知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5999518
(24)【登録日】2016年9月9日
(45)【発行日】2016年9月28日
(54)【発明の名称】懸滴プレート
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20160915BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20160915BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20160915BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 Z
C12Q1/02
C12N5/0735
【請求項の数】15
【全頁数】17
(21)【出願番号】特願2013-555882(P2013-555882)
(86)(22)【出願日】2012年3月2日
(65)【公表番号】特表2014-506799(P2014-506799A)
(43)【公表日】2014年3月20日
(86)【国際出願番号】EP2012053588
(87)【国際公開番号】WO2012117083
(87)【国際公開日】20120907
【審査請求日】2015年2月18日
(31)【優先権主張番号】11156741.8
(32)【優先日】2011年3月3日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】512115852
【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロッシュ アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】110001346
【氏名又は名称】特許業務法人 松原・村木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ファッティンガー クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】イエザ パトリック
(72)【発明者】
【氏名】キスリング トム
(72)【発明者】
【氏名】フォーゲリン ディエター
(72)【発明者】
【氏名】ツムシュタイン トマス
(72)【発明者】
【氏名】マクギニス クラウディア
【審査官】
伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１０／０３１１９４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００３／０７８７００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００１−５０２０５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００４−２５４６２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００９−０５０１９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００８／１２３７４１（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｍ ３／００
Ｃ１２Ｑ １／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
それぞれ液体の液滴（２０,２１；４０,４１,４２；６０,６１,５２,６３,６４）を受けることが可能な所定数の液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）を含み、各液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）が、円周微小流体湿潤バリア（１０２；３０２；５０２；７０２；９０２）を含み、当該円周微小流体湿潤バリアは、各凹部（１００；５００）を囲繞するように配置されるとともに、微小流体湿潤バリアを超えて液滴が広がるのを防ぐように構成された懸滴プレート（１；３；５；６；９）であって、
各液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）は、閉塞した底部（１０１；５０１）と、少なくとも１つの追加の円周微小流体湿潤バリア（１０４；３０４,３０６；５０４,５０６,５０８,５１０；６０４,６０６；９０４,９０６）を含み、各追加の円周微小流体湿潤バリア（１０４；３０４,３０６；５０４,５０６,５０８,５１０；６０４,６０６；９０４,９０６）は、湿潤性領域（１０３；３０３，３０５；５０３，５０５，５０７，５０９）が２つの隣接して設けられた微小流体湿潤バリアの間に配置された状態で、前記円周微小流体湿潤バリア（１０２；３０２,３０４；５０２,５０４,５０６,５０８；６０４,６０６；９０４,９０６）を囲繞するように配置されていることを特徴とする懸滴プレート。
