特許 5997407 多項目増幅手法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】5997407

(24)【登録日】2016年9月2日

(45)【発行日】2016年9月28日

(54)【発明の名称】多項目増幅手法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160915BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160915BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

【請求項の数】11

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-85134(P2016-85134)

(22)【出願日】2016年4月21日

【審査請求日】2016年4月21日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000156581

【氏名又は名称】日鉄住金環境株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100098121

【弁理士】

【氏名又は名称】間山 世津子

(74)【代理人】

【識別番号】100107870

【弁理士】

【氏名又は名称】野村 健一

(72)【発明者】

【氏名】山口 正裕

(72)【発明者】

【氏名】蔵田 信也

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１００８６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２２５１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５３５４３１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3’末端側の一部の配列を持つフォワードプライマー(a)と、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3’末端側の一部の配列を持つリバースプライマー(b)からなるプライマー対を、少なくとも1対以上含むプライマー対群Xおよび、3’末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つフォワードプライマー(c)と、3’末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つリバースプライマー(d)からなるプライマー対Yおよび、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持つフォワードプライマー(e)と、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つリバースプライマー(f)からなるプライマー対Zにより構成されるプライマーセットを用いて複数の標的核酸群をPCR法により同時に増幅する方法。

【請求項2】

前記プライマー対Yのフォワードプライマー(c)とリバースプライマー(d)の各々が、人工核酸配列C、Dの3’末端と人工核酸配列A,Bの5’末端の間に、検体を識別するための人工核酸配列（以下、バーコード配列）を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記増幅が、前記のプライマー対群Xおよびプライマー対Y,Zを最初にすべて混合し、途中の精製・希釈を伴わず、一連の反応で完了する請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

試料溶液中において、前記プライマー対Zが、前記プライマー対Yの濃度の少なくとも3倍で存在する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

試料溶液中において、前記プライマー対Yが、それに由来するプライマーダイマーが産生されない濃度で存在し、かつ、前記プライマー対Zが、目的産物を得るのに十分な濃度で存在する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記プライマー対群Xが、少なくとも5対のプライマーからなる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記プライマー対群Xが、少なくとも20対のプライマーからなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

試料溶液中において、前記プライマー対群X中の各プライマー対が、1〜20nMの範囲で存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

試料溶液中において、前記プライマー対群X中の各プライマー対の濃度を調整することで、各標的遺伝子の増幅効率を均一に近づけることができる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記プライマー対群Xによる増幅は2サイクル以上、前記プライマー対Y、Zによる増幅は20サイクル以上行われる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記増幅が、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて行われる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、主に特定の核酸配列群の検出または配列決定を行うアッセイに関する。特定の実施形態において、本発明は標的とする核酸配列に、検体を識別するための人工核酸配列であるバーコード配列を含む1つ以上の人工的に設計された核酸配列（以下、人工核酸配列）が付加される増幅方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

特定の核酸配列を検出することは、医療における遺伝子診断、食品における衛生検査、環境におけるモニタリングなど、多くの分野に渡って用いられている。

【0003】

加えて、近年次世代シーケンサーが台頭し、従来法のシーケンス法と比べて核酸配列決定が格段に容易になったことから、新たな解析手法として広がりを見せている。

【0004】

次世代シーケンサーにて、複数検体由来の増幅産物の混合物を供するためには、配列決定を行いたい核酸断片の両末端に、検体を識別するためのバーコード配列を含む特定の人工核酸配列が付加されていなくてはならず、そのための核酸増幅反応ステップが、標的とする核酸配列を増幅するステップに加えて必要である。

【0005】

標的とする核酸配列に特異的なプライマーの5’末端側に、あらかじめバーコード配列を含む特定の人工核酸配列が付加されているプライマーを用いても、次世代シーケンサーに供する核酸断片は得られるが、核酸配列の種類ごとに検体の数だけバーコード配列が異なるプライマーを用意しなければならず、極めて不経済である。そのため、特異的プライマーとは別に、人工核酸配列のみで構成されたプライマーを増幅に供し、増幅の過程でそれぞれの核酸配列に共通に付加する手法が求められる。

