特許 5989641 リポタンパク質製剤及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5989641

(24)【登録日】2016年8月19日

(45)【発行日】2016年9月7日

(54)【発明の名称】リポタンパク質製剤及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/00 20060101AFI20160825BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160825BHJP

   A61K 31/575 20060101ALI20160825BHJP

   A61K 31/685 20060101ALI20160825BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20160825BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20160825BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20160825BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/02

   A61P43/00 121

   A61K37/22

   A61K31/575

   A61K31/685

   A61P9/00

   A61P3/06

   A61P9/10 103

   A61P9/10 101

【請求項の数】10

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2013-516907(P2013-516907)

(86)(22)【出願日】2011年6月30日

(65)【公表番号】特表2013-529648(P2013-529648A)

(43)【公表日】2013年7月22日

(86)【国際出願番号】AU2011000819

(87)【国際公開番号】WO2012000048

(87)【国際公開日】20120105

【審査請求日】2014年6月20日

(31)【優先権主張番号】61/359,925

(32)【優先日】2010年6月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500021413

【氏名又は名称】シーエスエル、リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】サミュエル・ライト

(72)【発明者】

【氏名】マルティン・インボーデン

(72)【発明者】

【氏名】ラインハルト・ボリ

(72)【発明者】

【氏名】マルセル・ヴェルクリ

【審査官】 天野 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０７−２４２６９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０７２２３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ３１／５７５

Ａ６１Ｋ ３１／６８５

Ａ６１Ｐ ３／０６

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アポリポタンパク質又はそのフラグメント；脂質；並びに、約０．５〜１．５ｇ／Ｌ及び約０．０１０〜０．０３０ｇ／ｇアポリポタンパク質からなる群から選択されるレベルの界面活性剤；を含んでなる再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）製剤であって、アポリポタンパク質がＡｐｏ−Ａ１であり、脂質がホスファチジルコリンであり、界面活性剤がコール酸ナトリウムである、ｒＨＤＬ製剤。

【請求項2】

界面活性剤のレベルが、約０．５〜１．５ｇ／Ｌである、請求項１に記載のｒＨＤＬ製剤。

【請求項3】

界面活性剤のレベルが、約０．０１５〜０．０３０ｇ／ｇアポリポタンパク質である、請求項１に記載のｒＨＤＬ製剤。

【請求項4】

製剤が安定剤をさらに含む、請求項１に記載のｒＨＤＬ製剤。

【請求項5】

アポリポタンパク質；脂質；及び界面活性剤；を含んでなるｒＨＤＬ製剤の製造方法であって、約０．５〜１．５ｇ／Ｌ及び約０．０１０〜０．０３０ｇ／ｇアポリポタンパク質からなる群から選択されるレベルで上記界面活性剤を提供する工程；を含み、アポリポタンパク質がＡｐｏ−Ａ１であり、脂質がホスファチジルコリンであり、界面活性剤がコール酸ナトリウムである、上記方法。

【請求項6】

界面活性剤のレベルが、約０．５〜１．５ｇ／Ｌである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

界面活性剤のレベルが、約０．０１５〜０．０３０ｇ／ｇアポリポタンパク質である、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

（Ａ）有機溶媒なしのホスファチジルコリン及びコール酸ナトリウムをＡｐｏ−Ａ１溶液に加える工程；
（Ｂ）工程（Ｉ）で調製された溶液中のコール酸ナトリウムのレベルを約０．０３ｇ／
ｇ Ａｐｏ−Ａ１に低下させる工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）の溶液に安定剤を加える工程；
を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

ヒトにおける心血管疾患、高コレステロール血症又は低コレステロール血症の１以上からなる群から選択される疾患、障害又は状態の治療に使用するための、アポリポタンパク質又はそのフラグメント；脂質；並びに、約０．５〜１．５ｇ／Ｌ及び約０．０１０〜０．０３０ｇ／ｇアポリポタンパク質からなる群から選択されるレベルの界面活性剤；を含んでなるｒＨＤＬ製剤であって、アポリポタンパク質がＡｐｏ−Ａ１であり、脂質がホスファチジルコリンであり、界面活性剤がコール酸ナトリウムである、ｒＨＤＬ製剤。

【請求項10】

疾患、障害又は状態には、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）、アテローム性動脈硬化症及び心筋梗塞が含まれる、請求項９に記載のｒＨＤＬ製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、再構成高密度リポタンパク質製剤に関する。より詳しくは、本発明は、低下された毒性を有する再構成高密度リポタンパク質製剤に関する。

【背景技術】

【0002】

高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、高密度（＞１．０６３ｇ／ｍＬ）と小さなサイズ（ストークス径＝５〜１７ｎｍ）を特徴とする脂質及びタンパク質を含有する異質リポタンパク質の一種である。さまざまなＨＤＬサブクラスは、脂質、アポリポタンパク質、酵素及び脂質輸送タンパク質（lipid transfer proteins）の量的及び質的内容において異なり、形状、密度、サイズ、電荷及び抗原性に違いが生じる。アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ−ＡＩ）は、主要なＨＤＬタンパク質であるが、Ａｐｏ−ＡＩＩ及びＡｐｏ−Ｖのような他のアポリポタンパク質も存在しうる。

【0003】

疫学的及び臨床的研究は、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルと心血管疾患のリスクの間に逆相関を確立した（非特許文献１に概説）。より詳しくは、再構成ＨＤＬ製剤の臨床投与は、発症間もない急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を患っている高コレステロール血症患者に有益な効果をもたらすことが示されている。

【0004】

典型的に、このような再構成ＨＤＬ製剤は、Ａｐｏ−ＡＩのようなタンパク質、ホスファチジルコリンのような脂質及びコラート又はデオキシコラートのような界面活性剤を含む。さらに、コレステロールを含むことがある。特許文献１に議論されたように、場合によっては、再構成ＨＤＬ製剤を製造するときに、脂質成分（例えばホスファチジルコリン）を溶解するために用いられる有機溶媒を用いることなく、再構成ＨＤＬ製剤を製造することは好都合でありうる。ＣＳＬ−１１１と称する、このタイプの再構成ＨＤＬ製剤は、臨床治験されたが、より高い用量の治療は、肝機能検査異常の後すぐに中断された。ＣＳＬ１１１で治療された患者は、プラークバーデン（plaque burden）指数における有益な傾向を示した。しかし、プラセボと比較したときに、アテローム体積率の変化又はプラーク体積の公称変化（nominal change）における統計的有意性は得られなかった（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第５，６５２，３３９号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Assmann et al., 2004, Circulation 109 III-8

【非特許文献2】Tardif et al., 2007, JAMA-Exp. 297 E1

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、先行技術の再構成ＨＤＬ製剤の１つ又はそれ以上の欠点を緩和又は回避する再構成ＨＤＬ製剤を提供することである。

【0008】

本発明の好ましい目的は、低下された又は最小限の毒性を有する再構成ＨＤＬ製剤を提供することである。

【0009】

本発明の別の好ましい目的は、冠動脈アテローム性動脈硬化症を含むが、これに限定されない疾患又は状態の予防的及び／又は治療的処置に有効である再構成ＨＤＬ製剤を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

大まかには、本発明は、毒性でないか、又は少なくとも比較的低い毒性を示すレベルでアポリポタンパク質、リン脂質及び界面活性剤を含むリポタンパク質製剤に関する。特定の実施態様において、界面活性剤及び脂質のレベルは、肝毒性を生じる、もたらす又は伴うそれより低いレベルである。

【0011】

一態様において、本発明は、アポリポタンパク質又はそのフラグメント；脂質；及びヒトに投与すると肝毒性を示すｒＨＤＬ製剤中に存在するレベルの約５〜５０％であるレベルで界面活性剤を含む、再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）製剤を提供する。

【0012】

別の態様において、本発明は、アポリポタンパク質；脂質；及び界面活性剤を含むｒＨＤＬ製剤の製造方法であって、ヒトに投与すると肝毒性を示すｒＨＤＬ製剤中に存在するレベルの約５〜５０％であるレベルで前記界面活性剤を準備する工程を含む前記方法を提供する。

【0013】

さらに別の態様において、本発明は、第１の態様による又は第２の態様の方法に従って製造されたｒＨＤＬをヒトに投与し、それによってヒトにおける疾患、障害又は状態を治療する工程を含む、ヒトにおける前記疾患、障害又は状態を治療する方法を提供する。

