特許 5997902 多重刺激応答型高分子及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5997902

(24)【登録日】2016年9月2日

(45)【発行日】2016年9月28日

(54)【発明の名称】多重刺激応答型高分子及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20160915BHJP

   C07K 1/02 20060101ALI20160915BHJP

   C08F 8/32 20060101ALI20160915BHJP

   C08F 20/06 20060101ALI20160915BHJP

   A61K 47/42 20060101ALN20160915BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   C07K1/02

   C08F8/32

   C08F20/06

   !A61K47/42

【請求項の数】2

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2012-4852(P2012-4852)

(22)【出願日】2012年1月13日

(65)【公開番号】特開2013-144647(P2013-144647A)

(43)【公開日】2013年7月25日

【審査請求日】2014年10月6日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 発行者名：社団法人 高分子学会、刊行物名：第５７回 高分子研究発表会（神戸）予稿集、第６０頁（発行日：平成２３年７月１５日）、及び、発行者名：公益社団法人 日本化学会 コロイドおよび界面化学部会、刊行物名：第６３回 コロイドおよび界面化学討論会 講演要旨集、第３３６頁（発行日：平成２３年８月２２日）に発表

(73)【特許権者】

【識別番号】503027931

【氏名又は名称】学校法人同志社

(74)【代理人】

【識別番号】100076406

【弁理士】

【氏名又は名称】杉本 勝徳

(74)【代理人】

【識別番号】100117097

【弁理士】

【氏名又は名称】岡田 充浩

(72)【発明者】

【氏名】東 信行

(72)【発明者】

【氏名】古賀 智之

(72)【発明者】

【氏名】松尾 祐作

【審査官】 星 浩臣

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−２５６０７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２３２９６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 深見史郎，ほか，elastin類似ペプチドをグラフト鎖に有する新規刺激応答性高分子の合成とその特性，日本化学会講演予稿集，２００９年 ３月１３日，Vol. 89, No. 1，p. 165，4 D1-20

【文献】 Colloids Surf B Biointerfaces, 2011, Vol. 85, No. 1, pp. 12-18

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ０８Ｆ ８／３２

Ｃ０８Ｆ ２０／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イオン性官能基としてカルボキシル基を含む第１の側鎖と、下式（１）で表されるアミノ酸配列を構成単位とするペプチド構造を含む第２の側鎖とを少なくとも有し、下式（２）で表される、ｐＨ及び温度に応答して可逆的に相転移を示す多重刺激応答型高分子。

【化1】

【化2】

（上式（１）において、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ独立して、疎水性アミノ酸残基から選ばれる任意のα−アミノ酸残基である。また、上式（２）において、ｘは１５以上１００未満の範囲であり、ｎは５０〜１５０００の範囲であり、ｍは１〜８の範囲であり、Ｙは主鎖と第２の側鎖とを連結する任意のアミノ酸残基に由来する構造部分であり、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ前記α−アミノ酸残基Ｘ¹及びＸ²の種類に応じたα−アミノ酸側鎖である。）

【請求項2】

ポリアクリル酸に対し、前記ポリアクリル酸のカルボキシル基の一部に、下式（３）で表されるペプチドのＮ末端をスペーサーを介して結合させてペプチド鎖をグラフトすることにより、下式（４）で表され、ｐＨ及び温度に応答して可逆的に相転移を示す多重刺激応答型高分子を製造する、多重刺激応答型高分子の製造方法。

【化3】

【化4】

（上式（３）、（４）において、ｍは１〜８の範囲であり、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ疎水性アミノ酸残基から選ばれるα−アミノ酸残基の種類に応じたα−アミノ酸側鎖である。また、上式（４）において、ｘは１５以上１００未満の範囲であり、ｎは５０〜１５０００の範囲であり、Ｙは主鎖と前記ペプチドのＮ末端とを連結する任意のアミノ酸残基に由来する構造部分である。）

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｐＨ及び温度に応答して可逆的に相転移を示す多重刺激応答型高分子及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

