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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5997394
(24)【登録日】2016年9月2日
(45)【発行日】2016年9月28日
(54)【発明の名称】パーキンソン病のバイオマーカーおよびその利用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20160915BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20160915BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20160915BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20160915BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20160915BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20160915BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20160915BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20160915BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20160915BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 DZNA
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C07K16/18
C12Q1/02
A61K37/02
A61P25/16
!C12P21/08
!C07K14/00
【請求項の数】14
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2015-545213(P2015-545213)
(86)(22)【出願日】2015年2月13日
(86)【国際出願番号】JP2015053930
(87)【国際公開番号】WO2015125702
(87)【国際公開日】20150827
【審査請求日】2015年10月14日
(31)【優先権主張番号】特願2014-28449(P2014-28449)
(32)【優先日】2014年2月18日
(33)【優先権主張国】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】591063394
【氏名又は名称】公益財団法人東京都医学総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100096769
【弁理士】
【氏名又は名称】有原 幸一
(74)【代理人】
【識別番号】100107319
【弁理士】
【氏名又は名称】松島 鉄男
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(72)【発明者】
【氏名】松田 憲之
(72)【発明者】
【氏名】小谷野 史香
(72)【発明者】
【氏名】尾勝 圭
(72)【発明者】
【氏名】呉 越
(72)【発明者】
【氏名】木村 まゆみ
(72)【発明者】
【氏名】佐伯 泰
【審査官】
草川 貴史
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１３／１５３３８６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１４−０２５７６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１０／００５０７７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
金尾智子，パーキンソン病原因遺伝子産物がミトコンドリアの品質管理を行う分子，科学研究費助成事業（科学研究費補助金）研究成果報告書，２０１３年 ８月２７日
【文献】
松田憲之，ユビキチン連結酵素Ｐａｒｋｉｎがミトコンドリアの異常によって活性化される仕組み，医学のあゆみ，日本，２０１３年，Vol.247,No.10，Page.1013-1018
【文献】
Koyano F、外１５名，Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin.，Nature，２０１４年 ６月 ５日，Vol.510,No.7503，Page.162-166
【文献】
松田憲之，遺伝性パーキンソン病関連分子ＰＩＮＫ１によってリン酸化されたユビキチンがＰａｒｋｉｎを活性化する，細胞工学，日本，２０１４年 ８月２２日，Vol.33,No.9，Page.974-976
【文献】
Kazlauskaite A、外９名，Parkin is activated by PINK1-dependent phosphorylation of ubiquitin at Ser65.，Biochem J，２０１４年 ５月１５日，Vol.460,No.1，Page.127-139
【文献】
Kane LA、外７名，PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity.，J Cell Biol，２０１４年 ４月２１日，Vol.205,No.2，Page.143-153
【文献】
Kazlauskaite A、外１名，PINK1 and Parkin - mitochondrial interplay between phosphorylation and ubiquitylation in Parkinson's，FEBS J，２０１５年 １月，Vol.282,No.2，Page.215-223
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン。
【請求項2】
ヒト由来のものである、請求項１に記載のリン酸化されたユビキチン（配列番号１）。
【請求項3】
Ｎ末端および／またはＣ末端にタグが付加された、請求項１または２に記載のリン酸化されたユビキチン。
【請求項4】
６５番目のセリン残基がアスパラギン酸残基に置換されたリン酸化模倣型ユビキチン。
【請求項5】
ヒト由来のものである、請求項４に記載のリン酸化模倣型ユビキチン（配列番号２）。
【請求項6】
Ｎ末端および／またはＣ末端にタグが付加された、請求項４または５に記載のリン酸化模倣型ユビキチン。
【請求項7】
被験者から単離された試料について、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンを検出または定量するステップを含むパーキンソン病の検査方法。
【請求項8】
前記検出または定量するステップが、免疫学的手法により行われる、請求項７に記載の検査方法。
【請求項9】
６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンからなるパーキンソン病検出用バイオマーカー。
【請求項10】
６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンに対して特異的結合能を有する抗体。
【請求項11】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項12】
（１）ＰＩＮＫ１を発現する細胞を提供するステップと、
（２）前記細胞中のミトコンドリアを傷害するステップと、
（３）前記細胞に候補化合物を接触させるステップと、
（４）前記細胞において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップと
を含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法。
（２）前記細胞中のミトコンドリアを傷害するステップと、
（３）前記細胞に候補化合物を接触させるステップと、
（４）前記細胞において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップと
を含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法。
【請求項13】
（１）ユビキチンと、キナーゼと、リン酸供与体とを含有するリン酸化反応溶液を調製するステップと、
（２）前記リン酸化反応溶液に候補化合物を添加するステップと、
（３）前記リン酸化反応溶液において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップと
を含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法。
（２）前記リン酸化反応溶液に候補化合物を添加するステップと、
（３）前記リン酸化反応溶液において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップと
を含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法。
【請求項14】
前記リン酸化反応溶液が細胞抽出液である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、パーキンソン病の診断用バイオマーカーおよびそれに対する抗体、パーキンソン病の検査・診断方法、ならびにパーキンソン病の治療薬または予防薬およびそのスクリーニング方法に関する。【背景技術】
【0002】
パーキンソン病は、６５歳以上の人口における罹患率が１％を超える、加齢に伴って高頻度で発症する神経変性疾患である。今後、人口の高齢化とともに患者数が大幅に増加することが予想されており、パーキンソン病の診断・予防・治療方法の早期確立が急務である。【0003】
パーキンソン病は、中脳の黒質におけるドーパミン神経細胞が変性・脱落することによって発症することが知られており、Ｌ−ドーパの投与によるドーパミン補充療法が、パーキンソン病の主な予後治療として行われている。しかし、ドーパミン補充療法は対症療法に過ぎず、パーキンソン病の症状を抑制するためには投薬を継続しなければならない。さらに、長期間にわたるＬ−ドーパの投与は、薬効の継続時間が短くなることによるウェアリング・オフや、ジスキネジアと呼ばれる異常な不随意性運動などの深刻な副作用をもたらすという問題がある。また、診断についても、パーキンソン病に特徴的な症状に基づいた診断方法しかないため、症状が軽い早期の段階では他の神経疾患との明確な区別ができないのが現状である。パーキンソン病の根本療法および早期かつ特異的な診断方法の確立のためには、パーキンソン病の発症機序、すなわちドーパミン神経細胞の変性が起こるメカニズムが解明される必要があり、その早急な解明が望まれている。【0004】
