特許 6001344 糖化残査成分結合能を有するペプチド及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6001344

(24)【登録日】2016年9月9日

(45)【発行日】2016年10月5日

(54)【発明の名称】糖化残査成分結合能を有するペプチド及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20160923BHJP

   C12P 19/14 20060101ALI20160923BHJP

   B09B 3/00 20060101ALI20160923BHJP

   B01J 20/24 20060101ALI20160923BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20160923BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20160923BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/08ZNA

   C12P19/14 AZAB

   B09B3/00 304Z

   B01J20/24 C

   !C12N9/02

   !C07K19/00

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2012-137719(P2012-137719)

(22)【出願日】2012年6月19日

(65)【公開番号】特開2014-1168(P2014-1168A)

(43)【公開日】2014年1月9日

【審査請求日】2015年5月11日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003207

【氏名又は名称】トヨタ自動車株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】000003609

【氏名又は名称】株式会社豊田中央研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(72)【発明者】

【氏名】浅野 英貴

(72)【発明者】

【氏名】池内 暁紀

(72)【発明者】

【氏名】幸田 勝典

(72)【発明者】

【氏名】梅津 光央

(72)【発明者】

【氏名】熊谷 泉

(72)【発明者】

【氏名】浅野 竜太郎

(72)【発明者】

【氏名】中澤 光

【審査官】 森井 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１１７５６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 第64回日本生物工学会大会講演要旨集, Sep-2012, p.249(4Ip24)

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１〜３から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列からなる、又は配列番号１〜３から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に１〜５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなる、糖化残査成分結合能を有するペプチド。

【請求項2】

上記アミノ酸配列は配列番号３に示すアミノ酸配列である、請求項１記載のペプチド。

【請求項3】

請求項１又は２記載のペプチドを含む糖化残査成分吸着剤。

【請求項4】

上記ペプチドがスペーサーを解して複数結合されてなることを特徴とする請求項３記載の糖化残査成分吸着剤。

【請求項5】

上記ペプチドと連結した機能部を更に含む、請求項３又は４記載の糖化残査成分吸着剤。

【請求項6】

上記機能部はタンパク質からなる、請求項５記載の糖化残査成分吸着剤。

【請求項7】

上記機能部はリグニン分解酵素である、請求項５記載の糖化残査成分吸着剤。

【請求項8】

上記機能部は蛍光物質又は発光物質である、請求項５記載の糖化残査成分吸着剤。

【請求項9】

請求項１又は２記載のペプチド及び/又は請求項３乃至８いずれか一項記載の糖化残査成分吸着剤の存在下に、セルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化する工程を含む、糖化方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、セルロース系バイオマスを糖化処理した後の残査である糖化残査成分に結合する能力を有するペプチド及び当該ペプチドの利用に関する。

【背景技術】

【0002】

木材の細胞壁は、親水性の炭水化物ポリマーであるセルロースやヘミセルロースと、疎水性の芳香族ポリマーであるリグニン等を主成分として形成されている。なかでも、セルロースやヘミセルロースといった炭水化物ポリマーを糖化酵素により構成単糖まで分解すれば、バイオエタノール等のバイオ燃料の材料として利用することができる。糖化酵素による炭水化物ポリマーの分解反応において、リグニン等の糖化酵素により分解されず残査として残った成分は、糖化酵素に対して阻害的に作用することが知られている。すなわち、バイオ燃料の原料として植物バイオマスを利用する場合、糖化残査成分に起因して糖化酵素の反応効率が悪いため、糖化酵素の使用量を著しく増大させる必要がありコスト高になってしまう。

【0003】

例えば、特許文献１には、間伐材や建設廃材等の木質系バイオマスからのエタノール製造において、木質系バイオマスが保有する糖化残査成分の一つであるリグニンによりセルロース成分の加水分解すなわち糖化反応が著しく阻害され、有効な脱リグニン技術が存在しない限り、バイオマスエタノールの製造を困難にしているのが現状であると記載されている。