刺激応答型高分子は、外部からの刺激によって相転移を示すので、この性質を利用して、例えば、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）や細胞足場材などの生体材料としての利用が検討されている。
このような刺激応答型高分子としては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）が知られており、このものは、３２℃を境に可逆的に相転移を示す（例えば、非特許文献１，２参照）。すなわち、溶液温度が３２℃を超えるとＰＮＩＰＡＡｍは凝集して溶解性を失う（このように、低温で溶解していた高分子が温度の上昇により相分離を起こす温度をＬＣＳＴ又は下限臨界溶解温度という）。しかし、ＰＮＩＰＡＡｍのＬＣＳＴは一定であり、変えることができないという欠点があった。
そこで、ｐＨ応答型のポリアクリル酸（ＰＡＡ）などにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）をグラフト鎖として導入することにより、ＬＣＳＴをｐＨで制御することも検討されている（例えば、非特許文献３参照）。この方法によれば、ＬＣＳＴをｐＨで制御することが可能であるが、ｐＨの変化に対するＬＣＳＴの変化は僅かであり、十分なものではなかった。
さらに、ＰＮＩＰＡＡｍは生分解性ではないので、生体材料としての応用にも限界があった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Ｙ．Ｇ．Ｔａｋｅｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４，３４１、１９９３年

【非特許文献2】Ｈ．Ｆｅｉｌら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６，２４９６、１９９３年

【非特許文献3】Ａｌｌａｎ Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ．，３７３，４９、１９９５年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

そこで、本発明は、生体適合性に優れるとともに、高感度のｐＨ及び温度応答性を示す多重刺激応答型高分子及びその製造方法を提供することを目的としている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意検討を行った。
その過程において、まず、側鎖としてイオン性官能基（本発明において、「適当な外部ｐＨ域においてイオン化し得る官能基」と定義する）を導入することでｐＨ応答性を発現させることを検討し、加えて、このｐＨ応答性に対して高感度の温度応答性を導入するための更なる検討を行った。そして、生体適合性を考慮し生体由来のエラスチンタンパクに着目して、そのＶＰＧＶＧ（Ｖはバリン残基、Ｐはプロリン残基、Ｇはグリシン残基を表し、本発明においては、それぞれ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙと記する場合もある）という特徴的なアミノ酸配列を手本にしてエラスチン類似ペプチドを系統的に合成するとともに、高分子の側鎖として、前記イオン性官能基に加えて、前記エラスチン類似ペプチドを導入することで、高感度のｐＨ及び温度応答性が発現されること、及び、前記アミノ酸配列におけるバリン残基を他のα−アミノ酸残基に置換すると、優れた多重刺激応答性を損なうことなく、応答ｐＨ域及び応答温度域を変えることができることをも見出した。

【0006】

さらに、このような多重刺激応答型高分子が、イオン性官能基を側鎖に有する高分子の該イオン性官能基の一部に特定のペプチドをグラフトすることにより容易に製造できることも見出した。

【0007】

本発明は上記知見に基づき完成されるに至った。
すなわち、本発明にかかる多重刺激応答型高分子は、イオン性官能基としてカルボキシル基を含む第１の側鎖と、下式（１）で表されるアミノ酸配列を構成単位とするペプチド構造を含む第２の側鎖とを少なくとも有し、下式（２）で表される、ｐＨ及び温度に応答して可逆的に相転移を示す多重刺激応答型高分子である。

【0008】

【化1】

【化2】

【0009】

本発明にかかる多重刺激応答型高分子の製造方法は、ポリアクリル酸に対し、前記ポリアクリル酸のカルボキシル基の一部に、下式（３）で表されるペプチドのＮ末端をスペーサーを介して結合させてペプチド鎖をグラフトすることにより、上式（２）で表され、ｐＨ及び温度に応答して可逆的に相転移を示す多重刺激応答型高分子を製造するものである。

【0011】

【化3】

【0012】

（上式（３）において、ｍは１〜８の範囲であり、Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ疎水性アミノ酸残基から選ばれるα−アミノ酸残基の種類に応じたα−アミノ酸側鎖である。）

【0013】

なお、本発明において、アミノ酸に関して「残基」というときは、ペプチド結合によりアミノ酸のカルボキシル基のＯＨ、アミノ基の水素原子の少なくともいずれかが除かれた構造部分を指す。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、生体適合性を有するエラスチン類似ペプチドを用いているため、生体材料としての幅広い利用が期待できるとともに、高感度のｐＨ及び温度応答性を示す点でも優れており、さらに、ペプチド構造を利用しているのでそのアミノ酸配列を変更するという簡易な手法により高い自由度で応答域を制御することができる利点もある。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】実施例１及び従来技術における多重刺激応答型高分子の一定ｐＨ下での温度応答性を示すグラフである。