各液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）は、閉塞した底部（１０１；５０１）と、少なくとも１つの追加の円周微小流体湿潤バリア（１０４；３０４,３０６；５０４,５０６,５０８,５１０；６０４,６０６；９０４,９０６）を含み、各追加の円周微小流体湿潤バリア（１０４；３０４,３０６；５０４,５０６,５０８,５１０；６０４,６０６；９０４,９０６）は、湿潤性領域（１０３；３０３，３０５；５０３，５０５，５０７，５０９）が２つの隣接して設けられた微小流体湿潤バリアの間に配置された状態で、前記円周微小流体湿潤バリア（１０２；３０２,３０４；５０２,５０４,５０６,５０８；６０４,６０６；９０４,９０６）を囲繞するように配置されていることを特徴とする懸滴プレート。
【請求項2】
前記各液滴区画がウェル（１０；３０；６０；９０）であることを特徴とする請求項１に記載の懸滴プレート。
【請求項3】
前記円周微小流体湿潤バリアは、円周縁部（１０２）を含み、
前記少なくとも１つの追加の円周微小流体湿潤バリアは、少なくとも１つの追加の円周縁部（１０４）を含み、各追加の円周縁部（１０４）は、前記湿潤性領域（１０３）が２つの隣接して設けられた円周縁部（１０２，１０４）の間に配置された状態で、前記円周縁部（１０２）を囲繞するように配置されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の懸滴プレート。
前記少なくとも１つの追加の円周微小流体湿潤バリアは、少なくとも１つの追加の円周縁部（１０４）を含み、各追加の円周縁部（１０４）は、前記湿潤性領域（１０３）が２つの隣接して設けられた円周縁部（１０２，１０４）の間に配置された状態で、前記円周縁部（１０２）を囲繞するように配置されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の懸滴プレート。
【請求項4】
２つの隣接する円周縁部（１０２，１０４）が、段状に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の懸滴プレート。
【請求項5】
前記円周微小流体湿潤バリアは、円周リム（３０２；５０２；６０２；９０２）を含み、
前記少なくとも１つの追加の微小流体湿潤バリアは、追加の円周リムを含み、各追加の円周リム（３０４，３０６；５０４，５０６，５０８，５１０；６０４，６０６；９０４；９０６）は、前記湿潤性領域（３０３，３０５；５０３，５０５，５０７，５０９）が２つの隣接して設けられた円周リムの間に配置された状態で、前記円周リム（３０２，３０４；５０２，５０４，５０６，５０８；６０２，６０４；９０２，９０４）を囲繞していることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の懸滴プレート。
前記少なくとも１つの追加の微小流体湿潤バリアは、追加の円周リムを含み、各追加の円周リム（３０４，３０６；５０４，５０６，５０８，５１０；６０４，６０６；９０４；９０６）は、前記湿潤性領域（３０３，３０５；５０３，５０５，５０７，５０９）が２つの隣接して設けられた円周リムの間に配置された状態で、前記円周リム（３０２，３０４；５０２，５０４，５０６，５０８；６０２，６０４；９０２，９０４）を囲繞していることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の懸滴プレート。
【請求項6】
前記隣接して設けられた円周リム（３０２，３０４，３０６；６０２，６０４，６０６；９０２，９０４，９０６）が、段状に配置されていることを特徴とする請求項５に記載の懸滴プレート。
【請求項7】
前記懸滴プレートが、所定数の穴（６１０；９１０）を有する個別に製造されたプレート（６１；９１）と、液滴区画を形成する対応する所定数の個別に製造されたウェル（６０；９０）とからなり、個別に製造された各ウェル（６０；９０）が、前記個別に製造されたプレート（６１；９１）のそれぞれの穴（６１０；９１０）に圧入されることを特徴とする請求項２から請求項６のいずれか一項に記載の懸滴プレート。
【請求項8】
前記個別に製造されたウェル（６０；９０）が、前記プレート（６；９）における前記プレート（６；９）の外面（６１１，９１１）を形成する側から前記穴（６１０；９１０）に圧入されることを特徴とする請求項７に記載の懸滴プレート。
【請求項9】
２４個のウェル、９６個のウェル、または３８４個のウェルを含むことを特徴とする請求項７または請求項８に記載の懸滴プレート。
【請求項10】
前記円周リム（５０３，５０４，５０６，５０８，５１０）が、平面上に配置されていることを特徴とする請求項５に記載の懸滴プレート。
【請求項11】
所定数の液滴区画（１０；３０；５０；６０，９０）またはウェルを有する請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１；３；５；６；９）と、前記懸滴プレートの前記所定数の液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）またはウェルに対応する数のウェル（７０）を有する受けプレート（７）とを含み、
前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）と前記受けプレート（７）は、組み付けた状態で、前記受けプレートのウェル（７０）が、前記懸滴プレートの前記液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）またはウェルに位置合わせして配置されるように組み付けられることを特徴とする懸滴プレート組立体。
