特許 5987053 フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5987053

(24)【登録日】2016年8月12日

(45)【発行日】2016年9月6日

(54)【発明の名称】フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20060101AFI20160823BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20160823BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/62 VZNA

   G01N27/62 X

   G01N33/68

【請求項の数】12

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2014-510487(P2014-510487)

(86)(22)【出願日】2012年5月11日

(65)【公表番号】特表2014-519029(P2014-519029A)

(43)【公表日】2014年8月7日

(86)【国際出願番号】US2012037455

(87)【国際公開番号】WO2012155019

(87)【国際公開日】20121115

【審査請求日】2015年2月23日

(31)【優先権主張番号】61/485,249

(32)【優先日】2011年5月12日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100109726

【弁理士】

【氏名又は名称】園田 吉隆

(74)【代理人】

【識別番号】100101199

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 義教

(72)【発明者】

【氏名】カー， スリンダー

(72)【発明者】

【氏名】サード， オラ

(72)【発明者】

【氏名】シュイ， コーヤン

【審査官】 伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０４２０２７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１０−５３０９６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１４０２４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 X YU，IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN,PARTIAL [HOMO SAPIENS]，HOMO SAPIENS (HUMAN) [ONLINE]，２０１０年１０月２７日，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABY48864.2?report=genpept&log$=seqview

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）生物学的サンプルが、ヒト又はヒト化抗体で処置された動物からの血清、血漿、組織、又は細胞であり、消化された抗体サンプルを形成するために、ヒト又はヒト化抗体を含む生物学的サンプルを消化酵素で処置し；
（ｂ）ヒトフレームワークペプチドがヒト又はヒト化抗体のフレームワーク領域にユニークかつ保存された配列番号１〜８から選択される一又は複数の配列を含み、一又は複数のヒトフレームワークペプチドを検出するために、質量分析によって消化された抗体サンプルを分析する

工程を含む、ヒト又はヒト化抗体を検出する方法。

【請求項2】

消化酵素がトリプシンである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

消化された抗体サンプルを親和性捕捉媒体又はクロマトグラフィーの吸着剤と接触させ、濃縮された消化された抗体サンプルを溶出させることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

生物学的サンプルを親和性捕捉媒体又はクロマトグラフィーの吸着剤と接触させ、濃縮された消化された生物学的サンプルを溶出させ、次いで濃縮された生物学的サンプルを消化酵素で処置することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

親和性捕捉媒体がビーズ担持プロテインＡ／Ｇである、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

クロマトグラフィーの吸着剤が固相抽出（ＳＰＥ）吸着剤である、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項7】

生物学的サンプルが血清又は血漿である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

消化された抗体サンプルの濃度が測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ヒト又はヒト化抗体が、（１）〜（３６）から選択される腫瘍関連抗原又は細胞表面受容体の一又は複数に結合する、請求項１に記載の方法：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプターＩＢ型）；
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５）；
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原）；
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６）；
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子、メソテリン）；
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ）；
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ．４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，セマフォリン ５ｂ Ｈｌｏｇ，セマドメイン，７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン（セマフォリン）５Ｂ）；
（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ；
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター）；
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，推定タンパク質 ＦＬＪ２０３１５）；
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９，ＩＰＣＡ−１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２，６回膜貫通型前立腺タンパク質）；
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，ＦＬＪ２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位カチオンチャネル，サブファミリーＭ，メンバー４）；
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌腫由来増殖因子）；
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルスレセプター）又はＨｓ ７３７９２）；
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β），Ｂ２９）；
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ）；
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）；
（１８）ＮＣＡ；
（１９）ＭＤＰ；
（２０）ＩＬ２０Ｒα；
（２１）ブレビカン；
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ；
（２３）ＡＳＬＧ６５９；
（２４）ＰＳＣＡ；
（２５）ＧＥＤＡ；
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３）；
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）；
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連α）；
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１）；
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のβサブユニット）；
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）；
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ−２）；
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１）；
（３５）ＩＲＴＡ２（ＦｃＲＨ５，免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２）；及び
（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通型プロテオグリカン）。

【請求項10】

ヒト又はヒト化抗体が、トラスツズマブ、オクレリズマブ、ペルツズマブ、抗ＰＤＬ１、抗ニューロピリン−１、抗ＭＵＣ１６、リツキシマブ、抗メソテリン、及び抗ＬＹ６Ｅから選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

ヒト又はヒト化抗体が薬物部分にコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

薬物部分が、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＰＮＵ−１５９６８２、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エリナフィド、及びそれらの立体異性体、アイソスター、類似体又は誘導体から選択される、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の開示】

【0001】

関連出願への相互参照
３７ＣＦＲ §１．５３（ｂ）のもとで提出されたこの非仮出願は、２０１１年５月１２日に提出された米国仮出願第６１／４８５，２４９号の３５ ＵＳＣ §１１９（ｅ）のもとでの利益を主張し、それは全体が参照により援用される。

【技術分野】

【0002】

発明の分野
本発明は、組織、血漿又は血清などの動物サンプルから目的のヒト又はヒト化抗体の量を検出および測定する方法に関する。本方法は、検出されて質量分析法により定量されるヒト又はヒト化抗体のフレームワーク領域にユニークで保存された一以上のペプチドを産生するために、サンプルの親和性濃縮及びプロテアーゼ消化を含む。

【背景技術】

【0003】

背景
治療用タンパク質のインビボでの研究から生成された血漿／血清サンプルの分析は、生物製剤産業において興味深いものである。従来のＥＬＩＳＡ法は、２５年以上にわたって使用され、幾つか限界がある。ＥＬＩＳＡは、生成するのに数ヶ月を要しうる高品質なカスタム試薬を必要とし、そのアッセイの最適化は更に多くの月を要する。従って、ＥＬＩＳＡは、長期のアッセイ開発時間を有し、それは早期発見ステージとタンパク質ベースの開発段階の両方における制限である (Murray et al (2001) J. Imm. Methods 255:41-56; Kirchner et al (2004) Clin. Pharmacokinetics 43(2):83-95)。適切なＥＬＩＳＡ試薬およびアッセイ条件は、各タンパク質治療薬の高度なカスタム結合要件に起因し、場合によっては可能でないかもしれない。ＥＬＩＳＡの他の制限は、試薬が血漿／血清タンパク質に非特異的に結合することができ、マトリックス干渉が一般的な現象であることである。一方、質量分析によるタンパク質の定量は非常に特異的であり、従って、マトリックス干渉はＥＬＩＳＡに比べて稀である。ＥＬＩＳＡアッセイの開発は、大きな労働力を要し、複雑な特定の試薬が必要になる可能性がある。ＥＬＩＳＡはまた、マトリックス干渉及び抗体の交差反応性に敏感である。ＥＬＩＳＡは、結合特性を利用して間接的に分析物の濃度を測定する。これらの多くの変数が、開発して堅牢な能力を持つ他の研究室へ転送するための、タンパク質定量のＥＬＩＳＡ法を困難なものとしている。これらの違いに基づいて、質量分析は、ＥＬＩＳＡと直交方法である。タンパク質定量の質量分析法、特にＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、カスタム試薬を必要とせず、より迅速なアッセイ開発を一般的にもたらす。加えて、質量分析は、マトリックス干渉を受けにくく、高度に特異的であり、多重化して自動化することができる一般的なアッセイ条件を提供する。質量分析の高い特異性は、分析物の固有の物理化学的特性、即ち、質量及び断片化パターンを用いて分析物濃度を測定する。堅牢なフォーマットは、承認された抗体療法において重要な利点である、素早い研究室から研究室への転送を可能とする。質量分析によりタンパク質を定量化するための一般的な方法は、インタクトなタンパク質のトリプシン消化である。得られたペプチドを、固定濃度での対応する安定同位体標識化内部標準を導入することにより質量分析によって分析される。

【0004】

質量分析（ＭＳ）によるペプチド及びタンパク質分析の最近の進歩は、フロントエンド気相イオン化、及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ、米国特許出願公開第２００３／００２７２１６号）のような導入技術の開発、並びに装置の感度、分解能、質量精度の改善、バイオインフォマティクス、及びソフトウェア・データ・デコンボリューション・アルゴリズムに起因する（“Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications", Cole, R.B., Ed. (1997) Wiley, New York; “Modern Protein Chemistry: Practical Aspects", Howard, G.C. and Brown, W.E., Eds. (2002) CRC Press, Boca Raton, FL, p. 71-102; Martin et al (1997) Cancer Chemother. Pharmacol. 40:189-201;国際公開第０３／０４６５７１号；国際公開第０３／０４６５７２号）。

【0005】

液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法は、血漿／血清サンプルなどの非常に複雑なマトリックスにおいてタンパク質の分析と定量化のための強力なツールである。目的のタンパク質および他の血漿／血清タンパク質の消化から生じるペプチド同一又は類似の名目上の質量を有することができ、二次元のＭＳ断片化はしばしば目的のペプチドの固有の断片を提供する。特定の親ペプチドと固有の断片イオンの組み合わせは、定量化されるべき分子を選択的に監視するために使用される。そのようなアプローチは、タンパク質定量のために一般的に使用されるモードである択的反応モニタリング（ＳＲＭ）と呼ばれる、「多重反応モニタリング」（ＭＲＭ）と呼ばれる。

【0006】

エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、液体サンプルの大気圧イオン化（ＡＰＩ）を提供する。エレクトロスプレー・プロセスは、蒸発下で、溶液中に含まれる種を代表するイオンを作成する高度に帯電した液滴を作成する。質量分析計のイオンサンプリングオリフィスは、質量分析のためにこれらのガス相イオンをサンプリングするために使用されてもよい。質量分析検出器によって測定される分析物に対する応答は、流体中の分析物の濃度に依存し、流体の流速とは無関係である。

【発明の概要】

【0007】

概要
本発明は、
（ａ）生物学的サンプルが、ヒト又はヒト化抗体で処置された動物からの血清、血漿、組織、又は細胞であり、消化された抗体サンプルを形成するために、消化酵素で生物学的サンプルを処理し、；
（ｂ）一以上のヒトフレームワークペプチドを検出するために質量分析によって消化された抗体サンプルを分析する
工程を含む、ヒト又はヒト化抗体を検出する方法を提供する。

【0008】

例示的な実施態様では、ヒトフレームワークペプチドは、配列番号１〜８から選択される一又は複数の配列を含む。

【0009】

例示的な実施態様では、消化酵素はトリプシンである。

【0010】

例示的な実施態様では、生物学的サンプルは親和性捕捉媒体又はクロマトグラフィーの吸着剤と接触させる。濃縮された生物学的サンプルは溶出され消化酵素で処置される。

【0011】

例示的な実施態様では、消化された抗体サンプルの濃度を測定する。

【0012】

本発明の一態様は、サンプルのプロテアーゼ消化又は免疫親和性捕捉に続いて、プロテアーゼ消化により、ヒト又はヒト化抗体のフレームワーク領域に固有で、即ち動物の生物学的サンプル中に存在しない、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって検出され定量化される一又は複数のペプチドを生成する方法である。

【0013】

本発明の一実施態様は、薬剤部分にコンジュゲートしたヒト又はヒト化抗体であり、抗体−薬剤コンジュゲートが本発明の方法によって測定される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、残基１０１で開始するヒト２Ｈ７抗体のオクレリズマブ Ｈｕ２Ｈ７（配列番号１１）、及び５つのカニクイザル抗ＣＤ２０抗体：ＣｙｎｏＨＣ １ａ Ｄ３ １（配列番号１２），ＣｙｎｏＨＣ １ｂ Ｅ５ １（配列番号１３），Ｃｙｎｏ ＨＣ ２ａ（配列番号１４），ＣｙｎｏＨＣ ２ｂ Ｅ６ １（配列番号１５），ＣｙｎｏＨＣ ３（配列番号１６）の重鎖アミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒト２Ｈ７（ｈｕ ２Ｈ７）Ｍａｂに固有であり、カニクイザルのＩｇＧ重鎖に存在しない、フレームワークシグネチャーペプチドが下線として同定され（ＦＳＰ１−８）各々はその配列に少なくとも一のアミノ酸の違いを有する。

【図2】図２は、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ジェネンテック、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２、抗ｐ１８５ＨＥＲ２）、組換えに由来したヒト化モノクローナル抗体、ＣＡＳ登録番号１８０２８８−６９−１の重鎖（配列番号１７）及び軽鎖（配列番号１８）を示す。

【図3】図３は、オクレリズマブ、ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７、ＰＲＯ７０７６９、ヒト化抗ＣＤ２０抗体、ＣＡＳ登録番号６３７３３４−４５−３の重鎖（配列番号１１）及び軽鎖（配列番号１９）を示す。

【図4】図４は、ペルツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４、ＣＡＳ登録番号３８０６１０−２７−５の重鎖（配列番号２０）及び軽鎖（配列番号２１）を示す。重鎖（配列番号２０）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ３、ＦＳＰ８が同定される。

