特許 5986576 新規アジュバント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5986576

(24)【登録日】2016年8月12日

(45)【発行日】2016年9月6日

(54)【発明の名称】新規アジュバント

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160823BHJP

   C07K 14/44 20060101ALI20160823BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20160823BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20160823BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20160823BHJP

   A61K 39/008 20060101ALI20160823BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20160823BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160823BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/44

   C07K19/00

   A61K39/00 A

   A61K39/39

   A61K39/008

   A61P37/04

   A61P43/00 105

【請求項の数】23

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2013-538198(P2013-538198)

(86)(22)【出願日】2011年11月10日

(65)【公表番号】特表2014-500719(P2014-500719A)

(43)【公表日】2014年1月16日

(86)【国際出願番号】EP2011069849

(87)【国際公開番号】WO2012062861

(87)【国際公開日】20120518

【審査請求日】2014年10月16日

(31)【優先権主張番号】61/412,034

(32)【優先日】2010年11月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10190705.3

(32)【優先日】2010年11月10日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513115350

【氏名又は名称】ラボラトリオス レティ，エセ．エレ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100090343

【弁理士】

【氏名又は名称】濱田 百合子

(74)【代理人】

【識別番号】100105474

【弁理士】

【氏名又は名称】本多 弘徳

(72)【発明者】

【氏名】ベダテ，カルロス アロンソ

(72)【発明者】

【氏名】アルバレス，マヌエル ソト

(72)【発明者】

【氏名】パロディ，ヌリア デラ フエンテ

(72)【発明者】

【氏名】ピコ デ コアニャ，ヤゴ スアレス

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５３３４７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１３８４５１（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １４／００−１４／８２５

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ．その全長にわたり、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、
ｉｉ．その全長にわたり、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、および
ｉｉｉ．その相補鎖が、配列（ｉ）又は（ｉｉ）の核酸分子と高度のストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列によって表される核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が抗原をコードしているヌクレオチド配列へ作動可能に連結されているとき、アジュバントとして使用するための核酸分子であって、
該核酸分子は、その全長にわたり、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている配列がない、核酸分子。

【請求項2】

前記核酸の配列が、前記抗原をコードしているヌクレオチド配列へ作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

核酸分子が、患者において抗原特異的免疫応答を誘発し得るポリペプチドをコードしている、請求項２に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記抗原が、患者の疾患又は症状に関連づけられることが知られている任意の生物に由来する、請求項２または３に記載の核酸分子。

【請求項5】

前記抗原が、自己（ｓｅｌｆ）もしくは自家（ａｕｔｏ）抗原であるか、或いはウイルス又は、細菌、酵母真菌、もしくは寄生虫などの微生物に由来する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項6】

請求項１に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチド。

【請求項7】

請求項２〜５のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチド。

【請求項8】

請求項１に記載の核酸分子を含む核酸構築物。

【請求項9】

請求項２〜５のいずれか１項に記載の核酸分子を含む核酸構築物。

【請求項10】

請求項１に記載の核酸分子、及び／又は請求項６に記載のポリペプチド、及び／又は請求項８に記載の核酸構築物を含む組成物。

【請求項11】

請求項２〜５のいずれか１項に記載の核酸分子、及び／又は請求項７に記載のポリペプチド、及び／又は請求項９に記載の核酸構築物を含む組成物。

【請求項12】

薬物として使用するための、請求項２〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項13】

前記薬物がワクチンである、請求項１２に記載の核酸分子。

【請求項14】

薬物として使用するための、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項15】

請求項１４に記載の薬物として使用するためのポリペプチドであって、該薬物がワクチンである、ポリペプチド。

【請求項16】

薬物として使用するための、請求項９に記載の核酸構築物。

【請求項17】

前記薬物がワクチンである、請求項１６に記載の薬物として使用するための核酸構築物。

【請求項18】

薬物として使用するための、請求項１１に記載の組成物。

【請求項19】

前記薬物がワクチンである、請求項１８に記載の薬物として使用するための組成物。

【請求項20】

請求項２〜５のいずれか１項に記載の抗原に関連する疾患又は症状を治療するための薬物の製造のための、請求項１に記載の核酸分子、請求項６に記載のポリペプチド、請求項８に記載の核酸構築物、及び／又は請求項１０に記載の組成物の使用。

【請求項21】

前記抗原に関連する疾患又は症状を治療するためのワクチンである薬物の製造のための、請求項２〜５のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項７に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸構築物、及び／又は請求項１１に記載の組成物の使用。

【請求項22】

ヒトでない患者において、請求項２〜５のいずれか１項に記載の抗原に関連する疾患又は症状を治療する方法であって、前記治療が、請求項１に記載の核酸分子、請求項６に記載のポリペプチド、請求項８に記載の核酸構築物、及び／又は請求項１０に記載の組成物を含む方法。

【請求項23】

ヒトでない患者において、請求項２〜５のいずれか１項に記載の抗原に関連する疾患又は症状を治療する方法であって、前記治療が、請求項２〜５のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項７に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸構築物、及び／又は請求項１１に記載の組成物を含むワクチンを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規アジュバント、及び抗原と組合せたワクチンとしてのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

アジュバントは、その役割が、特異抗原と組合せて用いたとき、抗原特異的免疫応答を増進するか又は指示することである物質として定義される（非特許文献１）。通常、抗原と組合されたアジュバントは、現在利用可能な市販のワクチンの場合と同様、それら自体に対する免疫応答は誘導しない。殆どの抗原は免疫原性が乏しいことから、アジュバントは、こうした抗原に対する自然及び獲得免疫応答を増強、活性化、及び指示するために使用される。アジュバントの概念は、宿主の免疫系と投与された抗原との間の境界において作用する、免疫系の特異細胞上の表面分子と相互作用するキャリアへ拡大されてきた（非特許文献２）。そうすることで、アジュバントは免疫系を刺激することを助け、かつ同時投与された抗原に対する応答を増大させる。それ故、アジュバントはワクチンの開発に広く使用されてきた。

【0003】

アジュバントは、その物理化学的（ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）性質又は作用機序によって分類し得る。アジュバントの２つの主要なクラスには、免疫応答を刺激する細菌毒素などの、免疫系に直接作用する化合物と、制御された方式で抗原提示を促進することができ、かつキャリアとして行動する分子とが含まれる。現在、油、アルミニウム塩、タンパク質、及び核酸を包含する抗原の免疫学的特性を増大するために、数多くのアジュバントが使用されている（非特許文献３）。

【0004】

原則として、抗原に対する応答、及び免疫応答の質は、アジュバントの純度及び性質に大いに依存するものであることから、理想的なアジュバントは、品質管理を促進するような方法で、化学的及び物理的に充分に定義されるべきである。殆どの場合、抗原は充分に定義されていることから、アジュバントの特異性のコントロールが、最終的な抗原特異免疫応答の再現可能な発生を保証するものとなるであろう。このような状況においては、アジュバントは、抗原に対し免疫応答を誘発するばかりでなく、また抗原が宿主において誘発した免疫応答を指示することがあってもよい。もし免疫応答が適切な方向に進行すれば、アジュバントの性質は、治療用製品としての抗原の価値に実質的に影響を及ぼすことができる。抗原に対する免疫応答（液性又は細胞媒介性）の誘導を助けることに加えて、アジュバントの目的は、特定のサイトカインの産生をもたらす免疫エフェクターを誘発することである。さらに、抗原−アジュバント構築物によって誘導される免疫応答の特異性及び大きさは、宿主の免疫細胞の性質に大いに依存し得ることから、アジュバントの効力は、宿主に無関係に分析することはできない。したがって、抗原により誘導される免疫応答は、アジュバントの性質と宿主の免疫系の性質とに依存して変わり得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】ワック（Ｗａｃｋ，Ａ．）ら、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００５年、第１７巻、ｐ．４１１−４１８．

【非特許文献2】セガル（Ｓｅｇａｌ ＢＨ）ら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ」、２００６年６月、第１１巻、第１１−１２号、ｐ．５３４−４０．

【非特許文献3】リード（Ｓｔｅｖｅｎ Ｇ．Ｒｅｅｄ）ら、「Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００３年、第２巻、ｐ．１６７−１８８．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

新規なワクチンが開発中であり、かつ免疫応答の効率的な誘導を得るためにアジュバントはほぼ常に必要であることから、新規なアジュバントが常に必要である。新規なアジュバントはまた、新規な魅力的な特性をワクチンに付与し得る。例えば、それらは誘導された免疫応答のタイプ及び方向に影響を及ぼし得る。

【課題を解決するための手段】

【0007】

第一の態様においては：
ｉ． 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチドをコードしている、ヌクレオチド配列、
ｉｉ． 配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ． その相補鎖が、配列（ｉ）又は（ｉｉ）の核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
ｉｖ． 遺伝コードの縮重のため、（ｉｉｉ）の項目下の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列によって表される核酸分子が提供される。

【発明の効果】

【0008】

本発明者らは、驚くべきことにリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種由来の特定のタンパク質フラグメントの、定義された抗原への遺伝子融合が、その結果得られたキメラタンパク質がインビボでマウスに投与される場合、融合された抗原の免疫原性的潜在能力を有意に増大し得ることを示す。本発明者らはまた、ＤＮＡプラスミド中に存在するキメラ遺伝子のインビボの発現から得られたタンパク質もまた、遺伝子融合された抗原に対し高い液性応答を誘導する一方、抗原をコードする遺伝子のみを含有するプラスミドの投与はそうではないことを示す。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、固相Ｋｍｐ１１を示す図である。Ｋｍｐ１１及びＱに対する液性応答。Ａ：Ｋｍｐ１１（２０μｇ）のｉｐ及びｓｃ投与後の、Ｋｍｐ１１に対するＩｇＧ応答。Ｂ：ＫＡＡＰ（５μｇ）及びＫｍｐ１１（１μｇ）のｉｐ及びｓｃ投与後の、Ｋｍｐ１１に対するＩｇＧ応答。Ｃ：ＫＡＡＰ（５μｇ）のｉｐ及びｓｃ投与後の、Ｑに対するＩｇＧ応答。Ｄ：Ｑ（５μｇ）＋Ｋｍｐ１１（２０μｇ）のｉｐ及びｓｃ投与後の、Ｋｍｐ１１に対するＩｇＧ応答。Ｅ：Ｑ（５μｇ）＋Ｋｍｐ１１（２０μｇ）のｉｐ及びｓｃ投与後の、Ｑに対するＩｇＧ応答。バーは、群内の動物間の応答のばらつきを示す。

【図2】図２は、固相Ｋｍｐ１１を示す図である。Ｋｍｐ１１及びＱに対する液性応答。Ａ：ｉｐ及びｓｃによる、ＫＡＡＰ（１μｇ）及びＫｍｐ１１（０，２５μｇ）の投与後の、Ｋｍｐ１１に対するＩｇＧ液性応答。Ｂ：ｉｐ及びｓｃによる、ＫＡＡＰ（１μｇ）の投与後の、Ｑに対する液性応答。Ｃ：ＫＡＡＰ（１μｇ）のｉｐ及びｓｃ投与後の、Ｋｍｐ１１に対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答。Ｄ：ＫＡＡＰ（１μｇ）のｉｐ及びｓｃ投与後の、Ｑに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答。バーは、群内の動物間の応答のばらつきを示す。

【図3】図３は、固相Ｋｍｐ１１を示す図である。Ｋｍｐ１１及びＱに対する液性応答。Ａ：ｐＲｃＫｍｐ１１（２０μｇ）、ＫＡＡＰ（３μｇ）、及びｐＲｃＫＡＡＰ ２０μｇ）のｓｃ投与後の、Ｋｍｐ１１に対するＩｇＧ応答。Ｂ：ＫＡＡＰ（３μｇ）及びｐＲｃＫＡＡＰ（２０μｇ）のｓｃ投与後の、Ｑに対するＩｇＧ応答。Ｃ：ｐＲｃＫｍｐ１１（２０μｇ）、ＫＡＡＰ（３μｇ）、及びｐＲｃＫＡＡＰ（２０μｇ）のｓｃ投与後の、Ｋｍｐ１１に対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答。Ｄ：ＫＡＡＰ（３μｇ）及びｐＲｃＫＡＡＰ（２０μｇ）のｓｃ投与後の、Ｑに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答。バーは、群内の動物間の応答のばらつきを示す。

【図4.1】図４．１は、固相Ｋｍｐ１１を示す図である。ＰＢＳ、ＫＡＡＰ、及びｐＲｃＫＡＡＰ注射マウスからの、非刺激及びＫＡＡＰ刺激脾細胞におけるサイトカイン産生。バーは、三重の測定間のばらつきを示す。Ｙ軸に示した単位は、ｐｇ／ｍｌで表示されている。Ｘ軸には、ワクチン接種を受けた群が示されている。

【図4.2】図４．２は、固相Ｋｍｐ１１を示す図である。ＰＢＳ、ＫＡＡＰ、及びｐＲｃＫＡＡＰ注射マウスからの、非刺激及びＫＡＡＰ刺激脾細胞におけるサイトカイン産生。バーは、三重の測定間のばらつきを示す。Ｙ軸に示した単位は、ｐｇ／ｍｌで表示されている。Ｘ軸には、ワクチン接種を受けた群が示されている。

【図5.1】図５．１は、固相Ｋｍｐ１１を示す図である。ＰＢＳ、ＫＡＡＰ、及びｐＲｃＫＡＡＰ注射マウスからの、非刺激及びＫｍｐ１１刺激脾細胞におけるサイトカイン産生。バーは、三重の測定間のばらつきを示す。Ｙ軸に示した単位は、ｐｇ／ｍｌで表示されている。Ｘ軸には、ワクチン接種を受けた群が示されている。

