特許 5990344 相乗作用を有する防腐剤ブレンド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5990344

(24)【登録日】2016年8月19日

(45)【発行日】2016年9月14日

(54)【発明の名称】相乗作用を有する防腐剤ブレンド

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/36 20060101AFI20160901BHJP

   A61Q 5/02 20060101ALI20160901BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20160901BHJP

   A61Q 19/10 20060101ALI20160901BHJP

   A61Q 5/12 20060101ALI20160901BHJP

   A61Q 1/00 20060101ALI20160901BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20160901BHJP

   A61K 8/34 20060101ALI20160901BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/36

   A61Q5/02

   A61Q19/00

   A61Q19/10

   A61Q5/12

   A61Q1/00

   A61Q17/04

   A61K8/34

【請求項の数】14

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2015-563131(P2015-563131)

(86)(22)【出願日】2014年6月27日

(65)【公表番号】特表2016-525068(P2016-525068A)

(43)【公表日】2016年8月22日

(86)【国際出願番号】EP2014063649

(87)【国際公開番号】WO2014207179

(87)【国際公開日】20141231

【審査請求日】2016年2月25日

(31)【優先権主張番号】13174309.8

(32)【優先日】2013年6月28日

(33)【優先権主張国】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】391003864

【氏名又は名称】ロンザ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＬＯＮＺＡ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ランフト、ヴォルカー

【審査官】 ▲高▼ 美葉子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５０６６２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５４４１５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第６４４７７９３（ＵＳ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００−８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＫＯＳＭＥＴ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）１から２０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）１０から８９重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）１０から８９重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物、及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物
の混合物であって、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比が１：４から４：１である、混合物と
を含む防腐剤組成物（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の総重量に基づく）。

【請求項2】

（ａ）１から１０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）２０から７０重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）２０から７０重量％の以下の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物、及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物
の混合物であって、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比が１：４から４：１である、混合物と
を含む、請求項１に記載の防腐剤組成物（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の総重量に基づく）。

【請求項3】

（ａ）２から１０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）２０から５０重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）４０から７０重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物、及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物
の混合物であって、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比が１：４から４：１である、混合物と
を含む、請求項２に記載の防腐剤組成物（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の総重量に基づく）。

【請求項4】

（ａ）４から１０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）２０から４５重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）５０から７０重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物、及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物
の混合物であって、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比が１：４から２：１である、混合物と
を含む、請求項３に記載の防腐剤組成物（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の総重量に基づく）。

【請求項5】

成分（ｃ）が、（ｉ）１，２−プロパンジオール及び（ｉｉ）１，４−ブタンジオールの混合物である、請求項１から４の何れか一項に記載の防腐剤組成物。

【請求項6】

（ａ）４から１０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）２０から４５重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）５０から７０重量％の、（ｉ）１，２−プロパンジオール及び（ｉｉ）１，４−ブタンジオールの混合物であって、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比が１：４から２：１である、混合物と
を含む、請求項５に記載の防腐剤組成物（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の総重量に基づく）。

【請求項7】

成分（ｃ）が、（ｉ）１，３−プロパンジオール及び（ｉｉ）１，３−ブタンジオールの混合物である、請求項１から４の何れか一項に記載の防腐剤組成物。

【請求項8】

（ａ）４から１０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）２０から４５重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）５０から７０重量％の、（ｉ）１，３−プロパンジオール及び（ｉｉ）１，３−ブタンジオールの混合物であって、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比が１：４から２：１である、混合物と
を含む、請求項７に記載の防腐剤組成物（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の総重量に基づく）。

【請求項9】

化粧品又はパーソナルケア製品中の微生物の増殖を防止又は阻害する方法であって、前記化粧品又はパーソナルケア製品に、請求項１から８の何れか一項に記載の防腐剤組成物を、前記化粧品又はパーソナルケア製品の全重量１００％に基づいて、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の合計として計算して０．１から１０．０重量％の量で添加する工程を含む、方法。

【請求項10】

請求項１から８の何れか一項に記載の防腐剤組成物が、前記化粧品又はパーソナルケア製品に、前記化粧品又はパーソナルケア製品の全重量１００％に基づいて、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の合計として計算して０．５から５．０重量％の量で添加される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記化粧品又はパーソナルケア製品が、シャンプー、ローション、シャワージェル、バブルバス、バスオイル、クリーム、ベビー用品、液体石鹸、ヘアージェル、メイクアップ用品、及び日焼け止めからなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