【0006】

また、標的とする核酸が複数種になる場合は、マルチプレックスPCRが用いられることが多いが、各標的核酸の増幅効率にばらつきが生じやすく、プライマー設計には高度なノウハウを要する。

【0007】

増幅効率のばらつきを抑制し、かつ人工核酸配列が付加された増幅産物を得るための手段として、人工核酸配列を3’末端側に有するプライマー及び、その人工核酸配列の全部あるいは3‘末端側の一部を特異的配列の5’末端側に付加したプライマーを用いた増幅反応手法が報告されている（特許文献１、２）。

【0008】

特許文献１，２によれば、特異的配列を有するプライマーの濃度を、人工核酸配列を付加した核酸で構成されているプライマー（以下、人工核酸プライマー）の濃度より低くすることで、全ての標的配列に共通に付加された人工核酸プライマーが増幅反応を支配的に行うことができ、増幅効率のばらつきが抑制される。

【0009】

しかし、特許文献１，２の手法を用いて次世代シーケンサーに供するための核酸配列を調製する場合、高い濃度で用いる人工核酸プライマーが約60〜70塩基と長鎖になるため、プライマーダイマーが産生される可能性が高まる。特に標的とする核酸配列が複数になる場合、用いられる特異的プライマーの種類が増えるため、プライマーダイマーが高頻度で産生される。これにより、次世代シーケンサー解析の際に標的配列以外の配列情報が多くなってしまい問題となる。

【0010】

加えて、標的とする核酸配列の種類が増えると、用いられる特異的プライマーの総量が増え、結果として人工核酸プライマーが増幅反応を支配的に行うことができず、人工核酸配列が付加されていない核酸配列の割合が高くなってしまうという問題点がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】ＷO２００６／０２３９１９

【特許文献2】特表２０１２−５２２５１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

従って、次世代シーケンサーを用いて主に複数の遺伝子を標的とする場合において、測定に必要な人工核酸配列を効率よく均一に付加するための技術が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、前記の課題を解決するにあたり、非特異的配列の増幅を抑制しつつ、人工核酸配列を付加する核酸増幅手法について検討を重ねた。その結果、標的遺伝子配列に人工核酸配列を付加する反応において、特異的プライマーの他に長鎖、短鎖の2対の人工核酸配列を有するプライマー（図１Ａ中の「プライマー対Y」および「プライマー対Z」）を用いることで、プライマーに由来する非特異的配列の増幅を抑制でき、かつ目的とする人工核酸配列が付加された核酸を効率よく増幅できることを発見した。さらに、バーコード配列等を含む人工核酸プライマー（プライマー対Y）濃度を低く、短鎖のプライマー（プライマー対Z）濃度を高くすることで、目的産物をより効率よく増幅させることができた。本発明はかかる発見に基づいて完成されたものである。

【0014】

このような技術は、様々な目的の解析に適用されうる。例えば、遺伝子変異の箇所を特定するために、がんの原因となりうる遺伝子を網羅的に解析することができる。その他にも、本技術は、種々のSNP解析、遺伝子変異解析、遺伝子発現解析において、次世代シーケンサーを用いる際に好適に利用可能であるが、検査対象が遺伝子増幅産物であり、人工核酸配列を付加し検体を識別することで複数の標的遺伝子を解析する手法であれば、その適用範囲は制限されるものではない。

【0015】

本発明は、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つフォワードプライマー(a)と、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つリバースプライマー(b)からなるプライマー対を、少なくとも1対以上含むプライマー対群Xおよび、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つフォワードプライマー(c)と、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つリバースプライマー(d)からなるプライマー対Yおよび、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持つフォワードプライマー(e)と、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つリバースプライマー(f)からなるプライマー対Zにより構成されるプライマーセットを用いて複数の標的核酸群を同時に増幅する方法を提供する。