前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）と前記受けプレート（７）は、組み付けた状態で、前記受けプレートのウェル（７０）が、前記懸滴プレートの前記液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）またはウェルに位置合わせして配置されるように組み付けられることを特徴とする懸滴プレート組立体。
【請求項12】
細胞に対する毒性を調べるために物質を検査する方法であって、 ａ）それぞれが所定量の被検物質および液体培地と、複数の細胞（８２）とを含んでいる所定数の液滴（２０；４０；６４）を、懸滴プレート（１；３；５；６；９）の対応する数の液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）に導入するステップと、 ｂ）前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）を反転し、前記液滴が前記各液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）から懸垂して、前記細胞（８２）が各液滴（２０；４０；６４）内で３次元細胞凝集体（８３）を形成するように、前記懸滴プレートが前記液滴（２０；４０；６４）を保持した状態で、前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）を所定時間培養するステップと、 ｃ）前記各液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）内で、前記液滴（２０；４０；６４）に追加の液体培地を供給して、３次元細胞凝集体（８３）のさらなる成長を促進させるステップと、 ｄ）前記被検物質が前記３次元細胞凝集体（８３）に対して有毒であるかどうか評価するため、前記３次元細胞凝集体（８３）を分析するステップと、を含み、 請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１；３；５；６；９）が使用され、 前記ステップｃ）は、前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）を再反転し、追加の液体培地の液滴を前記３次元細胞凝集体を含む各液滴に付加して、前記各液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）内にそれぞれ大きな液滴（２１；４１,４２；６５,６６,６７,６８）を形成し、その後、前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）を再度反転して、前記液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）から懸垂する前記各大きな液滴（２１；４１,４２；６５,６６,６７,６８）内で、前記３次元細胞凝集体（８３）を成長させることで行われることを特徴とする方法。
【請求項13】
ｅ）前記成長した３次元細胞凝集体（８３）を、前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）の前記液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）から受けプレート（７）の対応する数のウェル（７０）へと移動させるステップと、
ｆ）前記３次元細胞凝集体（８３）を含む前記ウェル（７０）を備えた前記受けプレート（７）を、さらに所定時間培養するステップと、
ｇ）培養後、前記被検物質が前記３次元細胞凝集体に対して有毒であるかどうか評価するため、前記３次元細胞凝集体を分析するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
ｆ）前記３次元細胞凝集体（８３）を含む前記ウェル（７０）を備えた前記受けプレート（７）を、さらに所定時間培養するステップと、
ｇ）培養後、前記被検物質が前記３次元細胞凝集体に対して有毒であるかどうか評価するため、前記３次元細胞凝集体を分析するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ステップｅ）は、前記受けプレート（７）の前記各ウェル（７０）が、前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）の前記各液滴区画（１０；３０；５０；６０；９０）と対向して配置されるように、前記懸滴プレート（１；３；５；６；９）と前記受けプレート（７）を組み付けて、その後、当該組み付けたプレートを遠心分離にかけることで行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞（８２）が胚性幹細胞であり、前記３次元細胞凝集体（８２）が胚様体であり、
前記被検物質が前記３次元細胞凝集体に対して有毒であるかどうか評価するため、前記３次元細胞凝集体（８３）を分析するステップは、前記胚様体が心筋細胞を含むかどうか分析することにより行われることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