【図5.2】固相Ｋｍｐ１１を示す図である。ＰＢＳ、ＫＡＡＰ、及びｐＲｃＫＡＡＰ注射マウスからの、非刺激及びＫｍｐ１１刺激脾細胞におけるサイトカイン産生。バーは、三重の測定間のばらつきを示す。Ｙ軸に示した単位は、ｐｇ／ｍｌで表示されている。Ｘ軸には、ワクチン接種を受けた群が示されている。

【図6】図６Ａ〜Ｃは、固相Ｃｕｐ ａ ４を示す図である。動物は、ＰＢＳ、５μｇのＣＡＡＰ；２μｇのＣｕｐ ａ ４、及び２μｇのＣｕｐ ａ ４＋３μｇのＡＡＰ、の３回の投薬で免疫化された。３回目の投薬の１週間後、血清を収集し、Ｃｕｐ ａ ４に対する反応性を分析した。１Ａ−：ＩｇＧ反応性。１Ｂ−：ＩｇＧ１反応性。１Ｃ−：ＩｇＧ２ａ反応性。血清は、ＩｇＧでは１／２０００、またＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａでは１／１０００希釈において試験した。星印は、統計的有意差を示す。

【図7】図７Ａ〜Ｃは、固相Ｃｕｐ ａ ４を示す図である。動物は、ＰＢＳ、５μｇのＣＡＡＰ；２μｇのＣｕｐ ａ ４、及び２μｇのＣｕｐ ａ ４＋３μｇのＡＡＰ、の２回の投薬で免疫化された。２回目の投薬の１週間後、血清を収集し、Ｃｕｐ ａ ４に対する反応性を分析した。２Ａ−：ＩｇＧ反応性。２Ｂ−：ＩｇＧ１反応性。１Ｃ−：ＩｇＧ２ａ反応性。血清は、ＩｇＧでは１／１６００、またＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａでは１／４００希釈において試験した。星印は、統計的有意差を示す。

【図8】図８は、固相Ｃｕｐ ａ ４を示す図である。ＰＢＳ、１．２５μｇのＣＡＡＰ；０．５μｇのＣｕｐ ａ ４、及び０．５μｇのＣｕｐ ａ ４＋０．７５μｇのＡＡＰの、１回の投薬で免疫化された動物からの血清のＩｇＧ反応性。投薬の１週間後、血清を収集し、Ｃｕｐ ａ ４に対する反応性を分析した。血清は、１／１００希釈において試験した。星印は、統計的有意差を示す。

【図9】図９Ａ〜Ｃは、固相Ｃｕｐ ａ ４を示す図である。動物は、ＰＢＳ、１．２５μｇのＣＡＡＰ；０．５μｇのＣｕｐ ａ ４、及び０．５μｇのＣｕｐ ａ ４＋０．７５μｇのＡＡＰの、２回の投薬で免疫化された。２回目の投薬の１週間後、血清を収集し、Ｃｕｐ ａ ４に対する反応性を分析した。４Ａ−：ＩｇＧ；４Ｂ−ＩｇＧ１；４Ｃ−ＩｇＧ２ａ。血清は、ＩｇＧについては１／４０００、またＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａについては１／１００の希釈において試験した。星印は、統計的有意差を示す。

【図10】図１０は、固相Ｓ１００Ａ２を示す図である。Ｓ１００Ａ２に対する反応性（Ｏ．Ｄ．単位で）。４群の動物（Ｎ＝５）を、Ｓ１００ＡＡＰ（１．０５μｇ）、Ｓ１００Ａ２（０．３μｇ）、ＡＡＰ（０．７５μｇのＡＡＰ）、及びＳ１００Ａ２＋ＡＡＰ（０．３μｇ＋０．７５μｇ）の１回の投薬で免疫化した。対照として用いたもう１つの動物群には、ＰＢＳ緩衝液を投与した。血清は、タンパク質投与の１５日後に取得した。血清を、１／１００の希釈において分析した。

【図11】図１１Ａ〜Ｃは、固相Ｓ１００Ａ２を示す図である。Ｓ１００Ａ２に対する反応性（Ｏ．Ｄ．単位で）。図１に示した動物の同じ群を、Ｓ１００ＡＡＰ（１．０５μｇ）、Ｓ１００Ａ２（０．３μｇ）、ＡＡＰ（０．７５μｇのＡＡＰ）、及びＳ１００Ａ２＋ＡＡＰ（０．３μｇ＋０．７５μｇ）で、１回目の投薬の１５日後に免疫化した。１週間後、血清を取得した。（Ａ）ＩｇＧ反応性。（Ｂ）ＩｇＧ１反応性。（Ｃ）ＩｇＧ２反応性。血清は、１／２００の希釈において分析した。星印は、高い統計的有意差を示す。

【図12】図１２は、発現ベクターＣｕｐ ａ４ ＡＡＰを示す図である。

【図13】図１３は、発現ベクターＳ１００Ａ２ ＡＡＰを示す図である。

【図14】図１４ａ〜ｃは、３回目の免疫化後のＳ１００Ａ２に対する反応性（Ｏ．Ｄ．単位で）。図１に示した動物の同じ群を、Ｓ１００ＡＡＰ（１．０５μｇ）、Ｓ１００Ａ２（０．３μｇ）、ＡＡＰ（０．７５μｇのＡＡＰ）、及びＳ１００Ａ２＋ＡＡＰ（０．３μｇ＋０．７５μｇ）で、２回目の投薬の１５日後に免疫化した。１週間後、血清を取得した。（ａ）ＩｇＧ反応性。（ｂ）ＩｇＧ１反応性。（ｃ）ＩｇＧ２ａ反応性。血清は、１／６４００の希釈において分析した。星印は、統計的有意差を示す（ｐ＜０．０５）。

【発明を実施するための形態】

【0010】

核酸分子
第一の態様においては：
ｉ． 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチドをコードしている、ヌクレオチド配列、
ｉｉ． 配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ． その相補鎖が、配列（ｉ）又は（ｉｉ）の核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
ｉｖ． 遺伝コードの縮重のため、（ｉｉｉ）の項目下の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列によって表される核酸分子が提供される。
前記核酸分子は、好ましくは、前記核酸分子が本明細書で後に定義される通りの抗原をコードしているヌクレオチド配列へ作動可能に連結されているとき、アジュバントとしての使用に向けたものである。

【0011】

本発明において記載された核酸分子は、コードされたタンパク質がアジュバントとして使用できることから魅力的である。アジュバントは、本明細書において、抗原がアジュバントと組合せて投与されるとき、免疫応答又はその増大が前記抗原に対し誘発されるような方法で、該抗原を免疫系に提示することができる分子として定義される。抗原特異的に誘発された免疫応答を分析するため、前記免疫応答が、アジュバントなしで抗原の存在下に誘導された免疫応答と比較される。誘導は、患者又は患者からの細胞において評価する。

【0012】

このような状況においては、抗原特異的に誘発された免疫応答とは、前記抗原に対する誘導免疫応答、又は前記抗原に対する免疫応答もしくは前記抗原に対する検出可能な免疫応答の誘導における増大と同義である。抗原特異的免疫応答を誘発することは、抗原に対する免疫応答を誘導すること、増強すること、又は増大することと置換えてもよい。

【0013】

免疫応答は、Ｂ及び／又はＴ細胞応答であってもよい。免疫応答は、Ｂ細胞応答、即ち前記抗原に対し特異的に向けられた抗体の産生であってもよい。抗体は、好ましくはＩｇＧ抗体、さらに好ましくは、ＩｇＧ２ａ抗体及び／又はＩｇＧ１抗体である。免疫応答は、Ｔ細胞応答、好ましくはＴｈ１応答、Ｔｈ２応答、又はバランスのとれたＴｈ２／Ｔｈ１応答であってもよい。当業者は、疾患によっては、それを管理するのにＢ及び／又はＴ細胞応答が誘導される必要があってもよいことを承知している。前記抗体の産生は、ＥＬＩＳＡにより、好ましくは実施例において行われた通りに評価することもできる。別法として、前記免疫応答は、例えば、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、又はＩＬ−１０などの、サイトカインの産生を測定することにより検出してもよい。かかるサイトカインの産生は、ＥＬＩＳＡにより、好ましくは実施例において行われた通り評価することもできる。

【0014】

好ましい実施態様においては、抗原特異的に誘発された免疫応答の検出とは、前記検出が前記アジュバント及び抗原の投与後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間もしくはそれより後か、或いは前記アジュバント及び抗原の投与の少なくとも１日後、又は少なくとも２日後、又は少なくとも３日後、又は少なくとも４日後もしくはそれより後に行われることを意味する。検出は、患者又は患者からの細胞において、好ましくは実施例において行われた通り評価される。

【0015】

本発明のこのような状況においては、抗原特異的に誘発された免疫応答とは、好ましくは、前記抗原に対する検出可能な免疫応答を意味する。検出可能な増大は、前記アジュバント及び抗原の投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２時間もしくはそれより後か、或いは少なくとも１日後、又は少なくとも２日後、又は少なくとも３日後、又は少なくとも４日後もしくはそれより後における、本明細書において既に特定された通りの抗体及び／又はサイトカインの量の、好ましくは少なくとも５％、又は１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％もしくはそれより多い増大を意味する。検出は、患者又は患者からの細胞において、好ましくは実施例において行われた通り評価される。

【0016】

好ましくは、本明細書において先に定義された具体的な特定のアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１、配列番号２）と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性もしくは類似性を有する前記アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、コードされたポリペプチドがアジュバントとして適格である場合、機能性であると言える。前記アミノ酸配列によって表される前記ポリペプチドは、抗原と共に使用されたとき、前記抗原に対する免疫応答を少なくともある程度まで誘発すること、誘導すること、増強すること、又は増大することができる。「少なくともある程度」までとは、好ましくは、配列番号１を用いて検出される抗原特異的免疫応答の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％ということを意味する。抗原に対する免疫応答を誘発すること、誘導すること、増強すること、又は増大することとは、本明細書において先に定義されている。

【0017】

本明細書に定義された核酸分子は、好ましくは、配列番号２の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２個又はそれより多い連続したヌクレオチドを含んでなり、かつそのコードされたポリペプチドが、本明細書において先に定義された通りの抗原と共に使用されたとき、抗原に対し免疫応答を誘発すること、誘導すること、増強すること、又は増大することが可能な分子である。好ましい実施態様においては、本明細書に定義された通りの前記核酸分子は、好ましくは、配列番号２の少なくとも７６２、７６５、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、又は１１１０個の連続したヌクレオチドを含む分子である。１つの好ましい実施態様においては、本明細書に定義された通りの前記核酸分子は、好ましくは、配列番号２の多くとも１１１０、１０００、９９０、９８０、９７０、９６０、９５０、９４０、９３０、９２０、９１０、９００、８９０、８８０、８７０、８６０、８５０、８４０、８３０、８２０、８１０、８００、７９０、７８０、７７０、又は７６５個の連続したヌクレオチドを含む分子である。

【0018】

本明細書に定義されたポリペプチドは、好ましくは、配列番号１の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２個又はそれより多い連続したアミノ酸を含んでなり、かつ本明細書において先に定義された通りの抗原と共に使用されたとき、抗原に対し免疫応答を誘発すること、誘導すること、増強すること、又は増大することが可能なポリペプチドである。好ましい実施態様においては、本明細書に記載された通りの前記核酸分子は、好ましくは、配列番号１の少なくとも２５４、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、又は３７０個の連続したアミノ酸を含む分子である。好ましい実施態様においては、本明細書に定義された通りの前記核酸分子は、好ましくは、配列番号１の多くとも３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、又は２５４個の連続したアミノ酸を含む分子である。配列番号１からなるポリペプチドはまた、ＡＡＰ（増強剤及び活性化剤タンパク質）とも呼ばれる。

【0019】

本発明に包含されるアミノ酸又はヌクレオチド配列は、本明細書に特定された通りの配列の１つから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれより多いヌクレオチド又はアミノ酸を、それぞれ置換すること、挿入すること、欠失すること、又は付加することにより誘導されてもよい。本発明に包含されるアミノ酸は、本明細書に特定された通りの配列の１つから、安定性、溶解性、及び免疫原性を高めるべく、付加的なＮ−もしくはＣ−末端アミノ酸、又は化学基を添加することにより誘導されてもよい。１つの実施態様においては、本発明に包含されるアミノ酸配列は、配列番号１に存在する少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換によって、配列番号１から誘導される。置換されてもよい前記アミノ酸は、ヒスチジンであってもよい。当業者は、ヒスチジンがアスパラギン又はグルタミンで置換されてもよいことを承知している（即ち、本明細書で後に定義される通りの保存的置換）。それ故、１つの実施態様においては、本発明に包含されるアミノ酸配列は、配列番号１に由来し、かつ１、２、３、４、５、又は多くとも６個のヒスチジンを含む。したがって、１つの実施態様においては、本発明に包含される核酸配列は、配列番号２に由来し、かつ１、２、３、４、５、又は多くとも６個のヒスチジンを含むアミノ酸配列をコードしている。１つの実施態様においては、前記アミノ酸配列は何らヒスチジンを含むことはなく、及び／又は、前記対応する核酸配列はヒスチジンを含むことはないアミノ酸配列をコードしている。

【0020】

したがって、１つの実施態様においては、核酸分子は：
ｉ． 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチドをコードしているヌクレオチド配列、
ｉｉ． 配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の配列同一性又は類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ． その相補鎖が、（ｉ）又は（ｉｉ）の配列の核酸分子に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び
ｉｖ．遺伝コードの縮重のため、（ｉｉｉ）の項目下の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列によって表され、
かつここで、前記核酸分子は、１、２、３、４、５、又は多くとも６個のヒスチジンを含むアミノ酸配列をコードしている。好ましくは、前記核酸分子はヒスチジンを含むことはないアミノ酸配列をコードしている。好ましくは、前記核酸分子において、ヒスチジンをコードする少なくとも１つのコドン、又はヒスチジンをコードする少なくとも２、３、４、５、もしくは６個のコドンが、アスパラギン又はグルタミンをコードするコドンで置換されている。