【0004】

また、特許文献２には、糖化酵素による分解反応に先立って脱リグニン処理を行う技術が開示されている。特許文献２における脱リグニン処理を行う工程では、１ミリメートル以下に微粉化した原料を過酸化水素水（通常３０％程度）と触媒量（過酸化水素の１／１００〜１／１０程度）のタングステン（あるいはより強力なモリブデン）酸ソーダにより８０〜９０℃前後で処理する。特許文献２では、以上の処理により、原料中のリグニンと形成した金属過酸化物中間体との優先的反応により、セルロース酸化分解を抑制したリグニン酸化解裂脱リグニン処理に成功したと記載されている。しかしながら、特許文献２に記載された方法では、脱リグニン処理といった処理工程が必要となり、全体の処理時間が長時間化するとともに当該工程に係るコストも問題となる。

【0005】

さらに、非特許文献１には、糖化酵素がリグニンに吸着することを阻害する物質（吸着阻害剤）としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を使用することが記載されている。すなわち、糖化酵素を用いたバイオマスの分解反応系に、ＢＳＡを共存させることで、糖化酵素のリグニンへの吸着を防止し、糖化率を向上したことが開示されている。しかし、ここに開示された吸着阻害剤が高価であるため、糖化効率の向上効果に伴って酵素使用量を削減できたとしても、全体としてのコストを削減することはできない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開2006-088136号公報

【特許文献2】特開2006-149343号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Rajeev Kumar, Charles E. Wyman, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 102, No. 6, April 15, 2009, p. 1544-1557

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

このように、糖化残査成分の存在下で炭水化物ポリマーを糖化する際、糖化残査成分による糖化酵素への阻害作用を安価に防止する技術が求められていた。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、糖化残査成分に結合する能力を有する新規なペプチドを提供し、当該ペプチドを利用したバイオマスの糖化方法、当該バイオマスを利用したエタノールの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、セルロースには吸着せず、糖化残査成分に吸着する能力を有する新規なペプチド群を見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。

【0010】

（１）配列番号１〜３から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、糖化残査成分結合能を有するペプチド。
（２）上記アミノ酸配列は配列番号３に示すアミノ酸配列である（１）記載のペプチド。
（３）上記アミノ酸配列を含む領域がリンカーを介して複数連結されてなる（１）記載のペプチド。

【0011】

（４）本発明に係るペプチドを含む糖化残査成分吸着剤。
（５）上記ペプチドと連結した機能部を更に含む（４）記載の糖化残査成分吸着剤。
（６）上記機能部はタンパク質からなる（５）記載の糖化残査成分吸着剤。

【0012】

（７）上記機能部はリグニン分解酵素である（５）記載の糖化残査成分吸着剤。
（８）上記機能部は蛍光物質又は発光物質である（５）記載の糖化残査成分吸着剤。
（９）本発明に係るペプチド及び/又は本発明に係る糖化残査成分吸着剤の存在下に、セルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化する工程を含む、糖化方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明に係る新規ペプチドは、糖化残査成分に吸着する能力を有する。このため、本発明に係る新規ペプチドは、糖化残査成分による糖化酵素に対する阻害作用を軽減し、糖化酵素による糖化効率を向上させることができる。したがって、本発明に係る新規ペプチドを利用することで、バイオマスの糖化処理、バイオマスを利用したエタノール製造において使用する酵素量を低減できることとなり、低コスト化を達成することができる。言い換えると、本発明に係る新規ペプチドを利用することで、バイオマスの糖化処理における糖化効率、バイオマスを利用したエタノール製造におけるエタノール収率を大幅に改善することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例で同定した３種類のペプチドを用いた糖化試験の結果を示す特性図である。

【図2A】実施例で同定した３種類のペプチドを用いた吸着試験の結果を示す特性図である。

【図2B】実施例で同定した３種類のペプチドを用いた吸着試験の結果を示す特性図である。

【図2C】実施例で同定した３種類のペプチドを用いた吸着試験の結果を示す特性図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明に係る新規ペプチド及び当該ペプチドの利用について詳細に説明する。
新規ペプチド
本発明に係る新規なペプチドは、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列を含むペプチドである。本発明に係る新規なペプチドは、糖化残査成分に対する吸着能を有しており、糖化残査成分の存在下で糖化酵素による糖化率を向上する機能を有している。ここで糖化残査成分とは、詳細を後述するセルロース系バイオマスを糖化酵素により糖化処理したときに、糖化酵素により加水分解されず残査として残った成分を意味する。

