特許 5989098 アセチル−補酵素Ａ誘導化合物の産生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5989098

(24)【登録日】2016年8月19日

(45)【発行日】2016年9月7日

(54)【発明の名称】アセチル−補酵素Ａ誘導化合物の産生

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/62 20060101AFI20160825BHJP

   C12P 23/00 20060101ALI20160825BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160825BHJP

   C12N 1/00 20060101ALN20160825BHJP

   C12N 1/14 20060101ALN20160825BHJP

   C12N 1/16 20060101ALN20160825BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20160825BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20160825BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/62

   C12P23/00

   !C12N15/00 A

   !C12N1/00 G

   !C12N1/14 C

   !C12N1/16 F

   !C12N1/20 A

   !C12N1/19

【請求項の数】48

【全頁数】52

(21)【出願番号】特願2014-510442(P2014-510442)

(86)(22)【出願日】2012年5月9日

(65)【公表番号】特表2014-513542(P2014-513542A)

(43)【公表日】2014年6月5日

(86)【国際出願番号】US2012037127

(87)【国際公開番号】WO2012154854

(87)【国際公開日】20121115

【審査請求日】2015年2月19日

(31)【優先権主張番号】61/483,896

(32)【優先日】2011年5月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511289736

【氏名又は名称】アミリス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(72)【発明者】

【氏名】メドウズ，アダム

【審査官】 森井 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００４７８８５（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ７／６２

Ｃ１２Ｐ ２３／００

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １／１４

Ｃ１２Ｎ １／１６

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

宿主細胞中で異種アセチル−ＣｏＡ誘導（ＨＡＣＤ）化合物を産生する方法であって、
（ａ）ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞の集団を、炭素源及び、０．２ｍｇ／Ｌよりも低い、制限量のパントテネートを含む培養基中で培養することであって、ここで、前記制限量のパントテネートが、非制限量のパントテネートの場合と比較して前記宿主細胞による前記ＨＡＣＤ化合物の産生を制限することと、その後に、
（ｂ）前記集団又はそのサブ集団を、炭素源及び非制限量のパントテネートを含む培養基中で培養することであって、ここで、前記非制限量のパントテネートが、前記制限量のパントテネートを超える量であり、前記集団又はそのサブ集団が、前記非制限量のパントテネートの存在下でより大量の前記ＨＡＣＤ化合物を産生することと、を含む方法。

【請求項2】

前記制限量のパントテネートがパントテネート滴定を実施することによって決定され、ここで、前記宿主細胞が増大する濃度のパントテネートを含む増殖培地中で培養され、ＨＡＣＤ化合物産生が各濃度のパントテネートで決定され、ここで、パントテネート滴定が、前記ＨＡＣＤ化合物産生がその最大にある場合の飽和量のパントテネートを含み、前記制限量のパントテネートが、ＨＡＣＤ化合物産生がその最大未満である場合の任意の濃度のパントテネートである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ａ）中の前記ＨＡＣＤ化合物の産生が、前記遺伝的に修飾された宿主細胞の前記最大ＨＡＣＤ化合物産生の５０、４０、３０、２０又は１０％未満である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ（ｂ）中の前記ＨＡＣＤ化合物の産生が、前記遺伝的に修飾された宿主細胞の前記最大ＨＡＣＤ化合物産生の５０、６０、７０、８０又は９０％を超える、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（ａ）の前記培養が、少なくとも１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間又は９６時間を超える期間にわたる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ステップ（ａ）の前記培養が、前記集団が０．０１と４００との間の細胞密度（ＯＤ_６００）に到達するために十分な期間にわたる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ステップ（ｂ）の前記培養が、３〜２０日間の期間にわたる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記制限量のパントテネートが、０ｍｇ／Ｌである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記非制限量のパントテネートが、０．２ｍｇ／Ｌよりも高い、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記非制限量のパントテネートが、少なくとも、ＨＡＣＤ化合物産生がその最大である場合の最小のパントテネート濃度である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記非制限量のパントテネートが、少なくとも１ｍｇ／Ｌである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記非制限量のパントテネートが、１０ｍｇ／Ｌである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ステップ（ｂ）が、培養基が非制限量のパントテネートを含むまで、パントテネートを前記制限量のパントテネートを含む培養基に加えることを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前記集団を非制限量のパントテネートを含む新しい培養基に移すことを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記方法が、制限量のパントテネート中で前記細胞を培養することを含まない方法から得られる産生と比較して、前記遺伝的に修飾された宿主細胞の集団による前記ＨＡＣＤ化合物の増加した産生をもたらす、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＨＡＣＤ化合物の産生が、収率（炭素基質１グラム当たりの産生されたＨＡＣＤのグラム数）又は生産性（１時間毎の培養基１リットル当たりの産生されたＨＡＣＤ化合物のグラム数）に関して測定される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ＨＡＣＤ化合物を回収することを更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記パントテネートが、２−デヒドロパントエート、（Ｒ）−パントエート、（Ｒ）−パントテネート、及びこれらの任意の塩又はエステルからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、及び動物細胞からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ＨＡＣＤ化合物が、アミノ酸、脂肪酸、イソプレノイド、及びポリケチドからなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記宿主細胞が、イソプレノイドを産生することが可能であり、イソプレノイド経路酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸を含み、前記イソプレノイド経路酵素が、
ａ）アセチル−補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素と、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの別の分子を縮合して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する酵素と、
ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転換する酵素と、
ｄ）メバロネートをメバロネート５−リン酸に転換する酵素と、
ｅ）メバロネート５−リン酸をメバロネート５−ピロリン酸に転換する酵素と、
ｆ）メバロネート５−ピロリン酸をＩＰＰに転換する酵素と、
ｇ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰに転換する酵素と、
ｈ）ＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５個を超える炭素を含有するポリプレニル化合物を形成するポリプレニルシンターゼと、
ｉ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合して、ＧＰＰを形成する酵素と、
ｊ）ＩＰＰの２つの分子を、ＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合する酵素と、
ｋ）ＩＰＰをＧＰＰと縮合してＦＰＰを形成する酵素と、
ｌ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合してＧＧＰＰを形成する酵素と、
ｍ）ＩＰＰ及びＦＰＰを縮合して、ＧＧＰＰを形成する酵素と、からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記宿主細胞が、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、サビネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョリオールシンターゼ、ヌートカトンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、ポリプレニルを修飾する酵素をコードする異種核酸を更に含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記宿主細胞が、ポリケチドを産生することが可能であり、ポリケチド合成酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸を含み、ここで、前記ポリケチド合成酵素が、
ａ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つをアシルキャリアタンパク質と縮合する酵素と、
ｂ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第１の反応体を、マロニル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第２の反応体と縮合して、ポリケチド産物を形成する酵素と、
ｃ）ポリケチド化合物上のβ−ケト化学基をβ−ヒドロキシ基に還元する酵素と、
ｄ）ポリケチド化合物中のアルカン化学基を脱水して、α−β−不飽和アルケンを産生する酵素と、
ｅ）ポリケチド化合物中のα−β−二重結合を飽和アルカンに還元する酵素と、
ｆ）ポリケチド化合物をアシルキャリアタンパク質から加水分解する酵素と、からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ポリケチドが、抗生剤活性、抗真菌活性、及び抗腫瘍活性の少なくとも１つを有する脂質である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ポリケチドが、マクロライド、抗生剤、抗真菌剤、細胞増殖抑制化合物、抗コレステロール血症化合物、抗寄生虫化合物、抗コクシジウム化合物、動物成長促進剤及び殺虫剤からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記宿主細胞が、脂肪酸を産生することが可能であり、脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸を含み、ここで、前記脂肪酸合成酵素が、
ａ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つをアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）に共有結合させる酵素と、
ｂ）アセチル−ＡＣＰ及びマロニル−ＡＣＰを縮合してアセトアセチル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｃ）アセトアセチル−ＡＣＰ中の二重結合をＮＡＤＰＨで還元して、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰ中にヒドロキシル基を形成する酵素と、
ｄ）Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰを脱水して、β−炭素及びγ−炭素の間に二重結合を形成してクロトニル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｅ）クロトニルＡＣＰをＮＡＤＰＨで還元してブチリル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｆ）Ｃ１６アシル化合物をアシルキャリアタンパク質から加水分解して、パルミテートを形成する酵素と、からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記脂肪酸が、パルミテート、パルミトイルＣｏＡ、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

宿主細胞中で異種アセチル−ＣｏＡ誘導（ＨＡＣＤ）化合物を産生する方法であって、
（ａ）炭素源を含有し、かつパントテネート補充を欠く培養基中でＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞の集団を培養することと、その後に、
（ｂ）前記集団又はそのサブ集団を、炭素源を含み少なくとも１ｍｇ／Ｌのパントテネートを補充された培養基中で培養することと、を含む方法。

【請求項30】

ステップ（ａ）の前記培養が、少なくとも１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間又は９６時間を超える期間にわたる、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

ステップ（ａ）の前記培養が、前記集団が０．０１と４００との間の細胞密度（ＯＤ_６００）に到達するために十分な期間にわたる、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

ステップ（ｂ）の前記培養が、３〜２０日間の期間にわたる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

ステップ（ｂ）が、前記培養基が少なくとも１ｍｇ／Ｌのパントテネートを含むまで、パントテネートをステップ（ａ）の前記培養基に加えることを含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前記集団を少なくとも１ｍｇ／Ｌのパントテネートを含む新しい培養基に移すことを含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記方法が、制限量のパントテネート中で前記細胞を培養することを含まない方法から得られる産生と比較して、前記遺伝的に修飾された宿主細胞の集団による前記ＨＡＣＤ化合物の増加した産生をもたらす、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ＨＡＣＤ化合物の産生が、収率（炭素基質１グラム当たりの産生されたＨＡＣＤのグラム数）又は生産性（１時間毎の培養基１リットル当たりの産生されたＨＡＣＤ化合物のグラム数）に関して測定される、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＨＡＣＤ化合物を回収することを更に含む、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記パントテネートが、２−デヒドロパントエート、（Ｒ）−パントエート、（Ｒ）−パントテネート、及びこれらの任意の塩又はエステルからなる群から選択される、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、及び動物細胞からなる群から選択される、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＨＡＣＤ化合物が、アミノ酸、脂肪酸、イソプレノイド、及びポリケチドからなる群から選択される、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記宿主細胞が、イソプレノイドを産生することが可能であり、イソプレノイド経路酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸を含み、前記イソプレノイド経路酵素が、
ｎ）アセチル−補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素と、
ｏ）アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの別の分子を縮合して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する酵素と、
ｐ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転換する酵素と、
ｑ）メバロネートをメバロネート５−リン酸に転換する酵素と、
ｒ）メバロネート５−リン酸をメバロネート５−ピロリン酸に転換する酵素と、
ｓ）メバロネート５−ピロリン酸をＩＰＰに転換する酵素
ｔ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰに転換する酵素と、
ｕ）ＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５個を超える炭素を含有するポリプレニル化合物を形成するポリプレニルシンターゼと、
ｖ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合して、ＧＰＰを形成する酵素と、
ｗ）ＩＰＰの２つの分子を、ＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合する酵素と、
ｘ）ＩＰＰをＧＰＰと縮合してＦＰＰを形成する酵素と、
ｙ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合してＧＧＰＰを形成する酵素と、
ｚ）ＩＰＰ及びＦＰＰを縮合して、ＧＧＰＰを形成する酵素と、からなる群から選択される、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記宿主細胞が、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、サビネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョリオールシンターゼ、ヌートカトンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、ポリプレニルを修飾する酵素をコードする異種核酸を更に含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記宿主細胞が、ポリケチドを産生することが可能であり、ポリケチド合成酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸を含み、ここで、前記ポリケチド合成酵素が、
ｇ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つをアシルキャリアタンパク質と縮合する酵素と、
ｈ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第１の反応体を、マロニル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第２の反応体と縮合して、ポリケチド産物を形成する酵素と、
ｉ）ポリケチド化合物上のβ−ケト化学基をβ−ヒドロキシ基に還元する酵素と、
ｊ）ポリケチド化合物中のアルカン化学基を脱水して、α−β−不飽和アルケンを産生する酵素と、
ｋ）ポリケチド化合物中のα−β−二重結合を飽和アルカンに還元する酵素と、
ｌ）ポリケチド化合物をアシルキャリアタンパク質から加水分解する酵素と、からなる群から選択される、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記ポリケチドが、抗生剤活性、抗真菌活性、及び抗腫瘍活性の少なくとも１つを有する脂質である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ポリケチドが、マクロライド、抗生剤、抗真菌剤、細胞増殖抑制化合物、抗コレステロール血症化合物、抗寄生虫化合物、抗コクシジウム化合物、動物成長促進剤及び殺虫剤からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記宿主細胞が、脂肪酸を産生することが可能であり、脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸を含み、ここで、前記脂肪酸合成酵素が、
ｇ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つをアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）に共有結合させる酵素と、
ｈ）アセチル−ＡＣＰ及びマロニル−ＡＣＰを縮合してアセトアセチル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｉ）アセトアセチル−ＡＣＰ中の二重結合をＮＡＤＰＨで還元して、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰ中にヒドロキシル基を形成する酵素と、
ｊ）Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰを脱水して、β−炭素及びγ−炭素の間に二重結合を形成してクロトニル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｋ）クロトニルＡＣＰをＮＡＤＰＨで還元してブチリル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｌ）Ｃ１６アシル化合物をアシルキャリアタンパク質から加水分解して、パルミテートを形成する酵素と、からなる群から選択される、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記脂肪酸が、パルミテート、パルミトイルＣｏＡ、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１１年５月９日出願の米国仮特許出願第６１／４８３，８９６号に対する優先権を主張し、同出願は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、遺伝的に修飾された宿主細胞による異種アセチル−ＣｏＡ誘導化合物の産生を調整するための非遺伝的スイッチとしてのパントテネート（ビタミンＢ５としても知られる）の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

合成生物学の出現は、工業規模及び品質における再生可能資源からの生物燃料、化学薬品及び生体材料の発酵微生物産生の有望性をもたらした。例えば、抗マラリア薬アルテミシニンに対する前駆体（例えば、Ｍａｒｔｉｎら著、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：７９６−８０２（２００３）を参照）；脂肪酸誘導燃料及び化学薬品（例えば、脂肪エステル、脂肪アルコール及びワックス；例えば、Ｓｔｅｅｎら著、Ｎａｔｕｒｅ ４６３：５５９−５６２（２０１０）を参照）；コレステロール降下剤を生成するポリケチドシンターゼ（Ｍａら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：５８９−６９２（２００９）参照）；及びポリケチド（Ｋｏｄｕｍａｌ著、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１５５７３−１５５７８（２００４）参照）の産生のために、機能的非天然の生物学的経路の構築に成功した。しかしながら、合成生物学の商業的成功は、再生可能製品の生産コストが、それらのそれぞれの再生不可能な対応部位の生産コストと競合してなされ得るか、又はそれを上回ってなされ得るかに大きく依存する。

【0004】

菌株の安定性は、これが、連続的発酵が生産的に実行され得る時間の長さに影響を及ぼすために、工業用発酵のコストの主要要因であり得る。菌株安定性は、一般的には、長時間の培養時間にわたる非異化発酵産物の好ましい生産特性（すなわち、高収率（時間当たりの化合物のグラム数）及び生産性（時間毎の発酵ブロス１リットル当たりのグラム数）を維持するための微生物の能力を指す。特に、経時的な産物の産生に関連する遺伝子の予定された対立遺伝子頻度の変更をほぼ有さない微生物集団を産生するための傾向である遺伝的安定性は、産物の持続的出力において中心的役割を果たす。

【0005】

バイオマス以外の産物（この産物は、定義によれば、より多くの細胞の産生において別の方法で使用され得る代謝エネルギー及び炭素を消費する）の非異化発酵については、不安定性の基準は、二重、すなわち、進化的突然変異及び選択である。第１に、産生欠損突然変異は、自発的かつランダムに起こる。第２に、減少した産生物収率を伴う細胞の増殖速度又は「適合」効果は、低産生株による最終的細胞集団の一掃に導き、これによって、全体の培養性能が低下する。この現象は、「菌株退化」と呼ばれ得る。

【0006】

ブラジルの燃料エタノール発酵は、長期間にわたる糖からのエタノールの極めて高い収率、すなわち最大理論収率の約９０％を達成する。これは、一部にはエタノールの産生が異化作用、すなわち、これが産生された糖の２つのＡＴＰを生じ、酸素の関与なしで酸化還元バランスが保たれていることに起因する。エタノールを産生しないよう突然変異する細胞は、発酵槽の低酸素条件下では適合し難く、細胞集団を一掃することはないであろう。このことは、工業的エタノール発酵が季節全体にわたって大多数の酵母バイオマスを再利用することを可能にし、これによって、糖の酵母細胞バイオマスへの転換を最小限に留め、ほぼ全ての糖をエタノール産生に向ける。このバイオマスの長期にわたる増殖及び再利用が、エタノール産生の効率を増加させ、各サイクル中にほとんどの糖がバイオマスに移動しないために操作費用が減少し、並びにより少なく小型の発酵槽が、接種のためにバイオマスを構築するのに必要とされるにすぎないために、資本投資も低減される。