【0021】

１つの好ましい実施態様においては、本明細書において先に定義された通りのヌクレオチド配列により表される本発明の核酸分子は、抗原をコードしているヌクレオチド配列をさらに含む。本発明者らは、抗原をコードする対応するヌクレオチド配列が本明細書において先に定義された通りのアジュバントをコードしている核酸分子に、含まれてなっていたか、融合されていたか、又は作動可能に連結されていた場合、本発明のアジュバントによって誘発された免疫応答が最適であったことを見出した。それ故、本発明のアジュバントは、好ましくは、そのコードしているヌクレオチド配列が、抗原をコードしているヌクレオチド配列へ融合されるか、又は作動可能に連結されるような方法で使用される。

【0022】

１つの好ましい態様においては、本発明の前記核酸分子は、その全長にわたり、配列番号３と同一か又は少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７６％、７５％であるポリペプチドをコードしている配列がないか、又は含むことはない。

【0023】

抗原は、本明細書では、ある分子が患者に存在するとき、前記抗原に対して誘起された抗体により認識されることが可能な前記分子として定義される。抗原が患者に存在するとき、特異的な免疫応答を前記患者から誘導することができる前記抗原は、免疫原性がある又は免疫原であると言われる。免疫応答は、好ましくは本明細書において先に定義された通りである。抗原は、好ましくはポリペプチド又はペプチドである。ペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれより多いアミノ酸を含んでなっていてもよい。抗原は、本明細書で後に特定される通りの生物に起源する、タンパク質フラグメント又は完全長タンパク質であってもよい。同じ生物からのいくつかの抗原を用いて、その生物と戦う際により有効になるようにすることも可能である。抗原はまた、核酸配列により表される、コードしている核酸分子を参照することによって定義されてもよい。

【0024】

抗原の供給源は、タンパク質、タンパク質の消化物、及び／又はそれらのフラグメントでもよく、それらは精製された形態であってもよく、或いは、好ましくは生物学的起源の粗組成物、例えば細菌ライセート、寄生虫ライセート、酵母ライセート、ウイルスライセート、真菌ライセート、超音波処理物、又は凝固物の中に含まれてなっていてもよい。別法として、抗原は、化学的に合成されるか又はインビトロで酵素的に産生されてもよい。抗原としてのタンパク質又はそのフラグメントの源はまた、ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型からの、前記のものをコードしている核酸又はそのフラグメントであってもよい。ＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、「裸」のＤＮＡであってもよく、好ましくはベシクルもしくはリポソーム中に含まれてなるか、又はそれらは核酸構築物もしくはベクター中に含まれてなっていてもよい。ベクターは、当該技術分野において公知の任意の（組換え）ＤＮＡ又はＲＮＡベクターでよく、かつ好ましくはプラスミドであり；ここで、潜伏期関連抗原をコードしている遺伝子は、コードされたメッセンジャーの発現及び翻訳を付与する調節配列に対し、作動可能に連結されている。ベクターはまた、限定するものではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、改変ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）、又は鶏痘ウイルスなどの、任意のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスか、或いは選ばれた患者の体内にポリペプチドの発現を付与することができる任意の他のウイルスベクターでもよい。ＤＮＡベクターは、エピソーム式複製ベクターなどの、非組込み型であってもよく、或いはランダムな組込みによるか又は相同組換えにより、宿主ゲノム中に組込まれるベクターであってもよい。

【0025】

任意選択でウイルス又はプラスミドなどのベクター中にはめ込まれた、本発明による抗原タンパク質又はそのフラグメントをコードしている遺伝子を含むＤＮＡ分子が、患者のゲノム中に組込まれてもよい。本発明の好ましい実施態様においては、かかる宿主は微生物であってもよい。好ましくは、かかる組換え微生物は、本発明によるポリペプチド又はそのフラグメントを宿主に送達することができる、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、又はウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）などの種であり、かつ最も好ましくは、ウシ型結核菌カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））、又はスメグマ菌である（Ｙｕｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ，（２００７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１４１：４１−４８，Ｃａｙａｂｉｙａｂ Ｙ．ｅｔ ａｌ，（２００６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：１６４５−１６５２に記載の通り）。組換えＢＣＧ及び組換えの方法は、当該技術分野において公知である；例えば、国際公開第２００４／０９４４６９号。かかる組換え微生物は、Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２７（６１２２）：５３２−５に示された通り、生きた組換え体及び／又は生きた弱毒化ワクチンとして製剤されてもよい。ベクターはまた、限定するものではないが、生きた弱毒化及び／又は組換え赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）もしくはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細菌などの、細菌起源の宿主中に含まれてなっていてもよい。

【0026】

本発明のこのような状況においては、患者はヒト又は動物を意味する。本発明の範囲内に包含される動物は、哺乳類、好ましくはイヌを含む。

【0027】

抗原は、患者の疾患又は症状に関連づけられることが知られている、任意の生物に由来してもよい。抗原は、細菌、酵母、真菌、寄生虫などの微生物に由来してもよい。別法として、抗原はウイルスに由来してもよい。抗原はまた、例えば、癌又は腫瘍抗原に、関連するか又はつながる、自己（ｓｅｌｆ）又は自家（ａｕｔｏ）抗原であってもよい。抗原はまた、アレルギー疾患に関連づけられるか又は結びつけられてもよい。

【0028】

疾患は、寄生虫症であってよい。この場合、抗原は、アピコンプレックス門（ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）（例えば、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ））及び／又はキネトプラスト（ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａｅ）門に属する原虫、とりわけトリパノソーマ科のメンバー、さらにとりわけトリパノソーマ科の原虫リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）の様々な種に由来してもよい。リーシュマニアには、Ｌ．メジャー（Ｌ．ｍａｊｏｒ）を含む大型リーシュマニア群（ｃｏｍｐｌｅｘ Ｌ．ｍａｊｏｒ）と、Ｌ．チャガシ（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）、Ｌ．ドノバニ（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）、及びＬ．インファンツム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）を含むドノバンリーシュマニア群（ｃｏｍｐｌｅｘ Ｌ．Ｄｏｎｏｖａｎｉ）と、Ｌ．アマゾネンシス（Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）及びＬ．メキシカーナ（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）を含むメキシコリーシュマニア群（ｃｏｍｐｌｅｘ Ｌ．Ｍｅｘｉｃａｎａ）とを含む、リーシュマニア亜属の種、並びに、Ｌ．ブラジリエンシス（Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びＬ．ペルビアナ（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎａ）を含むブラジルリーシュマニア群（ｃｏｍｐｌｅｘ Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）と、Ｌ．グヤネンシス（Ｌ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）及びＬ．パナメンシス（Ｌ．ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）を含むガイアナリーシュマニア群（ｃｏｍｐｌｅｘ Ｌ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）とを含む、亜種ビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）を含む、２０を超える公知の種がある。好ましい実施態様においては、抗原は、リーシュマニア種、好ましくはリーシュマニア・メジャー及び／又はリーシュマニア・インファンツムに由来する。もう１つの好ましい実施態様においては、抗原は、プラスモジウム種から得られる。とりわけ興味のあるプラスモジウム種は、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及びプラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）である。

【0029】

例えば、抗原が寄生虫から、好ましくはリーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア種から由来する場合、前記化合物は、イボラらによる刊行物（Ｉｂｏｒｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ ２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：３８６５−７６）に記載された通りの寄生虫症を引き起こす寄生虫に由来する、別のタンパク質の供給源からなる群から選択することもできる。抗原の好ましいタンパク質供給源は、このような状況においては、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４などのヒストンか、又はＬｉＰ０、Ｌ２、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ１６、Ｓ６、Ｌ３、Ｌ５、及びＳ４などのリボソームタンパク質である。好ましいＨ２Ａタンパク質は、配列番号３によって表される。Ｈ２Ａをコードしている好ましい核酸は、配列番号４によって表される。好ましいＨ２Ｂタンパク質は、配列番号５によって表される。Ｈ２Ｂをコードしている好ましい核酸は、配列番号６によって表される。好ましいＨ３タンパク質は、配列番号７によって表される。Ｈ３をコードしている好ましい核酸は、配列番号８によって表される。好ましいＨ４タンパク質は、配列番号９によって表される。Ｈ４をコードしている好ましい核酸は、配列番号１０によって表される。好ましいＬｉＰ０タンパク質は、配列番号１１によって表される。ＬｉＰ０をコードしている好ましい核酸は、配列番号１２によって表される。好ましいＬ２タンパク質は、配列番号１３によって表される。Ｌ２をコードしている好ましい核酸は、配列番号１４によって表される。好ましいＬ７タンパク質は、配列番号１５によって表される。Ｌ７をコードしている好ましい核酸は、配列番号１６によって表される。好ましいＬ８タンパク質は、配列番号１７によって表される。Ｌ８をコードしている好ましい核酸は、配列番号１８によって表される。好ましいＬ１６タンパク質は、配列番号１９によって表される。Ｌ１６をコードしている好ましい核酸は、配列番号２０によって表される。好ましいＳ４タンパク質は、配列番号２１によって表される。Ｓ４をコードしている好ましい核酸は、配列番号２２によって表される。好ましいＳ６タンパク質は、配列番号２３によって表される。Ｓ６をコードしている好ましい核酸は、配列番号２４によって表される。好ましいＬ３タンパク質は、配列番号２５によって表される。Ｌ３をコードしている好ましい核酸は、配列番号２６によって表される。好ましいＬ５タンパク質は、配列番号２７によって表される。Ｌ５をコードしている好ましい核酸は、配列番号２８によって表される。

【0030】

別の例は、ストバーら、及びエビシャーら、及びポウトら（Ｓｔｏｂｅｒ Ｃ．Ｂ．Ｕ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ（２００６），Ｖａｃｃｉｎｅ．，２４：２６０２−２６１６；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ Ｔ．，ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，６８：１３２８−１３３６；及びＰｏｏｔ Ｊ ｅｔ ａｌ，（２００９），Ｖａｃｃｉｎｅ，２７：４４３９−４４４６）に見られる通りの、いくつかの寄生虫抗原を含有するポリ−プロテインの使用である。

【0031】

次の段落では、ヒストンタンパク質はまた、抗原のタンパク質供給源として使用してもよい。好ましい化合物は、ヒストンタンパク質もしくはそのフラグメント、又は前記ヒストンもしくは前記ヒストンフラグメントをコードしている核酸分子を包含する。さらに好ましくは、ヒストンタンパク質は、ＥＰ １ ６８７ ０２３において同定された通りの、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及び／又はＨ４である。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４は、充分に保存された核タンパク質であり、かつそれらの配列は、当該技術分野において周知である（Ｒｅｑｕｅｎａ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ ２０００；Ｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｔｏｄａｙ １６：２４６−５０）。好ましくは、ヒストンは、疾患を引き起こす生物と系統樹において近接している生物から得られる。それ故、リーシュマニア症などの寄生虫症の治療において使用されるべきヒストンの供給源として特に興味深いのは、原虫、例えばプラスモジウムである。加えて、興味深いのは、トリパノソーマ科のメンバー、より詳細にはトリパノソーマ科の原虫リーシュマニアの様々な種である。

【0032】

他の好ましい化合物は、他のリボソームタンパク質もしくはそのフラグメント、又は前記タンパク質もしくはそのフラグメントをコードしている核酸分子を包含する。他のリボソームタンパク質の例は、Ｌ１９及びＳ４を包含する。

【0033】

他の好ましい化合物は、国際公開第２００９／０９０１７５号において同定された通りの、リボソームタンパク質抽出物を包含する。

【0034】

疾患は、限定するものではないが、アレルギー又は癌を包含する。癌に関連づけられるか又は癌に特異的であることが知られている任意のタイプの抗原を、本発明のこのような状況において使用してもよい。かかるタイプの抗原はまた、腫瘍抗原とも称される。腫瘍抗原は、突然変異した癌遺伝子もしくは突然変異した腫瘍抑制遺伝子のタンパク質産物、又は腫瘍もしくは癌において発現されることが知られている任意の遺伝子もしくは突然変異した遺伝子のタンパク質産物であってもよい。腫瘍抗原は、過剰発現されたか、又は異常に発現された遺伝子のタンパク質産物であってもよい。腫瘍抗原は、癌ウイルスのタンパク質産物であってもよい。腫瘍抗原は、癌胎児遺伝子のタンパク質産物であってもよい。腫瘍抗原の例には、以下の遺伝子のタンパク質産物が包含される：アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｐ５３、又はＣＤ２０。本明細書で定義された通りの腫瘍抗原はまた、タンパク質産物の一部、即ち本明細書で特定された通りの遺伝子のタンパク質産物から由来するポリペプチド、ペプチドであってもよい。

【0035】

好ましい癌抗原は、ＣＤ２０又はそのフラグメントを包含する。ＣＤ２０は、いくつかのＢ細胞性悪性腫瘍において発現される。ＣＤ２０を代表する好ましいアミノ酸配列は、配列番号３７として特定される。このような状況における好ましい抗原は、配列番号３７の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれより多い連続したアミノ酸を含んでなり、及び／又は、配列番号３７と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性もしくは類似性を有する。