パーキンソン病の大多数は孤発性であるが、一部は家族性（遺伝性）であり、複数の原因遺伝子が単離・同定されている。孤発性パーキンソン病と遺伝性パーキンソン病は臨床症状が共通していることから、ドーパミン細胞の変性における共通のメカニズムの存在が推定されており、遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子の解析が孤発型パーキンソン病の発症メカニズムの解明につながることが期待されている。遺伝性劣性若年性パーキンソン症候群の原因遺伝子としては、ＰＩＮＫ１およびＰａｒｋｉｎが同定されている（非特許文献１）。ＰＩＮＫ１はミトコンドリアに局在するＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼを、Ｐａｒｋｉｎはユビキチンリガーゼ（Ｅ３）を、それぞれコードしており、ＰＩＮＫ１とＰａｒｋｉｎが膜電位の消失したミトコンドリア上に集積し、ミトコンドリアをユビキチン化することにより、不良ミトコンドリアのみを選択的に分解へと導く（非特許文献２）。この不良ミトコンドリアの選択的分解機構（マイトファジー）の異常が、パーキンソン病における神経変性の一因と考えられている。【0005】
Ｐａｒｋｉｎは、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）である。Ｅ３は、ユビキチン−プロテアソーム系における基質特異性を決定する上で最も重要な酵素であり、マイトファジー異常によるパーキンソン病の発症メカニズムを解明する上で、Ｐａｒｋｉｎ活性化のメカニズムを理解することは極めて重要である。Ｐａｒｋｉｎは、通常は不活性型の状態で細胞質に存在するが、不良ミトコンドリアに移行すると活性化されて、Ｅ３酵素として機能するようになる。このＰａｒｋｉｎのミトコンドリアへの移行と活性化の両方に、ＰＩＮＫ１が必須であることが知られている（非特許文献３）。さらに最近の研究により、ミトコンドリアの膜電位の低下に伴ってＰＩＮＫ１の自己リン酸化が起こると、ＰＩＮＫ１依存的にＰａｒｋｉｎがリン酸化され、その結果、Ｐａｒｋｉｎは、ミトコンドリアへと移行するとともに、Ｅ３酵素として活性化されることが見出された（非特許文献４、非特許文献５）。しかし、Ｐａｒｋｉｎの活性化にはリン酸化が必須である一方、それのみでは不十分であることも確認されており、Ｐａｒｋｉｎ活性化のメカニズムは依然として部分的な理解にとどまっている。【0006】
Ｅ３酵素として活性化されたＰａｒｋｉｎは、ミトコンドリア外膜上の基質タンパク質をユビキチン化し、ミトコンドリアを分解へと導く。ユビキチンは、全ての真核生物に普遍的に存在する７６個のアミノ酸からなるタンパク質であり、そのアミノ酸配列は高度に保存されている。ユビキチン研究の歴史は古く、ユビキチンは、基質タンパク質を分解へと誘導する目印として働く以外にも、ＤＮＡ修復や細胞内のシグナル伝達などの種々の機能に関与することが明らかにされている。また、ユビキチンは、７つのリジン残基を有しており、これらのリジン残基を介して他のユビキチンのＣ末端のグリシン残基と結合してポリユビキチン鎖を形成することができ、その際の結合パターンの違い（すなわちポリユビキチン鎖の形状の違い）によって、種々の異なる機能が発揮されることも詳細に研究されている。しかし、ユビキチン自体が何らかの翻訳後修飾を受けて、その機能が変化するといった報告は、今までに一例もなされていない。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３９２， ｐｐ．６０５−６０８， １９９８
【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．４４１， ｐｐ．１１６２−１１６６， ２００６
【非特許文献3】Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１８９， ｐｐ．２１１−２２１， ２０１０
【非特許文献4】Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．， Ｖｏｌ．２， ｓｒｅｐ０１００２， ２０１２
【非特許文献5】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２８８， ｐｐ．２２０１９−２２０３２， ２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、Ｐａｒｋｉｎの活性化機構を明らかにし、それに基づくパーキンソン病の早期診断、予防、根本的な治療を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｐａｒｋｉｎが完全に活性化されるためには、Ｐａｒｋｉｎのリン酸化に加えて、ユビキチンがリン酸化されることが必須であることを見出した。ユビキチンのリン酸化がＰａｒｋｉｎの活性化のために必須であるという知見が新規であるのみならず、ユビキチン自体が何らかの翻訳後修飾を受けること、また、それによって細胞内シグナル伝達の制御に関与するということは、従来全く知られていなかった驚くべき発見事項である。本発明者らは、この新規な発見に基づき、リン酸化されたユビキチンが、パーキンソン病の検出、診断、予防、治療、およびパーキンソン病の予防・治療薬のスクリーニングに有用であることを見出した。【0010】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、被験者から単離された試料について、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンを検出または定量するステップを含む、パーキンソン病の検査方法を提供するものである。【0011】
前記検出または定量するステップは、免疫学的手法により行われることが好ましい。【0012】
また、本発明は、一実施形態によれば、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンからなるパーキンソン病検出用バイオマーカーを提供するものである。【0013】
また、本発明は、一実施形態によれば、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンに対して特異的結合能を有する抗体を提供するものである。【0014】
前記抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることが好ましい。【0015】
また、本発明は、一実施形態によれば、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンを含んでなるパーキンソン病の治療薬または予防薬を提供するものである。【0016】
また、本発明は、一実施形態によれば、６５番目のセリン残基がアスパラギン酸残基に置換されたリン酸化模倣型ユビキチンを含んでなるパーキンソン病の治療薬または予防薬を提供するものである。【0017】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）ＰＩＮＫ１を発現する細胞を提供するステップと、（２）前記細胞中のミトコンドリアを傷害するステップと、（３）前記細胞に候補化合物を接触させるステップと、（４）前記細胞において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップとを含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供するものである。【0018】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）ユビキチンと、キナーゼと、リン酸供与体とを含有するリン酸化反応溶液を調製するステップと、（２）前記リン酸化反応溶液に候補化合物を添加するステップと、（３）前記リン酸化反応溶液において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップとを含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供するものである。【0019】
前記リン酸化反応溶液は、細胞抽出液であることが好ましい。【発明の効果】
【0020】
本発明に係るリン酸化されたユビキチンは、パーキンソン病の発症プロセスを測定・評価できるバイオマーカーとして、パーキンソン病の早期かつ特異的な診断や、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニングに有用である。また、本発明に係るリン酸化されたユビキチンに対して特異的結合能を有する抗体は、前記バイオマーカーの検出・測定に有用である。【0021】
また、本発明に係るリン酸化されたユビキチンおよびリン酸化模倣型ユビキチンは、パーキンソン病の治療薬または予防薬として有用であり、早期かつ根本的なパーキンソン病の治療を可能とする。【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】ＣＣＣＰ処理細胞におけるユビキチンのリン酸化をＰｈｏｓ−ｔａｇアッセイにより確認した図である。
【図2】無細胞系におけるユビキチンのリン酸化をＰｈｏｓ−ｔａｇアッセイにより確認した図である。
【図3】ユビキチンのリン酸化部位を特定するための質量分析の結果を示す図である。
【図4】無細胞系における組換えユビキチンのリン酸化部位が６５番目のセリン残基であることをＰｈｏｓ−ｔａｇアッセイにより確認した図である。
【図5】ＣＣＣＰ処理細胞における組換えユビキチンのリン酸化部位が６５番目のセリン残基であることをＰｈｏｓ−ｔａｇアッセイにより確認した図である。
【図6】ＰＩＮＫ１−／−細胞におけるユビキチンのリン酸化をＰｈｏｓ−ｔａｇアッセイにより確認した図である。
【図7】単離ＰＩＮＫ１によるユビキチンのリン酸化をＰｈｏｓ−ｔａｇアッセイにより確認した図である。
【図8】リン酸化模倣型ユビキチンによるＰａｒｋｉｎ活性化を細胞内ユビキチン化アッセイにより確認した図である。
【図9】Ｃ末端改変ユビキチンによるＰａｒｋｉｎ活性化を細胞内ユビキチン化アッセイにより確認した図である。
【図10】ミトコンドリアのユビキチン化を示す多重蛍光免疫染色像である。
【図11】無細胞系における組換えユビキチンまたは６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンによるＰａｒｋｉｎの活性化を示す図である。
【図12】Ｐａｒｋｉｎの活性化メカニズムの模式図である。
【図13】抗リン酸化ユビキチンウサギポリクローナル抗体による、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンの検出を示す図である。
【図14】抗リン酸化ユビキチンモルモットポリクローナル抗体による、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンの検出を示す図である。
【図15】細胞内における６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンの存在を、質量分析により確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。【0024】
本発明の第一の局面は、パーキンソン病の早期検出に関する。この局面では、パーキンソン病検出用のバイオマーカーおよびその用途が提供される。【0025】
本発明は、一実施形態によれば、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンからなるパーキンソン病検出用バイオマーカーである。本実施形態における「パーキンソン病検出用バイオマーカー」とは、パーキンソン病の罹患の有無もしくは罹患の程度を検出するための指標となる生体分子を意味する。【0026】
「パーキンソン病」とは、臨床的には、（１）四肢の筋固縮、（２）安静時振戦などの不随意運動、（３）寡動や無動、（４）姿勢保持反射障害の少なくとも２つ以上の症状を呈し、病理学的には、黒質におけるドーパミン神経細胞の変性脱落を特徴とする神経変性疾患である。本発明に係る「パーキンソン病」には、いわゆるパーキンソン病（孤発性パーキンソン病）の他にも、若年性パーキンソニズム、家族性（遺伝性）パーキンソニズム、線条体黒質変性症（多系統萎縮症）などが包含される。【0027】