【0016】

本発明に係る新規ペプチドは、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるペプチド、すなわち全長が１２アミノ酸残基からなるペプチドでも良い。

【0017】

また、本発明に係る新規ペプチドは、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に対して、１又は複数のアミノ酸を付加したアミノ酸配列からなり、糖化残査成分への吸着能を有するペプチドでもよい。すなわち、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に対して１又は複数のアミノ酸を付加したとしても、糖化残査成分に対する吸着能、及び糖化残査成分存在下で糖化酵素による糖化率を向上する機能を保持することができる。

【0018】

ここで、複数のアミノ酸とは、特に限定されず、例えば２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜３０個、更に好ましくは２〜２０個、更に好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜７個、最も好ましくは２〜５個のアミノ酸とすることができる。なお、前述したアミノ酸の個数は、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列のN末端に付加するアミノ酸又はC末端に対して付加するアミノ酸の個数を意味している。

【0019】

さらに、本発明に係るペプチドは、配列番号１〜３のいずれかに示す複数のアミノ酸配列を、スペーサー配列を介して或いはスペーサー配列を介さず直接連結した構成であっても良い。配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列の繰り返し回数としては、特に限定されず適宜、設定することができる。配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列の繰り返し回数としては、例えば２〜５０回、好ましくは２〜３０回、より好ましくは２〜２０回、最も好ましくは２〜１０回とすることができる。配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列の繰り返し回数をこの範囲とすることによって、糖化残査成分に対する吸着能をより向上でき、糖化残査成分の存在下で糖化酵素による糖化率をより向上できることが期待できる。ここで、スペーサー配列とは、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列の間を連結するアミノ酸配列であり、その長さ及び配列には何ら限定されるものではない。スペーサー配列としては、例えば２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜３０個、更に好ましくは２〜２０個、更に好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜７個、最も好ましくは２〜５個のアミノ酸配列とすることができる。

【0020】

本発明に係るペプチドは、糖化残査成分に対して吸着する能力を有している。ペプチドが糖化残査成分に対して吸着する能力を有するか否かは、従来公知の吸着試験によって評価することができる。ここで、吸着試験とは、吸着等温線を測定し、液相吸着のラングミュア式を用いて最小二乗法により結合定数と飽和結合量を計算するといった手法を挙げることができる。だたし、吸着試験としては、上述した手法による試験に限定されず、糖化残査成分に対する供試ペプチドの吸着を定性的に評価できる試験であればどのような原理に従う試験であってもよい。なお、吸着試験としては、糖化残査成分に対する供試ペプチドの吸着を定量的に評価できる試験を採用しても良い。

【0021】

特に、本発明に係るペプチドは、糖化残査成分に対して特異的に吸着する能力を有することが好ましい。ここで、糖化残査成分に対して特異的に吸着する能力とは、少なくともセルロースへの吸着能、好ましくはセルロースへの吸着能及びヘミセルロースへの吸着能と比較して、糖化残査成分への吸着能が有意に高いことを意味する。すなわち、本発明に係るペプチドは、セルロースへの吸着能と比較して、糖化残査成分に対する吸着能が有意に高いといった特徴を有していることが好ましい。さらに、本発明に係るペプチドは、セルロースへの吸着能及びヘミセルロースへの吸着能と比較して、糖化残査成分に対する吸着能が有意に高いといった特徴を有していることが更に好ましい。糖化残査成分に対して特異的に吸着する能力とは、糖化残査成分を除く他の全ての分子に対して全く吸着しないことを意味するのではないことに留意する。

【0022】

供試ペプチドについて、糖化残査成分への吸着能、セルロースへの吸着能及びヘミセルロースへの吸着能は上述した吸着試験によってそれぞれ測定することができる。特に、糖化残査成分に対する供試ペプチドの吸着を定量的に評価できる試験により、糖化残査成分への吸着能、セルロースへの吸着能及びヘミセルロースへの吸着能を比較可能に検証することができる。これにより、供試ペプチドが糖化残査成分に対して特異的に吸着する能力を有するか否か、更には供試ペプチドにおける糖化残査成分に対する吸着能の特異性を定量的に判断することができる。