請求項１から８の何れか一項に記載の防腐剤組成物を含む、防腐処理された化粧品又はパーソナルケア製品であって、
前記防腐剤組成物を、前記化粧品又はパーソナルケア製品の全重量１００％に基づいて、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の合計として計算して０．１から１０．０重量％の量で含む、製品。

【請求項13】

請求項１から８の何れか一項に記載の防腐剤組成物を含む、防腐処理された化粧品又はパーソナルケア製品であって、
前記防腐剤組成物を、前記化粧品又はパーソナルケア製品の全重量１００％に基づいて、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の合計として計算して０．５から５．０重量％の量で含む、製品。

【請求項14】

前記化粧品又はパーソナルケア製品が、シャンプー、ローション、シャワージェル、バブルバス、バスオイル、クリーム、ベビー用品、液体石鹸、ヘアージェル、メイクアップ用品、及び日焼け止めからなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ソルビン酸又はその塩をベースとする相乗作用を有する防腐剤ブレンドに関する。

【背景技術】

【0002】

ソルビン酸は、食物及び飼料、医薬品、並びに化粧品等の種々の製品のための防腐剤として、長年使用されてきた天然に存在する酸である。ソルビン酸は、本質的にヒト及び哺乳動物に対して非毒性であり、且つ微かな匂いを有するだけなので、より問題となる毒物学的又は感覚的特性を有する他の防腐剤に取って代るものとして魅力的である。しかし、ソルビン酸は、水に比較的やや難溶性の固体である。実用的な理由から、シャンプー、ローション、クリーム、液体石鹸等の液体又は半液体の化粧品及びパーソナルケア製品の製造者は、それらの製品に容易に混合することができる液体又は易溶性の防腐剤配合物を好む。更に、ソルビン酸及びその塩の殺菌性能はあまり高くない。
従って、本発明の目的は、改善された殺菌活性を有する液体形態のソルビン酸系防腐剤を提供することであった。

【0003】

本発明によれば、この目的は、請求項１に記載の防腐剤ブレンドにより達成された。
驚くべきことに、１，４−ブタンジオール及び１，３−ブタンジオールから選択されるブタンジオール、１，２−プロパンジオール及び１，３−プロパンジオールから選択されるプロパンジオール、ベンジルアルコール、並びにソルビン酸又はその塩を含む組成物が、化粧品及びパーソナルケア配合物に容易に混合することができる均質な液体であるのみならず、これらの成分を単独で使用した場合と比較してかなりの相乗効果を有することも見出された。

【0004】

本発明によれば、この相乗作用を有する防腐剤組成物には、
（ａ）１から２０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）１０から８９重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）１０から８９重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物；及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物
の混合物（ここで、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比は、１：４から４：１である）と；
が含まれる（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全重量に基づく）。

【0005】

好ましい実施態様では、この相乗作用を有する防腐剤組成物には、
（ａ）１から１０重量％のソルビン酸又はその塩と；
（ｂ）２０から７０重量％のベンジルアルコールと；
（ｃ）２０から７０重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物；及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物
の混合物（ここで、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比は、１：４から４：１である）と；
が含まれる（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全重量に基づく）。

【0006】

より好ましくは、この相乗作用を有する防腐剤組成物には
（ａ）２から１０重量％のソルビン酸又はその塩と、
（ｂ）２０から５０重量％のベンジルアルコールと、
（ｃ）４０から７０重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物、及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物
の混合物（ここで、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比は、１：４から４：１である）と
が含まれる（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全重量に基づく）。

【0007】

最も好ましくは、この相乗作用を有する防腐剤組成物には、
（ａ）４から１０重量％のソルビン酸又はその塩と、
（ｂ）２０から４５重量％のベンジルアルコールと、
（ｃ）５０から７０重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、又はそれらの混合物、及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、又はそれらの混合物の
混合物（ここで、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比は、１：４から４：１である）と
が含まれる（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全重量に基づく）。