【0007】

対照的に、多くのアセチル−ＣｏＡ誘導炭化水素（例えば、イソプレノイド、脂肪酸、及びポリケチド）の産生は一般的には、本質的に非異化作用であり、すなわち、これらは系の酸化還元のバランスを保つことを補助するよう供給される多量の酸素を頻繁に伴い、ＡＴＰ、ＮＡＤＰＨ、及び炭素の正味投入量を通常必要とする。かかる環境は、より低い産物、より良い遺伝子型を産生するより高いバイオマスへと向かう進展をもたらし、より高速の菌株退化に導く。

【0008】

非異化作用産物を産生することの負の選択的重圧を低減させる１つの方法は、発酵槽の生産性を最大にするために、バイオマスが生み出されねばならない発酵の段階中などの産物が不必要な期間中の産物の形成をスイッチオフ状態にすることである。遺伝的スイッチは、これを実際に達成する一般的な方法であるが、例えば、外因性誘導物質のコスト、このスイッチを転写及び翻訳する上での遅延、並びに遺伝的スイッチそれ自体で突然変異が生じる場合、低産生株の供給源にもなり得ることに起因する欠点を有する場合がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、当該技術分野において、発酵中にアセチル−ＣｏＡ誘導化合物の産生のタイミングを制御することができる代謝スイッチへの要求が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本明細書において、遺伝的に修飾された宿主細胞から異種アセチル−ＣｏＡ誘導化合物（「ＨＡＣＤ化合物」）を産生するための発酵プロセスが提供される。いくつかの実施形態では、このプロセスは、その間に細胞バイオマスが蓄積されると同時に、ＨＡＣＤ化合物産生が実質的に低減される構築ステージ（「オフ」ステージ）と、その間ＨＡＣＤ化合物産生が起動される産生段階との２つの段階を含む。したがって、ＨＡＣＤ化合物の産生が必要とされない発酵のステージ中に、ＨＡＣＤ化合物産生に関連する負の選択的重圧が軽減される。理論に束縛されるものではないが、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物産生の低減又は排除は、産生ステージ中の菌株の改善された安定性をもたらし、このことがより長期の持続的ＨＡＣＤ化合物産生をもたらし、これによって、全体の収率及び／又は菌株の生産性が増加すると考えられる。発酵培養におけるＨＡＣＤ化合物産生の「オフ」及び「オン」状態は、培養基中のアセチル−ＣｏＡに対する前駆体であるパントテネートの量によって制御される。

【0011】

アセチル−ＣｏＡは、アミノ酸、脂肪酸、イソプレニド、及びポリケチドを含む多くの重要な生体分子のための構築ブロックとして使用されるアセテートの活性化形態である。補因子である補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡのＣｏＡ部分）は、３つの前駆体から生合成される（図１Ｂ）。これら前駆体の２つ、すなわちＬ−システイン及びアデノシン−５’−三リン酸は、殆どの生体系によって効率的に合成され得るので、これらは制限的ではない。これとは対照的に、第３番目の前駆体であるパントテネートは制限的であり、殆どの生体で不十分な量で産生されるに過ぎない。結果的に、大部分の生体系は、最適な成長、健康及び生存能力のために、パントテネート化合物の外部の供給源（例えば、培養基又は食物源における）を必要とする。しかしながら、本明細書で提供された方法は、アセチル−ＣｏＡ誘導化合物を産生するよう操作された細胞を培養する場合、パントテネートが制限された量で使用され得るか又は完全に省略され得るという予期せぬ発見に一部は基づく。これら細胞は、増殖及び生存能力を維持することができ、場合によっては制限的パントテネート濃度下での改善された増殖を実証することができる。好都合なことに、これら同一の条件は、ＨＡＣＤ化合物の産生における減少をもたらす。したがって、本明細書で提供される方法は、異種アセチル−ＣｏＡ誘導化合物の産生のために、改善された発酵プロセスの「オフ」及び「オン」ステージをもたらすための非遺伝的スイッチとしてパントテネートを利用する。

【0012】

したがって、一態様では、本明細書において、宿主細胞中で異種アセチル−ＣｏＡ誘導（ＨＡＣＤ）化合物を産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）炭素源及び制限量のパントテネートを含む培養基中でＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞の集団を培養すること（制限量のパントテネートは、宿主細胞によるＨＡＣＤ化合物の産生を制限する）と、その後に、
（ｂ）前述の集団又はそのサブ集団を炭素源及び非制限量のパントテネートを含む培養基中で培養すること（非制限量のパントテネートは、制限量のパントテネートを超える量であり、前述の集団又はそのサブ集団は、非制限量のパントテネートの存在下でより多くの量のＨＡＣＤ化合物を産生する）と、を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、パントテネートの制限量は、パントテネート滴定を実施することによって決定され、宿主細胞は、増大する濃度のパントテネートを含む増殖培地中で培養され、並びにＨＡＣＤ化合物産生は、パントテネートの各濃度で決定され、パントテネート滴定は、ＨＡＣＤ化合物産生がその最大である場合のパントテネートの飽和量を含み、制限量のパントテネートは、ＨＡＣＤ化合物の産生がその最大未満である場合の任意濃度のパントテネートである。

【0014】

いくつかの実施形態では、「構築」ステージ（ステップ（ａ））中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に改変された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の５０、４０、３０、２０又は１０％未満である。いくつかの実施形態では、「産生」ステージ（ステップ（ｂ））中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の５０、６０、７０、８０又は９０％を超える。

【0015】

いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の培養することは、前述の集団が０．０１と４００との間の細胞密度（ＯＤ_６００）に到達するのに十分な一定の時間にわたる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の培養することは、３〜２０日の期間にわたる。いくつかの実施形態では、制限量のパントテネートは、０．２ｍｇ／Ｌよりも低い。いくつかの実施形態では、制限量のパントテネートとは、０ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．２ｍｇ／Ｌよりも高い。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートとは、ＨＡＣＤ化合物産生がその最大である場合での少なくとも最小のパントテネート濃度である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートとは、１０ｍｇ／Ｌである。

【0016】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、培養基が非制限量のパントテネートを含むまで、制限量のパントテネートを含む培養基にパントテネートを添加することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の集団を、非制限量のパントテネートを含む新しい培養基に移すことを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では本明細書に提供される方法は、制限量のパントテネート中で細胞を培養することを含まない方法から得られる産生と比較して、遺伝的に修飾された宿主細胞の集団によるＨＡＣＤの増加した産生をもたらす。いくつかの実施形態ではＨＡＣＤ化合物の産生は、収率（炭素基質のグラム数当たりのＨＡＣＤ化合物のグラム数）又は生産性（１時間毎の培養基１リットル当たりの産生されたＨＡＣＤ化合物のグラム数）に関して測定される。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＡＣＤ化合物を回収することを更に含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、パントテネートは、２−デヒドロパントエート、（Ｒ）−パントエート、（Ｒ）−パントテネート、及びこれらの任意の塩又はエステルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、及び動物細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、アミノ酸、脂肪酸、イソプレノイド、及びポリケチドからなる群から選択される。

【0019】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、イソプレノイドを産生することが可能であり、かつイソプレノイド経路酵素をコード化する少なくとも１つの異種核酸を含み、このイソプレノイド経路酵素は、
ａ）アセチル−補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素と、
ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡの別の分子と縮合して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する酵素と、
ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転換する酵素と、
ｄ）メバロネートをメバロネート５−リン酸に転換する酵素と、
ｅ）メバロネート５−リン酸をメバロネート５−ピロリン酸に転換する酵素と、
ｆ）メバロネート５−ピロリン酸をＩＰＰに転換する酵素と、
ｇ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰに転換する酵素と、
ｈ）ＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰ分子を縮合して５個を超える炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼと、
ｉ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合してＧＰＰを形成する酵素と、
ｊ）ＩＰＰの２つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合する酵素と、
ｋ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合してＦＰＰを形成する酵素と、
ｌ）ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを縮合してＧＧＰＰを形成する酵素と、
ｍ）ＩＰＰとＦＰＰを縮合してＧＧＰＰを形成する酵素と、からなる群から選択される。

【0020】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、サビネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョリオールシンターゼ、ヌートカトンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、ポリプレニルを修飾する酵素をコード化する少なくとも１つの異種核酸を更に含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、宿主細胞はポリケチドを産生することが可能であり、かつポリケチドシンターゼ酵素をコード化する少なくとも１つの異種核酸を含み、このポリケチドシンターゼは、
ａ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つをアシルキャリアタンパク質と縮合する酵素と、
ｂ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第１の反応体を、マロニル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第２の反応体と縮合して、ポリケチド産物を形成する酵素と、
ｃ）ポリケチド化合物上のβ−ケト化学基をβ−ヒドロキシ基に還元する酵素と、
ｄ）ポリケチド化合物中のアルカン化学基を脱水して、α−β−不飽和アルケンを産生する酵素と、
ｅ）ポリケチド化合物中のα−β−二重結合を飽和アルカンに還元する酵素と、
ｆ）ポリケチド化合物をアシルキャリアタンパク質から加水分解する酵素と、からなる群から選択される。

【0022】

いくつかの実施形態では、ポリケチドは、抗生剤、抗真菌剤、抗腫瘍剤活性の少なくとも１つを有する脂質である。いくつかの実施形態では、ポリケチドは、マクロライド、抗生剤、抗真菌剤、細胞増殖抑制化合物、抗コレステロール血症化合物、抗寄生虫化合物、抗コクシジウム化合物、動物成長促進剤及び殺虫剤からなる群から選択される。

【0023】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は脂肪酸を産生することが可能であり、かつ脂肪酸シンターゼ酵素をコード化する少なくとも１つの異種核酸を含み、この脂肪酸シンターゼ酵素は、
ａ）アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つをアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）に共有結合させる酵素と、
ｂ）アセチル−ＡＣＰ及びマロニル−ＡＣＰを縮合してアセトアセチル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｃ）アセトアセチル−ＡＣＰ中の二重結合をＮＡＤＰＨで還元して、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰ中にヒドロキシル基を形成する酵素と、
ｄ）Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰを脱水して、β−炭素及びγ−炭素の間に二重結合を形成してクロトニル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｅ）クロトニルＡＣＰをＮＡＤＰＨで還元してブチリル−ＡＣＰを形成する酵素と、
ｆ）Ｃ１６アシル化合物をアシルキャリアタンパク質から加水分解して、パルミテートを形成する酵素と、からなる群から選択される。

【0024】

いくつかの実施形態では、脂肪酸は、パルミテート、パルミトイルＣｏＡ、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。

【0025】

別の態様では、本明細書において、宿主細胞中で異種アセチル−ＣｏＡ誘導（ＨＡＣＤ）化合物を産生する方法が提供され、この方法は、
（ａ）炭素源を含有し、かつパントテネート補充を欠如する培養基中でＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞の集団を培養することと、その後に、
（ｂ）前述の集団又はそのサブ集団を、炭素源を含みかつ少なくとも１ｍｇ／Ｌのパントテネートで補充された培養基中で培養することと、を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の培養することは、前述の集団が０．０１と４００との間の細胞密度（ＯＤ_６００）に到達するのに十分な期間にわたる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の培養することは、３〜２０日の期間にわたる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】（Ａ）Ｒ−パントテネートの分子構造、並びにその３つの前駆体：Ｌ−システイン、（Ｒ）−パントテネート、及びＡＴＰに由来する補酵素Ａの３つのセグメントの強調を伴う（Ｂ）補酵素Ａの分子構造を示す。

【図2】酵母（Ａ）及び細菌（Ｂ）におけるパントテネート生合成経路を示す。

【図3】様々な量のパントテネートの存在下で菌株Ｙ４６８９及びＹ４３５２に関して得られた例示的ＨＡＣＤ化合物の収率（Ａ）及び細胞密度（Ｂ）を示す。菌株Ｙ４６８９及びＹ４３５２はそれぞれ、異種酵素（ＭＥＶ経路の酵素：ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ、及びファルネセンシンターゼを含む）を含有し、それぞれ１５％及び１３％の収率でＨＡＣＤ化合物を産生することが可能であった。

【図4】０．４ｍｇ／Ｌ又は０．００２ｍｇ／Ｌのパントテネートを含む寒天上での菌株Ｙ４７２０、Ｙ５０３８、及びＹ２２０５の細胞増殖を示す。菌株Ｙ４７２０及びＹ５０３８はそれぞれ異種酵素（ＭＥＶ経路の酵素：ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ、及びファルネセンシンターゼを含む）を含有し、それぞれ１４％及び６％の収率で例示的ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能であった。菌株Ｙ２２０５は、いずれのＨＡＣＤ化合物も産生しないＣＥＮ．ＰＫ２野生型対照であった。

【図5】０又は１０ｍｇ／Ｌのパントテネートの存在下で、例示的ＨＡＣＤ化合物であるファルネセンの異なる収率を生じることが可能な酵母宿主細胞の細胞増殖を示す。各菌株の適切なファルネセンの収率が示され、１０％未満の収率でファルネセンを産生する菌株に関するデータ測定点は灰色であり、一方１０％以上の収率でファルネセンを産生する菌株に関するデータ測定点は黒色である。

【図6】１０ｍｇ／Ｌのパントテネートの存在下で、ＨＡＣＤ化合物であるファルネセンを産生することが可能な酵母宿主細胞の集団の菌株退化（すなわち、経時的なＨＡＣＤ化合物産生の減少傾向）を示す。

【図7】イソペンテニル二リン酸（「ＩＰＰ」）の産生に関するメバロネート（「ＭＥＶ」）経路の図式的表現を提供する。

【図8】ＩＰＰ及びジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）、及びゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）への転換の図式的表現を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0028】

６．１ 用語の定義
用語「アセチル−ＣｏＡ誘導化合物」とは、アセチル−ＣｏＡに由来の１つ以上のアセチル基から宿主細胞によって生合成される分子を指す。

【0029】

用語「内因性」とは、宿主細胞において自然に発生し得る物質又はプロセスを指す。

【0030】

用語「遺伝的に修飾された」とは、異種ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を示す。

【0031】

用語「ＨＡＣＤ化合物」とは、遺伝的に修飾された宿主細胞によって産生される異種アセチル−ＣｏＡ誘導化合物を指す。ＨＡＣＤ化合物としては、限定されるものではないが、アミノ酸、脂肪酸、イソプレノイド、及びポリケチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、このＨＡＣＤ化合物は、イソプレノイド、脂肪酸及びポリケチドからなる群から選択される。

【0032】

用語「異種」とは、自然状態では通常見られないものを指す。用語「異種化合物」とは、通常その化合物を産生しない細胞による化合物の産生、又は化合物がその細胞によって通常産生されないレベルでの化合物の産生を指す。

【0033】

用語「異種酵素」とは、自然状態において所定の細胞中で通常見られない酵素を指す。この用語は、
（ａ）所定の細胞に対して外因性（すなわち、宿主細胞中で自然に存在しない又は宿主細胞の所定の内容物中には自然に存在しないヌクレオチド配列によってコード化された）酵素と、
（ｂ）宿主細胞中で自然に見られる（例えば、酵素が、この細胞に対して内因性であるヌクレオチド配列によってコード化される）が、宿主細胞中では不自然な量で（例えば、自然で見られるものを超える又はそれよりも少なく）産生される酵素と、である酵素を包含する。

【0034】

用語「パントテネート化合物」とは、２−デヒドロパントエート、（Ｒ）−パントエート、（Ｒ）−パントテネート、及びこれらの任意の塩又はエステルからなる群から選択される任意の化合物を指す。

【0035】

用語「産生」とは、一般的に、本明細書で提供される遺伝的に修飾された宿主細胞によって生成されるＨＡＣＤ化合物の量を指す。いくつかの実施形態では、産生は、宿主細胞によるＨＡＣＤ化合物の収率として表される。他の実施形態では、産生は、ＨＡＣＤ化合物を産生することにおける宿主細胞の生産性として表される。

【0036】

用語「生産性」とは、その中で宿主細胞が経時的に（時間当たり）培養される（体積で）発酵ブロスの量当たりの産生されたＨＡＣＤの量（重量で）として表される、宿主細胞によるＨＡＣＤ化合物の産生を指す。

【0037】

用語「収率」とは、宿主細胞によって消費される炭素源の量当たりのＨＡＣＤ化合物の量（重量で）として表される、宿主細胞によるＨＡＣＤ化合物の産生を指す。
６．２ 異種化合物の産生を調整するための非遺伝的スイッチとしてのパントテネートの使用

【0038】

本明細書に提供される方法及び組成物は、ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞が培養される培養基でパントテネートが制限されるか培養基から省かれる場合、ＨＡＣＤ化合物の産生が実質的に低減され、並びにペントテネートが培養基中に提供される場合、ＨＡＣＤ化合物産生が増加されるという発見に基づく。したがって、パントテネートは、遺伝的に修飾された宿主細胞中のＨＡＣＤ化合物の産生のための非遺伝的スイッチとして作用する。特に、産生が要求される場合にのみ起こるようＨＡＣＤ化合物産生のタイミングを制御することは、比産生段階中の炭素流を、細胞の維持及びバイオマスへと方向転換する。この炭素のより有効な使用は、宿主細胞の代謝的負荷を大きく低減し、異種遺伝子の安定性を増加させ、菌株退化を低減させ、並びに細胞のより良好な全般的健康状態及び生存能力に寄与する。したがって、本明細書に提供される方法は、パントテネートを、異種アセチル−ＣｏＡ誘導化合物の産生に関する改善された発酵プロセスの「オフ」及び「オン」ステージをもたらすための非遺伝的スイッチとして利用する。