【図2】実施例１〜５の多重刺激応答型高分子について、ｐＨごとのＬＣＳＴの測定結果をプロットしたグラフである。

【図3】実施例１の多重刺激応答型高分子の一定温度下でのｐＨ応答性を示すグラフである。

【図4】実施例１の多重刺激応答型高分子について、ＬＣＳＴを超えるサンプルに酵素を添加した後の濁度の経時変化を示すグラフである。

【図5】実施例１の多重刺激応答型高分子について、ＬＣＳＴ未満のサンプルに酵素を添加した後の濁度の温度依存性を示すグラフである。

【図6】実施例１の多重刺激応答型高分子についてのＣＤスペクトルである。

【図7】実施例１〜５の多重刺激応答型高分子について、波長１９８ｎｍでのＣＤスペクトルの測定結果を温度ごとにプロットしたグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明にかかる多重刺激応答型高分子及びその製造方法の好ましい実施形態について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。

【0017】

〔多重刺激応答型高分子〕
本発明にかかる多重刺激応答型高分子は、以下に詳述する第１の側鎖と第２の側鎖とを少なくとも有するものである。

【0018】

＜第１の側鎖＞
第１の側鎖は、イオン性官能基を含むものである。このイオン性官能基は、外部ｐＨが変動したときに可逆的にイオン化するが、イオン化した際には、各イオン間で電荷による反発が生じる。この外部ｐＨに依拠したイオン間反発の有無により、高分子にｐＨ応答性を与える。

【0019】

イオン性官能基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などのアニオン性官能基や、アミノ基、４級アンモニウム塩基などのカチオン性官能基が挙げられる。中でも、カルボキシル基又はアミノ基が好ましく挙げられる。

【0020】

＜第２の側鎖＞
第２の側鎖は、下記（１）で表されるアミノ酸配列を構成単位とするペプチド構造を含むものである。この第２の側鎖は、エラスチン類似の前記特定のペプチド構造を含むことにより、外部温度に応じて、ランダムコイルとβ−ターン構造の構造転移を示し、これにより、高分子に温度応答性を与える。

【0021】

【化4】

【0022】

（上記において、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ独立して、任意のα−アミノ酸残基である。）

【0023】

ここで、第２の側鎖がイオン性官能基を有していると、第１の側鎖との間で電荷による相互作用が生じて、多重刺激応答性の制御が複雑化するおそれがあるので、このような制御の複雑化を避ける場合には、Ｘ¹、Ｘ²として、非イオン性アミノ酸残基を選択することが好ましく、例えば、バリン残基、アラニン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基などの疎水性アミノ酸残基が好ましく挙げられる。中でも、バリン残基、アラニン残基、イソロイシン残基が好ましく挙げられる。
なお、上記（１）では、便宜上、Ｘ¹を左末端に、Ｇｌｙを右末端に表示しているが、これはＮ末端側がＸ¹、Ｃ末端側がＧｌｙでなければならないという意味ではない。すなわち、前記アミノ酸配列を構成するα−アミノ酸単位のいずれがＮ末端側にあってもよく、例えば、ＧｌｙがＮ末端側にあって、Ｃ末端側に向けて、順にＸ²，Ｇｌｙ，Ｘ¹，Ｐｒｏが結合している場合も、上記（１）は含んでいる。

【0024】

また、前記ペプチド構造は、上記（１）で表されるアミノ酸配列からなる構成単位を１つのみ含むものであっても良いし、２以上含むものであっても良い。中でも、前記構成単位を１〜８含むものが好ましく、３〜５含むものがより好ましい。なお、２以上含む場合は、各構成単位におけるＸ¹，Ｘ²は同一でも良いし、異なっていても良い。

【0025】

さらに、前記ペプチド構造は、主鎖に直接に結合していても良いが、適当なスペーサーを介して結合されていても良い。このようなスペーサーとしては、本発明の多重刺激応答性を害することなく主鎖と前記ペプチド構造を隔てて連結する働きを有するものであれば特に限定されないが、具体的には、両末端に反応性官能基を有する二官能化合物、例えば、アミノ酸、ジオール、ジアミン、ジカルボン酸などを用いて得られる有機鎖が導入し易く好ましい。アミノ酸は２以上組み合わせて（ペプチド鎖として）用いることもできる。

【0026】

＜多重刺激応答型高分子＞
本発明にかかる多重刺激応答型高分子は第１の側鎖と第２の側鎖とを少なくとも有するものであればよく、本発明の効果を害しない範囲であれば、第１の側鎖及び第２の側鎖以外の側鎖を有していても良い。第１の側鎖と第２の側鎖の割合については特に限定するわけではないが、例えば、モル比において、両者の合計を１００としたとき、第２の側鎖の割合が１５以上１００未満であることが好ましい。いずれかが過剰でありすぎると、多重刺激応答性が十分に得られにくくなるおそれがある。

