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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5988101
(24)【登録日】2016年8月19日
(45)【発行日】2016年9月7日
(54)【発明の名称】酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物とその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20160825BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20160825BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20160825BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20160825BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20160825BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20160825BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20160825BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20160825BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20160825BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
A01K67/027
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/02
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
【請求項の数】14
【全頁数】48
(21)【出願番号】特願2012-553799(P2012-553799)
(86)(22)【出願日】2012年1月20日
(86)【国際出願番号】JP2012051738
(87)【国際公開番号】WO2012099279
(87)【国際公開日】20120726
【審査請求日】2015年1月14日
(31)【優先権主張番号】特願2011-10833(P2011-10833)
(32)【優先日】2011年1月21日
(33)【優先権主張国】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100091096
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100118773
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節
(72)【発明者】
【氏名】岩脇 隆夫
(72)【発明者】
【氏名】及川 大輔
【審査官】
竹内 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００５／０４９７９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２００９−１７１９２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００９／１０７８７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
J. Biol. Chem., 2005, 280(21), pp.20340-20348
【文献】
Mutation Research, vol.696, pp.21-40 (2010)
【文献】
Biochem J., vol.409, pp.205-213 (2008)
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物由来Ｎｒｆ２タンパク質においてＮｅｈ２−Ｎｅｈ６ドメイン配列を含み、かつ、Ｎｅｈ１ドメイン配列又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン配列を欠失させるか又は機能欠損させてなる部分タンパク質をコードする核酸配列と、該部分タンパク質をコードする核酸配列の上流に配置された、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）又はＡＲＥとプロモーターの組み合わせからなるストレス誘導性プロモーター配列と、該部分タンパク質をコードする核酸配列の下流に配置された、検出可能シグナルを発することが可能なタンパク質をコードする核酸配列とを含む、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物。
【請求項2】
前記部分タンパク質が、前記Ｎｒｆ２タンパク質からＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン配列を欠失させてなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項3】
哺乳動物由来Ｎｒｆ２がヒトＮｒｆ２又はマウスＮｒｆ２である、請求項１又は２に記載の核酸構築物。
【請求項4】
前記Ｎｅｈ２−Ｎｅｈ６ドメイン配列が、配列番号１（ヒト）又は配列番号２（マウス）のＮｒｆ２タンパク質のアミノ酸配列中のそれぞれアミノ酸１位〜４３３位又はアミノ酸１位〜４２５位からなるアミノ酸配列を含むものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項5】
前記ＡＲＥが複数回リピートからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項6】
前記ＡＲＥと組み合わせるプロモーターがウイルス由来プロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項7】
前記核酸構築物が、その３’末端にタグコード配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項8】
前記タグコード配列がＦｌａｇタグコード配列である、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項9】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項10】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物又は請求項９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項11】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物又は請求項９に記載のベクターを含む非ヒト動物。
【請求項12】
非ヒト動物が小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物又は低酸素ストレスインジケーター発現用核酸構築物をさらに含む、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【請求項13】
請求項１０に記載の細胞又は請求項１１又は１２に記載の非ヒト動物において、酸化ストレスを提供した際に増大する検出可能シグナルの強度を測定することを含む、酸化ストレスを測定するための方法。
【請求項14】
請求項１０に記載の細胞又は請求項１１又は１２に記載の非ヒト動物に、候補薬剤の存在下で、ある特定の酸化ストレスを提供し、該候補薬剤非存在下の対照と比べて検出可能シグナルの強度が減少するときに該候補薬剤が酸化ストレス抑制能を有すると判定することを含む、酸化ストレス抑制剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物に関する。具体的には、酸化ストレスは、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１経路に関連するストレスである。本発明はまた、上記核酸構築物を使用して酸化ストレスを測定する方法に関する。
本発明はさらに、上記核酸構築物を使用して酸化ストレス抑制用薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【0002】
酸化ストレスとは、生体内で活性酸素種の生成と消去システムのバランスが乱れ、活性酸素種が過剰になる状態を指す。この状態が進行すると生体を構成している核酸、タンパク質、脂質等が酸化され、生体に障害が生じる。細胞は酸化ストレス・親電子性物質にさらされると、グルタチオン合成酵素やヘムオキシゲナーゼ １（ＨＯ−１）などの抗酸化タンパク質や第二相解毒酵素を発現誘導することで、生体防御に努める（非特許文献１）。このような酸化ストレスによる遺伝子発現機構において、遺伝子上流に存在する抗酸化剤応答配列ＡＲＥ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）とそこに結合する転写因子Ｎｒｆ２が重要な機能を果たしている（非特許文献２及び３）。Ｎｒｆ２は、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）型転写因子であり、酸化ストレス、親電子性ストレス、毒性化合物及び発癌物質などに対する細胞防御の重要な制御因子として作用する（非特許文献３、４、５及び６）。通常の条件下では、Ｎｒｆ２は、それとＫｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １；これはＣｕｌ３系ユビキチンＥ３リガーゼ複合体の基質アダプタータンパク質である。）との結合を介するユビキチン−プロテアソーム経路によって迅速に分解される（非特許文献７〜１０）。酸化ストレス又は親電子性ストレスに曝されると、Ｋｅａｐ１中の複数の反応性システイン残基が共有結合によって修飾され、Ｋｅａｐ１により仲介される分解からＮｒｆ２が解放される。この結果、Ｎｒｆ２の安定化とその後の核への移行が生じ、核の中で、Ｎｒｆ２は小Ｍａｆファミリータンパク質のメンバーと二量体を形成する。この複合体が酸化／親電子性応答要素（ＡＲＥ／ＥｐＲＥ）として知られるｃｉｓ作用性ＤＮＡ要素（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔ）を介して広範囲の転写を活性化する（非特許文献２及び３）。
重要なことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルで、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２系が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患に関与するか或いは該疾患を軽減することが示されている（非特許文献１１）。また、Ｎｒｆ２ノックアウト（Ｎｒｆ２ ＫＯ）マウスを使用した最近の研究により、Ｎｒｆ２の機能不全がヒト疾患の病態に関与していることや、Ｎｒｆ２がヒト疾患に重要な役割を果たしている可能性があることが示されている（非特許文献１２〜１４）。さらにまた、最近ではＮｒｆ２が急性肺障害および急性炎症の生体側防御因子として重要な働きをすることが明らかになっている（非特許文献１５）。
これまで、酸化ストレスやそれに対する細胞の応答反応は主に培養細胞を用いて研究されており、また、酸化ストレス状態をモニターするレポーターについても低感度のものしか知られていない。さらにまた、一般に、酸化ストレスの検出は、ある種のタンパク質の発現量を測定することによって行われている。具体的には、酸化ストレス誘導性の転写因子であるＮｒｆ２の発現量をウエスタン解析により測定すること、或いは、その下流で誘導されるＨＯ−１の発現レベルをノーザン解析で測定することが行われている。しかし、これらの手法では、細胞を溶解する過程があるため、個体レベルで酸化ストレスを受けている臓器を特定することが難しい。これまで、Ｎｒｆ２により酸化ストレス依存的に誘導されるプロモーターからアルカリホスファターゼを発現させるレポーターが作製されているが、感度が十分ではなく、また、レポータータンパク質が個体観察に適さないことから、動物個体の解析は行われず培養細胞レベルの解析にとどまっている（非特許文献１６）。