【図5】図５は、Ｔ細胞調節因子の拡張されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーである抗ＰＤＬ１の重鎖（配列番号２２）及び軽鎖（配列番号２３）を示す。重鎖（配列番号２２）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。

【図6】図６は、抗ニューロピリン１、抗ＮＲＰ１、ＭＮＲＰ１６８５Ａの重鎖（配列番号２４）及び軽鎖（配列番号２５）を示す。重鎖（配列番号２４）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。

【図7】図７は、抗ＭＵＣ１６、ＭＭＵＣ３３３３Ａ／ＤＭＵＣ４０６４Ａの重鎖（配列番号２６）及び軽鎖（配列番号２７）を示す。重鎖（配列番号２６）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。

【図8】図８は、リツキシマブ、Ｃ２Ｂ８、ＭａｂＴｈｅｒａ、（リツキサン（登録商標）、ジェネンテック、バイオジェン／アイデック）、ＣＡＳ登録番号１７４７２２−３１−７の重鎖（配列番号２８）及び軽鎖（配列番号２９）を示す。重鎖（配列番号２８）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。

【図9】図９は、一以上のフレームワークシグネチャーペプチド（ＦＳＰ）を用いて動物の血漿／血清中の治療抗体を定量化するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の一般的な工程を示す。

【図10】図１０は、トリプシンによって消化されたトラスツズマブの多重反応モニタリングを示す。フレームワークシグネチャーペプチドのＦＳＰ３（１２．５分）、ＦＳＰ８（１５分）及びＦＳＰ５（１７分）がベースライン分離されて定量される。

【図11】図１１は、血漿中に添加された、親和性捕捉され次いで消化された抗ＭＵＣ１６抗体−薬物コンジュゲートに由来するＦＳＰ５のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。

【図12】図１２は、全血漿消化／ＳＰＥアプローチにより調製されたリチウムヘパリン化カニクイザル血漿中に１〜１０００μｇ／ｍＬの様々な濃度で添加されたＦＳＰ８の検量線を示す。

【図13】図１３は、全血漿消化／ＳＰＥサンプル調製の後で、ＬＬＯＱ＝１μｇ／ｍＬにてリチウムヘパリン化カニクイザル血漿中に添加されたＦＳＰ８の検出を実証するＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。

【図14】図１４は、動物血漿／血清中でｍＡｂのフレームワークシグネチャーペプチド（ＦＳＰ）を生成するための、タンパク質治療薬の親和性捕捉と酵素消化を含む、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法の工程のフローチャートを示す。

【図15】図１５は、ビオチン化捕捉プローブに結合したストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上、又は、プロテインＡ、Ｇ被覆磁気ビーズ上における動物の血漿／血清からのｍＡｂの捕捉、続く磁気分離による単離、捕捉された抗体の消化、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の画を示す。

【図16】図１６は、抗体の一般的な捕捉のためプロテインＡ、Ｇ被覆磁気ビーズ（上）の実施態様、及び抗体の特異的な捕捉のためのビオチン化捕捉プローブに結合したストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（下）の実施態様を示す。

【図17a】図１７ａは、ラット血漿中でトラスツズマブ抗体を１μｇ／ｍＬにて、ＦＳＰ８のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分離及び検出を示す。

【図17b】図１７ｂは、安定同位体標識された（ＳＩＬ）ＦＳＰ８内部標準のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分離及び検出を示す。

【図18】図１８は、ラット血漿中で１〜２５０μｇ／ｍＬのからのトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））の濃度に対して、安定同位体ラベル化ＦＳＰ８内部標準に対するＦＳＰ８の割合をプロットされる検出の直線性を示す。

【図19a】図１９ａは、固定化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又は抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体への結合により捕捉され、電気化学発光又は比色検出を用いたＥＬＩＳＡアッセイで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を用いて検出されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ治療薬）の画を示す。

【図19b】図１９ｂは、生物学的サンプルからのｍＡｂ治療薬のプロテインＡビーズ捕捉、一以上のフレームワークシグネチャーペプチド（ＦＳＰ）、例えばＦＳＰ８を形成するための、捕捉されたｍＡｂ治療薬のトリプシン消化、及び９３８．０（Ｍ，２＋）から８３６．７（ｙ１５，２＋）への遷移を検出するための、複数の反応モニタリング（ＭＲＭ）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検出で開始されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの要素を示す。

【図20】図２０は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、トラスツズマブを投与したラットからの血漿／血清サンプルの個々の薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。

【図21】図２１は、抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体、３Ａ５を投与したラットからの血漿／血清サンプルの個々の薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。

【図22】図２２は、抗メソテリン（Ｍｓｌｎ）モノクローナル抗体を投与したラットからの血漿／血清サンプルの個々の薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。

【図23】図２３は、抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体、３Ａ５（ＭＭＵＣ１２０６Ａ）を投与したカニクイザルから２８日間の血漿中の抗体の測定による、血漿／血清サンプルの平均薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。

【図24】図２４は、抗メソテリン（Ｍｓｌｎ）モノクローナル抗体を投与したカニクイザルから４０日間の血漿中の抗体の測定による、血漿／血清サンプルの平均薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。

【図25】図２５は、マウス有効性試験で抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗ＬＹ６Ｅ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを投与したマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ）からの血漿／血清サンプルの個々の薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の実施態様の詳細な説明
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有し、Singleton et al, (1994) “Dictionary of Microbiology and Molecular Biology", 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY;及びJaneway, et al (2001) “Immunobiology", 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkと一致している。商品名が本明細書で使用される場合、商品名の製品製剤、ジェネリック医薬品、および商品名製品の活性医薬成分（複数可）も含まれる。

【0016】

定義
用語「生物学的サンプル」は動物から由来又は分離された任意の成分であり、血液、血漿、血清、細胞、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、ミルク、気管支洗浄液、骨髄、羊水、唾液、胆汁、硝子体、涙、又は組織を含む。

【0017】

用語「消化酵素」とは、特定又は一般的、ランダムな方法のいずれかで、ペプチド又はタンパク質を断片に切断するか又は加水分解することができる酵素である。消化酵素は、抗体が生物学的サンプルの成分である抗体から、消化された抗体サンプルを形成することができる。消化酵素は、トリプシン、パパイン、エンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＡｒｇＣ、黄色ブドウ球菌Ｖ８、キモトリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｓｎ−Ｃ、ペプシン、及びエンドプロテアーゼＧｌｕＣなどのプロテアーゼが含まれる。

【0018】

用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

【0019】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。

【0020】

ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号；米国特許第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

【0021】

ダイアボディは二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である（欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448)。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。

【0022】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（米国特許第６２４８５１６号）。

【0023】

抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による生産を含む。

【0024】

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。

【0025】

用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。

【0026】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の定常ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。従っ従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

【0027】

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

【0028】

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0029】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表す抗体のフレームワーク領域である。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。

【0030】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。

【0031】

一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む（米国特許第４８１６５６７号； Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855）。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0032】

所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。所定の実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。

【0033】

ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 5821337; US 7527791; US 6982321; US 7087409; Kashmiri et al. (2005) Methods 36:25-34 （（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498 （「リサーフェイシング」を記述）； Dall'Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60 （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及び Osbourn et al, (2005) Methods 36:61-68; Klimka et al. (2000) Br. J. Cancer 83:252-260 （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。

【0034】

ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域(Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623)；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域(Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633); 及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; 及びRosok et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618を参照）を含む。

【0035】

ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74; Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。

【0036】

ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。

【0037】

ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えばKozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner et al., (1991) J. Immunol., 147: 86を参照。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006）に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, (2006) Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, (2005) Histology and Histopathology, 20(3):927-937及びVollmers and Brandlein, (2005) Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-9１に記載される。

【0038】

ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。

【0039】

本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2): 299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093; Fellouse, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472；及びLee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132に記載されている。

【0040】

所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしで免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のように如何なる免疫化もせずに、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対するヒト抗体の単一源を提供することが可能である。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードせしめ、インビトロでの再配列を達成させることによって合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーは、米国特許第５７５０３７３；米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号；米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号；米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号；米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号；米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号；米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号；米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号に記載されているヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。

【0041】

ある実施態様において、抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施態様において、結合特異性の一つは第一抗原に対してであり、他は第二抗原に対してである。所定の実施態様において、二重特異性抗体は、同一抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまた、抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬物を局所化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

【0042】

多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び“knob-in-hole"エンジニアリング（米国特許第５７３１１６８号）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）、２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）、二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）、及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。

【0043】

「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。

【0044】

本明細書中の抗体又は断片はまた、抗原並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含んでなる「２重作用(Dual Acting）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。

【0045】

抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。

【0046】

抗体は、抗体及びタンパク質、薬剤部分、標識、又は他の基を含む融合タンパク質を含む。融合タンパク質は、薬物動態などの特性を最適化するために、組換え技術、コンジュゲーション、又はペプチド合成によって作製することができる。本発明のヒト又はヒト化抗体はまた、アルブミン結合性ペプチド（ＡＢＰ）配列を含む融合タンパク質であり得る（Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043；国際公開第０１／４５７４６号）。本発明の抗体は、（ｉ）Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043の表ＩＩＩ及びＩＶ，頁３５０３８；（ｉｉ）米国特許出願公開第２００４／０００１８２７号の［００７６］；及び（ｉｉｉ）国際公開第０１／４５７４６号の頁１２−１３（これらの全ては参照により本明細書に援用される）によって教示されるＡＢＰ配列との融合タンパク質を含む。

【0047】

置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされた。

【0048】

【0049】

アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．

【0050】

非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。

【0051】

置換型変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0052】

変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。

【0053】

所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で発生する可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。

【0054】

突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。

【0055】

アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。

【0056】

グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。

【0057】

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる(Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32)。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を作成するために行われ得る。

【0058】

一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善し得る（米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号）。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotech. Bioeng. 87:614が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号， Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号， Adamｓら、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotech. Bioeng. 87:614; Kanda, Y. et al. (2006) Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688;国際公開第２００３／０８５１０７号）を含む。

【0059】

抗体変異体が、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともに更に与えられる。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は記述されている（国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；国際公開第１９９９／２２７６４号）。

【0060】

Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。

【0061】

ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロでのアッセイの非限定的な例が、米国特許第５５００３６２号； Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063); Hellstrom, I et al. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502; US 5821337; Bruggemann, M. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができるＣ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（Gazzano-Santoro et al. (1996), J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M.S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; Cragg, M.S. and M.J. Glennie, (2004) Blood 103:2738-2743)）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（Petkova, S.B. et al. (2006) Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769）。

【0062】

エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二つ以上の置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。

【0063】

ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。（米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号； Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604)。

【0064】

所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。

【0065】

幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. (2000) J. Immunol. 164: 4178-4184に説明される。

【0066】

増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0067】

システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーとの呼ばれる抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。

【0068】

抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。

【0069】

別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。

【0070】

本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる(Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる（Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。

【0071】

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えば Flatman et al. (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87を参照のこと。

【0072】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

【0073】

「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。

【0074】

「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。

【0075】

参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。

【0076】

アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：分率Ｘ／Ｙの１００倍、ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。

【0077】

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。例えば、Kindtら、Kuby Immunology,第６版， W.H. Freeman and Co.,頁91 (2007)。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる(Portolano et al. (1993) J. Immunol. 150:880-887; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628)。

【0078】

「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は当該技術分野で知られており、当該技術分野で良く知られる方法及び情報を使用して、ヒト又はヒト化抗体の生成に使用のために調製することができる。癌の診断及び治療のための効果的な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者は、一以上の正常な非癌性細胞上と比較して、一又は複数の特定の型の癌細胞の表面上に発現される膜貫通ペプチド又はそうでなければ腫瘍関連ペプチドを特定しようとしてきた。しばしば、このような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌細胞の表面上と比較して癌細胞の表面でより豊富に発現される。このような腫瘍関連細胞の表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの治療を介した破壊のために癌細胞を特異的に標的とする能力を生みだしている。

【0079】

ＴＡＡの例としては、限定されないが、以下に一覧されるＴＡＡ（１）−（３６）が挙げられる。便宜のために、これらの抗原に関連する情報は、その全てが当技術分野で知られており、以下に一覧され、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の核酸とタンパク質配列同定規則に従う名称、別称、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主要な参考文献（複数可）を含む。ＴＡＡ（１）−（３６）に対応する核酸及びタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースで利用可能である。抗体によって標的化される腫瘍関連抗原は、引用した参考文献に同定される配列に対する配列同一性が少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を有するか、あるいは引用した参考文献に見出される配列を有するＴＡＡと同一の生物学的特性又は特徴を実質的に示す全てのアミノ酸配列変異体及びアイソフォームを含む。例えば、変異体配列を有するＴＡＡは、一般的に、一覧されている対応する配列を持つＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に列挙される参考文献における配列及び開示は、参照により明確に援用される。