【0008】

一の好ましい実施態様では、この相乗作用を有する防腐剤組成物の成分（ｃ）は、（ｉ）１，２−プロパンジオール及び（ｉｉ）１，４−ブタンジオールの混合物である。
より好ましくは、この相乗作用を有する防腐剤組成物には、
（ａ）４から１０重量％のソルビン酸又はその塩と、
（ｂ）２０から４５重量％のベンジルアルコールと、
（ｃ）５０から７０重量％の
（ｉ）１，２−プロパンジオール；及び
（ｉｉ）１，４−ブタンジオールの混合物（ここで、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比は、１：４から２：１である）と
が含まれる（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全重量に基づく）。

【0009】

別の好ましい実施態様では、この相乗作用を有する防腐剤組成物の成分（ｃ）は、（ｉ）１，３−プロパンジオール及び（ｉｉ）１，３−ブタンジオールの混合物である。
より好ましくは、この相乗作用を有する防腐剤組成物には、
（ａ）４から１０重量％のソルビン酸又はその塩と、
（ｂ）２０から４５重量％のベンジルアルコールと、
（ｃ）５０から７０重量％の
（ｉ）１，３−プロパンジオール；及び
（ｉｉ）１，３−ブタンジオールの混合物（ここで、（ｉ）対（ｉｉ）の重量比は、１：４から２：１である）と
が含まれる（重量％は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全重量に基づく）。

【0010】

主な成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に加えて、この相乗作用を有する防腐剤組成物には、溶媒、抗酸化剤、安定剤、着色剤、芳香剤及び香料等の補助剤、又は当該技術分野で知られている他の添加剤を含有させることができる。
本発明に係る相乗作用を有する防腐剤組成物は、好ましくは、化粧品又はパーソナルケア製品（トイレタリー）中で微生物が増殖するのを防止又は阻害する方法において使用される。この方法には、前記製品に上記実施態様のうちいずれか１つに係る防腐剤組成物を、それぞれの化粧品又はパーソナルケア製品の全重量１００％に基づいて、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の合計として計算して０．１から１０．０重量％、好ましくは０．５〜５．０重量％の量で添加する工程が含まれる。

【0011】

適切な化粧品及びパーソナルケア製品には、非限定的に、シャンプー、ローション、シャワージェル、バブルバス、バスオイル、クリーム、ベビー用品、液体石鹸、ヘアージェル、メイクアップ用品及び日焼け止めが含まれる。
上記実施態様のうちいずれか１つに係る防腐剤組成物を含む防腐された化粧品及びパーソナルケア製品、又は上記方法によって得られる防腐された化粧品及びパーソナルケア製品もまた、本発明の目的である。
以下の非限定的な例により、本発明を更に説明することを意図する。特に断らない限り、全ての百分率は重量（ｗ ／ ｗ）による。

【実施例】

【0012】

例１
防腐剤濃縮物の調製
ソルビン酸（６ｇ）を攪拌下でベンジルアルコール（２０ｇ）、１，２−プロパンジオール（３７ｇ）及び１，４−ブタンジオール（３７ｇ）の混合物に、透明な無色の溶液が得られるまで溶解した。

【0013】

例２
接種試験、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）
Ａ）試薬及び培地
トリプシン大豆ブロス(tryptic soy broth)：３０ｇの培地（Ｍｅｒｃｋ）を１Ｌの脱イオン水に懸濁する。９ｍＬを２０ｍＬのガラス管に分注して、オートクレーブする（１２１℃にて１５分間）。最終的なｐＨは７．３±０．２である。
トリプシン性大豆寒天プレート：既製のプレート（Ｍｅｒｃｋ）。最終的なｐＨは７．３±０．２である。
サブロー−２％グルコース−寒天プレ−ト：既製のプレ−ト（Ｍｅｒｃｋ）。最終的なｐＨは５．６±０．２である。
サブロー−２％グルコース−寒天傾斜培地：４７ｇの培地（Ｍｅｒｃｋ）を１Ｌの脱イオン水に懸濁する。約６ｍＬを２０ｍＬのガラス管に分注して、オートクレーブする（１２１℃にて１５分間）。最終的なｐＨは５．６±０．２である。管を傾斜させて、冷却する。
ＮａＣｌ−ペプトン溶液：８．０ｇの塩化ナトリウムと１．５ｇのトリプトン水を１Ｌの脱イオン水に溶解する。９ｍＬを２０ｍＬのガラス管に分注して、オートクレーブする（１２１℃にて１５分間）。
不活化培地：１Ｌの培地の場合、３０．０ｇのトリプシン大豆ブロス、３０．０ｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、３０．０ｇのサポニン、１．０ｇのヒスチジン及び１．０ｇのシステインを脱イオン水に溶解する。少量のアリコートに分けて、オートクレーブする（１２１℃にて１５分間）。