前記被検物質が前記３次元細胞凝集体に対して有毒であるかどうか評価するため、前記３次元細胞凝集体（８３）を分析するステップは、前記胚様体が心筋細胞を含むかどうか分析することにより行われることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、独立クレームに記載された懸滴プレートに関するものである。
【背景技術】
【0002】
３次元構造で培養される細胞は、従来の２次元（単層）培養での細胞に比べて、例えば、創薬または毒性分析のような多数の適用や分析において生理学的により重要性が高いことが一般的に認められている。このような３次元細胞凝集体を形成するため、懸滴プレートが提案されている。懸濁細胞を有する細胞培地の液滴は、このようなプレートの培養区画またはウェル（well）内に載置された後、プレートが反転される。細胞が表面に付着できる利用可能な基質が存在しないので、細胞は懸滴の頂点に蓄積し、３次元細胞凝集体を形成する。胚性幹細胞（ＥＳ細胞； embryonic stem cells）を使用する場合、これらの幹細胞は液滴の頂点に沈下し、そこで幹細胞どうしが集まって、胚様体と呼ばれる３次元細胞凝集体を形成する。
【0003】
プレートの反転が不要な懸滴プレートが、国際公開パンフレットＷＯ２０１０／０３１１９４に示されている。この参照文献に示されているプレートは、プレート本体と、第１および第２の平行な面と、本体全体を第１の（上）面から第２の（下）面に垂直に貫通する複数の導管とを含む。導管は、第１の（上）面に近接する位置に設けられた漏斗形状の入口区画と、第２の（下）面に近接する位置に設けられた逆漏斗形状の培養区画と、入口区画と培養区画との間に配置された毛細管部分とを含む。本体の第２の（下）面から突出して、各培養区画を囲繞する個別のリム形状を有するレリーフ構造が設けられている。これらのリムにより、液滴がリムを超えて広がることが防止される。
【0004】
細胞を含む液体は、入口区画と毛細管部分を介して導入される。一例として、幹細胞を含む液体培地が、このような方法で培養区画に導入され、液滴が懸垂したプレートを所定時間培養することで、細胞が凝集して３次元胚様体が形成される。しばらくした後に新しい液体培地を供給する必要がある場合には、入口区画と毛細管部分を介して「古い」液体培地を（例えば、ピペットにより）吸引して、その後、上述した方法で「新しい」液体培地を供給する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ＷＯ２０１０／０３１１９４に記載されたプレートは、細胞を培養して３次元細胞凝集体を形成するには概ね適しているが、まだ改良の余地がある。例えば、入口区画と毛細管部分を介して古い液体培地を吸引するため、吸引装置（例えば、ピペット）が必要であり、吸引装置は、最適な吸引が行われるように、入口区画の壁に対してしっかりと嵌合するように構成されていなければならない。次に新しい液体培地を供給する場合にも、同様のことが言える。しかしながら、さらに重要な事として、各培養区画内で懸滴の安定性には限りがあることである。別の不利益としては、制御できない割合で、開口した入口区画を介して液体が蒸発することがあることである。
【0006】
したがって、本発明の目的は、懸滴の安定性と液体の蒸発に関する上述した問題を解決する懸滴プレートを提案することである。また、液体培地の追加供給または交換を簡単に行うことも必要である。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上述した目的を達成するため、本発明は、懸滴プレートに関する独立クレームの特徴によって特定されるような懸滴プレートを提案する。さらに、本発明による懸滴プレートの各実施例は、従属クレームの対象とする。
【0008】
特に、本発明は、それぞれ液体の液滴を受けることが可能な所定数の液滴区画を含む懸滴プレートを提案する。各液滴区画は、円周微小流体湿潤バリアを含み、当該円周微小流体湿潤バリアは、各凹部を囲繞するように配置されるとともに、微小流体湿潤バリアを超えて液滴が広がるのを防ぐ。さらに、各区画は、閉塞した底部と、少なくとも１つの追加の円周微小流体湿潤バリアを含み、各追加の円周微小流体湿潤バリアは、湿潤性領域が２つの隣接して設けられた微小流体湿潤バリアの間に配置された状態で、前記円周微小流体湿潤バリアを囲繞するように配置されている。
【0009】
特に、ＷＯ２０１０／０３１１９４に示された懸滴プレートと比較すると、培養区画の閉塞した底部構造と円周湿潤バリアが、各培養区画から懸垂する液滴の安定性を改善する役割を果たしており、これは、入口区画で空気接触がある構成を有するＷＯ２０１０／０３１１９４の懸滴プレートとは対照的に、空気接触が存在しないことによるものと考えられる。また、空気接触が存在しないことにより、液体の蒸発が大幅に減少される。
【0010】