【0014】

なおさらに別の態様において、本発明は、ヒトにおける疾患、障害又は状態の治療に使用するための第１の態様による又は第２の態様の方法に従って製造されたｒＨＤＬ製剤を提供する。

【0015】

好ましくは、界面活性剤のレベルは、肝毒性を示すそれの約５〜１０％である。特定の実施態様において、これは約０．０３ｇ／ｇのアポリポタンパク質に相当する。

【0016】

好ましくは、界面活性剤は、胆汁酸塩又は胆汁酸である。より好ましくは、界面活性剤はコール酸ナトリウムである。

【0017】

アポリポタンパク質は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の標準的及び／又は機能的成分である任意のアポリポタンパク質であってもよい。アポリポタンパク質は、好ましくは約２０〜５０ｇ／Ｌの濃度である。好ましくは、アポリポタンパク質は、Ａｐｏ−Ａ１又はそのフラグメントである。

【0018】

適切には、脂質レベルは、肝毒性を生じる、又は伴うそれの約２０〜７０％である。好ましくは、脂質は約３０〜６０ｇ／Ｌの濃度である。特に好都合な脂質濃度は、約３０〜５０ｇ／Ｌ、又は特定の実施態様において、約３４又は４７ｇ／Ｌである。

【0019】

好ましくは、脂質はリン脂質である。より好ましくは、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）であるか、又はそれを含む。

【0020】

１つの好ましい実施態様において、アポリポタンパク質：脂質のモル比は、１：２０〜１：１００の範囲にある。より好ましくは、アポリポタンパク質：脂質のモル比は、１：４０〜１：７５の範囲にある。特に好都合なアポリポタンパク質：脂質の比率は、約１：４０又は１：５５である。

【0021】

適切には、ｒＨＤＬ製剤は、安定剤をさらに含む。好ましくは、安定剤は、ショ糖のような糖質である。好ましい濃度は、約６５〜８５ｇ／Ｌ ｒＨＤＬ製剤である。

【0022】

本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」という用語は、記載された完全体（integer）又は完全体の群を包含するが、他のいかなる完全体又は完全体の群を排除しない意味であることが理解される。

【0023】

以下、詳細に記載された本発明の非限定的な実施態様を理解する助けになる以下の図面を参照のこと。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】コラート及びホスファチジルコリンの両方を同時に減らすと肝毒性が低下することを示す急性ラット研究の結果を示す。

【図2】コラートを選択的に減らすと肝毒性の低下を示す急性ラット研究の結果を示す。

【図3】異なる濃度のコラート存在下におけるＣＳＬ１１１の濁度分析の結果を示す。

【図4】凍結乾燥及び再構成後の異なる濃度のコラート存在下におけるＣＳＬ１１１の濁度の結果を示す。

【図5】室温（ＲＴ）での再構成ＨＤＬ １：５０ ＰＣの濁度分析の結果を示す。

【図6】３７℃での再構成ＨＤＬ １：５０ ＰＣの濁度分析の結果を示す。

【図7】室温での再構成ＨＤＬ １：７５ ＰＣの濁度分析の結果を示す。

【図8】３７℃での再構成ＨＤＬ １：７５ ＰＣの濁度分析の結果を示す。

【図9】ｒＨＤＬ製剤の製造方法の実施態様の概要を提供する。

【0025】

発明の詳述
本発明は、少なくとも部分的に、先行技術に記載されたＣＳＬ１１１再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）製剤によって示された肝毒性が、特に製剤中のＡｐｏ−Ａ１に対する界面活性剤の比率に関して考えたときに、過剰な界面活性剤のためであったという予想外の発見からもたらされた。これに関して、コール酸ナトリウムのレベルは、約０．３ｇ／ｇＡｐｏ−Ａ１であった。しかし、また、発明者等は、界面活性剤を完全に排除することはできず、そしてそれによって、ｒＨＤＬ製剤が、十分な安定性及び治療活性を示すレベルに保持しなければならないことを発見した。

【0026】

さらにまた、ＣＳＬ１１１中に存在するそれと比較して、脂質濃度の低下は、ｒＨＤＬ製剤の治療活性を実質的に損なうことなく、肝毒性を低下させることが予想外に見出された。

【0027】

なおさらなる発見において、ｒＨＤＬ製剤に最適なアポリポタンパク質：脂質のモル比が、特定された。

【0028】

従って、一態様において、本発明は、アポリポタンパク質又はそのフラグメント；脂質及びヒトに投与すると肝毒性を示すｒＨＤＬ製剤中に存在するレベルの約５〜５０％であるレベルの界面活性剤を含むｒＨＤＬ製剤を提供する。

【0029】

本明細書に用いられるように、「再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）」製剤は、血漿中に典型的に存在する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と機能的に同等である、類似した、相当する、又は模倣した、人工的に製造された任意のリポタンパク質製剤又は組成物であってもよい。ｒＨＤＬ製剤は、その範囲内に「ＨＤＬ模倣剤」及び「合成ＨＤＬ粒子」を含む。

【0030】

これに関して、「ヒトにｒＨＤＬ製剤を投与すると肝毒性を示す」とは、ヒトに投与した後に、その後、有害事象を生じる、もたらす、又は少なくとも伴う、ｒＨＤＬ製剤中の界面活性剤のレベルを意味する。典型的に、有害事象は、異常な又は損なわれた肝機能によって表されるような肝毒性である。肝機能が異常であるか又は損なわれた可能性のある非限定的な例としては、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性（ＡＬＴ）の上昇、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性の上昇及び／又はビリルビンレベルの上昇が含まれる。本発明によれば、界面活性剤の適したレベルは、先に記載されたように、有害事象を生じない、もたらさない又は伴わないそれである。典型的に、これは、注入終了後に測定される。

【0031】

好ましくは、界面活性剤のレベルは、肝毒性を示すそれの約５〜３５％である。この範囲は、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％及び３５％を含む。より好ましくは、界面活性剤のレベルは、肝毒性を示すそれの約５〜２０％である。都合よくは、レベルは、肝毒性を示すそれの約５〜１０％である。好ましくは、これらのレベルは、肝毒性を示す界面活性剤の最小又は閾値レベルの観点から表した。

【0032】

例として、本発明に至る研究で示された、肝毒性を生じる、もたらす又は少なくとも伴う界面活性剤のレベルは、０．３ｇ／ｇ Ａｐｏ−ＡＩ又は６ｇ／Ｌ ｒＨＤＬ製剤（２０ｇ／Ｌ Ａｐｏ−ＡＩで）である。従って、５〜１０％のこの界面活性剤レベルは、０．０１５〜０．０３ｇ／ｇ Ａｐｏ−ＡＩ又は０．５〜０．９ｇ／Ｌ ｒＨＤＬ製剤（３０ｇ／Ｌ Ａｐｏ−ＡＩで）である。

【0033】

界面活性剤の「レベル」は、界面活性剤の絶対量、界面活性剤の濃度（例えば、ｒＨＤＬ製剤の単位体積当たりの質量）及び／又はｒＨＤＬ製剤の別成分の量又は濃度に対する界面活性剤の量の比率又は濃度であってもよい。ほんの一例として、界面活性剤のレベルは、ｒＨＤＬ製剤中に存在するアポリポタンパク質（例えばＡｐｏ−ＡＩ）の全質量に関して表してもよもよい。

【0034】

安全性及び肝毒性の回避は、本発明の１つの目的であるが、本発明では、ｒＨＤＬ製剤の安定性を維持するために十分な界面活性剤のレベルも必要である。実施例中により詳細に記載されたように、３０ｇ／Ｌアポリポタンパク質を含むｒＨＤＬ製剤の約０．４５ｇ／Ｌより少なくない界面活性剤濃度は、安定性及び非毒性の両方に関して最適である。安定性は、当分野で知られた任意の手段で都合よく測定されうるが、ｒＨＤＬ製剤の濁度が好ましい基準ある。

【0035】

界面活性剤は、ｒＨＤＬ製剤における使用に適した、胆汁酸及びその塩を含む、任意のイオン性（例えば、陽イオン性、陰イオン性、双極性）界面活性剤又は非イオン性界面活性剤であってもよい。イオン性界面活性剤には、胆汁酸及びその塩、ポリソルベート（例えばＰＳ８０）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、セチルトリメチル−アンモニウムブロミド、ラウロイルサルコシン、ｔｅｒｔ−オクチルフェニルプロパンスルホン酸及び４'−アミノ−７−ベンズアミド−タウロコール酸が含まれうる。

