特許 5990620 ＥＮ２に特異的に結合するＤＮＡアプタマーおよびこれの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5990620

(24)【登録日】2016年8月19日

(45)【発行日】2016年9月14日

(54)【発明の名称】ＥＮ２に特異的に結合するＤＮＡアプタマーおよびこれの用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20160901BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160901BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20160901BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20160901BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20160901BHJP

   G01N 33/547 20060101ALI20160901BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20160901BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 HZNA

   C12N15/00 F

   C12M1/00 A

   G01N33/574 A

   G01N33/553

   G01N33/547

   !C12Q1/68 A

【請求項の数】6

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2015-94438(P2015-94438)

(22)【出願日】2015年5月1日

(65)【公開番号】特開2016-119897(P2016-119897A)

(43)【公開日】2016年7月7日

【審査請求日】2015年5月1日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0188124

(32)【優先日】2014年12月24日

(33)【優先権主張国】KR

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，第６６巻，２０１５年，第３２〜３８頁，エルゼビア社出版（発行日：平成２６年１１月６日）

(73)【特許権者】

【識別番号】509191159

【氏名又は名称】ポステック アカデミー‐インダストリー ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パン、チャンギル

(72)【発明者】

【氏名】キム、ユン‐クン

(72)【発明者】

【氏名】チョ、フンホ

(72)【発明者】

【氏名】イ、ソンファン

(72)【発明者】

【氏名】ヨン、ヒョン チュン

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０８５４８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５４０８５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２５４０７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 MORGAN R. et al.，Engrailed-2 (EN2): a tumor specific urinary biomarker for the early diagnosis of prostate cancer.，Clin Cancer Res, 2011, vol.17, no.5, pp.1090-1098

【文献】 KILLICK E. et al.，Role of Engrailed-2 (EN2) as a prostate cancer detection biomarker in genetically high risk men.，Sci Rep, 2013, 3:2059

【文献】 LEE S. et al.，Cationic surfactant-based colorimetric detection of Plasmodium lactate dehydrogenase, a biomarker for malaria, using the specific DNA aptamer.，PLoS One, 2014 July, vol.9, no.7, e100847

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ Ａｐｔａｍｅｒ）として、配列番号５ないし配列番号１０から選択される塩基配列で構成されることを特徴とする、ＤＮＡアプタマー。

【請求項2】

請求項１記載のＤＮＡアプタマーを含む、前立腺がん診断用の組成物。

【請求項3】

ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）特異的ＤＮＡアプタマー；および上記のＤＮＡアプタマーが固定されている基板を含むが、上記のＤＮＡアプタマーは配列番号５ないし１０から選択される塩基配列で構成されることを特徴とする、前立腺がん診断用のバイオセンサー。

【請求項4】

上記の基板は金属電極層および金属のナノ粒子層で構成されて、上記の金属は金（Ａｕ）であることを特徴とする、請求項３記載の前立腺がん診断用のバイオセンサー。

【請求項5】

上記のバイオセンサーは上記の基板とＤＮＡアプタマーリンカーをさらに含むことを特徴とする、請求項３記載の前立腺がん診断用のバイオセンサー。

【請求項6】

（１）被検体試料を請求項３記載のバイオセンサーに処理する段階；および
（２）上記のバイオセンサーに結合されたＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）のレベル（ｌｅｖｅｌ）を測定する段階を含む、前立腺がん診断のための情報提供方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー、これを含む前立腺がん診断用のバイオセンサー、および前立腺がん診断のための情報提供方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

前立腺がんは男性に最も一般的な形態のがんであり、５０歳以上の男性の３割が発病すると推定される。複数の臨床的な証拠によれば、ヒトの前立腺がんは骨へ転移される傾向を有するとみられて、アンドロゲン依存性の状態からアンドロゲン耐性の状態へ不可避に進行されて患者の死亡率を増加させると知られている。さらに、前立腺がん治療を受けた男性の約２５％は病が再発して追加的な治療を必要とする疾病として、現在アメリカで男性のがん死亡原因の中で第２の原因を示しているので、これに関する早期診断および治療が必要な実情である。