本実施形態におけるパーキンソン病検出用バイオマーカーは、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンからなる。以降、本明細書では、６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチンを、「Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン」と記載する。【0028】
本実施形態における「Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン」には、特定のアミノ酸配列（配列番号１）からなるユビキチンだけでなく、リン酸化された６５番目のセリン残基が保存されていることを限度として、配列番号１のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるユビキチンが包含され得る。ここで、「１〜数個」とは、好ましくは「１〜３個」、「１または２個」、または「１個」である。【0029】
また、本実施形態における「Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン」には、リン酸化された６５番目のセリン残基が保存され、かつ、配列番号１からなるユビキチンと同等の生理機能が維持されていることを限度として、配列番号１と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるユビキチンが包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、好ましくは、約９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上であり、特に好ましくは、９８％以上または９９％以上である。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて決定することができる。【0030】
本実施形態のパーキンソン病検出用バイオマーカーは、正常（パーキンソン病に罹患していない）被験者においては、ミトコンドリア異常に伴って産生され、その後に消失するが、パーキンソン病患者においては、ＰＩＮＫ１の機能喪失のために産生されないか、Ｐａｒｋｉｎの機能喪失やミトコンドリアストレスの亢進によって、その濃度が上昇すると予想される。すなわち、本実施形態のパーキンソン病検出用バイオマーカーは、パーキンソン病に罹患していない被験者の正常値と比較して逸脱（減少または増加）を指標とすることにより、パーキンソン病を早期かつ特異的に検出することができる。【0031】
本発明は、一実施形態によれば、被験者から単離された試料について、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンからなるパーキンソン病検出用バイオマーカーを検出または定量するステップを含む、パーキンソン病の検査方法である。【0032】
本実施形態において「検査」とは、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンからなるパーキンソン病検出用バイオマーカーを指標として、数値的に定量またはその有無を検出することを意味する。この検査結果に基づけば、医師は、被験者がパーキンソン病に罹患しているか否かを判定・診断し、適切な治療方針を決定し得る。【0033】
本実施形態において「被験者」とは、パーキンソン病に罹患し得る動物個体である。動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。【0034】
本実施形態における「試料」は、被験者から採取し得る生体試料であり、例えば被験者由来の組織、細胞または体液などであってよいが、特に限定されない。組織試料または細胞試料としては、例えば、脳、心筋、骨格筋などが挙げられる。体液試料としては、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液などが挙げられる。試料は、当業者に周知の方法により被験者から得ることができる。【0035】
本実施形態において、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンの検出または定量は、当分野において周知の方法により行うことができ、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、イムノブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学的染色法などの免疫学的手法や、液体クロマトグラフィー、質量分析などの手法により行うことができる。好ましい検出または定量方法は、免疫学的手法である。免疫学的手法によるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンの検出または定量は、例えば、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンに対して特異的結合能を有する抗体を用いて行うことができる。【0036】
Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンの検出または定量を質量分析により行う場合には、試料から精製されたユビキチンをトリプシンやエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃなどのプロテアーゼにより切断し、例えば、前駆イオンのｍ／ｚ（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍ／ｚ）が５７４．２９７、荷電状態（ｃｈａｒｇｅ ｓｔａｔｅ）が＋２であるペプチド断片：Ｅ（ｐＳ）ＴＬＨＬＶＬＲ（リン酸化ユビキチンの６４〜７２番目のアミノ酸に相当）に由来するシグナルを検出する。また、その際に、前駆イオンのｍ／ｚが５３４．３１４、荷電状態が＋２であるペプチド断片：ＥＳＴＬＨＬＶＬＲ（リン酸化されていないユビキチンの６４〜７２番目のアミノ酸に相当）に由来するシグナルを、陽性対照として検出することができる。【0037】
本実施形態のパーキンソン病の検査方法は、上記検出または定量の結果を、パーキンソン病に罹患していない対照由来の試料（正常対照試料）について予め決定されたバイオマーカープロファイルと比較するステップをさらに含んでもよい。この比較の結果に基づいて、被験者由来の試料におけるパーキンソン病検出用バイオマーカーが正常値から有意に逸脱していることが示された場合、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性があると判定される。その意味で、本実施形態によるパーキンソン病の検査方法は、被験者がパーキンソン病に罹患しているかどうかを評価判別する方法、すなわち診断方法であり得る。また、検出または定量の結果を、例えば治療薬の投与の前後において同一人について比較し、治療効果を判断することもできる。【0038】
本実施形態のパーキンソン病の検査方法は、パーキンソン病の早期かつ特異的な検出を可能とするものであり、極めて有用である。【0039】
本発明は、一実施形態によれば、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンに対して特異的結合能を有する抗体である。以降、本明細書では、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンに対して特異的結合能を有する抗体を、「抗Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン抗体」と記載する。【0040】
本実施形態における「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖなどの抗体断片であってよい。これらの抗体の作製方法は、当分野において周知の方法により作製することができる。本実施形態における抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。【0041】
具体的には、本実施形態における抗体がポリクローナル抗体である場合には、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンまたはその部分ペプチド（リン酸化Ｓｅｒ６５を含み、長さが６〜３０アミノ酸、好ましくは９〜２５アミノ酸の断片）を抗原とし、抗原をラット、ウサギ、モルモット、ヤギなどの哺乳動物に免疫する。その後、前記動物の血清を回収して精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。【0042】
また、本実施形態における抗体がモノクローナル抗体である場合には、上記と同様の手順により作製した免疫感作動物から抗体産生細胞を回収し、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを調製する。その後、抗原に対して高い特異的親和性を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択し、選択されたクローンの培養液を回収して精製することによりモノクローナル抗体を取得することができる。【0043】
キメラ抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、例えば、可変領域がヒト以外の動物のイムノグロブリン由来であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来である抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ウサギなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものを用いてもよい。キメラ抗体は、当分野において周知の方法により作製することができる。【0044】
ヒト化抗体（ヒト型ＣＤＲ移植抗体）は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部がヒト以外の動物のモノクローナル抗体に由来するものであり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来である抗体を意味する。ヒト化抗体は、当分野において周知の方法により作製することができる。【0045】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖなどの抗体断片は、上述した抗体の抗原結合領域を含む部分または当該領域から誘導された部分である。抗体断片は、当分野において周知の方法により作製することができる。【0046】
本実施形態の抗Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン抗体は、細胞内または組織内のＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンの検出または定量に使用することができる。【0047】