また、これまで、ストレス誘導性プロモーターとタンパク質分解制御部位を組み合わせたレポーター（非特許文献１７）、蛍光又は発光タンパク質、マーカータンパク質及び調節タンパク質を含む酸化ストレスを測定するためのプローブ試薬（特許文献１）などが知られている。
このように、ｉｎ ｖｉｖｏでの酸化ストレスの研究は、酸化ストレスと関係する神経変性疾患、心血管疾患、糖尿病、関節リウマチなどの疾患の病理、発症及び細胞生物学に有用な情報を与えるはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際出願第ＷＯ ２００９／１０７８号パンフレット
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｒｕｓｈｍｏｒｅ ＴＨ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５（２４）：１４６４８−１４６５３
【非特許文献2】Ｒｕｓｈｍｏｒｅ ＴＨ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６（１８）：１１６３２−１１６３９
【非特許文献3】Ｉｔｏｈ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７；２３６：３１３−３２２
【非特許文献4】Ｍｏｉ Ｐ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６；９１：９９２６−９９３０
【非特許文献5】Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６；９３（２５）：１４９６０−１４９６５
【非特許文献6】Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００４；１０１：６３７９−６３８４
【非特許文献7】Ｉｔｏｈ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９９；１３（１）：７６−８６
【非特許文献8】Ｉｔｏｈ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２００３；８：３７９−３９１
【非特許文献9】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００４；２４：７１３０−７１３９
【非特許文献10】Ｋａｔｏｈ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００５；４３３：３４２−３５０
【非特許文献11】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＡ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８；１１４７：６１−６９
【非特許文献12】Ｙｏｈ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２００１；６０：１３４３−１３５３
【非特許文献13】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４；３２１：７２−７９
【非特許文献14】Ｉｓｈｉｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７５：６９６８−６９７５
【非特許文献15】Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ Ｈ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００４；１０（１１）：５４９−５５７
【非特許文献16】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００２；８１：１２３３−１２４１
【非特許文献17】Ｈａｒａｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００７；３６０：７９１−７９６
【発明の概要】
【0005】
上で述べたように、酸化ストレスは、種々の疾患と関連していることが知られているだけに、細胞及び生体において酸化ストレス状態を高感度でモニター又は検出可能なシステムの構築に対するニーズが高い。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでの酸化ストレスの解析を容易にするために、少なくともＮｒｆ２におけるＮｅｈ２ドメインのＫｅａｐ１と結合してユビキチン化される機能を保持させ、Ｎｅｈ１ドメイン又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメインのＤＮＡ結合能を欠失させることにより、酸化ストレス時におけるストレス応答の検出時のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を向上させることに着目し、ＯＫＤ４８（Ｋｅａｐ１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，Ｎｏ−４８）（「ＡＪＩＳＡＩ（ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ ｊｏｉｎｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）」ともいう）と名づけた生細胞でも使用可能な酸化ストレスインジケーターを今回見出した。本明細書では、ＯＫＤ４８のような酸化ストレスインジケーターの特異性と感受性、ならびに、酸化ストレスインジケーター発現トランスジェニック非ヒト動物の有用性について記載する。
すなわち、本発明は以下の特徴を包含する。
（１）Ｎｒｆ２タンパク質において少なくともＮｅｈ２ドメイン配列を含み、かつ、Ｎｅｈ１ドメイン配列又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン配列を実質的に欠失させるか又は機能欠損させてなる部分タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置されたストレス誘導性プロモーター配列と、該核酸配列の下流に配置された、検出可能シグナルを発することが可能なタンパク質（例えば、発光若しくは蛍光タンパク質、又は標識可能なタグ配列が結合されたタンパク質）をコードする核酸配列とを含む、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物。
（２）部分タンパク質が、Ｎｒｆ２タンパク質からＮｅｈ１ドメイン配列又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン配列を実質的に欠失させてなるアミノ酸配列を含む、上記（１）に記載の核酸構築物。
（３）Ｎｒｆ２タンパク質が哺乳動物由来Ｎｒｆ２である、上記（１）又は（２）に記載の核酸構築物。
（４）哺乳動物由来Ｎｒｆ２がヒトＮｒｆ２又はマウスＮｒｆ２である、上記（３）に記載の核酸構築物。
（５）部分タンパク質が、（ａ）配列番号１（ヒト）又は配列番号２（マウス）のＮｒｆ２タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸１位〜９３位からなるＮｅｈ２ドメイン配列、（ｂ）該Ｎｅｈ２ドメイン配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、（ｃ）該Ｎｅｈ２ドメイン配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列、を含むものである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸構築物。
（６）部分タンパク質が、（ｄ）配列番号１（ヒト）又は配列番号２（マウス）のＮｒｆ２タンパク質のアミノ酸配列中のそれぞれアミノ酸１位〜４３３位又はアミノ酸１位〜４２５位からなる、Ｎｅｈ２−Ｎｅｈ６ドメイン配列を含むアミノ酸配列、（ｅ）該Ｎｅｈ２−Ｎｅｈ６ドメイン配列を含むアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、（ｆ）該Ｎｅｈ２−Ｎｅｈ６ドメイン配列を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列、を含むものである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸構築物。
（７）ストレス誘導性プロモーターが、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）、又はＡＲＥとプロモーターの組み合わせからなる、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の核酸構築物。
（８）ＡＲＥが複数回リピートからなる、上記（７）に記載の核酸構築物。
（９）前記核酸構築物が、その３’末端にタグコード配列を含む、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の核酸構築物。
（１０）タグコード配列がＦｌａｇタグコード配列である、上記（９）に記載の核酸構築物。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
（１２）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸構築物又は上記（１１）に記載のベクターを含む細胞。
（１３）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸構築物又は上記（１１）に記載のベクターを含む非ヒト動物。
（１４）非ヒト動物が小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物又は低酸素ストレスインジケーター発現用核酸構築物をさらに含む、上記（１３）に記載の非ヒト動物。
（１５）上記（１２）に記載の細胞又は上記（１３）又は（１４）に記載の非ヒト動物において、酸化ストレスを提供した際に増大する検出可能シグナル（例えば、発光又は蛍光シグナル）の強度を測定することを含む、酸化ストレスを測定するための方法。
（１６）上記（１２）に記載の細胞又は上記（１３）又は（１４）に記載の非ヒト動物に、候補薬剤の存在下で、ある特定の酸化ストレスを提供し、該候補薬剤非存在下の対照と比べて検出可能シグナル（例えば、発光又は蛍光シグナル）の強度が減少するときに該候補薬剤が酸化ストレス抑制能を有すると判定することを含む、酸化ストレス抑制剤をスクリーニングする方法。
本発明のインジケーターは、細胞又は動物においてＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１経路に関連した酸化ストレスを特異的に検出可能にし、また、酸化ストレス時におけるストレス応答検出のＳ／Ｎ比を向上させるという利点を有する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１１−０１０８３３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
図１は、Ｎｒｆ２のドメイン構造（Ａ）、ならびに、ヒトＮｒｆ２及びマウスＮｒｆ２の各ドメインの位置と％同一性（Ｂ）を示す。図２は、ヒトＮｒｆ２及びマウスＮｒｆ２のアミノ酸配列アラインメントを示す。
図３は、ｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ−ｈＮｒｆ２（１−４３３）−ＧＬ４−Ｆｌａｇからなる核酸構築物（ＯＫＤ４８）、ならびに、通常条件と酸化ストレス条件での該核酸構築物の転写の抑制と誘導を模式的に示す。ＯＫＤ４８構築物としてｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ−ｈＮｒｆ２（１−４３３）ＧＬ４−Ｆｌａｇを作製した。ヒトＮｒｆ２では、Ｎｅｈ２ドメインはＫｅａｐ１結合及びユビキチン化領域として機能し、Ｎｅｈ１ドメインはＤＮＡ結合領域として機能する。ＯＫＤ４８構築物は、３×ＡＲＥプロモーター、ヒトＮｒｆ２（アミノ酸１−４３３）コード配列及びＦｌａｇタグ結合Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＧＬ４）コード配列を有する。通常条件下では、ＯＫＤ４８構築物の転写は誘導されなかった。また、漏出したＯＫＤ４８タンパク質は、Ｋｅａｐ１系によって分解された。酸化ストレス下では、ＯＫＤ４８は、３×ＡＲＥプロモーターによって転写誘導され、得られたＯＫＤ４８タンパク質はＫｅａｐ１系によって安定化された。このように、酸化ストレスを受けた細胞でのみ発光を検出した。
