としない植え込み型光源であってもよい。植え込み型光源は、内側本体を備えてもよく、内側本体は、電源を有するように構成される光を発生するための少なくとも１つの手段を有する。いくつかの実施形態において、電源は、光発生手段に電力を供給するための内部バッテリーであってもよい。別の実施形態において、植え込み型光源は、光発生手段に電力を供給するための外部源から無線で送信される電磁エネルギーを受信するための外部アンテナを備えることができる。無線で送信される電磁エネルギーは、電波、マイクロ波、または植え込み型光源の光発生手段に電力を供給するために外部源から送信されることができるいずれか他の電磁エネルギー源であってもよい。一実施形態において、光発生手段は、半導体プロセスまたは当該技術分野において既知の他のプロセスを使用して生成される集積回路によって制御される。
【0048】
いくつかの態様において、光手段は発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＬＥＤは、青色および／または緑色の光を発生することができる。他の実施形態において、ＬＥＤは、琥珀色、黄色、および／または青色の光を発生することができる。いくつかの実施形態において、いくつかのマイクロＬＥＤが、植え込み型光源の内側本体内に埋め込まれる。他の実施形態において、光発生手段は、半導体レーザーダイオードであるか、または光を発生することができる任意の他の手段である。光発生手段は、（光カフ（ｌｉｇｈｔ ｃｕｆｆ）等）の光源に近接する神経の形質膜上に発現される光応答性タンパク質を活性化するのに十分な強度を有する光を発生することができる。いくつかの実施形態において、Ｎａｃのコリン作動性介在ニューロンまたは線条体に到達する、光発生手段によって生成される光の強度は、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２、０．１ｍＷ／ｍｍ２、０．２ｍＷ／ｍｍ２、０．３ｍＷ／ｍｍ２、０．４ｍＷ／ｍｍ２、０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．０ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．３ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．１ｍＷ／ｍｍ２、約２．２ｍＷ／ｍｍ２、約２．３ｍＷ／ｍｍ２、約２．４ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２、約７ｍＷ／ｍｍ２、約８ｍＷ／ｍｍ２、約９ｍＷ／ｍｍ２、または約１０ｍＷ／ｍｍ２のいずれかの強度を有する（これらの数の間の値を含む）。
【0049】
いくつかの態様において、光発生手段は、外部コントローラによって外部から活性化されてもよい。外部コントローラは、送信コイルに取り付けられてもよい発電機を備えることができる。外部コントローラのいくつかの実施形態において、発電機に電力を提供するためのバッテリーが発電機に接続されてもよい。スイッチが発電機に接続されてもよく、個人が手動で発電機を起動させるかまたは停止させることができる。いくつかの実施形態において、スイッチを起動させると、発電機は、外部コントローラ上の送信コイルと植え込み型光源の外部アンテナとの電磁結合によって、光源上の光発生手段に電力を提供することができる。送信コイルは、植え込み型光源の外部アンテナと近接しているとき、光発生手段に電力を供給するためおよび植え込み型光源に１つ以上の制御信号を送信するために、該アンテナとの電磁結合を確立することができる。いくつかの実施形態において、外部コントローラの送信コイルと植え込み型光源の外部アンテナとの電磁結合は、高周波磁気インダクタンス結合であってもよい。高周波磁気インダクタンス結合が用いられる場合、電波の使用周波数は、これらの数の間のあらゆる値（例えば、約１ＭＨｚ、約２ＭＨｚ、約３ＭＨｚ、約４ＭＨｚ、約５ＭＨｚ、約６ＭＨｚ、約７ＭＨｚ、約８ＭＨｚ、約９ＭＨｚ、約１０ＭＨｚ、約１１ＭＨｚ、約１２ＭＨｚ、約１３ＭＨｚ、約１４ＭＨｚ、約１５ＭＨｚ、約１６ＭＨｚ、約１７ＭＨｚ、約１８ＭＨｚ、約１９ＭＨｚ、または約２０ＭＨｚ）を含む、約１〜２０ＭＨｚであってもよい。しかしながら、受光器、赤外線、または医用遠隔測定システム等の他の結合技術が使用されてもよい（例えば、Ｋｉｏｕｒｔｉ，“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ：Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｗｏｒｌｄ，Ｏｐｔｉｃｏｎ１８２６，（８）：Ｓｐｒｉｎｇ，２０１０を参照）。
【0050】
光源を含む光刺激デバイスの例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／５０６２８号および第ＰＣＴ／ＵＳ０９／４９９３６号、ならびにＬｌｅｗｅｌｌｙｎらの２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１６１−１６５に見出すことができ、それらの各々の開示は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。精神病を誘発する方法および精神病状態に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法
【0051】
本発明は、非ヒト動物において精神病を誘発するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを非ヒト動物に投与することであって、光応答性オプシンタンパク質は、非ヒト動物の前頭前皮質においてＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に発現され、タンパク質は光に応答性を示し、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットが光で照射されるとＶ層錐体ニューロンのサブセットの膜脱分極を誘発することができ、それによって、タンパク質を光で活性化することは非ヒト動物において精神病を誘発する、投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、統合失調症が誘発される。いくつかの実施形態において、社会的探索行動の妨害が誘発される。
【0052】
本発明はまた、前頭前皮質組織片においてＶ層錐体ニューロンのサブセットの膜の脱分極を誘発するための方法であって、前頭前皮質組織片においてＶ層錐体ニューロンのサブセットの細胞膜上に発現される光応答性オプシンタンパク質を活性化することであって、光応答性オプシンタンパク質は、光によるニューロンの膜脱分極を誘発することができる、活性化することを含む、方法を提供する。
【0053】
いくつかの態様において、本明細書に記載される非ヒト動物および前頭前皮質組織片は、精神病（例えば、統合失調症）を治療するために有用な化合物の有効性を同定、スクリーニング、または試験するために使用されてもよい。例えば、本発明は、精神病を治療するために有用である可能性のある化合物をスクリーニングする方法であって、非ヒト動物の前頭前皮質に化合物を投与する前および後に動物の精神病状態を測定することであって、精神病状態は、動物においてＶ層錐体ニューロンの対象の細胞膜上に発現される光応答性オプシンの光活性化によって誘発され、オプシンの光活性化は膜の脱分極を誘発する、測定することを含み、化合物の投与後の精神病状態の測定値のうちの１つ以上における改善は、化合物が精神病を治療するために有用である可能性があることを示す、方法を提供する。いくつかの実施形態において、精神病状態の測定は行動測定（社会的探索行動等）である。いくつかの実施形態において、精神病状態の測定は細胞測定（Ｖ層錐体ニューロンのサブセットによって示される脱分極パターンの電気生理学的測定等）である。別の実施形態において、方法は、化合物の投与前に、動物にＤ２刺激薬（キンピロール等）を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、化合物は、限定されないが、スルピリドおよびハロペリドール等のＤ２拮抗薬であってもよい。いくつかの実施形態において、化合物、限定されないが、ニフェジピン等のＬ型Ｃａ２＋チャネル拮抗薬であってもよい。
【0054】
