特許 5990987 微生物固定方法、および微生物検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5990987

(24)【登録日】2016年8月26日

(45)【発行日】2016年9月14日

(54)【発明の名称】微生物固定方法、および微生物検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20160901BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160901BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160901BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/00 N

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 A

【請求項の数】3

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2012-89782(P2012-89782)

(22)【出願日】2012年4月11日

(65)【公開番号】特開2013-215153(P2013-215153A)

(43)【公開日】2013年10月24日

【審査請求日】2015年2月24日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000099

【氏名又は名称】株式会社ＩＨＩ

(74)【代理人】

【識別番号】110000936

【氏名又は名称】特許業務法人青海特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】石井 浩介

(72)【発明者】

【氏名】北野 誠

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−１０１３６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０７−１７７９００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０１２１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４５４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０８５３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Microbiological Methods，２００６年，Vol. 67，p. 373-380

【文献】 水環境学会誌 Journal of Japan Society on Water Environment，２００９年，Vol. 32, No. 5，p. 267-272

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

固定前の微生物を含む溶媒を９９℃以上で１５秒間以上加熱して該微生物を固定することを特徴とする微生物固定方法。

【請求項2】

パラホルムアルデヒドを用いずに前記微生物を固定することを特徴とする請求項１に記載の微生物固定方法。

【請求項3】

ＦＩＳＨ法を用いた微生物検出方法であって、
固定前の検出目的の微生物を含む溶媒を９９℃以上で１５秒間以上加熱して該検出目的の微生物を固定する工程と、
固定された前記検出目的の微生物をプローブとともにインキュベートすることで、該検出目的の微生物の核酸と該プローブとを相補的に結合させる工程と、
前記相補的に結合させる工程において残存したプローブを除去する工程と、
前記検出目的の微生物の核酸と相補的に結合したプローブを検出する工程と、
を含むことを特徴とする微生物検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物を固定する微生物固定方法、およびこれを用いた微生物検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物数を定量するために、ＦＩＳＨ（Fluorescence In Situ Hybridization）法が広く利用されている。ＦＩＳＨ法では、まず、採取した場所から微生物の検出を行う施設（試験機関や研究機関、分析機関等）に移動する際に微生物が増殖してしまう事態を回避するために固定（微生物の細胞分裂を抑止すること）を行う。そして、検出目的の微生物のｒＲＮＡと相補的に結合する蛍光標識されたプローブと、固定した微生物群とを、ハイブリダイズさせる。続いて、蛍光顕微鏡やフローサイトメータで、プローブを検出することにより、検出目的の微生物数の定量を行う。

【0003】

微生物の固定方法としては、４％のパラホルムアルデヒド中に４℃で１．５時間〜１６時間程度、微生物を浸漬させておく方法が一般的に行われている（例えば、非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】R I Amann,et al, Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations., Appl. Environ. Microbiol.1990, 56(6):1919.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、上述した非特許文献１の技術では、微生物の固定に１．５時間〜１６時間といった長時間を要している。このため、ＦＩＳＨ法を利用して微生物の定量を試みる場合、微生物の採取から定量結果が得られるまでに、最短で７時間も要することになっていた。

【0006】

また、固定に利用されるパラホルムアルデヒドは、毒性を有するため、ディスポーザルの手袋を着用したり、保護眼鏡をかけたりする等、安全を確保するために注意が必要であった。また、パラホルムアルデヒドを含む廃液の処理に費用がかかっていた。

【0007】

そこで本発明は、このような課題に鑑み、新規の簡易な構成で、微生物の固定を短時間で行うことができる微生物固定方法、およびこれを用いた微生物検出方法を提供することを目的としている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題を解決するために、本発明の微生物固定方法は、固定前の微生物を含む溶媒を９９℃以上で１５秒間以上加熱して該微生物を固定することを特徴とする。
また、パラホルムアルデヒドを用いずに前記微生物を固定するとしてもよい。