【0036】

典型的に、胆汁酸は、コール酸、デオキシコール酸ケノデオキシコール酸又はウルソデオキシコール酸を含む、２４炭素を有するジヒドロキシル化又はトリヒドロキシル化ステロイドである。好ましくは、界面活性剤は、コラート、デオキシコラート、ケノデオキシラート又はウルソデオキシラート塩のような胆汁酸塩である。特に好ましい界面活性剤は、コール酸ナトリウムである。

【0037】

アポリポタンパク質は、天然由来ＨＤＬの又は再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の機能性の生物活性成分である任意のアポリポタンパク質であってもよい。典型的に、アポリポタンパク質は、血漿由来又は組換え型アポリポタンパク質のいずれか、例えばＡｐｏ−ＡＩ、Ａｐｏ−ＡＩＩ若しくはＡｐｏ−ＡＶ、ｐｒｏ−ａｐｏ−Ａ１、若しくはＡｐｏ−ＡＩ Ｍｉｌａｎｏのような変異体である。好ましくは、アポリポタンパク質は、Ａｐｏ−ＡＩである。また、アポリポタンパク質の生物活性フラグメントも考えられる。フラグメントは、天然由来、化学合成又は組換え型であってもよい。ほんの一例として、Ａｐｏ−ＡＩの生物活性フラグメントは、好ましくはＡｐｏ−ＡＩのレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）刺激活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５〜１００％を有するか、又はさらに１００％を超える。

【0038】

適切には、アポリポタンパク質は、約２０〜５０ｇ／Ｌの濃度である。これは、２０、２５、３０、３５、４０、４５及び５０ｇ／Ｌ、そしてこれらの量の間の任意の範囲を含む。アポリポタンパク質は、好ましくは約３０ｇ／Ｌの濃度である。

【0039】

ｒＨＤＬ製剤は、肝毒性が生じないレベルで脂質を含む。適切には、脂質のレベルは、肝毒性を生じるか、又は伴うそれの約２０〜７０％である。特定の実施態様において、脂質のレベルは、好ましくは肝毒性を生じるか、又は伴うそれの約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％、そしてこれらの量の間の任意の範囲である。好ましくは、これらのレベルは、肝毒性を示す脂質の最小又は閾値レベルの観点から表される。

【0040】

例として、本発明に至る研究で示された、肝毒性を生じる、もたらす又は少なくとも伴う脂質レベルは、８４ｇ／Ｌである。従って、脂質は、好ましくは約３０〜６０ｇ／Ｌの濃度である。これは、３０、３５、４０、４５、５０、５５及び６０ｇ／Ｌ、そしてこれらの量の間の任意の範囲を含む。特に好都合な脂質濃度は、約３０〜５０ｇ／Ｌ、又は特定の実施態様において、約３４又は４７ｇ／Ｌである。

【0041】

脂質の「レベル」は、脂質の絶対量、脂質の濃度（例えばｒＨＤＬ製剤の単位体積当たりの質量）及び／又はｒＨＤＬ製剤の別成分の量又は濃度に対する脂質の量の比率又は濃度であってもよい。ほんの一例として、脂質のレベルは、ｒＨＤＬ製剤中に存在するアポリポタンパク質（例えばＡｐｏ−ＡＩ）のモル比の観点から表してもよい。

【0042】

１つの好ましい実施態様において、アポリポタンパク質：脂質のモル比は、１：２０〜１：１００の範囲にある。この範囲は、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０及び１：９０のようなモル比を含む。より好ましくは、アポリポタンパク質：脂質のモル比は、１：４０〜１：７５の範囲にある。特に好都合なアポリポタンパク質：脂質の比率は、約１：４０又は１：５５である。

【0043】

脂質は、天然由来ＨＤＬの又は再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）の機能性の生物活性成分である、任意の脂質であってもよい。このような脂質には、リン脂質、コレステロール、コレステロールエステル、脂肪酸及び／又はトリグリセリドが含まれる。好ましくは、脂質はリン脂質である。リン脂質の非限定的な例としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（レシチン）、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（ケファリン）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）又はその天然若しくは合成誘導体が含まれる。天然誘導体には、卵ＰＣ、卵ＰＧ、大豆ＰＣ、水素化大豆ＰＣ、大豆ＰＧ、脳ＰＳ、スフィンゴリピド、脳ＳＭ、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ケファリン、カルジオリピン、及びジセチルホスフェートが含まれる。合成誘導体には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジラウリルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＭ）及びジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＭ）が含まれる。また、リン脂質は、上のリン脂質のいずれかの誘導体又は類似体であることもできる。

【0044】

好ましくは、リン脂質は、単独の又は１つ若しくはそれ以上の他のリン脂質と組み合わせたホスファチジルコリンであるか、又はそれを含む。別のリン脂質の例は、スフィンゴミエリンである。

【0045】

適切には、ｒＨＤＬ製剤は、安定剤をさらに含む。特に、安定剤は、凍結乾燥中にｒＨＤＬ製剤の安定性を維持する。適切には、安定剤は、糖質又は糖アルコールのような炭水化物である。適した糖アルコールの例は、マンニトール及びソルビトールである。好ましくは、安定剤は、ショ糖のような二糖の糖質である。ショ糖の好ましい濃度は、ｒＨＤＬ製剤の約６５〜８５ｇ／Ｌ（約６．５〜８．５％ｗ／ｖに相当する）である。好ましくは、ショ糖の濃度は、約７５ｇ／Ｌ（約７．５％ｗ／ｗに相当する）である。これは、ＣＳＬ１１１と比較して、絶対項において、そしてリポタンパク質濃度に対しての両方で、低下されたショ糖濃度である。この比較的低下されたショ糖は、本発明のｒＨＤＬ製剤のより速い注入速度を可能にできることが提案される。別の安定剤は、アミノ酸（例えばグリシン、プロリン）、抗酸化剤、乳化剤、界面活性剤、キレート剤、ゼラチン、合成油、ポリオール、アルギナート又は任意の薬学的に許容しうる担体及び／又は賦形剤でありうるか又はそれらを含むが、それらに限定されるわけではない。これに関して、例として、“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”, Frokjaer et al., Taylor &; Francis (2000), “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)及び国際公開第ＷＯ２００９／０２５７５４号を参照のこと。

【0046】

特に好ましい実施態様において、ｒＨＤＬ製剤は、
（ｉ）約３０ｇ／Ｌ Ａｐｏ−ＡＩ；
（ｉｉ）Ａｐｏ−ＡＩグラム当たり約０．０３ｇのナトリウムコラート；
（ｉｉｉ）約３４又は４７ｇ／Ｌホスファチジルコリン；及び
（ｉｖ）約７５ｇ／Ｌショ糖；
を含み、
ここにおいて、Ａｐｏ−ＡＩ：ホスファチジルコリンのモル比は、約１：４０又は１：５５である。

【0047】

別の態様において、本発明は、アポリポタンパク質；脂質；及び界面活性剤を含むｒＨＤＬ製剤の製造方法であって、ヒトに投与すると肝毒性を示すｒＨＤＬ製剤中に存在するそれの約５〜５０％であるレベルで前記界面活性剤を供給する工程を含む前記方法を提供する。

【0048】

好ましくは、前記方法は、ヒトに投与すると肝毒性を示すレベルの約５〜１０％であるレベルで前記界面活性剤を供給する工程を含む。

【0049】

方法の好ましい実施態様において、界面活性剤の初期又は出発レベルは、ヒトにｒＨＤＬ製剤を投与して肝毒性を示さないレベルに低下されるか又は除去される。

【0050】

界面活性剤の低下又は除去は、例えば濾過、疎水性吸着又は疎水的相互作用クロマトグラフィー、透折、イオン交換吸着及びイオン交換クロマトグラフィーを含む当分野で知られたなんらかの手段で実施されうる。