【0039】

したがって、一態様では、本明細書に提供されるものは、宿主細胞中で異種アセチル−ＣｏＡ誘導（ＨＡＣＤ）化合物を産生する方法であって、この方法は、
（ａ）炭素源及び制限量のパントテネートを含む培養基中でＨＡＣＤ化合物を生成することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞の集団を培養すること（制限量のパントテネートは、宿主細胞によるＨＡＣＤ化合物の産生を制限する）と、その後に、
（ｂ）前述の集団又はそのサブ集団を炭素源及び非制限量のパントテネートを含む培養基中で培養すること（非制限量のパントテネートは、制限量のパントテネートを超える量であり、前述の集団又はそのサブ集団は、非制限量のパントテネートの存在下でより多くの量のＨＡＣＤ化合物を産生する）と、を含む。

【0040】

第１のステップ（すなわち、「構築」ステージであるステップ（ａ））において、遺伝的に修飾された宿主細胞は、パントテネートが制限されるか又は省かれている増殖又は「構築」培地中で増殖される。第２のステップ（すなわち、「産生」ステージであるステップ（ｂ））において、パントテネート化合物が培養基に加えられ、これが、ＨＡＣＤ化合物の産生を実質的に増強するための非遺伝的スイッチとして働く。低レベルのパントテネート又はその不在中での初期増殖は、細胞のバイオマスが迅速に増加すると同時に細胞のエネルギー要求が満足されることを保証する。その後、パントテネート化合物を含有する増殖培地に切り替えることが、ＨＡＣＤ産物の合成を可能にする。

【0041】

実施例５（以下）及び図３Ａは、イソプレノイドファルネセンを産生するためのアセチル−ＣｏＡ生合成経路を通して高い代謝流量を有する、遺伝的に修飾された宿主細胞中でのＨＡＸＤ化合物産生に及ぼす培養基中のパントテネート化合物濃度の影響を示す。低いパントテネート化合物レベル（０．２ｍｇ／Ｌ、テストされた最大パントテネート化合物濃度の＜１％）では、ＨＡＣＤ化合物の実際の産生はない。パントテネート化合物レベルを上昇させることは、有効なプラトーに達するまでＨＡＣＤ化合物産生の増加と相関する。１ｍｇ／Ｌのパントテネート（テストされた最大パントテネート化合物濃度の１０％）を超えて更に増加させることは、ＨＡＣＤ化合物産生における更なる増加をもたらさない。

【0042】

注目すべきことに、これら細胞の増殖は、ＨＡＣＤ化合物産生に対して逆の傾向を示す。図３Ｂは、ＨＡＣＤ化合物産生に関してテストされた同一のパントテネート濃度レベルにおける同一菌株の増殖を示す。パントテネートの不在又は低レベルのパントテネートは、菌株が最大のＨＡＣＤ化合物産生に必要とされるパントテネートレベルにおいて培養された場合に観察されたものよりも良好な増殖を実際にもたらす。以下の実施例６及び７並びに図４及び５に示すように、この低いパントテネートレベルに対する応答は、より高い量のＨＡＣＤＥ化合物を産生するよう操作された宿主細胞の中で頻繁に観察された。したがって、ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能なある菌株において、僅かなパントテネート中で又はパントテネートを含まずに培養される場合に、改善された増殖の更なる利点が観察される。「構築」ステージ中（すなわち、ＨＡＣＤ化合物産生が止められる場合）の改善された増殖は、発酵の産生段階に必要とされる細胞バイオマスのより速い確立を可能にする。

【0043】

以下に提供される実施例８及び図６は、パントテネートが発酵プロセスの全てのステージを通して提供される場合起こり得る菌株退化の現象を裏付けている。ＨＡＣＤファルネセンの旺盛な産生は、発酵の最初で一過性に維持されるが、時間の経過と共に、先に観察された最大産生のわずか６０％近くまで減少する。このことが、宿主細胞集団の全体の産生の低下（例えば、収率及び／又は生産性）をもたらす。しかしながら、以下の実施例９及び表１に記載されるように、「構築」ステージ中の培養基のパントテネートを制限する又は培養基からそれを省くことによって、ＨＡＣＤ化合物産生は、発酵の過程にわたって実質的に増加され得る。
６．２．１ 制限量及び非制限量のパントテネート

【0044】

本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法における使用のための「制限」及び「非制限」量のパントテネートは、ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な任意の遺伝的に修飾された宿主細胞に関して決定され得る。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、培養基中の上昇するパントテネートの量の存在下でＨＡＣＤ化合物産生曲線、すなわちパントテネート滴定を実施することによって決定される。例示的パントテネート滴定は、以下の実施例５及び図３に提供されている。

【0045】

例えば、遺伝的に修飾された宿主細胞の集団を複数個のサブ集団に分け、平行して培養し、各サブ集団は、異なる、例えばパントテネートの上昇する量（パントテネートを含まないものも包含する）を含む培養基中で増殖され、ＨＡＣＤ化合物産生が定義された一定期間後に分析評価される。好ましい実施形態では、パントテネート滴定は、その濃度によって宿主細胞のＨＡＣＤ化合物産生が最大量で一定になった状態、すなわち、パントテネート濃度における増加でＨＡＣＤ化合物産生の更なる増加が観察されない場合のパントテネートの少なくとも２種の濃度を含む。いくつかの実施形態では、「非制限量」のパントテネートは、宿主細胞のＨＡＣＤ化合物産生がその最大で一定になる場合のパントテネートの少なくとも最小量である。この量は、特定の宿主細胞についてのＨＡＣＤ化合物産生に関するパントテネートの「飽和」又は「最適」量とも呼ばれ、したがって、この量は、宿主細胞のＨＡＣＤ化合物産生を制限することはなく、すなわち、培養基中のパントテネートの欠如のために、ＨＡＣＤ化合物生産が負の影響を受けることがない量である。他の実施形態では、「非制限」量のパントテネートは、ＨＡＣＤ化合物産生が最適下限である場合でもＨＡＣＤ化合物生産が観察されるパントテネートの任意の濃度を包含することができる。

【0046】

一旦宿主細胞に関する非制限量のパントテネートが決定されたら、この量は発酵プロセスの産生ステージ中に使用され得、これは構築ステージ中に使用される「制限」量のパントテネートを決定するよう使用され得る。いくつかの実施形態では、発酵の構築ステージにおける使用のための「制限」量のパントテネートは、非制限量のパントテネートよりも低い任意の量であり得る。

【0047】

いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ（培養基の体積当たりのパントテネートの重量）である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、少なくとも１ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、少なくとも１０ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．０１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間のパントテネートの量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．０１ｍｇ／Ｌと１ｍｇ／Ｌとの間のパントテネートの量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．０１ｍｇ／Ｌと０．１ｍｇ／Ｌとの間のパントテネートの量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間のパントテネートの量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．００１ｍｇ／Ｌよりも高い量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．０１ｍｇ／Ｌよりも高い量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．０２ｍｇ／Ｌよりも高い量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．１ｍｇ／Ｌよりも高い量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．２ｍｇ／Ｌよりも高い量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、１ｍｇ／Ｌよりも高い量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、２ｍｇ／Ｌよりも高い量である。いくつかの実施形態では、非制限量のパントテネートは、１０ｍｇ／Ｌよりも高い量である。

【0048】

いくつかの実施形態では、制限量のパントテネートは、上記の方法により決定されたような非制限量のパントテネートよりも２倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍又は１００，０００倍低い量である。いくつかの実施形態では、制限量のパントテネートは、上記の方法により決定されたような飽和量のパントテネートよりも２倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍又は１００，０００倍低い量である。いくつかの実施形態では、制限量のパントテネートは、上記の方法により決定されたような非制限量の５０％未満、２０％未満、１０％未満、１％未満、０．５％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０１％未満、又は０．００１％未満である量である。いくつかの実施形態では、制限量のパントテネートは、上記の方法により決定されたような飽和量の５０％未満、２０％未満、１０％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、又は０．００１％未満である量である。他の特定の実施形態では、制限量のパントテネートは、１０ｍｇ／Ｌ未満、又は１ｍｇ／Ｌ未満、又は０．２ｍｇ／Ｌ未満、又は０．１ｍｇ／Ｌ未満、又は０．０２ｍｇ／Ｌ未満、又は０．０１ｍｇ／Ｌ未満、若しくは０．００１ｍｇ／Ｌのパントテネートの量である。特定の実施形態では、制限量のパントテネートは０ｍｇ／Ｌで、すなわちパントテネートを含まない。したがって、この特定の実施形態においては、構築ステージ中に、宿主細胞はパントテネートの外部供給源を含まない細胞培養基中で培養され、細胞に使用可能なパントテネートの供給源は、内部的に産生される内因性パントテネートであるに過ぎない。

【0049】

特定の実施形態では、非制限量のパントテネートは、上記のように所定の宿主細胞に関する最適量又は飽和量であり、制限量はパントテネートを含まない。別の特定の実施形態では、非制限量のパントテネートは、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌであり、制限量はパントテネートを含まない。別の特定の実施形態では、非制限量のパントテネートは、０．０１〜１０ｍｇ／Ｌのパントテネートの量であり、制限量はパントテネートを含まない。別の特定の実施形態では、非制限量のパントテネートは、少なくとも１０ｍｇ／Ｌであり、制限量はパントテネートを含まない。

【0050】

いくつかの実施形態では、構築ステージ（上記の方法のステップ（ａ））中のＨＡＣＤ化合物の生産は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物生産、すなわち、宿主細胞が飽和量又は最適量のパントテネートを含む培地中で培養される場合のＨＡＣＤ化合物産生の量の５０、４０、３０、２０又は１０％未満である。いくつかの実施形態では、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物生産の５０％未満である。いくつかの実施形態では、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物の生産は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の４０％未満である。いくつかの実施形態では、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の３０％未満である。いくつかの実施形態では、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の２０％未満である。いくつかの実施形態では、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の１０％未満である。いくつかの実施形態では、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の５％未満である。いくつかの実施形態では、構築ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の１％未満である。

【0051】

いくつかの実施形態では、産生ステージ（上記の方法のステップ（ｂ））中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物生産の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％を超える。いくつかの実施形態では、構築（産生）ステージ中のＨＡＣＤ化合物の生産は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の５０％を超える。いくつかの実施形態では、構築（産生）ステージ中のＨＡＣＤ化合物の生産は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の６０％を超える。いくつかの実施形態では、構築（産生）ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の７０％を超える。いくつかの実施形態では、構築（産生）ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の８０％を超える。いくつかの実施形態では、構築（産生）ステージ中のＨＡＣＤ化合物の生産は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の９０％を超える。いくつかの実施形態では、構築（生産）ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の９５％を超える。いくつかの実施形態では、構築（産生）ステージ中のＨＡＣＤ化合物の産生は、遺伝的に修飾された宿主細胞の最大ＨＡＣＤ化合物産生の１００％以上である。

【0052】

発酵プロセスの構築ステージ及び産生ステージが実行される間の一定期間は異なってもよく、宿主細胞の増殖速度（例えば、培養基中のパントテネートの制限又は補充による）、宿主細胞の増殖の固有速度、並びに宿主細胞、発酵、及びプロセスの特定の要求に応じてのｐＨ、温度、及び好気性、微好気性、又は嫌気性への要求等の他の培養条件などの因子に依存するであろう。しかしながら、ＨＡＣＤ化合物産生に関連する負の選択的重圧が「オフ」状態において軽減されるために、構築ステージのいずれの持続時間も、発酵の最終的生産性にいくらかの利点をもたらすことが期待される。

【0053】

いくつかの実施形態では、構築ステージは、産生ステージ中にＨＡＣＤ化合物の産生を支援し得る細胞のバイオマスのある量を生み出すのに十分な期間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、所望の細胞密度に到達するまで、複数回の二倍化を起こすよう接種時において集団が存在するのに十分な期間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、構築ステージが実行されている発酵容器又は発酵槽中で、宿主細胞集団が０．０１と４００との間の細胞密度（ＯＤ_６００）に到達するのに十分な期間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、少なくとも０．０１のＯＤ_６００に到達するまで実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、少なくとも０．１のＯＤ_６００に到達するまで実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、少なくとも１．０のＯＤ_６００に到達するまで実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、少なくとも１０のＯＤ_６００に到達するまで実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、少なくとも１００のＯＤ_６００に到達するまで実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、０．０１と１００との間のＯＤ_６００に到達するまで実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、０．１と１０との間のＯＤ_６００に到達するまで実行される。いくつかの実施形態では、構築ステージは、１と１００との間のＯＤ_６００に到達するまで実行される。他の実施形態では、構築ステージは、少なくとも１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間又は９６時間を超える期間にわたって実行される。

【0054】

いくつかの実施形態では、産生ステージは、所望の量のＨＡＣＤ化合物を産生するのに十分な期間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、生産ステージは、少なくとも１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間又は９６時間を超える期間にわたって実行される。

【0055】

いくつかの実施形態では、産生ステージは、３日と２０日との間の期間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、産生ステージは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０日又は２０日を超える期間にわたって実行される。

【0056】

特定の実施形態においては、ＨＡＣＤ化合物を産生する方法は、遺伝的に修飾された宿主細胞の増殖又は維持を可能にするのに十分な条件中で、炭素源と制限されたパントテネート化合物濃度を含む又はパントテネート化合物を含まない培地中で遺伝的に修飾された宿主細胞の発酵を実施することと、次いで引き続いて培養基中にパントテネート化合物を、ＨＡＣＤ化合物の産生を誘発するのに十分な濃度で提供することと、発酵処理全体を通してパントテネート化合物の濃度を維持することとを含む。

【0057】

別の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物を産生する方法は、宿主細胞を別個の構築及び産生培養基中で培養することを含む。例えば、この方法は、細胞が制限量のパントテネート（例えば、少量のパントテネート又はパントテネートを含まない）を含む培地中で培養され接種物を産生する構築ステージにおいて遺伝的に修飾された宿主細胞を培養することと、次いでこの接種物を、非制限量のパントテネートを含む第２の発酵培地に移すことと、第２の発酵ステージにおける定常状態条件を維持し、ＨＡＣＤ産物を含有する細胞培養を産生することと、を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムを超える量で１つ以上のＨＡＣＤ化合物を産生するために十分である。いくつかのかかる実施形態では、ＨＡＣＤ誘導化合物は、細胞培養の１リットル当たり約１０〜約５０グラム、約１５グラムを超える、約２０グラムを超える、約２５グラムを超える、又は約３０グラムを超える量で産生される。

【0059】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、１つ以上のＨＡＣＤ化合物を、乾燥細胞重量の１グラム当たり約５０ミリグラムを超える量で産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、組換え的に産生されるＨＡＣＤ化合物は、乾燥細胞重量の１グラム当たり約５０〜１５００ミルグラム、約１００ミリグラムを超える、約１５０ミリグラムを超える、約２００ミリグラムを超える、約２５０ミリグラムを超える、約５００ミリグラムを超える、約７５０ミリグラムを超える、又は約１０００ミリグラムを超える量で産生される。

【0060】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法の実行は、宿主細胞が制限量のパントテネート中で培養される構築ステージを含まない方法から得られたＨＡＣＤ化合物産生に比べて、遺伝的に修飾された宿主細胞の集団によるＨＡＣＤ化合物の増加した産生をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法の実行は、細胞培養の単位体積当たりを基準として、宿主細胞が制限量のパントテネート中で培養される構築ステージを含まない方法により産生されるＨＡＣＤ化合物の量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、若しくはそれ以上の倍率の高い量で、１つ以上のＨＡＣＤ化合物の産生をもたらす。

【0061】

いくつかの実施形態では、この方法の実行は、単位乾燥細胞重量当たりを基準として、宿主細胞が制限量のパントテネート中で培養される構築ステージを含まない方法により産生されるＨＡＣＤ化合物の量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、若しくはそれ以上の倍率の高い量で、１つ以上のＨＡＣＤ化合物の産生をもたらす。

【0062】

いくつかの実施形態では、この方法の実行は、単位時間毎の細胞培養の単位体積当たりを基準として、宿主細胞が制限量のパントテネート中で培養される構築ステージを含まない方法により生成されるＨＡＣＤ化合物の量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、若しくはそれ以上の倍率の高い量で、１つ以上のＨＡＣＤ化合物の産生をもたらす。

【0063】

いくつかの実施形態では、この方法の実行は、単位時間毎の単位乾燥細胞重量当たりを基準として、宿主細胞が制限量のパントテネート中で培養される構築ステージを含まない方法により産生されるＨＡＣＤ化合物の量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、若しくはそれ以上の倍率の高い量で、１つ以上のＨＡＣＤ化合物の産生をもたらす。
６．２．２ 培養基及び条件

【0064】

微生物培養の維持及び増殖のための材料及び方法は、微生物学及び発酵科学の分野の当業者には周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，第２版，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６を参照）。宿主細胞、発酵、及びプロセスの特定の要求に応じて、適切な培養基、ｐＨ、温度、並びに好気性、微好気性、又は嫌気性条件への要求を考慮しなければならない。