【0027】

なお、ここにいう側鎖とは、直鎖状の主鎖に結合したものだけでなく、例えば、デンドリマーにおけるデンドロンのごとき多分岐高分子における側鎖も含む。デンドリマーとしてはポリアミドアミン構造を有するものが広く知られており、特に限定するわけではないが、本発明においても、このポリアミドアミン構造を有するものが好適に採用できる。後述するが、ポリアミドアミンデンドリマーは、そのアミンの一部に第２の側鎖となるペプチド鎖を導入することで、本発明の多重刺激応答型高分子を比較的容易に得ることができる。

【0028】

直鎖状の主鎖に前記第１の側鎖及び第２の側鎖が結合した構造を有するものとしては、特に限定するわけではないが、例えば、下式（２）で表される多重刺激応答型高分子が好ましく挙げられる。

【0029】

【化5】

【0030】

上式（２）において、ｘは第１の側鎖と第２の側鎖とのモル比率に等しく、特に限定するわけではないが、上述のように、１５以上１００未満の範囲であることが好ましい。
ｎは高分子の重合度を表しており、特に限定するわけではないが、５０〜１５０００の範囲であることが好ましい。
上式（２）において、第２の側鎖における括弧内の特定のアミノ酸配列は、上記（１）に記載の表現で言えば、Ｘ¹をＮ末端側に有し、Ｃ末端側に向けて、順に、Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｘ²，Ｇｌｙが結合しているものである。Ｒ¹、Ｒ²は、前記（１）におけるα−アミノ酸残基Ｘ¹、Ｘ²の種類によって自動的に定まるα−アミノ酸側鎖であって、例えば、バリン残基であればイソプロピル基であり、アラニン残基であればメチル基であり、イソロイシン残基であればｓｅｃ−ブチル基である。
ｍは、上記特定のアミノ酸配列の繰り返し数であり、特に限定するわけではないが、上述したように、１〜８の範囲であることが好ましく、３〜５の範囲であることがより好ましい。
上記（２）で示される上記多重刺激応答型高分子では、スペーサーとしてアミノ酸が用いられている。すなわち、Ｙは、スペーサーとなるアミノ酸のアミノ酸残基に由来する構造部分であり、このような任意のアミノ酸残基としては特に限定されないが、例えば、β−アラニン残基（−Ｙ−＝−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）などが好ましく挙げられる。

【0031】

〔多重刺激応答型高分子の製造方法〕
上述した本発明の多重刺激応答型高分子は、例えば、以下に詳述する本発明の製造方法により容易に製造することができる。

【0032】

すなわち、上述した本発明の多重刺激応答型高分子は、イオン性官能基を側鎖に有する高分子に対し、前記イオン性官能基の一部に、下式（３）で表されるペプチドのＮ末端もしくは下式（４）で表されるペプチドのＣ末端を直接に又はスペーサーを介して結合させてペプチド鎖をグラフトする、ことにより製造することができる。

【0033】

【化6】

【0034】

【化7】

【0035】

多重刺激応答型高分子について上述したように、ｍは１〜８の範囲であることが好ましく、３〜５の範囲であることがより好ましい。
Ｒ¹及びＲ²はそれぞれα−アミノ酸残基の種類に応じて自動的に定まるα−アミノ酸側鎖である。

【0036】

高分子のイオン性官能基としては、多重刺激応答型高分子について上述したように、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などのアニオン性官能基や、アミノ基、４級アンモニウム塩基などのカチオン性官能基が挙げられる。中でも、カルボキシル基又はアミノ基が好ましく挙げられる。

【0037】

前記カルボキシル基を側鎖に有する高分子としては、特に限定するわけではないが、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、クロトン酸、無水マレイン酸などのカルボキシル基含有ビニル系単量体の単独重合体もしくは共重合体、グルタミン酸やアスパラギン酸などの酸性アミノ酸を主たる構成アミノ酸とするポリペプチドなどが挙げられる。

【0038】

前記アミノ基を側鎖に有する高分子としては、特に限定するわけではないが、例えば、アリルアミンなどのアミノ基含有ビニル系単量体の単独重合体もしくは共重合体、リシンやキトサンなどの塩基性アミノ酸を主たる構成アミノ酸とするポリペプチドなどが挙げられる。また、ポリアミドアミンデンドリマーのごとき、アミノ基を側鎖に有する多分岐高分子も好ましく挙げられる。