【0023】

また、本発明に係るペプチドは、糖化残査成分の存在下における糖化酵素の糖化率（糖化効率と同義）を向上させることができる。これは、本発明に係るペプチドが、糖化残査成分に優先的に吸着することで糖化酵素と糖化残査成分との非特異的な吸着を阻害することによると考えられる。ここで、糖化率は、セルロース等の炭水化物ポリマーを糖化酵素により加水分解し（糖化し）、生成された単糖を定量し、単糖の生成量として評価できる。単糖の生成量を定量する方法としては、例えば、Somogyi法、Tauber-Kleiner法、Hanes法（滴定法）、ビシンコニン酸法（BCA法）Park-Johnson法、3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）法、TZ法（Journal of Biochemical Methods, 11(1985)109-115）等の公知の方法を適宜採用すればよい。ここで、糖化残査成分の存在下とは、バイオマスを構成するリグニンやリグニン由来物質（例えばリグニン分解物）を含む糖化残査成分が糖化酵素による加水分解反応の反応系に含まれている状態を意味する。例えば、植物バイオマスを糖化酵素により糖化する工程は、植物バイオマスを構成する糖化残査成分が反応系に含まれるため、糖化残査成分の存在下で糖化する工程となる。

【0024】

糖化酵素
ここで、糖化酵素とは、バイオマスに含まれる炭水化物ポリマーを構成単糖に加水分解する酵素（酵素群）を意味する。糖化酵素としては、セルラーゼ及びヘミセルラーゼを挙げることができる。

【0025】

セルラーゼとは、セルロースのグリコシド結合を加水分解する活性を有する酵素の総称である。セルラーゼを構成する酵素としては、結晶セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオハイドロラーゼ（CBH1及びCBH2）、結晶セルロースを分解できないが非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ（EG）、β-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒するβグルコシダーゼを挙げることができる。

【0026】

なお、セルラーゼとしては、従来公知のものを適宜使用することができる。また、セルラーゼとしては、化学的に合成されたものでも良いし、微生物の生産物を精製したものでも良い。また、セルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤を使用することもできる。また、本発明に係るポリペプチドは、セルラーゼを発現する微生物、すなわちセルロース系バイオマスを加水分解する能力を有する微生物と共存することで、当該微生物の糖化活性を増強することもできる。セルラーゼの分泌生産能が高い微生物としては例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）が挙げられる。すなわち、本発明に係るポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）による糖化活性を増強することができる。そのようなセルラーゼ生成能を有する微生物としては、例えばAspergillus niger、A. foetidus、Alternaria alternata、Chaetomium thermophile、C. globosus、Fusarium solani、Irpex lacteus、Neurospora crassa、Cellulomonas fimi、C. uda、Erwinia chrysanthemi、Pseudomonas fluorescence、Streptmyces flavogriseus、Trichoderma viride及びAcremonium cellulolyticus等を挙げることができる。

【0027】

また、ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース等に加水分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称である。ヘミセルラーゼには、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシロシダーゼ、マンノシダーゼ、キシログルカナーゼ及び4-o-メチルグルコニダーゼ等の酵素が含まれる。

【0028】

糖化処理
糖化処理の対象となるセルロース系バイオマスとは、セルロース繊維の結晶構造とヘミセルロース及びリグニンとの複合体を含むバイオマスを意味する。特に、セルロース繊維の結晶構造及びヘミセルロースをセルロース系バイオマスに含まれる多糖類として扱う。セルロース系バイオマスには、間伐材、建築廃材、産業廃棄物、生活廃棄物、農産廃棄物、製材廃材及び林地残材及び古紙等の廃棄物が含まれる。また、セルロース系バイオマスとしては、段ボール、古紙、古新聞、雑誌、パルプ及びパルプスラッジ等も含む。さらに、セルロース系バイオマスとしては、おが屑や鉋屑等の製材廃材、林地残材又は古紙等を粉砕、圧縮し、成型したペレットをも含む。