【0051】

いくつかの実施態様において、非極性ポリスチレン樹脂は、界面活性剤レベルを低下させるのに適していることがある。このような樹脂は、好ましくは架橋コポリマー（例えば架橋スチレン及びジビニルベンゼンコポリマー）の形態にある。非限定的な例としては、アンバーラートＸＡＤ−２（Amberlite XAD-2）及びバイオビーズＳＭ（Bio Beads SM）が含まれる。

【0052】

濾過には、ゲル濾過、ゲル透過、ダイアフィルトレーション及び限外濾過が含まれるが、当分野で十分に理解されているように、それらに限定されるわけではない。ゲル透過の非限定的な例では、セファデックス（Sephadex）樹脂のような多孔性の架橋デキストランが用いられることがある。

【0053】

特に大規模製造に適した特に好ましい実施態様において、界面活性剤レベルは、ダイアフィルトレーションによって低下される。

【0054】

適切には、有機溶媒がない場合、方法は、脂質及びアポリポタンパク質を合わせる工程を含む。

【0055】

従って、１つの好ましい実施態様において、本発明は、
（Ｉ）有機溶媒なしのホスファチジルコリン及びコラート界面活性剤をＡｐｏ−Ａ１溶液に加える工程；
（ＩＩ）工程（Ｉ）で調製された溶液中のコラート界面活性剤のレベルを、約０．０３ｇ／ｇ Ａｐｏ−Ａ１に低下させる工程；
（ＩＩＩ）安定剤、好ましくはショ糖を工程（ＩＩ）の溶液に加える工程；
を含む、ｒＨＤＬ製剤の製造方法を提供する。

【0056】

好ましくは、工程（Ｉ）で、Ａｐｏ−ＡＩ：ホスファチジルコリンの比率が約１：４０又は１：５５になるように、ホスファチジルコリンを加える。

【0057】

好ましくは、工程（ＩＩＩ）のショ糖の最終濃度は、約７５ｇ／Ｌである。

【0058】

適切には、方法は、工程（ＩＩＩ）で製造されたｒＨＤＬ製剤を凍結乾燥する工程（ＩＶ）をさらに含む。

【0059】

特定の実施態様において、ｒＨＤＬ製剤の製造方法は、ヒトへの投与に適した品質及び安全性のｒＨＤＬ製剤の大規模な商業的製造に適していることは、いうまでもない。大規模な商業的製造方法の非限定的な例を図９にまとめる。

【0060】

さらに別の態様において、本発明は、先に記載されたような、又は先に記載されたような方法に従って製造されたｒＨＤＬをヒトに投与し、それによってヒトにおける疾患、障害又は状態を治療する工程を含む、ヒトにおける前記疾患、障害又は状態の治療方法を提供する。

【0061】

また、本発明は、ヒトにおける疾患、障害又は状態の治療に使用するための、先に記載されたような、又は先に記載されたような方法に従って製造されたｒＨＤＬ製剤を提供する。

【0062】

適切には、疾患、障害又は状態は、前記ｒＨＤＬ製剤の予防的又は治療的投与に対して反応性である。このような疾患、障害又は状態の非限定的な例には、心血管疾患（例えば急性冠動脈症候群（ＡＣＳ、アテローム性動脈硬化症及び心筋梗塞）又はＡＣＳにかかりやすい糖尿病、脳卒中若しくは心筋梗塞のような疾患、障害若しくは状態、高コレステロール血症（例えば血清コレステロールの上昇又はＬＤＬコレステロールの上昇）及びタンジアー病の症状であるような高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルの降下により生じる低コレステロール血症が含まれる。

【0063】

ｒＨＤＬ製剤は、当分野で知られた任意の投与経路によって投与されうる。典型的に、ｒＨＤＬ製剤は、非経口的に、例えば静脈注入又は注射によって投与される。

【0064】

ｒＨＤＬ製剤の投薬用量は、１〜１２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でありうる。好ましくは、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ及び７０ｍｇ／ｋｇの用量を含む、５〜８０ｍｇ／ｋｇの範囲である。本発明の好ましい実施態様が十分に理解され、そして実際的な効果をもたらすように、以下の非限定的な実施例を参照のこと。

【0065】

実施例
以下に提供された実施例は、ｒＨＤＬ製剤（例えばＣＳＬ１１１）のどの要因が肝毒性に寄与するかを決定する初期の研究（実施例１及び２）並びに本発明のｒＨＤＬ製剤の開発及び毒性試験の実施態様（実施例３〜８）を記載している。

【0066】

実施例１
Ａｐｏ−Ａ１：ＰＣの異なる比率及びコラートレベルの調節効果を比較する肝毒性研究
異なるＡｐｏ ＡＩ：ＰＣ比（１：１５０、１：１００及び１：５０）を含むＨＤＬ製剤について、ＡＬＴ活性により測定する肝毒性のレベルを、ラットモデルにおいて測定した（下の実施例２のモデルの詳細を参照のこと）。各ＨＤＬ製剤は、１：１５０製剤では６ｇ／Ｌから、１：５０製剤では１．１ｇ／Ｌまでの範囲のレベルを有する異なるコラート濃度を含んだ。

【0067】

結果は、１：１５０のＨＤＬ製剤では、３００ｍｇ／ｋｇからの用量についてＡＬＴレベルの上昇が観察されたことを示した。１：１００のＨＤＬ製剤では、４００ｍｇ／ｋｇからの用量でＡＬＴレベルの上昇が生じ、レベルは６００ｍｇ／ｋｇでかなり上昇した。これに対して、１：５０のＨＤＬ製剤では、６００ｍｇ／ｋｇの用量までＡＬＴ活性の上昇が観察されなかった（図１）。これらの結果は、ＨＤＬ製剤中のＰＣレベル及び／又はコラートレベルのいずれかによって肝毒性が低下することを示唆している。コラートレベルがＡＬＴ活性に直接影響があるかどうかを調べるために、ＣＳＬ１１１からコラートを減らしたさらなる研究を行った。結果は、ＣＳＬ１１１製剤中でコラートを減らすと、３００ｍｇ／ｋｇでラットに注入したときに、ＡＬＴレベルの低下が起こったことを示している（図２）。次いで、さらに減損（depleted）ＨＤＬ製剤にコラートをまた加えた場合、再補充（resupplemented）ＨＤＬ製剤では、３００ｍｇ／ｋｇでラットに注入したときにＡＬＴレベルの上昇を生じた（図２）。本研究は、約１ｇ／Ｌまでコラートを減らすと実質的にｒＨＤＬ毒性が低下するが、また、さらなる寄与因子は、約１：５０のａｐｏＡ１：ＰＣの比率までＰＣを減らすことであることを示している。

【0068】

実施例２
段階的なコラートレベル及びＡｐｏ−Ａ１：ＰＣの比率を比較する肝毒性研究
序論
本研究の目的は、以下、ｒＨＤＬ ＰＣ １：１５０（３ｇ／Ｌコラート）、ｒＨＤＬ ＰＣ １：１００（１ｇ／Ｌコラート）、ｒＨＤＬ ＰＣ １：５０（３ｇ／Ｌコラート）、ｒＨＤＬ ＰＣ １：５０（０．２ｇ／Ｌコラート）のような段階的なコラート濃度及びＡ−Ｉ Ａｐｏ対ＰＣの比率を有する再構成ＨＤＬ製剤（ｒＨＤＬ）の肝毒性を測定することである。覚醒ラットモデルを用いて肝機能における上記製剤の効果を測定した。肝毒性は、血清中の肝酵素活性（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の測定により評価した。

【0069】

Ａｐｏ−Ａ１は、製剤の活性成分であると考えられ、そしてＡｐｏ−Ａ１の血漿レベルは、暴露の鍵となる指標である。

【0070】

物質及び方法
ｒＨＤＬ試験製剤の投与
ｒＨＤＬ試験製剤１
物質／ＩＮＮ： ｒＨＤＬ ＰＣ １：１５０（３ｇ／Ｌコラート）
製造者： CSL Behring AG、ベルン、スイス
ロット番号： Ｑ．３
用量： ６００ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．
経路： 尾静脈からの静脈注入
頻度： 注入ｔ＝０−６０分
適用体積： ３１．２５ｍＬ／ｋｇ／ｈ

ｒＨＤＬ試験製剤２
物質／ＩＮＮ： ｒＨＤＬ ＰＣ １：１００（１ｇ／Ｌコラート）
製造者： CSL Behring AG、ベルン、スイス
ロット番号： Ｏ．３−２
用量： ６００ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．
経路： 尾静脈からの静脈注入
頻度： 注入ｔ＝０−６０分
適用体積： ３０．３０ｍｌ／ｋｇ／ｈ