【0080】

腫瘍関連抗原（１）−（３６）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質レセプターＩＢ型，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）ten Dijke,P., et al Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997))；国際公開第２００４／０６３３６２号（請求項２）；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３／１３４７９０−Ａ１号（頁３８−３９）；国際公開第２００２／１０２２３５号（請求項１３；頁２９６）；国際公開第２００３／０５５４４３号（頁９１−９２）；国際公開第２００２／９９１２２号（実施例２；頁５２８−５３０）；国際公開第２００３／０２９４２１号（請求項６）；国際公開第２００３／０２４３９２号（請求項２；図１１２）；国際公開第２００２／９８３５８号（請求項１；頁１８３）；国際公開第２００２／５４９４０号（頁１００−１０１）；国際公開第２００２／５９３７７号（頁３４９−３５０）；国際公開第２００２／３０２６８号（請求項２７；頁３７６）；国際公開第２００１／４８２０４号（実施例；図４）；ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質レセプター，タイプＩＢ／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１．相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８；ＮＰ＿００１１９４．１；ＡＹ０６５９９４

【0081】

（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１，ＳＬＣ７Ａ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273)；国際公開第２００４／０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４／０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３／０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２／７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２／９９０７４号（請求項１９；頁１２７−１２９）；国際公開第２００２／８６４４３号（請求項２７；頁２２２，３９３）；国際公開第２００３／００３９０６号（請求項１０；頁２９３）；国際公開第２００２／６４７９８号（請求項３３；頁９３−９５）；国際公開第２０００／１４２２８号（請求項５；頁１３３−１３６）；米国特許出願公開第２００３／２２４４５４号（図３）；国際公開第２００３／０２５１３８号（請求項１２；頁１５０）；ＮＰ＿００３４７７溶質担体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体，ｙ＋システム），メンバー５／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３−ホモサピエンス；相互参照：ＭＩＭ：６００１８２；ＮＰ＿００３４７７．３；ＮＭ＿０１５９２３；ＮＭ＿００３４８６＿１

【0082】

（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通型上皮抗原，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）；Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528)；国際公開第２００４／０６５５７７号（請求項６）；国際公開第２００４／０２７０４９号（図１Ｌ）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００４／０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３／１５７０８９号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３／１８５８３０号（実施例５）；米国特許出願公開第２００３／０６４３９７号（図２）；国際公開第２００２／８９７４７号（実施例５；頁６１８−６１９）；国際公開第２００３／０２２９９５号（実施例９；図１３Ａ，実施例５３；頁１７３，実施例２；図２Ａ）；ＮＰ＿０３６５８１前立腺の６回膜貫通型上皮抗原相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５；ＮＰ＿０３６５８１．１；ＮＭ＿０１２４４９＿１

【0083】

（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５，ＭＵＣ１６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）；J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)）；国際公開第２００４／０４５５５３号（請求項１４）；国際公開第２００２／９２８３６号（請求項６；図１２）；国際公開第２００２／８３８６６号（請求項１５；頁１１６−１２１）；米国特許出願公開第２００３／１２４１４０号（実施例１６）；相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１

【0084】

（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ，ＭＳＬＮ，ＳＭＲ，巨核球増強因子、メソテリン，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)）；国際公開第２００３／１０１２８３号（請求項１４）；（国際公開第２００２／１０２２３５号（請求項１３；頁２８７−２８８）；国際公開第２００２／１０１０７５号（請求項４；頁３０８−３０９）；国際公開第２００２／７１９２８号（頁３２０−３２１）；国際公開第９４１０３１２号（頁５２−５７）；相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１；ＮＰ＿００５８１４．２；ＮＭ＿００５８２３＿１

【0085】

（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ，ＮＰＴＩＩｂ，ＳＬＣ３４Ａ２，溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム），メンバー２，ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター３ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582)；国際公開第２００４／０２２７７８号（請求項２）；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；国際公開第２００２／１０２２３５号（請求項１３；頁３２６）；欧州特許第０８７５５６９号（請求項１；頁１７−１９）；国際公開第２００１／５７１８８号（請求項２０；頁３２９）；国際公開第２００４／０３２８４２号（実施例ＩＶ）；国際公開第２００１／７５１７７号（請求項２４；頁１３９−１４０）；相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７；ＮＰ＿００６４１５．１；ＮＭ＿００６４２４＿１

【0086】

（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２，ＫＩＡＡ１４４５，Ｍｍ．４２０１５，ＳＥＭＡ５Ｂ，ＳＥＭＡＧ，セマフォリン ５ｂ Ｈｌｏｇ，セマドメイン（sema domain），７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様），膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン（セマフォリン）５Ｂ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０４０８７８）；Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150）；国際公開第２００４／０００９９７号（請求項１）；国際公開第２００３／００３９８４号（請求項１）；国際公開第２００２／０６３３９号（請求項１；頁５０）；国際公開第２００１／８８１３３号（請求項１；頁４１−４３，４８−５８）；国際公開第２００３／０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３／１０１４００号（請求項１１）；受託番号：Ｑ９Ｐ２８３；ＥＭＢＬ；ＡＢ０４０８７８；ＢＡＡ９５９６９．１．Ｇｅｎｅｗ；ＨＧＮＣ：１０７３７

【0087】

（８）ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ，Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２，ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）；Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553；米国特許出願公開第２００３／１２９１９２号（請求項２）；米国特許出願公開第２００４／０４４１８０号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００４／０４４１７９号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３／０９６９６１号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３／２３２０５６号（実施例５）；国際公開第２００３／１０５７５８号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３／２０６９１８号（実施例５）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３／０２５１４８号（請求項２０）；相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８；ＡＡＱ８８９９１．１；ＡＹ３５８６２８＿１

【0088】

（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンタイプＢレセプター，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）；Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206；国際公開第２００４／０４５５１６号（請求項１）；国際公開第２００４／０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４／０４００００号（請求項１５１）；国際公開第２００３／０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３／０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００３／０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２／６１０８７号（図１）；国際公開第２００３／０１６４９４号（図６）；国際公開第２００３／０２５１３８号（請求項１２；頁１４４）；国際公開第２００１／９８３５１号（請求項１；頁１２４−１２５）；欧州特許第０５２２８６８号（請求項８；図２）；国際公開第２００１／７７１７２号（請求項１；頁２９７−２９９）；米国特許出願公開第２００３／１０９６７６号；米国特許第６５１８４０４号（図３）；米国特許第５７７３２２３号（請求項１ａ；Ｃｏｌ ３１−３４）；国際公開第２００４／００１００４号

【0089】

（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４，推定タンパク質ＦＬＪ２０３１５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）；国際公開第２００３／１０４２７５号（請求項１）；国際公開第２００４／０４６３４２号（実施例２）；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００３／０８３０７４号（請求項１４；頁６１）；国際公開第２００３／０１８６２１号（請求項１）；国際公開第２００３／０２４３９２号（請求項２；図９３）；国際公開第２００１／６６６８９号（実施例６）；相互参照：遺伝子座番号：５４８９４；ＮＰ＿０６０２３３．２；ＮＭ＿０１７７６３＿１

【0090】

（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９，ＩＰＣＡ−１，ＰＣＡＮＡＰ１，ＳＴＡＭＰ１，ＳＴＥＡＰ２，ＳＴＭＰ，前立腺癌関連遺伝子１，前立腺癌関連タンパク質１，前立腺の６回膜貫通型上皮抗原２，６回膜貫通型前立腺タンパク質，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)）；国際公開第２００３／０８７３０６号；米国特許出願公開第２００３／０６４３９７号（請求項１；図１）；国際公開第２００２／７２５９６号（請求項１３；頁５４−５５）；国際公開第２００１／７２９６２号（請求項１；図４Ｂ）；国際公開第２００３／１０４２７０号（請求項１１）；国際公開第２００３／１０４２７０号（請求項１６）；米国特許出願公開第２００４／００５５９８号（請求項２２）；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；米国特許出願公開第２００３／０６０６１２号（請求項１２；図１０）；国際公開第２００２／２６８２２号（請求項２３；図２）；国際公開第２００２／１６４２９号（請求項１２；図１０）；相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８；ＡＡＮ０４０８０．１；ＡＦ４５５１３８＿１

【0091】

（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０，ＦＬＪ２００４１，ＴＲＰＭ４，ＴＲＰＭ４Ｂ，一過性レセプター電位カチオンチャネル，サブファミリーＭ，メンバー４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)）；米国特許出願公開第２００３／１４３５５７号（請求項４）；国際公開第２０００／４０６１４号（請求項１４；頁１００−１０３）；国際公開第２００２／１０３８２号（請求項１；図９Ａ）；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２／３０２６８号（請求項２７；頁３９１）；米国特許出願公開第２００３／２１９８０６号（請求項４）；国際公開第２００１／６２７９４号（請求項１４；図１Ａ−Ｄ）；相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６；ＮＰ＿０６０１０６．２；ＮＭ＿０１７６３６＿１

【0092】

（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ，ＣＲ１，ＣＲＧＦ，ＣＲＩＰＴＯ，ＴＤＧＦ１，奇形癌腫由来増殖因子，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３又はＮＭ＿００３２１２）Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)）；米国特許出願公開第２００３／２２４４１１号（請求項１）；国際公開第２００３／０８３０４１号（実施例１）；国際公開第２００３／０３４９８４号（請求項１２）；国際公開第２００２／８８１７０号（請求項２；頁５２−５３）；国際公開第２００３／０２４３９２号（請求項２；図５８）；国際公開第２００２／１６４１３号（請求項１；頁９４−９５，１０５）；国際公開第２００２／２２８０８号（請求項２；図１）；米国特許第５８５４３９９号（実施例２；Ｃｏｌ １７−１８）；米国特許第５７９２６１６号（図２）；相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５；ＮＰ＿００３２０３．１；ＮＭ＿００３２１２＿１

【0093】

（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体レセプター２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルスレセプター）又はＨｓ．７３７９２ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320；国際公開第２００４／０４５５２０号（実施例４）；米国特許出願公開第２００４／００５５３８号（実施例１）；国際公開第２００３／０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００４／０４５５２０号（実施例４）；国際公開第９１０２５３６号（図９．１−９．９）；国際公開第２００４／０２０５９５号（請求項１）；受託番号：Ｐ２００２３；Ｑ１３８６６；Ｑ１４２１２；ＥＭＢＬ；Ｍ２６００４；ＡＡＡ３５７８６．１．

【0094】

（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ７９β，ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β（immunoglobulin-associated beta）），Ｂ２９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６２６又は１１０３８６７４）；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625)；国際公開第２００４／０１６２２５号（請求項２，図１４０）；国際公開第２００３／０８７７６８号，米国特許出願公開第２００４／１０１８７４号（請求項１，頁１０２）；国際公開第２００３／０６２４０１号（請求項９）；国際公開第２００２／７８５２４号（実施例２）；米国特許出願公開第２００２／１５０５７３号（請求項５，頁１５）；米国特許第５６４４０３３号；国際公開第２００３／０４８２０２号（請求項１，頁３０６及び３０９）；国際公開第９９／５５８６５８号，米国特許第６５３４４８２号（請求項１３，図１７Ａ／Ｂ）；国際公開第２０００／５５３５１号（請求項１１，頁１１４５−１１４６）；相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５；ＮＰ＿０００６１７．１；ＮＭ＿０００６２６＿１

【0095】

（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４，ＩＲＴＡ４，ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ），ＳＰＡＰ１Ｂ，ＳＰＡＰ１Ｃ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４，ＡＹ３５８１３０）；Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775；国際公開第２００４０１６２２５号（請求項２）；国際公開第２００３０７７８３６；国際公開第２００１／３８４９０号（請求項５；図１８Ｄ−１−１８Ｄ−２）；国際公開第２００３／０９７８０３号（請求項１２）；国際公開第２００３／０８９６２４号（請求項２５）；相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９；ＮＰ＿１１０３９１．２；ＮＭ＿０３０７６４＿１

【0096】

（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）；Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429；国際公開第２００４／０４８９３８号（実施例２）；国際公開第２００４／０２７０４９号（図１Ｉ）；国際公開第２００４／００９６２２；国際公開第２００３／０８１２１０；国際公開第２００３／０８９９０４号（請求項９）；国際公開第２００３／０１６４７５号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３／１１８５９２号；国際公開第２００３／００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００３／０５５４３９号（請求項２９；図１Ａ−Ｂ）；国際公開第２００３／０２５２２８号（請求項３７；図５Ｃ）；国際公開第２００２／２２６３６号（実施例１３；頁９５−１０７）；国際公開第２００２／１２３４１号（請求項６８；図７）；国際公開第２００２／１３８４７号（頁７１−７４）；国際公開第２００２／１４５０３号（頁１１４−１１７）；国際公開第２００１／５３４６３号（請求項２；頁４１−４６）；国際公開第２００１／４１７８７号（頁１５）；国際公開第２０００／４４８９９号（請求項５２；図７）；国際公開第２０００／２０５７９号（請求項３；図２）；米国特許第５８６９４４５号（請求項３；Ｃｏｌ ３１−３８）；国際公開第９６３０５１４号（請求項２；頁５６−６１）；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４／０４３３６１号（請求項７）；国際公開第２００４／０２２７０９号；国際公開第２００１／００２４４号（実施例３；図４）；受託番号：Ｐ０４６２６；ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６７；ＡＡＡ３５８０８．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６１；ＡＡＡ３５８０８．１