【0003】

現在使用されている前立腺がん診断法の中で直接的な方法としては、前立腺を直接造影したり組織検査を通じた診断方がある。直接造影したり組織検査により診断する場合には、初期に前立腺がんの発病の可否を診断することに困難があるところ、体外で診断できる方法の開発が至急である。

【0004】

間接的な方法ではｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）検査を利用して体外で検診できる診断方法がある。しかし、診断に利用されるＰＳＡは悪性前立腺の上皮組織だけではなく、正常および良性からも生成されて前立腺がんの検出においての仮性良性率を高める結果をもたらした。また、血清ＰＳＡのレベルが非常に高い場合には効果的な前立腺がんの標準的な診断方法で用いられるが、一方、ＰＳＡ血清のレベルが２−１０ｎｇ／ｍＬのように低い場合には、確かな前立腺がん診断ができない。上記のようにＰＳＡ濃度が低い場合には血清ＰＳＡはＢＰＨ（ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、前立腺炎またはその他身体的な外傷のような非−腫瘍疾病から由来できるので、前立腺がんの診断のためのＰＳＡ分析は検出特異性と関連して問題点が存在する。

【0005】

したがって、新規のバイオマーカーを用いた前立腺がんの診断が主要な課題の対象になっていて、これに関する研究が行われているが（韓国特許公開番号１０−２００９−０１１１３０７）、まだ不十分なのが実情である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】韓国特許公開番号１０−２００９−０１１１３０７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は上記のような問題点を解決するために案出されたもので、本発明から製造されたＤＮＡアプタマーのＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）タンパク質に対する特異的な結合能を確認してこれに基づいて本発明を完成するようになった。

【0008】

これで、本発明の目的はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡアプタマー）の開発で、配列番号５ないし１０から選択される塩基配列で構成されることを特徴とする、ＤＮＡアプタマーを提供することである。

【0009】

また、本発明の他の目的は上記のＤＮＡアプタマーを含む、前立腺がん診断用の組成物を提供することである。

【0010】

また、本発明の他の膜的はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）特異的ＤＮＡアプタマー；および上記のＤＮＡアプタマーが固定されている基板を含むが、上記のＤＮＡアプタマーは配列番号５ないし１０から選択される塩基配列で構成されることを特徴とする、前立腺がん診断用のバイオセンサーを提供することである。

【0011】

また、本発明のもう一つの目的は（１）被検体試料を上記のバイオセンサーに処理する段階；および上記のバイオセンサーに結合されたＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）のレベル（ｌｅｖｅｌ）を測定する段階を含む、前立腺がん診断のための情報提供方法を提供することである。

【0012】

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるだろう。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記のような本発明の目的を達成するために、本発明はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ Ａｐｔａｍｅｒ）で、配列番号５ないし１０から選択される塩基配列で構成されることを特徴とする、ＤＮＡアプタマーを提供する。

【0014】

また、本発明は上記のＤＮＡアプタマーを含む、前立腺がん診断用の組成物を提供する。

【0015】

また、本発明はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）特異的ＤＮＡアプタマー；および上記のＤＮＡアプタマーが固定されている基板を含むが、上記のＤＮＡアプタマーは配列番号５ないし１０から選択される塩基配列で構成されることを特徴とする、前立腺がん診断用のバイオセンサーを提供する。

【0016】

本発明の一具現例として、上記の基板は金属電極層および金属ナノ粒子層構成されて、上記の金属は金（Ａｕ）であることができる。

【0017】

本発明の他の具現例として、上記のバイオセンサーは上記の基板とＤＮＡアプタマーの間のリンカーをさらに含むことができる。

【0018】

また、本発明は（１）被検体試料を上記のバイオセンサーに処理する段階；および上記のバイオセンサーに結合されたＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）のレベル（ｌｅｖｅｌ）を測定する段階を含む、前立腺がん診断のための情報提供の方法を提供する。