本実施形態の抗Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン抗体は、任意の標識物質を結合させることにより、パーキンソン病の検査用試薬とすることもできる。ここでいう任意の標識物質とは、当該分野で公知のあらゆる核酸用標識物質であってよく、例えば、ビオチン、蛍光色素、発光物質、放射性同位元素、酵素などが挙げられる。また、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン検出試薬は、更に必要に応じて、容器、緩衝液、陽性対照、陰性対照、検査プロトコールなどの付加的な要素と組み合わせることにより、パーキンソン病の検査用キットとすることもできる。【0048】
本発明の第二の局面は、パーキンソン病の治療または予防に関する。この局面では、パーキンソン病の治療薬または予防薬が提供される。【0049】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンを含んでなるパーキンソン病の治療薬または予防薬である。Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、Ｐａｒｋｉｎを活性化し、マイトファジーを正常化することにより、パーキンソン病を根本的に治療または予防することができる。【0050】
本発明において、「治療」とは、パーキンソン病を完全に治癒することのみならず、パーキンソン病の症状を寛解させる、状態を緩和する、または、病態の進行を遅らせるもしくは停止させることをも含む。【0051】
本実施形態におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンには、特定のアミノ酸配列（配列番号１）からなるユビキチンだけでなく、リン酸化された６５番目のセリン残基が保存されていることを限度として、配列番号１のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるユビキチンが包含され得る。ここで、「１〜数個」とは、好ましくは「１〜３個」、「１または２個」、または「１個」である。【0052】
また、本実施形態における「Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン」には、リン酸化された６５番目のセリン残基が保存され、かつ、配列番号１からなるユビキチンと同等の生理機能が維持されていることを限度として、配列番号１と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるユビキチンが包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、好ましくは、約９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上であり、特に好ましくは、９８％以上または９９％以上である。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて決定することができる。【0053】
本実施形態におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、遺伝子工学的手法による生合成や、化学合成により製造することができる。【0054】
遺伝子工学的手法により生合成する場合には、例えば、ユビキチンをコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換することによってユビキチンを発現させ、ユビキチンを精製した後、リン酸化を行うことにより、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンを製造することができる。【0055】
ユビキチンを発現させる宿主細胞としては、例えば、菌、酵母、哺乳動物細胞などを使用することができる。好ましくは、ＢＬ２１（ＤＥ３）やＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）などの大腸菌や、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞などのヒト由来の細胞を宿主細胞として用いることができる。発現ベクターとしては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＴ７（シグマ・アルドリッチ社製）やｐＥＴ（メルクミリポア社製）などの大腸菌発現プラスミドを用いることができ、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）などの動物細胞発現プラスミドや、レトロウイルスやアデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどを用いることができる。形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などの周知の方法により行うことができる。【0056】
ユビキチンのリン酸化は、宿主細胞から単離精製されたユビキチンを、膜電位を低下させることによりＰＩＮＫ１を蓄積させたミトコンドリア、ＰＩＮＫ１を含有する免疫沈降産物、またはＰＩＮＫ１と反応させることにより行うことができる。前記反応は、マグネシウムなどの２価イオンおよびＡＴＰなどのリン酸供与体を含有するバッファー中で行うことができる。【0057】
化学合成により製造する場合には、例えば、ペプチド合成機によりユビキチンを合成した後、リン酸化修飾を行うことにより、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンを製造することができる。化学合成を実施するための操作は、全て公知の方法により行うことができる。【0058】
本実施形態におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、カルボキシル末端に細胞膜透過性ペプチドが融合されたものであってもよい。細胞膜透過性ペプチドを融合させたＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、細胞内に効率よく送達されることができるため、好ましい。細胞膜透過性ペプチドとは、アルギニンやリジンなどの塩基性アミノ酸を多く含み、細胞膜を透過する性質を有するペプチドである。本実施形態における細胞膜透過性ペプチドには、特に限定されないが、例えば、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ、ＢＭＶ−ｇａｇ、ＨＴＬＶ−ＩＩＲｅｘなどが挙げられる。【0059】
本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬は、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンを有効成分として含有する。この治療薬または予防薬は、有効成分のみから構成されていてもよいが、さらに任意の成分として、薬学的に許容される公知の希釈液、担体、賦形剤などを含んでもよい。【0060】
本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬を製造するためには、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンを、必要に応じて上記公知の希釈液、担体、賦形剤などと組み合わせて製剤化すればよい。パーキンソン病の治療薬または予防薬において、有効成分であるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、各形態に応じた範囲で適切な投与量となるように含有されれば良い。Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、その投与量が、通常成人１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上となるように、薬剤中の含有量が決定されることが好ましいが、かかる範囲には限定されず、患者の症状、年齢、性別などにより適宜調整されることが可能である。投与量の上限は、１日当たり、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）以下が好ましく、１ｍｇ／ｋｇ（体重）以下がより好ましい。【0061】
本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、直腸投与剤などに製剤化してもよい。従って、本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬は、経口、腹腔内、皮内、静脈内、筋肉内などの投与を含む、種々の方法により達成することができる。【0062】
パーキンソン病の治療薬または予防薬の経口用製剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤などの固形剤とすることができる。この場合には、適切な添加物、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などの添加剤や、さらに所望により結合剤、崩壊剤、潤沢剤、着色剤、香料などを配合することができる。または、パーキンソン病の治療薬または予防薬の経口用製剤は、例えばシロップ剤などの液剤とすることができ、この場合には、滅菌水、生理食塩水、エタノールなどを担体として使用し得る。さらに所望により、懸濁剤などの補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。【0063】
パーキンソン病の治療薬または予防薬の非経口製剤は、例えば、注射剤や直腸投与剤などの液剤とすることができる。この場合には、定法に従って、有効成分であるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンを、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、さらに必要に応じて、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して調製することもできる。【0064】
本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬は、パーキンソン病の根本的な治療または予防に有用である。【0065】
また、本発明は、一実施形態によれば、６５番目のセリン残基がアスパラギン酸残基に置換されたリン酸化模倣型ユビキチンを含んでなるパーキンソン病の治療薬または予防薬である。６５番目のセリン残基がアスパラギン酸残基に置換されたリン酸化模倣型ユビキチンは、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンと同様にＰａｒｋｉｎを活性化し、マイトファジーを正常化することにより、パーキンソン病を根本的に治療または予防することができる。以降、本明細書では、６５番目のセリン残基がアスパラギン酸残基に置換されたリン酸化模倣型ユビキチンを、「Ｓｅｒ６５Ａｓｐリン酸化模倣型ユビキチン」と記載する。【0066】
本実施形態におけるＳｅｒ６５Ａｓｐリン酸化模倣型ユビキチンには、特定のアミノ酸配列（配列番号２）からなるユビキチンだけでなく、６５番目のアスパラギン酸残基が保存されていることを限度として、配列番号２のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるユビキチンが包含され得る。ここで、「１〜数個」とは、好ましくは「１〜３個」、「１または２個」、または「１個」である。【0067】