【0036】

癌は、胃腺腫及び／又は乳腺腫瘍でもよい。好ましい癌抗原は、Ｓ１００Ａ２タンパク質又はそのフラグメントを包含する。Ｓ１００Ａ２タンパク質は、ヒト胃腺癌（１）及び乳腺（２）腫瘍の進行に関連してアップレギュレートされる、カルシウム結合タンパク質である。Ｓ１００Ａ２を代表する好ましいアミノ酸配列は、配列番号４２として特定される。好ましいＳ１００Ａ２をコードしている好ましい核酸配列は、配列番号４３として特定される。このような状況における好ましい抗原は、配列番号４２の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個又はそれより多い連続したアミノ酸を含んでなり、及び／又は、配列番号４２と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性もしくは類似性を有する。

【0037】

疾患は、アレルギーであってもよい。抗原はまた、アレルギー疾患に関連するか又は結びつけられてもよい。好ましいアレルギー抗原の例は、イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）の種、好ましくはアリゾナイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ）からのアレルゲン（Ｃｕｐａ４又はＣｕｐａ１）を包含する。好ましいＣｕｐａ４を（表す）コードしている好ましい核酸配列は、配列番号３８として特定される。好ましいＣｕｐａ１を（表す）コードしている好ましい核酸配列は、配列番号３９として特定される。好ましいＣｕｐａ４を表す好ましいアミノ酸配列は、配列番号４０として特定される。好ましいＣｕｐａ１を表す好ましいアミノ酸配列は、配列番号４１として特定される。このような状況における好ましい抗原は、配列番号３８もしくは３９によってコードされる（表される）アミノ酸配列の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個の連続したアミノ酸、又はそれより多くを含んでなり、及び／又は、配列番号３８もしくは３９によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性もしくは類似性を有する。

【0038】

このような状況におけるもう一つの好ましい抗原は、配列番号４０もしくは４１によって表されるアミノ酸配列の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個の連続したアミノ酸、又はそれより多くを含んでなり、及び／又は、配列番号４０もしくは４１によって表されるアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性もしくは類似性を有する。

【0039】

しかしながら、当業者は、本発明がこの具体的な抗原に限定されないことを理解するであろう。

【0040】

本明細書において特定された抗原の各々（即ち、タンパク質、その一部、ポリペプチド、又はペプチド）は、好ましくは、本明細書で先に定義されたアジュバントであるポリペプチドと一緒に、又はそれへ融合されて使用される。それは、好ましい態様において、抗原をコードしている核酸分子が、そのコードされたポリペプチドがアジュバントとして機能する本明細書で先に定義された通りの本発明の核酸分子に、作動可能に連結されていることを意味する。さらに好ましい実施態様においては、アジュバントとして機能するポリペプチドをコードしている本明細書で先に定義された通りの本発明の核酸分子に、作動可能に連結されている、抗原をコードしている前記核酸分子は、１つの単一なポリペプチドをコードしている１つの単一な核酸分子である。前記ポリペプチドは、キメラポリペプチドと称されてもよい。このキメラポリペプチドは、本発明のアジュバントへ融合された抗原を含むか又はそれから構成されている。このキメラポリペプチドは、５’及び／又は３’末端において、及び／又は抗原とアジュバントとの間に、１つ以上の付加的なアミノ酸を含んでなっていてもよい。

【0041】

本発明はそれ故、本明細書で先に定義した通りの核酸分子であって、この核酸配列が所与の抗原をコードしているヌクレオチド配列に作動可能に連結されているとき、前記抗原のためのアジュバントとして挙動することができるポリペプチドをコードしている、該核酸分子を提供する。好ましい実施態様においては、この核酸分子は、患者において抗原特異的免疫応答を誘導することができるポリペプチドをコードする。それ故、本発明は、２つのタイプの核酸分子：
−アジュバントをコードしている核酸分子を含むか又はそれから構成されているもの、
−抗原をコードしている核酸分子へ融合された、アジュバントをコードしている核酸分子を含むか又はそれから構成されているもの、
を包含する。

【0042】

当業者は、使用する供給源のタイプ（タンパク質ベース又は核酸ベース）に依存して、どちらのタイプの製剤が適切であるかを理解するであろう。抗原は、そのまま（裸のタンパク質又は核酸）で投与されてもよい。別法として、核酸ベースの供給源は、本明細書に定義された通りの核酸構築物を使用して投与されてもよい。好ましくは、タンパク質ベースの製剤が選択される。より好ましくは、本明細書で先に特定された通りのキメラポリペプチドが使用される。

【0043】

もう１つの実施態様においては、抗原はウイルスに由来してもよい。それに由来する抗原が公知である、ヒトにおいて疾患を引き起こす任意のウイルスは、本発明の範囲内に包含される。

【0044】

もう１つの実施態様においては、酵母、真菌、アレルゲン、癌細胞、又は任意の他の病的細胞から由来してもよい。それに由来する抗原が公知である、ヒトにおいて疾患を引き起こす任意の酵母又は真菌は、本発明の範囲内に包含される。

【0045】

したがって、本発明の核酸分子は、前記核酸分子が抗原をコードするヌクレオチド配列を含むとき、抗原特異的免疫応答を誘導することができる、本明細書において特定された通りのポリペプチド、好ましくはキメラポリペプチドをコードする。

【0046】

ポリペプチド
さらなる態様において、本明細書において先に特定された通りの核酸分子によってコードされたポリペプチドが提供される。このポリペプチドは、アジュバントと、好ましくは先のセクションにおいて定義された通りの抗原とを含む。

【0047】

本明細書に用いるとき、「ポリペプチド」は、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、又はタンパク質を指す。ポリペプチドは、連続したアミノ酸を含む。用語「ポリペプチド」は、天然産又は合成された分子を包含する。

【0048】

核酸構築物
さらなる態様においては、先のセクションにおいて特定された通りの核酸分子を含む核酸構築物が提供される。この核酸構築物は、先のセクションにおいてアジュバントとして定義されたポリペプチドをコードしている核酸分子を含んでなっていてもよい。この核酸構築物は、アジュバントとして定義されたポリペプチドをコードしている核酸分子と、先のセクションにおいて定義された抗原をコードしている核酸分子とを含んでなっていてもよい。

【0049】

本発明はまた、本発明の核酸構築物を含む、発現ベクターにも関係する。好ましくは、発現ベクターは、細胞、患者、又は無細胞発現系において、コードされたポリペプチドの産生又は発現を指示する１つ以上の調節配列に作動可能に連結されている、本発明のヌクレオチド配列を含む。発現ベクターは、組換え発現ベクターとして理解されてもよい。

【0050】

したがって、アジュバントを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）か、又はアジュバントで構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）か、又はアジュバントからなる（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）ポリペプチドをコードしている、本明細書に定義された通りの核酸分子は、好ましくは、薬物として、さらに好ましくはアジュバントとして使用するためのものである。したがって、前記ポリペプチドは、好ましくは薬物として、さらに好ましくはアジュバントとしての使用に向けたものである。

【0051】

したがって、アジュバント及び抗原を含むか、又はアジュバント及び抗原で構成されるか、又はアジュバント及び抗原からなるポリペプチドをコードしている、本明細書に定義された通りの核酸分子は、好ましくは、薬物として、さらに好ましくは前記抗原に対するワクチンとしての使用に向けたものである。したがって、前記ポリペプチドは、好ましくは薬物として、さらに好ましくは前記抗原に対するワクチンとしての使用に向けたものである。

【0052】

本発明のワクチンは、治療用ワクチンとして機能してもよい。典型的には、抗原との接触、即ち、感染と、前記抗原に関連する疾患の最初の症状の出現との間には、期間がある。この場合、ワクチンは、疾患の病理学的影響を相殺する免疫応答を宿主において誘発することにより、疾患を防止及び／又は治療し、及び／又はその進行を遅延させることとなる、薬理学的免疫産物として作用することとなる。治療用ワクチンは、治療用ワクチンが感染又は疾患を既に有している患者において防御を誘導することができるという点で、予防用ワクチンとは異なる。もう１つの実施態様においては、ワクチンは、予防用ワクチンである。予防用ワクチンは、前記患者が前記抗原に接触する前に投与されてよい。

【0053】

本明細書で定義された通りの薬物は、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内、又は病巣内経路による、注射又は注入によって投与される。好ましい投与様式は、皮下である。薬物は、当該技術分野において公知の通常の技術により、薬学的に許容される媒体又は送達ビヒクルと組合されてもよい。例えば、薬物は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されてもよい。非経口投与可能な組成物を調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、第２０版、ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＰＡ、ＵＳＡ、２０００年を含む様々な出典においてさらに詳細に記載されている。薬物は、好ましくは、治療上有効な投与量、即ち、本明細書に定義された通りの疾患又は症状と戦うために、ヒト又は動物の免疫系の能力を増大することができる量で投与される。好ましくは、本発明の薬物の治療上有効な投与量は、前記疾患又は症状の発生を、防止及び／又は遅延させることができる。当業者は、疾患又は症状に依存して、疾患又は症状の発生を追跡するために、前記疾患の発生に関連したどのパラメータ又は症状を選択すべきかを理解するであろう。

【0054】

本発明はさらに、本発明の核酸分子又はポリペプチドに加えて、もう１つの別個の既知のアジュバントの使用を包含する。任意の既知のアジュバントが、本発明において使用されてよい。当業者は、いくつかの適切なアジュバントを承知している。アジュバントは、最も好ましくは以下のアジュバントのリストから選択される：カチオン性（抗菌性）ペプチド、サポニン、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、例えば、限定するものではないが、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧモチーフ、ＬＰＳ、リピドＡ、リポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓ、及び細菌のフラジェリン又はその一部、及び化学修飾を有するその誘導体。本発明による方法及び組成物において使用するための、他の好ましいアジュバントは：生菌もしくは死菌ＢＣＧとの混合物、前記潜伏期関連抗原もしくはその一部との免疫グロブリン複合体、ＩＣ３１（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ．ｃｏｍより；国際公開第２００３／０４７６０２号で）、ＱＳ２１／ＭＰＬ（ＵＳ２００３０９５９７４）、ＤＤＡ／ＭＰＬ（国際公開第２００５／００４９１１号）、ＤＡ／ＴＤＢ（国際公開第２００５／００４９１１号；Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００４ Ｍａｒ；７２（３）：１６０８−１７）、及び可溶性ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）（ｗｗｗ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｐ．ｃｏｍより；ＵＳ２００２１９２１９５）である。加えて、もう１つの好ましいアジュバントは、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｙｕｍ、又はプロピオノバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ Ｔ．，ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，６８：１３２８−１３３６、Ｐｏｏｔ Ｊ ｅｔ ａｌ，（２００９），Ｖａｃｃｉｎｅ，２７：４４３９−４４４６、及びＦｅｒｒｅｉｒａ Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ，（２００８），Ｖａｃｃｉｎｅ，２６：６７−６８５）の使用を包含する。

【0055】

特に好ましいアジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用することが知られているものである。自然免疫系を活性化することができるアジュバントは、ＴＬＲの１−１０を包含するＴｏｌｌ様受容体を介し、及び／又はＲＩＧ−１（レチノイン酸誘導遺伝子−１）タンパク質を介し、及び／又はエンドテリン受容体を介して、特に良好に活性化される。ＴＬＲ受容体を活性化することができる化合物、並びにその修飾及び誘導体は、当該技術分野において充分に実証されている。ＴＬＲ１は、細菌リポタンパク質及びそのアセチル化体により活性化されてもよく；ＴＬＲ２は、加えて、グラム陽性細菌糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、フィンブリエ、外膜タンパク質、細菌由来又は宿主由来の熱ショックタンパク質、及びマイコバクテリアのリポアラビノマンナンにより活性化されてもよい。ＴＬＲ３は、特にウイルス由来の、ｄｓＲＮＡによるか、又は化学化合物ポリ（Ｉ：Ｃ）により活性化されてもよい。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主由来又は細菌由来の熱ショックタンパク質、ウイルスコート又はエンベエロープタンパク質、タキソール又はその誘導体、オリゴ糖を含有するヒアルロナン、及びフィブロネクチンにより活性化されてもよい。ＴＬＲ５は、細菌鞭毛、又はフラジェリンで活性化されてもよい。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアのリポタンパク質、及びＢ群連鎖球菌の易熱性可溶性因子（ＧＢＳ−Ｆ）、又はブドウ球菌のモジュリンにより活性化されてもよい。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリン及び誘導体により活性化されてもよい。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、又はクロマチン−ＩｇＧ複合体により活性化されてもよい。とりわけ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９は、ウイルス感染に対する自然免疫応答を媒介する際に重要な役割を果たしており、これらの受容体を活性化することができる化合物は、本発明における使用には特に好ましい。とりわけ好ましいアジュバントは、限定するものではないが、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬ３及びＴＬ９受容体をトリガーする非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニストを含む合成生成された化合物を含む。もう１つの好ましい実施態様においては、アジュバントは、本明細書で先に定義された通りの核酸分子に物理的に連結されている。アジュバント及び共刺激化合物又は官能基の、ペプチドを含むＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープへの物理的連結は、その役割が抗原を取込み、代謝し、かつ提示することである抗原提示細胞、とりわけ、樹状細胞の同時刺激によって、増強された免疫応答を提供する。もう１つの好ましい免疫修飾化合物は、Ｔ細胞接着阻害剤、さらに好ましくはＢＱ−７８８などのエンドテリン受容体の阻害剤である（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ，（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４８９２）。ＢＱ−７８８は、Ｎ−ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−ガンマ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかしながら、任意のＢＱ−７８８誘導体又は修飾されたＢＱ−７８８化合物もまた、本発明の範囲内に包含される。

【0056】

他のアジュバントは、ＭＰＬ−ＳＥ（Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、又はＥＭ００５（ＩＤＲＩ，ＵＳＡ）を包含する。