【0097】

（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）；Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002；国際公開第２００４／０６３７０９；欧州特許第１４３９３９３号（請求項７）；国際公開第２００４／０４４１７８号（実施例４）；国際公開第２００４／０３１２３８号；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２００２／７８５２４号（実施例２）；国際公開第２００２／８６４４３号（請求項２７；頁４２７）；国際公開第２００２／６０３１７号（請求項２）；受託番号：Ｐ４０１９９；Ｑ１４９２０；ＥＭＢＬ；Ｍ２９５４１；ＡＡＡ５９９１５．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１８７２８

【0098】

（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)）；国際公開第２００３／０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２／６４７９８号（請求項３３；頁８５−８７）；特公平５−００３７９０号公報（図６−８）；国際公開第９９４６２８４号（図９）；相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０；ＡＡＨ１７０２３．１；ＢＣ０１７０２３＿１

【0099】

（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒα，ＺＣＹＴＯＲ７，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）；Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４／００５３２０号（実施例５）；国際公開第２００３／０２９２６２号（頁７４−７５）；国際公開第２００３／００２７１７号（請求項２；頁６３）；国際公開第２００２／２２１５３号（頁４５−４７）；米国特許出願公開第２００２／０４２３６６号（頁２０−２１）；国際公開第２００１／４６２６１号（頁５７−５９）；国際公開第２００１／４６２３２号（頁６３−６５）；国際公開第９８／３７１９３号（請求項１；頁５５−５９）；受託番号：Ｑ９ＵＨＦ４；Ｑ６ＵＷＡ９；Ｑ９６ＳＨ８；ＥＭＢＬ；ＡＦ１８４９７１；ＡＡＦ０１３２０．１．

【0100】

（２１）ブレビカン（ＢＣＡＮ，ＢＥＨＡＢ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）；Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002；米国特許出願公開第２００３／１８６３７２号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３／１８６３７３号（請求項１１）；米国特許出願公開第２００３／１１９１３１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３／１１９１２２号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３／１１９１２６号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３／１１９１２１号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３／１１９１２９号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３／１１９１３０号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３／１１９１２８号（請求項１；図５２）；米国特許出願公開第２００３／１１９１２５号（請求項１）；国際公開第２００３／０１６４７５号（請求項１）；国際公開第２００２／０２６３４号（請求項１）

【0101】

（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ，ＥＲＫ，Ｈｅｋ５，ＥＰＨＴ３，Ｔｙｒｏ５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）；Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)）；国際公開第２００３／０４２６６１号（請求項１２）；国際公開第２０００／５３２１６号（請求項１；頁４１）；国際公開第２００４／０６５５７６号（請求項１）；国際公開第２００４／０２０５８３号（請求項９）；国際公開第２００３／００４５２９号（頁１２８−１３２）；国際公開第２０００／５３２１６号（請求項１；頁４２）；相互参照：ＭＩＭ：６００９９７；ＮＰ＿００４４３３．２；ＮＭ＿００４４４２＿１

【0102】

（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）；米国特許出願公開第２００４／０１０１８９９号（請求項２）；国際公開第２００３／１０４３９９号（請求項１１）；国際公開第２００４／０００２２１号（図３）；米国特許出願公開第２００３／１６５５０４号（請求項１）；米国特許出願公開第２００３／１２４１４０号（実施例２）；米国特許出願公開第２００３／０６５１４３号（図６０）；国際公開第２００２／１０２２３５号（請求項１３；頁２９９）；米国特許出願公開第２００３／０９１５８０号（実施例２）；国際公開第２００２／１０１８７号（請求項６；図１０）；国際公開第２００１／９４６４１号（請求項１２；図７ｂ）；国際公開第２００２／０２６２４号（請求項１３；図１Ａ−１Ｂ）；米国特許出願公開第２００２／０３４７４９号（請求項５４；頁４５−４６）；国際公開第２００２／０６３１７号（実施例２；頁３２０−３２１，請求項３４；頁３２１−３２２）；国際公開第２００２／７１９２８号（頁４６８−４６９）；国際公開第２００２／０２５８７号（実施例１；図１）；国際公開第２００１／４０２６９号（実施例３；頁１９０−１９２）；国際公開第２０００／３６１０７号（実施例２；頁２０５−２０７）；国際公開第２００４／０５３０７９号（請求項１２）；国際公開第２００３／００４９８９号（請求項１）；国際公開第２００２／７１９２８号（頁２３３−２３４，４５２−４５３）；国際公開第０１／１６３１８号

【0103】

（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）；Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788；国際公開第２００４／０２２７０９号；欧州特許第１３９４２７４号（実施例１１）；米国特許出願公開第２００４／０１８５５３号（請求項１７）；国際公開第２００３／００８５３７号（請求項１）；国際公開第２００２／８１６４６号（請求項１；頁１６４）；国際公開第２００３／００３９０６号（請求項１０；頁２８８）；国際公開第２００１／４０３０９号（実施例１；図１７）；米国特許出願公開第２００１／０５５７５１号（実施例１；図１ｂ）；国際公開第２０００／３２７５２号（請求項１８；図１）；国際公開第９８／５１８０５号（請求項１７；頁９７）；国際公開第９８／５１８２４号（請求項１０；頁９４）；国際公開第９８／４０４０３号（請求項２；図１Ｂ）；受託番号：Ｏ４３６５３；ＥＭＢＬ；ＡＦ０４３４９８；ＡＡＣ３９６０７．１

【0104】

（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）；ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ−ｐａｒｔｎｅｒ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１−ホモ・サピエンス種：ホモサピエンス（ヒト）；国際公開第２００３／０５４１５２号（請求項２０）；国際公開第２００３／０００８４２号（請求項１）；国際公開第２００３／０２３０１３号（実施例３，請求項２０）；米国特許出願公開第２００３／１９４７０４号（請求項４５）；相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９；ＡＡＰ１４９５４．１；ＡＹ２６０７６３＿１

【0105】

（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子レセプター，ＢＬｙＳレセプター３，ＢＲ３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）；ＢＡＦＦレセプター／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１−ホモサピエンス Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001）；国際公開第２００４／０５８３０９号；国際公開第２００４／０１１６１１；国際公開第２００３／０４５４２２号（実施例；頁３２−３３）；国際公開第２００３／０１４２９４号（請求項３５；図６Ｂ）；国際公開第２００３／０３５８４６号（請求項７０；頁６１５−６１６）；国際公開第２００２／９４８５２号（Ｃｏｌ １３６−１３７）；国際公開第２００２／３８７６６号（請求項３；頁１３３）；国際公開第２００２／２４９０９号（実施例３；図３）；相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９；ＮＰ＿４４３１７７．１；ＮＭ＿０５２９４５＿１；ＡＦ１３２６００

【0106】

（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプターＣＤ２２−Ｂアイソフォーム，ＢＬ−ＣＡＭ，Ｌｙｂ−８，Ｌｙｂ８，ＳＩＧＬＥＣ−２，ＦＬＪ２２８１４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）；Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146；国際公開第２００３／０７２０３６号（請求項１；図１）；相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６；ＮＰ＿００１７６２．１；ＮＭ＿００１７７１＿１

【0107】

（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９α，免疫グロブリン関連α（immunoglobulin-associated alpha），免疫グロブリンベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合性に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質），等電点：４．８４，分子量：２５０２８ ＴＭ：２［Ｐ］遺伝子染色体：１９ｑ１３．２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７４．１０）；国際公開第２００３／０８８８０８号，米国特許出願公開第２００３／０２２８３１９号；国際公開第２００３／０６２４０１号（請求項９）；米国特許出願公開第２００２／１５０５７３号（請求項４，頁１３−１４）；国際公開第９９／５８６５８号（請求項１３，図１６）；国際公開第９２／０７５７４号（図１）；米国特許第５６４４０３３号；Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464

【0108】

（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫レセプター１は、ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染、おそらくエイズ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質共役型受容体）；３７２アミノ酸，等電点：８．５４ 分子量：４１９５９ ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：１１ｑ２３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７０７．１）；国際公開第２００４／０４００００号；国際公開第２００４／０１５４２６号；米国特許出願公開第２００３／１０５２９２号（実施例２）；米国特許第６５５５３３９号（実施例２）；国際公開第２００２／６１０８７号（図１）；国際公開第２００１／５７１８８号（請求項２０，頁２６９）；国際公開第２００１／７２８３０号（頁１２−１３）；国際公開第２０００／２２１２９号（実施例１，頁１５２−１５３，実施例２，頁２５４−２５６）；国際公開第９９／２８４６８号（請求項１，頁３８）；米国特許第５４４００２１号（実施例２，ｃｏｌ ４９−５２）；国際公開第９４／２８９３１号（頁５６−５８）；国際公開第９２／１７４９７号（請求項７，図５）；Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779

【0109】

（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドを結合しそれらをＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のβサブユニット）；２７３アミノ酸，等電点：６．５６、分子量：３０８２０．ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１１．１）；Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519；国際公開第９９／５８６５８号（請求項１３，図１５）；米国特許第６１５３４０８号（Ｃｏｌ ３５−３８）；米国特許第５９７６５５１号（ｃｏｌ １６８−１７０）；米国特許第６０１１１４６号（ｃｏｌ １４５−１４６）；Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119

【0110】

（３１）Ｐ２Ｘ５（プリンレセプターＰ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５は、細胞外ＡＴＰにより開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経発生に関与する可能性があり、欠乏は、特発性排尿筋不安定性の病態生理の一因となり得る；４２２アミノ酸），等電点：７．６３，分子量：４７２０６ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１７ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５５２．２）；Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199；国際公開第２００４／０４７７４９号；国際公開第２００３／０７２０３５号（請求項１０）；Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173；国際公開第２００２／２２６６０号（請求項２０）；国際公開第２００３／０９３４４４号（請求項１）；国際公開第２００３／０８７７６８号（請求項１）；国際公開第２００３／０２９２７７号（頁８２）

【0111】

（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２，Ｌｙｂ−２）；３５９アミノ酸，等電点：８．６６，分子量：４０２２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）；国際公開第２００４／０４２３４６号（請求項６５）；国際公開第２００３／０２６４９３号（頁５１−５２，５７−５８）；国際公開第２０００／７５６５５号（頁１０５−１０６）；Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903

【0112】

（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質であり、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデスの患者における疾患活性の上昇に関連する）；６６１アミノ酸，等電点：６．２０，分子量：７４１４７ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：５ｑ１２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５７３．１）米国特許出願公開第２００２／１９３５６７号；国際公開第９７／０７１９８号（請求項１１，頁３９−４２）；Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822；国際公開第２００３／０８３０４７号；国際公開第９７／４４４５２号（請求項８，頁５７−６１）；国際公開第２０００／１２１３０号（頁２４−２６）

【0113】

（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃレセプター様タンパク質１，Ｃ２タイプＩｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含む免疫グロブリンＦｃドメインについての推定上のレセプターであり、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）；４２９アミノ酸，等電点：５．２８，分子量：４６９２５ ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１−１ｑ２２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７０．１）；国際公開第２００３／０７７８３６号；国際公開第２００１／３８４９０号（請求項６，図１８Ｅ−１−１８−Ｅ−２）；Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777；国際公開第２００３／０８９６２４号（請求項８）；欧州特許第１３４７０４６号（請求項１）；国際公開第２００３／０８９６２４号（請求項７）

【0114】

（３５）ＩＲＴＡ２（ＦｃＲＨ５，免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連２（Immunoglobulin superfamily receptor translocation associated ２）、Ｂ細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター；一部のＢ細胞悪性腫瘍においてトランスロケーションによる遺伝子の調節解除が発生する）；９７７アミノ酸，等電点：６．８８、分子量：１０６４６８、ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｈｕｍａｎ：ＡＦ３４３６６２，ＡＦ３４３６６３，ＡＦ３４３６６４，ＡＦ３４３６６５，ＡＦ３６９７９４，ＡＦ３９７４５３，ＡＫ０９０４２３，ＡＫ０９０４７５，ＡＬ８３４１８７，ＡＹ３５８０８５；Ｍｏｕｓｅ：ＡＫ０８９７５６，ＡＹ１５８０９０，ＡＹ５０６５５８；ＮＰ＿１１２５７１．１；国際公開第２００３／０２４３９２号（請求項２，図９７）； Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127；国際公開第２００３／０７７８３６号；国際公開第２００１／３８４９０号（請求項３，図１８Ｂ−１−１８Ｂ−２）