【0029】

セルロース系バイオマスは、いかなる形状で使用しても良いが、いわゆるソフトバイオマスについては圧搾処理しておくことが好ましく、いわゆるハードバイオマスについては粉砕処理しておくことが好ましい。ソフトバイオマスの圧搾処理とは、ソフトバイオマスに対して所定の圧力を加えることで、バイオマスの組織を緩和・破壊する処理を意味する圧搾処理には、食品分野、農業分野で通常使用されている圧搾装置を利用することができる。また、ハードバイオマスの粉砕処理とは、例えばカッターミルなどの装置によってバイオマスを粉砕する処理を意味する。粉砕処理では、ハードバイオマスを例えば0.1〜2mm（平均径）程度に粗粉砕することが好ましい。

【0030】

糖化処理とは、以上のようなセルロース系バイオマスに対して、糖化酵素を作用させる、或いは糖化酵素生産能を有する微生物を作用させる処理である。糖化処理によりセルロース系バイオマスに含まれるセルロース及びヘミセルロースが、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等の単糖（可溶糖）まで糖化される。このとき、本発明に係るペプチドを存在させることによって、糖化率を向上させることができる。なお、本発明に係るペプチドは、大腸菌などの宿主細胞を用いて合成したものでも良いし、当該ペプチドをコードする核酸を、上記糖化酵素生産能を有する微生物に発現可能に導入することで合成したものでも良い。

【0031】

上述した本発明に係るペプチドは、この糖化処理において糖化酵素による糖化率を向上できるため、セルロース系バイオマスの仕込量に対する可溶糖の生成量を向上させることができる。言い換えると、上述した本発明に係るペプチドを糖化処理の反応系に存在させることで、セルロース系バイオマスを効率良く糖化することができ、目的とする可溶糖の生産量を向上することができる。

【0032】

なお、上述のように、本発明に係るペプチドによれば糖化酵素の糖化率を向上できるが、これは、言い換えると、糖化酵素の使用量を低減できることをも意味する。本発明に係るペプチドを使用することによって、糖化酵素の使用量を下げることができるためコストの低減を達成することができる。

【0033】

さらに、本発明に係るペプチドは、糖化酵素による糖化処理の最中に糖化残査成分に吸着した状態を維持し、糖化残査成分への糖化酵素の吸着を防止することができる。よって、糖化処理の終了後、糖化酵素を回収する際の回収量を大幅に向上させることができる。

【0034】

一方、本発明に係るペプチドは、糖化酵素を吸着した状態の糖化残査成分に作用すると、糖化残査成分に吸着した糖化酵素を剥離して、優先的に糖化残査成分に吸着することとなる。よって、本発明に係るペプチドを糖化処理の反応終了後に反応液に添加することによって、糖化残査成分に吸着した糖化酵素を剥離して、糖化酵素の回収率を向上させることができる。

【0035】

アルコール発酵
本発明に係るペプチドを利用したアルコール発酵とは、セルロース系バイオマスをセルラーゼにより糖化して得られる糖からアルコールを生合成することを意味する。特に本発明に係るペプチドを利用することで、上述のようにセルロース系バイオマスを効率良く糖化でき、セルロース系バイオマス由来の糖の生産量を向上することができる。したがって、本発明に係るペプチドを利用することによって、アルコール発酵におけるアルコール収量も向上することができる。

【0036】

特に、本発明に係るペプチドを利用したアルコール発酵は、いわゆる同時糖化発酵であってもよい。同時糖化発酵とは、セルロース系バイオマスをセルラーゼにより糖化する工程と、糖化により生成されたグルコースを糖源とするエタノール発酵の工程とが同時に進行することを意味する。ここで、アルコール発酵は、従来公知のアルコール発酵能を有する酵母を利用することができる。

【0037】

このような酵母としては、特に限定されないが、Candida shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。また、アルコール発酵能を有する酵母は、野生型の酵母でも良いし、野生型の酵母に突然変異が導入された変異型の酵母でも良いし、また所定の遺伝子を導入又は欠損するように改変された組換え酵母であっても良い。

【0038】

また、アルコール発酵に際して、培養液のpHは特に限定されないが、例えば培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、アルコール発酵に際して、反応液を攪拌や振とうしてもよい。