【0039】

上記において、高分子のイオン性官能基の一部に、式（３）で表されるペプチドのＮ末端もしくは式（４）で表されるペプチドのＣ末端を「直接」結合する場合の例としては、例えば、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基の一部に式（３）で表されるペプチドのＮ末端をアミド結合する場合、あるいは、アミノ基を側鎖に有する高分子の該アミノ基の一部に式（４）で表されるペプチドのＣ末端をアミド結合する場合などが好適に挙げられる。

【0040】

また、高分子のイオン性官能基の一部に、式（３）で表されるペプチドのＮ末端もしくは式（４）で表されるペプチドのＣ末端を「スペーサーを介して」結合する場合の例としては、例えば、スペーサーが１もしくは２以上のアミノ酸であれば、これを介して、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基とペプチドのＮ末端、あるいは、アミノ基を側鎖に有する高分子の該アミノ基とペプチドのＣ末端とを連結することができる。
また、スペーサーがジオール、ジアミンなどであれば、これを介して、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基とペプチドのＣ末端とを連結することができる。
さらに、スペーサーがジカルボン酸などであれば、これを介して、アミノ基を側鎖に有する高分子の該アミノ基とペプチドのＮ末端とを連結することができる。
このように、高分子が有するイオン性官能基の種類や用いるスペーサーの種類により種々の態様が有り得る。
このうち、アミノ酸をスペーサーとして用い、これを介して、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基とペプチドのＮ末端、あるいは、アミノ基を側鎖に有する高分子の該アミノ基とペプチドのＣ末端とを連結するか、または、ジエチレングリコールをスペーサーとして用い、これを介して、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基とペプチドのＣ末端とを連結することが好ましい。

【0041】

上記した種々の実施形態のうち、前記イオン性官能基を側鎖に有する高分子としてポリアクリル酸を用い、該ポリアクリル酸のカルボキシル基の一部に、上式（３）で表されるペプチドのＮ末端を直接に又は１もしくは２以上の任意のアミノ酸（例えば、β−アラニン酸）を介して結合させてペプチド鎖をグラフトする方法が特に好ましい。

【0042】

上式（３）や上式（４）で表されるペプチドは、Ｆｍｏｃ基（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）やＢｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）などの保護基を用いた固相ペプチド合成法などの従来公知の方法で合成することができる。
但し、第２の側鎖がイオン性官能基を有していると第１の側鎖との電荷による相互作用が生じて、多重刺激応答性の制御が複雑化するおそれがあるので、上式（３）で表されるペプチドはＣ末端がアミド化され、上式（４）で表されるペプチドはＮ末端がアセチル化されている。
上式（３）で表されるペプチドにおけるＣ末端のアミド化は、例えば、ペプチドアミン用レジンを担体として用いることで得ることができる。このようなペプチドアミン用レジンとしては、例えば、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＭＢＨＡ樹脂、ＣＬＥＡＲ−Ａｍｉｄｅ樹脂などが知られている。
また、上式（４）で表されるペプチドにおけるＮ末端のアセチル化は、例えば、Ｎ末端に無水酢酸を作用させることで容易に行うことができ、具体的には、アセチル化を行う対象となるペプチドの溶液に対し、無水酢酸溶液、ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）溶液、ＨＯＡｔ（ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液を加え、撹拌混合する方法などが挙げられる。この場合、溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などが好適である。

【0043】

次に、前記高分子と前記ペプチドにおけるカルボキシル基とアミノ基との縮合反応も、従来公知の方法で行うことができる。通常、溶媒中で縮合剤の存在下で反応を行う。

【0044】

前記溶媒としては、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、エタノールなどの有機溶媒、水などが挙げられる。溶媒は、１種単独であるいは２種以上を混合して用いることができる。

【0045】

縮合剤を用いる場合、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩（ＤＭＴ−ＭＭ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣまたはＷＳＣ）などが挙げられる。また、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＰ）、ＮＨＳなどの活性化剤を前記縮合剤と併用して用いることもできる。
前記縮合反応は、特に限定するわけではないが、例えば、０〜６０℃の範囲の温度で、１〜４８時間程度行うことができる。

【0046】

なお、本発明の多重刺激応答型高分子は、グラフト技術を用いた上記製造方法以外の共重合技術によっても得ることができる。
例えば、カルボキシル基やアミノ基などのイオン性官能基を有する単量体と、上記所定のペプチド鎖を有する単量体を別々に調製し、これらを共重合することにより得ることができる。この場合、共重合は、ランダム共重合でもブロック共重合でも良いが、ランダム共重合がより好ましい。ブロック共重合の場合、得られる多重刺激応答型高分子は、イオン性官能基を有する第１の側鎖同士が近接し、また、ペプチド構造を有する第２の側鎖同士が近接したものとなるので、両側鎖の挙動が個別に現れてしまって、これらの相乗作用に基づく所望の多重刺激応答性が得られなくなるおそれがあるからである。