【0009】

上記課題を解決するために、本発明の微生物検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いた微生物検出方法であって、固定前の検出目的の微生物を含む溶媒を９９℃以上で１５秒間以上加熱して該検出目的の微生物を固定する工程と、固定された前記検出目的の微生物をプローブとともにインキュベートすることで、該検出目的の微生物の核酸と該プローブとを相補的に結合させる工程と、前記相補的に結合させる工程において残存したプローブを除去する工程と、前記検出目的の微生物の核酸と相補的に結合したプローブを検出する工程と、を含むことを特徴とする。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、新規の簡易な構成で、微生物の固定を短時間で行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施形態にかかる微生物検出方法の処理の流れを説明するためのフローチャートである。

【図2】実施例１および比較例における検出結果を説明するための図である。

【図3】実施例２における検出結果を説明するための図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。かかる実施形態に示す寸法、材料、その他具体的な数値等は、発明の理解を容易とするための例示にすぎず、特に断る場合を除き、本発明を限定するものではない。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能、構成を有する要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略し、また本発明に直接関係のない要素は図示を省略する。

【0014】

（微生物固定方法）
本実施形態にかかる微生物固定方法は、微生物を含む溶媒を６０℃以上で１５秒間以上加熱する工程を含む。ここで、溶媒は、微生物の生息環境と同様の溶媒がよく、川等の淡水に生息する微生物を固定する場合、淡水と実質的に等しい浸透圧を有する溶媒（水でもよい）がよく、海水に生息する微生物を固定する場合、海水と実質的に等しい浸透圧を有する溶媒がよい。

【0015】

また、溶媒としては、緩衝液が好ましく、例えば、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）、ＴＢＳ（Tris Buffered Saline）であってもよいし、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等を用いた所謂ＧＯＯＤ Ｂｕｆｆｅｒであってもよい。

【0016】

加熱する温度は６０℃以上であり、好ましくは７０℃以上、より好ましくは８０℃以上、さらに好ましくは９０℃以上、さらに好ましくは９９℃以上である。なお、好熱菌や超好熱菌といった、温泉や、熱水域等に生息する菌を固定する場合、１２２℃以上が好ましい。

【0017】

加熱する時間は１５秒間〜１時間であり、好ましくは３０秒間〜１０分間、より好ましくは１分間〜５分間、さらに好ましくは１分間である。加熱する時間が１５秒間未満であると、微生物の固定が十分に行われず、１時間を超えると、酸化が進行して細胞が破壊されてしまうおそれがある。したがって、加熱する時間は１５秒間〜１時間（上記、加熱に適した温度（６０℃以上）になってからの時間）が好ましい。例えば、９９℃で１分間加熱することにより、土壌に生息する微生物や活性汚泥等の一般的な微生物を固定することが可能となる。

【0018】

このように、微生物を含む溶媒を加熱するだけといった簡易な構成で、微生物を、１分間程度といった短時間で確実に固定することができる。したがって、従来利用していたパラホルムアルデヒドを利用する必要がなくなり、ディスポーザルの手袋を着用したり、保護眼鏡をかけたりせずとも安全に微生物の固定を行うことが可能となる。また、パラホルムアルデヒドを含む廃液を処理する必要がなくなるため、廃液処理にかかる費用を削減することができる。

【0019】

なお、本実施形態にかかる微生物固定方法で固定可能な微生物は、原核生物であっても真核生物であってもよく、例えば、大腸菌、大腸菌群、ビブリオ属の菌、コレラ菌、赤痢菌、肺炎レンサ球菌、レジオネラ、フザリウム等のカビが挙げられる。また、微生物を含む活性汚泥や土壌、河川水、食品サンプル等が液体状である場合、溶媒に分散させず、そのまま加熱してもよい。

【0020】

（微生物検出方法）
続いて、かかる微生物固定方法を利用した微生物検出方法について説明する。図１は、本実施形態にかかる微生物検出方法の処理の流れを説明するためのフローチャートである。図１に示すように、微生物検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いた微生物検出方法であり、固定工程Ｓ１１０、濃縮工程Ｓ１２０、前処理工程Ｓ１３０、第１洗浄工程Ｓ１４０、ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０、第２洗浄工程Ｓ１６０、反応後処理工程Ｓ１７０、検体作成工程Ｓ１８０、定量工程Ｓ１９０とを含む。以下、各工程について詳述する。