【0039】

本発明を利用したアルコールの製造方法では、アルコール発酵の後、培地からアルコールを回収する。アルコールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したアルコール発酵が終了した後、固液分離操作によってアルコールを含む液層と、酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるアルコールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いアルコールを回収することができる。なお、アルコールの精製度は、アルコールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。

【0040】

本発明に係るペプチドの利用
上述した本発明に係るペプチドは、糖化残査成分に対する吸着能を有し、糖化残査成分の存在下で糖化酵素による糖化率を向上する作用を有する。このような機能を利用することによって、上述した本発明に係るペプチドを「糖化残査成分吸着剤」や「糖化率改善剤」として使用することができる。以下、これら「糖化残査成分吸着剤」や「糖化率改善剤」を単に「剤」或いは「本発明に係る剤」と呼称する。

【0041】

一方、上述した本発明に係るペプチドを剤として使用する場合、上述した本発明に係るペプチドに対して機能部を連結したような構成としてもよい。すなわち、本発明を適用した剤は、上述した本発明に係るペプチドと、当該ペプチドに連結した機能部とを備える構成でもよい。ここで、機能部としては、上述した本発明に係るペプチドの使用用途に応じて適宜設定することができる。機能部とは、上述した本発明に係るペプチドと連結することで、当該ペプチドと機能部とからなる分子に所定の機能を付与するものである。例えば、機能部としては、所定の酵素活性を有するタンパク質を挙げることができる。タンパク質を機能部とする場合、本発明に係る剤は、従来公知の手法を適用して上述したペプチドと機能部とからなる融合タンパク質として製造することができる。

【0042】

その他にも、機能部としては、蛍光物質、発光物質、色素及びナノ粒子といった分子を例示することができる。

【0043】

より具体的に、機能部としては、リグニン分解酵素を挙げることができる。リグニン分解酵素を機能部とすることによって、本発明に係る剤は、上述したペプチドによる糖化残査成分吸着能と、当該機能部によるリグニン分解能を併せ持つこととなる。リグニン分解酵素としては、ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ（LiP）及びマンガンペルオキシダーゼ（MnP）が挙げられる。これらリグニン分解酵素は、如何なる生物由来の酵素であっても良く、例えば、白色腐朽菌由来の酵素を特に限定すること無く使用することができる。具体的に、本発明に係る剤は、公知のリグニン分解酵素のN末端及び/又はC末端にリンカーを介して又はリンカーを介さずに直接上述したペプチドを結合した融合タンパクとして合成することができる。

【0044】

なお、セルラーゼは、炭水化物ポリマーの加水分解反応に関与する触媒部位と、炭水化物ポリマーへの結合に関与する基質結合部位がリンカーで結ばれた構造をしており、基質結合部位を欠損させると反応性が低下することが報告されている。この報告から、本発明に係る剤においては、上述したペプチドがセルラーゼにおける基質結合部位と同等に機能することとなり、機能部たるリグニン分解酵素によるリグニン分解効率が向上することが理解される。

【0045】

一方、より具体的に、機能部としては、蛍光物質や発光物質を挙げることができる。蛍光物質や発光物質を機能部とすることによって、本発明に係る剤は、上述したペプチドによる糖化残査成分吸着能により、糖化残査成分に対して当該ペプチドを介して蛍光物質や発光物質を吸着させることができる。具体的に、本発明に係る剤は、上述したペプチドのN末端及び/又はC末端に、定法に従って蛍光物質や発光物質を連結した物質として合成することができる。

【0046】

このように構成された剤は、リグニン分解酵素といった糖化残査成分を分解する分解酵素の活性を測定する際に使用することができる。例えば、先ず、リグニン等の糖化残査成分と上述した構成の本発明に係る剤とを共存させることで、糖化残査成分に対して当該ペプチドを介して蛍光物質や発光物質を吸着させる。その後、評価対象の分解酵素を作用させる。分解酵素が糖化残査成分を分解すれば、反応液上清に蛍光物質や発光物質が出てくることになる。よって、反応液を固液分離に供し、得られた反応液上清の吸光度を測定するなどして蛍光物質や発光物質を定量的に測定することによって、分解酵素の糖化残査成分分解活性を測定することができる。