ｒＨＤＬ試験製剤３
物質／ＩＮＮ： ｒＨＤＬ ＰＣ １：５０（３ｇ／Ｌコラート）
製造者： CSL Behring AG、ベルン、スイス
ロット番号： Ｐ．３
用量： ６００ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．
経路： 尾静脈からの静脈注入
頻度： 注入ｔ＝０−６０分
適用体積： ３１．５８ｍｌ／ｋｇ／ｈ
有効期限： ｎ．ａ．

ｒＨＤＬ試験製剤４
物質／ＩＮＮ： ｒＨＤＬ ＰＣ １：５０（０．２ｇ／Ｌコラート）
製造者： CSL Behring AG、ベルン、スイス
ロット番号： Ｐ．２
用量： ９００ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．
経路： 尾静脈からの静脈注入
頻度： 注入ｔ＝０−１２０分
適用体積： ２３．０８ｍｌ／ｋｇ／ｈ ｂ．ｗ．

【0071】

研究デザイン
本研究は、全１４匹のラットにおける４群オープントライアルとして設計された。投与計画を表１にまとめた。

【0072】

処置群

【表1】

【0073】

実験動物
種： ラット
菌株： ＣＤ
性別： 雄
動物の数： 1４匹
供給： Charles River Laboratories（Sulzfeld、ドイツ）
体重： ２８６〜３２８ｇ
到着時の週齢： ７〜９週
ハウジング： マクロロンケージ（macrolon cages）
床敷： 木の削りくず（Braun, Battenberg, Germany）
水： 水道水、自由に、
食物： 標準ラット食（Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, ドイツ）
明／暗： １２時間／１２時間
温度： ２１〜２２℃
相対湿度： ４０〜５０％

【0074】

動物を拘束機器（ラットホルダー）中に置き、そして側方尾静脈（lateral tail vein）に静脈カテーテルを貫通させた。試験物質を６０／１２０分間注入した。

【0075】

血液サンプルを眼窩後静脈束（retro-orbital venous complex）から取出し、そしてベースライン、静脈注入後１時間／２時間及び７時間／８時間で血清チューブに集めた。血液サンプルを血清に処理し、−２０℃で貯蔵した。

【0076】

肝酵素の測定
商業的に入手可能な酵素測光試験キット（Greiner Biochemica）を用いて、サンプルをＡＳＴ及びＡＬＴ活性について分析した。

【0077】

Ａｐｏ Ａ−Ｉ血漿レベルの測定
ヒトＡｐｏ Ａ−Ｉレベルの測定は、比濁分析アッセイによって実施した。

【0078】

結果
研究下には、１：５０、１：１００及び１：１５０のＡ−Ｉ Ａｐｏ対ＰＣの比率並びに１若しくは３ｇ／Ｌの所定のコラート濃度又は減損コラート（０．２ｇ／Ｌ）を有するｒＨＤＬ製剤があった。生理食塩水をビヒクル（vehicle）としてそしてＣＳＬ １１１を陽性対照として供給した。採血は、ベースライン（時点０）時、注入終了時（６００及び９００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ１時間又は２時間）、そして７時間又は８時間で行った。肝酵素活性（ＡＬＴ及びＡＳＴ）及びヒトＡｐｏ Ａ−Ｉレベルを上記の時点で評価した。

【0079】

ベースラインのＡＳＴ濃度は、６３〜８７Ｕ／Ｌの範囲であった。ＡＳＴ濃度は、Ａｐｏ ＡＩ：ＰＣ １：５０（コラート０．２ｇ／Ｌ）を除くすべての製剤について、注入終了後、そして７時間／８時間の時点で上昇した。

【0080】

ベースラインのＡＬＴ濃度は、３９〜４５Ｕ／Ｌの範囲であった。ＡＳＴ濃度は、Ａｐｏ ＡＩ：ＰＣ １：５０（コラート０．２ｇ／Ｌ）を除くすべての製剤について、注入終了時、そして７時間／８時間の時点で上昇した。

【0081】

ベースラインのヒトＡｐｏ Ａ−Ｉ濃度は、最も低い検出限界より下にあった。注入終了時、６００ｍｇ／ｋｇの用量のすべての製剤について、濃度は約１３ｇ／Ｌに上昇した。９００ｍｇ／ｋｇの１：５０の製剤は、１５ｇ／ＬのＡｐｏ Ａ−Ｉ濃度となった。

【0082】

すべての群、用量及び時点について平均及び標準偏差を表２〜４に示した。

【0083】

【表2】

【0084】

【表3】

【0085】

【表4】

【0086】

結論
結論として、９００ｍｇ／ｋｇでＡｐｏ ＡＩ：ＰＣの比率１：５０（０．２ｇ／Ｌコラート）のｒＨＤＬ製剤だけ、肝機能検査異常が誘発されなかった。これに対して、６００ｍｇ／ｋｇでより高いコラートレベル（３ｇ／Ｌ）を有する同じ１：５０のｒＨＤＬ製剤は、ＡＳＴ及びＡＬＴの両方でレベル上昇を示した。ｒＨＤＬ製剤の脂質及び残りの界面活性剤含量を調節することによって肝毒性が良好に最小化されたことを示唆している。

【0087】

実施例３
ｒＨＤＬ製剤中のコラートレベルを比較する安定性試験
本発明のｒＨＤＬ製剤の実施態様は、先行技術のｒＨＤＬ製剤ＣＳＬ１１１と比較して、ＣＳＬ１１１と少なくとも同等の生物活性を維持しながら、肝毒性の有意な低下を示す。このｒＨＤＬ製剤は、ＰＣに対するより低いタンパク質の比率、より低レベルのコラート、より高いタンパク質含量及び低下されたショ糖濃度によってＣＳＬ１１１とは区別される。

【0088】

再構成ＨＤＬの製剤
出発物質Ａｐｏ−ＡＩ
出発物質として、精製及び殺菌されたＡｐｏ−ＡＩ溶液を用いた。バッチサイズは、３０ｇ又は３５ｇのタンパク質のいずれかであった。

【0089】

脂質溶液
脂質溶液を調製するための式を下に示す。最初に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むバッファー溶液を調製した。必要な量は、式１に従って算出した：

【数1】

【0090】

次に、コール酸ナトリウム（１．３ｍｏｌ／ｍｏｌ脂質）をこの溶液に加え、そして溶解した。

【0091】

次いで、算出された量の脂質を入れ（式２）、混合物を６〜１８時間穏やかに撹拌し（脂質は溶解した）、それから予め殺菌された０．２μｍのMillipak 40 Gamma Gold（Millipore Art. MPGL04GH2）を用いて濾過した。

【数2】

Ｍ（脂質）：ＰＣについては７７５ｇ／ｍｏｌ；ＳＭについては７３１ｇ／ｍｏｌ
Ｍ（Ａｐｏ−ＡＩ）：２８’０７８ｇ／ｍｏｌ

【0092】

脂質インキュベーション及びＵＦ／ＤＦ
Ａｐｏ−ＡＩ溶液（タンパク質３０ｇ−３５ｇ）を、５Ｌ二重ジャケット付き容器中に入れ、そして１〜４℃に冷却した。次いで、脂質溶液を加え、そして１〜４℃で２〜１６時間撹拌した。実験によっては、タンパク質−脂質溶液を３０℃で３０分間加熱し、冷却し、それから１〜４℃で２〜１６時間インキュベートした。

【0093】

コラートを除去するため、１％ショ糖溶液７〜９体積に対して１０ｋＤａのカセットを用いてＵＦ／ＤＦを実施した。

【0094】

次いで、溶液を２２〜２８ｇ／Ｌ（ＦＰ中のタンパク質濃度２０ｇ／Ｌ）又は３２〜３８ｇ／Ｌ（ＦＰ中のタンパク質濃度３０ｇ／Ｌ）に濃縮し、そして、その後、ショ糖及びＷＦＩを加えることによってショ糖７．５％、そしてタンパク質２０ｇ／Ｌ又は３０ｇ／Ｌにした。ｒＨＤＬバルクを滅菌濾過（Sartopore 2、１５０ｃｍ２、ＰＥＳ、カットオフ（cut off）０．１μｍ、Sartorius Art. 5441358K4--00）し、そして層流で充填した。