【0019】

また、本発明はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ Ａｐｔａｍｅｒ）を含む組成物の前立腺がんの診断用度を適用する。

【発明の効果】

【0020】

本発明による組成物はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ Ａｐｔａｍｅｒ）を有効成分として含めて、上記のＤＮＡアプタマーおよびこれを利用したバイオセンサーで、ＥＮ２タンパク質との強い結合力と優れた特異性を確認したところ、従来のＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）検査の検出特異性問題を克服した前立腺がん診断用の組成物として有用に用いられると期待される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＥＮ２タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、およびｓｉｚｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙで確認した結果である。

【図2】ＥＮ２タンパク質と特定の結合配列を有するｄｓＤＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）の間の結合可否をＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）を通じて確認した結果である。

【図3】ＥＮ２タンパク質と特定の結合配列を有するｄｓＤＮＡの間の結合可否をＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を通じて確認した結果である。

【図4】ＥＮ２タンパク質濃度（１ｎＭ〜１００ｎＭ）によるｄｓＤＮＡプローブとの結合可否をＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（ＳＧＩ）スペクトルを通じて確認した結果である。

【図5】ＥＮ２タンパク質濃度（１ｎＭ〜１００ｎＭ）によるｄｓＤＮＡプローブとの結合により蛍光信号の減少を数値化した結果である。

【図6】ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマーの２次構造を表したものである。

【図7】ＤＮＡアプタマーを用いたＥＮ２タンパク質検出用のバイオセンサーの製造方法に関しての概略的な模式図である。

【図8】ＥＮ２タンパク質検出用のバイオセンサーで、ＤＮＡアプタマーのループの長さによるインピーダンス（ｉｍｐｅｄａｎｃｅ）値の変化を表した結果である。

【図9】ＥＮ２タンパク質検出用のバイオセンサーで、ＤＮＡアプタマーのステムの長さによるインピーダンス値の変化を表した結果である。

【図10】ＥＮ２タンパク質検出用のバイオセンサーで、金の表面とＤＮＡアプタマー間のリンカーの長さによるインピーダンス値の変化を表した結果である。

【図11】ｈｐＤＮＡ３アプタマーを含むＥＮ２タンパク質検出用のバイオセンサーで、ＥＮ２タンパク質濃度（１ｎＭ〜１００ｎＭ）によるインピーダンス値の変化を表した結果である。

【図12】ｈｐＤＮＡ３アプタマーを含むＥＮ２タンパク質検出用のバイオセンサーで、ＥＮ２タンパク質濃度のＬｏｇ値によるインピーダンス値の変化を表した結果である。

【図13】ｈｐＤＮＡ３アプタマーを含むＥＮ２タンパク質検出用のバイオセンサーで、様々なタンパク質の間の結合可否および混合された溶液でのＥＮ２タンパク質との結合可否を相対的なインピーダンス値を通じて確認した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

奔発明者はＥＮ２と強い結合能を有するＤｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡに基づいたＨａｉｒｐｉｎ構造のＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ Ａｐｔａｍｅｒ）およびこれを用いたバイオセンサーを製造して、上記のＤＮＡアプタマーおよびバイオセンサーのＥＮ２に対する強い結合力と優れた特異性を確認して、これに基づいて本発明を完成した。

【0023】

以下、本発明を具体的に説明する。

【0024】

本発明はＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）に特異的に結合するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ Ａｐｔａｍｅｒ）を提供する。

【0025】

本発明で、「ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）」は従来の前立腺がん診断に用いられるＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）検査の検出特異性の問題を解決できるバイオマーカー（ｂｉｏ−ｍａｒｋｅｒ）の一つである。ＥＮ２タンパク質は細胞の中で、転写因子として作用して、前立腺がん細胞の中では過多発現されてＤＮＡ転写調節障害をもたらす。さらに前立腺がん細胞内でＥＮ２発現が増加する場合、小便で排泄されるＥＮ２タンパク質の量もまた増加するから、体外分析に適合するので、ＥＮ２タンパク質を検出により効果的に前立腺がんを診断することができる。