本発明はまた、精神病を治療するために有用である可能性のある化合物をスクリーニングする方法であって、化合物とともに前頭前皮質組織片をインキュベートする前および後に組織片の精神病状態を測定することであって、前頭前皮質組織片は、Ｖ層錐体ニューロンの対象を含み、光応答性オプシンは、Ｖ層錐体ニューロンの対象の細胞膜上に発現され、精神病状態は、光応答性オプシンの活性化によって誘発されるニューロンの膜脱分極によって誘発される、測定することを含み、化合物を用いたインキュベーションの後の精神病状態の読み出し情報のうちの１つ以上における改善は、化合物が精神病を治療するために有用である可能性があることを示す、方法を提供する。いくつかの実施形態において、精神病状態の測定は細胞測定である。別の実施形態において、化合物を用いたインキュベーションの前に前頭前皮質組織片にＤ２刺激薬（キンピロール等）を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、化合物は、限定されないが、スルピリドおよびハロペリドール等のＤ２拮抗薬であってもよい。いくつかの実施形態において、化合物は、限定されないが、ニフェジピン等のＬ型Ｃａ２＋チャネル拮抗薬であってもよい。例示的な実施形態
【0055】
本開示は、種々の精神障害に関与する神経細胞集団の同定するために有用であると考えられる。本発明の特定の用途は、種々の精神障害と関連する神経細胞集団に関する疾患モデルを評価することを容易にする。本明細書に開示される例示的な実施形態の多くの態様は、この分野における以前の開発に関し、またそれらに大いに基づいているため、以下の考察は、そのような以前の開発を要約し、実施例に見出されるものを含む実施の詳細および変更が導き出される可能性のある基盤および基礎となる教示の確固たる理解を提供する。これに関連して、以下の考察は、参照により本明細書に組み込まれる参考文献中に提供され、またその教示とともに提供される。本発明は、必ずしもそのような用途に限定されるわけではないが、本発明の種々の態様は、この前後関係を用いて、種々の例の考察を通して理解されてもよい。
【0056】
本明細書において論じられる実施形態および特定の用途（実施例を含む）は、上述の態様、実施形態、および実施のうちの１つ以上、ならびに図に示されるものおよび以下に記載されるものと関連して実施されてもよい。仮特許文書の一部を形成し、参照により本明細書に完全に組み込まれる以下の実施例が参照されてもよい。方法、デバイス、および物質を含む、光応答性分子および／またはオプシンに関するさらなる詳細については、以下の背景刊行物もまた参照されてもよい：Ｚｈａｎｇらに対する米国特許公開第２０１０／０１９０２２９号、標題「Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ」、Ｚｈａｎｇらに対する米国特許公開第２０１０／０１４５４１８、同じく標題「Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ」、およびＢｏｙｄｅｎらに対する米国特許公開第２００７／０２６１１２７、標題「Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ」。これらの出願は、仮特許文書の一部を形成し、参照により本明細書に完全に組み込まれる。これらの刊行物と一致して、光刺激を提供するためおよび標的細胞を制御するために、多数のオプシンがインビボおよびインビトロの哺乳類細胞において使用することができる。例えば、ＣｈＲ２が細胞内に導入されると、ＣｈＲ２チャネルロドプシンの光活性化によって細胞の励起および発火が生じる。ＮｐＨＲが細胞内に導入される場合、ＮｐＨＲオプシンの光活性化によって細胞の抑制が生じる。上で参照した特許出願の開示のこれらのおよび他の態様が、本開示の種々の態様を実施する上で有用である可能性がある。
【0057】
いくつかの態様において、精神障害に関与する神経集団を同定する方法であって、光応答性オプシンを発現する標的ニューロン集団に光刺激を提供することと、光刺激に応じた標的ニューロン集団の第１の電気パターンを測定することと、精神病を誘発することが分かっている薬物を標的ニューロン集団に導入することと、標的ニューロン集団に光刺激を提供することと、光刺激に応じた標的ニューロン集団の後続の電気パターンを測定することと、第１の電気パターンと後続の電気パターンとを比較することとを含む方法が本明細書に提供される。さらなる実施形態において、精神病に関連するニューロンのサブセットを同定する。いくつかの実施形態において、ニューロンのサブセットは、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットである。いくつかの実施形態において、標的ニューロン細胞集団は、患者である。いくつかの実施形態において、薬物は、限定されないが、キンピロール等のＤ２刺激薬であってもよい。いくつかの実施形態において、薬物は、限定されないが、フェンシクリジン等のＮＭＤＡ受容体阻害薬であってもよい。
【0058】
図５を参照すると、本開示の一実施形態と一致する、対象となる細胞を同定するためのモデルが示される。脳内の対象となる領域は（５００）と指定される。対象となる領域は、例えば、対象となる疾患の以前に同定された特長または該領域の既知の機能に基づいて選択されてもよい。対象となる領域内の１つ以上の細胞型がオプシン（５１０）で修飾される。異なる細胞型の各々が、異なる波長の光に応答する異なるオプシンで修飾されてもよい。特定の代替の実施形態において、異なる細胞型が同じオプシンで修飾されるが、それは異なる試料または患者においてである。対象となる領域内の異なる細胞型は、刺激される特定の細胞型を修飾するために使用されるオプシンに基づいて決定される範囲の可視光で刺激される（５２０）。各細胞型の応答が観察される（５８０）。マクロレベル（細胞レベルの代わりに）で観察された場合に、患者において特定の状態を誘発することが分かっている薬物が、対象となる領域に導入される（５３０）。薬物の存在下における各細胞型の応答が観察される（５９０）。特定の状態を誘発することが分かっている薬物の存在下における各細胞型の応答が、細胞が「正常な」または「自然な」状態にある（つまり、薬物が存在しない）場合の、同じ細胞型の刺激に対する応答と比較される（５４０）。その比較に基づいて、細胞型のうちの１つ以上が、薬物によって引き起こされる状態を形成することに関与しているかどうかに関する決定を行うことができる（５５０）。薬物の存在下における応答のうちの１つ以上がベースラインの応答と異なる場合、その細胞型が、誘発される特定の状態を引き起こすことに関与しているかどうかを判定するために、変化する応答を示す細胞型をさらに調査することができる。
【0059】
種々の代替のおよび補足的な実施形態において、対象となる領域は、インビボで（５６０）、インビトロで（５７０）、またはその両方で調べることができる。対象となる領域をインビトロで調べる実施形態において、神経回路をインタクトに維持する対象となる領域の切片が使用されてもよい。複数セットの切片が使用され、各セットにおいて対象となる領域内の異なる細胞型が修飾される。代替として、対象となる領域内の各細胞型の単一細胞が調べられてもよい。代替のインビトロ法により、単離された細胞の応答、およびそれが周囲の細胞に及ぼす影響を観察することができる。複数セットの切片または単一細胞の使用により、全ての細胞を一度に発火させることなく、全ての異なる細胞型を修飾するために、単一のオプシン型が使用されることが可能となる。
【0060】
対象となる領域をインビボで調べる実施形態において、複数の対象が使用されてもよく、各対象において異なる細胞型が修飾される。代替として、異なる波長の光に応答する異なる興奮性オプシンが、対象となる領域内の異なる細胞型を修飾するために使用されてもよい。
【0061】
特定のより具体的な実施形態において、対象となる領域は、前頭前皮質のＶ層である。Ｖ層の錐体ニューロンが修飾される。前頭前皮質は、統合失調症等の精神病状態に関与すると考えられる。キンピロールまたはＰＣＰ等の薬物がＶ層錐体ニューロンに導入される。薬物の導入前の細胞の応答を薬物の導入後の応答と比較することで、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットが異なる応答を有することが実験的に明らかになった。このＶ層錐体ニューロンのサブセットは、統合失調症または他の精神病のための種々の治療薬の有効性を調べるために使用することができる。
【0062】
図６を参照すると、対象となる細胞型を判定する方法が開示される。標的細胞型が選択される（６００）。標的細胞の選択は、以前の経験的な結果に基づいて行われる。標的細胞が刺激され、刺激に対する応答が観察される（６１０）。特定のより具体的な実施形態において、標的細胞の刺激は、標的細胞内に導入された光応答性分子を活性化することにより達成される。精神病が誘発される（６２０）。これは、精神病を誘発することが分かっている薬物を対象に導入することによって達成することができる。標的細胞が再び刺激され、応答が観察される（６３０）。精神病の誘発前と精神病の誘発後の標的細胞の応答の比較が行われる（６４０）。精神病を誘発することが分かっている薬物の存在下において細胞が異なる反応を示すかどうかに基づいて、標的細胞が対象において精神病を引き起こすことに関与しているかどうかを判定するために、この比較を使用することができる。