【0047】

〔多重刺激応答型高分子の用途〕
本発明の多重刺激応答型高分子は、ｐＨ及び温度に応じて相転移を示すことから、ＤＤＳ、細胞足場材料、アクチュエーター、分離材料などとして好適に利用することができる。

【実施例】

【0048】

以下、実施例を用いて、本発明にかかる多重刺激応答型高分子及びその製造方法について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0049】

〔エラスチン類似ペプチドの合成〕
下記合成経路１に従い、合成例１〜３にかかるエラスチン類似ペプチド（ＥＬＰ）を合成した。

【0050】

【化8】

【0051】

＜合成例１＞
以下に詳述するようにして、上記合成経路１に記載の最終生成物において、Ｘ＝Ｖａｌである合成例１のＥＬＰを得た。
すなわち、まず、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＭＢＨＡ樹脂１．５ｇ（０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＭＦ１５ｍＬにより一晩膨潤させた。このＦｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＭＢＨＡ樹脂に対して、下記（１）脱保護基及び（２）アミノ酸鎖の伸長を逐次行った。

【0052】

（１）脱保護基（脱Ｆｍｏｃ基）
Ｆｍｏｃ基を除去するため、ピペリジン／ＤＭＦ（体積比＝１／４）１５ｍＬを加え撹拌した。この操作を３分×２回、２０分×１回行った。その後、ＤＭＦで溶液が中性になるまで洗浄を繰り返した。

【0053】

（２）アミノ酸鎖の伸長（縮合反応）
伸長したいアミノ酸鎖に応じたＦｍｏｃ−アミノ酸のＤＭＦ溶液（７ｍＬ）、ＤＩＰＣ：０．３８ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３ｍＬ）、ＨＯＡｔ：０．４２ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）を加え、２時間撹拌することで所望のＦｍｏｃ−アミノ酸鎖を縮合結合した。縮合後、ＤＭＦにより洗浄し、未反応のＦｍｏｃ−アミノ酸を除去した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸の使用量は、それぞれ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ：０．９ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ：１．０２ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ：１．０１ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）とした。

【0054】

上記（１）、（２）の手順を繰り返すことでＦｍｏｃ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）₄−ＮＨ−ＳＡＬ−ＭＢＨＡ樹脂を得た。

【0055】

その後、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ：０．９３６ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）をスペーサーとして導入し、Ｆｍｏｃ基を除去することでＮＨ₂−β−Ａｌａ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）₄−ＮＨ−ＳＡＬ−ＭＢＨＡ樹脂を合成した。

【0056】

次に、合成したＮＨ₂−β−Ａｌａ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）₄−ＮＨ−ＳＡＬ−ＭＢＨＡ樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭにより洗浄したのち、デシケーター内で減圧乾燥させた。乾燥後、ＴＦＡ／ＤＣＭ（体積比＝９／１）３０ｍＬで２時間×２回撹拌し、樹脂からのペプチドの切り出しを行った。その後、メタノールとＴＦＡを共沸させることで減圧濃縮した。最後に、水に溶解させ凍結乾燥することで目的のエラスチン類似ペプチドＮＨ₂−β−Ａｌａ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）₄−ＮＨ₂を得た。

【0057】

＜合成例２＞
Ｆｍｏｃ−アミノ酸の一つとしてＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ：１．０７ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は合成例１と同様にして、上記合成経路１に記載の最終生成物において、Ｘ＝Ｉｌｅである合成例２のＥＬＰを得た。

【0058】

＜合成例３＞
Ｆｍｏｃ−アミノ酸の一つとしてＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ：０．９９ｇ（３．０２ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は合成例１と同様にして、上記合成経路１に記載の最終生成物において、Ｘ＝Ａｌａである合成例３のＥＬＰを得た。