図４は、ｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ−ｈＮｒｆ２（１−４３３）−ＧＬ４−Ｆｌａｇからなる核酸構築物（ＯＫＤ４８）を含むベクターの構造を示す。
図５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＫＤ４８の特性決定を示す。（Ａ）酸化ストレスに対するＡＪＩＳＡの特異性。ＯＫＤ４８構築物をＨｅＬａ細胞中にトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイを、種々のストレス物質（亜ヒ酸ナトリウム（ＡＳＮ），マレイン酸ジエチル（ＤＥＭ），Ｈ２Ｏ２，ツニカマイシン（Ｔｕｎ），ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（Ｔｇ），ジチオトレイトール（ＤＴＴ），エトポシド（Ｅｔｐ）又はｔｈｅｎｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ（ＴＴＦＡ））の存在下又は非存在下で８時間又は１６時間処理したのち行った。（Ｂ）種々のストレス下でのＯＫＤ４８構築物のタンパク質発現。ＯＫＤ４８構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、種々のストレス物質の存在下又は非存在下で８時間処理した。細胞の溶解液を、抗Ｌｕｃ抗体又は抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用するウエスタンブロッティング法で解析した。（Ｃ）種々のストレス下での内在性Ｎｒｆ２のタンパク質発現。ＨｅＬａ細胞を種々のストレス物質の存在下又は非存在下で８時間又は１６時間処理したのち、細胞の溶解液を、抗Ｌｕｃ抗体又は抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用するウエスタンブロッティング法で解析した。（Ｄ）ＯＫＤ４８活性に対するＮｒｆ２過剰発現の影響。ＯＫＤ４８構築物及びＮｒｆ２過剰発現ベクターをＨｅＬａ細胞中にトランスフェクションし、亜ヒ酸ナトリウム（ＡＳＮ）の存在下又は非存在下、８時間処理したのち、ルシフェラーゼアッセイを行った。（Ｅ）ＯＫＤ４８活性に対するＫｅａｐ１過剰発現の影響。ＯＫＤ４８構築物及びＫｅａｐ１過剰発現ベクター（全長又は切断型アミノ酸１−３１４）をＨｅＬａ細胞中にトランスフェクションし、亜ヒ酸ナトリウム（ＡＳＮ）の存在下又は非存在下、８時間処理したのち、ルシフェラーゼアッセイを行った。
図６は、ルシフェラーゼ融合Ｎｒｆ２断片の最適化を示す。（Ａ）試験構築物の概略図。ヒトＮｒｆ２の部分断片（アミノ酸１−９３もしくはアミノ酸１−４３３）又は全長コード配列を、Ｆｌａｇタグ結合ルシフェラーゼ（ＧＬ４）コード配列と融合した。これらの融合遺伝子は、３×ＡＲＥプロモーター又は陰性対照としてのＨＳＶ−ＴＫ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）プロモーターによって駆動された。（Ｂ）試験構築物を用いるルシフェラーゼアッセイ。各試験構築物をＨｅＬａ細胞中にトランスフェクションし、亜ヒ酸ナトリウム（ＡＳＮ）、マレイン酸ジエチル、Ｈ２Ｏ２の存在下又は非存在下、８時間又は１６時間処理したのち、ルシフェラーゼアッセイを行った。
図７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓからの蛍光の検出を示す。（Ａ）ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ構築物からの蛍光画像。ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、その後、亜ヒ酸ナトリウム（ＡＳＮ）又はマレイン酸ジエチルの存在下又は非存在下で８時間処理した。これらの蛍光画像を位相差画像と一緒に得た。（Ｂ）種々のストレス下でのＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ構築物からの蛍光強度。ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、その後、細胞を、亜ヒ酸ナトリウム（ＡＳＮ），マレイン酸ジエチル（ＤＥＭ），Ｈ２Ｏ２，ツニカマイシン（Ｔｕｎ），ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（Ｔｇ），ジチオトレイトール（ＤＴＴ），エトポシド（Ｅｔｐ）又はｔｈｅｎｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ（ＴＴＦＡ））の存在下又は非存在下で８時間処理した。それらの細胞の溶解液からの蛍光を測定し、同時トランスフェクションしたルシフェラーゼに対して正規化した。図中、ｎ．ｄ．は検出されないことを表す。（Ｃ）種々のストレス下でのＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ構築物のタンパク質発現。ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクションし、種々のストレス物質の存在下又は非存在下で８時間処理した。それらの細胞溶解液を抗ＧＦＰ抗体又は抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用するウエスタンブロッティング法で解析した。
図８は、酸化ストレス物質としてＡＳＮ試薬を投与して６時間経ったマウスを開腹し、発光シグナルを観察したものを示す。
図９は、マウスＯＫＤ４８のストレス条件下（ストレス物質：ＤＥＭ又はＡＳＮ）での発光特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明について以下に詳細に説明する。１．酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物
本発明の酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物は、Ｎｒｆ２タンパク質において少なくともＮｅｈ２ドメイン配列を含み、かつ、Ｎｅｈ１ドメイン配列又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン配列を実質的に欠失させるか又は機能欠損させてなる部分タンパク質をコードする核酸配列と、該核酸配列の上流に配置されたストレス誘導性プロモーター配列と、該核酸配列の下流に配置された、発光若しくは蛍光タンパク質、又は（各種試薬で）標識可能なタグ配列が結合されたタンパク質、をコードする核酸配列とを含むことを特徴とする。
本明細書中の「核酸」という用語は、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡそれらの化学修飾体などを含む意味で使用される。
本明細書中の「酸化ストレスインジケーター」という用語は、細胞又は生体内で生じた酸化ストレスのインジケーター（指示物質又は指示薬）であり、本発明では、Ｎｒｆ２タンパク質において少なくともＮｅｈ２ドメインを機能的に保持させ、一方Ｎｅｈ１ドメイン又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメインを機能欠損させたものを指す。
Ｎｅｈ２ドメインに関連して使用される「機能的に保持され（る）」という用語は、Ｋｅａｐ１と結合してユビキチン化される機能を保持された上で、配列番号１（ヒトＮｒｆ２タンパク質）又は配列番号２（マウスＮｒｆ２タンパク質）のアミノ酸配列中のアミノ酸１位〜９３位の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性をもつアミノ酸配列を有するＮｅｈ２ドメインをいう。Ｎｅｈ２ドメインの機能は、酸化ストレスのない通常時に酸化ストレスインジケーターがＮｒｆ２による分解を受ける上で必須となる。
さらにまた、「Ｎｅｈ１ドメイン又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメインを実質的に欠失させるか又は機能欠損させる」という用語は、Ｎｅｈ１ドメインの機能である「ＤＮＡ結合能」が失われていればよい状態を指し、したがって必ずしもＮｅｈ１ドメインの全体が欠失される必要がなく、すなわちＮｅｈ１ドメインの一部、例えばその１〜５０個、好ましくは１〜２０個のアミノ酸が欠失されずに残存してもよいことを意味する。また、Ｎｅｈ３は非存在であることが好ましい。いずれにしても、Ｎｅｈ１ドメインの存在により、酸化ストレスがない場合であっても酸化ストレス応答を示すことがあるため、Ｎｅｈ１ドメインを非機能的にすることが必要である。
「酸化ストレス」という用語は、生体内で活性酸素種の生成と消去システムのバランスが乱れ、活性酸素種が過剰になる状態を指し、本発明では特にＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２経路に関連する。酸化ストレスにより誘導されるヘムオキシナーゼ１（ＨＯ−１）が紫外線（ＵＶ−Ａ）照射により誘導され、この誘導にＮｒｆ２タンパク質が関与することが知られている（Ａｌｌａｎｓｏｎ Ｍ ａｎｄ Ｒｅｅｖｅ ＶＥ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００４；１２２：１０３０−１０３６；Ｚｈｏｎｇ ＪＬ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２０１０；９：１８−２４）。従って、例えば、本発明によれば紫外線照射によって引き起こされる生理条件に近い低レベルの酸化ストレスであっても検出することができる。紫外線照射の強度は、例えば１〜１００ｍＷ／ｃｍ２、好ましくは２〜５０ｍＷ／ｃｍ２、より好ましくは５〜３０ｍＷ／ｃｍ２である。酸化ストレスはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、肝疾患を始めとした各臓器の変性疾患、糖尿病、関節リウマチなどの多くの疾患と関連する。また、急性炎症や慢性炎症などの炎症反応との関連も報告されている。本発明では、上記酸化ストレスインジケーターを用いて酸化ストレスをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで測定することを可能にする。
「Ｎｒｆ２タンパク質」という用語は、動物細胞内において酸化ストレスに応答して、これに対する防御機能を担う抗酸化タンパク質の発現を誘導する塩基性ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）型転写因子として働くタンパク質を指す。細胞に酸化ストレスがない状態では、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１と結合した形で細胞質に存在している。このときＫｅａｐ１はさらにユビキチンリガーゼ複合体と結合して、Ｎｒｆ２のユビキチン化を促進している。ユビキチン化されたＮｒｆ２は蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソームによって分解を受けるため、その機能が抑えられている。一方、細胞が酸化ストレスにさらされると、活性酸素がＫｅａｐ１と反応し、その構造に変化を与える。この構造変化によりＫｅａｐ１がＮｒｆ２から解離することでＮｒｆ２のユビキチン化が抑えられる。これにより分解が抑制されたＮｒｆ２は、安定化されて細胞内での量を増加させ、核内に移行して転写因子としての機能を発揮するようになる。このときＮｒｆ２は抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ；ＡＲＥ）に結合し酸化ストレス防御遺伝子を発現する。Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１経路を介した酸化ストレス防御機構については、伊東健、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）７８（２）ｐｐ．７９−９２（２００６）（日本）に記載されている。