【0063】
本開示の特定の実施形態において、キンピロール等のＤ２刺激薬およびフェンシクリジン（「ＰＣＰ」）等の精神異常発現薬の両方が、ヒトおよび動物において統合失調症様行動を引き起こす。これらのおよび他の薬物は、異なるニューロン受容体を介して作用するが、該薬物は両方とも、前頭前皮質（「ＰＦＣ」）のＶ層錐体ニューロンのサブセットにおいて活性依存性脱分極の表現型を誘発した。これらのニューロンにおける活性依存性脱分極は、ニューロンを通る情報の流れを妨害し、陰性症状型の社会的行動の原因として関連している。
【0064】
本開示の種々の態様は、前頭前皮質におけるＶ層錐体ニューロンのサブセットの特徴を対象としている。サブセットの特徴は、双安定性をもたらし、これらのニューロンを通る情報の流れを妨害する、活性依存性脱分極を含む。破壊的な双安定性は、Ｃａ２＋チャネルサブタイプ（Ｌ型チャネル）に依存する。このチャネルは、以前に統合失調症と関連付けられている。さらに、サブセットニューロンの脱分極が非社会的表現型を形成する一方で、Ｌ型チャネルの遮断は、精神異常発現薬によって誘発された社会的機能不全を矯正する。
【0065】
本開示の特定の態様は、統合失調症および他の関連する状態において観察されるような精神病的行動および認知障害の考えられる細胞基盤を同定することを対象としている。外部電源を導入することなく細胞を活性化するために、光遺伝学的ツールが使用される。これにより、例えば、領域内の他の細胞も活性化されて結果を変更することなく、オプシンに感染させた標的細胞集団の活性化に対する応答を観察することができる。特定の実施形態において、細胞の応答は、細胞の「自然な」状態、すなわち、マクロレベルでの行動変化を引き起こすことが分かっている追加の刺激が存在しない状態で、観察される。次いで、この応答は、刺激が導入された後の対象となる細胞の応答と比較される。
【0066】
本開示の特定の態様は、統合失調症または他の精神病における前頭前野の機能不全と関連する特定のニューロンを探索することを対象としている。ＰＦＣ内のＶ層錐体ニューロン等の、脳の特定の領域または特定の種類の神経細胞が、さらなる検討のために選択されてもよい。ＰＦＣ内のＤ２受容体はＶ層錐体ニューロン上で濃縮され、Ｄ２受容体は統合失調症に影響を及ぼすことが分かっているため、Ｖ層錐体ニューロンは、統合失調症および他の形態の精神病に関して注目されている。さらに、Ｖ層錐体ニューロンは、新皮質の出力ニューロンであり、随伴発射を含む信号に関与している。
【0067】
本開示の種々の態様は、精神障害と特定のニューロンとの間の関連性を検証するために使用される。対象となるニューロンは、インビボでチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）を発現するように修飾される。修飾されたニューロン中のＣｈＲ２が刺激される。刺激によってもたらされる認知障害および他の陰性症状が定量化される。Ｔｈｙ１：：Ｃｈｒ１８トランスジェニックマウスを用いたモデルにおいて、ＣｈＲ２の発現はＰＦＣ内のＶ層錐体ニューロンに局在化する。軽度の光刺激（例えば、４７０ｎｍ、０．４ｍＷ、１０Ｈｚで５ミリ秒）は、正常な運動に影響を及ぼすことなく、マウスの社会的探索行動を妨害するのに十分である。刺激の周波数を増加すると（例えば、４７０ｎｍ、０．４ｍＷ、４０Ｈｚで２．５ミリ秒）、社会的行動がほぼ完全に消失し、様々な緊張病様行動が誘発される。そのような結果を評価することにより、ＣｈＲ２を発現する細胞が精神病様行動に寄与するという結論に導かれる。特定の実施形態において、このような知見は、オプシンを発現する細胞の回路レベルでの調査のための基盤として使用される。
【0068】
本開示の特定の態様は、オプシンの活性化を、対象となる標的細胞の薬理学的操作と組み合わせることを対象としている。Ｄ２刺激薬キンピロールは、動物において統合失調症様行動を誘発する。キンピロールは、インビボで送達されてもよいか、または対象となる領域からの切片に適用されてもよい。切片を使用する場合、光によって誘起されるネットワーク活動が調べられる。図２Ａを含む実施例において論じられるように、キンピロールの適用は、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットの応答を変化させる。細胞応答における変化は、もはやスパイクを誘発しない特定の閃光、閃光とは関係のない新しいスパイク、およびプラトー電位を含む。高頻度のスパイク期間の後に、直接刺激よりも数十ミリ秒または数百ミリ秒長く持続する長期脱分極が起こる。特定の場合において、この長期脱分極は、さらなるスパイクを誘発する。他の場合において、脱分極は、スパイク閾値を超えるプラトー様脱分極を引き起こす。
【0069】
精神病を誘発することが分かっている薬物を使用して異常応答を誘発することにより、抗精神病薬の有効性を試験すること、および既知の抗精神病薬の機構を確認することができる。例えば、抗精神病薬ハロペリドールの適用は、キンピロールが標的細胞に及ぼす効果を逆転させる。同様に、特定のＤ２拮抗薬スルピリドも、正しい用量で使用されると、キンピロールが標的細胞に及ぼす効果を逆転させる。キンピロール、ハロペリドール、およびスルピリドが、Ｄ２受容体、スパイクレート、および標的細胞の他の特徴に及ぼす効果に関するさらなる考察については、実施例を参照されたい。
【0070】
上で簡潔に論じたように、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットは、キンピロールが存在する場合に活性依存性脱分極を示すことが観察された。この反応を示す細胞のサブセットは、顕著な凹形曲線と、キンピロールが存在しない場合の過分極電流パルスに応じた脱分極後のリバウンドとによって同定することができる。顕著な凹形曲線およびリバウンドを示さないＶ層錐体ニューロンは、キンピロールの存在下で活性依存性脱分極を示さない。錐体ニューロンの２つの亜集団は、それらの入力抵抗または膜時定数において違いはない。しかしながら、活性依存性脱分極を示す細胞は、静止状態で若干さらに脱分極される傾向にある。
【0071】
特定のより具体的な実施形態において、キンピロールが活性依存性脱分極を誘発するＴｈｙ１：ＣｈＲ２トランスジェニックマウス由来のニューロンの全てがＣｈＲ２を強力に発現する一方で、逆に、ＣｈＲ２を強力に発現するほとんどのニューロンが活性依存性脱分極を示す。したがって、活性依存性脱分極を示したＶ層錐体ニューロンの亜集団は、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスにおいて社会的行動の異常および他の行動学的異常をもたらしたＣｈＲ２によって活性化された集団と実質的に同様であった。トランスジェニックマウスにおいて、電流注入単独で活性依存性脱分極を誘発することができ、光遺伝学的刺激は必要ではなかった。
【0072】
活性依存性脱分極を示す細胞は、形態学的に異なる。１本の太い尖端樹状突起を保有するＶ層錐体ニューロンのサブセットは、表層２／３に到達するまで２つに分岐しない。該細胞はまた、Ｖ層内に多くの突起を有する。対照的に、活性依存性脱分極を示さない細胞は、層４または５で分岐する尖端樹状突起を含む、より不均一な形態を有する。層５の錐体ニューロンのサブセット間の違いに関するより詳細な議論については実施例を参照されたい。
【0073】
本開示の特定の実施形態において、単一細胞レベルで電気生理学的パターンが調べられる。活性依存性脱分極は、さらなるスパイクを阻止する著しい脱分極、長期双安定性、電流注入によって誘発されるスパイクの増加、および直接刺激の期間よりも長く持続し、さらなるスパイクを誘発することができる後脱分極を含む、さまざまな顕著な細胞行動を誘発すると考えられる。双安定性は、典型的にはβ／γバンドにおける律動的活動と関連している。特定の実施形態において、双安定性は、２０〜４０Ｈｚのパワースペクトルでピークを迎える。
【0074】
特定の実施形態において、キンピロールが神経興奮性に及ぼす正味の効果（例えば、スパイクの増加対脱分極遮断および関連する現象）は、キンピロール適用の用量および期間、ならびに入力強度に依存する。具体的には、スパイクの増加は、キンピロール適用初期の間に、またはより長期のキンピロール適用後に長期脱分極もしくは双安定性へと移行する弱い脱分極入力に応じて、またはより強い脱分極入力に応じて起こり得る。活性依存性脱分極は、対照条件（キンピロールを適用する前）において存在する可能性がある。この現象は、ある状況において、切片におけるＤ２受容体の異常に高いレベルの活性化によって誘発され得ることが分かった。
【0075】