また、本実施形態における「Ｓｅｒ６５Ａｓｐリン酸化模倣型ユビキチン」には、６５番目のアスパラギン酸残基が保存され、かつ、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンと同等の生理機能が維持されていることを限度として、配列番号２と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるユビキチンが包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、好ましくは、約９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上であり、特に好ましくは、９８％以上または９９％以上である。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて決定することができる。【0068】
本実施形態におけるＳｅｒ６５Ａｓｐリン酸化模倣型ユビキチンは、上記のＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンと同様に、遺伝子工学的手法による生合成や、化学合成により製造することができる。【0069】
本実施形態におけるＳｅｒ６５Ａｓｐリン酸化模倣型ユビキチンは、上記のＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンと同様に、カルボキシル末端に細胞膜透過性ペプチドが融合されたものであってもよい。【0070】
本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬は、Ｓｅｒ６５Ａｓｐリン酸化模倣型ユビキチンを有効成分として含有する。この治療薬または予防薬は、有効成分のみから構成されていてもよいが、さらに任意の成分として、薬学的に許容される公知の希釈液、担体、賦形剤などを含んでもよい。【0071】
本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬は、上記のＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンを含んでなるパーキンソン病の治療薬または予防薬と同様にして製剤化されることができる。【0072】
本実施形態によるパーキンソン病の治療薬または予防薬は、パーキンソン病の根本的な治療または予防に有用である。【0073】
本発明の第三の局面は、パーキンソン病の新規治療薬または新規予防薬の開発に関する。この局面では、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法が提供される。【0074】
本発明は、一実施形態によれば、（１）ＰＩＮＫ１を発現する細胞を提供するステップと、（２）前記細胞中のミトコンドリアを傷害するステップと、（３）前記細胞に候補化合物を接触させるステップと、（４）前記細胞において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップとを含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法である。本実施形態の方法は、ユビキチンのＳｅｒ６５のリン酸化を促進する化合物を、パーキンソン病の治療薬または予防薬に有効な物質として取得できるものである。【0075】
本実施形態のスクリーニング方法は、ＰＩＮＫ１を発現する細胞を調製して使用する。以降、本明細書では、ＰＩＮＫ１を発現する生細胞を、「ＰＩＮＫ１発現細胞」と記載する。【0076】
本実施形態におけるＰＩＮＫ１発現細胞には、動物個体から採取された細胞を用いることができる。動物個体由来の細胞は、ＰＩＮＫ１を発現する組織、例えば、脳や筋肉などの組織から、当業者に周知の方法により採取することができる。動物個体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどであり、好ましくはヒトである。【0077】
本実施形態におけるＰＩＮＫ１発現細胞には、ＰＩＮＫ１を発現する哺乳動物細胞株を用いてもよい。哺乳動物細胞株としては、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞などのヒト由来の細胞株を用いることが好ましい。【0078】
次いで、ＰＩＮＫ１発現細胞中のミトコンドリアを傷害する。ミトコンドリアの傷害は、従来公知の方法により行うことができ、例えば、ＣＣＣＰ処理、ロテノン処理、パラコート処理、ＭＰＴＰ処理などによってミトコンドリアを傷害することができる。【0079】
次いで、ミトコンドリアが傷害されたＰＩＮＫ１発現細胞に、候補化合物を接触させる。候補化合物には、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、非ペプチド性化合物、合成化合物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。【0080】
上記細胞と候補化合物との接触は、例えば、ＰＩＮＫ１発現細胞を培養する培地や、リン酸緩衝生理食塩水やトリス塩酸緩衝液などの各種緩衝液に対して候補化合物を添加し、その中で一定時間細胞をインキュベートすることにより行うことができる。添加される候補化合物の濃度は、化合物の種類により異なるが、例えば、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で適宜選択することができる。インキュベートは、好ましくは、１０分〜２４時間行うことができる。【0081】
次いで、前記細胞におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチン量を測定する。Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン量は、上記パーキンソン病の検査方法におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンの検出または定量と同様に、例えば、抗Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン抗体を用いたＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色、イムノブロットなどの各種免疫学的手法や、質量分析などの手法により行うことができる。【0082】
本実施形態のスクリーニング方法において、細胞におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンが、候補化合物との接触前と比較して有意に増加した場合は、当該候補化合物は、パーキンソン病の治療薬または予防薬として有望であると評価することができる。一方、細胞におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンが、候補化合物との接触前と同等量またはそれ以下の量しか検出されない場合は、当該候補化合物は、パーキンソン病の治療薬または予防薬として有望ではないと評価することができる。【0083】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）ユビキチンと、キナーゼと、リン酸供与体とを含有するリン酸化反応溶液を調製するステップと、（２）前記リン酸化反応溶液に候補化合物を添加するステップと、（３）前記リン酸化反応溶液において生成された６５番目のセリン残基がリン酸化されたユビキチン量を測定するステップとを含む、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法である。本実施形態の方法は、ユビキチンのＳｅｒ６５のリン酸化を促進する化合物を、パーキンソン病の治療薬または予防薬に有効な物質として取得できるものである。【0084】
本実施形態のスクリーニング方法は、ユビキチンと、キナーゼと、リン酸供与体とを含有するリン酸化反応溶液を使用する無細胞系アッセイである。本実施形態におけるリン酸化反応溶液としては、生細胞から調製した細胞抽出液を用いてもよいし、ユビキチンと、キナーゼと、リン酸供与体とを混合して調製した人工的な反応溶液を用いてもよい。本実施形態の好ましいリン酸化反応溶液は、細胞抽出液である。【0085】
リン酸化反応溶液として、細胞抽出液を用いる場合には、細胞抽出液は、上記のＰＩＮＫ１発現細胞から調製されたものであってもよいし、ＰＩＮＫ１を発現しない細胞から調製されたものであってもよい。【0086】
本実施形態における「ＰＩＮＫ１を発現しない細胞」には、ＰＩＮＫ１を全く発現しない細胞のみならず、ＰＩＮＫ１を実質的に発現しない細胞も含まれる。ＰＩＮＫ１を実質的に発現しない細胞とは、通常行われる遺伝子発現の検出手段（ノーザンブロット法など）によって、ＰＩＮＫ１遺伝子の発現を検出することができない細胞を意味する。ＰＩＮＫ１を実質的に発現しない細胞には、例えば、動物個体においてＰＩＮＫ１を実質的に発現しない組織、例えば、肺、脾臓、胸腺、白血球などから、当業者に周知の方法により採取することができる。動物個体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどであり、好ましくはヒトである。ＰＩＮＫ１を全く発現しない細胞は、ＰＩＮＫ１−／−ノックアウト動物から採取されたものであってよく、例えば、ＰＩＮＫ１−／−ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）などであってよい。【0087】
本実施形態における細胞抽出液は、細胞を物理的に破砕する方法や、ＣＨＡＰＳなどの界面活性剤により溶解する方法など、従来公知の方法により調製することができる。本実施形態における細胞抽出液は、好ましくは、細胞を物理的に破砕して調製する。【0088】
リン酸化反応溶液として、ユビキチンと、キナーゼと、リン酸供与体とを混合して調製した反応溶液を用いる場合には、キナーゼによるリン酸化反応に適した反応バッファー中に、ユビキチンと、キナーゼと、リン酸供与体とを混合することにより調製することができる。反応バッファーには、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋を含有するトリス塩酸バッファーなどを使用することができる。リン酸化反応溶液における各成分の組成は、細胞から調製した細胞抽出液の組成に準じて適切に決定することができる。【0089】
本実施形態におけるユビキチンは、任意の真核生物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物由来のものであり、特に好ましくはヒト由来のユビキチンである。本実施形態におけるユビキチンは、上記のＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンと同様に、遺伝子工学的手法による生合成や、化学合成により調製することができる。【0090】
本実施形態におけるキナーゼには、ＰＩＮＫ１の他にも、ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ５、ＥＲＫ７、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ、ｐ３８などのＭＡＰキナーゼや、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＣａＭキナーゼ、Ｍｏｓ／Ｒａｆキナーゼ、ｃｄｃ２などの任意のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼを使用することができる。好ましくは、本実施形態におけるキナーゼは、ＰＩＮＫ１である。本実施形態におけるキナーゼは、任意の真核生物由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物由来のものであり、特に好ましくはヒト由来のキナーゼである。本実施形態におけるキナーゼは、遺伝子工学的手法による生合成により調製することができる。【0091】