さらに、培養区画内にすでに含まれている液滴に追加の液体培地の液滴を供給して大きな液滴を形成するため、懸滴プレートを再反転する必要があるが、この再反転を簡単で便利な方法で行うことができる。これは、第１には液滴の優れた安定性に起因するものであり、第２には、液体培地の液滴を簡単に追加供給できる、追加の円周微小流体湿潤バリアと、当該追加の円周微小流体湿潤バリアと前記微小流体湿潤バリアとの間の湿潤性領域に起因するものである。このように形成された大きな液滴は、前記追加の微小流体バリアにより広がることが防止されるので、懸滴構成へとプレートが再度反転された後、大きな液滴の優れた安定性が維持される。追加の微小流体湿潤バリアの数は、一般的には限定されないが、実施例では、単に１つまたは２つの追加の微小流体湿潤バリアが存在してもよい。
【0011】
本発明による懸滴プレートの一実施例では、各液滴区画がウェルであることを特徴とする一方、別の実施例では、液滴区画を（それぞれ微小流体湿潤バリアで囲繞された）平面によって形成してもよい。
【0012】
本発明による懸滴プレートの他の実施例では、円周微小流体湿潤バリアが円周縁部を含み、少なくとも１つの追加の円周微小流体湿潤バリアが、少なくとも１つの追加の円周縁部を含む。各追加の円周縁部は、湿潤性領域が２つの隣接して設けられた円周縁部の間に配置された状態で、前記円周縁部を囲繞するように配置されている。この実施例の他の変形例では、２つの隣接する円周縁部が段状に配置されている。
【0013】
他の実施例では、本発明による懸滴プレートが、所定数の穴を有する個別に製造されたプレートと、液滴区画を形成する対応する所定数の個別に製造されたウェルとからなり、個別に製造された各ウェルが、個別に製造されたプレートのそれぞれの穴に圧入される。これにより、ポリスチレンまたは他の好適な材料から形成することができるプレートとウェルの両方を簡単に製造することができる。個別に製造されたプレートとウェルは、ウェルを穴に圧入することで簡単に組み付けることができる。一般的には、ウェルをプレートの内面に超音波溶着するという選択肢もある（この場合、プレートに穴を設けなくてもよいかもしれない）が、超音波溶着によりウェルに含まれる内容物の顕微分析がより困難になることもあるので、ウェルを穴に圧入することが望ましい。
【0014】
本発明による懸滴プレートの他の実施例では、個別に製造されたウェルが、プレートにおけるプレートの外面を形成する側から穴に圧入される。これにより、プレートとウェルの組み付けが簡単になり、組み付けを自動的に行ってもよい。好適な実施例では、本発明による懸滴プレートは、２４個のウェル、９６個のウェル、または３８４個のウェルを含んでもよい。
【0015】
本発明による懸滴プレートの別の実施例では、円周微小流体湿潤バリアが円周リムを含み、少なくとも１つの追加の微小流体湿潤バリアが追加の円周リムを含み、各追加の円周リムは、湿潤性領域が２つの隣接して設けられた円周リムの間に配置された状態で、前記円周リムを囲繞している。この実施例の一変形例では、隣接して配置された円周リムが段状に配置されていることを特徴とする一方、この実施例の別の変形例では、円周リムが平面上に配置されている。
【0016】
本発明の他の態様は、上述した本発明による懸滴プレートと、受けプレートとを含む懸滴プレート組立体に関する。懸滴プレートは、所定数の液滴区画またはウェルを有し、受けプレートは、懸滴プレートの所定数の液滴区画またはウェルに対応する数のウェルを有する。懸滴プレートと受けプレートは、組み付けた状態で、受けプレートのウェルが、懸滴プレートの液滴区画またはウェルに位置合わせして配置されるように組み付けられる。このような組立体により、組立体を遠心分離することで、３次元細胞凝集体を懸滴プレートから受けプレートのウェルまで簡単に移動することができる。
【0017】
本発明の別の態様は、細胞に対する毒性を調べるために物質を検査する方法に関する。この方法は、ａ）それぞれが所定量の被検物質および液体培地と、複数の細胞とを含んでいる所定数の液滴を、懸滴プレートの対応する数の培養区画に導入するステップと、
ｂ）懸滴プレートを反転し、液滴が各液滴区画から懸垂して、細胞が各液滴内で３次元細胞凝集体を形成するように、懸滴プレートが液滴を保持した状態で、懸滴プレートを所定時間培養するステップと、
ｃ）培養区画内で、液滴に追加の液体培地を供給して、３次元細胞凝集体のさらなる成長を促進させるステップと、
ｄ）被検物質が３次元細胞凝集体に対して有毒であるかどうか評価するため、３次元細胞凝集体を分析するステップと、を含む。
本発明によるこの方法では、上述した本発明による懸滴プレートが使用され、ステップｃ）は、懸滴プレートを再反転し、追加の液体培地の液滴を３次元細胞凝集体を含む各液滴に付加して、各培養区画内にそれぞれ大きな液滴を形成することで行われる。その後、懸滴プレートを再度反転して、培養区画から懸垂する各大きな液滴内で、３次元細胞凝集体を成長させる。この方法による利点は、本発明の懸滴プレートの利点を説明した際に既に言及している。さらに、追加の液体培地の供給等、少なくともいくつかの工程ステップを自動化することができる。
【0018】
本発明による方法の一実施例は、さらに、ｅ）成長した３次元細胞凝集体を、懸滴プレートの培養区画から受けプレートの対応する数のウェルへと移動させるステップと、
ｆ）３次元細胞凝集体を含むウェルを備えた受けプレートを、さらに所定時間培養するステップと、
ｇ）培養後、被検物質が３次元細胞凝集体に対して有毒であるかどうか評価するため、３次元細胞凝集体を分析するステップと、を含む。