【0059】

〔多重刺激応答型高分子の合成〕
下記合成経路２に従い、実施例１〜５にかかる多重刺激応答型高分子を合成した。

【0060】

【化9】

【0061】

＜実施例１＞
以下に詳述するようにして、上記合成経路２に記載の最終生成物において、ｘ＝３６、Ｘ＝Ｖａｌである実施例１の多重刺激応答型高分子を得た。
すなわち、まず、ナスフラスコ内で前記合成例１のエラスチン類似ペプチド０．８０ｇ（０．４６ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させ、さらに、トリフルオロ塩を除去するためにトリエチルアミン７７μｌ（０．５７６ｍｍｏｌ）を加えた。
ここに、重量平均分子量２５万のポリアクリル酸（ＰＡＡ）０．０８３ｇ（０．０００３５ｍｍｏｌ）を溶解させた。溶解後、縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭ０．４５ｇ（１．４４ｍｍｏｌ）を用いて、ＤＭＦ３０ｍｌ中で縮合を行った。縮合は、室温で２４時間行った。縮合後は、ＤＭＦを減圧除去し、超純水に溶解後、蒸留水中４℃下で分画分子量１２０００〜１４０００の透析膜を用いて透析を行い、未反応のペプチドおよび縮合剤を除去することで精製を行った。精製確認はＵＶ−ｖｉｓスペクトルにより行った。具体的には、蒸留水を交換する際に透析後の外液を測定し、ペプチドのカルボニル基のπ−π^*遷移に基づく１９８ｎｍ付近のピークが消失したことから確認した。透析後、目的物の水溶液を凍結乾燥させることで実施例１の多重刺激応答型高分子を得た。この多重刺激応答型高分子について¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより構造確認を行いグラフト率ｘ＝３６（％）と算出した。

【0062】

＜実施例２〜５＞
実施例１において、合成例１のエラスチン類似ペプチドに代えて、合成例２，３のエラスチン類似ペプチドを用いるとともに、各仕込み量を表１に示す量としたこと以外は同様にして、ペプチド鎖の構成アミノ酸残基及びグラフト率が異なる実施例２，３にかかる多重刺激応答型高分子を得た。また、実施例１において、各仕込み量を表１に示す量としたこと以外は同様にして、グラフト率の異なる実施例４，５にかかる多重刺激応答型高分子を得た。

【0063】

【表1】

【0064】

〔物性及び性能の評価〕
＜濁度測定による多重刺激応答性の評価＞
（濁度の測定方法）
多重刺激応答性の評価は、濁度を測定することにより行い、この濁度測定は日本分光社製Ｊ−８２０型を用いて行った。光路長１ｃｍの石英セルを用いるようにし、また、温度変化は日本分光社製ＰＴＣ−４２３Ｌ型ペルチェ式恒温装置とＬＡＵＤＡ社製Ｅ２００を用い、温度勾配１℃／ｍｉｎで行った。各温度での濁度は７００ｎｍの吸光度から求め、濁度が５０％変化したときの温度をＬＣＳＴと定義した。

【0065】

（一定ｐＨ下での温度応答性）
実施例１の多重刺激応答型高分子を用い、これを、所定のｐＨの５０ｍＭ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄／クエン酸緩衝溶液に溶解させてサンプル（高分子濃度＝１ｗｔ％）を調製した。上記方法に従って、一定ｐＨ下（ｐＨ３．３）での濁度の温度依存性を測定した。同様にして、ｐＨ３．９，ｐＨ４．２，ｐＨ４．９，ｐＨ５．４，ｐＨ５．９，ｐＨ６．４のそれぞれについても測定した。
結果を図１にまとめて示す（図１下図）。
比較のため、従来の多重刺激応答型高分子の温度応答性も併せて図１に示す（図１上図。Ａｌｌａｎ Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ．３７３，４９（１９９５）からの引用）。
この従来の多重刺激応答型高分子は、下式に示す構造を有するもので、ポリアクリル酸（重量平均分子量２５００００）にＮＩＰＡＡｍ（重量平均分子量２２００）がグラフトしたものである。

【0066】

【化10】

【0067】

図１に見るように、本発明の多重刺激応答型高分子は、従来の多重刺激応答型高分子（ΔｐＨ２．５に対しΔＬＣＳＴ＝１８℃程度）と比べて、ｐＨ変化に対する温度応答性の感度が非常に大きい。

【0068】

次に、第２の側鎖のペプチド構造における構成アミノ酸残基（及びグラフト率）が異なる実施例２，３の多重刺激応答型高分子、グラフト率が異なる実施例４，５の多重刺激応答型高分子のそれぞれについても同様にサンプル（高分子濃度＝１ｗｔ％）を調製し、上記方法に従って、ｐＨを様々に変えて、一定ｐＨ下での温度応答性を測定し、ＬＣＳＴを導出した。これらの結果を、実施例１の結果とともに、図２にまとめた。

【0069】

図２に見るように、第２の側鎖のペプチド構造における構成アミノ酸残基やグラフト率を変化させることで、多重刺激応答性を損なうことなく応答域に変化を持たせることができることが分かる。