本開示の特定の態様は、全細胞電圧クランプ法を対象としている。これによって、活性依存性脱分極を生じさせるイオンチャネル電流の同定が可能となる。同定されたＶ層錐体ニューロンのサブセット（上述の）において、電圧依存性Ｃａ２＋電流が活性依存性脱分極に寄与する。活動電位の間に起こるＬ型チャネルを介したＣａ２＋流入は、スパイクの再分極において重要な役割を果たすＣａ２＋依存性Ｋ＋電流を活性化する。強力なＤ２の活性化はまた、Ｌ型チャネルを介したＣａ２＋流入を増加させる。さらに、強力なＤ２の活性化は、スパイクＡＨＰを増大させ、短いスパイク間間隔で選択的にスパイクを抑制することが予想される。Ｄ２の遮断は、Ｃａ２＋依存性Ｋ＋電流の動員を抑制し、スパイク再分極障害、より幅広いスパイク、より大きなＮａ＋チャネルの不活性化、より高いスパイク閾値、および短いスパイク間間隔のスパイクの減少をもたらすことが予想される。
【0076】
本開示の特定の実施形態において、キンピロールが標的細胞集団に及ぼす影響が、フェンシクリジン（ＰＣＰ）等の別の精神異常発現薬の影響と比較される。ＰＣＰは、ヒトにおいて統合失調症とよく似た症状を引き起こし、動物において統合失調症をモデル化するために長い間使用されてきた。ＰＣＰの精神異常発現効果は、ＮＭＤＡ受容体の遮断に長い間寄与してきた。驚くべきことに、前頭前野のＮＭＤＡ受容体を遮断する用量と同様の用量で、ＰＣＰは、キンピロールによって誘発されるものと実質的に同一であった直接刺激の期間よりも長く持続する活性依存性脱分極および後脱分極を引き起こした。キンピロールとは対照的に、スルピリドによって効果が遮断されることはなかったが、ニフェジピンによって遮断された。このことは、ＰＣＰは、Ｄ２受容体を活性化しないが、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを介して活性依存性脱分極を引き起こすことを示唆している。ＰＣＰは、活性依存性脱分極を介して、直接刺激の期間よりも長く持続する後脱分極、スパイクを阻止する著しい脱分極、双安定性、および直接刺激の期間よりも長く持続する持続的な発火を含む、キンピロールがもたらしたものと同様の範囲の影響をもたらす。活性依存性脱分極は、顕著な凹形曲線と、過分極電流の注入に応じたリバウンド後脱分極とを示したＶ層錐体ニューロンの亜集団に限定される。興味深いことに、いくつかの場合において、ＰＣＰは、ニフェジピンによって遮断された幅広い活動電位を誘発し、樹状Ｃａ２＋スパイクを描く可能性があることが分かった。Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２の皮質切片における一連の光パルスに対する応答の間、ＰＣＰが（キンピロールと同様に）短いスパイク間間隔でスパイクを抑制したことから、ＰＣＰがＬ型Ｃａ２＋電流に及ぼす影響により、（キンピロールの影響と同様に）活動電位の間にＣａ２＋依存性Ｋ＋電流の動員を亢進させることが示唆された。
【0077】
構造的におよび機能的に異なる精神異常発現薬であるキンピロールおよびＰＣＰは、共通の原因として重要なＣａ２＋チャネル依存性の異常な神経状態に集中する。したがって、ＰＣＰは、以前はこの種の経路と関連付けられていなかったが、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを動員することによって、その精神異常発現作用の一部に影響を及ぼすと考えられる。ＰＣＰの存在下において、Ｌ型カルシウムチャネル拮抗薬ニフェジピンは、マウスにおいてＰＣＰによって誘発された社会的障害を改善する。ニフェジピンはまた、ＰＣＰ単独で誘発される緊張病様行動の発生率を低下させる。適切な用量のニフェジピンは、過剰なレベルのカルシウムチャネルの活性化を減少させ、それによって長期のスパイクおよび双安定性を防止し、正常な前頭前野出力および前頭前皮質によって媒介される他の行動を回復する。
【0078】
Ｖ層錐体ニューロンのサブセットについて観察された応答を、統合失調症および／または他の形態の精神疾患に罹患する患者において観察された症状に適用すると、活性依存性脱分極は、前頭前野ネットワークにおける固執行動および脱線行動の両方を支持することができる単一の細胞現象を意味する。したがって、活性依存性脱分極の誘発に伴って、ニューロンは、統合失調症等の疾患のための新しい潜在的治療薬を研究するための疾患モデルとして使用することができる。
【0079】
本開示は、種々の精神障害、より具体的には精神病および／または精神病の症状に関与する特定の神経細胞集団を標的とするために有用であると考えられる。本発明の特定の用途は、精神病および／または精神病の症状と関連する特定の神経細胞集団を標的にすることによって、それらを評価、治療、および特徴付けることを容易にする。本明細書に開示される例示的な実施形態の多くの態様は、この分野における以前の開発に関し、またそれらに大いに基づいているため、以下の考察は、そのような以前の開発を要約し、実施例に見出されるものを含む実施の詳細および変更が導き出される可能性のある基盤および基礎となる教示の確固たる理解を提供する。これに関連して、以下の考察は、参照により本明細書に組み込まれる参考文献中に提供され、またその教示とともに提供される。本発明は、必ずしもそのような用途に限定されるわけではないが、本発明の種々の態様は、この前後関係を用いて、種々の例の考察を通して理解されてもよい。
【0080】
本開示の実施形態は、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットである細胞を標的にすることを対象としている。これらの細胞を標的にすることは、精神病状態を生成、作製、治療するか、またはさもなければ特徴付けるために特に有用であり得る。
【0081】
図７を参照すると、本開示の一実施形態と一致する、神経障害の制御および特徴付けのためのモデルが示される。対象となる神経障害に関与することが同定されている細胞型が選択される。細胞型の特徴および既知の機能に依存して、同定された細胞型を感染させるためにオプシンが選択される（７００）。例えば、特定のより具体的な実施形態において、ＣｈＲ２等の興奮性オプシンが、同定された細胞型を感染させるために選択される。ＣｈＲ２は、同定された細胞型の励起が所望される場合に選択される。同定された細胞型は、第２のオプシンを使用して、またはモデル化された疾患の異常行動を誘発することが分かっている薬物を導入することによって、異常行動を示すように修飾することができる。行動は、マクロレベルで示されてもよく、モデル化された疾患の外的徴候を含むことができる。他の実施形態において、モニタリングされる行動は、細胞レベルであり、刺激に対する細胞の応答を含むことができる。
【0082】
種々の実施形態において、図７に示されるように、同定された細胞型は、インビボ（７３０）またはインビトロ（７２５）で位置してもよく、また刺激されてもよい（７０５）。同定された細胞型は、例えば、単一細胞として（７５０）、または動物由来の切片の一部として（７４５）刺激されてもよい。インビボ（７３０）モデルの場合、同定された細胞型は、例えば、トランスジェニック動物（７３５）またはヒト（７４０）であってもよい。
【0083】
選択されたオプシンが対象となる細胞型に送達された後、同定された細胞型が刺激され（７０５）、応答が観察される（７２０）。同定された細胞型の応答は、細胞が「正常な」状態にある場合、または病態が誘発されている場合、またはその両方で観察することができる。最初の観察後、対象となる薬物が選択される。薬物は、同定された細胞型、モデル化された疾患、他の薬物に関する以前の観察、これらの要因の組み合わせ、または特定の疾患を治療するための可能性のある薬物の決定を誘導する他の要因に基づいて選択されてもよい。初期用量の薬物が同定された細胞に導入され（７１０）、薬物の存在下において、細胞の刺激に対する応答が観察される（７１５）。次いで、その応答が、薬物が存在しない場合の細胞の応答と比較される（７５５）。
【0084】
他の実施形態において、対象となる薬物の存在下における細胞の応答が、異常行動を誘発することが分かっている薬物の存在下における細胞の応答と比較される。対象となる薬物はまた、異常行動を誘発することが分かっている薬物に加えて、同定された細胞型に導入されてもよい。
【0085】
特定の実施形態において、評価に基づいて、対象となる薬物の用量が変更され、同定された細胞型が再び刺激される。次いで、変更された用量に対する応答が、対象となる薬物の非存在下における応答、および対象となる薬物の以前の投与量に対する応答と比較されてもよい。応答はまた、モデル化された疾患のための他の薬物または治療薬と比較されてもよい。これにより、特定の疾患のための最適な投与量および薬物の決定が可能になる。観察される応答は、行動応答または細胞応答であってもよいため、有効な投与量および／または薬物は、一連の可能性のある薬物から決定されてもよい。
【0086】