【0095】

アンバーライト（Amberlite）によるコラートの低減
アンバーライトの調製
すべての濾過工程は、Nalgene ０．２μｍ ＰＥＳフィルター（Art. 595-4520）で実施した。

【0096】

アンバーライトＸＡＤ−２（４００ｇ）を２０％（ｖ／ｖ）メタノール５００ｍＬに加えた。懸濁液を１〜２時間撹拌し、それからアンバーライトを濾過した。次に、１Ｍ ＮａＯＨ ３００ｍｌを１０００ｍＬビーカー中に入れ、アンバーライトを加え、そして撹拌下で１５分間５５〜６０℃に加熱した。アンバーライトを濾過し；その後、この手順をさらに２回繰り返した。次いで、アンバーライトを、ｐＨ中性まで水（ＳＷＡ）（約１０〜１５Ｌ）で洗浄し、濾過し、メタノール３００ｍＬに加え、１時間撹拌し、それから混合物を２〜８℃で少なくとも一夜放置した。メタノールを除去し、アンバーライトを濾過し、水（ＳＷＡ）約１０Ｌで洗浄し、そして再び濾過した。次いで、アンバーライトをショ糖溶液約４Ｌ中に注ぎ、７．５％又は１０％はいずれも、減損される再構成ＨＤＬのショ糖濃度に相当する。混合物を数分間撹拌し、そして使用直前に濾過した。

【0097】

アンバーライトによるコラートの低減
再構成ＨＤＬを２〜８℃に冷却し、アンバーライトＸＡＤ−２を加え、そして混合物を３．５時間撹拌した。アンバーライトを濾過し、そして排出した。この工程を２回行った。

【0098】

実験に応じて、タンパク質５ｇに対して、それぞれの減損工程のためにアンバーライト１００〜１６０ｇを用いた。

【0099】

減損後、コラートをまた加えて異なるコラート濃度を達成した。

【0100】

再構成ＨＤＬ １：７５ＰＣを０．７ｇ／Ｌのコラート濃度に低下させるため、再構成ＨＤＬに、アンバーライトを異なる比率で加えることによって、加えるべきアンバーライトの量を実験的に決定した（予備実験）。これらの実験から、１回の処置でタンパク質５ｇ当たりアンバーライト５０ｇが必要であることがわかった。次いで、主要バッチの減損には、このアンバーライト対タンパク質の比率を用いた。

【0101】

安定性評価
ＣＳＬ１１１
肝毒性に影響を及ぼしうると本発明者らが仮定した１つの化合物は、コラートである。従って、最終製剤中のコラート低減が、主要目的であった。最初の実験をＣＳＬ１１１で実施した。安定な生成物がなお保証される最低コラート濃度を見出すため、再構成ＣＳＬ１１１をアンバーライトで処理し、そして、その後、コラートをまた加えて異なる濃度を得た。

【0102】

これらの物質において安定性評価を実施した。また、異なるコラート濃度を有するＣＳＬ１１１の安定性における凍結乾燥の影響を調べた。

【0103】

再構成ＨＤＬ １：５０ ＰＣ／１：７５ ＰＣ
２つの製剤（１．５０ ＰＣ及び１：７５ＰＣ）をアンバーライトでコラート減損し、そしてコラートで補充して異なるコラート濃度を得た。これらの溶液を凍結乾燥し、再構成し、そして安定性を調べてこれらの製剤の安定性を保証するのに必要である必要な最低コラート濃度を決定した。

【0104】

結果
ＣＳＬ１１１についての結果
ＣＳＬ１１１をアンバーライトで処理してコラートを除去した。

【0105】

次いで、コラートを加えて、本研究に必要な異なる濃度を得た。２．８ｇ／Ｌコラートより下の範囲では、コラート濃度がさらに低下するにつれて濁度は増大した。２．８ｇ／Ｌコラートより上の濃度では、濁度値の変化は、ほとんど検出されなかった（図３）。

【0106】

次いで、これらのサンプルを凍結乾燥し、そして再構成した。貯蔵０時間、２４時間及び７日後に濁度を測定した。凍結乾燥及び再構成後の濁度値は、非凍結乾燥サンプルよりも高かった（図３及び図４を比較する）。

【0107】

再構成ＣＳＬ１１１粒子は、安定なままである最低コラート濃度が必要であると考えられる。コラート濃度があまりに低い場合、凝集物及び混濁が発生した。また、低いコラート濃度では分子サイズ分布の変化が、より速かった。

【0108】

再構成ＨＤＬ １：５０ ＰＣ
濁度についてのデータを図５及び６に示した。濁度データは、コラート濃度≧０．３ｇ／Ｌについて、室温での変化が小さいことを示した。

【0109】

室温で２４時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図示せず）は、濁度値と同じ傾向を示した。コラート濃度≧０．３ｇ／Ｌでは、変化が小さかった。０．８〜１．０ｇ／Ｌの間で、クロマトグラムは、ほとんど違いを示さなかった。そのため、コラート濃度が１．０ｇ／Ｌより上に上昇しても、安定性が高まることは期待されない。従って、２０ｇ／Ｌタンパク質を有する１：５０製剤について、０．３〜１．０ｇ／Ｌの間のコラート濃度が最適であると考えられる。３０ｇ／Ｌタンパク質を含む生成物について算出すると、最適コラート濃度は、０．５〜１．５ｇ／Ｌの範囲である。

【0110】

再構成ＨＤＬ １：７５ ＰＣ
１：７５製剤の濁度測定（図７及び８）は、０．６ｇ／Ｌコラートより下の濃度について明確な上昇を示している。他の濃度（０．６〜２．０ｇ／Ｌコラート）についての貯蔵１日後の違いは、あまりなかった。

【0111】

室温で２４時間後の分子サイズ分布のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図示せず）は、減損サンプルと他のサンプルの間の明確な違いを示した。

【0112】

クロマトグラムは、１．０〜１．３ｇ／Ｌコラートの間でほとんど違いを示さなかった。そのため、１．３ｇ／Ｌより上のコラート濃度で安定性が大いに高まることは期待されない。従って、２０ｇ／Ｌタンパク質を有する１：７５の製剤について、０．６〜１．３ｇ／Ｌの間のコラート濃度が、最適であるためと考えられる。３０ｇ／Ｌタンパク質を有する製剤について、これは、０．９〜２．０ｇ／Ｌの最終コラート濃度と同等である。

【0113】

結論
本発明のｒＨＤＬ製剤について、０．５〜１．５ｇ／Ｌの最適コラート濃度が選ばれた。この範囲より下では、安定性が低下した。１．５ｇ／Ｌより上のコラート濃度では、安定性が僅かに高められた。しかし、より高いコラート濃度では、肝毒性におけるかなりの増加を予想することができる。

【0114】

実施例４
ＣＳＬ１１１を用いた肝毒性試験の比較
序論
本研究の目的は、ウサギに静脈注入した後の本発明のｒＨＤＬ製剤の実施態様についての良好な肝毒性プロファイルを確定することである。肝毒性は、血清中の肝酵素（ＡＬＴ）活性の増強として定義される。Ａｐｏ−Ａ１は、両製剤の活性成分であると考えられ、そしてＡｐｏ−Ａ１の血漿レベルは、暴露の鍵となる指標である。

【0115】

物質及び方法
ｒＨＤＬ試験製剤の投与
ｒＨＤＬ試験製剤１
物質／ＩＮＮ： ｒＨＤＬ ＣＳＬ１１１
製造者： CSL Behring AG、ベルン
ロット番号： Ｅ５０２−０３７５０−００００５
用量： ７５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．
経路： ｉ．ｖ．
頻度： 注入ｔ＝０−４０分
適用体積： ４．９５ｍＬ／ｋｇ／ｈ
ｒＨＤＬ試験製剤２
物質／ＩＮＮ： ｒＨＤＬ（ＰＣ １：５５）
製造者： CSL Behring AG、ベルン
ロット番号： １００３．Ｅ００９．０１
用量： ７５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．
経路： ｉ．ｖ．
頻度： 注入ｔ＝０−４０分
適用体積： ３．８７ｍＬ／ｋｇ／ｈ