Ｎｒｆ２は、図１Ａに示すように、Ｎ末端側から順番に、Ｎｅｈ２ドメイン、Ｎｅｈ４ドメイン、Ｎｅｈ５ドメイン、Ｎｅｈ６ドメイン、Ｎｅｈ１ドメイン及びＮｅｈ３ドメインからなる６つのＮｅｈ（Ｎｒｆ２−ＥＣＨ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインによって構成されており、種間で高度に保存されている（伊東健 ２００６，上掲）。ＥＣＨは、ニワトリＮｒｆ２の別称である。ここで、Ｎｅｈ２は、Ｎｒｆ２活性の抑制性の制御ドメインであり、Ｋｅａｐ１と結合する部位及びユビキチン化部位を有している。Ｎｅｈ４及びＮｅｈ５はともに、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ；Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）であり、補助因子である転写コアクチベーター（ＣＢＰ）と結合する。Ｎｅｈ６は核において恒常的に分解されるドメイン（Ｄｅｇｒｏｎ）である。Ｎｅｈ１は、塩基性−ＣＮＣ特異的領域（Ｂａｓｉｃ）とロイシンジッパー領域（Ｌ−Ｚｉｐ）からなり、ＢａｓｉｃはＤＮＡと特異的に結合する、及び、核への移行に関与する領域であり、Ｌ−Ｚｉｐは小Ｍａｆ群因子とのヘテロ二量体形成に重要な領域である。Ｎｅｈ３は転写活性化に関わる領域（ＴＡＤ）である（Ｎｉｏｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００５；２５：１０８９５−１０９０６）。
本明細書で使用する「Ｎｅｈ２−Ｎｅｈ６ドメイン」という用語は、Ｎｒｆ２タンパク質のＮｅｈ２ドメインのＮ末端アミノ酸残基からＮｅｈ１ドメインのＮ末端アミノ酸の直前のアミノ酸残基までを指す。また、「Ｎｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン」とは、Ｎｅｈ１ドメインのＮ末端アミノ酸残基からＮｒｆ２タンパク質のＣ末端アミノ酸残基までを指す。
本明細書で使用される「Ｎｒｆ２」という用語は、脊椎動物、無脊椎動物、温血動物、哺乳動物、鳥類などの動物に由来のＮｒｆ２、その相同体（ホモログ、もしくはオーソログ）、及びその類似体（アナログ）（例えば変異体（Ｎｒｆ２の生物活性を保持するが、部分的にアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加を含む）又は化学修飾体）を含む。動物由来のＮｒｆ２のアミノ酸配列又は塩基配列は、ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどの配列データベースにアクセスすることによって入手可能である。
例えば、図２に、哺乳動物由来のＮｒｆ２のなかで、特にヒトＮｒｆ２及びマウスＮｒｆ２のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１、配列番号２）のアラインメントが示されている。ヒトとマウスのＮｒｆ２間の配列同一性は約８０％である。また、図１Ｂには、ヒトとマウスのＮｒｆ２タンパク質のＮｅｈ２、Ｎｅｈ４、Ｎｅｈ５、Ｎｅｈ６、Ｎｅｈ１、Ｎｅｈ３の各ドメインの位置と％同一性が示されている。配列同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズムを利用して決定できるし（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（３）：４０３−１０，１９９０）、また％同一性は、２つのアミノ酸配列を、一致度が最大となるようにギャップを導入してか又はギャップを導入しないでアラインメントさせたとき、総アミノ酸残基数（ギャップの数も含む）に対する同一アミノ酸残基数のパーセンテージを意味する。この定義は、ＤＮＡの塩基配列の％同一性に関しても同様に適用する。この場合、上記アミノ酸配列に代えて塩基配列、上記アミノ酸に代えてヌクレオチド（又は塩基）がそれぞれ対象となる。
このように、本発明では、Ｎｒｆ２として、哺乳動物由来Ｎｒｆ２が好ましく、例えばヒト由来Ｎｒｆ２及びマウス由来Ｎｒｆ２がより好ましいが、保存性の高いドメインであるＮｅｈ２以外のＮｒｆ２領域に全成熟アミノ酸残基数の約２０％以下、好ましくは約１０％以下、さらに好ましくは約５％以下、例えば約４％以下、約３％以下、約２％以下又は約１％以下のアミノ酸変異（欠失、置換、挿入又は付加）があってもよい。すなわち、ヒトＮｒｆ２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列、を含むタンパク質であり、一方、マウスＮｒｆ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、例えば９６％、９７％、９８％又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
本発明の核酸構築物は、少なくとも、上記インジケーターをコードする核酸配列とストレス誘導性プロモーター配列とを含む。
「ストレス誘導性プロモーター」という用語は、ストレス防御遺伝子の遺伝子発現を制御するプロモーターを指す。そのようなプロモーターは、以下のものに限定されないが、例えばキノンレダクターゼ（ＱＲ）プロモーター、Ｎｒｆ２の標的遺伝子プロモーター、プロモーター活性化部位である抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）又はＭａｆ認識配列（ＭＡＲＥ；Ｍａｆ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）などである。或いは、これらのプロモーター又はプロモーター活性化部位と、別のプロモーター又はエンハンサーとの組み合わせであってもよい。ここで、別のプロモーター又はエンハンサーは、ウイルス由来プロモーター、哺乳動物由来プロモーター、組織特異的プロモーターなどを含み、例えばＨＳＶ−ＴＫ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２００９ ３１５（１５）：２４９６−５０４）、ＨＳＶ−ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｅｌｌ １９８１；２５：３８５−３９８，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．Ｂｅｌｇｒａｄｅ ２００６；５８（４）：１９７−２０３，ｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター／エンハンサー（Ｊ．Ｖｉｔｏｌ．１９９５；６９：２１９４−２２０７，ｐＫＭ２Ｌ−ｐｖＣＭＶ（ＲＤＢ Ｎｏ．５５５１；ＲＩＫＥＮ，ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＣＭＶＴＮＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ））やＳＶ−４０ウイルスプロモーター／エンハンサー（Ｃｅｌｌ １９８１；２７：２９９−３０８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９１；６５（１２）：６９００−６９１２，ｐＫＭ２Ｌ−ｐｖＳＶ４０（ＲＤＢ Ｎｏ．５５５０；ＲＩＫＥＮ），ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ），ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ），ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、伸長因子 １（ＥＦ−１）プロモーター（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７（２４）；４７７５−４７８２）などである。また、エンハンサーの例は、Ｎｒｆ２の標的遺伝子由来エンハンサー、例えばヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）エンハンサー（薬学雑誌２００７；１２７（４）：７５７−７６４（日本），Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３；２８５：Ｆ５１５−Ｆ５２３）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ−１（ＮＱＯ１）エンハンサー（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９６；９３：１４９６０−５）などである。上記組み合わせは、例えばＡＲＥとＨＳＶ−ＴＫ基本プロモーター（ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の組み合わせ、ＡＲＥとＨＯ−１エンハンサーの組み合わせなどであり、好ましくは、ＡＲＥとＨＳＶ−ＴＫ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒの組み合わせである。
上記のプロモーター／エンハンサーの配列の具体例を以下に示す。
ＡＲＥは、酸化ストレスの原因物質である親電子性物質（例えばマレイン酸ジエチル（ＤＥＭ）、亜ヒ酸ナトリウム（ＡＳＮ）、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔ−ＢＨＱ）など）に応答して生体防御遺伝子の発現誘導を仲介する遺伝子発現制御配列（又は、ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ）である。本発明の実施形態によれば、ＡＲＥは複数回リピート、好ましくは３〜５回のリピートであり、より好ましくは３回リピートである。複数回リピートでは、ＡＲＥ配列とＡＲＥ配列との間に、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個、の任意の塩基からなる配列がスペーサーとして存在することが好ましい。ＡＲＥの塩基配列は、ＴＧＡ（Ｇ／Ｃ）ＮＮＮＧＣ（ここでＮはＧ，Ｃ，Ａ又はＴである。）（Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００４；１０（１１）：５４９−５７）であり、例えばＴＧＡＣＡＴＴＧＣ（配列番号８）及び／又はＴＧＡＣＡＡＡＧＣ（配列番号９）である。後述の実施例で使用されたＡＲＥの３回リピート配列（３×ＡＲＥ）は、次のとおりである（配列番号１０）。
また、後述の実施例で使用された３ｘＡＲＥ−ＴＫ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列は、次のとおりである（配列番号１１）。
本発明の核酸構築物は、ターミネーター、ポリＡ配列、リボソーム結合配列などの調節配列、必要に応じて選択マーカー配列、をさらに含むことができる。さらにまた、該核酸構築物は、上流及び下流にＮｒｆ２遺伝子の５’−非翻訳領域配列及び３’−非翻訳領域配列を含むことが可能であり、これは細胞ゲノムへの組み込みを意図したものである。３’−非翻訳領域配列又は５’−非翻訳領域配列のサイズは、非限定的に、例えば１ｋｂ以上、好ましくは１〜７ｋｂである。
本発明の酸化ストレスインジケーターは、Ｎｒｆ２タンパク質において、少なくともＮｅｈ２ドメインを含み、かつ、Ｎｅｈ１ドメイン又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン、好ましくはＮｅｈ１−Ｎｅｈ３ドメイン、が発光又は蛍光タンパク質、又は標識可能なタグ配列が結合されたタンパク質、によって置換された改変Ｎｒｆ２タンパク質である。本発明の核酸構築物では、改変Ｎｒｆ２タンパク質の発現によって発光又は蛍光の観察が可能となる。
選択マーカー配列は、本発明の核酸構築物が組み込まれた細胞を選択するために有用であり、例えば薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）などを含むことができる。また、細胞ゲノムへの組込み後に選択マーカー配列を除去する場合、核酸構築物において、選択マーカー配列の両端にｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列などのリコンビナーゼ認識配列を配置し、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系、ＦＬＰ−ＦＲＴ系などのリコンビナーゼ−リコンビナーゼ認識配列系を利用して除去を行うことができる。必要であればＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、或いは、ジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子もしくはその断片などのネガティブ選択マーカー配列を核酸構築物に挿入することができる。