本発明による方法のこの実施例の好適な変形例では、ステップｅ）は、受けプレートの各ウェルが、懸滴プレートの各培養区画と対向して配置されるように、懸滴プレートと受けプレートを組み付けて、その後、当該組み付けたプレートを遠心分離にかけることで行われる。これにより、好適且つ自動的に、３次元細胞凝集体を懸滴プレートから受けプレートの各ウェルまで移すことができる。
【0019】
本発明による方法の実施例では、細胞が胚性幹細胞であり、３次元細胞凝集体が胚様体である。被検物質が３次元細胞凝集体に対して有毒であるかどうか評価するため、３次元細胞凝集体を分析するステップは、胚様体が心筋細胞を含むかどうか分析することにより行われる。この実施例は、心筋細胞が鼓動を打つので、３次元細胞凝集体の中に心筋細胞が存在することを容易に検出できて便利である。
【0020】
本発明の他の有利な特徴は、図面を参照して示す各実施例の以下の詳細な説明により、明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
図１から図６は、本発明の懸滴プレート１の第１実施例またはその詳細を様々な図で示す（上記参照）。プレート１は、ウェル１０の形状を有する所定数の液滴区画を含む。図示した実施例は２４ウェルプレートであるが、他の如何なる個数のウェルも考えられる。好適なプレートは、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート等の標準マイクロウェルプレートに従って配列された標準化された個数のウェルを有する。
【0023】
一般的に、ウェルの異なる実施例が考えられるが、懸滴プレート１の実施例のウェル１０は、図６の拡大図に示すように実施される。ウェル１０は、閉塞した底部１０１を有する第１凹部１００を囲繞する尖った円周縁部１０２の形状の第１円周湿潤バリアを含む。第１円周縁部１０２は、第２の尖った円周縁部１０４で囲繞され、湿潤性領域１０３が第１円周縁部１０２と第２円周縁部との間に配置されている。図６に示すように、これらの円周縁部は段状に配置されているが、このような配置は必須ではない。環状の切欠き１０５が、第２円周縁部１０４を囲繞するように設けられている。
【0024】
ウェル１０がこのような幾何学形状を有する理由は、ウェル１０に液滴を供給して、ウェル１０から液滴を懸垂させる工程を表す図３、図４および図５を参照することで、より明確になる。図３では、懸滴プレート１が再反転位置、すなわちウェル１０が上方を向いた状態で示されている。最も外側の左側位置に配置されたウェル１０には、小さな液滴２０を確認することができる。左側から２番目のウェルでは、大きな液滴２１を確認することができ、この液滴は、大きな液滴２１を形成するために液滴２０に別の液滴を供給することで得られたものである。ウェル１０に液滴を供給する場合、例えば、ピペットを用いて行うことができる。特にウェル１０内への液滴の載置は、ピペッティングロボットを用いて行うことができるが、手作業で行うこともできる。ウェルから液体を吸引する場合（例えば、「古い」液体培地を「新しい」液体培地と交換することを意図する場合）、液滴に容易にアクセスできるので、簡単に行うことができる。
【0025】
図４は、小さな液滴２０と大きな液滴２１が各ウェル１０から懸垂する位置にある懸滴プレート１を示し、この位置は、図４の細部Ｖを示す図５で最も良く見ることができる。小さな液滴２０が最も外側の左側のウェル１０から懸垂し、大きな液滴２１が左側から２番目のウェル１０から懸垂している。
【0026】
図５および図６から、液滴２０および大きな液滴２１が縁部を超えて広がるのを防止する微小流体バリアとしての第１および第２円周縁部１０２,１０４の機能がより明確になる。したがって、第１および第２円周縁部１０２，１０４は、各ウェル１０から懸垂する液滴の安定化に寄与する。第２円周縁部１０４に関しては、この効果が環状の切欠き１０５によって高められている。第１および第２円周縁部１０２，１０４の間に配置された湿潤性領域１０３（図６参照）により、液滴２０に追加の液滴を加えて大きな液滴２１（図４および図５参照）を形成することが簡単に行える。ウェル１０の閉塞した底部１００は、底部を貫通する孔または溝を介して液体が蒸発することを防ぎ、「背面」空気が液滴を押圧することを防止したことで、ウェルから懸垂する液滴を安定させる役割も果たす。
【0027】
本発明の懸滴プレートの第２実施例を、それぞれ懸滴プレート３の単一のウェル３０のみを示した図７から図９に示す。この実施例は、各微小流体バリアを超えて液滴が広がるのを防止する微小流体バリアの段状構成を含んでいる点において、すでに詳述した第１実施例と何らかの関係がある。しかしながら、第２実施例は、尖った縁部の代わりに、ウェル３０が、凹部３０１を囲繞し、当該凹部を超えてウェル３０の開放端部側に突出する第１円周リム３０２によって囲繞された閉塞底部３００を有する凹部３０１を含む点において第１実施例と異なる。図７は、ウェル３０から懸垂する小さな液滴４０を示す。液滴４０は、微小流体バリアを形成する第１円周リム３０２によって、凹部３０１内に保持される。
【0028】
図８は、液滴４０に別の液滴を加えて大きな液滴４１を形成した点が図７と異なっている。大きな液滴４１は、第１円周リム３０２を囲繞する第２円周リム３０４によって保持され、第１円周リム３０２と第２円周リム３０４との間には湿潤性領域３０３が配置されている。第２円周リム３０４もまた、リム３０４を超えて大きな液滴４１が広がるのを防止する微小流体バリアとして作用する。