【0116】

研究デザイン
本研究は、全６匹の雌のウサギにおける２群オープントライアルとして設計された。投与計画を表５にまとめた。

【0117】

処置群

【表5】

【0118】

実験動物
種： ウサギ
菌株： ＣＨＢ
動物の数、性別： ６匹（雌）
供給： Fa. Bauer (Neuenstein-Lohe、ドイツ)
体重： ３．１〜３．３ｋｇ
到着時の月齢： 約３〜４ヵ月
ハウジング： ワイヤースチールケージ；１動物／ケージ
床敷： なし
水： 水道水、自由に、
食物： Deukanin Pellets（Deuka）、自由に、
明／暗： １２時間／１２時間
温度： ２１〜２３℃
相対湿度： ５０％

【0119】

動物モデル
動物を拘束機器（ウサギホルダー）中に固定した。静脈カテーテルを耳静脈に留置した。試験物質を４０分の静脈注入として与えた。血液サンプルを耳動脈から採取し、そして血清及びストレプトキナーゼ−血漿（５％）バイアル中に集めた。血液サンプルを血清に処理し、−２０℃で貯蔵し、そして血漿に処理し、そして− ８０℃で貯蔵した。

【0120】

肝酵素の測定
商業的に入手可能な酵素測光試験キット（Greiner Biochemica）を用いて、ＡＬＴ活性についてサンプルを分析した。

【0121】

Ａｐｏ Ａ−Ｉ血漿レベルの測定
ヒトＡ−Ｉ Ａｐｏの測定は、比濁分析アッセイによって実施した。

【0122】

結果
in vivoデータの平均及び標準偏差を表６〜７に示した。

【0123】

本明細書において試験されたｒＨＤＬ製剤の実施態様では、ＡＬＴ血清レベルが上昇しなかった。ＣＳＬ１１１では、８時間で２５Ｕ／Ｌから９４Ｕ／ＬまでＡＬＴが上昇した。

【0124】

ｒＨＤＬ製剤（１．５ｍｇ／ｄＬ）及びＣＳＬ１１１（１．６ｍｇ／ｄＬ）については、４０分の時点でヒトＡｐｏ−ＡＩのピークレベルが見られた。

【0125】

【表6】

【0126】

【表7】

【0127】

実施例５
より低いリン脂質レベルを含んでいる粒子について、本発明の合成ＨＤＬ粒子を製造する能力を測定した。Ａ−Ｉ Ａｐｏ対リン脂質の比率は１：２から１：５５までの範囲であった。
合成ＨＤＬ粒子を製造するため、コール酸ナトリウム（New Zealand Pharmaceuticals）をバッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ８．０）中に溶解し、そして透明になるまで撹拌した。大豆ホスファチジルコリン（Phospholipid GmbH）を適当な体積のコラートに加え、室温で１６時間撹拌した。ａｐｏＡ−Ｉ溶液を、１０ｍＭ ＮａＣｌで９．０ｇ／Ｌ（ＯＤ２８０によって測定）のタンパク質濃度に希釈し、そして適当な体積の脂質溶液と混合してタンパク質対脂質の適当な比率を得た。混合物を２〜８℃で１６時間撹拌した。ランニングバッファー（running buffer）として１％ショ糖を用いてHiPrep 26/10脱塩カラム上でコラートを除去することによってＨＤＬ模倣剤を製造した。溶出液を限外濾過によってそれぞれ２０ｇ／Ｌのタンパク質濃度及び７．５％ショ糖に濃縮した。

【0128】

再構成ＨＤＬ製剤を２〜８℃でインキュベート（貯蔵）し、そして以下のパラメーター：
・透過率（４０５ｎｍ）、粒径分布（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、エンドトキシン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）、Native PAGE、ＬＣＡＴ活性化、ａｐｏＡ−Ｉ濃度及びin vitro毒性を０、５及び１４日後に測定した。

【0129】

日０で、以下のさらなる試験を実施した：ｉ）サンプルを含んでいる脂質に適合させた改質ビウレット（デオキシコレートをビウレット溶液に加えた）によるタンパク質濃度；ｉｉ）ホスファチジルコリン濃度（ProDiagnostica mti-diagnostics GmbH）；及びｉｉｉ）コラート濃度を比色法Gallsauren試験キット及びGallsauren-Stoppreagens（Trinity
Biotech）によって測定した。

【0130】

粒径分布は、ランニングバッファーとしてＰＢＳ＋０．１％ナトリウムアジドを用いて、Superose 6 10/300 GLカラム（GE Healthcare）を使用したＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。流速は０．５ｍＬ／分であり、サンプル５μＬを注射し、検出は２８０ｎｍの波長で行った。NuPAGE Novex Bis-Tris Gels ４−１２％及びＭＯＰＳ又はＭＥＳ電気泳動バッファー（Invitrogen）によるXCell SureLock Mini-Cellを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元／非還元）によって合成ＨＤＬ粒子を分析した。タンパク質バンドを、Bio-Safe Coomassie Stain（Bio-Rad）により視覚化した。Native PAGEは、Native Page Novex Bis-Tris Gels 4-16%及びNativePAGE Running Buffer Kit（Invitrogen）でXCell SureLock Mini-Cellを用いて実施した。タンパク質バンドを、GelCode Blue Stain Reagent（Thermo Scientific）により視覚化した。ａｐｏＡ−Ｉ濃度は、３Ｄ ＣＥ機器（Agilent technologies）及びExtended Light Path CEキャピラリー（５０μｍ、５６ｃｍ、いずれもAgilent Technologies）を用いて、キャピラリー電気泳動によって測定した。電気泳動バッファーは、５３ｍＭ Na-Borat ｐＨ９．１、０．２１％ＳＤＳ、５％メタノールであった。電気泳動は、２５ｋＶで行った。

【0131】

ＬＣＡＴ活性を四つ組で（quadruplicate）測定した。簡潔には、サンプル１０μＬを冷却されたチューブ中にピペットで移した。ヒト血漿１５０μＬ、ＰＢＳ １５０μＬ及び１４Ｃコレステロール（Perkin Elmer）２０μＬを２５ｍｇ／ｍＬヒトアルブミン溶液中に溶解し、混合し、そして２〜８℃で９０分間インキュベートした。二つ組のサンプルを３７℃で、その他の２つのサンプル（ブランク）を２〜８℃で３０分間インキュベートした。エタノール２ｍＬを加えて反応を停止し、その後、ヘキサン（１×５ｍＬ、１×３ｍＬ）で２回抽出した。ヘキサンを蒸発乾固し、そして残留物をヘキサン０．５ｍＬ中に再溶解した。抽出物を固相Amino SPEカラムを通過させ、ヘキサン２×１ｍＬで溶離することによって、コレステロールエステルを他の物質から分離した。溶出液中の放射能をシンチレーションベータカウンターで測定した。

【0132】

ＨＥＰ−Ｇ２細胞の製造に関与するin vitro毒性（日１）：１つのＴ７５フラスコからのＨＥＰ−Ｇ２細胞の対数期培養物を取り、培地を除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄した。培地（９０％ＤＭＥＭ、１０％不活化ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸、１％Pen/Strep）１０ｍＬ中でトリプシン処理及び再懸濁した後、ノイバウエル（Neubauer）／トリパンブルー（Trypan blue）によって濃度を決定した。１００μｌ細胞（１０×１０４ Ｃ／ｍＬ）／ウェルを９６ウェルＦ底プレートに接種した。プレートを３７℃／５％ＣＯ₂、９５％Ｈ₂Ｏで一夜インキュベートした。インキュベーション（日２）：最も高い化合物濃度のサンプル７００μＬを培地中に調製した。ウェルの第１列からの培地を取出し、そして溶液２００μｌを細胞に加えた。連続１：２希釈系列を行い、そしてプレートを３７℃／５％ＣＯ₂、９５％Ｈ₂Ｏで７２時間の間インキュベートした。生存率（日３）：ニュートラルレッド溶液（Neutral Red Solution）（ＰＢＳ １００ｍＬ中のNeutral Red ７０ｍｇ）３×５０μＬを各ウェルに加えた。プレートを３７℃／５％ＣＯ₂、９５％Ｈ₂Ｏで２時間インキュベートし、そしてウェルをＰＢＳ ２００μＬ／ウェルで１回洗浄し、エタノール１００μＬを各ウェルに加え、そしてプレートを振盪機上に２０分間置いた。各ウェルの吸収を５４０ｎｍで読取った。