【0115】

（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２，ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ，ＴＰＥＦ，ＨＰＰ１，ＴＲ，増殖因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチンに関連する推定上の膜貫通型プロテオグリカン）；３７４アミノ酸，ＮＣＢＩ受託番号：ＡＡＤ５５７７６，ＡＡＦ９１３９７，ＡＡＧ４９４５１，ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５７２７６；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ：２３６７１；ＯＭＩＭ：６０５７３４；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＵＩＫ５；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１７９２７４；ＡＹ３５８９０７，ＣＡＦ８５７２３，ＣＱ７８２４３６；国際公開第２００４／０７４３２０号（配列番号８１０）；特開２００４−１１３１５１号公報；国際公開第２００３／０４２６６１号；国際公開第２００３／００９８１４号；欧州特許第１２９５９４４号（頁６９−７０）；国際公開第２００２／３０２６８号（頁３２９）；国際公開第２００１／９０３０４号；米国特許出願公開第２００４／２４９１３０号；米国特許出願公開第２００４／０２２７２７号；国際公開第２００４／０６３３５５号；米国特許出願公開第２００４／１９７３２５号；米国特許出願公開第２００３／２３２３５０号；米国特許出願公開第２００４／００５５６３号；米国特許出願公開第２００３／１２４５７９号；Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84

【0116】

組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換えの方法および組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗体を作成する方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、および必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。

【0117】

抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

【0118】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号；米国特許第５７８９１９９号；米国特許第５８４０５２３号； Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, (2003),頁245-254（大腸菌における抗体断片の発現を記述している））を参照。発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、さらに精製することができる。

【0119】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす（Gerngross, (2004) Nat. Biotech. 22:1409-1414; Li et al. (2006) Nat. Biotech. 24:210-215）。

【0120】

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。

【0121】

植物細胞培養物もまた宿主として利用することができる（米国特許第５９５９１７７号、米国特許第６０４０４９８号、米国特許第６４２０５４８号、米国特許第７１２５９７８号、米国特許第６４１７４２９号、トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載している）。

【0122】

脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al. (1977, J. Gen Virol. 36:59）に記載された２９３細胞又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（Mather, (1980) Biol. Reprod. 23:243-251に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ ２）；ウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al. (1982) Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ⁻ ＣＨＯ細胞（Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。

【0123】

アッセイ
抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法などの公知の方法によってその抗原結合活性について試験される。別の態様では、競合アッセイは、抗原に対する結合について別の既知の抗体と競合する抗体を同定するために使用されてもよい。所定の実施態様において、このような競合する抗体は、既知の抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。

【0124】

典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原は、抗原に結合する第一の標識された抗体（例えばＨＥＲ２又はＣＤ２０）、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が抗原への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。

【0125】

一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそれらの抗体を同定するために与えられる。生物学的活性は、例えば、腫瘍の阻害を含み得る。

【0126】

ある実施態様において、本発明の方法の抗体は、生物学的サンプル中の抗原の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、細胞、尿、硝子体、涙、又は組織を含む。特定の実施態様において、本方法は、抗体の抗原への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗体と抗原との間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えば発現された抗原タンパク質が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗体が抗体による治療にふさわしい被検体を選択するために使用される。本発明の抗体を用いて診断され得る典型的な障害は、癌及び免疫疾患を含む。

【0127】

標識されコンジュゲートされた抗体が、本発明の方法の特定の実施態様において利用される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、ラジオアイソトープの^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。

【0128】

細胞死滅を生じさせる薬物部分は、リンカーユニットを介して抗体に共有結合され、標的とされた細胞死滅治療効果のための抗体−薬物コンジュゲートを形成することができる。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物を含む典型的な実施態様は、腫瘍細胞を標的とする抗体（Ａｂ）、及び細胞毒性又は細胞分裂阻害薬部分（Ｄ）、及びＤにＡｂを結合するリンカー部分（Ｌ）を含む。抗体は、例えばリジン及びシステインなどの一又は複数のアミノ酸残基を介して、リンカー部分（Ｌ）によりＤに結合され；その組成物は式Ｉを有し：

ここでｐは１から約２０、又は約２から約５である。反応性のリンカー部分を介して抗体分子にコンジュゲートすることができる薬物部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入される遊離システイン残基の数によって制限され得る。

【0129】

抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）は、細胞毒性又は細胞増殖抑制効果を有する任意の化合物、部分又は基が含まれる。薬物部分は、限定されないが、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はインターカレーション、及びＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質合成、及びトポイソメラーゼの阻害を含むメカニズムによってそれらの細胞毒性及び細胞増殖抑制効果を与え得る。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。例示的な薬物部分としては、限定されないが、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＰＮＵ−１５９６８２、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エリナフィド（elinafide）、及びそれらの立体異性体、アイソスター、類似体又は誘導体などを含み、かつ細胞毒性活性を有するこれら薬物の誘導体を含む。

【0130】

抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、従来の小分子及び抗体癌化学療法と比較して非特異的な毒性を低減しかつ有効性を高めるように設計された抗癌治療薬を標的とする。これらは、非常に強力な、コンジュゲートした小分子治療薬を癌細胞に特異的に送達するためのモノクローナル抗体の強力な標的化能力を使用する。これらの抗体−薬物コンジュゲートの薬物動態及び毒性などの特性を評価するために、血漿、尿及び他の生物学的サンプルからそれらを特徴付けて定量化できることが有用である。免疫親和性膜（ＩＡＭ）捕捉及び質量分析によって抗体−薬物コンジュゲートを検出しそしてスクリーニングする方法は、ビーズベースの親和性捕捉法（米国特許出願公開第２００９／０２８６２５８号）を含み、開示されている（米国特許出願公開第２００５／０２３２９２９号）。

【0131】

生物学的サンプル中のヒト抗体及びヒト化抗体を測定する方法
本発明の一態様は、前臨床研究由来の、カニクイザル及びラット血漿及び組織サンプル、及び潜在的に他の非ヒト種において、一般的な抗体の骨格構造を持つ様々なヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）及びヒト化モノクローナル抗体治療薬の定量化のための再現性のある効率的かつ経済的で一般的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づいた方法である。抗体の消化は、投与されたヒト又はヒト化治療用抗体にユニークであり、サルとラットの内因性タンパク質には見られない保存されたフレームワーク領域に由来するペプチドを与える。

【0132】

図９は、一以上のフレームワークシグネチャーペプチド（ＦＳＰ）を用いて動物の血漿／血清中の治療抗体を定量化するための一般的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を示す。

【0133】

本発明の方法は、
（ａ）血清又は血漿サンプルが、ヒト又はヒト化抗体で処置された動物に由来し、消化された抗体サンプルを形成するために、消化酵素で生物学的サンプルを処理し；
（ｂ）ヒトフレームワークペプチドが配列番号１〜８から選択される一又は複数の配列を含む、一又は複数の一般的なヒトフレームワークペプチドの濃度を検出および測定するために、質量分析によって消化された抗体サンプルを分析する
工程を含むヒト又はヒト化抗体を検出する一般的なアプローチを包含する。

【0134】

例示的な実施態様では、消化酵素はトリプシンである。代替的なプロテアーゼは、配列番号１〜８を有するもの以外に更なるフレームワークペプチドを生成し得る。任意の特定の酵素、例えばエンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＡｒｇＣ、黄色ブドウ球菌Ｖ８、及びエンドプロテアーゼＧｌｕＣなどを使用することができる。パパインなどの非特異的プロテアーゼを使用することができる。定量のために生成されたペプチドは、トリプシンによるのとは異なる配列を有し得るが、ヒト抗体に存在し動物の抗体には存在しない一般的なフレームワークペプチドを使用する概念は同じである。

【0135】

別の実施態様では、本方法は更に、消化された抗体サンプルを親和性捕捉媒体又は固相抽出（ＳＰＥ）サンプル精製と接触させ、濃縮された消化された抗体サンプルを溶出させることを含む。

【0136】

別の実施態様では、本方法は配列番号１〜８から選択される配列を有する一又は複数のヒトフレームワークペプチドを含んでなる抗体の親和性捕捉とその後の消化を含む。親和性捕捉法はＥＣＤ（細胞外ドメイン抗原結合）、抗ＩＤ捕捉又はプロテインＡ又はＧにより達成され得る。

【0137】

別の実施態様において、生物学的サンプルは非ヒト哺乳動物に由来する血清、血漿、組織又は細胞株である。

【0138】

本方法の例示的な実証において、抗体は、抗ＨＥＲ２トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ジェネンテック社）である。その他の抗体は、本発明の方法に供した。非臨床試験の血漿からトリプシン消化され分析された抗体には、抗ＭＵＣ１６、抗ＭＳＬＮ（メソテリン）、抗Ｓｔｅａｐ１、抗ＣＤ２０（２Ｈ７およびリツキシマブ）、抗ＨＥＲ３（２Ｃ４、ペルツズマブ）、抗ＮＲＰ１、抗ＰＤＬ１、抗ＬＲＰ６、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＧＦＲＡ１７Ｃ９、抗ＮＲＧ１、及び抗ＬＹ６Ｅが含まれる。

【0139】

別の実施態様では、抗体サンプルはビーズ担持プロテインＡ／Ｇにより免疫沈降（ＩＰ）親和性捕捉を用いて分析され、続いてビーズ上での消化と分析を行った。

【0140】

フレームワークシグネチャーペプチド
ヒト抗体のフレームワーク領域は大部分が保存されている。図１は、ヒト２Ｈ７抗体のオクレリズマブ（配列番号１１）、及び５つのカニクイザル抗ＣＤ２０抗体：ＣｙｎｏＨＣ １ａ Ｄ３ １（配列番号１２），ＣｙｎｏＨＣ １ｂ Ｅ５ １（配列番号１３），Ｃｙｎｏ ＨＣ ２ａ（配列番号１４），ＣｙｎｏＨＣ ２ｂ Ｅ６ １（配列番号１５），ＣｙｎｏＨＣ ３（配列番号１６）の重鎖アミノ酸配列の配列アラインメントを示す。ヒト２Ｈ７（ｈｕ ２Ｈ７）Ｍａｂに固有であり、カニクイザルのＩｇＧ重鎖に存在しない、フレームワークシグネチャーペプチドが同定され（ＦＳＰ１−８）各々はその配列に少なくとも一のアミノ酸の違いを有する。入手可能な配列情報に基づくと、フレームワークシグネチャーペプチド（ＦＳＰ１−８）はヒト抗体対してにのみ特有であり、カニクイザルのＩｇＧ変異体には特有ではない。表２のフレームワークシグネチャーペプチド（ＦＳＰ１−８）は、内因性ＩｇＧ１及びある場合にはＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４にも存在する。これらのペプチドは、他のヒト治療用抗体又はヒト化治療用抗体及びヒトＩｇＧの間でも共通している。

【0141】

【0142】

トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）をモデル参照基準として使用し、カニクイザル及びラット血漿に添加され、その後、ＳＰＥの予備濃縮又はプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズによる免疫沈降の有無に関わらず、直接全血漿消化、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に先立つ続くビーズ上での消化が続き、作業校正範囲は、両方の血漿のマトリクスにおいて１〜１０００μｇ／ｍＬで確立された。特異性はまた試験され、陰性対照のブランク血漿及び添加された血漿サンプルの両方で確認した。

【0143】

トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、ジェネンテック）は、マウスＨＥＲ２抗体の組換えＤＮＡ由来のヒト化、ＩｇＧ１カッパ、モノクローナル抗体バージョンであり、細胞ベースのアッセイにおいて高い親和性で（Ｋｄ＝５ｎＭ）ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）の細胞外ドメインに選択的に結合する（米国特許第５８２１３３７号；米国特許第６０５４２９７号；米国特許第６４０７２１３号；米国特許第６６３９０５５号； Coussens L, et al (1985) Science 230:1132-9; Slamon DJ, et al (1989) Science 244:707-12）。トラスツズマブは、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域を持つヒトフレームワーク領域を含む。トラスツズマブはＨＥＲ２抗原に結合し、従って癌細胞の増殖を阻害する。トラスツズマブは、インビトロでのアッセイおよび動物の両方で、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている（Hudziak RM, et al (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis GD, et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga J, et al (1998) Cancer Res. 58:2825-2831）。トラスツズマブは、抗体依存性細胞傷害、ＡＤＣＣのメディエーターである（Hotaling TE, et al (1996) ［要旨］。Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) ［要旨］。Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4)，補足 12:60-70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137）。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮは、ＥｒｂＢ２を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために１９９８年に承認された(Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744）。