特定のより具体的な実施形態において、同定された細胞型は、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットである。モデル化された病態と一致する異常行動を誘発するために、同定された細胞型にＰＣＰまたはキンピロール等の薬物が導入される。次いで、細胞内に導入されたオプシンを活性化する可視光を使用して同定された細胞型が刺激され、刺激に対する応答が観察される。次いで、第２の薬物である対象となる薬物が、同定された細胞型に導入される。対象となる薬物の存在下における刺激に対する応答が観察され、病態における細胞の応答と比較される。この比較は、対象となる薬物の有効性を決定するために使用することができる。この比較はまた、用量または薬物の投与の他の態様に対する変更を行うべきかどうかを決定するためにも使用することができる。
【0087】
図８を参照すると、本開示の一実施形態と一致する、推奨される治療薬の有効性を決定するための方法が示される。治療薬をインビトロで調査する場合、異常行動は細胞レベルで起こり得る。治療をインビトロで調査する場合、患者の観察可能な行動を含む異常行動は、細胞レベルおよび／またはマクロレベルであり得る。異常行動は、治療される異常行動を引き起こすことが分かっている薬物の投与によって誘発することができる（８００）。患者（インビボ）または細胞（もしくは複数の細胞）（インビトロ）のいずれかに、推奨される治療薬が投与される（８１０）。治療薬の存在下における刺激に対する細胞または患者の応答が観察される（８２０）。次いで、その観察が、治療の有効性を評価するために使用される（８３０）。
【0088】
図８と一致する種々の実施形態において、治療は、例えば、薬物、電気刺激、または行動学的治療であってもよい。応答は、例えば、光刺激に対するものであってもよい。光刺激は、対象となる細胞集団に導入された選択された光応答性分子に基づいて、細胞を励起または抑制することができる。
【0089】
上述のおよび図示される種々の実施形態は、一緒におよび／または他の様式で実施されてもよい。図面／図に示されるアイテムのうちの１つ以上はまた、具体的な用途に従って有用であるように、より別個のもしくは統合された様式で実施されてもよいか、または特定の場合において除去されてもよいか、および／もしくは使用不可能であると見なされてもよい。例えば、上述のような疾患モデルに関与する実施形態は、様々な異なるオプシンおよび刺激を使用して実施されてもよい。さらに、モデル化は、インビボまたはインビトロで行うことができる。本明細書の説明を考慮して、当業者は、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、それらに対する多くの変更が行われてもよいことを理解するであろう。
【実施例】
【0090】
ここでは、ヒトおよび動物において統合失調症様行動を引き起こすが、異なる受容体を介して作用し、ＰＦＣにおけるＶ層錐体ニューロンのサブセットの新規の活性依存性脱分極の表現型に集中する、Ｄ２刺激薬キンピロールおよび精神異常発現性フェンシクリジンを示す。この活性依存性脱分極が、双安定性を誘発し、これらのニューロンを通る情報の流れを妨害すること、そして、この破壊的な双安定性が、統合失調症と関連付けられたＣａ２＋チャネルサブタイプ（Ｌ型チャネル）に依存することを示す。最後に、これらのニューロンの細胞エンドフェノタイプが、陰性症状型の社会的行動の原因として関連していることを示す：これらのニューロンを選択的に脱分極させることにより、光遺伝学的的に非社会的表現型が作製されるが、その一方で、Ｌ型チャネルの遮断が、精神異常発現薬によって誘発される社会的機能不全を矯正する。これらのデータを総合して、統合失調症および関連疾患に関連する機構によって動員される前頭前野機能不全の新規細胞機構を定義する。実施例１：ＣｈＲ２を発現する下辺縁Ｖ層錐体ニューロンの光刺激によってマウスにおいて誘発された精神病様行動
【0091】
２つの理由から、ＰＦＣ内のＶ層錐体ニューロンにおいて探索を行うことを選択した。第一に、ＰＦＣ内のＤ２受容体はＶ層錐体ニューロン上で濃縮され（３、４）、全ての既知の抗精神病薬がＤ２受容体を遮断するため、Ｄ２受容体は、統合失調症および他の形態の精神病において重要な役割を果たす（５）一方で、ドーパミンレベルを増加させる薬物（例えば、Ｌ−Ｄｏｐａ刺激薬）およびドーパミン受容体刺激薬は、正常な個体において精神病を引き起こすことができるか、または統合失調症に罹患する患者において症状を悪化させることができる。実際、皮質Ｄ２受容体への結合は、とりわけ、統合失調症の認知症状および陰性症状に対する、特定の抗精神病薬の優れた有効性を具体的に説明することができる６）。第二に、Ｖ層錐体ニューロンは、随伴発射を含む信号に関与する新皮質の重要な出力ニューロンであり、欠乏すると、幻聴等の精神病症状を引き起こす自己モニタリングの障害に寄与する可能性がある（７）。
【0092】
マウスにおける精神病的行動に寄与するこれらのニューロンを検証するために、新皮質でのＣｈＲ２の発現が主としてＶ層錐体ニューロンに局在化する、十分に確立されたＴｈｙ１：：ＣｈＲ１８トランスジェニックマウスを使用して、ＰＦＣ内のＶ層錐体ニューロンにおいてチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）を刺激した（図１Ａ〜Ｂ）（８）。統合失調症の認知障害および陰性症状の特徴を定量化するために、これらのマウスにおいて社会的探索行動を測定し、陽性様症状を評価するために、常同性運動および硬直を含む解体型または緊張病性の行動を測定した。材料および方法
【0093】
下辺縁前頭前皮質の上に片側光ファイバを設置することによって、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスにおいてＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現する下辺縁Ｖ層錐体ニューロンの光刺激を達成した（図１Ａ〜Ｂ）。Ｖ層ニューロンの低周波および高周波γバンド光刺激は、それぞれ、４７３ｎｍ青色光（１０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅）および４７３ｎｍ青色光（４０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅）によって達成した。統合失調症の認知障害および陰性症状の特徴を定量化するために、これらのマウスにおいて社会的探索行動を測定し、陽性様症状の評価のために、常同性運動および硬直を含む解体型または緊張病性の行動を測定した。結果
【0094】
比較的軽度の光刺激（４７０ｎｍ、０．４ｍＷ、１０Ｈｚで５ミリ秒）が、正常な運動に影響を及ぼすことなく、社会的探索行動を顕著に妨害するために十分であったことが分かった（図１Ｃ〜Ｅ）。具体的には、低周波光刺激が、試験した６頭のＴｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ動物のうちの６頭において新生幼獣の社会的探索行動を低下させた（ｐ＝０．０３、光オン／光オフの時期を交互に用いた）（図１Ｃ〜Ｄ）。オープンフィールドデータにより、低周波光刺激時にＴｈｙ１：：ＣｈＲ２動物の全体的な速度（左）またはトラック長（右）に違いは認められなかったことが実証され、正常な運動は軽度の刺激による影響を受けなかったことが示された（図１Ｅ）。刺激の周波数を増加すると（４７０ｎｍ、０．４ｍＷ、４０Ｈｚで２．５ミリ秒）、社会的行動がほぼ完全に消失し、様々な緊張病様行動が誘発された（図Ｆ〜Ｈ）。具体的には、Ｖ層錐体ニューロンの光刺激の周波数を増加することにより、試験した６頭の動物のうちの６頭において新生幼獣の社会的探索行動がほぼ完全に消失した（ｐ＜０．０１、光オン／光オフの時期を交互に用いた）（図Ｆ〜Ｇ）。さらに、高周波の４０Ｈｚの光刺激により、試験した６頭のマウスのうちの３頭において緊張病様硬直姿勢で過ごす時間を有意に増加させ（左、ｐ＜０．０５）、試験した６頭のマウスのうちの２頭において、反復性の頭部左右運動に執着して過ごす時間が増加する傾向が観察された（右、ｐ＝０．１３）（図１Ｈ）。これらの結果は、ＰＦＣにおけるＶ層錐体ニューロンの異常活性が、統合失調症様行動に寄与する可能性があるという考えをさらに立証するものであり（９）、回路レベルでの調査のための基盤を提供する。さらに、これらの結果は、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰマウス系においてＣｈＲ２を発現するＶ層錐体ニューロンの光刺激により、このマウスを統合失調症のための動物モデルとして使用できることを実証するものである。実施例２：Ｄ２刺激薬は、Ｖ層錐体ニューロンのサブセットにおいてＬ型Ｃａ２＋チャネルによって媒介される、Ｄ２拮抗薬を用いた治療によって逆転可能な活性依存性脱分極を誘発する
【0095】