【0133】

リン脂質対タンパク質の異なる比率を含む合成ＨＤＬ粒子の特徴の概要を表８に示した。％透過率は、粒子が安定であったことを示す。合成粒子中に存在するリン脂質のレベルが下がるにつれてＬＣＡＴ値は低下した。これは、ＬＣＡＴに対して基質として作用するリン脂質と一致していた。

【0134】

ＨＰＬＣ−ＳＥＣの結果は、１：２０及び１：３０の比率を有する粒子が、単一の対称ピークとして溶離されたことを示した。Ａ−Ｉ Ａｐｏに対する脂質レベルがより低い合成ＨＤＬ粒子は、１：５及び１：２の比率の粒子においてより顕著であった肩（shoulder）を含んでいた。さらに、主要ピークの溶離時間は、タンパク質に対するリン脂質の比率が低下するにつれて次第に遅くなった。これは、粒子が次第に小さくなっていることを示している。このサイズ変化は、Native PAGE結果にも反映されており、ここで低分子量バンドは、比率が１：５５から１：２に下がるにつれて強度の増加が観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、すべてのサンプルについて類似していた。

【0135】

in vitroアッセイ結果は、各製剤に対する細胞生存率が、１４日間にわたって安定なままであることを示した。細胞を最も高い濃度（２ｍｇ／ｍｌ）の再構成ＨＤＬと共にインキュベートしたときに、脂質レベルの上昇に伴って細胞生存率の僅かな低下が観察された（下の表９を参照のこと）。

【0136】

【表8】

【0137】

【表9】

【0138】

実施例６
異なる界面活性剤を用いて再構成された合成ＨＤＬ粒子の毒性における効果を試験した。
粒子を製造するため、アンバーライトＸＡＤ−２ビーズを２０％メタノール中のインキュベーションによって一夜洗浄し、その後、１Ｍ水酸化ナトリウムで４回、そして超純水で２回洗浄することによって浄化した。使用前にビーズを７．５％ショ糖で洗浄し、そしてフィルター上で乾燥させた。

【0139】

合成ＨＤＬ粒子を、以下の方法によって製造した。残留コラートを含んでいる凍結乾燥ＨＤＬ粒子をＷＦＩにより３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度に再構成した。アンバーライトＸＡＤ−２ビーズ（タンパク質ｇ当たり１０ｇ）を、再構成ＨＤＬ製剤に加え、そして振盪しながら２〜８℃で３．５時間インキュベートした。濾過によりビーズを除去した後、さらなる分のアンバーライトＸＡＤ−２ビーズ（タンパク質ｇ当たりビーズ１０ｇ）を用いてこの手順をもう１回繰り返した。次いで、濾過によりビーズを除去し、そして界面活性剤（コラート、デオキシコレート、オクチルグルコシド、ポリソルベート８０（Polysorbate 80））加えて１ｇ／Ｌ又は６ｇ／Ｌの最終的な界面活性剤濃度を得た。

【0140】

次いで、上の実施例で測定されたように、安定性についてサンプルを試験した。

【0141】

ポリソルベート８０製剤について、測光アッセイによって界面活性剤レベルを測定した：サンプル１０００ｍＬ中のタンパク質を０．１Ｍ酢酸アンモニウム５ｍＬで沈殿させ、そして遠心分離によって沈降させた。上澄みを蒸発乾固し、そして四ホウ酸ナトリウムバッファー（四ホウ酸ナトリウム０．９５３ｇ、Ｈ₂Ｏで１００ｍＬまで、ＨＣｌ １０ｍＬ添加）１ｍｌ ｐＨ９．１中に再溶解し、ＴＢＰＥ−Ｋ溶液（塩化カリウム１．７６ｇ、四ホウ酸ナトリウム０．４８ｇ、０．１Ｍ ＫＯＨ４８００ｍＬ、エタノール５ｍＬ中のＴＢＰＥ−Ｋ０．０１５ｇ、Ｈ₂Ｏで１００ｍＬまで）４ｍｌを加え、そして転倒型ミキサー上でジクロロメタン２．５ｍｌにより３０分間抽出した。相分離した後、ジクロロメタン相の吸収を６１１ｎｍ（参照波長７００ｎｍ）で測定した。

【0142】

タンパク質に対するリン脂質の異なる比率を含む合成ＨＤＬ粒子の特徴の概要を表１０に示した。％透過率及びＬＣＡＴ値は、粒子が安定であり、そして機能性であったことを示している。

【0143】

ＨＰＬＣ−ＳＥＣの結果は、異なる界面活性剤を有する粒子が、単一の対称ピークとして溶離されたことを示した。また、これは、Native PAGEで観察されるバンドパターンにおいても反映された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、すべてのサンプルについて類似していた。in
vitroアッセイ結果は、存在する界面活性剤のレベルに応じて細胞生存率が変化することを示した。特に、高い界面活性剤レベルでは、細胞生存率の低下が起こる。しかしながら、１４日間にわたって、値は安定なままであった（表１１参照）。

【0144】

【表10】

【0145】

【表11】

【0146】

【表12】

【0147】

実施例７
ＰＯＰＣ（NOF Corporation）を用いてＨＤＬ粒子を再構成したことを除いて、上の実施例５に記載されたように合成ＨＤＬ粒子を製造した。次いで、実施例５に記載された方法に従って粒子を試験した。

【0148】

結果は、ダイズホスファチジルコリンで再構成された合成ＨＤＬ粒子と類似の毒性を示す安定な／機能性の生成物を示している（表１２及び１３）。

【0149】

【表13】

【0150】

【表14】

【0151】

実施例８
安全性及び忍容性並びに本発明の再構成ＨＤＬ製剤の用量漸増の薬物動態は、健常ボランティアにおける単回又は多回静脈注入によって評価することができる。研究は２群で行い、一方は、漸増用量の合成ＨＤＬ粒子の使用を含み、そしてもう一方は通常の生理食塩水（０．９％）プラセボコンパレーターの使用を含んだ。注入は、無作為化及び二重盲検化された（被験者、研究者及び結果評価者）。

【0152】

健常ボランティアは、年齢１８歳から５５歳まで、そして少なくとも体重４５ｋｇの男性又は女性のいずれかであることができる他の参加基準には、１８〜４２．０ｋｇ／ｍ２のボディマス指数（ＢＭＩ）が含まれうる。除外基準には、ｉ）臨床的に有意な医学的状態、障害又は疾患の証拠；ｉｉ）肝胆汁性疾患の証拠；ｉｉｉ）臨床関連の臨床検査結果異常の証拠；及びｉｖ）アルコール又は物質乱用の病歴の証拠が含まれうる。

【0153】

安全性及び忍容性は、ｉ）注入後１４日までの薬物関連の臨床的な有害事象の頻度；及びｉｉ）注入後１４日までの肝機能検査測定（例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇）によって測定される。薬物動態学的情報は、合成ＨＤＬ粒子の注入後１０日まで測定することができる。特定の測定には、リポタンパク質の血漿レベルを測定が含まれる。

【0154】

結論
本発明のｒＨＤＬ製剤が、改善された毒性プロファイルを有しており、かつ生物活性が保持されているかどうかを試験することで、本発明のｒＨＤＬ製剤及びＣＳＬ１１１製剤の実施態様を評価した。本発明のｒＨＤＬ製剤は、１：４０又は１：５５の低下されたＡｐｏ−ＡＩ対ＰＣの比率を有するのに対して、ＣＳＬ１１１は、１：１５０の比率を有する。また、さらなる精製に取り組むことで製剤中のコラートが実質的に低減された。結果として、本発明のｒＨＤＬ製剤は、ＣＳＬ１１１と比較して低下された肝毒性を示す。重要なことに、Ａｐｏ−ＡＩの血清レベルは、両方の製剤について類似しており、活性成分への類似の暴露を示した（表７を参照のこと）。

【0155】

明細書を通して、本発明をいずれか１つの実施態様又は特定の特徴を集めたものに限定することなく、本発明の好ましい実施態様を説明することを目的としてきた。説明及び図示された実施態様に、本発明を逸脱することなくさまざまな変更及び改良を加えることができる。

【0156】

この明細書に参照された各特許の開示及び科学文献、コンピュータープログラム及びアルゴリズムは、全体として参照により組み込まれている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】