【0026】

本発明で用いられる用語、「アプタマー」という特定物質に対して高い特異性と親和度を有する 一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡである。 従来に開発されている抗体を用いた方法は、生体の免疫システムを利用して作られているので、比較的に多くの時間がかかり、高コストであるという点、タンパク質であるため、その安定性が問題になる場合がありますが、アプタマーは合成において、比較的に単純な方法で可能であり、細胞、タンパク質、小さな有機物質も標的物質になることがあるため、これを利用した新しい検出方法の開発が可能であり、その特異性および安定性がすでに開発されている抗体に比べて非常に高い点に着目して、ＥＮ２タンパク質の特異的検出のためにＤＮＡアプタマーを使用した。上記のアプタマーは、好ましくは、配列番号５ないし１０の塩基配列からなることができるが、これらに限定されるものではない。

【0027】

また、本発明は、上記ＤＮＡアプタマーを含む、前立腺がんを診断するための組成物を提供する。

【0028】

本発明の組成物は、上記のＤＮＡアプタマー以外に薬理学的にも生理学的にも許容される担体、賦形剤、希釈剤をさらに含むことができ、これらの組成物に含めることができる適切な担体、賦形剤、および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロフィールヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油などを挙げることができる。上記の組成物は、薬剤化する場合、通常の充填剤、増量剤、結合剤、崩解剤、界面活性剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。

【0029】

また、本発明は、ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）特異的ＤＮＡアプタマー;上記のＤＮＡアプタマーが固定されている基板を含む、前立腺がん診断用のバイオセンサーを提供する。

【0030】

本発明の上記のＤＮＡアプタマーが固定されている基板は、金属電極層と金属ナノ粒子層からなり、上記の電極層とナノ粒子の材質は、電界または磁界によって誘引されることがあり、電界の特性を変化させることができる任意の材質も用いることができ、好ましくは、金（Ａｕ）からなることができるが、これらに限定されるものではない。

【0031】

また、上記のバイオセンサーは、ＥＮ２の特異的な結合を向上させるために、上記の基板とＤＮＡアプタマーの間にリンカーをさらに含むことができる。上記のリンカーは、５個から１５個の塩基配列からなることができ、好ましくは、１０個の塩基配列からなることができるが、これらに限定されるものではない。

【実施例】

【0032】

本発明の一実施例では、ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）タンパク質を発現、精製して５‘−ＴＡＡＴＴＡ−３’の特定の結合配列を確認し（実施例１ないし３参照）、上記の特定の結合配列を有するｄｓＤＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）のＥＮ２タンパク質との強い結合能を確認した（実施例４ないし５を参照）。また、上記の実験結果に基づいて、安定性および結合能が強化されたＤＮＡアプタマーとバイオセンサーを製造して（実施例６ないし７を参照）、上記のバイオセンサーは、ＥＮ２タンパク質に対する結合特異性も非常に優れているので、前立腺がんの診断のための情報提供の方法で用いることができることを確認した（実施例８参照）。

【0033】

そこで、（１）本発明は、被検体試料を上記バイオセンサに処理する段階；および、（２）上記のバイオセンサーに結合されたＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）のレベル（ｌｅｖｅｌ）を測定する段階を含む、前立腺がんの診断のための情報提供の方法を提供する。

【0034】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されているものであり、下記の実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。

【0035】

実施例１．ＥＮ−２遺伝子クローニング
ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）遺伝子を増幅するために、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（５‘−ＣＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＡＣ ＣＣＣ ＡＡＧ Ｃ−３ ’（配列番号１））とｒｅｖｅｒｓｅプライマー（５‘−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＧＡ ＣＴＴ ＧＣ−３ ’（配列番号２））を使用した。