【0057】

好ましい実施態様においては、アジュバントは、Ｔｈ_１促進アジュバント（ＣｐＧ ＯＤＮモチーフを含むアジュバントのような）である。Ｔｈ１促進アジュバントは、文献（Ｌｉｕ Ｎ， ｅｔ ａｌ（２００３），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６８７−６９３）において、所与の抗原と一緒に使用した場合、処理された患者の脾細胞の上清中に、この抗原と共に培養されたときに検出されるような、該抗原に対するＴｈ_１免疫応答を、促進するか、トリガーするか、又は誘導するか、又はその増大を誘導することができるアジュバントとして定義されている。対照として、Ｔｈ１免疫応答の促進又はトリガリングが、抗原及びアジュバントで処理されたことのない同じ患者の脾細胞集団において、又は抗原で処理されただけの同じ集団を用いて評価される。Ｔｈ_１免疫応答をトリガーすること又は促進することは、好ましくは、処理された患者の脾細胞を抗原と共に培養することにより、及び／又は抗原特異的ＩｇＧ２ａ免疫グロブリンの産生を誘導することにより検出されるような、ＩＦＮγの誘導によって定義される。このサイトカイン及びＩｇＧ２ａの誘導の評価は、本明細書において既に定義されている。好ましい実施態様においては、Ｔｈ−１促進アジュバントは、オリゴデオキシヌクレオチドであるか、又はそれを含むか、又はそれからなる。さらに好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、ＣｐＧを含むか、又はＣｐＧからなり、これにおいてＣは、メチル化されていない（ＣｐＧ ＯＤＮ）：３’プリン−ＣｐＧ−５’ピリミジンである。好ましいオリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホロチオアート修飾ＯＤＮ配列であるか、又はそれを含むか、又はそれからなる。かかる修飾を有するオリゴデオキシヌクレオチドの使用は、使用したオリゴデオキシヌクレオチドがそれ故、非修飾オリゴヌクレオチドよりも安定であること、及びそれ故、ひとたびそれらが血流中にあるとなれば容易に分解されることはないことから有利である。好ましいＴｈ−１促進アジュバントは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つからなるか、又はそれを含む。免疫刺激性ＯＤＮの好ましい配列（５’から３’へ）は、ＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡ（配列番号２９）及びＧＣＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴ（配列番号３０）であった。当業者は、本明細書に明確に記載された配列に限定されない。本明細書で先に定義された通りのＴｈ−１促進特性を伝える別の配列をデザインしてもよい。

【0058】

好ましい実施態様においては、本明細書で定義された通りの薬剤（又は医薬用製剤、又は医薬組成物、又は薬物）は、感染症及び／又は疾患、好ましくは寄生虫感染症、及び／又は寄生虫症と戦うための、患者の免疫系の能力を増大するために使用される。とりわけ、それをヒト又は動物の患者に投与するために使用してもよい。本明細書に定義された通りの薬剤は、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内、鼻腔内、又は病巣内経路による、注射又は注入によって投与される。好ましい投与様式は、皮下である。本発明は、本明細書で定義された通りの薬物又は核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドの、特定の投与様式に限定されない。好ましい投与様式は、カプセル又は錠剤を用いた経口投与である。別法として、本明細書で定義された通りの薬物又は核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドは、カテーテルもしくはポンプ、又は坐剤により、局所的に投与されてもよい。別法として、本明細書で定義された通りの薬物又は核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドは、外用投与されてもよい。本明細書で定義された通りの薬物又は核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドの、或いは前記化合物を含む組成物の製剤は、意図された投与様式及び（治療）適用に依存する。医薬担体は、前記化合物を患者に送達するのに適した、任意の適合性の非毒性物質でよい。例えば、滅菌水、又は不活性な固体、又は賦形剤が、担体として使用されてもよく、通常は薬学的に許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤などが補足される。組成物は、液体、例えば前記化合物又は前記化合物を含む組成物の安定化された懸濁液の状態か、或いは固体及び／又は乾燥形態：例えば粉末の状態のいずれかになる。経口及び直腸内投与には、前記化合物を、カプセル、錠剤、坐剤、及び粉末などの固体剤形か、又はエリキシル、シロップ、クリーム、軟膏、浣腸剤、及び懸濁液などの液体剤形で投与し得る。もう１つの形態は、半固体又は半液体の形態でもよく、これにおいて前記化合物は、パッチなどの固体支持物の中又はその上の液体形態として存在する。

【0059】

薬剤は、当該技術分野において公知の通常の技術により、薬学的に許容される媒体、又は送達ビヒクルと組合されてもよい。例えば、本明細書で定義された通りの薬物又は核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチド、及び任意選択で第２のアジュバントを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解してもよい。非経口投与可能な組成物を調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、「レミントンの薬学」、第２０版、ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＰＡ、ＵＳＡ、２０００年を含む様々な出典においてさらに詳細に記載されている。薬剤は、好ましくは、治療上有効な投与量、即ち、本明細書に定義された通りの感染症又は疾患と戦うための、ヒト又は動物の免疫系の能力を増大することができる量で投与される。好ましくは、本発明の医薬用製剤の治療上有効な投与量は、本明細書に定義された通りの免疫応答を誘発することができる：投与量は、それが、本明細書で定義された通りに処置された患者において、特異抗原に対し適切な免疫応答を誘発するか、又は適切な免疫応答を誘導するかもしくはその増大を誘導することができるとき、治療上有効である。なおさらに好ましくは、誘発又は誘導された免疫応答は、防御免疫応答である。好ましい実施態様においては、本明細書で定義された通りの薬剤は、ワクチンである。さらに好ましい実施態様においては、少なくとも５、１０、１５、又は２０マイクログラムの、本明細書で定義された通りの核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドがワクチンにおいて使用されている。前記ワクチンは、少なくとも１回、２回、３回、４回、又はそれより多く投与されてもよい。本明細書で定義された通りのワクチンは、予防用又は治療用のワクチンでもよい。本明細書で定義された通りの核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドがその中に溶解されてもよい体積は、１００ないし５００マイクロリットルで変動してもよい。

【0060】

組成物
加えて、核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドと、任意選択で第２のアジュバント、好ましくはＴｈ_１促進アジュバントとを含む組成物が提供される。前記組成物のそれぞれの特徴は、本明細書において既に定義されている。好ましい実施態様においては、この組成物は、本明細書で特定された通りの核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドからなり、好ましいＴｈ_１促進アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。好ましい組成物は、ＰＢＳ又は適切な緩衝液中に溶解された、核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドと、任意選択で第２のアジュバント、好ましくはＴｈ_１促進アジュバントとを含むか、又はそれらからなる。本明細書で既に定義された通り、抗原は、前記ペプチドもしくはポリペプチド中に含まれるものとして既に存在するか、或いは前記核酸分子の一部によってコードされているか、又は前記核酸構築物中に存在する核酸分子の一部によってコードされているものとして存在してもよい。さらに好ましい実施態様においては、核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドと、任意選択で第２のアジュバント、好ましくはＴｈ１促進アジュバントとが、連続的に投与されることも、本発明によって包含される。それ故、各成分はそれらが双方とも患者に投与される限り、１つの組成物中に物理的に存在する必要はない。

【0061】

かかる組成物は、薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体をさらに含んでなっていてもよい。

【0062】

かかる組成物は、好ましくは薬剤として、又は薬物としての使用に向けたものである。薬剤は、好ましくはワクチンである。薬剤、アジュバント、及びワクチンは、本明細書で既に広範囲に定義されている。

【0063】

組成物は、本明細書で既に定義された通り、液体、固体、又は半液体もしくは半固体の形態であってもよい。

【0064】

１つの好ましい実施態様においては、治療用又は予防用の処置の特異性を改善する目的で、別の化合物が、核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドと連続的に又は同時に使用される。例えば、処置された患者の免疫応答をさらに増強する別の化合物を使用することは有利である。さらに好ましくは、かかる化合物は、核酸分子又は核酸構築物又はペプチド又はポリペプチドと一緒に、１つの組成物中には存在しない。

【0065】

使用
したがって、アジュバントをコードしている本明細書で特定された通りの核酸分子、抗原をコードしている核酸分子、対応するペプチド、対応するポリペプチド、対応する核酸構築物、及び／又は対応する組成物の、本明細書で先に特定された通りの抗原に関連する疾患又は症状を治療するための薬物製造のための使用がさらに提供される。それ故、抗原に関連する疾患又は症状を治療するためのワクチンである薬物製造のための、抗原をコードしている核酸分子へ作動可能に連結された、アジュバントをコードしている本明細書で特定された通りの核酸分子、対応するペプチド、対応するポリペプチド、対応する核酸構築物、及び／又は対応する組成物の使用がさらに提供される。

【0066】

この使用についてのそれぞれの特徴は、本明細書において既に定義されている。

【0067】

治療法
さらなる態様においては、抗原に関連する疾患又は症状を治療する方法であって、前記治療が、アジュバントをコードしている核酸分子、及び抗原をコードしている核酸分子、対応するペプチド、対応するポリペプチド、対応する核酸構築物、及び／又は対応する組成物を含む、該方法が提供される。

【0068】

したがって、本明細書で特定された抗原に関連する疾患又は症状を治療する方法であって、前記治療がワクチンを含んでなり、前記ワクチンが、抗原をコードしている核酸分子に作動可能に連結された、アジュバントをコードしている本明細書で特定された通りの核酸分子、対応するペプチド、対応するポリペプチド、対応する核酸構築物、及び／又は対応する組成物を含む、該方法がさらに提供される。

【0069】

この方法についてのそれぞれの特徴は、本明細書において既に定義されている。

【0070】

定義
配列同一性
「配列同一性」は、本明細書において、配列を比較することにより測定される通りの、２つ以上のアミノ酸（ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）配列、或いは２つ以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド）配列の間の関係として定義される。当該技術分野においては、「同一性」はまた、アミノ酸又は核酸配列間の、場合によっては、一連のかかる配列間のマッチによって測定される通りの、配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換体を、第２のペプチド又はポリペプチドの配列と比較することにより測定される。好ましい実施態様においては、同一性又は類似性は、本明細書で特定された通りの配列番号全体にわたり計算される。「同一性」及び「類似性」は、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されたものを含む公知の方法によって容易に計算し得る。

【0071】

同一性を測定するための好ましい方法は、検査された配列間の最大マッチを与えるべくデザインされる。同一性及び類似性を測定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムにおいて集成される。２つの配列間の同一性及び類似性を測定するための好ましいコンピュータプログラム法は、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）を包含する。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給源から公に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を測定するために使用してよい。

【0072】

ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を包含する：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：ＢＬＯＳＳＵＭ６２、Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）より；ギャップペナルティ：１２；及びギャップ長ペナルティ：４。これらのパラメータと共に有用なプログラムは、「Ｏｇａｐ」プログラムとして、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．に立地するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐより公に入手可能である。上記のパラメータは、アミノ酸比較用のデフォルトパラメータである（末端ギャップに対するペナルティなし）。

【0073】

核酸比較のための好ましいパラメータは、以下を包含する：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；及びギャップ長ペナルティ：３。ギャッププログラムとして、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．に立地するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐより公に入手可能。上記に示したのは、核酸比較用のデフォルトパラメータである。

【0074】

任意選択で、アミノ酸類似性程度を測定するため、当業者はまた、当業者には明らかであるような、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。保存的アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり；アミノ含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；かつ硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されたアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列の少なくとも１つの残基が除去されており、かつその場所に別の残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸交換は、保存的である。天然産アミノ酸の各々について好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａ／ｓｅｒ；Ａｒｇ／ｌｙｓ；Ａｓｎ／ｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐ／ｇｌｕ；Ｃｙｓ／ｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎ／ａｓｎ；Ｇｌｕ／ａｓｐ；Ｇｌｙ／ｐｒｏ；Ｈｉｓ／ａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅ／ｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕ／ｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓ／ａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔ／ｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅ／ｍｅｔ、ｌｅｕ、又はｔｙｒ；Ｓｅｒ／ｔｈｒ；Ｔｈｒ／ｓｅｒ；Ｔｒｐ／ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌ／ｉｌｅ又はｌｅｕ。

【0075】

ハイブリダイゼーション条件
核酸分子用のハイブリダイゼーション条件は、低度又は中度又は高度のストリンジェンシーを有してもよい（サザンブロッティング法）。低度又は中度又は高度のストリンジェンシー条件とは、４２℃における、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、２００ｐｇ／ｍｌのせん断及び変性されたサケ精子ＤＮＡ、及び、低度又は中度又は高度のストリンジェンシーについて、それぞれ２５％又は３５％又は５０％のいずれかのホルムアミド中での、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。続いて、ハイブリダイゼーション反応を、２ＸＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ、及び低度又は中度又は高度のストリンジェンシーについて、それぞれ５５℃又は６５℃又は７５℃を使用して、３０分間ずつ３回洗浄する。

【0076】

核酸構築物、発現ベクター、作動可能に連結された、発現、調節配列
核酸構築物は、天然産遺伝子から単離されるか、又はさもなければ自然界に存在しない方法で組合されているか又は並置されている、核酸セグメントを含有するべく修飾されている核酸分子として定義される。核酸分子は、ヌクレオチド配列によって表される。任意選択で、核酸構築物中に存在するヌクレオチド配列は、細胞又は患者において、前記ペプチド又はポリペプチドの産生又は発現を指示する１つ以上の調節配列へ、作動可能に連結されている。

【0077】

「作動可能に連結された」とは、本明細書において、調節配列が、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に対し、細胞及び／又は患者における本発明のペプチド又はポリペプチドの産生／発現を、該調節配列が指示するような位置に適切に置かれている立体配置として定義される。

【0078】

「作動可能に連結された」はまた、配列（即ち、アジュバントとして定義された）が、抗原をコードしているもう１つの配列に対し、細胞及び／又は患者においてキメラポリペプチド（即ち、抗原に融合されたアジュバントを含む）が生成されるような位置に適切に置かれている立体配置を定義するために使用してもよい。