本発明において酸化ストレスの検出には、検出可能シグナルを発することが可能な任意のタンパク質を使用することができる。また、例えば、細胞死誘導分子などを利用することで酸化ストレスを受けた細胞や組織を特異的に死滅させることもできる。好ましくは発光若しくは蛍光タンパク質、又は標識可能なタグ配列が結合されたタンパク質が使用される。本明細書中ではこれらについて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明で使用される発光又は蛍光タンパク質は、特に制限されずに任意のものを使用できる。蛍光タンパク質としては、オワンクラゲ由来蛍光タンパク質及びその誘導体、例えばＧＦＰ，ＹＦＰ，ＥＢＦＰ，ＥＣＦＰ，ＥＧＦＰ，ＥＹＦＰ，Ｖｅｎｕｓなど、またサンゴ由来蛍光タンパク質及びその誘導体、例えばＤｓＲｅｄ，ＨｃＲｅｄ，ｍＣｈｅｒｒｙなどを使用することができる。発光タンパク質は、代表的な例として、ホタル、コメツキムシ等の甲虫類、ウミホタル、バクテリアなどの生物がもつ生物発光反応を触媒する酵素であるルシフェラーゼを含む。蛍光タンパク質に関しては、例えばＳｈｉｍｏｍｕｒａ Ｏ ｅｔ ａｌ（１９６２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５９：２２３−３９；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｇ（２００１）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２０４（１）：９−１８；Ｓｈａｎｅｒ Ｎ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９０５−９０９；Ｈｅｉｍ Ｒ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３−６６４などの文献を挙げることができる。また、ルシフェラーゼに関しては、例えばｄｅ Ｗｅｔ ＪＲ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：７８７０−７８７３、特開２００８−２８９４７５号公報、特開２００５−２４５４５７号公報などの文献を挙げることができる。このような蛍光又は発光タンパク質は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、チッソ（日本）などからも市販されている。
標識可能なタグ配列が結合されたタンパク質は、タグタンパク質とも称され、例えばテトラシステインタグ（標識試薬：ＦｌＡｓＨラベリング試薬又はＲｅＡｓＨラベリング試薬；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（標識試薬：多数あり；Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＳＮＡＰ−ｔａｇ、ＣＬＩＰ−ｔａｇ、ＡＣＰ−ｔａｇ及びＭＣＰ−ｔａｇ（以上、標識：多数あり；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌｎａｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＦＡＰｓ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；２６（２）：２３５−２４０）などを含むが、これらに限定されない。これらのタグタンパク質は、タンパク質を蛍光タグ配列と結合してラベルしたものである。
本発明の核酸構築物は、次のようにして作製することができるが、以下は例示であって当該方法に制限されるものではない。
ヒト、マウスなどの動物種由来のＮｒｆ２遺伝子をｃＤＮＡクローニングし、ＰＣＲ増幅し、ベクターに組み込んだのち、Ｎｒｆ２のＮｅｈ１コード領域又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３コード領域の実質的に両末端を制限酵素で切断・除去し、予め作製しておいた発光若しくは蛍光タンパク質又はタグタンパク質、或いはレポーター配列（例えばＦｌａｇタグなど）を連結した発光若しくは蛍光タンパク質又はタグタンパク質、をコードする核酸を該切断サイトに挿入する。Ｎｅｈ１コード領域及びＮｅｈ３コード領域はそれぞれ、例えば、ヒトＮｒｆ２の場合、配列番号１のアミノ酸配列の４３４位〜５６１位、５６２位〜６０５位の配列をコードする領域に相当し、一方、マウスＮｒｆ２の場合、Ｎｅｈ１コード領域及びＮｅｈ３コード領域はそれぞれ、配列番号２のアミノ酸配列の４２６位〜５５３位、５５４位〜５９７位の配列をコードする領域に相当する（図１Ｂ参照）。Ｎｅｈ１コード領域又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３コード領域の置換において、該領域の機能が不全若しくは機能欠損になるのであれば、該領域の全部でなく一部分を発光若しくは蛍光タンパク質又はタグタンパク質をコードする核酸で置換してもよい。このとき、Ｎｒｆ２タンパク質からＮｅｈ１又はＮｅｈ１−Ｎｅｈ３を欠失した残りのタンパク質部分をコードする核酸は、少なくともＮｅｈ２を含むアミノ酸配列をコードする核酸からなる。このようにして得られた改変Ｎｒｆ２タンパク質をコードする核酸をＰＣＲによって増幅し、増幅産物を回収する。Ｎｅｈ３コード領域は必ずしも必須ではないため、ＰＣＲ増幅の際に、該領域を増幅しないようにプライマーを設計することによってＮｅｈ３コード領域を含有しない増幅産物を作製することができる。後述の実施例では、ｈＮｒｆ２（１−４３３）−Ｌｕｃ、ｍｏｕｓｅ Ｎｒｆ２（１−４２６）−Ｌｕｃ（ここで、ＬｕｃはルシフェラーゼをコードするＤＮＡを表す。）をコードする核酸が増幅産物として得られる。これらの核酸構築物は、未改変Ｎｒｆ２−Ｌｕｃ核酸構築物と比べてより高いＳ／Ｎ比を付与することができる。
後述の実施例で実際に使用した配列（３ｘＡＲＥ−ＴＫｂａｓａｌ−ＯＫＤ４８−ＬＵＣ）を次に示す（配列番号１２）。
後述の実施例で実際に使用した配列（３ｘＡＲＥ−ＴＫｂａｓａｌ−ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ）を次に示す（配列番号１３）。
ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、目的の増幅産物の塩基配列に基づいて設計可能であるし、またＰＣＲ条件は慣用の条件を使用可能である。
一般にＰＣＲ反応は、二本鎖ＤＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡに分離するステップ、一本鎖ＤＮＡにプライマーをアニーリングするステップ、及び一本鎖ＤＮＡを鋳型にしてプライマーを伸長するステップを１サイクルとし、これを約２０〜４５サイクル反復することを含む。変性ステップは、例えば９４〜９８℃、約１０秒〜約５分の処理からなり、アニーリングステップは、例えば約５０〜６８℃、約１０〜６０秒の処理からなり、伸長ステップは、例えば７２℃、約２０秒〜約１０分の処理からなる。全サイクルの開始前に９４〜９８℃、約３０秒〜約５分の処理を行ってもよく、また、全サイクルの完了後に７２℃、約１〜１０分の処理を行ってもよい。プライマーは、正方向プライマー及び逆方向プライマーからなり、鋳型ＤＮＡの塩基配列に基づいて設計される、また、プライマーのサイズは、一般に、１５〜３０塩基、好ましくは２０〜２５塩基である。ＰＣＲ反応液は、鋳型ＤＮＡ、耐熱性ポリメラーゼ、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）などを含むＰＣＲバッファーからなる。サーマルサイクラーなどのＰＣＲ装置を使用すると便利にＰＣＲ反応を実施することができる。ＰＣＲの手法の具体例については、ＦＭ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＲＡ Ｓｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２３０：１３５０−１３５４、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５２：１６４３−１６５１などを参照することができる。
一方、核酸構築物のもうひとつの要素であるストレス誘導性プロモーターについては、それを合成するか、又は、それを含むライブラリー、例えば動物組織由来ゲノムライブラリーから調製し、ユニーク制限サイト又はマルチクローニングサイトを含むベクターに組み込む。このベクター中、ストレス誘導性プロモーターの３’側の制限サイト又はクローニングサイトに、改変Ｎｒｆ２タンパク質をコードする核酸を挿入する。必要に応じて、作製された核酸構築物をベクターから切り出し、電気泳動などの精製法を用いて回収する。ここで、ストレス誘導性プロモーターは、上に例示したようなものであり、好ましくは酸化ストレス誘導性プロモーターであり、本発明ではＡＲＥ、ＡＲＥとプロモーター（例えばＨＳＶ−ＴＫ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒなど）の組み合わせが好ましい。ＡＲＥは、前述のとおり、ＡＲＥの複数回リピートであることが好ましく、例えばＡＲＥの３回リピート（３×ＡＲＥ）がより好ましい。
このようにして、図３に示すような本発明の核酸構築物を作製することができる。もしこの核酸構築物をゲノムに組み込むことが意図される場合には、核酸構築物の５’側及び３’側にそれぞれＮｒｆ２遺伝子の約１〜７ｋｂの５’−非翻訳領域配列、約１〜７ｋｂの３’−非翻訳領域配列を連結するとよい。このような核酸構築物を含むベクターは、細胞ゲノム上のＮｒｆ２遺伝子（又はＮｒｆ２遺伝子座）と相同組換えを起こし、これによって核酸構築物が該ゲノムに組み込まれる。この手法は、特に該核酸構築物を含むトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスを作製するために利用しうる。
２．ベクター
本発明はさらに、上記の核酸構築物を含むベクターも提供する。
ベクターは、プラスミド（例えばｐＢｒｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＵＣ系など）、ファージ、コスミド、ウイルス、ＢＡＣ、ＰＡＣなどのいずれでもよく、これらに制限されない。プラスミドは、動物細胞用プラスミド、例えば哺乳動物用プラスミドであり、便利には市販のプラスミドを使用できる。また、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス、レンチウイルスなどのウイルスベクターである。ＢＡＣ及びＰＡＣは人工染色体である。
本発明のベクター構築物の例を図４に示す。
３．細胞
本発明はさらに、上記の核酸構築物又は上記のベクターを含む細胞を提供する。
細胞は、一般に動物細胞であり、好ましくは温血動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト細胞又はマウス細胞である。細胞はまた、培養細胞、初代細胞、継代細胞、株化細胞、形質転換細胞、トランスフェクション細胞、体細胞、生殖細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、組織幹細胞、遺伝子操作等により分化多能性が付与された細胞（例えば人工多能性（ｉＰＳ）細胞を含む）および当該細胞より分化した細胞などを非限定的に包含する。哺乳動物細胞の例は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞などを含む。
上記細胞は、本発明の核酸構築物又はベクターによって形質転換又はトランスフェクションされる。形質転換又はトランスフェクションの手法は、通常、動物細胞の形質転換法であり、例えばウイルス感染法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム法、リン酸カルシウム法などの公知の手法を含む。
ウイルス感染法は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスなどの公知のウイルスベクターを利用する手法である。この手法は、ウイルスが動物細胞に感染しやすい特性を利用している。