【0014】

Ｂ）接種物の調製
略等量の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ６５３８、緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７及び大腸菌ＡＴＣＣ ８７３９を含有する混合接種物を、以下の手順に従って調製した：
各細菌株の１つのコロニーを、保存培養株からトリプシン大豆寒天プレートに移し、１８〜２４時間、３７±２℃でインキュベートした。次に、このようにして得られた各々の培養株の幾つかのコロニーをトリプシン大豆ブロス管に移し、再び、１８〜２４時間、３７±２℃でインキュベートして、細菌継代培養株を得、これの２００μＬを滅菌プラスチック管中の２ｍＬのＮａＣｌ−ペプトン溶液に添加して、約１０^９ｃｆｕ／ｍＬのそれぞれの細菌を含有する接種物を得た。最終的に、混合接種物を、等容積の各接種物を混合することにより調製した。

【0015】

Ｃ）接種試験
例１で得られた防腐剤組成物を、２種の異なる濃度でベルギー、エスタンピュイのＭｃＢｒｉｄｅ ＷＣＥから供給される通常の髪の毛用の防腐処理されていない標準的なシャンプー調製物（「Ｓｈａｍｐｏｏ ＵＬＤ」）のサンプル２０ｇに添加した。比較のために、追加した２０ｇのサンプルについて、防腐剤組成物の成分の各々を単独で又は２種の又は３種の成分の組合せのいずれかで当量にて使用して試験した。その後、各サンプルに、工程Ａ）で得た混合接種物２００μＬを接種し、激しく振とうして、均質な汚染物を得た。その後、サンプルを室温で保存し、７日毎に、２００μＬのサンプルを採取し、各々を１．８ｍＬの不活化培地と混合し、得られた混合物１００μＬを寒天プレートの表面に均質に塗布し、２〜３日間、３７±２℃でインキュベートすることにより、細菌のカウントを測定した。インキュベート期間後、寒天プレート上に形成されたコロニーをカウントし、その結果をｃｆｕ／ｍＬに換算した。必要に応じて、連続希釈液をＮａＣｌ−ペプトンで調製して、細菌のカウントが高い場合に対処した。その結果を、以下の表１に記載する。「０日」における記載は、接種物の細菌のカウントから計算した開始時のレベルを表す。イタリック体での記載は比較試験を示す。

【0016】

【表1】

【0017】

例３
接種試験、真菌（ｆｕｎｇｉ）
Ａ）接種物の調製
略等量のカンジダアルビカンスＡＴＣＣ １０２３１と黒色アスペルギルスＡＴＣＣ １６４０４を含有する混合接種物を、以下の手順に従って調製した：
カンジダアルビカンスの１つのコロニーを保存培養株からサブロー−２％グルコース寒天プレートに移し、４２〜４８時間、３０±２℃でインキュベートした。その後、このようにして得られた培養株の数個のコロニーを、滅菌プラスチック管中の約２ｍＬのＮａＣｌ−ペプトン溶液に移し、微生物のカウントが約１０^８ｃｆｕ／ｍＬである接種物を得た。
約１００μＬの黒色アスペルギルスの胞子の保存溶液を、サブロー−２％グルコース−寒天傾斜培地に移し、その表面上に均一に広げ、１０〜１２日間、３０±２℃でインキュベートした。その後、ＮａＣｌ−ペプトン溶液（９ｍＬ）を、傾斜培地に、幾つかの滅菌ガラスビーズと共に添加し、激しく振とうした。得られた混合物を、滅菌ガラスウールを介して、空の滅菌管中にろ過した。微生物のカウントを、プレートカウント（３０±２℃にて２〜５日間インキュベートする。）によりチェックして、約２×１０^７ｃｆｕ／ｍＬであることを確認した。
最終的に、混合接種物を、等容積の各接種物を混合することにより調製した。