【0079】

「作動可能に連結された」は、本明細書で定義された通りのアジュバントとして挙動し得るタンパク質をコードしている配列の、本明細書で定義された通りの抗原をコードしている配列への、結果としてキメラタンパク質をコードしているキメラ核酸配列を生じる遺伝子融合を指す。

【0080】

発現は、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を包含する、ペプチド又はポリペプチドの産生にかかわる任意の段階を含むものと理解されよう。

【0081】

調節配列は、本明細書において、ポリペプチドの発現に必要又は有利である全ての成分を包含するべく定義される。最低でも、調節配列はプロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。任意選択で、核酸構築物中に存在するヌクレオチド配列によって表されるプロモーターは、本明細書で特定された通りのペプチド又はポリペプチドをコードしているもう１つのヌクレオチド配列へ、作動可能に連結されている。

【0082】

発現ベクターは、組換えＤＮＡ法を都合よく受けることができ、かつ細胞及び／又は患者において本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現をもたらし得る、任意のベクターでもよい。本明細書で用いるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の、転写方向に対して上流に位置する、１つ以上の遺伝子又は核酸の転写を調節するべく機能する核酸フラグメントを指す。それは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の結合部位、転写開始部位、及び、限定するものではないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写の量を調節するべく直接又は間接的に作用する当業者に公知の任意の他のヌクレオチド配列を包含する、任意の他のＤＮＡ配列の存在によって特定される、結合部位に関係づけられる。本発明の状況の中では、プロモーターの終端部は、好ましくは転写開始部位（ＴＳＳ）のヌクレオチド−１である。

【0083】

本文書及びそのクレームにおいて、動詞「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用型は、その語に続く項目は包含されるけれども、具体的に挙げられなかった項目が除外されていないことを意味するべく、非制限的な意味で使用される。加えて、動詞「からなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書で定義された通りの核酸構築物の生成物、又は組成物、又は核酸分子、又はペプチドもしくはポリペプチドが、具体的に同定されたもの以外の付加的な成分を含んでなっていてもよいことを意味する「本質的に〜からなる」で置換えてもよく；前記付加的な成分は、本発明の独自の特徴を変えるものではない。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、１つの要素が存在すること及び複数の要素のうちのただ１つが存在することを文脈が明らかに必要としない限り、１つ以上の要素が存在する可能性を除外するものではない。それ故、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常は「少なくとも１つ」を意味する。

【0084】

本明細書に引用された全ての特許及び文献は、その記載全体が参照により本明細書に組入れられる。

【0085】

以下の実施例は、例示を目的として提示されたにすぎず、何ら本発明の範囲を制限することを意図したものではない。

【実施例】

【0086】

セクションＩ
材料及び方法
動物及び免疫化。雌の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ Ｓ．Ａ．（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）から購入した。動物の免疫化は、結果のセクションに包含される図の凡例に示された通りの、腹腔内（ｉｐ）又は皮下（ｓｂ）経路によって行われた。マウスを、眼窩静脈叢穿刺により出血させた。

【0087】

キメラＫｍｐ１１ＡＡＰ遺伝子を発現するＤＮＡプラスミドの構築
Ｈ２Ａ抗原決定基のアミノ及びカルボキシル末端をコードしているＤＮＡ配列を、キメラクローンｐＰＱ（Ｓｏｔｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ Ｊａｎ；３６（１）：５８−６３）から、ＢａｍＨＩ消化により取出した。ＰＱ又はＱの核酸配列は、配列番号４６によって表される。ＰＱ又はＱのアミノ酸配列は、配列番号４７によって表される。結果として得られた、Ｈ２Ａ決定基をコードする配列のないクローンを、ｐＡＡＰ（配列番号２）と命名した。Ｋｍｐ１１タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、プラスミドｐＢＬｓ−ＫＭＰ−１１（Ｆｕｅｒｔｅｓ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ ６（２００１）１０７−１１７）中に存在する該タンパク質をコードしているＤＮＡ配列の、順行５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＴＡＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号３１）及び逆行５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＴＧＧＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＧＣＡＧＣ−３’（配列番号３２）オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅によって得た。次いでＫｍｐ１１タンパク質をコードしているＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化し、ｐＡＡＰ（Ｈ２Ａ決定基を欠く、ＢａｍＨＩ消化されたｐＰＱクローン）（配列番号３３）に挿入した。結果として得られた、ｐＫｍｐ１１Ａと称されるクローンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｍ１５株）に形質転換した。ｐＫｍｐ１１ＡＡＰクローンによって発現された、キメラの精製されたタンパク質は、ＫＡＡＰ（配列番号３４）と称された。Ｋｍｐ１１を逆向きにコードする配列の挿入を有するクローンの選択を避けるため、１０番目−１２番目の位置に、ＴＴＡトリプレットが含められた。Ｋｍｐ１１タンパク質とｐＡＡＰによってコードされたタンパク質フラグメントとの間の交点にフレキシビリティを与えるため、９番目−１１番目の位置に、グリシンをコードしているトリプレットが導入された。

【0088】

プラスミドｐＲｃＫＡＡＰの構築
ＫＡＡＰタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有するＤＮＡプラスミドを構築するため、上記に示されたｐＫｍｐ１１ＡＡＰプラスミドを、順行５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号３５）及び逆行５’−ＣＡＴＴＡＣＴＧＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧ−３’（配列番号３６）をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅した。ＤＮＡ配列を、ｐＲｃ／ＣＭＶ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化プラスミドに挿入した。プラスミドｐＲＣは、Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎにより市販されている。ＤＮＡプラスミドは、エンドトキシンフリーのＧｉｇａ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。

【0089】

タンパク質精製
クローンｐＫｍｐ１１ＡＡＰによって発現された、組換えタンパク質ＫＡＡＰ、並びに組換えＱ及びＫｍｐ１１タンパク質（Ｓｏｔｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）Ｊａｎ；３６（１）：５８−６３、及びＰｌａｎｅｌｌｅｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００２）；８０（３）：２４１−７）の精製は、Ｎｉニトリロ三酢酸樹脂カラム上で、供給業者（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供された方法に従い、変性条件下に実施した。

【0090】

ｐＲｃＫＡＡＰによるＫＡＡＰ及びＫｍｐ１１タンパク質の発現
ＣＯＳ７細胞に、２０μｇのｐＲｃＫｍｐ１１ＡＡＰ又はｐＲｃＫｍｐ１１プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。簡単に言えば、３ｘ１０^６個のコンピテント細胞を、１００ｍｍプレート上で、５％ ＦＣＳを加えたダルベコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）中に播種し、それらが５０〜７５％集密に達したときトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に細胞を収穫し、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、直ちにレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の緩衝液の添加により溶解させた。タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に移した。ブロットを、ＫＡＡＰタンパク質で免疫化されたマウスからの血清を用いてプローブした。抗ＫＡＡＰと反応する、予想されたサイズのタンパク質バンドが、ブロットにおいて観察された。

【0091】

液性応答の分析
血清試料を、Ｑ又はＫｍｐ１１に対する特異的抗体について分析した。簡単に言えば、標準的なＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２μｇ／ｍｌのＱ又はＫｍｐ１１を含有する１００μｌのＰＢＳで、室温において一晩コートした。ＩｇＧ及びアイソタイプ特異的分析は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて行った：抗ＩｇＧ及び抗ＩｇＧ１の希釈（１：１０００）、かつ抗ＩｇＧ２ａの希釈（１：５００）。オルトフェニレンジアミンジヒドロクロライド−ＯＰＤ−（Ｄａｋｏ，Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、基質として使用した。１５分後、１００μｌの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４の添加により反応を停止した。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

【0092】

サイトカイン分析
最後の免疫化の１週間後、無菌条件下で、ＤＭＥＭ培地を含有する無菌皿の上に、マウスから脾臓を摘出した。単一細胞懸濁液は、オートクレーブしたメッシュを用いて脾臓を粉砕することにより調製した。これに５〜１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を添加し、内容物を均一に混合した。透明な上清をゆっくりとピペットアウトした。細胞は、４℃において２５０ｇで（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５遠心分離機、ＨＢ−４ローター）１０分間の遠心分離によってペレット化した。赤血球及び脾細胞を含有するペレットが収集された。ペレットを、０．９％塩化アンモニウムで１回洗浄して、赤血球を溶解した。１つの群の各マウスからの脾細胞をプールし、１０％ＦＣＳ及び０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ中で、１０^７細胞／ｍｌの密度に再懸濁し、次に１．５ｍｌのエッペンドルフ管にて、２００ｍｌのアリコート（５ｘ１０^５細胞）に分けた。脾細胞を、１２μｇ／ｍｌのＫＡＡＰ又はＫｍｐ１１で再刺激した。細胞を、５％ＣＯ_２及び９５％の湿度を含有する雰囲気下に、３７℃で４８時間インキュベートした。各群（Ｎ＝４）からのマウスの上清をプールした。全ての測定は、三重に行った。細胞増殖を調節するため、ＣｏｎＡ（３μｇ／ｍｌ）処理細胞の上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を測定した。未処理の細胞に比較して、多量のＩＦＮ−γ（１０００倍）及びＩＬ−２（２００倍）が、ＣｏｎＡ処理細胞において検出された。

【0093】

サイトカイン測定。細胞培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＩＬ−１０濃度を、ＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。結果は、ＦＡＣＳ ＣＡＬＩＢＵＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を用いて取得し、ＦＣＡＰソフトウェアを使用して分析した。

【0094】

結果
アミノ酸配列、配列番号１、によりコードされたタンパク質（ＡＡＰ）が、共有結合により結合されたＫｍｐ１１などの抗原に対し、液性応答を増大又は改変することができるかどうかを知るため、ＡＡＰ及びＫｍｐ１１ ＤＮＡの遺伝子融合により形成されたキメラ遺伝子によって発現された、ＫＡＡＰタンパク質をマウスに投与した。ＡＡＰ配列は、７５％の同一性を有するＨ２Ａ抗原に対応する、アミノ及びカルボキシ末端アミノ酸フラグメントをコードしているＤＮＡを除いて、先に記載されたＱ配列に由来する。キメラＫＡＡＰタンパク質においては、Ｋｍｐ１１タンパク質は完全なタンパク質の１／４に相当する。５匹のマウスからなる２つの群に、それぞれ、２０μｇのＫｍｐ１１、５μｇのＫＡＡＰ、及び２０μｇのＫｍｐ１１−５μｇのＱの、３回の投薬を、０日、１５日目、及び３０日目に注射するというアッセイを設計した。タンパク質は、皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）経路によりマウスに投与した。３回目の投薬の１週間後、Ｑ及びＫｍｐ１１に対するＩｇＧの反応性を、ＥＬＩＳＡ試験によって測定した。図１Ａは、Ｋｍｐ１１タンパク質が、ｉｐ経路により投与されたとき、Ｋｍｐ１１に対し高い反応性を誘発したこと、しかしｓｃ経路によってそれが投与された場合、免疫応答をトリガーすることができなかったことを示す。５μｇのＫＡＡＰのｉｐ投与の後、Ｋｍｐ１１に対する応答もまた高く、かつ２０μｇのＫｍｐ１１タンパク質が単独で投与された場合に観察されたものと同様であること、及びさらに、２０μｇのＫｍｐ１１が同じ経路によって単独で投与されたときの応答の欠如とは対照的に、ｓｃ投与後に高い応答がトリガーされたことが観察された（図１Ｂ）。高い応答は、ＫＡＡＰタンパク質がｉｐ又はｓｃのいずれかで投与されたとき、Ｑに対して観察された（図１Ｃ）。

【0095】

５μｇのＫＡＡＰが投与されたとき、Ｋｍｐ１１に対する高い応答が誘発され、かつ５μｇのＫＡＡＰ中のＫｍｐ１１の量が、約１μｇのＫｍｐ１１に相当することから、本発明者らは、１μｇのＫｍｐ１１もまた血清学的応答を誘導し得たかどうかを試験した。図１Ｂは、このたんぱく質がｉｐ投与されたとき、Ｋｍｐ１１に対しわずかな液性応答を誘導することができること（平均ＯＤ＝０．３）、しかしその応答は、５μｇのＫＡＡＰの投与後に誘発されたもの（よりも）有意に低かったことを示している。さらに、予想された通り、１μｇのＫｍｐ１１のｓｃ投与後には、何らＫｍｐ１１に対する反応性がなかったこと、しかし対照的に、５μｇのＫＡＡＰ中に存在する同じ量のＫｍｐ１１の投与後では、応答が高かったことが観察されたといってもよい。

【0096】

Ｋｍｐ１１に対する反応性の増加が、Ｋｍｐ１１とＱタンパク質中に存在するタンパク質フラグメントとの同時投与に起因するかどうかを知る目的で、Ｋｍｐ１１タンパク質を、Ｑと混合して投与した。Ｋｍｐ１１に対する反応性は、混合物がｉｐ投与された場合低下したこと、及び混合物がｓｃ投与された場合、Ｑ中に存在するタンパク質フラグメントはＫｍｐ１１に対し何らアジュバント効果を誘発することはないという指摘通り、Ｋｍｐ１１に対し何ら応答が見られなかったことが観察された（図１Ｄ）。高い血清学的反応性は、Ｑに対して観察された（図１Ｅ）。