【0065】

本明細書に提供されるＨＡＣＤ化合物を産生する方法は、限定されるものではないが細胞培養プレート、フラスコ、又は発酵槽が挙げられる好適な容器中で、好適な培養基（例えば、パントテネート補充の有無で）中で実施され得る。更に、この方法は、微生物生産物の工業生産を支援するために、当該技術分野で既知の発酵の任意のスケールで実施され得る。撹拌槽発酵槽、エアリフト式発酵槽、気泡発酵槽、又はこれらの組み合わせが挙げられる任意の好適な発酵槽が使用されてもよい。出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を宿主細胞として利用する特定の実施形態では、Ｋｏｓａｒｉｃら著，Ｕｌｌｍａｎｎ‘ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第６版、第１２巻，３９８−４７３頁，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＤａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙに記載されているような発酵槽内で菌株が増殖され得る。

【0066】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるようなＨＡＣＤ化合物を産生する方法における使用のための培養基は、その中でＨＡＣＤ化合物を生成することが可能な遺伝的に修飾された微生物が生存することができるような、すなわち、少量のパントテネート補充又はパントテネートの補充が全くない状態で、増殖及び生存能力を支持かつ維持することができるような任意の培養基を含む。いくつかの実施形態では、パントテネートで補充される場合、この培養基はまた、所望のＨＡＣＤ化合物を産生するために必要な生合成経路を促進する。

【0067】

いくつかの実施形態では、この培養基は、同化可能な炭素、窒素及びリン酸塩源を含む水性培地である。かかる培地はまた、適切な塩、鉱物、金属及び他の栄養素も含有することができる。いくつかの実施形態では、炭素源及びパントテネート化合物以外の必須細胞栄養素のそれぞれは、発酵培地に漸次的に又は連続的に添加され、それぞれの必要とされる栄養素は、例えば、炭素源をバイオマスに転換する細胞の代謝又は呼吸機能に基づく所定の細胞増殖曲線に従って、増殖する細胞による効率的同化作用に必要な本質的に最小レベルで維持される。

【0068】

微生物を培養するための好適な条件及び好適な培地は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、好適な培地は、例えば、誘導物質（例えば、遺伝子産物をコード化する１つ以上のヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターの制御下にある場合）、レプレッサー（例えば、遺伝子産物をコード化する１つ以上のヌクレオチド配列が、抑制性プロモーターの制御下にある場合）、又は選択剤（例えば、遺伝子修飾を含む微生物を選択するための抗生剤）等の１つ以上の追加的薬剤で補充される。

【0069】

いくつかの実施形態では、炭素源は、単糖類（単純糖）、二糖類、多糖類、非発酵性炭素源、又は１つ以上のこれらの組み合わせである。好適な単糖類の非限定的例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖類の非限定的例としては、ショ糖、乳糖、マルトース、トレハロース、セロビオース、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好適な多糖類の非限定的例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好適な非発酵性炭素源の非限定的例としては、アセテート及びグリセロールが挙げられる。

【0070】

培養基中のグルコースなどの炭素源の濃度は、細胞増殖を促進するべきであるが、使用される微生物の増殖を抑制するほど高くあるべきではない。典型的には、増殖及びバイオマスの所望のレベルを達成するレベルではあるが、検出不可能なレベルで（約＜０．１ｇ／ｌである検出限界で）添加されるグルコースなどの炭素源で、培養は実行される。他の実施形態では、培養基中のグルコースなどの炭素源の濃度は、約１ｇ／Ｌを超え、好ましくは約２ｇ／Ｌを超え、より好ましくは５ｇ／Ｌを超える。これに加えて、培養基中のグルコースなどの炭素源の濃度は、典型的には、約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２０ｇ／Ｌ未満である。培養成分濃度への言及は、初期及び／又は進行中の成分濃度の双方を指すことに留意すべきである。場合によっては、培養中に培養基に炭素源を枯渇させることが好ましいこともある。

【0071】

好適な培養基で使用され得る同化可能な窒素の供給源としては、単純窒素源、有機窒素源及び複合窒素源が挙げられるが、これらに限定されない。かかる窒素源としては、無水アンモニア、アンモニウム塩並びに動物、植物及び／又は微生物起源の物質が挙げられる。好適な窒素源としては、タンパク質加水分解物、微生物バイオマス加水分解物、ペプトン、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、尿素、及びアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、培養基中の窒素源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌを超え、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌを超え、より好ましくは約１．０ｇ／Ｌを超える。しかしながら、ある濃度を超えての窒素源の培養基への添加は、微生物の増殖に対して有利ではない。結果的に、培養基中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。更に、若干の例では、培養中に培養基に窒素源を枯渇させることが好ましい場合もある。

【0072】

有効な培養基は、無機塩、ビタミン、微量金属又は成長プロモーター等の他の化合物を含有することができる。かかる他の化合物は、有効な培地中の炭素、窒素又は鉱物源中に存在し得るか、又はその培地に特別に添加され得る。

【0073】

培養基はまた、好適なリン酸塩源を含有することができる。かかるリン酸塩源は、無機及び有機双方のリン酸塩源を含む。好ましいリン酸塩源としては、一塩基性又は二塩基性のリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム、リン酸アンモニウム並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、培養基中のリン酸塩の濃度は、約１．０ｇ／Ｌを超え、好ましくは約２．０ｇ／Ｌを超え、より好ましくは５．０ｇ／Ｌを超える。しかしながら、ある濃度を超えてのリン酸塩の培養基への添加は、微生物の増殖に対して有利ではない。したがって、培養基中のリン酸塩の濃度は、典型的には、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。

【0074】

好適な培養基はまた、マグネシウムの供給源を、好ましくは硫酸マグネシウム七水和物などの生理学的に許容可能な塩の形態で含むことができるが、マグネシウムの同様な量を与える濃度で他のマグネシウム源が使用され得る。典型的には、培養基中のマグネシウムの濃度は、約０．５ｇ／Ｌを超える、好ましくは約１．０ｇ／Ｌを超える、より好ましくは２．０ｇ／Ｌを超える。しかしながら、ある濃度を超えてのマグネシウムの培養基への添加は、微生物の増殖に対して有利ではない。したがって、培養基中の窒素源の濃度は、約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約３ｇ／Ｌ未満である。更に、若干の例では、培養中に培養基にマグネシウム源を枯渇させることが好ましい場合もある。

【0075】

いくつかの実施形態では、培養基はまた、クエン酸三ナトリウムの二水和物などの生物学的に許容可能なキレート剤も含むことができる。かかる例では、培養基中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌを超える、好ましくは約０．５ｇ／Ｌを超え、より好ましくは１ｇ／Ｌを超える。しかしながら、ある濃度を超えてのキレート剤の培養基への添加は、微生物の増殖に対して有利ではない。したがって、培養基中のキレート剤の濃度は、典型的には、約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２ｇ／Ｌ未満である。

【0076】

培養基はまた、培養基の所望のｐＨを維持するために、生物学的に許容可能な酸又は塩基を最初に含むことができる。生物学的に許容可能な酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的に許容可能な塩基としては、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、使用される塩基は、水酸化アンモニウムである。

【0077】

培養基はまた、生物学的に許容可能なカルシウム源を含むことができ、これは、限定されないが、塩化カルシウムが挙げられる。典型的には、培養基中の塩化カルシウム二水和物などのカルシウム源の濃度は、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの範囲内である。

【0078】

培養基はまた、塩化ナトリウムも含むことができる。典型的には、培養基中の塩化ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの範囲内である。

【0079】

いくつかの実施形態では、培養基はまた、微量金属を含むことができる。かかる微量金属は、便宜上、培養基の残部からは別個に調製され得る原溶液として培養基に添加され得る。典型的には、培養基に添加されるかかる微量金属溶液の量は、約１ｍｌ／Ｌを超える、好ましくは約５ｍｌ／Ｌを超える、より好ましくは１０ｍｌ／Ｌを超える。しかしながら、ある濃度を超えての微量金属の培養基への添加は、微生物の増殖に対して有利ではない。したがって、培養基に添加されるかかる微量金属溶液の量は、典型的には、約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、より好ましくは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。原溶液での微量金属を添加することに加えて、それぞれが微量金属溶液の上記範囲によって定められた成分の量に独立して対応する範囲内で、個々の成分は別個に添加され得る。

【0080】

発酵のステージに応じて培養基中に不在であるか又は存在し得るパントテネート又はＢ５に加えて、培養基は、ビオチン、カルシウム、パントテネート、イノシトール、ピリドキシン−ＨＣｌ、及びチアミン−ＨＣｌ等の他のビタミンを含むことができる。かかるビタミンは、便宜上、培養基の残部からは別個に調製され得る原溶液として培養基に添加され得る。しかしながら、ある濃度を超えてのビタミンの培養基への添加は、微生物の増殖に対して有利ではない。

【0081】

本明細書に記載の発酵法は、限定されるものではないが、バッチ法、流加法、細胞リサイクル法、連続法及び半連続法が挙げられる従来の培養モードで実施され得る。いくつかの実施形態では、発酵は、流加法モードで実行される。かかる場合には、発酵の生産ステージ中のパントテネートを含む培地の成分のいくつかは培養中に枯渇される。いくつかの実施形態では、例えば生産ステージの始めに、比較的高濃度のかかる成分で培養が補充されることで、添加が必要とされる以前に、増殖及び／又はＨＡＣＤ化合物産生が一定期間にわたって支援される。成分のレベルが培養によって枯渇されると同時に添加を行うことで、これら成分の好ましい範囲が、培養全体を通して維持される。培養基中の成分のレベルは、例えば、定期的に培養基をサンプリングし、濃度に関して分析評価することによって、監視され得る。あるいは、一旦標準的培養技法が開発されたら、培養全体の特定の時間における既知のレベルに対応する一定時間間隔で添加が実行され得る。当業者であれば理解されるように、栄養素の消費の速度は、培地の細胞密度が増加するにつれて、培養中に増加する。更に、外部微生物の培養基への侵入を回避するために、当該技術分野で既知のように、添加は無菌添加法を使用して実施される。これに加えて、少量の消泡剤が培養中に添加されてもよい。

【0082】

培養基の温度は、遺伝的に修飾された細胞の増殖及び／又はＨＡＣＤ化合物の産生に好適な任意の温度であり得る。例えば、接種物で培養基を摂取する前に、培養基を約２０℃〜約４５℃の範囲の温度に、好ましくは約２５℃〜約４０℃の範囲の温度に、より好ましくは約２８℃〜約３２度の範囲の温度にもっていき、この温度で維持され得る。

【0083】

培養基のｐＨは、培養基への酸又は塩基の添加によって制御され得る。アンモニアがｐＨを制御するよう使用されるような場合には、アンモニアはまた、培養基中の窒素源としても好都合に働く。好ましくは、ｐＨは約３．０〜約８．０に、より好ましくは約３．５〜約７．０に、最も好ましくは約４．０〜約６．５に維持される。

【0084】

培養基はまた、細胞増殖を維持するための並びにＨＡＣＤ化合物の産生のために細胞代謝を維持するための培養の過程中に、溶解された酸素含有量を有するようにも維持され得る。培養基の酸素濃度は、酸素電極の使用を通してなどの既知の方法を使用して監視されることができる。酸素は、撹拌、振蕩又はスパージングによる培地のアジテーション及び曝気を通して、当該技術分野で既知の方法を使用して、培養基に添加されることができる。好ましくは、培養基中の酸素濃度は、大気圧及び約２０℃〜約４０℃の範囲の温度での培養基中の酸素の溶解度に基づいて、培地中の酸素の飽和値の約２０％〜約１００％の範囲にある。この範囲を下回る酸素濃度における周期的下降が培養中に起こる場合があるが、これらは培養に悪影響を及ぼさない。

【0085】

培地の曝気が空気の使用に関連付けて本明細書で記載されたが、酸素の他の供給源が使用されることもできる。特に有用なものは、周囲空気中の酸素の体積分率を超える酸素の体積分率を含有する曝気ガスの使用である。これに加えて、かかる曝気ガスは、培地に悪影響を及ぼすことがない他のガスを含むこともできる。

【0086】

いくつかの実施形態では、培養基のグルコース濃度などの炭素源濃度が、培養中に監視される。培養基のグルコース濃度は、例えば、上澄み液、例えば培養基の細胞を含まない成分中のグルコース濃度を監視するよう使用され得る、グルコースオキシダーゼ酵素テスト又は高圧液体クロマトグラフィー等の既知の技術を使用して監視され得る。先に述べたように、炭素源濃度は、細胞増殖阻害が起きるレベルよりも低く保持されるべきである。かかる濃度は、炭素源としてのグルコースに関して、生物体間で変動する場合があるが、細胞増殖阻害は約６０ｇ／Ｌを超えるグルコース濃度で起こり、これは試験によって容易に決定され得る。したがって、炭素源としてグルコースが使用される場合、このグルコースは発酵槽に供給され、検出限界より低く維持されることが好ましい。あるいは、培養基中のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌから約１００ｇ／Ｌの範囲で、より好ましくは約２ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌの範囲で、更により好ましくは約５ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの範囲で維持される。炭素源濃度は、例えば実質的に純粋なグルコース溶液の添加によって所望のレベル内で維持され得るが、最初の培養基のアリコートの添加によって培養基の炭素源濃度を維持することが無難でありかつ好ましい場合がある。最初の培養基のアリコートの使用は、培地中の他の栄養素（例えば、窒素及びリン酸塩源）の濃度が同時に維持され得るために望ましい場合がある。同様に、微量金属溶液のアリコートの添加によって、微量金属濃度が培養基中で維持され得る。
６．２．３ ＨＡＣＤ化合物の回収

【0087】

宿主細胞によってＨＡＣＤが一旦産生されると、ＨＡＣＤは、当該技術分野で既知の好適な分離及び精製法を使用して、次の使用のために回収又は単離され得る。いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤを含む有機相が、遠心分離によって発酵から分離される。他の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物を含む有機相が、発酵から自発的に分離する。他の実施形態では、無乳化剤及び／又は核生成剤を発酵反応に添加することによって、ＨＡＣＤ誘導化合物を含む有機相が発酵から分離される。無乳化剤の例示的な例としては、凝集剤及び凝固剤が挙げられる。核生成剤の例示的な例としては、ＨＡＣＤ化合物それ自体の液滴並びにドデカン、イソプロピルミリストレート、及びオレイン酸メチル等の有機溶媒が挙げられる。

【0088】

これら細胞中で産生されるＨＡＣＤ化合物は、培養上澄み液中及び／又は宿主細胞に結合して存在することができる。ＨＡＣＤ化合物が宿主細胞に結合されている場合の実施形態では、ＨＡＣＤの回収は、細胞を透過性にするか又は溶解する方法を含む。あるいは又は同時に、限定されるものではないが、クロマトグラフィー、抽出、溶媒抽出、膜分離、電気透析、逆浸透、蒸留、化学的誘導体化及び結晶化が挙げられる回収法を使用して、培養基中のＨＡＣＤが回収され得る。

【0089】

いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、有機相中に存在する場合がある他の産生物から分離される。いくつかの実施形態では、分離は、吸着、蒸留、ガス−液体抽出（逆抽出）、液体−液体抽出（溶媒抽出）、限界濾過、及び標準的クロマトグラフィー技術を使用して可能となる。

【0090】

いくつかの実施形態では、回収されたＨＡＣＤ化合物は純粋であり、例えば、少なくとも約４０％純粋、少なくとも約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は９８％を超えて純粋であり、ここでＨＡＣＤ化合物における「純粋」とは、他のＨＡＣＤ化合物、汚染物質等を含まないＨＡＣＤ化合物を指す。
６．３ 遺伝的に修飾された微生物

【0091】

本明細書に提供されるものは、異種アセチル−ＣｏＡ誘導（ＨＡＣＤ）化合物を産生する遺伝的に修飾された微生物（例えば、遺伝的に修飾された出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞）である。この遺伝的に修飾された微生物は、本明細書に記載の遺伝的修飾を欠如する親微生物に比較して、アセチル−ＣｏＡから生合成された１つ以上の化合物をより大量に産生する。

【0092】

例えば、宿主細胞中で１つ以上のＨＡＣＤ化合物の産生の増加をもたらすために、発現ベクター又は染色体導入構築物を使用する微生物を遺伝的に修飾する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆら著，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９７８）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｃ．ら（編集），Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第１９４巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら著，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら編集，現行版，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これに加えて、例えば、細胞中での１つ以上のＨＡＣＤ化合物の産生の増加をもたらす遺伝子発現の阻害は、欠失、変異、及び／又は遺伝子再構成によって達成され得る。これはまた、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、三重鎖ＤＮＡ、並びに転写及び／又は翻訳阻害剤の使用でも実行され得る。更に、トランスポゾンが遺伝子発現を崩壊するために使用され得、これは例えば、トランスポゾンをプロモーターとコード化領域との間に挿入することによって、又は２つの遺伝子の一方又は双方を不活性化するために２つの隣接する遺伝子間に挿入することによる。