【0018】

例１で得た防腐剤組成物を、ｐＨ５．５を有し、且つ表２に記載の組成を有する防腐処理されていないシャンプー調製物に添加した。

【表2】

【0019】

比較のために、防腐剤組成物の各々の成分の当量について、単独で又は２種の成分を組合せて試験した。その後、シャンプー調製物を、菌類の混合物と共にインキュベートし、細菌（ｇｅｒｍ）のカウントを、プレートを３〜５日間、３０±２℃でインキュベートしたことを除いて、本質的に例２の工程Ｃ）に記載したのと同じ方法を使用して７日毎に測定した。その結果を以下の表３に記載する。「０日」における記載は接種物の細菌のカウントから計算した開始時のレベルを表す。イタリック体での記載は、比較試験を示す。

【表3】

【0020】

例４
防腐剤濃縮物の調製
例１の手順を、種々の量のソルビン酸を使用して繰返した。４種の組成物（ＡからＤ）を調製した。各組成物の成分の濃度を以下の表４に記載する。

【表4】

【0021】

例５
接種試験
２つのシリーズの接種物（接種＃１及び接種＃２と表示）を、例２と３に記載した方法に従って、微生物の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ６５３８、緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７、バークホルデリアセパシアＡＴＣＣ ２５４１６、肺炎桿菌ＡＴＣＣ ４３５２、エンテロバクターゲルゴビエＡＴＣＣ ３３０２８、及びカンジダアルビカンスＡＴＣＣ １０２３１、並びに、略等量の、化粧品から単離した２種のペニシリウム種及びアスペルギルスブラジリエＡＴＣＣ１６４０４からなる「混合カビ」接種物を使用して調製した。接種物を、２重量％（サンプル全体の重量に基づいて）の表４に記載した防腐剤濃縮物のうち１種を添加することによって防腐処理された試験基剤（ローション）のサンプルに添加して、防腐処理されたサンプルにおけるソルビン酸の濃度をそれぞれ０．０２％、０．０５％、０．０８％及び０．０９％とした。試験基剤の組成物を以下に示す。

成分 含有物名 重量％
脱イオン水 水（ａｑｕａ） ８２．９５
キサンタンガム キサンタンガム １ ．００
グリセロール グリセリン ２．００
Ｖｅｒｓｅｎｅ（登録商標）Ｎａ_２ ＥＤＴＡ二ナトリウム ０．０５
セテアリルアルコール セテアリルアルコール ２．００
ステアリン酸 ステアリン酸 ２．００
Ｌｏｎｚｅｓｔ（商標）ＭＳＡ ステアリン酸グリセリル＆
ＰＥＧ１００ステアラート ２．００
Ｇｌｙｃｏｓｐｅｒｓｅ（商標）
Ｏ−２０ ポリソルバート８０ １．００
ｐＨ調整剤、防腐剤 − ７．００

【0022】

接種物の量を、以下の表５に記載したローションのグラム当たりのコロニー形成単位の数となるように選択した。

【表5】

サンプル（各々３５ ｇ）に、グラム当たり約２×１０^６の細菌又はグラム当たり１０^５の酵母細胞又はカビ胞子を接種した。個々の確認物を、一晩経過した傾斜培地の細菌及び酵母培養物から、及び７から１０日経過した非常に胞子が出ているカビ培養株から調製した。全てのサンプルを、２４時間後及び４週間毎週、生存生物について定量的に（細菌はトリプシン性大豆寒天に及び菌類は麦芽寒天に）塗布し、試験基剤（化粧水）のグラム当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｇ）の数を測定した。０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０と０．０７％のレシチンが添加された変法レーゼンブロスを中和剤として使用した。カビの胞子を接種したサンプルは４８時間後にも塗布した。最初の確認の４週間後、サンプルを再び確認し、同様のサンプリング計画を実施した。対照サンプル（防腐剤なし）に対するｃｆｕ／ｇ数もまた接種＃１と接種＃２の両方の後、０時間（即ち、接種直後）において測定した。その結果を以下の表６から１１に記載する。表１１のデータは、試験基剤に添加する前にエージングした組成物Ｄを用いて調製したサンプルに関する。

【0023】

防腐剤（表４参照） 表番号
なし（防腐処理されていない対照） 表６
組成物Ａ 表７
組成物Ｂ 表８
組成物Ｃ 表９
組成物Ｄ 表１０
組成物Ｄ（エージング＊） 表１１
＊）５０℃にて１月間エージングした後、室温で数か月間貯蔵した。

【表6】

【表7】

【表8】