【0144】

ＦＳＰ１−８の安定同位体標識化（ＳＩＬ）類似体（配列番号１−８）は、インサイツ（“spiked in"）内部標準として使用することができる。安定同位体標識は典型的には^１３Ｃ、^１５Ｎ、及び^２Ｈを含む。内部標準は、ペプチド配列の一又は複数のアミノ酸残基に組み込むことができる。内部標準は、消化の前又は後でサンプルに導入することができ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の最中で生じる変動（例えば、自動サンプラーの性能、ＬＣ分離とＭＳ応答における変化）を補正するように機能することができる。例えば、ＦＳＰ８の安定同位体標識されたバージョンは、フェニルアラニン（Ｆ）とチロシン（Ｙ）との間のリジンが^１３Ｃ及び^１５Ｎで標識される場合に調製された。

【0145】

それらのＭＳ特性に基づいて、ＦＳＰ８は最も強いシグナル応答に起因して、定量化のための主要なペプチドとして経験的に選択された。加えて、３つの他のペプチド、ＦＳＰ４、ＦＳＰ５、及びＦＳＰ３が、定性的確認のためにモニタリングされた。これら４つのペプチドの各々は、動物の生物学的マトリックス中のｍＡｂを定量化するための代用物として使用することができる。それらの対応するＳＩＬ ＩＳがアッセイに使用された（表３）。ＦＳＰ６は、同時に溶出する干渉バックグラウンドがカニクイザル血漿中で検出されたため、カニクイザル以外の動物マトリックスにおいてのみ使用することができる。比較的弱いイオン化が、ＦＳＰ１、ＦＳＰ５及びＦＳＰ２で観察された。

【0146】

【0147】

ヒト抗体及びヒト化抗体
図２は、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ジェネンテック、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２、抗ｐ１８５ＨＥＲ２）、組換えに由来したヒト化モノクローナル抗体、ＣＡＳ登録番号１８０２８８−６９−１の重鎖（配列番号１７）及び軽鎖（配列番号１８）を示す。

【0148】

図３は、オクレリズマブ、ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７、ＰＲＯ７０７６９、ヒト化抗ＣＤ２０抗体、ＣＡＳ登録番号６３７３３４−４５−３の重鎖（配列番号１１）及び軽鎖（配列番号１９）を示す。

【0149】

図４は、ペルツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４、ＣＡＳ登録番号３８０６１０−２７−５の重鎖（配列番号２０）及び軽鎖（配列番号２１）を示す。重鎖（配列番号２０）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ３、ＦＳＰ８が同定される。

【0150】

図５は、Ｔ細胞調節因子の拡張されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーである抗ＰＤＬ１の重鎖（配列番号２２）及び軽鎖（配列番号２３）を示す。重鎖（配列番号２２）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。

【0151】

図６は、抗ニューロピリン１、抗ＮＲＰ１、ＭＮＲＰ１６８５Ａの重鎖（配列番号２４）及び軽鎖（配列番号２５）を示す。重鎖（配列番号２４）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。抗ＮＲＰ１は、ＶＥＧＦファミリーのメンバーを含み、種々のリガンドに結合することが知られているマルチドメイン受容体である、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）を特異的に標的とする組換え、ファージ由来、ヒトモノクローナル抗体である。抗ＮＲＰ１は、マウス異種移植モデルにおいて抗ＶＥＧＦとの組合せにおける有効性、及び前臨床の種において広い用量範囲にわたる強い非線形薬物動態を実証している。現在、単剤として、及びパクリタキセルの有無にかかわらず、ベバシズマブを併用した第Ｉ相試験で評価されている。

【0152】

図７は、抗ＭＵＣ１６、ＤＭＵＣ４０６４Ａの重鎖（配列番号２６）及び軽鎖（配列番号２７）を示す。重鎖（配列番号２６）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。

【0153】

図８は、リツキシマブ、Ｃ２Ｂ８、ＭａｂＴｈｅｒａ、（リツキサン（登録商標）、ジェネンテック社、バイオジェン／アイデック）の重鎖（配列番号２８）及び軽鎖（配列番号１９）を示す。重鎖（配列番号２８）に下線が引かれるようにＦＳＰ２、ＦＳＰ４、ＦＳＰ８が同定される。リツキシマブ（リツキサン（登録商標）、ジェネンテック／バイオジェン・アイデック；ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）、ロシュ、ＲＥＤＩＴＵＸ（登録商標）、ＣＡＳ登録番号１７４７２２−３１−７）は、ＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作型キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。リツキシマブは米国特許第５７３６１３７号において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。リツキシマブは、再発性又は難治性の低悪性度又は濾胞性、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞ＮＨＬを有する患者の治療に適応される。リツキシマブは、細胞表面ＣＤ−２０に結合し、Ｂ細胞枯渇をもたらす (Cartron et al (2002)Blood 99: 754-758; Idusogie et al (2000) J. Immunol. 164: 4178-4184; Grillo-Lopez AJ, et al (1999) Semin Oncol; 26:66-73；米国特許第５７３６１３７号）。リツキサン（米国特許第５６７７１８０号；米国特許第５７３６１３７号）は、造血器悪性腫瘍で最も広く使用されているモノクローナル抗体であり、広範な臨床診療で確立されている。リツキサンは、再発性又は難治性、低悪性度又は濾胞性、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療のために、１９９７年にＦＤＡの承認を最初に受けた。また、欧州連合（ＥＵ）では１９９８年に商品名ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）のもとに承認された。２００６年２月、リツキサンはまた一以上のＴＮＦアンタゴニスト療法に対して応答が不十分であった、中程度から重度の活動性関節リウマチに罹患した成人患者において、徴候や症状を軽減するために、メトトレキサートと併用してＦＤＡの承認を受けた。リツキシマブ抗体（Ｃ２Ｂ８とも命名）のアミノ酸配列、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における組換え発現を介するその産生のための例示的な方法は、米国特許第５７３６１３７号に開示されている。

【0154】

サンプルの調製
図１５は、ビオチン化捕捉プローブに結合したストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上、又は、プロテインＡ、Ｇ被覆磁気ビーズ上における動物の血漿／血清からのｍＡｂの捕捉、続く磁気分離による単離、捕捉された抗体の消化、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の画を示す。

【0155】

図１６は、抗体の一般的な捕捉のためプロテインＡ、Ｇ被覆磁気ビーズ（上）の実施態様、及び抗体の特異的な捕捉のためのビオチン化捕捉プローブに結合したストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（下）の実施態様を示す。

【0156】

プロテインＡにより効率的かつ再現可能に標的のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を単離する免疫沈降の可能性を２通りの形式で評価した：（ａ）磁気ビーズに結合したプロテインＡ及び（ｂ）９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングされるプロテインＡ。予備的な試験において、プロテインＡマイクロタイタープレートは、標的のＭａｂ、特にサル血漿からのＭａｂと一緒に内因性ＩｇＧの総負荷を捕捉することにおいて、プロテインＡ磁気ビーズと比較して非常に容量が制限された。プロテインＡ磁気ビーズを用いるビーズ上での消化が、リチウム／ヘパリンで処置されたカニクイザル及びスプラーグドーリーラット血漿の両方からＦＳＰを単離するための評価用に選択された。全血漿消化及び続く固相抽出（ＳＰＥ）もまた試験され、バックグラウンドノイズからの干渉を除去するには効果が弱いことが見出された。

【0157】

生物学的サンプルの分離及び分析
ＦＳＰ特異性、検出感度及び再現性を評価するための２つのアプローチが調査された：（１）全血漿消化／ＳＰＥ（固相抽出）、及び（２）免疫沈降（ＩＰ）。

【0158】

サル（カニクイザル）及びラット血漿サンプル（各々の種でｎ＝１０ロット）が、ロット間の特異性、潜在的な干渉効果、及び再現性を評価するために評価された。ブランクの血漿対照とともに、ブランク血漿サンプルは強化され、すなわち、２０μｇ／ｍｌのトラスツズマブを添加された。１〜１０００μｇ／ｍｌの範囲のトラスツズマブである標準物質トラスツズマブのサンプル一式がプールした血漿マトリックス中に調製され、個々のサル及びラットの血漿サンプルと並行して実行された。

【0159】

図１２は、全血漿消化／ＳＰＥアプローチにより調製されたリチウムヘパリンカニクイザル血漿中に１〜１０００μｇ／ｍＬの様々な濃度で添加されたトラスツズマブ（ＦＳＰ８を代用物として用いる）の検量線を示す。安定同位体標識ペプチド内部標準（ＩＳ）を２０％アセトニトリル中で調製し、適切な濃度で含有する作業内部標準溶液を作製した。

【0160】

図１４は、動物血漿又は血清中におけるモノクローナル抗体の免疫沈降（ＩＰ）の工程及び対応するフレームワークシグネチャーペプチド（ＦＳＰ）を生成する工程を示す。プロトコルは、実施例１−４で定義される。

【0161】

動物のサンプルは、プロテインＡ常磁性ビーズ（ミリポア）による免疫沈降（ＩＰ）、続くトリプシン消化によって調製した。９６ウェルの円錐底のマイクロタイタープレート（VWR Scientific）に、２５μＬアリコートの希釈血清又は血漿［０．１：５．０：３．０：０．２：９１．７：０．１ Ｔｗｅｅｎ ２０／トリス塩酸塩（１Ｍ）／塩化ナトリウム（５Ｍ）／ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）／水／ＢＳＡ，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｗのローディングバッファー（ＳＮ１）による１：２ｖ／ｖ希釈］を１２５μＬのローディングバッファーと一緒に入れた。予め洗浄し、ローディングバッファーに再懸濁したプロテインＡ磁性ビーズの２５μＬのアリコートを各ウェルに添加した。次いで、混合物を、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の捕捉を可能にする一定の混合下で１２０分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。上清を捨て、ビーズを洗浄バッファー（ＳＮ２）（５．０：３．０：０．２：９１．８ トリス塩酸塩（１Ｍ）／塩化ナトリウム（５Ｍ）／ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）／水、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）で十分に洗浄した洗浄及び磁気分離を、マイクロプレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）、及び９６ウェルの平らな磁石（バイオテック）をそれぞれ用いて行った。洗浄／分離の工程はまた、キングフィッシャー９６磁性粒子プロセッサ（サーモサイエンティフィック）を用いて実施することができる。

【0162】

免疫沈降（ＩＰ）に続いて、作業ＩＳ溶液の２５μｌのアリコートを、代わりに２０％アセトニトリルを２５μＬ添加されたブランクを除いて、各ウェルに添加した。７５μＬのＲａｐｉＧｅｓｔ溶液（０．０５：３７．５：１０ ＲａｐｉＧｅｓｔ粉末／５０ｍＭの重炭酸アンモニウム／アセトニトリル，ｗ／ｖ／ｖ）及び１０μＬの０．１ＭのＤＴＴのアリコートが添加された。プレートは、接着性封止フィルム（ＶＷＲサイエンティフィック）で覆われ、約１分間、穏やかに振動し、６０分間６０℃でインキュベートした。２５μＬの体積のヨード酢酸（０．１Ｍ）を添加し、プレートをアルミ箔で覆い、光から保護し、約３０分間室温でインキュベートした。１０μＬのトリプシン溶液（０．２５０ｍｇ／ｍＬの）のアリコートを各ウェルに加え、続いてプレートを約９０分間３７℃でインキュベートした。消化は、各ウェルに２ＭのＨＣｌを１５μＬ添加し、３７℃で３０分間プレートをインキュベートすることによって停止させた。次いでサンプルを、Ｔｏｍｔｅｃ（ＣＴ、ＵＳＡ）によって９６ウェルの円錐底収集プレートの上部に配置されたマルチスクリーンＨＴＳフィルタープレート（０．４５μｍ、ミリポア）へ移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離してろ液を収集した。収集プレートを密封し、２０μＬの容量のろ液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳに直接注入した。

【0163】

ＥＬＩＳＡ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
ＥＬＩＳＡ（図１９ａ）およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（図１９ｂ）は、抗体の単回投与後にラット血漿中の全抗体を測定することで比較した。図１９ａは、固定化細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又は抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体との結合によって捕捉され、電気化学発光、比色分析、又は発色性基質の検出を伴うＥＬＩＳＡアッセイにおいて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を用いて検出されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ治療薬）の画を示す。