【0097】

５μｇのＫＡＡＰの投与後に観察された高い血清学的応答の故に、本発明者らは１μｇのＫＡＡＰの投与後の、Ｑ及びＫｍｐ１１に対する応答を分析した。５匹のマウスに対し、０及び１５日目に、足蹠にｓｃ注射した。ＩｇＧ及びＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ応答は、２回目の投薬の１週間後に分析した。対照として、１μｇのＫＡＡＰ中に存在する量である、０．２５μｇのＫｍｐ１１をマウスに注射した。図２Ａは、ｉｐ又はｓｃのいずれかの投与による１μｇのＫＳＡＡＰの投与後に、Ｋｍｐ１１に対する高い応答が得られたこと、しかし０．２５μｇのＫｍｐ１１の、ｉｐ又はｓｃのどちらの投与後も、何ら応答が得られなかったことを示す。Ｑに対する高い液性応答は、ＫＡＡＰがｉｐ又はｓｃ経路のどちらによって投与された場合も観察された（図２Ｂ）。応答は、３μｇ及び５μｇのＫＡＡＰの投与後に観察されたものと同様であった（データは示さず）。応答のタイプは、Ｋｍｐ１１又はＱのどちらに対しても、主としてＩｇＧ１タイプのものであり（図２Ｃ及びＤ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比は、約０．５であった。

【0098】

ＫＡＡＰをコードしている遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡをマウスに投与した後、ＫＡＡＰタンパク質が液性応答を誘発し得るかどうかを知るため、Ｑ及びＫｍｐ１１に対するＩｇＧ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ａ液性応答を分析した。７匹のマウスからなる群に、０、１５日目、及び３０日目に、２０μｇのｐＲｃＫＱ１、２０μｇのｐＲｃＫｍｐ１１、及び３μｇのＫＡＡＰを、足蹠に注射した。対照動物にＰＢＳを投与した。図３は、ｐＲｃＫＡＡＰの投与後に、Ｋｍｐ１１（図３Ａ）及びＱ（図３Ｂ）に対し、高いＩｇＧ反応性が検出されたこと、及びそれはＫＡＡＰタンパク質の投与後に検出されたものと同様であったことを示している。しかしながら、Ｋｍｐ１１タンパク質をコードしている遺伝子のみを含有するＤＮＡプラスミドの投与後には、何ら応答が得られなかった。反応性がＱに対して分析された場合（図３Ｄ）、バランスのとれたＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比が、ＫＡＡＰ又はｐＲｃＫＡＡＰ投与後のどちらでも検出された。Ｋｍｐ１１に対して試験したとき、平均ＩｇＧ１反応性のわずかな優勢が観察された（図３Ｃ）。

【0099】

サイトカイン産生を、ＫＡＡＰ及びｐＲｃＫＡＡＰ注射マウスからの、非刺激脾細胞において、並びにＫＡＡＰ及びＫｍｐ１１刺激脾細胞において分析した。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０の抗原特異的な産生増大が、ｐＲｃＫＡＡＰ免疫化動物から単離されたＫＡＡＰ刺激細胞において観察された。ＰＢＳ及びＫＡＡＰ免疫化マウスからのＫＡＡＰ刺激細胞によって産生されるサイトカインには、何ら差異が検出されなかった。ＰＢＳ及びＫＡＡＰ免疫化された（マウス）からのＫＡＡＰ刺激細胞において、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０に同様の増加が検出されたことから、非刺激細胞に比較したサイトカイン産生における増加は、ＫＡＡＰ特異細胞の刺激によるよりも、むしろ脾細胞の非特異的刺激による可能性が最も高い。ＩＬ−１７の同様の産生が、ＫＡＡＰで刺激されたＰＢＳ、ＫＡＡＰ、及びｐＲｃＫＡＡＰ免疫化マウスからの脾細胞において観察された（図４）。ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１７の産生増大はまた、ｐＲｃＫＡＡＰ免疫化動物からの脾細胞のＫｍｐ１１刺激後に観察された。また、ＩＬ−１７の産生における増加が、ＫＡＡＰ免疫化マウスからの細胞において観察された。加えて、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−６の非特異的産生が、非刺激細胞に比較してＫｍｐ１１で刺激された細胞培養物において観察された（図５）。

【0100】

結論：
Ｋｍｐ１１の免疫原性的潜在能力は、リーシュマニア・インファンツム由来のＬｉｐ２ａ、Ｌｉｐ２ｂ、及びＰ０タンパク質からのフラグメントによって形成されたキメラタンパク質に対して遺伝子融合されたとき、高度に増大される。Ｋｍｐ１１との、Ｌｉｐ２ａ、Ｌｉｐ２ｂ、及びＰ０フラグメント混合物（しかし融合はされていない）を含有するキメラタンパク質は、Ｋｍｐ１１の免疫原性的潜在能力を増大しない。

【0101】

Ｋｍｐ１１タンパク質は、リーシュマニア・インファンツム由来のＬｉｐ２ａ、Ｌｉｐ３ｂ、及びＰ０タンパク質の抗原決定基をコードしているＤＮＡフラグメントに融合されたＤＮＡとして投与されたとき、高い液性応答を誘発した。Ｋｍｐ１１タンパク質は、ＤＮＡとして単独で投与された場合には、検出可能な液性応答を誘発しない。

【0102】

ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０の抗原特異的な産生増大は、ｐＲｃＫＡＡＰで免疫化された動物から単離された、ＫＡＡＰ刺激細胞において観察された。また、ＩＦＮ−γの産生増大は、Ｋｍｐ１１による刺激後にも観察された。このタイプの産生増大は、ＫＡＡＰで免疫化された動物から単離された、ＫＡＡＰ刺激細胞では観察されなかった。

【0103】

ＡＡＰ ＤＮＡ配列の、インビトロの翻訳から得られるタンパク質を、遺伝子融合されたタンパク質に対する抗体の生成を促進するための道具として使用してもよい。ＡＡＰ ＤＮＡ配列は、ＤＮＡとして投与する場合、抗原の免疫原性的潜在能力を促進するためのベクターとして使用してもよい。

【0104】

ＡＡＰタンパク質は、遺伝子融合された抗原に対する免疫応答を誘発するための、担体として、及びアジュバントとして使用してもよい。

【0105】

セクションＩＩ
材料及び方法
ＣＡＡＰ発現ベクター（Ｃｕｐ ａ ４−ＡＡＰ）の構築
Ｃｕｐ ａ ４は、既にｐＱＥ−３０ベクターにクローン化されており、組換えタンパク質として発現及び精製されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｐ ａ ４，ａ ｎｅｗ ａｌｌｅｒｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ（アリゾナイトスギ由来の新規アレルゲン、Ｃｕｐ ａ ４の分子クローニング及びキャラクタリゼーション），Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ Ｏｃｔ ２２；４０１（３）：４５１−７． Ｙａｇｏ Ｐｉｃｏ ｄｅ Ｃｏａｎａ，Ｎｕｒｉａ Ｐａｒｏｄｙ，Ｍｉｇｕｅｌ Ａｎｇｅｌ Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｊｅｒｏｎｉｍｏ Ｃａｒｎｅｓ，Ｄａｎｉｅｌａ Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｒｅｎａｔｏ Ａｒｉａｎｏ，Ｊｏａｑｕｉｎ Ｓａｓｔｒｅ，Ｇｉａｎｎｉ Ｍｉｓｔｒｅｌｌｏ，Ｃａｒｌｏｓ Ａｌｏｎｓｏ）。次にこのタンパク質を、Ｋ（Ｋｍｐ１１）フラグメント（本特許）を遊離する目的でＫＡＡＰキメラ（ｑｕｉｍｅｒｉｃ）タンパク質をＢａｍ ＨＩで消化した後に調製されていた、ＡＡＰベクターに挿入した。得られた発現ベクターは、ＡＡＰキメラタンパク質プラスＣｕｐ ａ ４ Ｃ．ａｒｉｚｏｎｉｃａアレルゲンを含有する（図１２）。このタンパク質をＣＡＡＰと称する。

【0106】

ＣＡＡＰタンパク質の発現及び精製
ＣＡＡＰタンパク質（レポータータンパク質）をコードしているベクターを、大腸菌発現株Ｍ１５（Ｑｉａｇｅｎ）に形質転換した。発現は、ＣＡＡＰベクターで形質転換ずみの細菌培養物への、１ｍＭ ＩＰＴＧの５時間の添加の後、標準的な条件下に実施した。タンパク質の精製は、ＫＡＡＰについて先に記載した通りに行った。

【0107】

結果
先のセクションで、免疫原性の乏しいタンパク質の免疫応答が、ＡＡＰフラグメントに融合されると、高度に増大されることを示した。ＡＡＰフラグメントがアジュバントとしても役立ち得るかどうか、及びそれ故、アジュバントの不在下でも免疫原性の高いタンパク質の免疫原性的潜在能力を増大し得るかどうかを知る目的で、ＣＡＡＰベクターを構築した。Ｃｕｐ ａ ４は、アリゾナイトスギ（Ｃｕｐｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ）由来のアレルゲン性タンパク質である。イトスギアレルギー患者の１０％において、Ｃｕｐ ａ ４に対し、強いＩｇＧＥ応答がトリガーされることが記載されている。Ｃｕｐ ａ ４に融合されたＡＡＰが、Ｃｕｐ ａ ４の免疫原性を増大するかどうかを調べるため、１群のマウス（Ｎ＝５）には、１匹ずつに、それぞれ３及び２μｇの、ＡＡＰ及びＣｕｐ ａ ４に相当する組換えＣＡＡＰタンパク質５μｇを注射した。第２の群のマウス（Ｎ＝５）には、１匹ずつに、３μｇのＡＡＰと２μのＣｕｐ ａ ４とにより形成される混合物を注射した。第３の群のマウス（Ｎ＝５）には、１匹ずつに、２μｇのＣｕｐ ａ ４タンパク質を注射した。第４の群には、３μｇのＡＡＰを投与した。タンパク質は全てＰＢＳ中に溶解し、何らアジュバントがない状態で、ｓ．ｃ．によりマウスに投与した。

【0108】

Ｃｕｐ ａ ４に対するＩｇＧ反応性を、１／２０００希釈において測定した。予想された通り、ＰＢＳ又はＡＡＰの３回目の投薬の１週間後では、Ｃｕｐ ａ ４に対する応答は何ら観察されなかった（データは示さず）。Ｃｕｐ ａ ４、ＣＡＡＰ、Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ、及びＡＡＰの３回目の投薬の１週間後の、ＩｇＧ応答の結果を図６Ａに示す。Ｃｕｐ ａ ４で免疫化された動物では、免疫原性の高いタンパク質から予想される通り、ＩｇＧ応答がＣｕｐ ａ ４に対して誘発されたことが観察される場合がある。応答は、０．９から２．３までの範囲で変動し、平均値は１．４ＯＤであった。Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰで免疫化された動物では、Ｃｕｐ ａ ４に対する反応性に小さな減少が観察された。このことは、Ｃｕｐ ａ ４と混合されたＡＡＰの投与が、Ｃｕｐ ａ ４の免疫原性を増大しなかったこと、それどころか、ＡＡＰがＣｕｐ ａ ４と競合することを示している。平均値は０．９５ＯＤであった。しかしながら、Ｃｕｐ ａ ４タンパク質がＡＡＰに融合されて（ＣＡＡＰ）投与されると、殆どの動物で応答の増加が観察された。応答は、Ｃｕｐ ａ ４で免疫化された動物において検出された１．４ＯＤとは対照的に、１．１から２．９ＯＤまでの範囲であり、平均値は２．２ＯＤであった。同様の挙動が、Ｃｕｐ ａ ４、Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ、及びＣＡＡＰ、及びＡＡＰ動物からの血清における、Ｃｕｐ ａ ４に対するＩｇＧ応答について、Ｃｕｐ ａ ４の強い免疫原的特性をさらに示すものとして、２回目の投薬の１週間後に観察された（図７Ａ）。ＡＡＰが、Ｃｕｐ ａ ４に対して誘発されたＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答の調節に何らかの影響を及ぼすかどうかを知る目的で、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプの応答を、Ｃｕｐ ａ ４、Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ、及びＣＡＡＰ（血清の希釈 １／４００）で免疫化された動物において、２回目及びその投薬量での投与後１週間で分析した。

【0109】

図７Ｂは、Ｃｕｐ ａ ４の２回目の投与の１週間後においても、ＩｇＧ１反応性の分散された強度が、０．８から２．４ＯＤまでの範囲（平均値１．１）で検出されたことを示している。Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰで免疫化された動物では、Ｃｕｐ ａ ４に対するＩｇＧ１反応性が幾分低く、かつ均一であり、平均値０．７ＯＤの周辺であった。対照的に、ＣＡＡＰで免疫化された動物における、Ｃｕｐ ａ ４に対するＩｇＧ１反応性の平均値は、抗原に融合された場合にアジュバントとしてＡＡＰが挙動することをさらに示すものとして、Ｃｕｐ ａ ４及びＣｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ動物において観察されたものよりも高かった（平均値２ＯＤ）。同様の差異はまた、Ｃｕｐ ａ ４に対するＩｇＧ１反応性が３回目の投薬の１週間後に分析されたとき（図６Ｂ）、特にＣｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ混合物が投与された場合に比較して観察された。Ｃｕｐ ａ ４、ＣＡＡＰ、及びＣｕｐ ａ ４＋ＡＡＰで免疫化された動物からの血清において、３回目の投薬の１週間後にＣｕｐ ａ ４に対するＩｇ２ａ反応性の強さが分析されたとき、Ｃｕｐ ａ ４及びＣｕｐ ａ ４＋ＡＡＰで免疫化された動物の血清において（図６Ｃ）、反応性はそれぞれ平均値０．８及び０．６ＯＤの周辺で均一であったことが観察された。ＣＡＡＰ群で観察されたＩｇＧ２ａ応答は、１．１から２．９ＯＤまでの範囲の値であり、かつ平均値は１．９ＯＤであり、Ｃｕｐ ａ ４及びＣｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ動物において検出されたものよりも高かった。同様の観察が、Ｃｕｐ ａ ４、Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ、及びＣＡＡＰ動物から、２回目の投薬の１週間後に得られた血清を分析した場合に検出された（図７Ｃ）。