【0036】

遺伝子増幅のためにcＤＮＡからｉ−ｐｆｕポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プロセスを介して増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応の各ステップは、次の通りである。 １）鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）の二本鎖ＤＮＡを解放する段階で９５℃で１分、２）鋳型とプライマーが結合するステップで５８℃で３０秒、３）新しい鎖を合成していく段階で、72℃で1分反応させ、このような手続きを３０回繰り返した。

【0037】

増幅されたＥＮ２遺伝子は、制限酵素切断反応とＤＮＡライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を介して（Ｈｉｓ）６−ｔａｇが含まれたベクトルであるｐＥＴ２８ａ−ｒｕベクトルにクローニングし、上記のベクトルを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ． ｃｏｌｉに形質転換した。

【0038】

実施例２．ＥＮ−２タンパク質の発現
ＥＮ２（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２）遺伝子が形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、３７℃のＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養した。その後、タンパク質の発現を誘導するために最終濃度が０．１ ｍＭになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加した後、３７℃で４時間培養した。タンパク質の発現は、ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓで確認し、細胞を高速遠心分離器を用いて、培地から分離させた後、ＰＢＳ（１０ ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）ｂｕｆｆｅｒで一度洗浄した。

【0039】

実施例３．ＥＮ−２タンパク質の精製
バクテリア細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現されたＥＮ２タンパク質を高純度に精製するために細胞溶菌バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭβ-ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、3％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０１％ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ８．０）に細胞を溶かした後、超音波破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して、１５分間超音波粉砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）することにより、細胞を破壊した。水溶液上のタンパク質と細胞を分離するために遠心分離した。

【0040】

また、高純度のタンパク質を得るためにＮｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と（Ｈｉｓ）６−ｔａｇのアミノ酸が結合する特性を利用した。具体的には、図１に示すように、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに吸着されたタンパク質の（Ｈｉｓ）６−ｔａｇはイミダゾール（ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）の化合物と競争的に吸着するので、ｉｍｉｄａｚｏｌｅの濃度を順次に高めることで、４０ｋＤのＥＮ２タンパク質を高純度に分離した。

【0041】

ただし、上記のようにＮｉ−ＮＴＡカラムで精製したタンパク質試料は、不純物が多く含まれている可能性がありますので、追加の精製を実施した。したがって、タンパク質のｐＩ値により分離するｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅコラムであるＭｏｎｏＱカラムを使用して、もう一度精製し、この後、タンパク質をサイズに応じて分離するｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎコラムのｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００コラムを利用してもう一度分離して、純度を９５％以上に高めた。

【0042】

実施例４．ＥＮ−２結合の有無の測定
ＥＮ２タンパク質は転写因子として、５‘−ＴＡＡＴＴＡ−３’の特定の結合配列を有していることを確認し、本発明者は、上記の特定の結合配列を有するＤｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を利用して、ＥＮ２特異的ＤＮＡアプタマーを設計しようとした。これに先んじて、５’−ＴＡＡＴＴＡ−３‘の特定の結合配列にＥＮ２が結合することができるかどうかを評価し、ＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）とＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を実施した。

【0043】

具体的には、ＥＭＳＡから、ＥＮ２タンパク質と特定の結合配列を有しているｄｓＤＮＡが含まれている溶液を３０分間反応させた後、ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１００ Ｖ、５０ ｍｉｎ）を実施した。また、ＳＰＲで、ＮＴＡ ｃｈｉｐに固定されたＥＮ２タンパク質と特定の結合配列を有しているｄｓＤＮＡが含まれている溶液と反応させた後、物質の組成変化に伴う共鳴波長の移動を観察することによって、ＥＮ２タンパク質との結合の有無を測定した。