【0021】

（固定工程Ｓ１１０）
固定工程Ｓ１１０は、上述した微生物固定方法を利用して微生物の固定を行う工程、すなわち、少なくとも検出目的の微生物を含む溶媒を６０℃以上で１５秒間以上加熱して検出目的の微生物を固定する工程である。このとき、微生物を含む溶媒が少量の場合、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）用のサーマルサイクラーを利用してもよい。

【0022】

（濃縮工程Ｓ１２０）
濃縮工程Ｓ１２０は、固定後の微生物群（検出目的の微生物を含む）を含む溶媒を、フィルタで濾過し、微生物群（検出目的の微生物を含む）をフィルタ上に捕捉する工程である。捕捉後、微生物群を捕捉したフィルタを乾燥させ、乾燥後にエタノール（例えば、９９．５％）に浸漬することで脱水し、再度乾燥させる。ここで、フィルタは、例えば、孔径が０．２２μｍのポリカーボネート製のフィルタが挙げられる。

【0023】

（前処理工程Ｓ１３０）
前処理工程Ｓ１３０は、４０℃程度で溶解した状態の寒天溶液（例えば、０．１％）に、微生物群を捕捉したフィルタを浸漬し、微生物群がフィルタから剥がれ落ちないように寒天でカバーする工程である。

【0024】

（第１洗浄工程Ｓ１４０）
第１洗浄工程Ｓ１４０は、寒天カバー後のフィルタ（以下、単にフィルタサンプルと称する）を、後述するプローブを含まない溶媒で洗浄する工程である。かかる第１洗浄工程Ｓ１４０を行うことにより、後述する定量工程Ｓ１９０において、バックグラウンドの蛍光染色を低減することができる。

【0025】

（ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０）
ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ反応）工程Ｓ１５０は、フィルタサンプル（固定された微生物群（検出目的の微生物を含む））をプローブとともにインキュベートすることで、検出目的の微生物の核酸（例えば、ｒＲＮＡやｒＲＮＡの前駆体）とプローブとを相補的に結合させる（ハイブリダイゼーション）工程である。

【0026】

ここでプローブは、検出目的の微生物の核酸と特異的に結合する、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブや、蛍光標識されたＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）プローブである。例えば、検出目的の微生物の１６ＳｒＲＮＡと特異的に結合するプローブや、検出目的の微生物の２３ＳｒＲＮＡと特異的に結合するプローブ、検出目的の微生物の５ＳｒＲＮＡと特異的に結合するプローブ、検出目的の微生物の１８ＳｒＲＮＡと特異的に結合するプローブが挙げられる。

【0027】

また、検出目的の微生物のｒＲＮＡの前駆体と特異的に結合するプローブが挙げられる。ここで、ｒＲＮＡの前駆体とは、例えば、ｒｒｎオペロンから転写された後であって、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ）で切断される前の状態のものを指す。ｒＲＮＡの前駆体は、増殖期に多く存在するため、ｒＲＮＡの前駆体と特異的に結合するプローブを利用することで、増殖している細胞（微生物）のみを検出することが可能となる。

【0028】

ここで、蛍光標識の色素は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ等を利用することができる。

【0029】

ＰＮＡプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ中のリン酸基による負電荷の反発が解消されているため、対象となるｒＲＮＡやｍＲＮＡとより強くハイブリダイズする。したがって、ＰＮＡプローブを用いることにより、オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合と比較して、ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０におけるインキュベート時間を短くすることができる。

【0030】

（第２洗浄工程Ｓ１６０）
第２洗浄工程Ｓ１６０は、プローブを含まない溶媒でフィルタサンプルを洗浄することにより、残存したプローブ（ハイブリダイズしなかったプローブ）をフィルタサンプルから除去する工程である。

【0031】

（反応後処理工程Ｓ１７０）
反応後処理工程Ｓ１７０は、第２洗浄工程Ｓ１６０後のフィルタサンプルをエタノール（例えば、９９．５％）に浸漬することで脱水し、再度乾燥させる工程である。

【0032】

（検体作成工程Ｓ１８０）
検体作成工程Ｓ１８０は、反応後処理工程Ｓ１７０において乾燥させたフィルタサンプルを、微生物群を捕捉した面の裏面がスライドガラスに接触するように、スライドガラスにマウントし、微生物群を捕捉した面にカバーガラスを密着させて検体を作成する工程である。