本実施形態におけるリン酸供与体には、例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰなどを使用することができる。本実施形態における好ましいリン酸供与体は、ＡＴＰまたはＧＴＰである。【0092】
次いで、リン酸化反応溶液に、候補化合物を添加する。候補化合物には、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、非ペプチド性化合物、合成化合物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。添加される候補化合物の濃度は、化合物の種類により異なるが、例えば、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で適宜選択することができる。リン酸化反応は、好ましくは、１０分〜２４時間行うことができる。【0093】
次いで、前記細胞におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチン量を測定する。Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン量は、上記パーキンソン病の検査方法におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンの検出または定量と同様に、例えば、抗Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン抗体を用いたＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色、イムノブロットなどの各種免疫学的手法や、質量分析などの手法により行うことができる。【0094】
本実施形態のスクリーニング方法において、リン酸化反応溶液中のＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンが、候補化合物の添加前と比較して有意に増加した場合は、当該候補化合物は、パーキンソン病の治療薬または予防薬として有望であると評価することができる。一方、リン酸化反応溶液中のＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンが、候補化合物の添加前と同等量またはそれ以下の量しか検出されない場合は、当該候補化合物は、パーキンソン病の治療薬または予防薬として有望ではないと評価することができる。【実施例】
【0095】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【0096】
＜実施例１：ミトコンドリア膜電位の消失に応じてユビキチンがリン酸化される＞１−１．ＣＣＣＰ処理細胞におけるユビキチンのリン酸化
ＨｅＬａ細胞は、１×非必須アミノ酸（ライフテック社製）、１×ピルビン酸ナトリウム（ライフテック社製）および１０％ウシ血清（ライフテック社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマ・アルドリッチ社製）中で、５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。ＨｅＬａ細胞を、１５〜３０μＭのＣＣＣＰ（和光純薬社製）により３時間処理した後、細胞抽出用バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０）中に懸濁し、細胞溶解物を調整した。また、ＣＣＣＰ処理を行わずに、それ以外同様の手順により調製した細胞溶解物を陰性対照とした。
【0097】
得られた細胞溶解物は、５０μＭのＰｈｏｓ−ｔａｇアクリルアミド（和光純薬社製）および１００μＭのＭｎＣｌ２を含有する１２．５−１５％のポリアクリルアミドゲルに供され、電気泳動された。また、対照として、Ｐｈｏｓ−ｔａｇを含有しないポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行った。電気泳動後のゲルは、０．０１％のＳＤＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有する転写バッファー中で１０分間洗浄した後、ＥＤＴＡを含有しない０．０１％ＳＤＳ転写バッファー中で１０分間インキュベートした。その後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ユビキチン抗体Ｐ４Ｄ１（セルシグナリングテクノロジー社製）（１：１０００）を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）（１：１００００）を二次抗体として用いて、イムノブロットを行った。検出は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬（ナカライテスク社製）により行った。【0098】
結果を図１に示す。図１左は、Ｐｈｏｓ−ｔａｇを含有しないポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った結果であり、図１右は、Ｐｈｏｓ−ｔａｇを含有するポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った結果である。ＣＣＣＰ処理を行った細胞溶解物をＰｈｏｓ−ｔａｇ含有ゲルで泳動したものには、泳動の遅れたバンド（図中、記号「＊」により表示）が確認された。この結果から、ＣＣＣＰ処理を行った細胞では、ユビキチンがリン酸化されていることが示唆された。【0099】
１−２．無細胞系におけるユビキチンのリン酸化ミトコンドリアの膜電位消失によってユビキチンのリン酸化が起こることを確認するために、無細胞系におけるユビキチンのリン酸化アッセイを行った。ＨｅＬａ細胞を、上記１−１と同様の手順によりＣＣＣＰ処理した後、ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を添加した無細胞系アッセイ用バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２２０ｍＭのソルビトール、１０ｍＭのＫＡｃ、７０ｍＭのスクロース）中に懸濁した。細胞懸濁液を、２５ゲージの注射針に３０回通過させることにより細胞を破砕し、細胞ホモジネート液を得た。次いで、細胞ホモジネート液を、４℃、８００×ｇにて１０分間遠心分離し、核除去後上清を回収した。核除去後上清を、４℃、１０，０００×ｇにて２０分間さらに遠心分離し、ミトコンドリアペレットを回収した。
【0100】
ミトコンドリアを、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＤＴＴおよび１％のグリセロールを添加した無細胞系アッセイ用バッファーにより調製された、終濃度４０ｎｇ／μＬのユビキチン（ボストンバイオケム社製）、ＨＡ−ユビキチン（ボストンバイオケム社製）、またはＨｉｓ６−ユビキチン（ボストンバイオケム社製）中で、３０℃で１時間インキュベートした。その後、４℃、１６，０００×ｇにて１０分間遠心分離し、ミトコンドリアを除去した。得られた上清について、上記１−１と同様の手順により、Ｐｈｏｓ−ｔａｇアッセイを行った。また、ＣＣＣＰ処理を行わずに調製したものを陰性対照とした。イムノブロットは、抗ユビキチン抗体（ダコジャパン社製）（１：５００）を一次抗体として、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰ抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社製）（１：５０００）を二次抗体として用いて行った。検出は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬（ナカライテスク社製）により行った。【0101】
結果を図２に示す。ＣＣＣＰ処理を行った細胞から単離したミトコンドリアと反応させたユビキチンはリン酸化されたのに対し（図２右、レーン８、「ｐＵｂ」と表示されたバンド）、ＣＣＣＰ処理を行わなかった細胞から単離したミトコンドリアと反応させたユビキチンにはリン酸化は見られなかった（図２右、レーン７）。なお、図２中、記号「＊」により表示されたバンドは、抗体の交差反応による。この結果から、ミトコンドリアの膜電位消失に応じてユビキチンのリン酸化が起こることが示された。また、ユビキチンのＮ末端にＨＡタグまたはＨｉｓ６タグを付加しても、ユビキチンのリン酸化は阻害されないことを確認した（図２右、レーン１０および１２）。【0102】
＜実施例２：ユビキチンのリン酸化部位は６５番目のセリン残基である＞２−１．質量分析法によるユビキチンのリン酸化部位の解析
ユビキチンのリン酸化部位を特定するために、液体クロマトグラフタンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による解析を行った。ユビキチンは、上記１−２と同様にしてＣＣＣＰ処理を行ったミトコンドリアと無細胞系において反応させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された。泳動後、ゲルをＣＣＢ染色によりバンドを検出した。ゲルを超純水により洗浄後、目的のバンドを切り出した。切り出されたゲル片を、１ｍｍ２の小片に切り刻み、１ｍＬの５０ｍＭの重炭酸アンモニウム／５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）中で１時間撹拌し、脱水した。その後、１００％ＡＣＮによりゲル小片を完全に脱水した。５０ｍＭの重炭酸アンモニウム／５％のＡＣＮ（ｐＨ８．０）を用いて２０ｎｇ／μＬに調製されたシークエンシンググレード改変トリプシン（プロメガ社製）をゲル小片に加え、３７℃で一晩インキュベートし、ゲル内トリプシン消化を行った。
【0103】
消化反応後、５０μＬの５０％ＡＣＮ／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加し、１時間振盪することにより、断片化ペプチドの抽出を行った。抽出液を別のチューブに回収した後、さらに残ったゲル小片に対して５０μＬの７０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡを加え、３０分間振盪することにより、追加の抽出を行った。回収された抽出液は、ＳｐｅｅｄＶａｃ（アイラ社製）により、２０μＬに濃縮された。濃縮された断片化ペプチドに２０μＬの０．１％ＴＦＡを加え、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ用サンプルとした。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳには、ナノフローＵＨＰＬＣ装置としてＥａｓｙ−ｎＬＣ１０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）およびを、解析ソフトウェアとしてＸｃａｌｉｂｕｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用した。断片化ペプチドのスペクトルは、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンにより、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにて検索した。【0104】