【0029】
図９は、大きな液滴４１にさらに別の液滴を加えて、さらに大きな液滴４２を形成した点が図８と異なっている。液滴４２は、第２円周リム３０４を囲繞する第３円周リム３０６によって保持され、第２円周リム３０４と第３円周リム３０６との間には別の湿潤性領域３０５が配置されている。第３円周リム３０６もまた、リム３０６を超えてさらに大きな液滴４２が広がるのを防止する微小流体バリアとして作用する。
【0030】
図１０乃至図１４は、本発明による懸滴プレート５の第３実施例の単一の液滴区画５０を示す。懸滴プレート５のこの実施例は、その区画５０が段状構成の微小流体バリアを含まずに、円周リム形状の微小流体バリアが、プレート５の平らな下面に配置されている点で第１、第２実施例と異なる。区画５０もまた、閉塞した底部５００を含む一方、凹部５０１は、凹部５０１を囲繞してプレート５の下面から突出する第１円周リム５０２によって境界される。図１０は、区画５０から懸垂する小さな液滴６４を示す。液滴６４は、微小流体バリアを形成する第１円周リム５０２によって、凹部５０１内に保持される。
【0031】
図１１は、別の液滴を液滴６４に加えて大きな液滴６５を形成したかどうか（また、最初の工程として液滴区画５０に大きな液滴４１を導入することができるかどうか）の点において図１０と異なっている。大きな液滴６５は、第１円周リム３０２を囲繞する第２円周リム５０４によって保持され、第１円周リム５０２と第２円周リム５０４との間には湿潤性領域５０３が配置されている。第２円周リム５０４もまた、リム５０４を超えて大きな液滴６５が広がるのを防止する微小流体バリアとして作用する。
【0032】
図１２は、第２円周リム５０４を囲繞する第３円周リム５０６によって保持されたさらに大きな液滴６６を示し、さらに別の湿潤性領域５０５が第２円周リム６０４と第３円周リム５０６との間に配置されている。第３円周リム５０６もまた、リム５０６を超えて液滴６６が広がるのを防止する微小流体バリアとして作用する。
【0033】
図１３は、第３円周リム５０６を囲繞する第４円周リム５０８によって保持されたさらに別の大きな液滴６７を示し、さらに他の湿潤性領域５０７が第３円周リム５０６と第４円周リム５０８との間に配置されている。第４円周リム５０８もまた、リム５０８を超えてさらに大きな液滴６７が広がるのを防止する微小流体バリアとして作用する。
【0034】
最後に、図１４は、第４円周リム５０８を囲繞する第５円周リム５１０によって保持されたさらに大きな液滴６８を示し、別の湿潤性領域５０９が第４円周リム５０８と第５円周リム５１０との間に配置されている。上述したものと同様に、第５円周リム５１０は、リム５１０を超えてさらに大きな液滴６８が広がるのを防止する微小流体バリアとして作用する。
【0035】
図１５では、胚性幹細胞分析の具体例を示し、本発明の懸滴プレートの上述した実施例のいずれも使用することができる本発明の方法の実施例を示している。以下の分析の説明では、本発明の懸滴プレート１の第１実施例を使用するものとする。分析のこの実施例では、胚様体に対する物質の毒性が検査される。このため、所定数の液滴が、対応する数の液滴区画またはウェル内に導入される。各液滴は、所定量の被験物質と、液体培地と、複数の幹細胞８２とを含む。懸滴プレート１の第１実施例の場合、プレート１が再反転位置（図４参照）にある間、対応するウェル１０内に２４滴の液滴２０を導入してもよい。ウェル１０に液滴２０を導入した後、プレート１は反転され、懸滴プレート１のウェル１０と対向して配された対応する数のウェル７０を有する別のプレート７と組み付けられて、閉塞した組立体を形成する。ウェル７０も培地を含んでいてもよい。このように形成された組立体は、既に詳述したように、液滴２０がウェル１０から懸垂するものであってもよい。このように形成された組立体（図１５の左上参照）は、所定時間、例えば３日間培養される。この培養期間の間、各液滴に含まれる幹細胞８２は沈下して、各液滴２０内の頂点、すなわち液滴２０の最下点（図１５の右上参照）で、３次元胚様体８３（より一般的には、３次元細胞凝集体）を形成する。
【0036】
第１培養期間の後、液滴２０に追加の液体培地を供給して、胚様体８３のさらなる成長を促進させることが必要になるかもしれない。このため、組立体を再度開いて、プレート１を再反転させる。この再反転位置で、追加の液体培地を各ウェル１０内の各液滴２０に供給して、大きな液滴２１を形成する。大きな液滴２１を形成するために追加の液体培地が供給されると、プレート１は再度反転され、別のプレート７と再度組み付けられる（別のプレート７のウェル７０も新しい液体培地を含んでいてもよい）。このように形成された組立体は、さらに所定時間、例えば２日間培養され、胚様体をさらに成長させる。
【0037】
さらなる培養期間の後、当技術部分野で周知の遠心分離機を用いて遠心分離することで、胚様体８３をプレート７（受けプレート）のウェルへ移動させてもよい。液体培地を含むプレート７のウェル７０内に胚様体８３を遠心分離した後、組立体を別の所定時間、例えば５日から７日間培養してもよい。胚様体８３は、プレート７の各ウェル７０の平坦な底部に沈下する。
【0038】