【0016】

特定の実施形態において、本発明は、試料中の1種類もしくは複数種類の核酸配列を増幅し、かつバーコード配列を含む人工核酸配列をその両末端に付加する方法を提供する。増幅反応溶液は、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つフォワードプライマー(a)と、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つリバースプライマー(b)からなるプライマー対を、少なくとも1対以上含むプライマー対群Xおよび、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つフォワードプライマー(c)と、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つリバースプライマー(d)からなるプライマー対Yおよび、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持つフォワードプライマー(e)と、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つリバースプライマー(f)からなるプライマー対Zにより構成されるプライマーセットを含む。

【0017】

また、本発明は、核酸配列を増幅し、かつ人工核酸配列をその両末端に付加する方法において、特異的プライマー及び人工核酸配列に由来する非特異的増幅を抑制し、標的とする核酸配列を効率よく得るための方法を提供する。

【0018】

また、本発明は、核酸配列を増幅し、かつ人工核酸配列をその両末端に付加する方法において、特異的プライマー及び人工核酸配列が付加されていない増幅産物が増幅反応の後期に分解されることで、人工核酸配列が付加された核酸配列を効率よく得るための方法を提供する。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、次世代シーケンサーに供するために人工核酸配列が付加された核酸配列を効率よく増幅することが可能になる。効率よく目的産物を得ることで、次世代シーケンサーで取得されるリード数も多くなり、解析精度の向上が望まれる。また、バーコード配列を含む長鎖プライマーの使用量が少なくて済み、全てに共通の短鎖プライマーで主な増幅が行われることから、低コスト化も可能な方法である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A】図１は、次世代シーケンサー解析に供するための人工核酸配列の付加反応における、本発明と先行技術のそれぞれのフローを示す。本発明(図1A)では、人工核酸配列C,Dを付加する段階において、プライマー対Yが低濃度であるため非特異的増幅が発生しにくく、短塩基長であるプライマー対Zを用いて主に増幅を行うことで、目的産物を効率よく得られることを示す。

【図1B】図１は、次世代シーケンサー解析に供するための人工核酸配列の付加反応における、本発明と先行技術のそれぞれのフローを示す。先行技術(図１B)においてはプライマー対Yのみで主な増幅を行うことにより非特異的増幅が発生しやすく、目的産物の収量が低下することを示す。

【図2】図２は、実施例１において詳細に記載されるように、本発明により増幅された標的遺伝子群を次世代シーケンサー解析に供し、得られたリード数を示す。すべての標的遺伝子が検出されており、それぞれ解析するのに十分な量のリード数が得られている。

【図3】図３は、実施例２において詳細に記載されるように、プライマー対群Xにおける各プライマー対の濃度を変えた場合における、各標的遺伝子のリード数比とプライマー濃度比の関係を示す。標的遺伝子の種類によらず、リード数とプライマー濃度は片対数の相関関係が見られる。

【図4】図４は、実施例３において詳細に記載されるように、プライマー対Y,Zを併用した場合とプライマー対Yのみを用いた場合における、増幅産物の違いを電気泳動図にて示す。