リポソーム法は、カチオン性リポソーム、例えばコレステロール系カチオン性リポソーム、などのリポソームを利用する手法であり、リポソームによる形質転換法はリポフェクションとも呼ばれる。この手法は、細胞の表面がアニオン性の電気的性質を有することを利用している。また、リポソームの表面に、細胞膜透過性ペプチド（例えばＨＩＶ−１ Ｔａｔペプチド、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、オリゴアルギニンペプチドなど）を結合したリポソームを利用することもできる。
４．非ヒト動物
本発明はさらに、上記の核酸構築物又は上記のベクターを含む非ヒト動物、すなわちトランスジェニック動物（ヒトを除く）又はその子孫動物を提供する。
トランスジェニック動物（ヒトを除く）の作製には、例えば核移植法や、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの分化多能性細胞を利用することができる。
本明細書において「動物」は、ヒトを除く動物、好ましくは鳥類、哺乳類、例えばサル、チンパンジーなどの霊長目、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯目、家畜動物として有用なウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、などの偶蹄目、イヌ、ネコなどの食肉目、ニワトリなどの鳥類などを包含するがこれらに限定されない。
核移植法は、例えば線維芽細胞などの体細胞のゲノムに本発明の核酸構築物又はベクターを導入したのち、該細胞から取出した核を、除核した受精卵又は未受精卵にマイクロインジェクトし、（除核した未受精卵の場合、電気刺激を与えたのち）これを仮親の子宮又は卵管に移植し、発生、出産させてキメラ動物を得ることを含む。
ＥＳ細胞を利用する方法は、動物（ヒトを除く）の卵子の胚盤胞から取出した内部細胞塊に本発明の核酸構築物又はベクターをマイクロインジェクション、ミクロセル融合法、エレクトロポレーションなどの手法によって導入したのち、ＥＳ細胞を別の胚の胚盤胞に注入し移植胚を得、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させてキメラ動物を得ることを含む（例えば、Ｅｖａｎｓ ＭＪ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ ＭＨ １９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６、押村光雄ら編、クロマチン・染色体実験プロトコール（２００４年）羊土社）。
ｉＰＳ細胞を利用する方法として一例を挙げると、動物由来の体細胞に、改変Ｎｒｆ２タンパク質をコードする核酸が発現可能な状態で上記の核酸構築物又はベクターを導入して形質転換細胞を作製したのち、文献記載の手法（例えばＴａｋａｈａｓｈｉ Ｋ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ ２００６，Ｃｅｌｌ １２６：６６３−６７６）によって、この細胞に転写因子（例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃなど）又はそれをコードする核酸（ベクターを含む）を導入し、培養することによってＥＳ細胞様の分化多能性細胞を得て、このｉＰＳ細胞を胚盤胞に注入し移植胚を得、さらにこの胚を仮親の子宮に移植し、出産させてキメラ動物を得ることができる。キメラ動物の選抜は、動物組織からゲノムＤＮＡを取り出し、サザンハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどの手法で導入核酸の存在を調べるか、或いは、マウス等の動物の毛色の変化で判定することもできる。
上記のように作製されたキメラ動物はさらに、同種の野生型と交配し、さらに、得られたヘテロ接合性の動物個体同士の交配を繰り返すことによってホモ接合性の子孫動物（ヒトを除く）を得ることができる。
また、上記のヘテロ接合性又はホモ接合性の子孫動物を、任意の同種の動物と交配させて酸化ストレスインジケーターと共に更なる特徴を付与させることもできる。そのような任意の動物としては、小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含む同種の動物や低酸素ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含む同種の動物を例示することができるが、これらに限定される訳ではない。また、交配を続けた子孫動物においても本発明の酸化ストレスインジケーターの機能を示す限り、本発明にかかる子孫動物と理解される。
例えば、小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含む同種の動物と交配させる場合には、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物と小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物とを含む非ヒト動物を作製することができ、これと同様にして低酸素ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含む同種の動物と交配させる場合には、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物と低酸素ストレスインジケーター発現用核酸構築物とを含む非ヒト動物を作製することができる。
小胞体ストレスは、ＩＲＥ１ａ−ＸＢＰ１経路、ＡＴＦ６経路、ＰＥＲＫ−ＡＴＦ４経路などと関連し、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、糖尿病、高脂血症、肥満などの代謝性疾患、癌などの疾患と関連している。小胞体ストレスは、小胞体膜タンパク質ＡＴＦ６、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫなどによって感知され、例えばＩＲＥ１は、ＸＢＰ１のスプライシングを誘導するため、この反応を利用して、小胞体ストレスをインビボで検査できるシステム（ＥＲＡＩシステム）が開発されているし、さらにまた、ＡＴＦ６は切断されて活性型ＡＴＦ６タンパク質に変換され、一方、ＰＥＲＫはｅＩＦ−２αをリン酸化して機能を低下させＡＴＦ４の合成を促進するため、これらの誘導物が小胞体ストレスの分析のために利用されている（特開２００５−２０４５１６号公報；Ｙｏｓｈｉｄａ Ｈ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２００７ Ｆｅｂ；２７４（３）：６３０−５８．ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ．）。
低酸素ストレスは、細胞が正常に生育する酸素濃度に比べて低い酸素濃度の条件下に晒された際に引き起こされるストレス応答を指し、ＨＩＦ−１αが関与する経路などと関連することが知られている。
小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含む非ヒト動物は、プロモーター（及び、場合により、エンハンサーと組み合わせてもよい。）の下流にＸＢＰ１遺伝子（イントロンを含む）、その３’側に発光若しくは蛍光タンパク質又はタグタンパク質コード配列を連結して含む小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物又は該構築物を含むベクターを有する非ヒト動物である。プロモーター等の例は、限定されないが、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）やＳＶ−４０ウイルスなどのウイルス由来のプロモーター及び／又はエンハンサー、β−アクチンプロモーター、伸張因子１（ＥＦ−１）プロモーター、それらの組み合わせなどである。ＸＢＰ１遺伝子には、例えばその５’端に、Ｆｌａｇなどのタグをコードする配列を連結してもよい。
小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物の例は、ＣＭＶエンハンサー及びβ−アクチンプロモーターを含む配列の下流に、タグコード配列（タグの例：Ｆｌａｇ）、ＸＢＰ１遺伝子、発光若しくは蛍光タンパク質又はタグタンパク質コード配列を順番に含む構築物である。
ＸＢＰ１（Ｘ−Ｂｏｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）の塩基配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）などから入手可能であり、例えば登録番号の例は、ＮＭ＿０１３８４２（マウス）、ＮＭ＿００１０７９５３、（ヒト）、ＮＭ＿００５０８０（ヒト）などである。
本発明の非ヒト動物はまた、上記のような酸化ストレス関連疾患を有する非ヒト動物、例えば該疾患のモデル動物（例えばマウス）と交配させて、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物、及び場合により小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物、低酸素ストレスインジケーター発現用核酸構築物などの他のストレスインジケーター発現用核酸構築物、を含む上記疾患を有する非ヒト動物を作製することができる。
例えば酸化ストレス関連疾患を有する非ヒト動物として、ヒト型Ａβを産生し得るキメラＡＰＰ遺伝子を含むＡＤモデル非ヒト動物と交配させる場合には、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含むＡＤモデル非ヒト動物を作製することができる。他の疾患モデル非ヒト動物においても同様である。
また、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物と小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含む非ヒト動物と、ヒト型Ａβを産生し得るキメラＡＰＰ遺伝子を含むＡＤモデル非ヒト動物と交配させる場合には、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物と小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物とを含むＡＤモデル非ヒト動物を作製することができる。酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物以外の、他のストレスインジケーター発現用核酸構築物は上述した作製方法のように任意に選択すればよく、交配させる他の疾患モデル非ヒト動物においても同様である。
以上のように、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物を保持させる限りにおいて、酸化ストレスのインジケーターの特徴を有して、他の更なる特徴を含む同種の動物を任意に作製し得る。
酸化ストレス関連疾患を有する非ヒト動物は、ヒト型Ａβを産生し得るキメラＡＰＰ遺伝子を含むＡＤモデル非ヒト動物（特開２００８−００００２７号公報）、ヒト・プレセニリン２遺伝子の変異体を含むＡＤモデル非ヒト動物（特開平１１−１４６７４３号公報）、α−シヌクレイン遺伝子を含むパーキンソン病モデル非ヒト動物（再表２００５／０４１６４９号公報）、Ｐａｒｋｉｎ遺伝子の変異体を含むパーキンソン病モデル非ヒト動物（特開２００３−０１８９９２号公報）、糖尿病モデル非ヒト動物（Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９９７ ４６：８８７−８９４）、肥満症モデル非ヒト動物（Ｎａｔｕｒｅ ３７２ ４２５−４３２，１９９４）、慢性炎症モデル非ヒト動物（Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２００９ １０ １７８−８８）などを包含するが、これらに限定されない。
５．酸化ストレス測定法
本発明はさらに、本発明の上記細胞又は上記非ヒト動物において、酸化ストレスを提供した際に増大する検出可能シグナル（例えば、発光又は蛍光シグナル）の強度を測定することを含む、酸化ストレスのレベルを測定するための方法を提供する。