この培養期間の後、組立体を再度開き、被験物質が細胞に対して有毒であるかどうかについて、細胞凝集体を検査することができる。様々な種類の分析が考えられるが、一つの種類の分析として、顕微鏡を用いて細胞凝集体を分析することが挙げられる。細胞凝集体はプレート７のウェルの平坦な底部に溜まるので、顕微分析が可能である。例えば、細胞凝集体が心筋細胞を含むかどうか検査することができる。なぜなら心筋細胞のような細胞は収縮および膨張する（鼓動を打つ）ので、この種の細胞は顕微鏡下で簡単に特定できるからである。
【0039】
上述したように遠心分離によって胚様体または３次元細胞凝集体を別のプレート７のウェル７０に移動させることは、任意である。代わりに、組立体を再度開き、遠心分離時に胚様体または３次元細胞凝集体が液滴の頂点からウェル１０の底部１０１（図６参照）へと移動するように、プレート１を遠心分離機に取り付けることができる。その後、胚様体がウェル１０の底部１０１に配置されて、顕微分析用の安定したバックグラウンドを形成するので、顕微鏡を用いて胚様体をプレートのウェル１０内で分析することができる。
【0040】
図１６乃至図２４は、本発明の懸滴プレート６（図２１乃至図２３）の他の実施例を示す。この実施例は、個別に製造されたウェル６０（図１６および図１７参照）を含み、これらのウェル６０は、個別に製造されたプレート６１（図１８乃至図２０参照）の穴６１０に圧入することができる。図１７に示す個別に製造されたウェル６０の断面図から分かるように、ウェル６０は、第１円周リム６０２と、第２円周リム６０４と、第３円周リム６０６とを含む。ウェルの構造と機能、第１、第２および第３円周リムの構造と機能については、図７、図８および図９を参照して既に詳細を説明しているので、上述した説明のこれらの部分を参照することとする。図示した実施例では、ウェル６０は、プレート６１におけるプレート６１の外面６１１を形成する側から、プレート６１の穴６１０に圧入される。すべてのウェル６０が穴６１０に圧入されると、ウェル６０はプレート６１に固定して取り付けられ、懸滴プレート６が完成する（図２１乃至図２４）。
【0041】
代わりに、個別に製造されたウェル６０を（例えば、超音波溶着または接着により）プレート６１の内面６１２に取り付けることも考えられる。この場合、プレート６１は穴を含まないものでもよい。しかしながら、ウェル６０をプレート６１の内面６１２に超音波溶着または接着した箇所が見えてしまい、ウェルの中身を顕微分析することがより困難になる虞がある。したがって、ウェル６０をプレート６１の穴６１０に圧入することが望ましい。
【0042】
図２５および図２６は、懸滴プレート６のウェル６０の数と対応する数のウェル８０を含む他のプレート８の実施例を示す。他のプレート８のウェル８０も、懸滴プレート６のウェル６０の配置と対応するように配置されている。
【0043】
図２７および図２８に示すように、懸滴プレート６は、懸滴プレート６の各ウェル６０が他のプレート８の対応するウェル８０の上に配置されるように、他のプレート８の上に積層して取り付けることができる。このように組み立てる一つの目的は、図１５に関連して既に詳細を説明しているので、上述した説明のこれらの部分を参照することとする。
【0044】
図１６乃至図２８を参照すると、２４ウェルプレートまたは２４ウェルプレートの組立体のみが記載されているが、以下で明らかになるように、９６ウェルプレートに同様の構成を適用することも可能である。
【0045】
図２９乃至図３８は、９６ウェル懸滴プレートとして構成された、本発明の懸滴プレート９（図３５乃至図３７）のさらに別の実施例を示す。２４ウェルの実施例と同様に、９６ウェルの実施例は、個別に製造されたウェル９０（図２９乃至図３１参照）を含み、これらのウェル９０は、個別に製造されたプレート９１（図３２乃至図３４参照）の穴９１０に圧入することができる。図３０および図３１に示す個別に製造されたウェル９０の断面図から分かるように、ウェル９０は、第１円周リム９０２と、第２円周リム９０４と、第３円周リム９０６とを含む。ウェルの構造と機能、第１、第２および第３円周リムの構造と機能については、図７、図８および図９を参照して既に詳細を説明しているので、上述した説明のこれらの部分を参照することとする。図示した実施例では、ウェル９０は、プレート９１におけるプレート９１の外面９１１を形成する側から、プレート９１の穴９１０に圧入される。すべてのウェル９０が穴９１０に圧入されると、ウェル９０はプレート９１に固定して取り付けられ、懸滴プレート９の形成が完成する（図３５乃至図３８）。
【0046】
図３９乃至図４１は、懸滴プレート９のウェル９０の数と対応する数のウェル９２０を含む他のプレート９２の実施例を示す。他のプレート９２のウェル９２０も、懸滴プレート９のウェル９０の配置と対応するように配置されている。
【0047】
図４１に示すように、懸滴プレート９は、懸滴プレート９の各ウェル９０が他のプレート９２の対応するウェル９２０の上に配置されるように、他のプレート９２の上に積層して取り付けることができる。
【0048】
上述した各実施例は、本発明の方法および懸滴プレートの様々な用途の単なる一例に過ぎないことは言うまでもなく、これらの実施例により本発明を限定する意図はない。むしろ権利保護の範囲は、添付した特許請求の範囲によって決められることを意図している。