【0033】

（定量工程Ｓ１９０）
定量工程Ｓ１９０は、検出目的の微生物の核酸と相補的に結合した（ハイブリダイズした）プローブを検出する工程である。具体的には、蛍光顕微鏡やフローサイトメータを用いて、プローブの蛍光色素を検出することで、プローブに結合した核酸を検出したとみなし、蛍光に染色された個体数をカウントする。

【0034】

以上説明したように、本実施形態にかかる微生物検出方法によれば、従来のパラホルムアルデヒドを用いた場合（１．５時間）と比較して、実質的に等しい微生物の固定を行うために要する時間を１分間といった短時間に短縮することができる。したがって、従来、最短で７時間かかっていた微生物の検出を、５．５時間に短縮することが可能となる。

【0035】

またプローブとして、ＰＮＡプローブを利用することで、オリゴヌクレオチドプローブを利用する場合と比較して、ハイブリダイゼーションの時間を２．５時間（オリゴヌクレオチドプローブ）から１５分間（ＰＮＡプローブ）に短縮することができる。つまり、本実施形態にかかる微生物固定方法およびＰＮＡプローブを利用することにより、従来７時間かかっていた微生物の検出を３．２５時間、すなわち半分以下に短縮することが可能となる。

【0036】

また、本実施形態において、固定工程Ｓ１１０において、微生物を含む溶媒を加熱することで微生物を固定している、すなわち、微生物の細胞膜（脂質二重層）が適度に破壊されている。このため、ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０において、微生物の細胞内にプローブが浸透しやすくなっている。つまり、検出目的の微生物の核酸とハイブリダイズするプローブ数を増加させることができる。したがって、パラホルムアルデヒドを利用した従来の固定方法で固定した微生物と比較して、蛍光強度を上昇させることができ、定量工程Ｓ１９０において定量精度を向上させることが可能となる。

【0037】

（実施例１）
検出目的の微生物を含む微生物群をＰＢＳに懸濁し、９５℃で２分間インキュベートした（固定工程Ｓ１１０）。そして、固定後の微生物群を含む溶媒を、ポリカーボネート製のフィルタ（直径２５ｍｍ、ろ過部分の直径１６ｍｍ、孔径０．２２μｍ）で濾過して、フィルタ上に微生物群を捕捉した。捕捉後、フィルタごと乾燥させ、９９．５％エタノールに浸漬することで脱水し、再度乾燥させた（濃縮工程Ｓ１２０）。

【0038】

続いて、４０℃で溶解した状態の寒天溶液（０．１％）に、微生物群を捕捉したフィルタを浸漬し、微生物群を捕捉した面の裏面がスライドガラスに接触するように、フィルタサンプルをスライドガラスに気泡が入らないように付着させ、乾燥させた（前処理工程Ｓ１３０）。

【0039】

そして、フィルタサンプルをスライドガラスから剥離し、検出目的の微生物の核酸と特異的に結合する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブ８０ｐｍｏｌ／μＬを含むバッファーＡに浸漬して、４６℃で２時間インキュベートした（ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０）。ここでバッファーＡは、０．９Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３５％ ホルムアミド、２％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ、０．０２％ ＳＤＳの水溶液を用いた。

【0040】

続いて、インキュベート後のフィルタサンプルを、バッファーＢに浸漬し、４８℃、１５分間洗浄した（第２洗浄工程Ｓ１６０）。ここでバッファーＢは、８０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ ＳＤＳの水溶液を用いた。

【0041】

そして、洗浄後のフィルタサンプルを９９．５％エタノールに１分間浸漬することで脱水し、乾燥させた（反応後処理工程Ｓ１７０）。

【0042】

続いて、乾燥後フィルタサンプルを、微生物群を捕捉した面の裏面がスライドガラスに接触するように、スライドガラスにマウントし、微生物群を捕捉した面にカバーガラスを密着させて検体を作成した（検体作成工程Ｓ１８０）。