本発明の測定方法において、酸化ストレスを測定する際の対照として、例えば、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含まない細胞または非ヒト動物、酸化ストレスを与えていない細胞または非ヒト動物、酸化ストレスの陽性または陰性対照を与えた細胞または非ヒト動物、などを使用することができる。
細胞を使用する場合には、例えば、培養細胞の培地に酸化ストレス物質を添加し、細胞に酸化ストレスを誘導し、細胞内の発光又は蛍光強度の増大を蛍光顕微鏡及び画像化装置、或いは細胞ライセート（ｌｙｓａｔｅ）を使用したルシフェラーゼアッセイや蛍光測定法などを用いて測定することができる。また、いかにして酸化ストレス物質が細胞に対し影響を及ぼすかをリアルタイムで観察することができる。
培地としては、通常の動物細胞培地、例えばＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ハムＦ１２、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆｉｓｈｅｒ培地、ＥＳ培地、霊長類ＥＳ培地などを基本培地とし、これに、抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシンなど）、血清（例えばウシ胎児血清など）、タンパク質因子（例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフェリン、インスリン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）など）、非必須アミノ酸、メルカプトエタノールなどを適宜添加することができる。
培養は、固体培養、液体培養等のいずれでもよく、例えば３５〜４０℃の範囲の温度で、ＣＯ２ガス含有空気の雰囲気下で、必要であれば線維芽細胞などのフィーダー細胞を使用して行うことができる。
非ヒト動物を使用する場合には、動物を個体レベルで解析することができる、例えばＸｅｎｇｅｎ社のＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用することによって、酸化ストレスの存在下で、生きた動物個体で発光又は蛍光シグナルを定量的に測定することができる。この方法であれば、酸化ストレスを受けている細胞を組織的に調べることが可能である。非ヒト動物として、酸化ストレス関連の疾患を有する動物を使用する場合には、酸化ストレスと疾患との関係を視覚的に調べることができるし、一方で、抗酸化ストレス薬、すなわち該疾患の治療薬の開発のために上記動物を使用することができる。また、このとき発光シグナルを得るためには、例えば、核酸構築物にルシフェラーゼ遺伝子を有する非ヒト動物であれば、ルシフェラーゼ基質を該動物に注射するだけで、酸化ストレスに応じて発光を検出することができる。ルシフェラーゼ基質は、例えばルシフェリンであり、ルシフェリンはルシフェラーゼによって酸化されて発光物質に変換される。
非ヒト動物を使用して本発明の酸化ストレス測定方法を実施する場合、非ヒト動物を反復して試験に供することができる。すなわち、非ヒト動物を酸化ストレスに曝露し、一定の期間の間に当該動物を酸化ストレスの影響から回復させ、再度非ヒト動物を酸化ストレスに曝露するとき、この非ヒト動物を使用して酸化ストレスを測定することができる。これにより、経時的な評価が必要な事例や、長期にわたり進行する疾患等への応用が可能となる。上記期間は、例えば１日以上、好ましくは２日以上、より好ましくは３日以上、かつ、例えば１０日以下、好ましくは７日以下、より好ましくは５日以下、最も好ましくは約４日である。
６．スクリーニング法
本発明はさらに、本発明の上記細胞又は上記非ヒト動物に、候補薬剤の存在下で、ある特定の酸化ストレスを提供し、薬剤を含まない対照と比べて検出可能シグナル（例えば、発光又は蛍光シグナルなど）の強度が減少するときに該候補薬剤が酸化ストレス抑制能を有すると判定することを含む、酸化ストレス抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。
候補薬剤は、天然物、非天然物（又は合成物）、有機物質、無機物質、低分子化合物、タンパク質、糖タンパク質、リポプロテイン、ペプチド、糖類、脂質、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオシドなど、或いは公知の治療用薬剤又は生物活性物質などから選択可能である。特に公知の治療用薬剤又は生物活性物質であれば、酸化ストレス抑制効果を有することが知られていなかった物質の新しい効果としてスクリーニングされる可能性があり、酸化ストレス抑制効果をもつ物質はさらに、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患、肝疾患を始めとした各臓器の変性疾患、糖尿病、関節リウマチなどの酸化ストレス関連疾患の治療薬となりうる可能性を有している。
また、例えば本発明の非ヒト動物が、酸化ストレスインジケーター発現用核酸構築物及び小胞体ストレスインジケーター発現用核酸構築物を含む動物である場合には、酸化ストレス及び／又は小胞体ストレスを抑制する薬剤のスクリーニングのために、該動物を使用することができる。小胞体ストレスは、前述したように、神経変性疾患、糖尿病、高脂血症、肥満などの代謝性疾患、慢性炎症、癌などの疾患と関連があり、この動物を用いれば、それぞれのストレスに対するストレス抑制剤を見出すことが可能になる。このように、酸化ストレスインジケーターと共に更なる機能を獲得させた動物については、適宜その機能を利用して、酸化ストレスの状態と合わせて他の生体内の反応等を解析することが可能である。
スクリーニング法は、「５．酸化ストレス測定法」で記載した手法又は実験系により実施することができる。
すなわち、細胞であれば、培養細胞にストレスをかける前に、かけると同時に、またはかけた後に、培地に候補薬剤を添加して細胞を培養し、細胞内の、例えば発光又は蛍光シグナルなどの検出可能シグナルを測定して、対照（候補薬剤なし）と比較して該シグナルを減少させうる物質を選択する。
非ヒト動物であれば、酸化ストレスをかける前に、かけると同時に、またはかけた後に、該動物に、経口投与、静脈内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、経粘膜投与などの投与経路によって候補薬剤を投与するか、或いは食餌と一緒に摂取させ、蛍光又は発光シグナルなどの検出可能シグナルを測定し、該シグナルを減少させる薬剤を選択する。
本発明の非ヒト動物が、酸化ストレス関連疾患をもつ動物との交配によって作製された動物であれば、疾患の治療効果も同時に判定することが可能になるため、このような動物を使用することで該疾患の治療剤を容易に見出すことが可能になると考えられる。
上記の方法で選抜された薬剤は、賦形剤、溶剤又は担体と組み合わせて医薬品の形態に製剤化されうる。医薬品は、固体製剤（例えば錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤など）、液体製剤（例えば溶液剤、懸濁剤など）、エーロゾル製剤、遅延放出製剤（例えば腸溶剤、多層製剤、コーティング製剤など）、などの多様な製剤に処方されうる。製剤化においては、種々の添加剤、例えば、崩壊剤、結合剤、安定化剤、滑沢剤、乳化剤、香味剤、着色料などを製剤に適宜添加することができる。
【実施例】
【0008】
本発明をさらに以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。実施例１
＜方法＞
［プラスミドの構築］
ｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌを作製するために、ＰＣＲによって増幅されたＡＲＥ断片（マウスＧＳＴＹａプロモーター由来；ＡＣＴＡＧＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＧＡ（配列番号１４）；結合された制限部位を太字で示した。）を、ＳｐｅＩ−ＸｂａＩで消化し、自己連結して、３回リピート断片を形成し、さらにＸｂａＩ−ＳｐｅＩ部位を有するｐＴＫｂａｓａｌに挿入した。ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ部位はＴＫ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒの５’部位に位置する。ヒトＮｒｆ２（図１の１−９３，１−４３３，全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ））をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ部位を有するｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ（又は図６のｐＴＫＸ）に挿入した。ルシフェラーゼ（ＧＬ４）をコードするｃＤＮＡを、その３’末端において１×Ｆｌａｇタグを用いてＰＣＲ増幅し、ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ部位を有するｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ−ｈＮｒｆ２（１−４３３）に挿入した。得られたｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ−ｈＮｒｆ２（１−４３３）−ＧＬ４−ＦｌａｇをＯＫＤ４８−Ｌｕｃプラスミドとして使用した。同様の手法でＧＦＰバージョン、すなわちｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ−ｈＮｒｆ２（１−４３３）−Ｖｅｎｕｓ−Ｆｌａｇを作製し、ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓプラスミドとして使用した。
ヒトＮｒｆ２の過剰発現ベクター（ｐＣＡＸ−ｈＮｒｆ２）を、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩを有するｐＣＡＸにＰＣＲ増幅ヒトＮｒｆ２断片を挿入することによって構築した。また、ヒトＫｅａｐ１の過剰発現ベクター（ｐＣＡＸ−ｈＫｅａｐ１）を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位を有するｐＣＡＸにＰＣＲ増幅ヒトＫｅａｐ１断片を挿入することによって構築した。同様の手法で、末端切断型バージョンのｐＣＡＸ−ｈＫｅａｐ１（１−３１４）を構築した。
［細胞培養、トランスフェクション及び処理］
ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２含有の雰囲気下、３７℃で培養した。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法を用いて細胞内にプラスミドＤＮＡを挿入した。薬剤に対する細胞応答をテストするために、細胞を、種々の時間にわたって、１０μＭ ＡＳＮ（ｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ），１００μＭ ＤＥＭ（ｄｉｅｔｈｙｌｍａｌｅａｔｅ），２００μＭ Ｈ２Ｏ２，２．５μｇ／ｍｌ ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ，１μＭ ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ，１ｍＭ ＤＴＴ，１００μＭ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ又は１００μｇ／ｍｌ ＴＴＦＡ（ｔｈｅｎｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）で処理した。
［ルシフェラーゼアッセイ］
ＯＫＤ４８−Ｌｕｃレポーターを使用する二連のルシフェラーゼアッセイでは、ｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部対照として使用した。ＨｅＬａ細胞を２４ウエルプレートに撒き、その後、プラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間目に、ルシフェラーゼアッセイのために細胞を溶解した。各レポーター活性の測定を、ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）とルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて行った。その結果は、３回の実験の平均±ＳＥＭとして示されている。それぞれの値を、誘導倍率として示し、この倍率は、未処理（ＮＴ）の倍率（図５Ａ）、Ｎｒｆ２過剰発現のない未処理（ＮＴ）の倍率（図５Ｄ）、又はＫｅａｐ１過剰発現のない未処理（ＮＴ）の倍率（図５Ｅ）に対してそれぞれ正規化された。このとき各ＮＴの倍率を１．０とした。