【0110】

ＡＡＰの早期のアジュバント能についてさらなる証拠を得るため、１群の動物を、上記に示した実験において用いたＣｕｐ ａ ４、ＣＡＡＰ、及びＣｕｐ ａ ４＋ＡＡＰタンパク質用量の１／４（それぞれ、０．５μｇのＣｕｐ ａ ４、１．５μｇのＣＡＡＰ、及び０．５μｇのＣｕｐ ａ ４＋０．７５μｇのＡＡＰに相当する）で免疫化した。１回目の投薬の１週間後、血清を収集した。Ｃｕｐ ａ ４に対するＩｇＧ反応性は、１／１００希釈において測定した。結果を図８に示す。Ｃｕｐ ａ ４、又はＣｕｐ ａ ４＋ＡＡＰで免疫化されたいずれの動物においても、何らＣｕｐ ａ ４に対する応答はなかったのに対し、ＣＡＡＰで免疫化された動物の全てにおいて陽性の応答が観測されたことが観察された。応答が０．１６から１．７ＯＤまでの範囲で変動したことが、再度観察された。したがって、１匹の動物を除き、応答は、免疫化後のそのような早期の段階において、殆どの動物において高かった。２回目の投薬後、興味深い結果も観察された。Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰ群では、ＡＡＰによってトリガーされる応答は、Ｃｕｐ ａ ４によってトリガーされる応答と競合する。実際、Ｃｕｐ ａ ４に対し、何らの反応性も検出されなかった（図９Ａ）。興味深いことに、この競合は、抗原がＡＡＰに融合された場合は起こらなかった。ＡＡＰのアジュバント能を詳細に識別するため、血清を１／４０００希釈において分析した（図９Ａ）。ＣＡＡＰで免疫化された動物の血清の平均ＯＤは、０，４５ＯＤであり、一方Ｃｕｐ ａ ４動物からの血清のそれは０．１５ＯＤであった。この群では、Ｃｕｐ ａ ４に対する２匹の動物の血清の反応性は、バックグラウンドレベルに近かった。ＣＡＡＰ群の動物からの血清は、全て陽性であった。双方の群におけるＣｕｐ ａ ４に対する反応性間の差異は、統計的有意差であった（ｐ＜０．０５）。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答が分析された場合（１／１００希釈）、上記に示されたデータ（図７Ｂ及び７Ｃ）が確認された（図９Ｂ及び９Ｃ）。ＡＡＰは、抗原へ融合された場合、ＩｇＧ２ａに向けて応答を指示する。ＣＡＡＰの投与による、Ｃｕｐ ａ ４に対する応答の反応性のｐ値は、Ｃｕｐ ａ ４に対し０．０５５であり、Ｃｕｐ ａ ４＋ＡＡＰに対してはｐ＜０．０５であった）。

【0111】

したがって、提示されたデータは、ＡＡＰタンパク質フラグメントが、Ｃｕｐ ａ ４に融合されて投与された場合、Ｃｕｐ ａ ４などの免疫原性の高いタンパク質に対する免疫応答を増大し得るだけでなく、誘発された応答のタイプを、とりわけＩｇＧ２ａ応答に向けて調節し得ることも示している。このタイプのアジュバント活性は、ＡＡＰがタンパク質Ｃｕｐ ａ ４と混合されて投与された場合には観察されない。それどころか、ＡＡＰは、抗原の免疫活性と競合するように見える。

【0112】

セクションＩＩＩ
Ｓ１００ＡＡＰ発現ベクターの調製
Ｓ１００Ａ２ＤＮＡフラグメントの、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ｐＤＥＳＴ−１７ベクター（研究室ストック）における、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧ−３’（配列番号４４）及び５’−ＡＡＣＴＴＡＡＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧ−３’（配列番号４５）プライマーを使用したＰＣＲ増幅の後、それをｐＳＴ Ｂｌｕｅ−１ベクターにサブクローン化した（ＢａｍＨＩ及びＡｆｌ ＩＩ制限部位はイタリック体で示されている）。これを次に、必要な制限部位を含めて合成された、修飾ＡＡＰベクター（ＰＱＥ３０ベクター中）にサブクローン化した。得られた発現ベクターは、ＡＡＰキメラタンパク質の３つのフラグメントプラスＳ１００Ａ２ＤＮＡフラグメントを含有する（図１３）。このベクターを、大腸菌発現株Ｍ１５（Ｑｉａｇｅｎ）中に形質転換した。発現は、標準的な条件下で実施した：１ｍＭ ＩＰＴＧの５時間の使用により０．８ Ｏ．Ｄ．_{４５０ｎｍ}培養物を誘導。最終的なベクターを、Ｓ１００ＡＡＰと命名した。Ｓ１００Ａ２タンパク質は、ＰＱＥ３０ベクター中で発現された。

【0113】

先のセクションにおいて、寄生虫の免疫原性の乏しいタンパク質（Ｋｍｐ１１）に対する免疫応答が、ＡＡＰＤＮＡ配列に融合されると高度に増大すること、及び免疫原性の高い植物タンパク質（Ｃｕｐ ａ４）に対する免疫応答もまた、ＡＡＰＤＮＡ配列に融合されると増大することが示された。また、レポータータンパク質の免疫原性を増大するＡＡＰの能力は、レポーター遺伝子がＡＡＰに遺伝子融合された場合にのみ有効であったことも示された。ＡＡＰフラグメントがアジュバントとしても役立ち得るかどうか、及びそれ故、哺乳動物のタンパク質の免疫原性的潜在能力を増大し得るかどうかを知る目的で、Ｓ１００ＡＡＰベクターを構築した。Ｓ１００Ａ２タンパク質は、ヒト胃腺癌（１）及び乳腺（２）腫瘍の進行に関連してアップレギュレートされる、カルシウム結合タンパク質である。Ｓ１００に融合されたＡＡＰがレポータータンパク質の免疫原性を増大するかどうかを試験するため、１群のマウス（Ｎ＝５）には、１匹ずつに、それぞれ０．７５μｇ及び０．３μｇの、ＡＡＰ及びＳ１００Ａ２に相当する組換えＳ１００ＡＡＰタンパク質１．０５μｇを注射した。第２の群のマウス（Ｎ＝５）には、１匹ずつに、０．７５μｇのＡＡＰと０．３μのＳ１００Ａ２とにより形成される混合物を注射した。第３の群のマウス（Ｎ＝５）には、１匹ずつに、０．３μｇのＳ１００Ａ２を注射した。第４の群には、０．７５μｇのＡＡＰを投与した。タンパク質は全てＰＢＳ中に溶解し、ｓ．ｃ．によりマウスに投与した。対照として、もう一つの群（Ｎ＝５）のマウスには、１匹ずつに、緩衝溶液（ＰＢＳ）を注射した。図１０は、１回目の投薬の１週間後の、１／１００希釈における、Ｓ１００Ａ２に対する全ＩｇＧ応答を示している。予想された通り、ＡＡＰ又はＰＢＳで免疫化されたマウスからの血清は、Ｓ１００Ａ２に対し何ら陽性の反応性を示さなかったことが観察された。Ｃｕｐ ａ ４について先に報告された通り、混合物として投与された場合の２つの免疫原性タンパク質の間の競合効果を示すものとして、１匹のマウスを除いて、Ｓ１００Ａ２に対する反応性は、該タンパク質がＡＡＰへ混合されて投与された場合に減少した（１匹の動物の血清の反応性は陰性であった）。Ｓ１００Ａ２タンパク質のみで免疫化されたマウスからのデータは、投与されたタンパク質が少量であっても、低いがしかし陽性の応答（平均ＯＤ＝０．４１）を誘導し得たことから、該タンパク質もまた、アジュバントの不在下で、マウスにおいて免疫原性であることを示した。それにもかかわらず、Ｓ１００ＡＡＰで免疫化されたマウスにおいて、ＡＡＰとＳ１００Ａ２との間に何ら免疫競合がなかったこと、しかし一方で、投与されたタンパク質がＡＡＰに融合された場合、Ｓ１００Ａ２に対する反応性が増加したこと（３０％）が観察された（平均ＯＤ＝０．５４）。

【0114】

図１１Ａに示した通り、ＡＡＰのアジュバント能は、タンパク質レポーターへ融合された場合、Ｓ１００ＡＡＰ、Ｓ１００Ａ２、ＡＡＰ＋Ｓ１００Ａ２、及びＡＡＰ（１．０５μｇのＳ１００ＡＡＰ；０．３μｇのＳ１００Ａ２；０，７５μｇのＡＡＰプラス０．３μｇのＳ１００Ａ２，及び０．７５μｇのＡＡＰ）の２回目の投薬後に明らかに観察された。Ｓ１００ＡＡＰで免疫化された動物の血清と、Ｓ１００Ａ２タンパク質のみで免疫化されたものの血清との間には、Ｓ１００Ａ２に対する反応性に、統計的有意差が検出された。レポータータンパク質へ融合されなかったＡＡＰの投与後の、Ｋｍｐ１１及びＣｕｐ ａ４に対する反応性について上記に示した観察と一致して、ＡＡＰはレポーターＳ１００Ａ２タンパク質へ融合されなかった場合、何らアジュバント能をもたなかったことが検出された。一方、双方のタンパク質間の免疫競合もまた起こるように見える。したがって、ＡＡＰがアジュバント効果を及ぼすためには、レポータータンパク質へ融合されることが必要であることから、免疫学的に興味深い特徴が、３つの実験デザインから推測されてもよい。言い換えればこのことは、ＡＡＰのビルトインアジュバントの能力が、レポータータンパク質へ遺伝子融合された場合に当てはまることを意味している。アジュバント効果は、応答のタイプを分析したとき、さらに観察された（図１１Ｂ）。Ｓ１００ＡＡＰ投与後のＳ１００Ａ２に対するＩｇＧ反応性は、Ｓ１００Ａ２又はＡＡＰ＋Ｓ１００Ａ２の投与後のＳ１００Ａ２に対する反応性に比較して増大されたことばかりでなく、反応性におけるこの増大はまた、ＩｇＧ２ａタイプを分析した場合にも観察されたことが検出された。Ｓ１００Ａ２の投与後に観察されたＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ反応性の比は、２．１の平均値であったのに対し、動物がＳ１００ＡＡＰで免疫化された場合には、ＡＡＰのアジュバント能はレポータータンパク質へ融合されるとＩｇＧ１−ＩｇＧ２ａ応答をＩｇＧ２ａに向けてトリガーすることを示すものとして、平均値は０．９５であった。タンパク質混合物で動物が免疫化された場合のＩｇＧ応答に関して上記に示された観察と一致して、Ｓ１００ＡＡＰで免疫化された動物の血清のＩｇＧ１反応性は、ＡＡＰ＋Ｓ１００Ａ２で免疫化された動物からの血清よりも有意に高かったことが観察された。ＡＡＰの、レポータータンパク質へ融合された場合にのみＩｇＧ２ａに向かうように復帰する能力をさらに示すものとして、双方の場合のＩｇＧ２ａ応答の平均値は、類似していた。

【0115】

Ｓ１００Ａ２に関連したＡＡＰのアジュバント能はさらに、示された通りの３回目の投与後に、なおより鮮明に観察される：

【0116】

ＡＡＰのアジュバント能をさらに示すものとして、３回目の抗原の投薬後の、同じ動物の血清を分析した。図１４ａ〜ｃは、Ｓ１００Ａ２に対する応答を示す。分析に用いる血清の希釈の滴定曲線の後、それがＡＡＰのアジュバント能をよりよく判別する希釈度であることから、１／６４００の希釈が選択された。Ｓ１００ＡＡＰで免疫化された動物の血清の、Ｓ１００Ａ２に対する反応性は、Ｓ１００Ａ２タンパク質の混合物のいずれかで免疫化された動物の血清において観察されたものより有意に高かったことがはっきりと検出された。ＡＡＰが液性応答を調節するかどうかを知る目的で、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答を分析した。双方のタイプの応答において増加が観測されたことが観察された。タンパク質が単独で投与された場合、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の平均比率は０．４５であった。しかしながら、ＡＡＰがＳ１００Ａ２へ融合された場合には、ＡＡＰがＩｇＧ２ａに向けて応答を調節したことを示すものとして、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の間の平均比率は１．６であった。加えて、ＡＡＰがまた、Ｓ１００Ａ２へ混合して投与された場合にもＩｇＧ２ａに向けて応答を調節することも注目されるべきである（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の平均比率は１．１に等しい）。

１− Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（早期及び進行胃腺癌検出のための潜在的バイオマーカーの同定）．Ｅｃｏｎｏｍｅｓｃｕ，ＭＣ，Ｎｅｃｕｌａ ＬＧ，Ｄｒａｇｕ Ｄ，Ｂａｄｅａ Ｌ，Ｄｉｍａ ＳＯ，Ｔｕｄｏｒ Ｓ，Ｎａｓｔａｓｅ Ａ，Ｐｏｐｅｓｃｕ Ｉ，Ｄｉａｃｏｎｕ ＣＣ．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；５７（１０４）：１４５３−６４．
２− ＭｃＫｉｅｒｎａｎ Ｅ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＥＷ，Ｅｖｏｙ Ｄ，Ｃｒｏｗｎ Ｊ，Ｄｕｆｆｙ ＭＪ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓ１００ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｂｒｅｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ（乳癌の進行におけるＳ１００遺伝子の役割）．Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２０１１ Ｊｕｎ；３２（３）：４４１−５０

【0117】

【化1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4.1】

【図4.2】

【図5.1】

【図5.2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]