【図5】図５は、実施例４において詳細に記載されるように、活性あるいはホットスタート法の異なるDNAポリメラーゼを用いた場合における、増幅産物の違いを電気泳動図にて示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明においては、プライマー対群Xおよびプライマー対Y、Zにより構成されるプライマーセットを用いて、複数の標的核酸群を同時に増幅する。
プライマー対群Xは、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つフォワードプライマー(a)と、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つリバースプライマー(b)からなるプライマー対を、少なくとも1対以上含む。
プライマー対Yは、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つフォワードプライマー(c)と、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つリバースプライマー(d)からなる。
プライマー対Zは、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持つフォワードプライマー(e)と、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つリバースプライマー(f)からなる。
プライマー対群Xにおいて、フォワードプライマー(a)は、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つ。標的核酸に相補的な配列は、１０〜４０塩基長であるとよく、好ましくは、１５〜３０塩基長であり、より好ましくは、１５〜２５塩基長である。人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列は、１０〜３０塩基長であるとよく、好ましくは、１０〜２５塩基長であり、より好ましくは、１５〜２５塩基長である。人工核酸配列Aの3‘末端側の一部の配列は、人工核酸配列Aにおける５’末端側から任意の数のヌクレオチドを除いた配列であるとよい。また、人工核酸配列Aの全部あるいは3’側の一部の配列の上流側には、別の配列が付加されていてもよい。
プライマー対群Xにおいて、リバースプライマー(b)は、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つ。標的核酸に相補的な配列は、１０〜４０塩基長であるとよく、好ましくは、１５〜３０塩基長であり、より好ましくは、１５〜２５塩基長である。人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列は、１０〜３０塩基長であるとよく、好ましくは、１０〜２５塩基長であり、より好ましくは、１５〜２５塩基長である。人工核酸配列Bの3‘末端側の一部の配列は、人工核酸配列Bにおける５’末端側から任意の数のヌクレオチドを除いた配列であるとよい。また、人工核酸配列Bの全部あるいは3’側の一部の配列の上流側には、別の配列が付加されていてもよい。
プライマー対群Xは、1対以上のプライマーからなる。通常、種類が増えるほど均一に増幅することが難しくなるとされるが、5対程度であれば容易に増幅可能であり、20対以上であっても、配列の組み合わせの最適化を行うことで増幅が可能である。
プライマー対Yにおいて、フォワードプライマー(c)は、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つ。人工核酸配列Aは、１５〜５０塩基長であるとよく、好ましくは、１５〜４０塩基長であり、より好ましくは、２０〜３０塩基長である。人工核酸配列Cは、１５〜４０塩基長であるとよく、好ましくは、２０〜４０塩基長であり、より好ましくは、２０〜３０塩基長である。
人工核酸配列Cの3’末端と人工核酸配列Aの5’末端の間に、検体を識別するための人工核酸配列（バーコード配列）を有してもよい。バーコード配列は、３〜２０塩基長であるとよく、好ましくは、５〜１５塩基長であり、より好ましくは、５〜１０塩基長である。
プライマー対Yにおいて、リバースプライマー(d)は、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つ。人工核酸配列Bは、１５〜５０塩基長であるとよく、好ましくは、１５〜４０塩基長であり、より好ましくは、２０〜３０塩基長である。人工核酸配列Dは、１５〜４０塩基長であるとよく、好ましくは、２０〜４０塩基長であり、より好ましくは、２０〜３０塩基長である。
人工核酸配列Dの3’末端と人工核酸配列Bの5’末端の間に、検体を識別するための人工核酸配列（バーコード配列）を有してもよい。バーコード配列は、３〜２０塩基長であるとよく、好ましくは、５〜１５塩基長であり、より好ましくは、５〜１０塩基長である。

【0022】

プライマー対Zにおいて、フォワードプライマー(e)は、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持ち、リバースプライマー(f)は、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つ。プライマー対Zの塩基長は、非特異的増幅を抑制するため、10〜40塩基の範囲で設計されることが望ましく、好ましくは10〜30塩基、さらに好ましくは10〜20塩基である。

【0023】

人工核酸配列A, B, C, D及びバーコード配列としては、次世代シーケンサー解析に用いられる配列を好適に用いることができる。例えばIllumina社が開示しているIllumina Adapter Sequence Document (http://support.illumina.com/downloads/illumina-customer-sequence-letter.html) においてPrimerと記載されている配列の全部あるいは一部は人工核酸配列A,B,C,Dとして、Index Adapterと記載されている配列はバーコード配列として用いるのに好適である。

【0024】

本発明において、増幅は、プライマー対群Xおよびプライマー対Y,Zについて、それらを最初にすべて混合し、途中の精製・希釈を伴わず、一連の反応で完了することができる。

【0025】

本発明は、非特異的配列の増幅及び、1段階目の特異的プライマーでの過剰な増幅、すなわち人工核酸配列C,Dが付加されていない産物の過剰な生成を抑制するため、特に増幅サイクル初期における活性を抑えることができるとされる様々な手法・試薬と組み合わせることで、より効率的な増幅を可能とする。具体的にはタッチダウンPCRや、化学修飾されたホットスタートDNAポリメラーゼを用いるなど、増幅反応効率が徐々に上がっていく手法・試薬が好ましい。