［蛍光画像化及び蛍光強度測定］
細胞の画像をとるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウエルプレートに撒き、その後、プラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間目に、ＦＳＸ１００（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって蛍光画像を得た。細胞溶解液の蛍光を測定するために、細胞を、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ及び１０μＭ ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）中で、３７℃、３０分間、溶解した。１６，５００ｇの遠心分離によって溶解液を透明にした。蛍光光度計（ＡＲＶＯ ＭＸ−２，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて上清の蛍光を測定した（発光波長５３５ｎｍ；励起波長４８５ｎｍ）。ｐＣＡＧ−ＧＬ３を内部対照として使用した。各サンプルの蛍光強度は、同時トランスフェクションされたルシフェラーゼ活性に対して正規化された。値は、３回の実験の平均±ＳＥＭとして示された。
［ウエスタンブロット分析］
細胞を、ＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２％ ＳＤＳ，５０ｍＭ ＤＴＴ，１０％グリセロール及び１μｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）中で溶解した。溶解液を、９８℃で、１０分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて溶解液中のタンパク質を分離した。電気泳動後、タンパク質をフッ化ポリビニリデン多孔質メンブレンに電気的に転写し、標準的手法で、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに対するモノクローナル抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ），ＧＦＰに対するモノクローナル抗体（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ），ＧＡＰＤＨに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），又はＮｒｆ２に対するポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて免疫学的に検出した。
［トランスジェニックマウス］
ｐ（３ｘＡＲＥ）ＴＫｂａｓａｌ−ｈＮｒｆ２（１−４３３）−ＧＬ４−Ｆｌａｇの４．５−ｋｂ ＳｐｅＩ−ＳｆｉＩ断片を、トランスジーンとして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス受精卵のなかにマイクロインジェクションし、トランスジェニック子孫を、５’−ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＡＧＴ ＧＧ−３’（配列番号１５）及び５’−ＡＣＴ ＣＧＧ ＣＧＴ ＡＧＧ ＴＡＡ ＴＧＴ ＣＣ−３’（配列番号１６）のプライマーを用いるＰＣＲによって選抜した。得られたマウスをｉｎ ｖｉｖｏでの画像化アッセイのために使用した。Ｄ−ルシフェリン（４．５ｍｇ）を腹腔内注射したのち、マウスを、標準的プロトコールに従って、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化システムＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて分析した。動物を含む実験プロトコールは、ＲＩＫＥＮ（日本）の動物研究委員会によって承認された。
＜結果＞
［新規の酸化ストレスインジケーター（ＯＫＤ４８）の設計と構築］
今回、本発明者らは、新しいタイプの酸化ストレスインジケーターであるＯＫＤ４８の作製に、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２経路を利用した。ストレス依存的な安定化に関連するＮｒｆ２の部分断片をルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子と融合させ、ストレス誘導性のプロモーターから発現させた。図３に示すように、通常時、内在性のＮｒｆ２は核内に存在しないので、レポーターの転写レベルの発現は誘導されず、また、漏出してくるレポータータンパク質もＫｅａｐ１による分解抑制を受けシグナルは検出されない。しかし、酸化ストレス時には、内在性Ｎｒｆ２量の増加と核内への移行に伴いレポーター遺伝子の転写が誘導され、さらに、Ｋｅａｐ１による分解抑制も解除されるので、レポータータンパク質の発現が増強され、シグナルが検出される。
図６にその一例を示すように、用いるＮｒｆ２の部分断片と、プロモーターの組み合わせについて、いくつかのバリエーションを作製し、最も良い応答性を示すものを探索した。Ｎｒｆ２断片に関しては、アミノ酸（ａ．ａ．）１〜９３、１〜４３３、または全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）について調べた。プロモーターについては、陰性対照として用いたＨＳＶ−ＴＫプロモーターの他、ＨＯ−１エンハンサー、３×ＡＲＥプロモーターを検討した。その結果、Ｎｒｆ２のａ．ａ．１〜４３３領域と３×ＡＲＥプロモーターの組み合わせが、酸化ストレス誘導剤であるＡＳＮやＤＥＭに対して最も良い応答性を示した。
［Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＫＤ４８の特性決定］
このように構築したＯＫＤ４８（ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ ｊｏｉｎｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）−Ｌｕｃが、実際の哺乳動物細胞で酸化ストレスインジケーターとして機能するかテストするために、融合遺伝子の発現ベクターを培養細胞に導入し、アッセイを行った（図５）。ＨｅＬａ細胞を用いて、各種薬剤に対する応答性をルシフェラーゼアッセイで評価したところ、ＯＫＤ４８−Ｌｕｃは、ＡＳＮ（亜ヒ酸ナトリウム）やＤＥＭ（マレイン酸ジエチル）など酸化ストレス誘導剤に対して特異的に応答し、Ｔｕｎ（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）やＴｇ（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）などの小胞体ストレス誘導剤、還元剤であるＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤でアポトーシスを誘導するＥｔｐ（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ｃｈｅｍｉｃａｌ ｈｙｐｏｘｉａ誘導剤のＴＴＦＡ（ｔｈｅｎｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）では、ほとんど活性化されなかった（図５Ａ）。このレポーターアッセイの結果と一致して、Ｌｕｃ抗体を用いたウエスタンブロットによっても、ＯＫＤ４８−ＬｕｃのＡＳＮやＤＥＭに特異的なタンパク質レベルでの上昇が確認できた（図５Ｂ）。図５Ｃに示すように、これらの薬剤の中で内在性Ｎｒｆ２を顕著に誘導するのは、ＡＳＮとＤＥＭのみであった。これらの結果は、作製したレポーターの特異性が内在性Ｎｒｆ２と一致することを示しており、ＯＫＤ４８−Ｌｕｃの酸化ストレスインジケーターとしての有用性を意味する。
次に本発明者らは、ＯＫＤ４８−Ｌｕｃに対する関連因子の過剰発現の影響を調べた。図５Ｄに示すように、Ｎｒｆ２の過剰発現により、通常条件（ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）においてもＯＫＤ４８−Ｌｕｃの活性は１００倍以上上昇し、さらにその活性はＡＳＮ処理によって若干上昇した。一方、Ｋｅａｐ１の過剰発現によって、ストレスの有無にかかわらずＯＫＤ４８−Ｌｕｃの活性は低下し、Ｎｒｆ２との結合領域を欠くＫｅａｐ１（１−３１４）の過剰発現では逆にＯＫＤ４８−Ｌｕｃの活性が上昇した（図５Ｅ）。これらの結果は、ＯＫＤ４８−ＬｕｃがＮｒｆ２により誘導され、Ｋｅａｐ１による分解／安定化の制御を受けるという想定した実施モデルを支持する。
このようなルシフェラーゼを融合したレポーターに加えて、ＧＦＰを融合したレポーター（ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ）も作製し、培養細胞でのチェックを行った（図７）。Ｌｕｃ型のレポーターと一致して、顕微鏡観察においてＯＫＤ４８−ＶｅｎｕｓはＡＳＮやＤＥＭ処理に伴って蛍光を発した（図７Ａ）。また、同様の結果が細胞溶解液（Ｌｙｓａｔｅ）を用いた蛍光測定（図７Ｂ）やＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット（図７Ｃ）によっても確認された。
［ＯＫＤ４８マウスの作製及びｉｎ ｖｉｖｏでの酸化ストレスのモニタリング］
Ｉｎ ｖｉｖｏで酸化ストレスをモニターするために、３×ＡＲＥ機動のＮｒｆ２（１−４３３）−Ｌｕｃ発現遺伝子を有するＯＫＤ４８−トランスジェニックマウスを作製した。ｉｎ ｖｉｖｏで酸化ストレス下の細胞を効果的に用いることが可能であることを確認するために、種々の組織や器官で酸化ストレスを誘導するＡＳＮをトランスジェニックマウスに腹腔内注射し（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、６時間後、開腹下で発光シグナルを観察した。ＡＳＮが注射されたトランスジェニックマウスは、肝臓で強い発光を示した（図８）。他の組織や器官でもいくらか発光が検出された（例えば、胃，及び腎臓；データを示さず）。これに対して、ＰＢＳを注射された対照トランスジェニックマウスは、ほとんど発光を示さなかった。この結果は、作製したトランスジェニックマウスが、動物個体での酸化ストレスの検出に利用可能であることを示す。
実施例２
［マウスＯＫＤ４８の作製とその特性］
実施例１と同様の手法で作製したマウスＯＫＤ４８−Ｌｕｃ（３ｘＡＲＥ＋ＴＫ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｍｏｕｓｅ Ｎｒｆ２（１−４２６）＋Ｌｕｃ）を導入したＨｅＬａ細胞を、酸化ストレス物質（ＤＥＭ又はＡＳＮ）で処理し、発光強度をルシフェラーゼアッセイ法で測定した。その結果、ｍｏｕｓｅ Ｎｒｆ２（１−４２６）−Ｌｕｃが、ＤＥＭ及びＡＳＮの両方で、ｍｏｕｓｅ Ｎｒｆ２（１−９３）及びｍｏｕｓｅ Ｎｒｆ２（ｆｕｌｌ）と比べて最も高いＳ／Ｎ比を示した（図９）。
【産業上の利用可能性】
【0009】
本発明のインジケーターは、細胞又は動物においてＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１経路に関連した酸化ストレスを特異的に検出可能にするため、酸化ストレスを受けている細胞や組織を生体レベル（ｉｎ ｖｉｖｏ）で視覚的に捕らえることができるし、或いは、前記インジケーターを発現可能な非ヒト動物を用いることによって、種々の酸化ストレス関連疾患の病理研究や治療用薬剤の開発に寄与する。【配列表フリーテキスト】
【0010】
配列番号３：ＨＳＶ−ＴＫ基本（ｂａｓａｌ）プロモーター配列番号７：マウスＨＯ−１エンハンサー−ＴＫ基本（ｂａｓａｌ）プロモーター
配列番号１０：３×ＡＲＥ
配列番号１１：３ｘＡＲＥ−ＴＫ基本（ｂａｓａｌ）プロモーター
配列番号１２：３ｘＡＲＥ−ＴＫｂａｓａｌ−ＯＫＤ４８−Ｌｕｃ
配列番号１３：３ｘＡＲＥ−ＴＫｂａｓａｌ−ＯＫＤ４８−Ｖｅｎｕｓ
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］