結果を図３に示す。ＣＣＣＰ処理を行った細胞から単離したミトコンドリアと反応させたユビキチン由来のペプチド断片について解析した結果、ユビキチンの５５〜７２番目のアミノ酸に相当するペプチド断片における６５番目のセリンのリン酸化が確認された（ＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥ（ｐＳ）ＴＬＨＬＶＬＲ）。さらに、ユビキチンの６４〜７２番目のアミノ酸に相当するペプチド断片における６５番目のセリンのリン酸化（Ｅ（ｐＳ）ＴＬＨＬＶＬＲ）も確認された。上記のリン酸化ペプチド断片は、ＣＣＣＰ処理を行わなかった細胞から単離したミトコンドリアと反応させた対照からは検出されなかった。これらの結果から、ユビキチンの６５番目のセリン残基（Ｓｅｒ６５）がリン酸化部位であることが示された。【0105】
２−２．無細胞系におけるユビキチンのリン酸化部位の解析ミトコンドリア膜電位の消失に応じてユビキチンのＳｅｒ６５がリン酸化されることをさらに確認するために、Ｓｅｒ６５に変異を導入した組換えユビキチンを用いて、上記１−２と同様の手順により、Ｐｈｏｓ−ｔａｇアッセイを行った。組換えユビキチンとして、Ｓｅｒ６５をアラニンに置換したもの（Ｓ６５Ａ）と、Ｓｅｒ６５をアスパラギン酸に置換したもの（Ｓ６５Ｄ）を用い、対照として野生型（ＷＴ）を用いた。
【0106】
組換えユビキチンおよび野生型ユビキチンは、以下の手順により調製した。Ｎ末端にＨｉｓ６タグ配列を付加した上記変異型または野生型ユビキチンをコードするＤＮＡを組み込んだｐＴ７ベクター（シグマ・アルドリッチ社製）により、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換した。得られた形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地２０ｍＬ中で３７℃にて一晩前培養し、その後２００ｍＬの培地に移した。３７℃で２時間のインキュベーション後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに６時間の培養を行った。回収した菌体を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４０ｍＬに懸濁し、超音波処理により破砕した。８，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離後、上清を回収し、通常の方法により精製し、バッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１００ｍＭのＮａＣｌ／１０％グリセロール）に対して透析した。【0107】
結果を図４に示す。Ｓｅｒ６５を有する野生型のユビキチンはリン酸化された一方（図４右、レーン２）、Ｓｅｒ６５が置換された組換えユビキチンには、いずれもリン酸化が見られなかった（図４右、レーン４および６）。この結果から、ユビキチンのＳｅｒ６５がリン酸化部位であることが確認された。【0108】
２−３．ＣＣＣＰ処理細胞におけるユビキチンのリン酸化部位の解析上記１−１と同様の手順により、ＣＣＣＰ処理を行ったＨｅＬａ細胞の抽出液について、Ｐｈｏｓ−ｔａｇアッセイを行った。Ｓ６５Ａ組換えユビキチンおよびＷＴユビキチンは、それぞれをコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン社製）に挿入したものを、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてＨｅＬａ細胞に導入することにより発現させた。
【0109】
結果を図５に示す。細胞内においても、野生型のユビキチンはリン酸化された一方（図５右、レーン２）、Ｓ６５Ａ組換えユビキチンはリン酸化されなかった（図５右、レーン４）。この結果からも、ユビキチンのＳｅｒ６５がリン酸化部位であることが確認された。【0110】
＜実施例３：ＰＩＮＫ１がユビキチンをリン酸化する＞３−１．ＰＩＮＫ１−／−細胞におけるユビキチンのリン酸化
ＰＩＮＫ１はキナーゼであり、ミトコンドリア膜電位の消失に応じて活性化されることが知られていることから、ユビキチンをリン酸化する酵素はＰＩＮＫ１である可能性が考えられる。この仮説を検証するために、ＰＩＮＫ１−／−ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を用いて、無細胞系におけるリン酸化試験を行った。
【0111】
ＰＩＮＫ１−／−のＭＥＦｓは、ＰＩＮＫ１−／−マウスの胎児から調製されたものを、Ｊｉｅ Ｓｈｅｎ博士（ハーバード大学）より分与していただいた。野生型ＰＩＮＫ１、キナーゼ活性欠失（ＫＤ）変異ＰＩＮＫ１、Ａ１６８Ｐ変異ＰＩＮＫ１またはＧ３８６Ａ変異ＰＩＮＫ１は、それぞれをコードする遺伝子をｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター（コスモバイオ社製）を用いてレトロウイルスにパッケージした。得られたレトロウイルスを、ＰＩＮＫ１−／−のＭＥＦｓに感染させることにより、野生型ＰＩＮＫ１または変異ＰＩＮＫ１発現細胞を作製した。それ以外は上記１−２と同様の手順により、Ｐｈｏｓ−ｔａｇアッセイを行った。【0112】
結果を図６に示す。ＣＣＣＰ処理したＰＩＮＫ１−／−のＭＥＦｓから単離されたミトコンドリアはユビキチンのリン酸化を誘導しないが（図６右、レーン２）、野生型ＰＩＮＫ１を導入したＰＩＮＫ１−／−のＭＥＦｓから単離されたミトコンドリアは、ＣＣＣＰ処理依存的にユビキチンのリン酸化が見られた（図６右、レーン４）。一方、キナーゼ活性を持たない変異ＰＩＮＫ１を導入したＰＩＮＫ１−／−のＭＥＦｓから単離されたミトコンドリアは、いずれもユビキチンをリン酸化しなかった（図６右、レーン６、８および１０）。この結果から、ユビキチンのリン酸化はＰＩＮＫ１によるものであることが示された。【0113】
３−２．ＣＣＣＰ処理細胞から単離されたＰＩＮＫ１によるユビキチンのリン酸化ＰＩＮＫ１がユビキチンをリン酸化するものであることをさらに確認するために、ＣＣＣＰ処理した細胞からＰＩＮＫ１を単離し、ユビキチンをリン酸化するかどうかを試験した。マウスレトロウイルス受容体であるｍＣＡＴ１を一過性発現させたＨｅＬａ細胞に対し、上記３−１と同様の手順により、ｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター（コスモバイオ社製）を用いてＰＩＮＫ１−３×Ｆｌａｇ遺伝子を導入し、安定発現細胞を得た。細胞を、上記１−２と同様の手順により、無細胞系アッセイ用バッファー中に懸濁した。次いで、１０ｍｇ／ｍＬのジギトニンにより４℃で１５分処理して細胞を可溶化した後、抗ＦＬＡＧ抗体２Ｈ８（トランスジェニック社製）をコンジュゲートさせたプロテインＧセファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社製）と４℃で１時間反応させ、免疫沈降を行った。反応後の免疫沈降物は、上記バッファーにより洗浄後、遠心分離により回収した。得られた免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後、上記１−１と同様にしてイムノブロットを行った。ミトコンドリアタンパク質の検出には、抗ＶＤＡＣ抗体ａｂ２（カルビオケム社製）（１：１，０００）、抗マイトフュージン２抗体ａｂ５６８８９（アブカム社製）（１：５００）、抗ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ（上野博士より供与）（１：１，０００）を使用した。
【0114】
結果を図７に示す。免疫沈降反応の結果、ＰＩＮＫ１のみが単離され、他のミトコンドリアタンパク質（ＶＤＡＣ、マイトフュージン２、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ）は除去されたことが示された（図７左）。【0115】
次いで、ミトコンドリアに代えて単離ＰＩＮＫ１を用いる以外は上記１−２と同様の手順により、Ｐｈｏｓ−ｔａｇアッセイを行った。また、ミトコンドリアを用いたものを対照とした。【0116】
結果を図７に示す。ＣＣＣＰ処理細胞から単離されたＰＩＮＫ１は、ＣＣＣＰ処理細胞から単離されたミトコンドリアと同様にユビキチンをリン酸化することが示された（図７右、レーン４）。この結果から、ＰＩＮＫ１がユビキチンをリン酸化していることが明確に示された。【0117】
＜実施例４：Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンはＰａｒｋｉｎの活性化因子である＞４−１．細胞内におけるリン酸化模倣型ユビキチンによるＰａｒｋｉｎの活性化（１）
ＰＩＮＫ１が活性化されると、ＰａｒｋｉｎのＥ３酵素としての活性化とミトコンドリアへの移行が起こることが知られている。そこで、ＰＩＮＫ１が活性化されてリン酸化されたユビキチンがどのような役割を果たしているのかを調べるために、リン酸化模倣型ユビキチンを用いてＰａｒｋｉｎを活性化することができるかどうかを試験した。
【0118】
リン酸化模倣型ユビキチンとしては、Ｓ６５Ｄユビキチンを使用した。Ｓ６５Ｄユビキチンは、Ｓ６５ＤユビキチンをコードするＤＮＡを挿入したｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン社製）を、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてＨｅＬａ細胞に導入することにより発現させた。ＧＦＰ−野生型Ｐａｒｋｉｎ（ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ ＷＴ）またはＧＦＰ−組換えＰａｒｋｉｎも、同様にしてＨｅＬａ細胞に導入することにより発現させた。ＧＦＰ−組換えＰａｒｋｉｎとして、Ｅ３酵素としての活性化とミトコンドリアへの移行に必須であるＳｅｒ６５のリン酸化を模倣したもの（ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ Ｓ６５Ｅ）と、部分的活性化型Ｐａｒｋｉｎとして知られる４０３番目のシステイン残基をアラニンに置換したもの（ＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎ Ｗ４０３Ａ）を用いた。【0119】
ＰａｒｋｉｎのＥ３酵素としての活性化は、Ｐａｒｋｉｎの自己ユビキチン化に基づいて評価した。細胞内ユビキチン化アッセイは、ＧＦＰ−ＰａｒｋｉｎまたはＧＦＰ−組換えＰａｒｋｉｎと、野生型ユビキチンまたはリン酸化模倣型ユビキチンとを含有するＨｅＬａ細胞の細胞質画分を、上記１−１の手順により単離して、イムノブロットすることにより行った。ＣＣＣＰ処理は、上記１−１と同様の手順により行った。【0120】
結果を図８に示す。Ｓ６５Ｄ組換えユビキチンは、ＣＣＣＰ処理不在下、すなわちＰＩＮＫ１が活性化されない条件下では、野生型Ｐａｒｋｉｎを活性化しなかった（図８左、レーン３）。一方、Ｓ６５Ｅ組換えＰａｒｋｉｎおよびＷ４０３Ａ組換えＰａｒｋｉｎは、ＣＣＣＰ処理不在下であっても、Ｓ６５Ｄ組換えユビキチンによって活性化されることが示された（図８中央、レーン３および図８右、レーン３）。この結果から、リン酸化されたユビキチンが、Ｐａｒｋｉｎの活性化因子であることが示唆された。【0121】