【0093】

いくつかの実施形態では、細胞中のＨＡＣＤ化合物の産生の増加は、特定のタンパク質、例えば、上記記載のような生合成経路に関与するタンパク質を発現するための発現ベクターの使用によって影響される。一般的に、発現ベクターは、複製シグナル及び発現制御配列、例えば、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作用的に結合されたプロモーター及びターミネーターを含む組換えポリヌクレオチド分子である。ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を発現するために有用な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）、プラスミドベクター、及びコスミドが挙げられる。酵母細胞中での使用に好適な発現ベクターの例示的な例としては、限定されないが、ＣＥＮ／ＡＲＳ及び２μプラスミドが挙げられる。酵母細胞中での使用に好適なプロモーターの例示的な例としては、限定されないが、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＴＥＦ１遺伝子のプロモーター、出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター、抑制性プロモーター、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＴＲ３遺伝子のプロモーター、及び誘導性プロモーター、例えば出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のガラクトース誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、及びＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）が挙げられる。

【0094】

発現ベクター及び染色体導入構築物は、限定されるものではないが、当業者に既知の任意の方法によって微生物細胞に導入され得る。例えば、Ｈｉｎｎｅｎら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１２９２−３（１９８７）；Ｃｒｅｇｇら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５（１９８５）；米国特許第５，２７２，０６５号；Ｇｏｅｄｄｅｌら編集，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ著，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら著，１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら編集，現行版，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照されたい。例示的技術としては、スフェロプラスト、電気穿孔、ＰＥＧ １０００媒介形質転換、及び酢酸リチウム又は塩化リチウム媒介形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。
６．３．１ 宿主細胞

【0095】

本明細書に提供される方法及び組成物で有用な細胞は、ＨＡＣＤ化合物、例えばイソプレノイド、ポリケチド、脂肪酸等を天然に又は組換えにより産生することが可能な任意の細胞を含む。いくつかの実施形態では、この細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胎生期癌細胞、又はマウス胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞はＳ２細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞、又はＳｆ９細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は単細胞生真核生物細胞である。

【0096】

いくつかの実施形態では、この細胞は菌糸体細菌細胞である。いくつかの実施形態では、この菌糸体細菌細胞は、放線菌綱の細胞である。特定の実施形態では、この菌糸体細菌細胞はストレプトマイセス属の細胞であり、例えば、ストレプトマイセス・アムボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｃｅ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・アズレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・クラコイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｃｕｒａｃｏｉ）、ストレプトマイセス・エリスラエウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）、ストレプトマイセス・ガリラエウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｇａｌｉｌａｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グラウケッセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ）、ストレプトマイセス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）、ストレプトマイセス・リモスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・ロセオフルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ、ストレプトマイセス・サーモトレランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ストレプトマイセス・ビオラセオルベル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍａｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）である。

【0097】

別の実施形態では、この細胞は真菌細胞である。より特定の実施形態では、この細胞は酵母細胞である。本明細書に提供される方法及び組成物において有用な酵母は、微生物寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）で寄託された酵母が挙げられ、アシクロコニディウム属（Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ属）、アンブロシオザイマ属（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ属）、アルスロアスカス属（Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ属）、アルキシオザイマ属（Ａｒｘｉｏｚｙｍａ属），アシュビア属（Ａｓｈｂｙａ属），バブジェビア属（Ｂａｂｊｅｖｉａ属）、ベンシングトニア属（Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属）、ボトリオアスカス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属）、ボトリオザイマ属（Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ属）、ブレッタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属）、ビュレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ属）、ビュレロマイセス属（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、シテロマイセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、シストフィロバシディウム属（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属）、デッカラ属（Ｄｅｋｋａｒａ属）、ディポダスコプシス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ属）、ディポダスカス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ属）、エニエラ属（Ｅｅｎｉｅｌｌａ属）、エンドマイコプセラ属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ属）、エレマスカス属（Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ属）、エレモセシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属）、エリスロバシディウム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属）、フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属）、フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属）、ガラクトマイセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ属）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属）、ガイラーモンデラ属（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ属）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属）、ハセガワエア属（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ属）、ホルターマンニア属（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ属）、ホルモアスカス属（Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ属）、ハイフォピキア属（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ属）、イサットヘンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属）、クロエケラスポラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ属）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、コンドア属（Ｋｏｎｄｏａ属）、クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ属）、クルツマノマイセス属（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属）、ロイコスポリディウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属）、ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、マラセジア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属）、メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属）、ムラキア属（Ｍｒａｋｉａ属）、マイクソザイマ属（Ｍｙｘｏｚｙｍａ属）、ナドソニア属（Ｎａｄｓｏｎｉａ属）、ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ属）、ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ属）、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ属）、オースポリディウム属（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属）、ファチコスポラ属（Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ属）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ属）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、ロドスポリディウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、サッカロマイコーデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属）、サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属）、サイトエラ属（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属）、サカグチア属（Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属）、サターノスポラ属（Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ属）、シゾブラストスポリオン属（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ属）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属）、スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属）、スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属）、スポロパキデミア属（Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ属）、ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属）、ステリグマトマイセス属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属）、ステリグマトスポリディウム属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），シンビオタフリナ属（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ属）、シンポディオマイセス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ属），シンポディオマイコプシス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属）、トリコスポリエラ属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属），トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属）、ツチヤエア属（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属）、ウデニオマイセス属（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属）、ワルトマイセス属（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ属）、ウィカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ属）、ウィカーハミエラ属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ属）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ属）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属）、ザイゴアスカス属（Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ属）、ザイゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、ザイゴウィリオプシス属（Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属）、及びザイゴザイマ属（Ｚｙｇｏｚｙｍａ属）等に属する。特定の実施形態では、本発明で提供される方法及び組成物における有用な酵母としては、出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、デッケラ・ブルキセレンシス（Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）（以前はサッカロマイセス・ラクティス：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓと呼ばれた）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、又はハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（現在、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）として既知））が挙げられる。いくつかの実施形態では、この微生物は、キャンディダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、キャンディダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、キャンディダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、キャンディダ・シュードトロピカリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、又はキャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）などのキャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）の菌株である。

【0098】

特定の実施形態では、この細胞は、出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞の菌株は、パン酵母、ＣＢＳ ７９５９、ＣＢＳ ７９６０、ＣＢＳ ７９６１、ＣＢＳ ７９６２、ＣＢＳ ７９６３、ＣＢＳ ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、及びＡＬ−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株は、ＰＥ２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１、及びＳＡ−１からなる群から選択される。特定の実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株は、ＰＥ−２である。特定の実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株は、ＣＡＴ−１である。別の特定の実施形態では、出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株は、ＢＧ−１である。

【0099】

いくつかの実施形態では、この細胞は半数体微生物細胞である。他の実施形態では、この細胞は二倍体微生物細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は異型接合体である。他の実施形態では、この細胞は、その交配型対立遺伝子に関するもの以外のホモ接合体（すなわち、この細胞が胞子形成するべき場合、得られる４つの半数体微生物細胞は、それらの交配型対立遺伝子を除いては遺伝的に同一であり、その中で、半数体細胞の２つは交配型ａであり、他の２つの半数体細胞は交配型αである）である。

【0100】

いくつかの実施形態では、この細胞は、工業的発酵、例えばバイオエタノール発酵に好適である細胞である。特定の実施形態では、この細胞は、工業的発酵環境のストレス条件として認識されている高溶媒濃度、高温、拡大された基質利用、栄養制限、浸透圧因性ストレス、酸性度、亜硫酸塩及び細菌混入、又はこれらの組み合わせ下で生存するよう調節される。例示的ＨＡＣＤ化合物を産生する細胞、例えばイソプレノイド、ポリケチド、及び脂肪酸を組換え的に産生する細胞、並びにかかる細胞を産生するための方法が、以下に提供される。
６．４ イソプレノイドの産生

【0101】

いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物はイソプレノイドである。イソプレノイドは、ＩＰＰに由来し、酵母中のＩＰＰは、ＭＥＶ経路の酵素によって生合成される（図６）。ＭＥＶ経路を介して産生されるＩＰＰは、その異性体であるＤＭＡＰＰに転換され得、縮合され、様々な追加的酵素の作用を通して修飾され、単純なＨＡＣＤイソプレノイド化合物及びより複雑なＨＡＣＤイソプレノイド化合物を形成することができる（図７）。

【0102】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝的に修飾された微生物は、ＭＥＶ経路の酵素、ＩＰＰイソメラーゼ、ポリプレニルシンターゼ、並びにポリプレニルを修飾してヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイド、又は修飾されたＨＡＣＤ化合物を形成することができる酵素からなる群から選択される酵素をコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、アセチル−補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成することができる酵素、例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＮＣ＿０００９１３ ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．２３２５３１５；大腸菌＝エッシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、（Ｄ４９３６２；パラコッカス・デニトリフィカンス）、及び（Ｌ２０４２８；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0104】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡの別の分子と縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＮＣ＿００１１４５．補体１９０６１．２０５３６；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、（Ｘ９６６１７；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、（Ｘ８３８８２；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅｏｌａ））、（ＢＴ００７３０２；ヒト＝ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、及び（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓタグ ＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７１；黄色ブドウ球菌＝スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0105】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに転換することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＮＭ＿２０６５４８；ショウジョウバエ＝ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓタグ ＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７０；黄色ブドウ球菌＝スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、（ＮＭ＿２０４４８５；ニワトリ＝ガッルス・ガッルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ））、（ＡＢ０１５６２７；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属 ＫＯ３９８８）、（ＡＦ５４２５４３；ニコチアナ・アテヌアタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅｏｌａ））、（ＡＸ１２８２１３、切断ＨＭＧＲをコード化する配列を提供、出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、及び（ＮＣ＿００１１４５：補体（１１５７３４．１１８８９８；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0106】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、メバロネートをメバロネート−５−リン酸に転換することができる酵素、例えばメバロネートキナーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の非限定的例としては、（Ｌ７７６８８；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））及び（Ｘ５５８７５；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、メバロネート−５−リン酸をメバロネート５−ピロリン酸に転換することができる酵素、例えばホスフォメバロネートキナーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の非限定的例としては、（ＡＦ４２９３８５；バラゴムノキ＝ヘベア・ブラシリエンシス（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））、（ＮＭ＿００６５５６；ヒト＝ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、及び（ＮＣ＿００１１４５：補体（７１２３１５．７１３６７０；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0108】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、メバロネート５−ピロリン酸をＩＰＰに転換することができる酵素、例えばメバロネートピロリン酸デカルボキシラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の非限定的例としては、（Ｘ９７５５７；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、（ＡＦ２９００９５；エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ））、及び（Ｕ４９２６０；ヒト＝ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0109】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＭＥＶ経路を介して産生されたＩＰＰをＤＭＡＰＰに転換することができる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の非限定的例としては、（ＮＣ＿０００９１３，３０３１０８７．３０３１６３５；大腸菌＝エッシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、及び（ＡＦ０８２３２６；ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0110】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５個を超える炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＩＰＰの１つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合してゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）の１つの分子を形成することができる酵素、例えばＧＰＰシンターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の非限定的例としては、（ＡＦ５１３１１１；グランディスモミ＝アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ））、（ＡＦ５１３１１２；グランディスモミ＝アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ））、（ＡＦ５１３１１３；グランディスモミ＝アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ））、（ＡＹ５３４６８６；ゴマノハグサ＝アンティリヌム・マユス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ））、（ＡＹ５３４６８７；ゴマノハグサ＝アンティリヌム・マユス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ））、（Ｙ１７３７６；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＡＥ０１６８７７、Ｌｏｃｕｓ ＡＰ１１０９２；セレウス菌＝バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）；ＡＴＣＣ １４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；オレンジスイート＝シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓｕ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、（ＡＹ５３４７４５；クラーキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８；イプス・ピニ）、（ＤＱ２８６９３０；トマト＝リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、（ＡＦ１８２８２８；ペパーミント＝メンタｘピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７；ペパーミント＝メンタｘピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３；ペパーミント＝メンタｘピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＰＺＥ４３１６９７、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＤ２４４２５；パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、ＡＹ８６６４９８；コオウレン＝ピクロリザ・クローア（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｋｕｒｒｏａ））、（ＡＹ３５１８６；ヨーロッパブドウ＝ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）及び（ＡＦ２０３８８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ１２８４３；チモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0112】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＩＰＰの２つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合し、又はＩＰＰの分子をＧＰＰの分子に添加して、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）を形成することができる酵素、例えばＦＰＰシンターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチドの例示的な例としては、（ＡＴＵ８０６０５；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＡＡＵ３６３７６；スイートワームウッド＝アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｈｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ））、（ＡＦ４６１０５０；ウシ＝ボース・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、（Ｄ００６９４；大腸菌＝エッシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＬ９５５２３；フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）ＡＴＣＣ ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；イネばか苗病菌＝ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ））、（ＣＰ０００００９、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＷ６００３４；グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；ヒマワリ＝ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、（ＨＵＭＦＡＰＳ；ヒト＝ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、（ＫＬＰＥＰＳＱＣＲ；キラー酵母＝クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ））、（ＬＡＵ１５７７７；シロバナハウチワマメ＝ルピナス・アルバス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ））、（ＬＡＵ２０７７１；シロバナハウチワマメ＝ルピナス・アルバス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ））、（ＡＦ３０９５０８；ハツカネズミ＝ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；アオカビ＝ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））、（ＰＡＦＰＳ１；グアユールゴムノキ＝パルテニウム・アルジュンタトゥム（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ））、（ＲＡＴＦＡＰＳ；ラット＝ラタス・ノルベジカス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、（ＹＳＣＦＰＰ；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、（Ｄ８９１０４；シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、（ＣＰ０００００３、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＴ８７３８６；ストレプトコッカス・ピオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、（ＣＰ００００１７、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＺ５１８４９；ストレプトコッカス・ピオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、（ＮＣ＿００８０２２、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿５９８８５６；ストレプトコッカス・ピオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６００８４５；ストレプトコッカス・ピオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６０２８３２；ストレプトコッカス・ピオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＭＧＡＳ１０７５０））、（ＭＺＥＦＰＳ；トウモロコシ＝ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、（ＡＥ０００６５７、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ０６９１３；アキフェックス・アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ））、（ＮＭ＿２０２８３６；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（Ｄ８４４３２、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１２５７５；枯草菌＝バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、Ｕ１２６７８、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２８８９４；ダイズ根粒菌＝ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ １１０））、（ＢＡＣＦＤＰＳ；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、（ＮＣ＿００２９４０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿８７３７５４；軟性下疳菌＝ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）３５０００ＨＰ））、（Ｌ４２０２３、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２３０８７；インフルエンザン菌＝ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＲｄＫＷ２０））、（Ｊ０５２６２；ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、（ＹＰ＿３９５２９４；ラクトバチルス・サケイ・亜種サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ）２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿０００２７３；レプトスピラ・インテロガンス血清型変種コペンハーゲニー（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ）菌株Ｆｉｏｃｒｕｚ Ｌ１−１３０））、（ＡＢ００３１８７；ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｌｕｔｅｕｓ））、（ＮＣ＿００２９４６、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０８７６８；淋菌＝ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＦＡ １０９０））、（Ｕ０００９０、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＢ９１７５３；リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種 ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ））、（ＣＰ００００３１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＶ９３５６８；シリシバクター・ポメロイ（Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉ）ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＫ９９８９０；肺炎連鎖球菌＝ストレプトコッカス ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６）、及び（ＮＣ＿００４５５６、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ７７９７０６；キシレラ・ファスティディオーサ・テメキュラ１（Ｘｙｌｅｌｌａ Ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ Ｔｅｍｅｃｕｌａ １））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0113】