【0026】

化学修飾されたホットスタートDNAポリメラーゼとは、室温で酵素を不活性化する熱不安定性のブロッキング基が導入されたDNAポリメラーゼのことであり、これらのブロッキング基は増幅の前段階において高温に達した際に除去され、酵素は活性化状態になる。このような修飾は、例えばシトラコン酸無水物、シス-アコニット酸無水物等をタンパク質のリジン残基に結合させることで達成することができる(特許第３０２６５５４号)。もう1つのホットスタート修飾法である、モノクローナル抗体を用いた手法(米国特許第５３３８６７１号)と比較して、活性化までの時間が長く、増幅サイクルの過程で段階的に活性が上がっていくため、増幅初期の特異性が高いという特徴を有する。

【0027】

本発明には、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。ユニバーサルプライマー（プライマー対Z）による増幅が行われる際、3’側にハイブリダイズしている特異的プライマー（プライマー対群X）あるいは特異的プライマーにより増幅された、人工核酸配列C, Dが付加されていない増幅産物を分解しながら伸長していくことで、特異的プライマーに由来するダイマーの生成が抑えられるとともに、最終的に人工核酸配列が付加された増幅産物の比率が高まるためである。

【0028】

ホットスタートにおける修飾法及び5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の有無に関して、主に市販されている酵素を表1に分類した。すなわち、表1に示してある酵素としては、Amplitaq Gold DNA Polymerase（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）、FastStart Taq DNA Polymerase（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、MethylTaq DNA Polymerase（ニッポンジーン社）等を特に好適に用いることができる。

【0029】

本手法における増幅サイクルは、特異的プライマー(プライマー対群X)による増幅を行うための前半サイクルと、プライマー対Y、Zによるユニバーサル増幅を行うための後半サイクルの2つの温度条件を設定することで、より効率的な増幅を可能とする。前半サイクルは2〜20サイクル行うことが望ましく、好ましくは5〜15サイクル、より好ましくは5〜10サイクルである。後半サイクルは20〜70サイクル行うことが望ましく、好ましくは30〜60サイクル、より好ましくは35〜50サイクルである。

【0030】

本手法の増幅サイクルに入る前に行う最初の熱変性工程としては、特に化学修飾されたホットスタートDNAポリメラーゼを用いる場合、94〜98℃において1〜15分行う事が望ましい。より好ましくは1〜10分、さらに好ましくは2〜8分である。

【0031】

本手法の増幅サイクルについて、前半サイクルにおける熱変性工程としては、94〜98℃で5〜90秒行う事が望ましく、より好ましくは5〜60秒、さらに好ましくは10〜30秒である。

【0032】

本手法の増幅サイクルについて、前半サイクルにおけるアニーリング工程としては、人工核酸配列AあるいはBが各特異的プライマーに共通に付加されているため、30〜120秒行うことが望ましい。より好ましくは60〜120秒、さらに好ましくは60〜90秒である。温度については、特異的プライマー部分のTm（通常、55〜65℃、好ましくは、60℃付近）に対し-10℃〜+10℃が望ましく、好ましくは-5℃〜+5℃である。

【0033】

本手法の増幅サイクルについて、前半サイクルにおける伸長工程としては、30〜120秒行うことが望ましく、好ましくは30〜90秒、より好ましくは45〜90秒である。伸長工程の温度は、通常は60〜80℃であり、好ましくは60〜75℃、より好ましくは65〜75℃である。

【0034】

本手法の増幅サイクルについて、後半サイクルにおける熱変性工程としては、94〜98℃で5〜90秒行う事が望ましく、より好ましくは5〜60秒、さらに好ましくは10〜30秒である。

【0035】

本手法の増幅サイクルについて、後半サイクルにおけるアニーリング工程としては、プライマー対群Xのハイブリダイズを抑えるため、5〜30秒と比較的短く行うことが望ましく、より好ましくは5〜15秒である。温度については、プライマー対ZのTm（通常、50〜65℃）に対し、-10℃〜+10℃が望ましく、好ましくは-5℃〜+5℃である。