ＣｈＲ２を発現する層錐体ニューロンの光刺激は、Ｔｈｙ１：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰトランスジェニックマウスにおいて統合失調症様行動を誘発する。したがって、次に、統合失調症に関連する薬理学的操作がＰＦＣ内のＶ層錐体ニューロンに影響を及ぼすことができるプロセスを探求することにした。上で論じたように、Ｄ２受容体は統合失調症において重要な役割を果たし、Ｄ２刺激薬キンピロールは動物において統合失調症様行動を誘発する（１０、１１）。統合失調症に関連する薬理学的操作がＰＦＣ内のＶ層錐体ニューロンに影響を及ぼすことができるプロセスを探求するために、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウス由来の前頭前野切片を使用して、キンピロールの存在下および非存在下において光によって誘起されるネットワーク活動を調べた後、既知のＤ２拮抗薬を用いて処理を行った（図２および３）。材料および方法
【0096】
光によって誘起されるネットワーク活動を調べるために、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２マウス由来の前頭前野切片を使用した。Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスから単離された脳切片にインビトロで光刺激を与え、Ｄ２刺激薬の非存在下（対照）またはＤ２刺激薬（２０μＭキンピロール）の存在下における一連の閃光（４７０ｎｍ、１ミリ秒）に対する細胞応答の電気生理学的記録により、Ｖ層錐体ニューロンをモニタリングした。続いて、キンピロールを除去するために脳切片を洗浄し、０．２〜２μＭハロペリドールまたは５μＭスルピリドのいずれか（どちらも既知のＤ２拮抗薬である）を用いて処理した。Ｖ層錐体ニューロンのスパイクレートおよびそのスパイクレートで伝達された情報の量を定量化し、またスパイクの数をスパイク間間隔の関数として定量化した。
【0097】
続いて、２０μＭキンピロール単独の存在下において、またはＤ２拮抗薬ハロペリドール（２μＭ）もしくはスルピリド（５μＭ）と組み合わせて、またはＬ型Ｃａ２＋チャネル拮抗薬ニフェジピン（１０μＭ）とともに、Ｖ層錐体ニューロンを過分極電流パルスおよび／または脱分極電流パルスで処理した。薬理学的条件または処理の下、電気生理学的記録によりインビトロの光刺激に対するＶ層錐体ニューロンの細胞応答をモニタリングした。結果
【0098】
図２Ａに示されるように、キンピロール（２０μＭ、紫色の波形、下パネル）の適用は、多くの割合のＶ層錐体ニューロンの応答に著しい変化をもたらした：以前にスパイクを誘起したいくつかの閃光はもはやスパイクを誘起せず（矢印）、閃光とは関係のない新しいスパイク（「＋」）およびプラトー電位（「ｐ」）が出現した。Ｖ層錐体細胞のサブセットにおいて、高頻度のスパイク期間の後に、直接刺激よりも数十ミリ秒または数百ミリ秒長く持続する長期の脱分極が観察された（図２Ｂ中央パネル、紫色の波形、１６／２６個のＶ層錐体ニューロンにおいて観察された）。この活性依存性脱分極は、さらなるスパイクを誘発するか、またはスパイク閾値を超えるプラトー様脱分極を引き起こすことができた（図２Ｂ）。キンピロールの洗い流しおよび抗精神病薬ハロペリドールの同時適用により、この効果は急速に逆転され（図２Ｂ下パネル、緑色の波形、９／９個の細胞に０．２〜１０μＭハロペリドールが観察された）、キンピロールおよび特定のＤ２拮抗薬スルピリドの同時適用においても同様であった（２／２個の細胞に５μＭスルピリドによる逆転が観察された）。
【0099】
興味深いことに、Ｄ２受容体の活性化が、これらのニューロンのスパイクレートが伝達した閃光レートに関する情報の量に及ぼす影響の逆Ｕ字形の曲線が観察された：情報量は、対照条件において最も高く、キンピロール（２０μＭ）によってＤ２受容体が活性化されたときには中程度であり、ハロペリドール（０．２〜２μＭ）またはスルピリド（５μＭ）によりＤ２受容体が遮断されたときに最も低かった（図２Ｃ、ｐ＜０．０５、対照対キンピロール、ｐ＜０．０１、対照対ハロペリドール／スルピリド、２方向ＡＮＯＶＡ）。この関係のための機構を同定し、その中で、Ｄ２受容体の活性化がＣｈＲ２刺激に応じたスパイクに及ぼす影響のＵ字曲線が再び認められた：ニューロンは、対照条件において最も多くのスパイクを発射し、ハロペリドール（０．２〜２μＭ）またはスルピリド（５μＭ）によりＤ２受容体が遮断されたときにスパイクの発射が最も少なかった（図２Ｄ、ｐ＜０．０１、対照対キンピロール；ｐ＜０．００１、対照対ハロペリドール／スルピリド、２方向ＡＮＯＶＡ）。Ｄ２受容体がキンピロールによって活性化されたとき、またはハロペリドールもしくはスルピリドによって遮断されたときにスパイクレートがより低かったことは、短いスパイク間間隔のスパイクの損失と特異的に関連しており（図２Ｅ、ｎ＝４細胞／群）、実際、Ｄ２刺激薬および拮抗薬の効果は、反復する活動電位に及ぼす影響に反映されると考えられる（図２Ｆ）。キンピロールを用いたＤ２の活性化（紫色の波形）は、スパイクの後過分極を増大させ（ＡＨＰ、図２Ｆの矢印）、対照条件において第２のスパイクを誘発する表示閾値下の後の入力と一致していた。対照的に、スルピリドによるＤ２の遮断は、活動電位の幅を広げ、Ｎａ＋チャネルの不活性化等の機構を介して短いスパイク間間隔のスパイクを防止することと一致した。
【0100】
活性依存性脱分極のさらなる特徴付けを行った。最初に、いずれか特定の識別する電気生理学的特性、遺伝子発現パターン、または形態によって定義されるＶ層錐体ニューロンの特定の亜集団にそれが存在するかどうかを判定することにした。顕著な凹形曲線と、過分極電流パルスに応じてリバウンド後脱分極とを示したほぼ全てのＶ層錐体細胞（図３Ａ上パネルの「＊」）が、２０μＭキンピロールの適用後に活性依存性脱分極を示した（１６／１７個の細胞）一方で、これらの特性を示さない層錐体ニューロンの０／９個は、キンピロールの適用後に活性依存性脱分極を示したことが分かった。錐体ニューロンのこれらの２つの亜集団は、それらの入力抵抗または膜時定数において違わなかったが、活性依存性脱分極を示した細胞は、静止状態で若干さらに脱分極された。興味深いことに、キンピロールが活性依存性脱分極を誘発したＴｈｙ１：ＣｈＲ２トランスジェニックマウス由来のニューロンの全てがＣｈＲ２を強力に発現し（１４／１４個の細胞）、逆に、ＣｈＲ２を強力に発現したほとんどのニューロンが活性依存性脱分極を示した（１４／１８個の細胞）。したがって、活性依存性脱分極を示したＶ層錐体ニューロンの亜集団は、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスにおいて社会的行動の異常および他の行動学的異常をもたらしたＣｈＲ２によって活性化された集団と実質的に同様であった（図１）。重要なのは、電流注入単独で活性依存性脱分極を誘発することができ（図３Ａ中央パネル、紫色の波形の「１」）、以下に記載するように、顕在化するために光遺伝学的刺激や図２に示されるような種類のネットワーク活動を必要としなかったということである。以前に記載された内側ＰＦＣのＶ層における形態学的サブネットワークに関連する可能性のある、活性依存性脱分極の存在と関連する形態学的特長もまた同定した（１２）：活性依存性脱分極を示した細胞は、Ｖ層内に突出する多くの突起とともに、表層２／３に到達するまで２つに分岐しない１本の太い尖端樹状突起を常に有し（図３Ｂ左パネル、ｎ＝５）、対称的に、活性依存性脱分極を示さなかった細胞は、より不均一な形態を有し、４層または５層において分岐する尖端樹状突起を含むことが多かった（右パネル）。
【0101】
この効果の細胞事象に関する理解を深めるために、単一細胞レベルで同一された関連する電気生理学的パターンについて調べた。活性依存性脱分極は、さらなるスパイクを阻止した著しい脱分極（図３Ａの「２」）、長期双安定性（図３Ａの「３」）、電流注入によって誘発されるスパイクの増加（図３Ｃの「４」）、および直接刺激の期間よりも長く持続し、さらなるスパイクを誘発することができた後脱分極（図３Ｃの「５」）を含む、広い範囲の顕著な細胞行動を誘発したと考えられた。最もよく観察された後脱分極を図３Ｄに示すように定量化し、キンピロールによって誘発されたより広い範囲の効果を、脱分極電流の注入後の後脱分極（ＡＤＰ）、脱分極によるスパイクの阻止（脱分極遮断）、双安定性、または脱分極電流注入の期間よりも長く持続した持続的な発火を示した、顕著な凹形曲線およびリバウンド後脱分極を示したＶ層錐体ニューロンの割合として図３Ｅに要約した。注目すべきは、双安定性が、典型的にはβ／γバンドの律動的活動と関連していたことである（図３Ｆ、双安定性を示した４／６個の細胞は、それらの２０〜４０Ｈｚのパワースペクトルでピークを有した）。
【0102】