【0164】

液体クロマトグラフ分離は、２００μＬ／分の流速で操作される逆相ＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｃ１８ ＰＡ−Ａカラム（２．１×５０ｍｍ、３μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いたＨＰアジレント１１００シリーズＬＣ二成分系又は島津ＬＣ−１０ＡＤＶＰ二成分系の何れかによって行われた。カラムは、カラムヒーター（Analytical Sales and Products, NJ, USA）によって５０℃に維持した。移動相の内訳はＡ：０．１％ギ酸水溶液及びＢ：アセトニトリル／メタノール中の０．１％ギ酸（７５：２５、ｖ／ｖ）であった。勾配条件は、０．４分間５％のＢで維持され、３．４分で４０％のＢまで傾斜させ、更に１分間で９５％のＢまで増大させ、０．５分間９５％のＢで維持し、その後０．１分で５％のＢに戻した。次いで、それを０．５分間５％に維持し、その後０．１分で最大９５％のＢまで戻して傾斜させ、キャリーオーバーの可能性を低減するために０．５分間そのレベルで維持した。最後に、勾配は０．１分で５％のＢへ戻され、０．９分間５％のＢで再平衡化された。ＬＣの総実行時間は７．５分であった。サンプルは、２０μＬの注入器ループを装備したＣＴＣのＨＴＳ ＰＡＬオートサンプラー（LEAP Technologies, NC, USA）を用いて注入した。オートサンプラー洗浄１は、アセトニトリル／イソプロパノール／トリフルオロエタノール／メタノール／水／ギ酸（容量で６０：１５：１５：５：５：０．２）及び洗浄２は、水／アセトニトリル／ギ酸（体積で９５：５：０．２）であった。

【0165】

ターボイオンスプレーを装備したサイエックスＡＰＩ４０００（登録商標）トリプル四重極質量分析計（AB Sciex, CA, USA）を定量用に使用した。ＭＳ機器は、ソース温度を５００℃に設定し、イオンスプレー電圧を５０００Ｖで陽イオンモードで操作した。ガスパラメータは、カーテンガスを２５、ネブライザーガスを４５、そして補助ガスを４０に設定した。１０の衝突ガスを使用した。シグネチャーペプチドの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）遷移の詳細及びそれらの対応する内部標準を表４に示す。滞留時間は、各ＭＲＭ遷移において５０ミリ秒に設定し、１０Ｖの同じ入射電位を印加した。Ｑ１とＱ３分解能の両方が単位に設定された。定量化はピーク面積に基づいて、Ｉｎｔｅｌｌｉｑｕａｎを用いて行った。

【0166】

【0167】

方法の適格性評価はモデルとしてトラスツズマブを用いて行った。校正標準は、１．００、１．７５、３．００、１０．０、２５．０、７５．０、２００および２５０μｇ／ｍＬのカニクイザル血漿又はスプラーグドーリーラット血漿にトラスツズマブを加えることによって調製した。品質管理（ＱＣ）は、血漿中にトラスツズマブを１．００（ＬＬＯＱ），２．５０（ＬＱＣ），１５．０（ＭＱＣ）及び１９０μｇ／ｍＬ（ＵＱＣ）で調製した。加えて、１０００μｇ／ｍＬの元の濃度の１０倍希釈倍率による希釈ＱＣが含まれた。アッセイ内ＱＣは、６つの複製で調製し、希釈ＱＣは３つの複製で調製した。方法の適格性評価のデータを表５に報告する。データは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイが、事前に定義された許容範囲内の値との良好な精度と正確さを有することを示している。

【0168】

【0169】

図１７ａは、代用物としてＦＳＰ８を使用して、ラット血漿中の１μｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ）のトラスツズマブ抗体の検出を示し、安定同位体標識化ＦＳＰ８内部標準（図１７ｂ）が同じ保持時間で検出された。サンプルは実施例４のプロトコルに従って調製した。良好な直線性が、図１８のラット血漿における１−２５０μｇ／ｍＬのトラスツズマブから実証された。

【0170】

図２０は、トラスツズマブ、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体の２ｍｇ／ｋｇのボーラスを投与したラットの個々の濃度−時間プロファイル（１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）を示す。投与後の２８時間にわたる血漿サンプルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（図１９Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図１９ａ）アッセイによって分析した。良好な一致が、２つのアッセイ方法の間で観察された。図２０からのＰＫパラメータは次のとおりである。

【0171】

【0172】

図２１は、３Ａ５、抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体の２ｍｇ／ｋｇのボーラスを投与したラットの個々の濃度−時間プロファイル（２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ）を示す。投与後の２８時間にわたる血漿サンプルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（図１９ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図１９ａ）アッセイによって分析した。良好な一致が、２つの方法の間で観察された。図２１からのＰＫパラメータは次のとおりである。

【0173】

【0174】

図２２は、抗メソテリン（Ｍｓｌｎ）モノクローナル抗体の２ｍｇ／ｋｇをボーラス投与されたラットの結果（３Ｇ，３Ｈ，３Ｉ）を示す。２８時間にわたる血漿サンプルを投与後に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（図１９ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図１９ａ）アッセイによって分析した。良好な一致が、２つの方法の間で観察された。図２２からのＰＫパラメータは次のとおりである。

【0175】

【0176】

図２３は、抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体、３Ａ５を投与したカニクイザルから２８日間の血中の抗体の測定による、血漿／血清サンプルの平均薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。図２３からのＰＫパラメータは次のとおりである。

【0177】

【0178】

図２４は、抗メソテリン（Ｍｓｌｎ）モノクローナル抗体を投与したカニクイザルから４２日間の血中の抗体の測定による、血漿／血清サンプルの平均薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示している。図２４からのＰＫパラメータは次のとおりである。

【0179】

【0180】

図２５は、次の構造

を有し、ここでＡｂは、システインアミノ酸を介してリンカーのマレイミドカプロイル（ＭＣ）基に連結された抗ＬＹ６Ｅ抗体であり、ｐはＡＤＣ分子中の抗体当たりの薬物部分（ＭＭＡＥ）の数である、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗ＬＹ６Ｅ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを投与したマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ）からの血漿／血清サンプルの個々の薬物動態（ＰＫ）に基づく、図１９ａのＥＬＩＳＡアッセイ及び図１９ｂに示すＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイの間の一致を示す。ＡＤＣの典型的な混合物中のｐの範囲は、約０から約２０、又は０から約８である。ｐが０である場合には、一定量のネイキッド、非結合型抗体が存在してもよい。抗体当たりの平均薬物負荷は約２から約５、又は約３から約４であって良い。このように、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の典型的な調製剤は、ＭＭＡＥなどの幾つかの数の薬物部分とコンジュゲートした抗体種の不均一な混合物である。リンカーはまたカテプシン認識の影響を受けやすいバリン−シトルリン（ヴァル−ＣＩＴ）ジペプチドユニットと、パラ−アミノベンジルオキシメチル（ＰＡＢ）ユニットを含む（米国特許第７６５９２４１号；米国特許第７４９８２９８号； Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; 及びDoronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784）。

【0181】

薬物部分ＭＭＡＥ（ベドチン、（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ、４Ｓ、５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ、２Ｒ）−３−（（（１Ｓ、２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−ｏｘｏｈｅｐｔａｎ−４−イル）−Ｎ、３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド、ＣＡＳ登録番号４７４６４５−２７−７）は、抗体にそのＮ末端を介して連結したドラスタチンのモノメチルアウリスタチンアナログ（米国特許第５６３５４８３号、米国特許第５７８０５８８号）である。ＭＭＡＥは、構造

を有する。

【0182】

図２３−２８の抗体投与実験からの２つのアッセイ法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びＥＬＩＳＡ）からのＰＫプロファイルとパラメータは高い一致を示しており、カニクイザル、ラットおよびマウスを含む動物において、代用物として共通のフレームワークシグネチャーペプチドを使用する単一の汎用ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイによるｍＡｂの定量化は実現可能で堅牢な性能であることを示唆している。単一のＭＳに基づくアプローチは、他の方法では達成するために複数のＥＬＩＳＡアッセイを必要とする信頼性のあるＰＫデータを生成することができる。更に、ＭＳのアプローチは、任意のカスタム試薬を必要とせず、方法の開発プロセスを加速し、薬物開発の初期段階でのＰＫ評価を利用できる手助けとなる。

【0183】

データ解析
検量線は、ＤＷＹＩＨＷＶＲ（配列番号９），ＦＳＰ３，ＦＳＰ４，ＦＳＰ５，ＦＳＰ８（全てサルとラットの両方）及びＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号１０）（ラットのみ）の免疫沈降のアプローチで確立され、全血漿消化／ＳＰＥのアプローチがＦＳＰ４，ＦＳＰ５，ＦＳＰ８（全てサルとラットの両方）で確立された。ブランクと添加血漿サンプルに対する特異性データが確立された。ＦＳＰ８に関して、異なるペプチドの面積比及び対応するＣＶ（変動係数）が、消化再現性の基準として与えられている。二次の（１／濃度（conc.)^２重み付き）回帰をデータにフィッティングするために使用した。

【0184】

サル血漿サンプルの処置に対する全血漿消化／ＳＰＥのアプローチにおいて（実施例３ｂ）、ＦＳＰ８は最も感受性の高いペプチドである。図１３は、全血漿消化／ＳＰＥサンプル調製の後で、ＬＬＯＱ（定量下限）＝１μｇ／ｍＬにてリチウムヘパリン化クイザル血漿中に添加されたＦＳＰ８の検出を実証するＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。４．４７分及び５．２０分でのピークがブランクにある。ＦＳＰ８は４．６６分で保持時間を有する。低濃度で定量化できる唯一の他のペプチドはＦＳＰ４とＦＳＰ５である。しかしながら、１μｇ／ｍＬのＬＬＯＱ−レベルにおける雑音に対する信号の比率（Ｓ／Ｎ）は５未満（＜）である。予想されるように、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫペプチド（配列番号：１０）は、全てのサル血漿中で内因性の高いバックグラウンドレベルを示した。試験された１０の個々のロットのうち９個は、類似した許容可能な特異性を有していた。ロット＃５は、全ての定量化ペプチドについて異常なバックグラウンドレベルを持っていた。そのパターンは、それが若干のヒト血漿で汚染された可能性があること示唆している。全体として、ＦＳＰ（即ち添加された）サンプルは、一次定量のための潜在的なシグネチャーペプチドであるＦＳＰ８の全ロットにおいて良好な正確さと精度を示した（例外：２７％のＣＶのＦＳＰ７）。ＦＳＰ８に比べてＦＳＰ４及びＦＳＰ５のピーク面積比は、異なるサンプル及びサンプルタイプ間において２０％未満のＣＶを示した。

【0185】

ラット血漿サンプルの処置に対する全血漿消化／ＳＰＥのアプローチにおいて（実施例３ｂ）、ＦＳＰ８は最も強力なペプチドである。低レベルの濃度で定量化できる唯一の他のペプチドはＦＳＰ４とＦＳＰ５である。しかし、これらのペプチドのＬＬＯＱレベルでのｓ／ｎは５未満である。検量線は、おそらく後で注入されたサンプルのシグナル抑制に起因して分割された性質を示した。試験された個々のロットの何れも、全ペプチドにおいて定量可能なバックグランドピークを有していなかった。分割曲線のため、ＦＳＰサンプルは非常に変動する精度と再現性の値を示した。ＦＳＰ８に関してＦＳＰ４及びＦＳＰ５のピーク面積比は、大概の場合ＣＶが２０％を超えることを示しており、再びアッセイ変動性を指摘している。

【0186】

サル血漿サンプルの処置に対する免疫沈降のアプローチにおいて（実施例４）、ＦＳＰ８は最も感受性の高い、即ち強力なペプチドである。他の全てのペプチドもまた低レベルの濃度で定量化可能である。他の全てのペプチドのＬＬＯＱレベルでのｓ／ｎは、５より大きい（ＦＳＰ２を除く）。予想されるように、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫペプチド（配列番号：１０）は、全てのサル血漿においてバックグラウンドレベルを示した。濃度と応答の間の関係は、恐らくはプロテインＡ磁性ビーズの飽和のため及び／又は内因性カニクイザルＩｇＧとの競合から、高濃度にて若干の非線形性を示した。試験された１０の個々のロットの中で、ロット＃５からのサンプルは、可変領域ペプチドＤＴＹＩＨＷＶＲ（配列番号９）を除いて全ての定量可能なペプチドにおいて似たレベルでバックグランドピークを有していた。全体として、ＦＳＰサンプルはＦＳＰ８の全ロットで良好な正確さと精度を示した（ブランク中のバックグランド濃度が考慮される場合ロット＃５を含める）。ほとんど全てのペプチドのピーク面積比は、異なるサンプル及びサンプルタイプの間でＣＶが１５％未満を示した（ＣＡＬＳのＣＶが約２３％であるＦＳＰ５を除く）。

【0187】

ラット血漿サンプルの処置に対する免疫沈降（ＩＰＴＥＮ欠損）のアプローチにおいて（実施例４）、ＦＳＰ８は最も強力なペプチドである。他の全てののペプチドは、低レベルの濃度でも定量化可能である。他の全てのペプチドのＬＬＯＱレベルでのｓ／ｎは５より大きい（ＦＳＰ２を除く）。濃度と応答との間の関係は、恐らくはラット血漿における低親和性の内因性ＩｇＧとの競合が少ないために、サル免疫沈降（ＩＰ）データの良好な線形性を示した。試験された個々のロットの何れも、全ペプチドにおいて定量可能なバックグランドピークを有していなかった。全体的に、ＦＳＰサンプルはＦＳＰ８の全ロットに対して良好な正確さと精度を示した。ほとんど全てのペプチドのピーク面積比は、異なるサンプル及びサンプルタイプの間でＣＶが２０％未満を示した（ＣＡＬＳのＣＶが２４％より大きいＦＳＰ５とＦＳＰ２を除く）。