【0036】

本手法の増幅サイクルについて、後半サイクルにおける伸長工程としては、30〜120秒行うことが望ましく、好ましくは60〜120秒、より好ましくは60〜90秒である。伸長工程の温度は、通常は60〜80℃であり、好ましくは60〜75℃、より好ましくは65〜75℃である。

【0037】

プライマー対群Xにおける各プライマー対のTm値は、なるべくばらつきが少ないことが望ましい。具体的には全プライマーの平均Tm（通常、55〜65℃）値に対して、±10℃の範囲にあることが望ましく、好ましくは±5℃、より好ましくは±3℃である。

【0038】

プライマー対群Xにおける各プライマー対の濃度は、人工核酸配列C,Dが付加されていない産物の過剰な生成を抑えるため、1〜30nMの範囲にあることが望ましく、好ましくは1〜20nM、さらに好ましくは1〜10nMである。試料溶液中において、プライマー対群X中の各プライマー対の濃度を調整することで、各標的遺伝子の増幅効率を均一に近づけることができる。

【0039】

プライマー対Yの濃度は、人工核酸配列C, Dの付加が行われる濃度において、なるべく低く抑えることが望ましい。具体的には5〜50nMの範囲にあることが望ましく、好ましくは
5〜30nM、さらに好ましくは5〜20nMである。

【0040】

プライマー対Zの濃度は、10〜200nMの範囲にあることが望ましく、好ましくは20~100nM、さらに好ましくは20〜50nMである。試料溶液中において、プライマー対Zは、プライマー対Yの濃度の少なくとも3倍で存在するとよい。また、試料溶液中において、前記プライマー対Yが、それに由来するプライマーダイマーが産生されない濃度で存在し、かつ、前記プライマー対Zが、目的産物を得るのに十分な濃度で存在するとよい。

【0041】

増幅は、PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、Rolling Cycle法SMAP法、PALSAR法などで行うことができる。

【0042】

プライマーに使用する核酸は、DNA、RNA等の天然核酸であってもよいし、2’,4’-BNA^coc、3’-Amino-2’,4’-BNA、2’,4’-BNA^NC（BNAは全てBridged Nucleic Acidの略称）、PNA（Peptide Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、TNA（Threose nucleic acid）、GNA（Glycol nucleic acid）等の人工核酸であってもよい。

【0043】

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示であって、本発明の限定を意図するものではない。

【実施例1】

【0044】

数十項目・数十検体の同時増幅
PCR反応の鋳型として、ヒト口腔内粘膜より採取したスワブから抽出したDNAを48検体用いた。DNA濃度は1〜4ng/μlの範囲であった。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD (サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、塩化マグネシウム水溶液（3mM）、10×PCR gold buffer、primer mix、barcode primer(10nM)、universal primer(40nM)からなる。反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。またprimer mix（図１Ａのプライマー対群X）の塩基配列および各プライマー対濃度を表２に、barcode primer（図１Ａのプライマー対Y）およびuniversal primer（図１Ａのプライマー対Z）の塩基配列を表３に示す。

【0045】

上記反応溶液をPCR増幅装置(Life touch(日本ジェネティクス社製))を用いて以下のPCR反応に供した。
(1)熱変性工程：95℃、300秒間
(2)熱変性工程：95℃、10秒間
(3)アニーリング工程：61℃、90秒間
(4)伸長工程：72℃、60秒間
(5)熱変性工程：95℃、10秒間
(6)アニーリング工程：61℃、10秒間
(7)伸長工程：72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。

【0046】

各増幅産物を2μlずつ等量混合し、AmpureXP(ベックマンコールター社製)を用いて精製を行った後、次世代シーケンサー測定(Miseq;イルミナ社製)に供した。

【0047】

Barcode primer中にあるバーコード配列に従って分離し、検体中の各標的遺伝子のリード数をカウントした結果を図２に示す。すべての標的遺伝子が検出されており、それぞれ解析するのに十分な量のリード数が得られている。