次に、活性依存性脱分極がＤ２受容体によって媒介されることを確認することにした。実際に、抗精神病薬ハロペリドール（０．２〜１０μＭ、図３Ａ下パネル、緑色の波形、９／９個の細胞）、またはより特定なＤ２拮抗薬スルピリド（５μＭ、図３Ｃ下パネル、緑色の波形、２／２個の細胞）のいずれかを使用してそれを阻止できることが分かった。活性依存性脱分極はまた、低用量のキンピロールを使用して誘発することができた：過分極電流パルスの間に顕著な凹形曲線およびその後にリバウンド後脱分極を示した８／１０個の細胞において、５μＭ（−）キンピロールまたは１０μＭキンピロールにより活性依存性脱分極および関連する現象（例えば、長期の後脱分極および／または双安定性）が誘発された。また、キンピロールが神経興奮性に及ぼす正味の効果（例えば、スパイクの増加対脱分極遮断および関連する現象）が、キンピロール適用の用量および期間、ならびに入力強度に依存することも分かった。具体的には、キンピロール適用初期の間に、またはより長期のキンピロール適用後に長期脱分極もしくは双安定性へと移行する弱い脱分極入力に応じて、またはより強い脱分極入力に応じて、スパイクの増加がしばしば観察された。まれに、活性依存性脱分極は、対照条件（キンピロールを適用する前）において存在し、この現象が、ある状況において、切片におけるＤ２受容体の異常に高いレベルの活性化によって誘発され得ることを示唆しており、そのような場合（ｎ＝３）、中程度の用量のハロペリドール（０．２〜２μＭ）によって、双安定性をより軽度の後脱分極に変換することができるか、または完全に活性依存性脱分極を阻止することができる。
【0103】
次に、全細胞電圧クランプにおいて、活性依存性脱分極を媒介する、考えられるイオンチャネル電流を同定することにした。活動電位を刺激するための一連の１ミリ秒ステップから０ｍＶの後、キンピロール（２０μＭ）は、−３０Ｍｖで徐々に活性化する脱分極電流を誘発し、−６０ｍＶで急速に不活性化するテール電流を増加させた：これらの効果はどちらもスルピリド（５μＭ）によって遮断された。これらの観察は、電圧依存性Ｃａ２＋電流が活性依存性脱分極に寄与することを示唆しており、実際、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル拮抗薬の適用により、５／５個の細胞において活性依存性脱分極が阻止された（５ｍＭ Ｎｉ２＋または１００μＭニフェジピン、ｎ＝２、１０μＭニフェジピン、ｎ＝３、図３Ｇ下パネル、灰色の波形）。活動電位の間に起こるＬ型チャネルを介したＣａ２＋流入は、スパイク再分極において重要な役割を果たすＣａ２＋依存性Ｋ＋電流を活性化するため、活性依存性脱分極におけるこのＬ型Ｃａ２＋チャネルの役割は、Ｄ２受容体の活性化がスパイクに及ぼす影響のＵ字曲線について説明できるかもしれない（図２Ｃ〜Ｆ）（１３）。強力なＤ２の活性化は、Ｌ型チャネルを介したＣａ２＋流入を増加させ（１３）、スパイクＡＨＰを増大させ、短いスパイク間間隔で選択的にスパイクを抑制することが予想され、逆に、Ｄ２の遮断は、Ｃａ２＋依存性Ｋ＋電流の動員を抑制し、スパイク再分極障害、より幅広いスパイク、より大きなＮａ＋チャネルの不活性化、より高いスパイク閾値、そして最終的には、短いスパイク間間隔のスパイクの減少をもたらすことが予想される。実施例３：フェンシクリジン（ＰＣＰ）もまた、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを介して、治療によって逆転可能な活性依存性脱分極を誘発する
【0104】
キンピロールが前頭前野出力を媒介するニューロンに及ぼす影響を調べ、それらの情報伝達能力を妨害する機構を同定し、次に、キンピロールの影響を別の精神異常発現薬であるフェンシクリジン（ＰＣＰ）の影響と比較した。ＰＣＰは、ヒトにおいて統合失調症とよく似た症状を引き起こし（１４）、動物において統合失調症をモデル化するために長い間使用されてきた。材料および方法
【0105】
Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２トランスジェニックマウスから単離された脳切片に直接電流刺激を与え、５μＭ ＰＣＰの非存在下または存在下における脱分極電流パルスに対する細胞応答の電気生理学的記録により、Ｖ層錐体ニューロンをモニタリングした。続いて、５μＭスルピリドまたは１０Ｍニフェジピンのいずれかを用いて脳切片を処理し、電気生理学的記録により処理に対する細胞応答をモニタリングした。統合失調症の認知障害および陰性症状の特徴を定量化するために、４〜１５ｍｇ／ｋｇのニフェジピン単独で、または５ｍｇ／ｋｇのＰＣＰと組み合わせて処理したマウスにおいて社会的探索行動を測定した。
【0106】
５μＭ ＰＣＰの適用後に、脱分極電流の注入後の後脱分極（ＡＤＰ）、脱分極によるスパイクの阻止（脱分極遮断）、双安定性、または脱分極電流注入の期間よりも長く持続した持続的な発火を示した、顕著な凹形曲線およびリバウンド後脱分極を示したＶ層錐体ニューロンの割合（図４Ｂ）。上：ニフェジピンによって社会的探索行動が用量依存様式で妨げられた（ｎ＝各群に８頭のマウス）。下：ＰＣＰによって社会的探索行動が妨げられたが、ＰＣＰで処理したマウスにおけるこの欠陥は、ニフェジピンによって用量依存様式で改善された（ｎ＝各群に８頭のマウス）（図４Ｃ）。野生型マウスおよびＣＡＣＮＡ１Ｃ機能獲得型遺伝子として設計されたＴＳ２ｎｅｏノックインマウスにおける、過分極電流パルスおよび脱分極電流パルスに対するＶ層錐体ニューロンの応答（図４Ｄ）（２０）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。４／４個の変異細胞および０／５個の野生型細胞において効果が認められ、大きな凹形曲線と、過分極電流の注入に応じたリバウンド脱分極とを示した（フィッシャーの直接確率検定によるｐ＜０．０１）。結果
【0107】
ＰＣＰの精神異常発現効果は、ＮＭＤＡ受容体の遮断に長い間寄与してきた：驚くべきことに、前頭前野のＮＭＤＡ受容体を遮断する用量と同様の用量（５μＭ）（１５）で、ＰＣＰは、キンピロールによって誘発されるものと実質的に同一である、直接刺激の期間よりも長く持続する活性依存性脱分極および後脱分極を引き起こした（図４Ａ、６／１２個のＶ層錐体ニューロンにおいて観察された）。これらの効果は、Ｄ２拮抗薬スルピリド（５μＭ、ｎ＝２個の細胞）によっては遮断されなかったが、Ｌ型Ｃａ２＋チャネル拮抗薬ニフェジピン（１０μＭ、ｎ＝２個の細胞）によって遮断されたことから、ＰＣＰは、Ｄ２受容体を活性化しないが、キンピロールのように、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを介して活性依存性脱分極を引き起こすことが示唆された。特筆すべきは、ＰＣＰが、活性依存性脱分極を介して、直接刺激の期間よりも長く持続する後脱分極、スパイクを阻止する著しい脱分極、双安定性、および直接刺激の期間よりも長く持続する持続的な発火を含む、キンピロールがもたらしたものと同様の範囲の影響をもたらしたということである（図４Ｂ）。活性依存性脱分極は、この場合も、顕著な凹形曲線と、過分極電流の注入に応じたリバウンド後脱分極とを示したＶ層錐体ニューロンの亜集団に限定された（活性依存性脱分極は、これらのニューロンのうちの６／９個、およびこれらの特性を示さない０／３個のＶ層錐体ニューロンに観察された）。興味深いことに、いくつかの場合において、ＰＣＰは、ニフェジピンによって遮断された幅広い活動電位を誘発し、樹状Ｃａ２＋スパイクを描く可能性があることが分かった（図４Ａ）。最後に、Ｔｈｙ１：：ＣｈＲ２の皮質切片における一連の光パルスに対する応答の間、ＰＣＰが（キンピロールと同様に）短いスパイク間間隔でスパイクを抑制したことから、ＰＣＰがＬ型Ｃａ２＋電流に及ぼす影響により、（キンピロールの影響と同様に）活動電位の間にＣａ２＋依存性Ｋ＋電流の動員を亢進させることが示唆された。
【0108】
構造的におよび機能的に異なる精神異常発現薬であるキンピロールおよびＰＣＰが、実際に、共通の原因として重要なＣａ２＋チャネル依存性の異常な神経状態に集中する場合、ＰＣＰ（以前はこの種の経路と関連付けられてはいなかった）が、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを動員することによって、その精神異常発現作用の一部に影響を及ぼすことができるという予測が出てくる。この新規の仮説を検証するために、ＰＣＰ（５ｍｇ／ｋｇ）およびＬ型カルシウムチャネル拮抗薬ニフェジピン（４、１５ｍｇ／ｋｇ）がマウスの社会的行動に及ぼす影響を測定した。仮説を立てた効果のＵ字曲線と一致して、ニフェジピン単独で、社会性を用量依存様式で低下させた（図４Ｃ上、ｐ＜０．０５、ｎ＝各群に８頭のマウス）一方で、それとは著しく対照的に、ニフェジピンは、ＰＣＰによって誘発された社会的障害を同様の用量依存性を伴って改善した（図４Ｃ下、ｐ＜０．０５、ｎ＝８各群に８頭のマウス）ことが分かった。さらに、ニフェジピン（１５ｍｇ／ｋｇ、図示せず）はまた、ＰＣＰ単独で誘発された緊張病様行動（例えば、旋回および硬直）の発生率を低下させた（１６）。これらのデータは、提案された仮説と一致する：ニフェジピン単独で、スパイクの再分極および反復性のスパイクを低下させるレベルまでＣａ２＋チャネルの活性化を減少させるが（前頭前野によって媒介される行動が損なわれる）、ＰＣＰと組み合わせると、適切な用量のニフェジピンは、過剰なレベルのカルシウムチャネルの活性化を減少させ（長期のスパイクまたは双安定性を防止する）、それによって、正常な前頭前野出力を回復させ、前頭前皮質によって媒介される行動をレスキューする。考察