いくつかの実施形態では、イソプレノイド産生細胞は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ若しくはＩＰＰ及びＦＰＰを結合して、ゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）を形成することができる酵素をコード化する異種ヌクレオチド配列を更に含む。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＢＴ００５３２８；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＮＭ＿１１９８４５：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００７４３０５２；バチルス・チューリンジェンシス血清型変種イスラエレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｅｒｏｖｏｒ ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、ＡＴＣＣ ３５６４６ ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；ニチニチソウ＝カタランサス・ロセウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００１４４５０９；フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティー（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）ＡＴＣＣ ２５５８６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；イネばか苗病菌＝ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ））、（ＡＹ３７１３２１；イチョウ＝ギンクゴ・ビロバ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ））、（ＡＢ０５５４９６；バラゴムノキ＝ヘベア・ブラシリエンシス（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））、（ＡＢ０１７９７１；ヒト＝ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、（ＭＣＩ２７６１２９；ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）ｆ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４；ハツカネズミ＝ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、Ｌｏｃｕｓ ＮＣＵ０１４２７；青かび＝ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０；青かび＝ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００９４３５６６；ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；ラタス・ノルベジカス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、（ＳＣＵ３１６３２；出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ））、（ＡＢ０１６０９５；シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ））、（ＳＡＧＧＰＳ；和ガラシ＝シナピス・アルバ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ））、（ＳＳＯＧＤＳ；スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿４６１８３２；シントロファス・アシディトロフィクス（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＳＢ）、（ＮＣ＿００６８４０、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０４０９５；海洋性発光細菌＝ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＥＲＷＣＲＴＥ；パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、（Ｄ９００８７、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１４１２４；パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ））、（Ｘ５２２９１、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＡ３６５３８；ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＦ１９５１２２、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ２４２９４；ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ））、及び（ＮＣ＿００４３５０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿７２１０１５；ミュータンス菌＝ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0114】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、ポリプレニルを修飾してヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイド、又は修飾されたＨＡＣＤ化合物を形成することができる酵素をコード化する異種ヌクレオチド配列を更に含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、カレンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチドの例示的な例としては、（ＡＦ４６１４６０、ＲＥＧＩＯＮ ４．．１９２６；ヨーロッパトウヒ＝ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ））及び（ＡＦ５２７４１６、ＲＥＧＩＯＮ ７８．．１８７１；サルビア・ステノフィラ（Ｓａｌｖｉａ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0116】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、ゲラニオールシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＡＪ４５７０７０；シナモン・テヌイピルム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ））、（ＡＹ３６２５５３；スイートバジル＝オキムム・バジリクム（Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＤＱ２３４３００；シソ＝ペリラ・フルテッセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）種１８６４）、（ＤＱ２３４２９９；レモンエゴマ＝ペリラ・シトリオデーラ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）種４９３５）、及び（ＤＱ０８８６６７；レモンエゴマ＝ペリラ・シトリオデーラ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0117】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、リナロオールシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＡＦ４９７４８５；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＡＣ００２２９４、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＢ７１４８２；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＡＹ０５９７５７；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＮＭ＿１０４７９３；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＡＦ１５４１２４；スイートワームウッド＝アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ））、（ＡＦ０６７６０３；クラーキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＦ０６７６０２；クラーキア・コンキンナ）、（ＡＦ０６７６０１；クラーキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ）、（Ｕ５８３１４；クラーキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ８４００９１；トマト＝リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、（ＤＱ２６３７４１；ラベンダー＝ラバンデュラ・アンギュスティフォリア（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、（ＡＹ０８３６５３；（ミズハッカ＝メンタ・シトラタ（Ｍｅｎｔｈａ ｃｉｔｒａｔａ）、（ＡＹ６９３６４７；スイートバジル＝オキムム・バジリクム（Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＸＭ＿４６３９１８；イネ＝オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、（ＡＰ００４０７８、Ｌｏｃｕｓ ＢＡＤ０７６０５；イネ＝オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、（ＸＭ＿４６３９１８、Ｌｏｃｕｓ ＸＰ＿４６３９１８；イネ＝オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、（ＡＹ９１７１９３；レモンエゴマ＝ペリラ・シトリオデーラ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ））、（ＡＦ２７１２５９；シソ＝ペリラ・フルテッセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ））、（ＡＹ４７３６２３；ヨーロッパトウヒ＝ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ））、（ＤＱ１９５２７４；シトカトウヒ＝ピセア・シトケンシス（Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、及び（ＡＦ４４４７９８；シソ＝ペリラ・フルテッセンス変種クリスパ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ）栽培品種Ｎｏ．７９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0118】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、リモネンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、ＲＥＧＩＯＮ：４７．１８６７；レモン＝シトラス・リモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ））及び（ＡＹ０５５２１４、ＲＥＧＩＯＮ：４８．１８８９；カワミドリ＝アガスターシェ・ルゴサ（Ａｇａｓｔａｃｈｅ ｒｕｇｏｓａ）並びに（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、ＲＥＧＩＯＮ；１．１９０５；シトカトウヒ＝ピセア・シトケンシス（Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、（ＡＦ００６１９３、ＲＥＧＩＯＮ：７３．１９８６；アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ））、及び（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、ＲＥＧＩＯＮ：２９．１８２８；ミドリハッカ＝メンタ・スピカタ（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0119】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、ミルセンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（Ｕ８７９０８；アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ））、（ＡＹ１９５６０９；キンギョソウ＝アンティリヌム・マユス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ））、（ＡＹ１０５６０８；キンギョソウ＝アンティリヌム・マユス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ））、（ＮＭ＿１２７９８２；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；シソ＝ペリラ・フルテッセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ））、（ＡＹ４７３６２６；ヨーロッパトウヒ＝ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ））、（ＡＦ３６９９１９；ヨーロッパトウヒ＝ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ））、及び（ＡＪ３０４８３９；西洋ヒイラギカシ＝クエルクス・イレックス（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｉｌｅｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0120】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、オシメンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ＡＹ１９５６０７；キンギョソウ＝アンティリヌム・マユス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ））、（ＡＹ１９５６０９；キンギョソウ＝アンティリヌム・マユス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ））、（ＡＹ１９５６０８；キンギョソウ＝アンティリヌム・マユス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ））、（ＡＫ２２１０２４；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、（ＮＭ＿１１３４８５；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＰＳ１０）、（ＡＢ１１０６４２；ウンシュウミカン＝シトラス・ウンシュウ（Ｃｉｔｒｕｓ ｕｎｓｈｉｕ）ＣｉｔＭＴＳＬ４）、及び（ＡＹ５７５９７０；ミヤコグサ＝ロータス・コルニクラタス（Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｎｔｕｓ）変種ジャポニカス（ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0121】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、α−ピネンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、ＲＥＧＩＯＮ：１．１８８７；テーダマツ＝ピヌス・タエダ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、ＲＥＧＩＯＮ：３２．１９２１；テーダマツ＝ピヌス・タエダ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、及び（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、ＲＥＧＩＯＮ：６１１１８９２；アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0122】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、β−ピネンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、ＲＥＧＩＯＮ：１．１７４９；スイートワームウッド＝アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）及び（ＡＦ５１４２８８、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１８３４；レモン＝シトラス・リモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0123】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、サビネンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、セージ＝サルビア・オフィシナリス（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）からのＡＦ０５１９０１、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１７９８が挙げられるが、これに限定されない。

【0124】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、γ−テルピネンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（レモン＝シトラス・リモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ）からのＡＦ５１４２８６，ＲＥＧＩＯＮ：３０．１８３２）及び（ウンシュウミカン＝シトラス・ウンシュウ（Ｃｉｔｒｕｓ ｕｎｓｈｉｕ）からのＡＢ１１０６４０、ＲＥＧＩＯＮ １．１８０３）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0125】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、テルピノレンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（バジル＝オシムム・バシリクム（Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）からのＡＹ６９３６５０）及び（ダラス・ファー＝シュードツガ・メンジーシー（Ｒｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）からのＡＹ９０６８６６、ＲＥＧＩＯＮ：１０．１８８７）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0126】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、アモルファジエンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例は、米国特許出願公開第２００４／０００５６７８号の配列番号３７である。

【0127】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、α−ファルネセンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的としては、ピラス・コムムニス（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）栽培品種ｄ’Ａｎｊｏｕ（ナシ、遺伝子名ＡＦＳ１）からのＤＱ３０９０３４及びマルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓｕ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（リンゴ；遺伝子名ＡＦＳ１）からのＡＹ１８２２４１が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｐｅｃｈｏｕｕｓら著，Ｐｌａｎｔａ ２１９（１）：８４−９４（２００４））。

【0128】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、β−ファルネセンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、メンタｘピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ（ペパーミント；遺伝子Ｔｓｐａｌ１）からの遺伝子バンク受入番号ＡＦ０２４６１５、及びスイートワームウッド＝アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）からのＡＹ８３５３９８が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｐｉｃａｕｄら著，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６６（９）：９６１−９６７（２００５））。

【0129】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、ファルネソールシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、トウモロコシ＝ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）からの遺伝子バンク受入番号ＡＦ５２９２６６、及び出芽酵母＝サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ（遺伝子Ｐｈｏ８）からのＹＤＲ４８１Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｓｏｎｇ，Ｌ．著，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２８：１４９−１５８（２００６））。

【0130】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、ネロリドールシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）からのＡＦ５２９２６６が挙げられるが、これに限定されない。

【0131】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、パチョリオールシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、ポゴステモン・カブリン（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ）からのＡＹ５０８７３０ ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５９が挙げられるが、これに限定されない。

【0132】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、ヌートカトンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）からのＡＦ４４１１２４ ＲＥＧＩＯＮ：１．１６４７及びペリラ・フルテッセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）からのＡＹ９１７１９５ ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５３が挙げられるが、これらに限定されない。

【0133】

いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチドは、アビエタジンシンターゼをコード化する。好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、（Ｕ５０７６８；アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ））及び（ＡＹ４７３６２１；トウヒ＝ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0134】

いくつかの実施形態では、細胞によって産生されるイソプレノイドは、Ｃ_５イソプレノイドである。これら化合物は、１個のイソプレン単位に由来し、ヘミテルペンとも呼ばれる。ヘミテルペンの例示的な例は、イソプレンである。他の実施形態では、このイソプレノイドはＣ_１０イソプレノイドである。これら化合物は２個のイソプレン単位に由来し、モノテルペンとも呼ばれる。モノテルペンの例示的な例は、リモネン、シトラネロール、ゲラニオール、メントール、ペリリルアルコール、リナロオール、ツジョン、及びミルセンである。他の実施形態では、イソプレノイドはＣ_１５イソプレノイドである。これら化合物は、３個のイソプレン単位に由来し、セスキテルペンとも呼ばれる。セスキテルペンの例示的な例は、ペリプラノンＢ、ギンゴライドＢ、アモルファジエン、アルテミシニン、アルテミシニン酸、バレンセン、ヌートカトン、エピ−セドロール、エピ−アリストロケン、ファルネソール、ゴシポール、サノニン、ペリプラノン、フォルスコリン、及びパチョウロール（これはパチョリアルコールとしても知られる）である。他の実施形態では、イソプレノイドはＣ_２０イソプレノイドである。これら化合物は、４個のイソプレン単位に由来し、ジテルペンとも呼ばれる。ジテルペンの例示的な例は、カスビン、エリュテロビン、パクリタキセル、プロストラチン、シュードプテロシン、及びタキサジエンである。更に他の例では、イソプノイドはＣ_２０＋イソプレノイドである。これら化合物は、４個を超えるイソプレン単位に由来し、アルブルシドＥ、ブルセアンチン、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、ジギトキシン、及びスクワレン等のトリテルペン（６個のイソプレン単位に由来するＣ_３０イソプレノイド化合物）；β−カロテン等のテトラテルペン（８個のイソプレン単位に由来するＣ_４０イソプレノイド化合物）；及びポリイソプレン等のポリテルペン８個を超えるイソプレン単位に由来するＣ_４０＋イソプレノイド化合物）が挙げられる。いくつかの実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロオール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、及びバレンセンからなる群から選択される。イソプレノイド化合物としてはまた、カロテノイド（リコペン、α−及びβ−カロテン、α−及びβ−クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、並びにルテイン）、ステロイド化合物、並びに混合されたテルペン−アルカロイド、及びコエンザイムＱ−１０等の他の化学基によって修飾されたイソプレノイドから構成される化合物も挙げられるが、これらに限定されない。
６．５ ポリケチドの産生

【0135】

いくつかの実施形態では、アセチル誘導化合物は、ポリケチドである。ポリケチドは、活性部位の配位基を含有する大きな多酵素タンパク質複合体であるポリケチドシンターゼ（ＰＫＳｓ）と呼ばれる酵素活性の回収によって触媒される連続的反応で合成される。ポリケチド生合成は、アセチル−ＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ及びこれらの活性化誘導体、マロニル−、メチルマロニル−及びエチルマロニル−ＣｏＡ等の単純な２−、３−、４−炭素構築ブロックから出発して、主としてクライゼン縮合反応を介するマロニル−ＣｏＡ誘導単位の脱カルボキシル化縮合を通して、段階的に進む。ＰＫＳ遺伝子は、通常、細菌では１つのオペロン内に、真核生物では遺伝子クラスタ内に構成されている。ポリケチドシンターゼの３つの型は特性化されていて、Ｉ型ポリケチドシンターゼは、２つのクラスに細分された大きな高度モジュールタンパク質であり、これらクラスは１）周期的にドメインを再利用する、反復性ＰＫＳｓと、２）別個のモジュールの配列を含有し、ドメインを繰り返さない、モジュールＰＫＳｓである。ＩＩ型ポリケチドシンターゼは、単官能タンパク質の凝集物であり、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼは、アシルキャリアタンパク質ドメインを使用することはない。

【0136】

それぞれの連続的鎖伸長工程が、以下に記載のケト還元、脱水及びエノイル還元の固定された配列に続く脂肪酸の生合成とは異なり、ポリケチド生合成の個々の鎖伸長中間体は、官能基修飾の全て、その一部を受けるか、又は官能基修飾を全く受けず、非常に多くの化学的に異なる産物をもたらす。更なる複雑さの度合いが、異なるスターター単位及び鎖伸長単位の使用並びに新しい立体異性体の発生から起こる。

【0137】

ポリケチドシンターゼによって指揮されるような完全なポリケチド合成の順番は次のように続き（Ｎ末端からＣ末端の順で）：最初の炭素構築ブロックを、アシルキャリアタンパク質上、成長するマクロライド鎖の伸長を触媒する伸長モジュール上、及び合成されたマクロライドの放出を触媒する末端モジュール上で開始又は充填する。この生合成中で活性な成分ドメイン又は別個の酵素官能基としては、スターター、エクステンダー及び中間体アシル単位の充填のためのアシル−トランスフェラーゼ；チオールエステルとして成長するマクロライドを保持するアシルキャリアタンパク質；鎖伸長を触媒するβ−ケト−アシルシンターゼ；アルコール官能基への第１番目の還元を担当するβ−ケトレダクターゼ；水を除去して不飽和チオールエステルをもたらすデヒドラターゼ；完全な飽和への最終還元を触媒するエノイルレダクターゼ；及びマクロライド放出及び環化を触媒するチオエステラーゼが挙げられる。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第１の反応体を、マロニル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つを、アシルキャリアタンパク質と縮合することができる酵素、例えばアシル−トランスフェラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示された遺伝的に修飾された微生物は、アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第１の反応体をマロニル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第２の反応体と縮合し、ポリケチド産物を形成することができる酵素、例えば、β−ケト−アシルシンターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示された遺伝的に修飾された微生物は、ポリケチド化合物上のβ−ケト化学基を、β−ヒドロキシ基に還元することができる酵素、例えば、β−ケトレダクターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示された遺伝的に修飾された微生物は、ポリケチド化合物中のアルカン化学基を脱水し、α−β−不飽和アルケンを生成することができる酵素をコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示された遺伝的に修飾された微生物は、ポリケチド化合物中のα−β−二重結合を、飽和アルカンに還元することができる酵素、例えば、エノイル−レダクターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示された遺伝的に修飾された微生物は、ポリケチド化合物をアシルキャリアタンパク質から加水分解することができる酵素、例えば、チオエステラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＫＳ触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコード化する複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＣＬＴ触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコード化する複数の異種ヌクレオチド配列を含む。

【0145】

特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小の芳香族ＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素、及びＡＣＰ活性を含む酵素のそれぞれをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小の芳香族ＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、及びＡＣＰ活性を含む酵素のそれぞれをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。更に別の特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新規のポリケチド合成のためのモジュール芳香族ＰＫＳ系、例えば、ＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む１つ以上の酵素、及びＡＣＰ活性を含む１つ以上の酵素のそれぞれをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小のＰＫＳ系、例えば、最小の芳香族ＰＫＳ系又は最小のモジュールＰＫＳ系を含み、最終産物ポリケチドの産生に寄与し得る追加的酵素活性を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新生ポリケチド骨格鎖の環化を容易にするシクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、アロマターゼ（ＡＲＯ）触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰのパンテテイン化に影響を及ぼすホロ−ＡＣＰシンターゼを含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、合成後ポリケチド修飾活性を付与する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、例えば、抗生剤活性を有するポリケチドが望ましい場合、合成後のポリケチドの修飾に影響を及ぼすグリコシラーゼ活性を含む酵素をコード化する異種ヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ヒドロキシラーゼ活性を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エポキシダーゼ活性を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、メチラーゼ活性を含む酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を更に含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、少なくとも１つのポリケチド合成経路酵素、及びアセチル−ＣｏＡ化合物を修飾し、マクロライド、抗生剤、抗真菌剤、細胞増殖抑制化合物、抗コレステロール血症化合物、抗寄生虫化合物、抗コクシジウム化合物、動物成長促進剤又は殺虫剤等のポリケチド産物を形成することができる酵素が挙げられるが、これらに限定されない生合成酵素をコード化する１つ以上の異種ヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物はポリエンである。いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、環式ラクトンである。いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、１４、１５、又は１６員のラクトン環を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、ポリケチドマクロライド、抗生剤、抗真菌剤、細胞増殖抑制化合物、抗コレステロール血症化合物、抗寄生虫化合物、抗コクシジウム化合物、動物成長促進剤及び殺虫剤からなる群から選択される。