【実施例2】

【0048】

マルチプレックス増幅におけるprimer mix中の各プライマー対の濃度検討

【0049】

PCR反応の鋳型として、ヒト口腔内粘膜より採取したスワブから抽出したDNAを用い、primer mixの濃度組成を変えて比較検討を行った。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD(サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、塩化マグネシウム水溶液（3mM）、10×PCR gold buffer、primer mix、barcode primer(10nM)、universal primer(40nM)からなる。反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。またbarcode primerおよびuniversal primerの塩基配列を表４に示す。

【0050】

上記反応溶液をPCR増幅装置(Life touch(日本ジェネティクス社製))を用いて以下のPCR反応に供した。
(1)熱変性工程：95℃、300秒間
(2)熱変性工程：95℃、10秒間
(3)アニーリング工程：61℃、90秒間
(4)伸長工程：72℃、60秒間
(5)熱変性工程：95℃、10秒間
(6)アニーリング工程：61℃、10秒間
(7)伸長工程：72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。

【0051】

各増幅産物を20μlずつ等量混合し、AmpureXP(ベックマンコールター社製)を用いて精製を行った後、次世代シーケンサー測定(Miseq;イルミナ社製)に供した。

【0052】

primer mixの塩基配列と各プライマー対濃度および、各検体、各標的遺伝子のリード数を表５に示す。また各標的遺伝子のリード数比とプライマー濃度比の関係を図３に示す。

【0053】

結果より、標的遺伝子のリード数とプライマー濃度は、片対数上で正の相関が見られた。このことから、本手法では標的遺伝子ごとに適切なプライマー濃度を設定することで、均一な増幅が可能であることが示された。

【実施例3】

【0054】

マルチプレックス増幅におけるbarcode primerおよびuniversal primerの効果検討

【0055】

PCR反応の鋳型として、ヒト口腔内粘膜より採取したスワブから抽出したDNAを用い、barcode primerのみで増幅を行った場合と、universal primerを併用した場合の比較を行った。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD (サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、塩化マグネシウム水溶液（3mM）、10×PCR gold buffer、primer mixは共通であり、一方はbarcode primer(10nM)、universal primer(40nM)、もう一方はbarcode primer(50nM)を含む。Primer mixの組成は、実施例２と同様である。またbarcode primer、universal primerの塩基配列を表６に示す。反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。

【0056】

上記反応溶液をPCR増幅装置(Life touch(日本ジェネティクス社製))を用いて以下のPCR反応に供した。
(1)熱変性工程：95℃、300秒間
(2)熱変性工程：95℃、10秒間
(3)アニーリング工程：61℃、90秒間
(4)伸長工程：72℃、60秒間
(5)熱変性工程：95℃、10秒間
(6)アニーリング工程：61℃、10秒間
(7)伸長工程：72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。

【0057】

上記の増幅産物をAgilent 2100 bioanalyzerに供し、電気泳動結果の比較を行った。結果を図４に示す。

【0058】

barcode primerのみの場合、約160bpの産物が多く増幅されており、これは目的産物の産物長(300〜500bp)よりも短く、プライマーダイマー等に由来する非特異的産物であると考えられる。一方、barcode primerを減らし、その分universal primerを用いた系においては、短い断片長は著しく減少する。以上より、短いuniversal primerの使用により、設計上比較的長くなってしまうbarcode primerに由来する非特異的産物の産生を抑制することができると言える。

【実施例4】

【0059】

DNAポリメラーゼの種類による増幅効率の検討

【0060】

PCR反応の鋳型として、ヒト口腔内粘膜より採取したスワブから抽出したDNAを用い、DNAポリメラーゼの種類を変えた場合の比較を行った。
PCR反応溶液の組成は、鋳型DNA10μl、DNAポリメラーゼとして所定量のAmplitaq Gold DNA Polymerase, LD (サーモフィッシャーサイエンティフィク社)、Takara Ex Taq HS(タカラバイオ社)、Hot-Start Gene Taq（ニッポン・ジーン社）のいずれか１種類、4種のdNTP(いずれも0.2mM)、各ポリメラーゼに対して所定量の塩化マグネシウム水溶液、PCR buffer、primer mix、barcode primer(10nM)、universal primer(40nM)を含む。primer mixの塩基配列および各プライマー対濃度を表７に示す。barcode primer、universal primerは実施例３と同様である。各反応溶液は、滅菌水で40μlにメスアップして調製した。