【0044】

その結果、図2に示すように、ＥＭＳＡはｄｓＤＮＡとＥＮ２タンパク質の結合による移動速度の減少を確認し、ＥＮ２濃度が増加するにつれて、明確な移動速度の減少を確認した。また、図3に示すように、ＳＰＲではｄｓＤＮＡとＥＮ２タンパク質結合によるＳＰＲ信号の増加（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）と、ｄｓＤＮＡとＥＮ２タンパク質の間の強い結合により増加されたＳＰＲ信号の遅れの減少（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）を確認した。上記の結果は、５‘−ＴＡＡＴＴＡ−３配列を有するｄｓＤＮＡはＥＮ２タンパク質と強い結合を形成することを示す。

【0045】

実施例５．蛍光測定を通じたＥＮ−２結合力の測定
上記のｄｓＤＮＡプローブを用いた定量的な分析が可能かどうかを確認するために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＳＧＩ）の蛍光色素を用いた蛍光分析を実施した。 ＥＮ２タンパク質が存在しない場合、ＳＧＩがｄｓＤＮＡプローブに結合して蛍光シグナルを発生させる一方、ＥＮ２タンパク質が存在する場合、ｄｓＤＮＡプローブがＥＮ２タンパク質に結合してＳＧＩの結合が減ることになる。本実施例では、様々なＥＮ２濃度（１ｎＭ〜１００ｎＭ）でのＳＧＩスペクトルを解析することにより、蛍光シグナルの減少するかどうかを比較した。

【0046】

その結果、図４ないし図５に示すように、対照群（０ ｎＭ）と比較して、ＥＮ２濃度が増加するにつれて、蛍光シグナルも減少することを確認した。上記の結果は、本発明のｄｓＤＮＡプローブを利用して、ＥＮ２特異的検出のための定量的分析が可能であることを意味する。

【0047】

実施例６．向上された安定性と結合強度を有するＤＮＡアプタマーの製造
ＥＮ２タンパク質の検出の安定性と結合強度を向上させるために、Ｈａｉｒｐｉｎ構造を有するＤＮＡアプタマーを設計した。図6に示すように、上記のＤＮＡアプタマーはＬｏｏｐ部分とＳｔｅｍ部分に分けられ、Ｌｏｏｐ部分とＳｔｅｍ部分の長さが異なるＤＮＡアプタマー（ｈｐＤＮＡ１、ｈｐＤＮＡ２、ｈｐＤＮＡ３、ｈｐＤＮＡ４、ｈｐＤＮＡ５、ｈｐＤＮＡ６）を製造した。

【0048】

この後、ＥＮ２タンパク質と、各ＤＮＡアプタマーの間の結合の強さを比較するために、ＥＮ２タンパク質と、各ＤＮＡアプタマーの間の解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｄ）を測定した。このとき、ＤＮＡアプタマーにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ａｍｉｄｉｔｅ（ＦＡＭ）をマーカーとして付着させ、ＦＡＭの蛍光シグナルからタンパク質に結合したＤＮＡアプタマーの量を測定した。

【0049】

その結果、下記の表１に示すように、Ｈａｉｒｐｉｎ ＤＮＡの構造を有するＤＮＡアプタマー（ｈｐＤＮＡ）は従来のｄｓＤＮＡプローブと比較して、概ね解離定数の値が減少することを確認した。特に、ｈｐＤＮＡ２とｈｐＤＮＡ３はＬｏｏｐ部分の２ ｂａｓｅｓ差で解離定数の値が大きく変わったのに対し、ｈｐＤＮＡ３とｈｐＤＮＡ５の間に大きな変化がなかった点を考慮すると、Ｌｏｏｐ部分の長さがＤＮＡアプタマーの結合強度に大きな影響を及ぶことを確認した。また、Ｌｏｏｐ部分の長さが８ ｂａｓｅｓのｈｐＤＮＡ3、ｈｐＤＮＡ5、ｈｐＤＮＡ６が他のＤＮＡアプタマーと比較して、解離定数値が低いことを確認しており、上記の結果は、Ｌｏｏｐ部分の長さが８ ｂａｓｅのＤＮＡアプタマーはＥＮ２タンパク質の検出において、最も安定性の高いことを意味する。