【0043】

そして、蛍光顕微鏡で検出目的とする微生物（検出目的とする微生物に特異的に結合したオリゴヌクレオチドプローブ）の検出を行った（定量工程Ｓ１９０）。

【0044】

図２は、検出結果を説明するための図である。実施例１では、緑色励起で赤色蛍光を発する色素で標識したオリゴヌクレオチドプローブを利用したため、蛍光顕微鏡において緑色励起光で観察を行った。その結果、図２（ａ）に示すように微生物が赤色（図２（ａ）ではグレー）に染色されていることが分かった。

【0045】

（比較例１）
検出目的の微生物を含む微生物群をＰＢＳに懸濁したのみで、固定工程を行わなかった。そして、この固定工程を行わないサンプルを上記実施例１と同様の方法で、濃縮工程Ｓ１２０、前処理工程Ｓ１３０、ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０、第２洗浄工程Ｓ１６０、反応後処理工程Ｓ１７０、検体作成工程Ｓ１８０、定量工程Ｓ１９０を順に行った。

【0046】

その結果、図２（ｂ）に示すように微生物が赤色（図２（ｂ）ではグレー）に染色されているものの、図２（ａ）の固定工程Ｓ１１０を行った実施例１と比較して、比較例１の方が、蛍光強度が低いことが分かった。

【0047】

これにより、実施例１において、固定工程Ｓ１１０を行ったことにより、微生物の細胞膜が適度に破壊され、ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０において、微生物の細胞内にプローブが効率よく浸透し、蛍光強度が向上したことが分かった。

【0048】

（実施例２）
実施例１における固定工程Ｓ１１０、濃縮工程Ｓ１２０、前処理工程Ｓ１３０を行った後、フィルタサンプルをスライドガラスから剥離し、検出目的の微生物の核酸と特異的に結合する蛍光標識されたＰＮＡプローブ８０ｐｍｏｌ／μＬを含むバッファーＡに浸漬して、４６℃で１５分間インキュベートした（ハイブリダイゼーション工程Ｓ１５０）。そして、実施例１と同様に、第２洗浄工程Ｓ１６０、反応後処理工程Ｓ１７０、検体作成工程Ｓ１８０を行った。

【0049】

そして、蛍光顕微鏡で検出目的とする微生物（検出目的とする微生物に特異的に結合したＰＮＡプローブ）の検出を行った（定量工程Ｓ１９０）。

【0050】

図３は、検出結果を説明するための図である。実施例２では、青色励起で緑色蛍光を発する色素で標識したＰＮＡプローブを利用したため、蛍光顕微鏡において青色励起光で観察を行った。その結果、図３に示すように微生物が緑色（図３ではグレー）に染色されていることが分かった。

【0051】

以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明はかかる実施形態に限定されないことは言うまでもない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された範疇において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。

【0052】

例えば、上述した実施形態において、前処理工程Ｓ１３０や、第１洗浄工程Ｓ１４０を省略してもよいし、第２洗浄工程Ｓ１６０を行った後、直ちに、検体作成工程Ｓ１８０、定量工程Ｓ１９０を行う場合、反応後処理工程Ｓ１７０を省略してもよい。

【0053】

また上述した実施形態において、微生物固定方法を利用する例としてＦＩＳＨ法を例に挙げて説明した。しかし、本実施形態にかかる微生物固定方法は、微生物を検出する様々な技術を利用することができる。例えば、本願発明者は、本実施形態にかかる微生物固定方法を行った後、微生物のＤＮＡと特異的に結合するＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を利用した全菌検査を行うことができたことを確認している。

【0054】

なお、本明細書の微生物検出方法の各工程は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいはサブルーチンによる処理を含んでもよい。

【産業上の利用可能性】

【0055】

本発明は、微生物を固定する微生物固定方法、およびこれを用いた微生物検出方法に利用することができる。

【符号の説明】

【0056】

Ｓ１１０ …固定工程
Ｓ１２０ …濃縮工程
Ｓ１３０ …前処理工程
Ｓ１４０ …第１洗浄工程
Ｓ１５０ …ハイブリダイゼーション工程
Ｓ１６０ …第２洗浄工程
Ｓ１７０ …反応後処理工程
Ｓ１８０ …検体作成工程
Ｓ１９０ …定量工程

【図1】

【図2】

【図3】