【0061】

上記反応溶液をPCR増幅装置(Life touch(日本ジェネティクス社製))を用いて以下のPCR反応に供した。
(1)熱変性工程：95℃、300秒間
(2)熱変性工程：95℃、10秒間
(3)アニーリング工程：61℃、90秒間
(4)伸長工程：72℃、60秒間
(5)熱変性工程：95℃、10秒間
(6)アニーリング工程：61℃、10秒間
(7)伸長工程：72℃、90秒間
(1)の熱変性工程の後、工程(2)〜(4)を10サイクル繰り返し、さらに工程(5)〜(7)を50サイクル繰り返した。

【0062】

上記の増幅産物をAgilent 2100 bioanalyzerに供し、電気泳動結果の比較を行った。結果を図５に示す。

【0063】

この反応において、目的産物は約450〜550bpに分布する。Amplitaq Gold LDを用いた増幅では、ほとんど目的産物と考えられる塩基長の範囲にピークが見られている。一方、Takara Ex Taq HSを用いた増幅では、350〜450bpの比較的短い塩基長の範囲にもピークが見られ、これは特異的プライマーによる産物が、増幅サイクル初期に過剰に生成してしまったためと推察される。また、それ以外の塩基長範囲にもピークが認められ、非特異的増幅が進行してしまったと考えられる。Hot-Start Gene Taqを用いた増幅では、短い非特異的産物が多く認められる。400bp付近に最も大きくピークが見られるが、人工核酸配列C,Dは付加されていないと考えられる。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を持たない酵素での増幅は、人工核酸配列C,Dが付加されにくく、またプライマー対群Xが分解されずに残存することにより、非特異的増幅も起きやすいと推察される。

【産業上の利用可能性】

【0064】

本発明は、SNP解析の多項目化の他、遺伝子発現解析、がん関連遺伝子変異解析等の次世代シーケンサーを用いて行われる解析に利用できる。

【配列表フリーテキスト】

【0065】

＜配列番号１〜７８＞
配列番号１〜７８は、表２のprimer mix中の各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号７９〜９３＞
配列番号７９〜９３は、表３のbarcode primerの各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号９４及び９５＞
配列番号９４及び９５は、表３のuniversal primerの各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号９６〜９８＞
配列番号９６〜９８は、表４のbarcode primerの各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号９９及び１００＞
配列番号９９及び１００は、表４のuniversal primerの各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１０１〜１９０＞
配列番号１０１〜１９０は、表５のprimer mix中の各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１９１及び１９２＞
配列番号１９１及び１９２は、表６のbarcode primerの各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１９３及び１９４＞
配列番号１９３及び１９４は、表６のuniversal primerの各プライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号１９５〜２１４＞
配列番号１９５〜２１４は、表７のprimer mix中の各プライマーの塩基配列を示す。

【要約】

【課題】次世代シーケンサーを用いて主に複数の遺伝子を標的とする場合において、測定に必要な人工核酸配列を効率よく均一に付加するための技術を提供すること。
【解決手段】3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Aの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つフォワードプライマー(a)と、3’末端側に標的核酸に相補的な配列を持ち、その上流側に人工核酸配列Bの全部あるいは3‘末端側の一部の配列を持つリバースプライマー(b)からなるプライマー対を、少なくとも1対以上含むプライマー対群Xおよび、3‘末端側に人工核酸配列Aを持ち、5’末端側に人工核酸配列Cを持つフォワードプライマー(c)と、3‘末端側に人工核酸配列Bを持ち、5’末端側に人工核酸配列Dを持つリバースプライマー(d)からなるプライマー対Yおよび、人工核酸配列Cの全部あるいは一部の配列を持つフォワードプライマー(e)と、人工核酸配列Dの全部あるいは一部の配列を持つリバースプライマー(f)からなるプライマー対Zにより構成されるプライマーセットを用いて複数の標的核酸群を同時に増幅する方法。
【選択図】図１Ａ

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]