【0050】

【表1】

【0051】

実施例７．検出条件の最適化およびバイオセンサーの製作
ＥＩＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）技術を利用して、検出感度に優れたバイオセンサーを設計した。図6に示すように、まず、金電極に金ナノ粒子を吸着させた後、ＤＮＡアプタマーを電極に結合させることで、ＥＮ２検出用のバイオセンサーを製造した。

【0052】

上記のセンサにＥＮ２タンパク質が結合すると、電子の流れを妨げるようになって増加されたインピーダンス値を示すようになるので、このような性質を利用して、最適化されたＥＮ２検出用のバイオセンサーを製造した。具体的には選択性と検出感度を高めるためにＤＮＡアプタマーのｌｏｏｐの長さ、ｓｔｅｍの長さ、および金表面とＤＮＡアプタマーの間のリンカーの長さの変化によるインピーダンス（ｉｍｐｅｄａｎｃｅ）値の変化を測定した。

【0053】

また、上記の実施例では、最適化されたアプタマーで構成されたバイオセンサーを用いて、ＥＮ２タンパク質の定量的検出可能かどうかを確認した。

【0054】

その結果、図８ないし１０に示すように、Ｌｏｏｐ部分の長さとＳｔｅｍ部分の長さがそれぞれ８ ｂａｓｅｓ、１４ ｂａｓｅｓ（ｈｐＤＮＡ3）のときのインピーダンス値が最も高いことを確認しており、これはＥＮ２タンパク質が最も多く結合したことをを意味する。これを基に、上記の実施例６と同様にＬｏｏｐ部分の長さが８ｂａｓｅのｈｐＤＮＡ3が結合力が高く、安定した序列であることを確認した。また、金表面と繋ぐ、ｐｏｌｙ Ａ配列で構成されたＬｉｎｋｅｒ部分の長さは、１０ ｂａｓｅｓが最も適していることで確認された。

【0055】

また、上記の結果に基づいて、最適化された条件に基づいて選択されたｈｐＤＮＡ3アプタマーを利用して、ＥＮ２タンパク質を検出した。その結果、図１１に示すように、Ｎｙｑｕｉｓｔ図式で、ＥＮ２の濃度が高くなるほど（１０ ｆＭ〜１ ｎＭ）のインピーダンス値が増加することを確認し、図１２に示すように、ＥＮ２の検出が定量的に行われて、検出限界は５．６２ ｆＭであることを確認した。

【0056】

実施例８．ＥＮ−２結合の特異性の確認
ＤＮＡアプタマーは選択的に結合するかどうかを確認するために、いくつかのタンパク質試料に対する結合特異性を確認した。人工尿溶液（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｕｒｉｎｅ Ｍｅｄｉｕｍ）に各タンパク質の濃度が１０ ｐＭになるように混合した後、ＤＮＡアプタマーとの結合可否を確認した。

【0057】

その結果、図１３に示すように、ＥＮ２タンパク質に対する優れた結合特異性を確認した。特に、ＴＡＴＡ ｂｏｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰ）は、ＥＮ２と同様Ｈｏｍｅｏｂｏｘを認識する転写因子であるにもかかわらず、本発明で開発されたＤＮＡアプタマーと結合しないことが確認された。また、いくつかのタンパク質が混合された溶液でＥＮ２が存在しない場合は、信号が検出されておらず、ＥＮ２を入れたときは、信号が検出される結果が示した。

【0058】

上記の結果は、本発明で開発されたＤＮＡアプタマーがＥＮ２タンパク質に対して高い結合特異性を有しているだけでなく、複雑な生物学的試料でも、バイオセンサーとして用いられることを意味する。

【0059】

前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有するものは本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更しなくて、他の具体的な形態に容易に変更が可能であることを理解できるだろう。したがって、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的ではないものとして理解するべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]