【0109】
本明細書において、Ｄ２受容体の活性化によって媒介される新規の活性依存性脱分極を同定し、特徴付けてきた：この現象は、活性化されるとマウスにおいて精神異常発現性様行動を生じさせる、定義されたＰＦＣ内のＶ層錐体ニューロンのサブセットに存在する。また、この活性依存性脱分極が、双安定性、スパイク異常、およびこれらのニューロンを通る情報の流れを妨害する他の細胞行動を生じさせ、したがって、統合失調症および関連する形態の精神疾患において前頭前野機能不全の原因となり得る機構としての表面的妥当性を有すると判定した。驚くべきことに、根本的に異なるクラスの精神異常発現薬（フェンシクリジン）もまた、Ｄ２受容体の活性化とは無関係の、同様の活性依存性脱分極を誘発することが分かった。最後に、この共通の活性依存性脱分極は、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルに依存しており、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを遮断することによって、行動するマウスにおけるＰＣＰの精神異常発現効果が改善されると判定した。
【0110】
これらのＶ層ニューロンでは、統合失調症において損なわれる認知ドメインに影響を及ぼす態勢が整っている。キンピロールの効果によって示されるように、これらのニューロンはＤ２受容体を発現し、前頭前野Ｄ２受容体は作業記憶およびセット切り替え課題に関与しており（９、１７）、さらに、ＰＦＣにおいて、Ｄ２受容体は、主として、ＰＦＣから他の脳領域に出力を送信するＶ層錐体ニューロン上に位置する（４）。したがって、図１Ａ〜Ｄに示される効果によって、これらのＶ層ニューロン内のＬ型Ｃａ２＋チャネルは、線条体等の脳の領域に向かってＰＦＣから流出する情報を大幅に変更することができる（１８）。我々は、この仮説を立てた前頭前野出力のゲート開閉におけるＤ２受容体の役割は、Ｄ１受容体による遅延期間活動の安定化（１９〜２３）、およびＤ１受容体を優先的に活性化する（２６）位相性ドーパミン放出（２５）による前頭前野入力のゲート開閉（２４）を補完することができることに注目する。また、本明細書において報告される活性依存性脱分極によって媒介される様々な効果が、一見すると逆説的な臨床上の観察を説明する補助となり得ると推測することも興味深い。統合失調症または他の形態の精神疾患に罹患する急性精神病性の患者は、非常に脱線思考的であることが多く、会話および思考の両方が、（仮に関連していても）ごくわずかに関連性のある話題の間で急速に移り変わる。しかしながら、同じ患者が、ほぼ同時に、著しく固執的であり、彼らの思考または会話をある１つの考えまたは言葉から切り換えることができない可能性もある。活性依存性脱分極は、前頭前野ネットワークにおける固執行動および脱線行動の両方を支持することができる単一細胞現象を意味する。Ｄ２の活性化が、これらのニューロンにおけるスパイクを増大する活性依存性脱分極を介して、運動応答または随伴発射の引き金となる出力信号を媒介する前頭前野ニューロンのサブセットに影響を及ぼす場合（７、９、１８、２７）、結果として生じる異常なまたは長期のスパイク（図２Ａ、Ｂ、図３Ｃ、Ｅ）が、皮質ネットワークによって媒介されるプロセスにおける脱線行動に対応する乱雑なまたは不適切な出力信号を生じさせる可能性がある。極めて高レベルのＤ２の活性化は、一方で、双安定性（図３Ａ）または脱分極によるスパイクの阻止（図３Ａ、Ｅ）を引き起こす可能性があり、出力信号を防止し、固執性または緊張病性のネットワーク行動に対応する。高用量の抗精神病薬を用いたＤ２受容体の遮断は、この重要な出力ニューロンの集団における前頭前野の情報伝達を抑制し（図２Ｃ、Ｄ、Ｆ、図３Ａ、Ｃ）、臨床的に観察されるように、精神運動制止遅滞およびパーキンソニズムに寄与する可能性があるため、治療の副作用もまた、この細胞表現型によって説明されるかもしれない。Ｄ２受容体の過剰な活性化および遮断の両方が同様の表現型（スパイクの減少）をもたらすという事実は、他の精神医学的現象、例えば、ＤＩ受容体の活性化の効果のＵ字曲線（１９）、およびＭｅＣＰ２の過剰発現および過小発現によって引き起こされる同様の神経学的憎悪（２８）等を連想させる。
【0111】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルは、全ゲノム関連解析によって統合失調症と関連付けられているが（２９）、現在まで、それらの役割に関する明確な仮説が存在しなかった。事実、わずかな例外を除いて（３０）、特定のニューロンにおけるイオンチャネルを精神疾患の症状と関連付けることは非常に困難であった。遺伝子の研究もまた、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを統合失調症において見られるものと同様の脱線思考および認知障害を含む（３２）双極性障害と関係付けており（３１）、我々は、長期Ｌ型電流（３５）によってＬ型Ｃａ２＋チャネルの活性の増加をもたらすように設計されたマウス系（３３、３４）が、Ｖ層ニューロンにおいて同様の細胞機能不全を誘発したことを最近発見した（図４Ｄ）。我々はまた、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルの拮抗作用により社会的行動が損なわれた一方で、同じ用量が、この行動においてＰＣＰによって誘発された障害をレスキューしたことも発見した（図４Ｃ）。適度な用量のニフェジピンおよび他のＬ型カルシウムチャネル拮抗薬は、統合失調症の治療のために有望である場合もあるが（３６〜３８）、決定的な研究が欠落している。本明細書において報告された知見は、前頭前野ニューロンの特定の亜集団における特定のイオンチャネルによってもたらされる現象を、統合失調症および他の精神疾患に関連する総体症状と関連付ける、関連性のある細胞エンドフェノタイプを提供することにより、そのような研究の慎重な設計および用量選択に情報を提供することができる。
【0112】
上述の発明は、明確な理解のための説明および例としてある程度詳細に記載してきたが、説明および例は、本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【0113】
本明細書に開示される全ての参考文献、刊行物、および特許出願は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。参考文献
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配列
ＣｈＲ２のアミノ酸配列：
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP （配列番号１）
ＳＦＯのアミノ酸配列：
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP （配列番号２）
ＳＳＦＯのアミノ酸配列：
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSAIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP （配列番号３）
Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列：
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED （配列番号４）
Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）のアミノ酸配列：
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Ｃ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）のアミノ酸配列：
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Ｃ１Ｖ１ （Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）のアミノ酸配列：
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED （配列番号７）
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]