【0070】

（一定温度下でのｐＨ応答性）
実施例１の多重刺激応答型高分子を用い、上記と同様にしてサンプル調製及び濁度の測定を行い、一定温度下（＝３５℃）でのｐＨ応答性を測定した。
結果を図３に示す。

【0071】

図３から、温度を一定としてｐＨを変化させた場合にも、溶解特性を変化させることができることが分かった。なお、ｐＨを３．５から６．０に変化させた場合と、６．０から３．５に変化させた場合とでは、若干の違いが認められた。

【0072】

（酵素添加時の刺激応答性の挙動）
本発明の多重刺激応答型高分子が有する第２の側鎖は、エラスチン類似のペプチド構造を含む。この特徴的な構成に基づく特異な挙動について観察した。
すなわち、まず、実施例１の多重刺激応答型高分子を溶解した５０ｍＭ、ｐＨ４．２、クエン酸／Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液にパパインを溶解させてサンプル（高分子濃度＝１ｗｔ％、酵素濃度＝１ｍｇ／ｍＬ）を得た。このサンプルの濁度を上記方法に従って測定し、その経時変化を５０℃（ＬＣＳＴを超える温度）下で測定した。
結果を図４に示す。

【0073】

得られた結果から、ＬＣＳＴ以上の５０℃という温度条件にあって、凝集状態にあった高分子が、酵素（パパイン）を添加して５分程度で溶解したことが分かった。
また、上記と同様にして、５℃（ＬＣＳＴ未満の温度）のサンプル（高分子濃度＝１ｗｔ％、酵素濃度＝１ｍｇ／ｍＬ）を調製し、これを５０℃（ＬＣＳＴを超える温度）まで昇温したところ、図５に示すように、もはや凝集が起こることはなかった。
以上の結果から、本発明の多重刺激応答型高分子は、生分解性という従来の多重刺激応答型高分子にない特性を有することが確認できた。このような特性を有することにより、例えば、温度やｐＨに関係なく、強制的かつ不可逆的に凝集性を失わせることができることが分かる。

【0074】

＜立体配座の温度依存性＞
上記のごとき本発明の多重刺激応答型高分子における特徴的な挙動が、特に第２の側鎖における特徴的なペプチド構造によってもたらされていることを、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定により立体配座の温度依存性を測定することにより確認した。

【0075】

このＣＤスペクトルの測定は日本分光社製Ｊ−８２０型を用い、光路長０．１ｃｍの石英セルを用いて、積算回数４回、走査速度１００ｎｍ／ｍｉｎで行った。
具体的には、測定対象となる各高分子をそれぞれ５ｍＭ、ｐＨ６．４、Ｎａ₂ＨＰＯ₄／クエン酸緩衝溶液に溶解させ、ストック溶液とした。ストック溶液を緩衝溶液で希釈することでｐＨ６．４のサンプル溶液の調製を行った。これらのサンプル溶液について、島津製作所製ＵＶ−２１００分光光度計を用いて光路長１ｍｍの石英セルでＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定を行い、１９８ｎｍ付近のペプチド結合に基づく吸収を測定することにより濃度を決定した（高分子濃度＝４０μＭ）。温度を変えてＣＤスペクトルの測定を行う際には、日本分光社製ＰＴＣ−４２３Ｌ型ペルチェ式恒温装置とＬＡＵＤＡ社製Ｅ２００を用い、温度勾配１℃／ｍｉｎで昇温するとともに、その温度に達してから５０秒後に測定を行うようにした。

【0076】

上述のようにして測定した実施例１の多重刺激応答型高分子のＣＤスペクトルを図６に示す。
また、実施例１〜５の多重刺激応答型高分子について、波長１９８ｎｍでの温度ごとの測定値をプロットしたグラフを図７に示す。

【0077】

図６，７に示す結果から、本発明の多重刺激応答型高分子においては、外部温度に依存して、可逆的にランダムコイルとβ−ターンの２つの立体配座をとることが分かり、これが第１の側鎖に基づくｐＨ応答性と相俟って特徴的な多重刺激応答性を発現していることが分かる。上記実施例１〜５における前記立体配座の可逆的変化は、第２の側鎖におけるペプチド構造のバリン残基とＸの各アミノ酸側鎖間の相互作用によるものであるから、これらバリン残基とＸの種類を様々に変更することにより、多重刺激応答性を高い自由度で制御できることが実証された。

【産業上の利用可能性】

【0078】

本発明にかかる多重刺激応答型高分子及びその製造方法は、特にＤＤＳや細胞足場材などの生体材料に好適に利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】