４−２．細胞内におけるリン酸化模倣型ユビキチンによるＰａｒｋｉｎの活性化（２）リン酸化されたユビキチンのＰａｒｋｉｎ活性化における役割をさらに調べるために、ポリユビキチン鎖の形成に必要であるユビキチンＣ末端のグリシン残基を欠失した組換えユビキチン（ＧＧＡＡまたはＧＧＶＶ）および組換えリン酸化模倣型ユビキチン（Ｓ６５ＤＧＧＡＡまたはＳ６５ＤＧＧＶＶ）を用いて、上記４−１と同様の手順により、細胞内ユビキチン化アッセイを行った。
【0122】
結果を図９に示す。Ｃ末端のグリシン残基を欠失したＳ６５Ｄリン酸化模倣型ユビキチンも、Ｃ末端のグリシン残基を有するＳ６５Ｄリン酸化模倣型ユビキチンと同様に、Ｓ６５Ｅ組換えＰａｒｋｉｎおよびＷ４０３Ａ組換えＰａｒｋｉｎを活性化することが示された（図９、レーン４〜６）。この結果から、リン酸化されたユビキチンは、Ｐａｒｋｉｎによって付加されるポリユビキチン鎖に使用されるのではなく、それとは独立のメカニズムにより、Ｐａｒｋｉｎの活性化因子として機能するものであることが示唆された。【0123】
＜実施例５：ミトコンドリア上の基質タンパク質に付加されるユビキチンはリン酸化されていなくてもよい＞５−１．多重蛍光免疫染色によるミトコンドリアのユビキチン化の可視化解析
上記４−２から示唆される事項についてさらに検証するために、リン酸化されないＳ６５Ａ組換えユビキチンがミトコンドリア上の基質タンパク質に付加されるかどうかを試験した。上記２−３と同様の手順により、ＨｅＬａ細胞にＳ６５Ａ組換えユビキチンを発現させた。また、野生型ユビキチンを発現させたものを対照とした。ＣＣＣＰ処理は、上記１−１と同様の手順により行った。
【0124】
細胞を、４％ホルムアルデヒドを用いて固定後、５０ｍｇ／ｍＬのジギトニンにより細胞を可溶化し、一次抗体として、抗ＧＦＰ抗体ａｂ６５５６（アブカム社製）（１：５００）、抗Ｆｌａｇ抗体２Ｈ８（トランスジェニック社製）（１：５００）および抗Ｔｏｍ２０抗体ＦＬ−１４５（サンタクルズバイオテクノロジー社製）（１：３，０００）を用い、二次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８または５６８標識抗マウスまたはウサギＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）（１：２，０００）を用いて免疫染色を行った。染色後の細胞は、共焦点レーザースキャン顕微鏡システムＬＳＭ５１０（カールツァイス社製）により観察した。統計的分析は、３回の実験を通して１００個以上の細胞を解析し、スチューデントのｔ検定により行った。【0125】
結果を図１０に示す。リン酸化されないＳ６５Ａ組換えユビキチンも、野生型ユビキチンと同様に、ミトコンドリア上の基質タンパク質に付加されることが示された。この結果からも、Ｐａｒｋｉｎによって付加されるポリユビキチン鎖がリン酸化されたユビキチンに由来するものに限られるわけではないことが確認された。【0126】
＜実施例６：Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンはＰａｒｋｉｎの完全な活性化に必須である＞６−１．無細胞系におけるＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンによるＰａｒｋｉｎの活性化
最後に、組換えＰａｒｋｉｎと組換えユビキチンまたはＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンを用いた無細胞系アッセイにより、Ｐａｒｋｉｎの活性化を評価した。ＷＴ、Ｓ６５ＥまたはＷ４０３ＡのＧＦＰ−Ｐａｒｋｉｎは、ＣＣＣＰ処理されていないＨｅＬａ細胞またはＰＩＮＫ１−／−のＭＥＦｓから、以下の手順により調製した。前記細胞を、ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を添加した無細胞系アッセイ用バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２２０ｍＭのソルビトール、１０ｍＭのＫＡｃ、７０ｍＭのスクロース）中に懸濁した。細胞懸濁液を、２５ゲージの注射針に３０回通過させることにより細胞を破砕し、細胞ホモジネート液を得た。次いで、細胞ホモジネート液を、４℃、８００×ｇにて１０分間遠心分離し、核除去後上清を回収した。核除去後上清を、４℃、１６，０００×ｇにて２０分間さらに遠心分離し、上清を回収することで、ミトコンドリアを除去した細胞質画分を得た。この上清に、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＤＴＴおよび１％のグリセロールを添加した。ＷＴ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５ＤのＨｉｓ６−ユビキチンまたはＨｉｓ６−Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、上記２−１、２−２の手順により調製した。
【0127】
ＰａｒｋｉｎのＥ３酵素としての活性化は、Ｐａｒｋｉｎの自己ユビキチン化に基づいて評価した。無細胞系ユビキチン化アッセイは、ＧＦＰ−ＰａｒｋｉｎまたはＧＦＰ−組換えＰａｒｋｉｎを含有するＨｅＬａ細胞の細胞質画分に、上記１−２、２−１の手順により調製された野生型ユビキチン、Ｓ６５Ｄ組換えユビキチンまたはＳｅｒ６５リン酸化ユビキチン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加し、３０℃で２時間インキュベートすることにより行った。【0128】
結果を図１１に示す。Ｓ６５Ｅ組換えＰａｒｋｉｎおよびＷ４０３Ａ組換えＰａｒｋｉｎは、膜電位の消失したミトコンドリアが存在せずとも、Ｓ６５Ｄリン酸化模倣型ユビキチンによって活性化されるが（図１１上段、レーン１２および１８）、野生型Ｐａｒｋｉｎは、Ｓ６５Ｄリン酸化模倣型ユビキチンによって活性化されなかった（図１１上段、レーン６）。野生型ユビキチンあるいはＳ６５Ａ組換えユビキチンは、Ｓ６５Ｅ組換えＰａｒｋｉｎおよびＷ４０３Ａ組換えＰａｒｋｉｎを活性化しなかった（図１１上段、レーン１０、１６）。また、ＰＩＮＫ１の影響を排除しても、全く同様の結果が得られた（図１１中段）。さらに、Ｓ６５Ｄリン酸化模倣型ユビキチンに代えて、実際にＳｅｒ６５がリン酸化されたユビキチンを用いた場合にも同様の結果が確認された（図１１下段）。【0129】
以上の実施例の結果から想定されるＰａｒｋｉｎの活性化メカニズムを図１２に示す。活性化されたＰＩＮＫ１は、Ｐａｒｋｉｎとユビキチンの両方をリン酸化する。また、Ｐａｒｋｉｎの活性化には、ＰＩＮＫ１によるＰａｒｋｉｎのリン酸化が必要であるが、それのみでは部分的な活性化しか起こらず、完全にＰａｒｋｉｎが活性化されるためには、Ｓｅｒ６５がリン酸化されたユビキチンの存在が必要である。【0130】
このように、本発明に係るＳｅｒ６５リン酸化ユビキチンは、Ｐａｒｋｉｎの活性化に必須の構成分子であり、パーキンソン病検出用バイオマーカーとして使用し得るものであることが確認された。また、本発明に係るパーキンソン病検出用バイオマーカーを使用することにより、パーキンソン病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供することができることが示唆された。さらに、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンおよびＳｅｒ６５Ａｓｐリン酸化模倣型ユビキチンは、Ｐａｒｋｉｎを活性化する効果を有し、パーキンソン病の治療薬または予防薬として使用し得るものであることが示唆された。【0131】
＜実施例７：抗Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン抗体の作製＞次いで、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンに対して特異的結合能を有する抗体を作製した。リン酸化Ｓｅｒ６５を含むユビキチン断片であるＣＮＩＱＫＥ（ｐＳ）ＴＬＨをウサギに、ＣＮＩＱＫＥ（ｐＳ）ＴＬＨＬＶをモルモットに、２週間間隔で４〜５回にわたって免疫した後、全採血し、血清を得ることにより、ポリクローナル抗体を含有する抗血清を得た。
【0132】
ポリクローナル得られた抗体の結合能評価は、上記１−２と同様の手順により調製したユビキチンサンプルを用いて行った。また、陽性対照には、抗ユビキチン抗体Ｚ０４５８（ダコ社製）を用いた。【0133】
結果を図１３および図１４に示す。陽性対照では、リン酸化されたユビキチン（図中、記号「＊」により表示）とリン酸化されていないユビキチン（図中、記号「＊＊」により表示）の両方が検出されているのに対し、抗ユビキチンウサギポリクローナル抗体と抗ユビキチンモルモットポリクローナル抗体はいずれも、リン酸化されたユビキチンのみを特異的に検出した。【0134】
このように、本発明に係る抗Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチン抗体は、Ｓｅｒ６５リン酸化ユビキチンに対して特異的な結合能を有し、上記パーキンソン病の検出方法に使用できるものであることが示唆された。【0135】
＜実施例８：質量分析法を用いたＳｅｒ６５リン酸化ペプチドの検出＞実際に生体内において、ミトコンドリア膜電位の消失に応じて、ユビキチンのＳｅｒ６５がリン酸化されるかどうかを確認するために、細胞抽出液についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を行った。細胞抽出液を、上記１−１と同様の手順により、ＣＣＣＰ処理されたまたは処理されていないＨｅＬａ細胞から調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。次いで、ユビキチンの分子量に相当する付近のゲルを切り出し、上記２−１と同様にしてサンプルを調製し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ機器を用いて質量分析解析に処した。ただし、プロテアーゼによる切断に際しては、トリプシン（プロメガ社製）に加えて、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（和光純薬社製）を用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定後、ユビキチンの６４〜７２番目のアミノ酸に相当するリン酸化ペプチド（Ｅ（ｐＳ）ＴＬＨＬＶＬＲ）および非リン酸化ペプチド（ＥＳＴＬＨＬＶＬＲ）に由来するフラグメントイオンに関して、曲線下面積値（Ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅｓ：ＡＵＣ）を、ＰｉｎＰｏｉｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（サーモフィッシャー社製）を用いて算出した。
【0136】
結果を図１５に示す。ＣＣＣＰ処理を行ったＨｅＬａ細胞の抽出液からは、リン酸化ペプチド断片（Ｅ（ｐＳ）ＴＬＨＬＶＬＲ）に由来するシグナルが検出された一方、ＣＣＣＰ処理を行わなかったＨｅＬａ細胞の抽出液からは、リン酸化ペプチド断片は検出されなかった。非リン酸化ペプチド断片（ＥＳＴＬＨＬＶＬＲ）に由来するシグナルはＣＣＣＰ処理・未処理両方のＨｅＬａ細胞の抽出液から検出された。これらの結果から、実際に生体内において、ミトコンドリア膜電位の消失に応じたユビキチンのＳｅｒ６５のリン酸化を、質量分析法によって検出できることが示された。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]