【0149】

いくつかの実施形態では、ポリケチド産生細胞は、例えば、ＰＫＳ酵素及び限定されるものではないが、以下のポリケチドから選択されるポリケチドを産生することが可能なポリケチド修飾酵素をコード化する配列である異種ヌクレオチド配列を含み、ポリケチドは：アベルメクチン（例えば、米国特許第５，２５２，４７４号；同第４，７０３，００９号、欧州特許出願公開第１１８，３６７号；ＭａｃＮｅｉｌら著，１９９３，「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」；Ｂａｌｔｚ，Ｈｅｇｅｍａｎ，＆ Ｓｋａｔｒｕｄ編集，（ＡＳＭ），２４５−２５６頁，「Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ ｆｏｒ Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ，Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ」；ＭａｃＮｅｉｌら著，１９９２，Ｇｅｎｅ １１５：１１９−１２５；及びＩｋｅｄａ及びＯｍｕｒａ著，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．９７：２５９９−２６０９を参照）；カンジシジン（ＦＲ００８）（例えば、Ｈｕら著，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１６３−１７２を参照）；カルボマイシン、クラマイシン（例えば、Ｂｅｒｇｈら著，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２年２月；１５（１）：８０−９を参照）；ダウノルビシン（例えば、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４年１０月；１７６（２０）：６２７０−８０を参照）；エポチロン（例えば、国際公開第９９／６６０２８号；及び同第００／０３１２４７号を参照）；エリスロマイシン（例えば、国際公開第９３／１３６６３号；米国特許第６，００４，７８７号；同第５，８２４，５１３号；Ｄｏｎａｄｉｏら著，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：６７５−９；及びＣｏｒｔｅｓら著，Ｎｏｖ．８，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：１７６−８を参照）；ＦＫ−５０６（例えば、Ｍｏｎｔａｍｅｄｉら著，１９９８；Ｅｕｒ． Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：５２８−５３４；及びＭｏｎｔａｍｅｄｉら著，１９９７；Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：７４−８０を参照）；ＦＫ−５２０（例えば、国際公開第００／０２０６０１号；及びＮｉｅｌｓｅｎら著，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：５７８９−９６を参照）；グリセウシン（例えば、Ｙｕら著，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４年５月；１７６（９）：２６２７−３４を参照）；ロバスタチン（例えば、米国特許第５，７４４，３５０号を参照）；フレノリシン（例えば、Ｋｈｏｓｌａら著，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９３年４月；１７５（８）：２１９７−２０４；及びＢｉｂｂら著，Ｇｅｎｅ １９９４年５月 ３；１４２（１）：３１−９を参照）；グラナチシン（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎら著，ＥＭＢＯ Ｊ．１９８９年９月；８（９）：２７１７−２５；及びＢｅｃｈｔｏｌｄら著，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９５年９月 ２０；２４８（５）：６１０−２０を参照）；メデルマイシン（例えば、Ｉｃｈｉｎｏｓｅら著，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３年７月；１４９（Ｐｔ７）：１６３３−４５を参照）；モネンシン（例えば、Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈら著，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９２年８月；２３４（２）：２５４−６４を参照）；ノナクチン（例えば、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０００年２月 １；１８３（１）：１７１−５を参照）；ナナオマイシン（例えば、Ｋｉｔａｏら著，Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（東京）．１９８０年７月；３３（７）：７１１−６を参照）；ネマデクチン（例えば、ＭａｃＮｅｉｌら著，１９９３，前述を参照）；ニッダマイシン（例えば、国際公開第９８／５１６９５号；及びＫａｋａｖａｓら著，１９９７，Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７５１５−７５２２を参照）；オレアンドマイシン（例えば、Ｓｗａｎら著，１９９４，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：３５８−３６２；国際公開第００／０２６３４９号；Ｏｌａｎｏら著，１９９８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９（３）：２９９−３０８；及びＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ ９９／０５２８３号を参照）；オキシテトラサイクリン（例えば、Ｋｉｍら著，Ｇｅｎｅ．１９９４年４月８；１４１（１）：１４１−２を参照）；ピクロマイシン（例えば、国際公開第９９／６１５９９号；同第００／００６２０号；Ｘｕｅら著，１９９８，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（１１）：６６１−６６７；Ｘｕｅら著，１９９８年１０月，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２１１１ １２１１６を参照）；プラテノリド（例えば、欧州特許出願公開第７９１，６５６号；及び米国特許第５，９４５，３２０号を参照）；ラパマイシン（例えば、Ｓｃｈｗｅｅｋｅら著，１９９５年８月，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８３９−７８４３；及びＡｐａｒｉｃｉｏら著，１９９６，Ｇｅｎｅ １６９：９−１６を参照）；リファマイシン（例えば、国際公開第ＷＯ ９８／０７８６８号；及びＡｕｇｕｓｔら著，１９９８年２月１３日，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（２）：６９−７９を参照）ソランジウム（例えば、米国特許第６，０９０，６０１号）；ソラフェン（例えば、米国特許第５，７１６５，８４９号；Ｓｃｈｕｐｐら著，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３６７３−３６７９）；を参照）；スピノシン（例えば、国際公開第９９／４６３８７号を参照）；スピラマイシン（例えば、米国特許第５，０９８，８３７号を参照）；テトラセノマイシン（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら著，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２年３月；１７４（６）：１８１０−２０；及びＳｈｅｎら著，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２年６月；１７４（１１）：３８１８−２１を参照）；テトラサイクリン（例えば、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ２００９年１２月 ９；１３１（４８）：１７６７７−８９を参照）；チロシン（例えば、米国特許第５，８７６，９９１号；同第５，６７２，４９７号；同第５，１４９，６３８号；欧州特許出願公開第７９１，６５５号；同第２３８，３２３号；Ｋｕｈｓｔｏｓｓら著，１９９６，Ｇｅｎｅ １８３：２３１−６；及びＭｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ及びＣｕｎｄｌｉｆｆｅら著，１９９４，Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：３４９−３５５を参照）；並びに６−メチルサリチル酸（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら著，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．１９９９年４月；１（２）：１８０−７；及びＳｈａｏら著，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００６年６月２３日；３４５（１）：１３３−９を参照）である。
６．６ 脂肪酸の産生

【0150】

いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は脂肪酸である。脂肪酸は、脂肪酸シンターゼによって触媒されたアセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡから一連の脱カルボキシル化クライゼン縮合によって合成される。ポリケチドシンターゼと同様に、脂肪酸シンターゼは、単一の酵素ではなく、その中で基質が１つの機能性ドメインから次の機能性ドメインまで手渡される２７２ｋＤａの多官能性ポリペプチドから構成された酵素系である。脂肪酸シンターゼの２つの主要なクラスが特性化されていて：Ｉ型脂肪酸シンターゼは、哺乳類及び真菌類に共通の単一の多官能性ポリペプチド（真菌及び哺乳類シンターゼの構造的配置は異なるが）並びに細菌（コリネバクテリア、マイコバクテリア、及びノカルジア）のＣＭＮ基である。古細菌及び真正細菌で見られるＩＩ型シンターゼは、脂肪酸の合成に関与する一連の別々の単官能性酵素である。脂肪酸伸長及び還元の機構は、これら触媒事象を担う酵素ドメインが２つのクラスの間で大部分は相同であるために、酵素ドメインシンターゼの２つのクラスで同一である。

【0151】

脱カルボキシル化クライゼン縮合における脂肪酸鎖の伸長の一巡後に、ケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、及びエノールレダクターゼの連続作用によって、β−ケト基が完全に飽和された炭素鎖に還元される。成長する脂肪酸鎖は、アシルキャリアタンパク質に連結されたこれら活性部位間で移動し、１６の炭素鎖の長さ（パルミチン酸）に到達した際にチオエステラーゼの作用によって最終的には放出される。

【0152】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、少なくとも１つの脂肪酸合成経路酵素、及びアセチル−ＣｏＡ化合物を修飾して、パルミテート、パルミトイルＣｏＡ、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、及びドコサヘキサエン酸等の脂肪酸産物を形成することができる酵素が挙げられるが、これらに限定されない生合成酵素をコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、パルミテート、パルミトイルＣｏＡ、パルミトオレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される脂肪酸である。

【0153】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、アシルキャリアタンパク質で、アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの少なくとも１つに共有結合することができる酵素、例えば、アシルト−ランスフェラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、それぞれがアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）に結合されたアセチル化学的部分とマロニル化学的部分とを縮合して、アセトアセチル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えば、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、アセトアセチル−ＡＣＰ中の二重結合をＮＡＤＰＨで還元し、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰ中のヒドロキシル基を形成することができる酵素、例えばβ−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰを脱水し、β−炭素及びγ−炭素の間に二重結合を形成してクロトニル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えばβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、クロトニルＡＣＰをＮＡＤＰＨで還元し、ブチリル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えばエノイルＡＣＰレダクターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝的に修飾された微生物は、アシルキャリアタンパク質からＣ１６アシル化合物を加水分解し、パルミテートを形成することができる酵素、例えばチオエステラーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、遺伝的に非修飾の親細胞と比較するとき、１つ以上の脂肪酸の産生の増加をもたらすために、アセチル−ＣｏＡシンターゼ及び／又はマロニル−ＣｏＡシンターゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。

【0160】

例えば、アセチル−ＣｏＡ産生を増加させるために、以下の１つ以上の遺伝子が細胞中で発現され得：これらはｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ（ピルベート及び２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ複合体のＥＩｐデヒドロゲナーゼ成分及びＥ２ｐジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分をコード化する）、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、及びｆａｂＦである。かかる酵素をコード化するヌクレオチド配列の例示的な例としては、ｐｄｈ（ＢＡＢ３４３８０、ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｐａｎＫ（ｃｏａＡとしても知られる、ＡＡＣ７６９５２）、ａｃｅＥＦ（ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｆａｂＨ（ＡＡＣ７４１７５）、ｆａｂＤ（ＡＡＣ７４１７６）、ｆａｂＧ（ＡＡＣ７４１７７）、ａｃｐＰ（ＡＡＣ７４１７８）、ｆａｂＦ（ＡＡＣ７４１７９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0161】

いくつかの実施形態では、増加した脂肪酸レベルは、脂肪酸分解に関与するタンパク質をコード化する遺伝子を減衰する又はノックアウトすることによって、細胞中でもたらされ得る。例えば、ｆａｄＥ、ｇｐｓＡ、ｉｄｈＡ、ｐｆｌｂ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ａｃｋＡ、及び／又はａｃｋＢの発現レベルは、当該技術分野で既知の技術を使用して、操作された宿主細胞中で減衰され又はノックアウトされ得る。かかるタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の例示的な例としては、ｆａｄＥ（ＡＡＣ７３３２５）、ｇａｐＡ（ＡＡＣ７６６３２）、ＩｄｈＡ（ＡＡＣ７４４６２）、ｐｆｌｂ（ＡＡＣ７３９８９）、ａａｈＥ（ＡＡＣ７４３２３）、ｐｔａ（ＡＡＣ７５３５７）、ｐｏｘＢ（ＡＡＣ７３９５８）、ａｃｋＡ（ＡＡＣ７５３５６）、及びａｃｋＢ（ＢＡＢ８１４３０）が挙げられるが、これらに限定されない。得られた宿主細胞は、適切な環境において増殖される場合、増加したアセチル−ＣｏＡ産生レベルを有するであろう。

【0162】

いくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに転換することができる酵素、例えばマルチサブユニットＡｃｃＡＢＣＤタンパク質をコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。ＡｃｃＡＢＣＤをコード化する好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、限定されないが、寄託番号ＡＡＣ７３２９６，ＥＣ６．４．１．２が挙げられる。

【0163】

いくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、リパーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列を含む。リパーゼをコード化する異種ヌクレオチド配列としては、寄託番号ＣＡＡ８９０８７及びＣＡＡ９８８７６が挙げられるが、これらに限定されない。

【0164】

いくつかの実施形態では、脂肪酸レベルの増加は、脂肪酸生合成経路における初期段階を阻害する（例えば、ａｃｃＢＣＤ、ｆａｂＨ、及びｆａｂＩ）、長鎖アシル−ＡＣＰのレベルにおける増加に導くことができるＰｌａＢを阻害することによって、細胞中でもたらされ得る。ＰｌａＢの発現レベルは、当該技術分野で既知の技術を使用して、操作された宿主細胞中で減衰され又はノックアウトされ得る。ＰｌｓＢをコード化する好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、限定されないが、寄託番号ＡＡＣ７７０１１が挙げられる。特定の実施形態では、細胞中の利用可能なアセチル−ＣｏＡの量を増加させるようｐｌｓＢ Ｄ３１ ＩＥ突然変異が使用され得る。

【0165】

いくつかの実施形態では、一価不飽和脂肪酸の産生の増加は、ｆａｂＡの抑制をもたらすｓｆａ遺伝子を過発現させることによって、細胞中でもたらされ得る。ｓｆａをコード化する好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、限定されないが寄託番号ＡＡＮ７９５９２が挙げられる。

【0166】

いくつかの実施形態では、脂肪酸レベルの増加は、脂肪酸基質の鎖長を制御する酵素、例えばチオエステラーゼの発現を調整することによって、細胞中でもたらされ得る。いくつかの実施形態では、脂肪酸産生細胞は、ｔｅｓ又はｆａｔ遺伝子を過発現するよう修飾された。好適なｔｅｓヌクレオチド配列の例示的な例としては、寄託番号：（大腸菌からのｔｅｓＡ：ＡＡＣ７３５９６で、Ｃ_１８：１脂肪酸の産生が可能）及び（大腸菌からのｔｅｓＢ：ＡＡＣ７３５５５）が挙げられるが、これらに限定されない。好適なｆａｔヌクレオチド配列の例示的な例としては、（ウンベルラリア・カリフォルニア（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのｆａｔＢ：Ｑ４１６５３及びＡＡＣ３４２１５で、Ｃ_１２：０脂肪酸の産生が可能）、（ｆａｔＢ２：メキシコ低木＝クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）からのＱ３９５１３及びＡＡＣ４９２６９で、Ｃ_８：０〜Ｃ_１０：０脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＢ３；メキシコ低木＝クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）からのＡＡＣ４９２６９及びＡＡＣ７２８８１で、Ｃ_１４：０〜Ｃ_１６：０脂肪酸を産生することが可能）、（ｆａｔＢ：クスノキ＝シンナモナム・カンフォラム（Ｃｉｎｎａｍｏｎｕｍ ｃａｍｐｈｏｒｕｍ）からのＱ３９４７３及びＡＡＣ４９１５１で、Ｃ_１４：０脂肪酸の産生が可能）、（ｆａｔＢ［Ｍ１４１Ｔ］：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＣＡＡ８５３８８で、Ｃ_１６：１脂肪酸を産生可能）、（ｆａｔＡ：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＮＰ１８９１４７及びＮＰ１９３０４１で、Ｃ_１８：１脂肪酸を産生可能）、（ｆａｔＡ：根粒菌＝ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）からのＣＡＣ３９１０６で、Ｃ_１８：１脂肪酸を優先的に産生することが可能）、（ｆａｔＡ：メキシコ低木＝クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）からのＡＡＣ７２８８３で、Ｃ_１８：１脂肪酸を産生することが可能）、及び（ｆａｔＡ１：ヒマワリ＝ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）からのＡＡＬ７９３６１）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0167】

いくつかの実施形態では、Ｃ_１０脂肪酸のレベルの増加は、当該技術分野で既知の技術を使用して、チオエステラーゼＣ_１８の発現又は活性を減衰させることによって、細胞中でもたらされ得る。チオエステラーゼＣ_１８をコード化する好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、寄託番号ＡＡＣ７３５９６及びＰ０ＡＤＡ１が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、Ｃ_１０脂肪酸のレベルの増加は、当該技術分野で既知の技術を使用して、チオエステラーゼＣ_１０の発現又は活性を増加させることによって、細胞中でもたらされ得る。チオエステラーゼＣ_１０をコード化する好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、寄託番号Ｑ３９５１３が挙げられるが、これに限定されない。

【0168】

いくつかの実施形態では、Ｃ_１４脂肪酸のレベルの増加は、当該技術分野で既知の技術を使用して、非Ｃ_１４脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現又は活性を減衰させることによって、細胞中でもたらされ得る。他の実施形態では、Ｃ_１４脂肪酸のレベルの増加は、当該技術分野で既知の技術を使用して、基質Ｃ_１４−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現又は活性を増加させることによって、細胞中でもたらされ得る。かかるチオエステラーゼをコード化する好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、寄託番号Ｑ３９４７３が挙げられるが、これに限定されない。

【0169】

いくつかの実施形態では、Ｃ_１２脂肪酸のレベルの増加は、当該技術分野で既知の技術を使用して、非Ｃ_１２脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現又は活性を減衰させることによって、細胞中でもたらされ得る。他の実施形態では、Ｃ_１２脂肪酸のレベルの増加は、当該技術分野で既知の技術を使用して、基質Ｃ_１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現又は活性を増加させることによって、細胞中でもたらされ得る。かかるチオエステラーゼをコード化する好適なヌクレオチド配列の例示的な例としては、寄託番号Ｑ４１６３５が挙げられるが、これに限定されない。
６．７ 細胞の保管方法

【0170】

いくつかの実施形態では、ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞は、低いパントテネート化合物又はパントテネート化合物不在の培地中で保管される場合、より生存可能でかつ健康である。特に、かかる細胞は、パントテネート化合物を含まない、又は低いパントテネート化合物濃度中で保管される場合、好適な増殖培地中に接種後により良好に増殖し、産生ステージ中に、より多量のＨＡＣＤ化合物を産生する。