【0047】

一方、より具体的に、機能部としては、色素や特異的な波長に励起される物質を挙げることができる。色素や特異的な波長に励起される物質を機能部とすることによって、上述したペプチドが吸着した部位を可視化することができる。

【実施例】

【0048】

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

【0049】

〔実施例１〕
本実施例では、糖化残査成分を豊富に含むバイオマスを調製し、これを抗原として使用するファージディスプレイ法により糖化残査成分に対する吸着能を有するペプチドを特定し、さらに特定したペプチドについて糖化率を向上させる機能を検証した。さらに、本実施例では、特定したペプチドについて、吸着特性を検証した。

【0050】

＜糖化残査成分を豊富に含むバイオマスの調製方法＞
先ず、前処理バイオマス10%（dry w/v）にセルラーゼ製剤（ノボザイムズ社製）及び50ｍM 酢酸緩衝液(pH5.0)を添加し、50℃で60時間の条件で糖化反応を行った。ここで、前処理バイオマスとしては、圧搾、蒸煮処理したネピアグラスを使用した。

【0051】

反応終了後、糖化残渣を回収し、得られた糖化残査を純水で2回洗浄した。洗浄後の糖化残査を6M塩酸グアニジン溶液に80℃で40時間浸漬した。これにより、糖化反応に使用したセルラーゼ製剤を除去した。

【0052】

次に、再び、糖化残渣を回収し、得られた糖化残査を純水で2回洗浄した。そして、再度、糖化残渣を6M塩酸グアニジン溶液に80℃で30分間浸漬した。これにより、セルラーゼ製剤を除去した
次に、再び、糖化残渣を回収し、得られた糖化残査を純水で2回洗浄した。そして、50mM酢酸バッファー(pH5.0)で２回洗浄した。洗浄後、糖化残査を50℃で2日間乾燥させた。乾燥した糖化残査を乳鉢で潰し、150μmの金網でふるいに掛けた。得られた糖化残査は、糖化残査成分を豊富に含むバイオマスとして、ファージディスプレイ法における抗原として使用した。

【0053】

＜ファージディスプレイ法＞
上述のようにして得られた糖化残査成分を豊富に含むバイオマスを抗原として使用した。ファージディスプレイ法は、市販のPh.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit(NEB社製)を使用して実施した。ファージディスプレイ法における結合・洗浄用水溶液としては、50mM 酢酸緩衝液（pH5.0、200mM NaCl、0.5% Tween20）を使用した。また、ファージディスプレイ法における解離用水溶液としては、50mM 酢酸緩衝液（pH5.0、2M NaCl）を使用した。ファージディスプレイ法におけるパンニング回数は4回とした。なお、ファージディスプレイ法の詳細な手順は、キットに添付の説明書に記載された通りとした。

【0054】

ファージディスプレイ法の結果、以下の３種類のペプチドを糖化残査成分を豊富に含むバイオマスに対して吸着するペプチドとして同定することができた。
ペプチド１：SGHHNLHKTEHR（配列番号１）
ペプチド２：SSLQAHKPHHLR（配列番号２）
ペプチド３：KHVPRSPVEALY（配列番号３）

【0055】

＜糖化試験＞
上述のようにして同定された３種類のペプチドについて、糖化酵素の糖化率を向上させる機能を糖化試験により検証した。糖化試験では、バイオマス量が0.5重量%となるように調整した前処理バイオマス溶液（200μl）、50mM酢酸緩衝液（pH5.0）、同定されたペプチド及びトリコデルマ培養上清（10μl）からなる反応液を準備した。なお、前処理バイオマスとしては、圧搾、蒸煮処理したネピアグラスを使用した。また、前処理バイオマス溶液は、前述の前処理バイオマスをウェットな状態のままで乳鉢で粉状にし、これを50mM酢酸緩衝液（pH5.0）に混合した溶液である。調製した反応液は、撹拌装置を用いてよく懸濁した。

【0056】

糖化試験は40℃の温度条件とし、1800rpmで攪拌しながら糖化反応を行った。また、反応時間を43時間とした。反応終了後、遠心分離（15000rpm）により固液分離し、反応上清を回収した。回収した反応上清に含まれる還元糖量をTZアッセイにより測定した。なお、TZアッセイはJue CK and Lipke PN (1985) Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11, 109-115に記載されている。