【0188】

プロテインＡ磁気ビーズによる免疫沈降（ＩＰ）は、全血漿消化／ＳＰＥ抽出よりも良い感受性と再現性を示した。ＩＰアプローチは、全マトリクス消化／ＳＰＥアプローチよりもより迅速で「より清潔」である。

【実施例】

【0189】

実施例１ 単純全血漿消化及び抽出手順
１． Ｌｏ−バインドプレートの中に（クエン酸ナトリウム）血漿の１０μＬを分取する。
２． ５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｍＭのＤＴＴ溶液を９５μＬ添加する。
３． 混合し、６０分間６０℃でインキュベートする。
４． ５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１００ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）の２０μＬを添加する。
５． 暗所で３０分間室温でインキュベートする。
６． ２０分間、光の当たる所に放置する。
７． ５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の５００μｇ／ｍＬのトリプシン溶液の１５μＬを添加する。
８． ３７℃で一晩インキュベートする。
９． １％ギ酸溶液１５μｌを加える。混合し、遠心分離する。
１０． ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（０．７ｍＬ／分で２０Ｌ注入、ＵＰＬＣ）で分析する。

【0190】

実施例２ ＭＡＸ／ＷＣＸ ｍｉｃｒｏＥｌｕｔｉｏｎ（登録商標）プレート（ウォーターズ社）の固相抽出プロトコル
１． ６００μＬの血清／血漿消化物を１００μＬの８％のＨ３ＰＯ４と混合する。
２． ＭＡＸ／ＷＣＸ Ｅｌｕｔｉｏｎ ＳＰＥプレート（ウォーターズ社、Milfo rd MA）を２００μＬのＭｅＯＨで調整する。
３． ＭＡＸ／ＷＣＸ Ｅｌｕｔｉｏｎ ＳＰＥプレートを２００μＬのＨ２Ｏで平衡化する。
４． ＭＡＸ／ＷＣＸ Ｅｌｕｔｉｏｎ ＳＰＥプレート上に希釈した血清／血漿消化物をロードする（２×３５０μＬのアリコート）。サンプルが滴下方式でベッドを通過できるように各添加後にちょうど十分な真空を適用する。
５． ５％のＮＨ４ＯＨの２００μＬで洗浄する。
６． ２０％のＡＣＮ（アセトニトリル）を２００μＬで洗浄する。
７． 中程度の真空下で（２×２５μＬ）の７５：２５：１のアセトニトリル／水／ＴＦＡ、ｖ／ｖ／ｖにより９６カ所の位置の、２．０ｍＬ、正方形ウェル、円錐の底、ポリプロピレンプレート中に溶出する。
８． 水２００μＬを加え、紫色のマットシールでプレートを密封し、約３０秒間ボルテックスする。
９． ４０００ ＱＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ上に２５μＬを注入する（AB Sciex, Foster City, CA, USA）。

【0191】

実施例３ａ 全血漿消化手順＃１
１． Ｌｏ−バインドプレートの中に血漿の１０μＬを分取する。
２． ５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｍＭのＤＴＴ溶液を９５μＬ添加する。
３． 混合し、６０分間６０°Ｃでインキュベートする。
４． ５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１００ｍＭのヨードアセトアミドの２０μＬを添加する。
５． 暗所で３０分間室温でインキュベートする。
６． ２０分間、光の当たる所に放置する。
７． ５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の５００μｇ／ｍＬのトリプシンの１５μＬを添加する。
８． ３７℃で一晩インキュベートする。
９． １％ギ酸溶液１５μｌを加える。混合し、遠心分離する。
１０． ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。

【0192】

実施例３ｂ 全血漿消化／ＳＰＥ（固相抽出）−プロトコル＃２
１． ２５μＬの血漿サンプルを１００μＬのＲａｐｉＧｅｓｔ^ＴＭ（ウォーターズ社、Milford MA）ＳＦ界面活性剤溶液（０．０５：４０：１０ ＲａｐｉＧｅｓｔ^ＴＭ／酢酸アンモニウム、５０ｍＭ／ＡＣＮ、ｗ／ｖ／ｖ）と混合するＲａｐｉＧｅｓｔ^ＴＭ希釈液（８０：２０酢酸アンモニウム、５０ｍＭ／ＡＣＮ、ｖ／ｖ）の更なる４００μＬを添加する。
２． ＤＴＴ（１Ｍ）を１０μＬ添加する。６０℃で約１時間インキュベートする。
３． ＩＡＡ（１Ｍ）を２５μＬ添加する。光から保護して、室温で約０．５時間インキュベートする。
４． トリプシンを２０μｇ添加する。３７℃で約１６時間インキュベートする。
５． 別用量の２０μｇのトリプシンを添加する。３７℃で約４時間インキュベートする。
６． ６ＭのＨＣｌを５０μＬ添加する。３７℃で約０．５時間インキュベートする。
７． Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ Ｅｌｕｔｉｏｎプレート（ウォーターズ社、Milford MA）を用いて、全血漿消化物の５００μＬをＳＰＥに供する。
８． ５００μＬの血清／血漿消化を１００μＬの８％のＨ３ＰＯ４と混合する。
９． Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ ＥｌｕｔｉｏｎＳＰＥプレートを２００μＬのＭｅＯＨで調整する。
１０． Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ ＥｌｕｔｉｏｎＳＰＥプレートを２００μＬのＨ２Ｏで平衡化する。
１１． Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ ＥｌｕｔｉｏｎＳＰＥプレート上に希釈した血清／血漿消化物をロードする（２×３００μＬのアリコート）。サンプルが滴下方式でベッドを通過できるようにちょうど十分な真空を適用する。
１２． ５％のＮＨ４ＯＨの２００μＬで洗浄する。
１３． ２０％のアセトニトリルの２００μＬで洗浄する。
１４．中程度の真空下で（２×２５μＬ）の７５：２５：１のアセトニトリル／水／ ＴＦＡ、ｖ／ｖ／ｖにより溶出する。
１５． 水２００μＬを加え、プレートを密封する。約３０秒間ボルテックスする。
１６． ＳＰＥ溶出液の最終容量は約２５０μＬである。この抽出物の２５μＬを直接注入する。

【0193】

実施例４ 免疫沈降プロトコル
１． 全てのビーズが均一に懸濁されるように、プロテインＡビーズ懸濁液をゆっくりと混合する。
２． ポリプロピレンチューブ中の浮遊ビーズの必要な量をピペッティングする。外部磁石の助けを借りて、貯蔵緩衝液からビーズを分離し、ビーズを乱すことなくピペットにより貯蔵緩衝液を除去する。（注：ウェル当たりに必要な２５−μＬのビーズ容量に基づいて、必要なビーズ容量を計算する）。
３． 初期のビーズ容量に等しいポリプロピレンチューブにＳＮ１緩衝液の容量を加える。ビーズがＳＮ１緩衝液に再懸濁されるように簡潔にボルテックスする。
４． 再び外部磁石の助けを借りて、ＳＮ１緩衝液からビーズを分離し、ビーズを乱すことなくＳＮ１緩衝液を除去する。
５． 工程３−４を更に２回繰り返す。
６． ビーズを洗浄後、初期のビーズ容量に等しいＳＮ１緩衝液の容量を加える。ビーズがＳＮ１緩衝液に再懸濁されるように簡潔にボルテックスする。洗浄されたビーズ溶液は、使用日に新たに調製すべきである。１時間の洗浄内で使用されない場合は２〜４°で保存すべきである。
７． 血漿サンプルをボルテックスし、マイクロチューブに２５μＬを分取する。
８． ＳＮ１緩衝液５０μｌで血漿サンプルを希釈する。簡潔にボルテックスする。
９． ９６ウェルマイクロタイタープレート内に希釈血漿サンプルの２５μＬを分取する。
１０． 各ウェルにＳＮ１緩衝液１２５μｌを加える。
１１． 各ウェルに（工程６からの）洗浄プロテインＡビーズを２５μＬ加える。ビーズは添加する前によく溶液に懸濁されていることを確認すること。
１２． 接着性封止フィルムでプレートを覆い、タイタープレートシェーカー上で室温で約２時間ゆっくりと振盪する。
１３． 外部磁石とプレート洗浄機を使用して磁気ビーズを分離し、上清中の非結合タンパク質を捨てる。プレート洗浄機を使用してＳＮ２緩衝液でビーズを３回洗浄する。ビーズは、各洗浄工程の前にタイタープレートシェーカー上で振盪することによりよく溶液に懸濁されていることを確認すること。
１４． 内部標準を含まないブランクを除き、各ウェルに作業内部溶液２５μｌを加える。内部標準を含まないブランクを含む各ウェルに作業内部標準希釈液２５μｌを加える。
１５． 各ウェルにＲａｐｉＧｅｓｔ溶液７５μｌを加える。
１６． 各ウェルに０．１ＭのＤＴＴ１０μｌを加える。接着性封止フィルムでプレートを覆い、タイタープレートシェーカー上で室温で約１分間ゆっくりと振盪する。
１７． 約１時間予熱したオーブンで６０℃でプレートをインキュベートする。
１８． 各ウェルに０．１ＭのＩＡＡ２５μｌを加える。接着性封止フィルムでプレートを覆い、タイタープレートシェーカー上で室温で約１分間ゆっくりと振盪する。これらの工程は光から保護されて実行されるべきである。アルミホイルでプレートを覆い、約３０分間室温でインキュベートする。
１９． 各ウェルにトリプシン溶液１０μｌを加える。接着性封止フィルムでプレートを覆い、タイタープレートシェーカー上で室温で約１分間ゆっくりと振盪する。
２０． 約９０分予熱したインキュベーター中で３７℃でプレートをインキュベートする。
２１． 各ウェルに２ＭのＨＣｌを１５μｌ加える。接着性封止フィルムでプレートを覆い、タイタープレートシェーカー上で室温で約１分間ゆっくりと振盪する。
２２． ３０分予熱したインキュベーター中で３７℃でプレートをインキュベートする。
２３． 約１分間タイタープレートシェーカー上でゆっくりとプレートを振盪する。Ｔｏｍｔｅｃを用いて、９６ウェル、円錐形底回収プレートの上部に配置されたマルチスクリーンＨＴＳフィルタープレートへ各ウェルから溶液を移す。
２４． マルチスクリーンＨＴＳフィルタープレート／９６ウェルの円錐底回収プレートの組み合わせを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、９６ウェルの円錐底回収プレート中にろ液を収集する。
２５． ９６ウェルの円錐底回収プレートを黄色の注入マットで密封し、直接注入する。

【0194】

ＳＮ１緩衝液：０．１：５．０：３．０：０．２：９１．７：０．１ Ｔｗｅｅｎ ２０／トリス塩酸塩（１Ｍ）／塩化ナトリウム（５Ｍ）／ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）／水／ＢＳＡ，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｗこの溶液は、Ｔｗｅｅｎ２０を１ｍＬ、１Ｍのトリス塩酸塩を５０．０ｍＬ、５Ｍの塩化ナトリウム溶液を３０ｍＬ、０．５ＭのＥＤＴＡを２ｍＬ、及びウシ血清アルブミンを１．００ｇを１Ｌのメスフラスコ中で混合して調製される。次いで容積を水で埋めあわせ、ウシ血清アルブミンを溶解させるために良く混合する。これは最大で１ヶ月２〜８℃で密閉容器中に保存される。

【0195】

ＳＮ２緩衝液：５．０：３．０：０．２：９１．８ トリス塩酸塩（１Ｍ）／塩化ナトリウム（５Ｍ）／ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）／水，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ。この溶液は、１Ｍのトリス塩酸塩を５０．０ｍＬ、５Ｍの塩化ナトリウム溶液を３０ｍＬ、０．５ＭのＥＤＴＡの２ｍＬを１Ｌのメスフラスコ中で混合して調製される。次いで容積を水で埋めあわせ、良く混合する。これは最大で１ヶ月２〜８℃で密閉容器中に保存される。

【0196】

例示的なＨＰＬＣ法＃１：

例示的なＨＰＬＣ法＃２：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｃ１８ ＰＡ−Ａ，３μｍ，２．１ｘ５０ｍｍ（部品＃１８８００２４２５）
移動相Ａ：０．１：１００ギ酸／水、ｖ／ｖ
移動相Ｂ：０．１：７５：２５ギ酸／アセトニトリル／メタノール，ｖ／ｖ／ｖ
流速：０．２０ｍＬ／分
勾配：

【0197】

前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]