【0171】

したがって、別の態様では、本明細書に提供されるものは、ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞を保管する方法であって、この方法は、遺伝的に修飾された宿主細胞を含む組成物と、同化性炭素、窒素及びリン酸塩源並びに０μモル／リットルと１０μモル／リットルとの間のパントテネート化合物を含む保存培地を調製することと、この組成物を凍結することとを含む。特定の実施形態では、保存培地は、検出可能なパントテネート化合物を含有しない。別の特定の実施形態では、保存培地は、１部のグリセロール：３部の培養基から３部のグリセロール：１部の培養基までの間の範囲の量で、グリセロールを含む。別の特定の実施形態では、保存培地は、−８０℃で凍結される。

【0172】

別の態様では、本明細書に提供されるものは、同化性炭素、窒素及びリン酸塩源並びに０μモル／リットルと１０μモル／リットルとの間のパントテネート化合物を含有する保存培地である。特定の実施形態では、保存培地は、検出可能なパントテネート化合物を含有しない。別の特定の実施形態では、保存培地は、１部のグリセロール：３部の培養基から３部のグリセロール：１部の培養基までの間の範囲の量で、グリセロールを含む。別の特定の実施形態では、保存培地は、−８０℃で凍結される。別の特定の実施形態では、保存培地は、ＨＡＣＤ化合物を産生することが可能な遺伝的に修飾された宿主細胞を含む。

【実施例】

【0173】

７． 実施例
７．１ 実施例１
この実施例は、酵母細胞培養の細胞密度（ＯＤ_６００）を決定するための例示的方法を記載する。

【0174】

細胞培養の８μＬのサンプルを、透明な９６−ウェルプレート中で、９２μＬのＴｒｉｔｏｎ ＯＤ希釈剤（２０ｇ／ＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、２００ｍＬ／ＬのＰＥＧ ２００、２００ｍＬ／Ｌの１００％エタノール、残部の水）と合わせて、この溶液を、１，０００ＲＰＭで６分間撹拌し、Ｍ５分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で６００ｎｍにての吸光度を測定することによって、ＯＤ_６００を決定した。
７．２ 実施例２

【0175】

この実施例は、酵母細胞培養のファルネセン力価を決定するために有用な例示的Ｎｉｌｅ Ｒｅｄベースの方法を記載する。

【0176】

細胞培養の９８μＬのサンプルを９６−ウェルの黒色ポリスチレン平底アッセイプレートに移し、ＤＭＳＯ中１００μｇ／ｍＬで溶解したＮｉｌｅ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の２μＬを各ウェルに加えた。蛍光レベルを、５００ｎｍの励起及び５５０ｎｍの放射によりＭ５分光光度計で直ちに測定した。
７．３ 実施例３

【0177】

この実施例は、酵母細胞培養のファルネセンス力価を決定するために有用な、例示的ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）ベースの方法を記載する。

【0178】

サンプルをメタノール−へプタン（１：１ｖ／ｖ）で抽出し、混合物を遠心分離して、細胞物質を除去した。メタノール−へプタン抽出物のアリコートを０．００１％のｔ−カリオフィレン（これは、特定のＧＣオーブンプロファイル中の有効な注入及び溶出を監視するための保持時間マーカーとして働く）を有するｎ−へプタン中に希釈し、次いで、パルス分割注入を使用して、メチルシリコーン固定相上に注入した。ファルネセンを、炎イオン化検出（ＦＩＤ）を備えたＧＣを用いて、沸点で分離した。
７．４ 実施例４

【0179】

この実施例は、発酵プロセスの産生ステージにおける増強されたＨＡＣＤ化合物産生に続く、第１の種培養中に構築されたバイオマスを増強させるための構築パントテネート化合物の非遺伝的スイッチとしての使用を例示する。
ａ）種培養の調製
２％ショ糖ＢＳＭ（バイオマス構築培地）及び０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含有するよう種培地を調製した。種培地のｐＨをＮａＯＨ溶液でｐＨ７．０に調整した。この培地（２５０ｍＬ）を滅菌し、遺伝的に修飾された宿主細胞の１つの種バイアルで接種し、好気条件下、３４℃で２４〜３６時間インキュベートした。
ｂ）主発酵プロセス
２リットルの槽サイズを有する撹拌した発酵槽を、２％のショ糖及び１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含有する無菌産生細胞培養培地で充填した。発酵を好気条件下３４℃で６日間にわたって実行し、ＨＡＣＤ産物の産生を最大化させた。
７．５ 実施例５

【0180】

この実施例は、高レベルの例示的異種ＨＡＣＤ二次代謝産物を産生するよう操作された酵母細胞の培養中で、バイオマス収率が増加され得、異種二次代謝産物の産生が、外因的に供給された（Ｒ）−パントテネートの量を低減させることによって、減少し得ることを立証する。

【0181】

酵母株Ｙ４６８９及びＹ４３５２は、それぞれが、以下のＭＥＶ経路の酵素：ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ、及びファルネセンシンターゼが挙げられる異種酵素を含む。これら菌株は、例示的異種ＨＡＣＤ二次代謝産物（ファルネセン）をそれぞれ１５％及び１３％の収率で産生することが可能である。

【0182】

酵母株Ｙ４６８９及びＹ４３５２からの細胞を、指数的に増殖する培養から採取し、水で３回洗浄し、次いで０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含む２％ショ糖ＢＳＭ中に再懸濁させた。それぞれの細胞懸濁液から採取した１５μＬを、１０ｍｇ／Ｌ（１００％）、１ｍｇ／Ｌ（１０％）、０．２ｍｇ／Ｌ（２％）、０．１ｍｇ／Ｌ（１％）、０．０２ｍｇ／Ｌ（０．２％）、０．０１ｍｇ／Ｌ（０．１％）、０．００１ｍｇ／Ｌ（０．０１％）、又は０ｍｇ／ＬのＤ−パントテネートのいずれかを含む２％ショ糖ＢＳＭの３６０μＬを含有する９６−ウェルプレートのウェルからなるバイオマス構築培養に加えた。バイオマス構築培養を、１，０００ｒｐｍでのＡＴＰシェーカー中８０％の湿度にて、及び３４℃で４８時間インキュベートし、この時点で培養はその最大ＯＤ_６００に到達した。次いでバイオマス構築培養を、同一の培地を含有する第２の９６−ウェルプレートのウェル及び第１の９６−ウェルプレートのようなプレート配置からなる産生培養に入れて、１：２５で希釈した。産生培養を１，０００ｒｐｍでのＡＴＰシェーカー中で、８０％の湿度、及び３４℃で４８時間インキュベートし、この時点でサンプルを各ウェルから取り出し、上記の実施例１及び２で記載された通りに、それぞれ最終バイオマス（すなわち、最終細胞密度）及びファルネセン力価を測定した。

【0183】

図３Ａ及び３Ｂは、パントテネートレベルがバイオマス構築及び産生培養中で低減された場合、双方の菌株が、ファルネセンを産生するそれらの能力で大幅に削減されたこと、並びに例示的ＨＡＣＤ（ファルネセン）の産生におけるこの減少は、最終細胞バイオマスにおける増加が伴われたことを示す。これら結果は、ＨＡＣＤ化合物産生を効果的に減少させるためにパントテネートは培養基から制限されるか省かれることができ、ＨＡＣＤ化合物産生を誘導又は増強させるために、パントテネートが添加されることができることを裏付けている。
７．６ 実施例６

【0184】

この実施例は、商業的量のＨＡＣＤ化合物を産生することが可能である酵母株が、外部的に供給されるペントテネート化合物の不在下で良好に培養する予期せぬ行動示すことを例示する。これとは対照的に、野生型酵母及びより少量のＨＡＣＤ化合物を産生する酵母株は、外部的に供給されるパントテネート化合物の存在下で、その不在下よりも良好な増殖の行動を示す。

【0185】

酵母株Ｙ４７２０及びＹ５０３８は、それぞれが、以下のＭＥＶ経路の酵素：ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ、及びファルネセンシンターゼが挙げられる異種酵素を含む。菌株Ｙ４７２０は収率１４％でファルネセンを産生することが可能であり、一方菌株５０３８は、約半分未満の６％でファルネセンを産生することが可能である。菌株Ｙ２２０５は、いずれのファルネセンも産生しないＣＥＮ．ＰＫ２野生型対照である。

【0186】

Ｙ４７２０、Ｙ５０３８、及びＹ２２０５の指数的に増殖する培養を、無菌ＰＢＳで１のＯＤ_６００まで希釈し、各希釈物の２０μＬを、ウェル当たり１８０μＬの無菌ＰＢＳを含有する９６−ウェルの列１のウェルに移した。マルチチャンネルピペットを使用して、列１の２０μを列２等に移し、プレート全体で１：１０の段階希釈物を得た。最終的に、滅菌した４８本の爪のピン止めツールを使用して、９６ウェルプレートからの培養物を、０．４ｍｇ／Ｌ又は０．００２ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートのいずれかを含有するＣＳＭ寒天プレート上にスタンプした。この寒天プレートを３０℃で１１２時間インキュベートし、コロニー成長を監視した。

【0187】

図４に示すように、Ｙ４７２０のコロニーは、０．４ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートの存在下では、他の２つの菌株のコロニーよりも小さかったが、０．００２ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートの存在下では大きく、このことは、菌株Ｙ５０３８及びＹ２２０５と比較して、菌株Ｙ４７２０はより低い（Ｒ）−パントテネート濃度を含む寒天上でより高い増殖速度を有したことを示唆している。同様な結果が、カルシウムＤ−パントテネートを完全に欠如した寒天プレートを使用して得られた。
７．７ 実施例７

【0188】

この実施例は、（Ｒ）−パントテネートを省くことが、高レベルの異種ＨＡＣＤ二次代謝産物を産生するよう遺伝的に操作された酵母細胞の増殖速度を増加させ、かつ低レベルの異種二次代謝産物を産生するよう遺伝的に操作された酵母細胞の増殖速度を低下させることを裏付ける。

【0189】

ＭＥＶ経路酵素：ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ、及びファルネセンシンターゼが挙げられる異種酵素を含み、例示的ＨＡＣＤ化合物（ファルネセン）を産生することが可能な多数の酵母菌種の４つの個々のコロニーを、１０ｍｇ／Ｌ又は０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートのいずれかを含む２％ショ糖ＢＳＭの３６０μＬを含有する９６−ウェルプレートからなるバイオマス構築培養中に接種した。このバイオマス構築培養を、１，０００ｒｐｍでのＡＴＲシェーカーで及び８０％の湿度にて、３４℃で７２時間増殖させて、この時点で培養がその最大ＯＤ_６００まで到達した。次いで、このバイオマス構築培養を、１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含む４％ショ糖ＢＳＭの３６０Ｌを含有する９６−ウェルプレートの第２のセットのウェルからなる産生培養に、１：２５で希釈した。産生培養を１，０００ｒｐｍでのＡＴＰシェーカーで、８０％の湿度、及び３４℃で４８時間インキュベートし、この時点でサンプルを各ウェルから取り出し、上記の実施例１及び３で記載された通りに、最終バイオマス（すなわち、最終細胞密度）及びファルネセン力価を測定した。

【0190】

図５に示すように、１２％を超える収率でファルネセンを産生した菌株は、より高い（Ｒ）−パントテネート濃度においてよりもより低い（Ｒ）−パントテネート濃度において、より大きいバイオマス収率を有した。１２％未満の収率でファルネセンを産生する菌株については、この逆が当てはまった。
７．８ 実施例８

【0191】

この実施例は、発酵プロセスの両構築及び産生ステージ間で、パントテネートが培養基中に存在し、したがってＨＡＣＤ化合物産生が「オン」状態にある場合に起こる菌株退化の現象を立証する。

【0192】

いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路酵素：ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ、及びファルネセンシンターゼが挙げられる異種酵素を含み、例示的ＨＡＣＤ化合物（ファルネセンス）を産生することが可能な酵母菌種の凍結した細胞懸濁液の１ｍｌバイアルを解凍し、２％のショ糖及び１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含有するＢＳＭ ２．０の５０ｍｌを入れた２５０ｍＬのバッフルフラスコに移し、シェーカー内で３４℃、２００ＲＰＭで２４時間増殖させた。次いで全培養物を、２％のショ糖及び１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含有するＢＳＭ ２．０の８５０ｍｌを入れた２．８ＬのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコに移し、シェーカー内で３４℃、２５０ＲＰＭで２４時間増殖させた。次いで全培養物を２Ｌの発酵槽に移した。発酵槽への栄養供給は、１４ｇ／Ｌ／時の糖に等しい最初のパルスで供給された、１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含む未定義のブラジルサトウキビシロップ培地であった。次いで、供給速度は、溶解された酸素の上昇によって指示されるような、炭素の発酵槽の需要に基づいて、自己調整される。発酵を、３４℃の一定温度、４．５の一定ｐＨ（水酸化ナトリウムの添加によって制御された）、及び２００ミリモルＯ_２／Ｌ／時の初期酸素移動速度で、溶解酸素が０％に到達するまで、微好気的に実行し、次いで残部の発酵のために１００ミリモルＯ_２／Ｌ／時に低下させた。３日毎に、オーバーフローを防止するために、タンクの容量を０．９Ｌまで減らす。サトウキビシロップ供給物中で損なわれた微量金属及びビタミンは、このときに補充される。産生されたファルネセンの量及び細胞による総消費の量を毎日監視し、これら２つの値の比（すなわち、糖を引いた産物収率）を７３時間毎の時間について決定し、図６に示すようにプロットする。培養の産物収率は、２１日目までに、６日目でのそのピークからこのピークの＜６５％まで下落する。
７．９ 実施例９

【0193】

この実施例は、例示的ＨＣＤ化合物を産生するよう遺伝的に操作された酵母細胞の増殖及び保存中に（Ｒ）−パントテネートを省くことが、酵母による異種二次代謝産物の産生を増加させることを裏付ける。

【0194】

酵母菌株Ｙ４９５４は、ＭＥＶ経路酵素：ＩＰＰイソメラーゼ、ＦＰＰシンターゼ、及びファルネセンシンターゼが挙げられる異種酵素を含む。この酵母菌株は、収率１３．６％でファルネセンを産生することが可能である。

【0195】

種バイアルの２つのセットを、Ｙ４９５４細胞の単一コロニーの半分を、１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含む２％ショ糖ＢＳＭ（種バイアル培地）の１５ｍＬが入った１２５ｍＬの振蕩フラスコに接種することによって調製し（種バイアル培地、「＋」）、他の半分を、０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含む２％のショ糖ＢＳＭ（種バイアル培地）の１５ｍＬが入った１２５ｍＬの振蕩フラスコに接種することによって調製した（種バイアル培地、「−」）。細胞を、４と９の間のＯＤ_６００に到達するまで、かつ残留ショ糖が３〜６ｇ／Ｌ周辺になるまで、２００ｒｐｍでのシェーカー内で３０℃にて増殖させた。２部の無菌５０％グリセロール溶液を３部の細胞ブロスに加え、懸濁液を種バイアルに小分けし、種バイアルをおよそ−１℃／分の速度でゆっくりと−８０℃に凍結させた。

【0196】

１つの種バイアルを、１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネート（バイオマス構築培地、「＋」）又は０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネート（バイオマス構築培地、「−」
）のいずれかを含む２％ショ糖ＢＳＭ（バイオマス構築培地）の５０ｍＬを入れた２５０ｍＬ振蕩フラスコ中で解凍することによって、並びにこの培養を３４℃及び２００ＲＰＭで２４時間にわたって増殖させることによって、バイオマス構築を達成した。次いで培養物を、８００ｍＬの同一の培地が入った１Ｌのフラスコに移し、更に４８時間増殖させた。

【0197】

例示的ＨＡＣＤ化合物（ファルネセン）の産生については、種構築培養を、１０ｍｇ／ＬのカルシウムＤ−パントテネートを含む産生培地（産生培地、「＋」）が入った２Ｌのベンチトップ発酵槽に移し、ファルネセン収率を最大化する供給プロトコルに従って、培養を６日間にわたってインキュベートした。

【0198】

表１に示すように、Ｙ４９５４細胞は、（Ｒ）−パントテネートが種バイアル培地から省かれた場合、より高いファルネセン収率を生じた。Ｙ４９５４細胞は、（Ｒ）−パントテネートがまたバイオマス構築培地から省かれた場合でも、更に高いファルネセン収率を生じた。

【0199】

表１はまた、種バイアル及びバイオマス構築培地において（Ｒ）−パントテネートを省くことは、産生段階中に（Ｒ）−パントテネートを供給する場合、宿主細胞がファルネセンを産生するための能力を不可逆的に危険にさらすことはない。実際には、低減された（Ｒ）−パントテネートを有する又は（Ｒ）−パントテネートを含まない種培地及びバイオマス構築培地、続いて（Ｒ）−パントテネートを含有する産生培地中での産生段階培養の使用が、異種ＨＡＣＤ化合物の最適な産生をもたらす。

【表1】

【0200】

本明細書で引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれるよう具体的かつ個別的に指示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本開示の範囲及び精神から逸脱することなく、各種の改変及び変更を加えることは、当業者には自明のことであろう。本開示は、理解を明確にするために例示及び実施例として若干の詳細をもって記載されてきたが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び改変がこれらになされてもよいこと、並びに特許請求の範囲は、かかる特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことが、本明細書に提供された教示を考慮して、当業者には容易に明らかであろう。実際に、本開示を実行するための記載されたモードの種々の改変は、当業者に理解されるものであり、これらは特許請求の範囲の範囲内であるよう意図されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】