【0057】

糖化試験の結果を図１に示した。図１に示すように、供試した３種類のペプチドは全て、糖化酵素による糖化反応の糖化率を向上させる機能を有することが明らかになった。特に、ペプチド３を使用した場合、対コントロール比で１．７倍の遊離糖を検出することができた。また、ペプチド３は、他のペプチドと比較して、糖化率の向上効果が最も優れていることが明らかとなった。

【0058】

＜吸着試験＞
上述のようにして同定された３種類のペプチドについて、バイオマス成分に対する吸着特性を吸着試験により検証した。本試験では、バイオマス成分として、アビセル（FMC BioPolymer社製）、再生アモルファスセルロース（RAC）、糖化残渣バイオマスを用いた。

【0059】

RACは、Biomacromolecules 2006, 7, 644-648のExperimental SectionにおけるRegenerated amorphous cellulose preparationの欄に記載された方法に準じて調製した。すなわち、約0.2gのアビセルを50mLの遠心分離菅に入れ、これに0.6mLの滅菌水を加えてアビセルを湿潤した。これによりセルロース懸濁スラリーを調製した。このスラリーに10mLの氷冷リン酸（86.2%）を徐々に添加し、強く撹拌することでリン酸の最終濃度が83.2%となった。最後の2mLのリン酸を添加する前にセルロース懸濁液を均一に撹拌した。セルロース混合物は数分内に透明に変化し、時折撹拌しながら氷上に約１時間置いた。その後、約40mLの氷冷した水を約10mLずつ添加した。氷冷水の添加間隔では強く撹拌した。この処理により白濁した沈殿物が形成された。得られた沈殿物を〜500０g、4℃の条件で20分間で遠心分離した。得られたペレットを氷冷水に懸濁し、その後、遠心分離することでリン酸を含む上清を除去した。この処理を4回繰り返した。約0.5mLのNa₂CO₃を添加して残存するリン酸を中和し、その後、45mLの氷冷滅菌水を使用してペレットを懸濁した。遠心分離後に得られたペレットを滅菌水に懸濁し、遠心分離する処理を２回又はpHが5〜7になるまで行った。アジ化ナトリウムを少量添加し、4℃以下の温度で長時間保持することで、再生アモルファス（均質）セルロース・スラリーを調製した。

【0060】

また、糖化残査バイオマスとしては、上述した＜糖化残査成分を豊富に含むバイオマスの調製方法＞に記載した方法により調製したバイオマスを使用した。

【0061】

吸着試験は以下のように実施した。すなわち、先ず、Ｎ末端に蛍光分子であるFITCを接合したペプチド１〜３をそれぞれ化学合成した。これらFITC接合ペプチド１〜３を様々な濃度となるように反応液に添加し、室温で10分間静置した。ここで、反応液としては、50mMの酢酸緩衝液（pH5.0）に糖化残査バイオマス、アビセル及びPASCのいずれかを5mg/mlとなるように分散させた溶液を使用した。

【0062】

反応終了後、反応液を12,000×gで10分間遠心分離し、その後、上清画分を回収した。そして、回収した上清画分を495nmで励起したときの520nmの蛍光強度を測定した。測定される蛍光強度は、バイオマスに吸着していないペプチドに由来するものである。よって、測定された520nmの蛍光強度を用いて、定法に従ってバイオマスに吸着していないペプチド量を算出することができる。そして、反応液に投入したペプチド量から、バイオマスに吸着していないペプチド量を差し引くことによって、バイオマスに吸着したペプチドを算出することができる。

【0063】

このように算出した、バイオマスに吸着したペプチド量を図２A〜Cに示した。図２Aは、バイオマスとして糖化残査バイオマスを用いた実験結果である。図２Bはバイオマスとしてアビセルを用いた実験結果である。図２CはバイオマスとしてRACを用いた実験結果である。図２A〜Cに示すように、供試した３種類のペプチドは全て、セルロース（アビセル、RAC）には吸着しないが、糖化残渣バイオマスに対する吸着能を有することが明らかとなった。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]