特許 6004944 鳥類Ｄ群ロタウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6004944

(24)【登録日】2016年9月16日

(45)【発行日】2016年10月12日

(54)【発明の名称】鳥類Ｄ群ロタウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160929BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20160929BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20160929BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

   G01N33/569 L

【請求項の数】6

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2012-555512(P2012-555512)

(86)(22)【出願日】2011年3月4日

(65)【公表番号】特表2013-521766(P2013-521766A)

(43)【公表日】2013年6月13日

(86)【国際出願番号】IB2011000600

(87)【国際公開番号】WO2011107883

(87)【国際公開日】20110909

【審査請求日】2014年2月7日

(31)【優先権主張番号】1003630.9

(32)【優先日】2010年3月4日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ロート， ベルンハルト

【審査官】 田中 耕一郎

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０６１８７３１９（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 MCNEAL M. M., et al.，UniProtKB/Swiss[online], Accession No. Q6PMI4，２０１５年 ４月１０日，インターネット＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/81986108?sat=12&satkey=7194534＞15-Dec-2009 uploaded, Definition: RecName: Full=Intermediate capside protein VP6

【文献】 WU H., et al.，Database DDBJ/EMBL/GenBank[online], Accession No. AB008672，２０１５年 ４月１０日，インターネット＜URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB008672＞15-Feb-2008 uploaded, Definition:Human rotavirus C mRNA for VP6, complete cds.

【文献】 BARMAN P., et al.，Database DDBJ/EMBL/GenBank[online], Accession No. AY786570，２０１５年 ４月１０日，インターネット＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY786570＞01-Nov-2005 uploaded, Definition:Human rotavirus C strain V469 major inner capsid protein VP6(VP6)

【文献】 AVIAN DISEASES，２００６年，Vol.50，P.411-418

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−Ｃ１２Ｎ １５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−Ｃ１２Ｑ ３／００

Ｃ０７Ｋ １／００−Ｃ０７Ｋ １９／００

Ａ６１Ｋ ３９／００−Ａ６１Ｋ ３９／４４

Ａ６１Ｋ ４９／００−Ａ６１Ｋ ４９／２２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）配列番号１または配列番号２に示す核酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列；
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す核酸配列の逆相補体に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列；
（ｃ）配列番号１および／または２に示す核酸配列の断片であって、配列番号１および／または２からの少なくとも２４個の連続的なヌクレオチドからなる、断片；
（ｄ）配列番号１および／または２に示す核酸配列の逆相補体の断片であって、配列番号１および／または２の逆相補体の少なくとも１６個の連続的なヌクレオチドからなり、該断片は、生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤウイルスの存在または非存在を検出することができる、断片；または
（ｅ）配列番号１または配列番号２に示す核酸配列に、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸配列
を含む、核酸。

【請求項2】

検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

請求項１に記載のＡＲＶＤウイルス核酸に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマーを含むキットであって、該キットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーは、該鋳型配列の一部に実質的に相補的な配列を含み、該第２のプライマーは、該鋳型配列の相補体の一部に実質的に相補的な配列を含み、ここで、実質的な相補性を有する該プライマー内の該配列は、増幅される該鋳型配列の末端を規定する、キット。

【請求項4】

前記鋳型配列の一部に実質的に相補的か、または該鋳型配列の逆相補体の一部に実質的に相補的であるプローブ配列をさらに含む、請求項３に記載のキット。

【請求項5】

前記鋳型配列が、配列番号１または配列番号２に示す核酸配列に含まれる、請求項３または請求項４に記載のキット。

【請求項6】

請求項１に記載の核酸分子をＡＲＶＤ感染の指標とするための、または生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤウイルスの存在もしくは非存在を同定するための方法であって、該核酸分子の存在または非存在を検出する工程を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

鳥類ロタウイルス
鳥類Ｄ群ロタウイルス

【背景技術】

【0002】

ロタウイルスは、ウイルスのレオウイルス科に属し、他の生物の中で、鳥類の胃腸系および気道に影響し得る。レオウイルス科は、オルトレオウイルス（鳥類および哺乳類レオウイルス）、オルビウイルス（ブルータングウイルス）、およびロタウイルス（ＡからＧ群）を含む異なる属からなる。

【0003】

ロタウイルスは、無エンベロープ、二重殻ＲＮＡウイルスである。そのゲノムは２本鎖ＲＮＡの１１個のセグメントから構成され、それらは６個の構造的タンパク質および６個の非構造的タンパク質をコードする。ビリオンの３層正二十面体タンパク質カプシドを形成する、６個のウイルスタンパク質（ＶＰ）が存在する。これらの構造的タンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、およびＶＰ７と呼ばれる（非特許文献１［１］）。ＶＰ６がカプシドの大部分を形成する。それは高度に抗原性であり、そしてロタウイルス種を同定するために使用し得る（非特許文献２［２］）。ＶＰに加えて、ロタウイルスによって感染した細胞においてのみ産生される、６個の非構造的タンパク質（ＮＳＰ）が存在する。これらはＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、ＮＳＰ５およびＮＳＰ６と呼ばれる（非特許文献１［１］）。

【0004】

鳥類ロタウイルス（ＡＲＶ）は周知であり（非特許文献３、非特許文献４および非特許文献５［３、４および５］）、そしてしばしば世界中で家禽の群れ、および特にニワトリの群れに影響を与える。感染したニワトリの症状は、下痢に続く体重増加の遅延、吸収不良症候群（ＭＡＳ）または発育不全症候群（ＲＳＳ）として公知である症候群である。

【0005】

１つのフィールド研究において、ＲＳＳを有する８個の群れからの６から１８日齢のブロイラーのヒヨコを調査して、どのＡＲＶがＲＳＳの病因に大きく寄与しているのかを決定した（非特許文献６［６］）。この研究において、ＲＳＳを有する群れの３４羽のうち３２羽のヒヨコでＡＲＶが検出された。ＲＳＳを有する群れにおいて、４つの群のＡＲＶ：ＡＶＲ Ａ、Ｄ、ＦおよびＧが同定された。この研究の結果は、ＲＳＳの病因において、Ｄ群ＡＲＶが主要な役割を果たしていることを示した。

【0006】

ニワトリ飼育者に対するＲＳＳの経済的影響は深刻である。全ての感染したニワトリは失われる。従って、ＡＲＶによる感染の初期の検出および予防が、非常に望ましい。

【0007】

現在、通常、ＲＮＡ−ＰＡＧＥを用いた１１個のゲノムＲＮＡ断片の移動に基づいて、ＡＲＶを検出および同定する。Ｄ群ＡＲＶに特徴的なＲＮＡ−ＰＡＧＥパターンは、５：２：２：２である（非特許文献７［７］）。このＲＮＡの移動の特徴的なパターンを使用して、Ｄ群ＡＲＶを同定し得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｐｅｓａｖｅｎｔｏ ＪＢ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＳＥ， Ｅｓｔｅｓ ＭＫ， Ｐｒａｓａｄ ＢＶ． Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００６） ３０９：１８９−２１９

【非特許文献2】Ｂｉｓｈｏｐ ＲＦ． Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． Ｓｕｐｐｌ． （１９９６） １２： １１９-２８

【非特許文献3】Ｓｏｎｇｓｅｒｍ Ｔ， Ｐｏｌ ＪＭ， ｖａｎ Ｒｏｏｚｅｌａａｒ Ｄ， Ｋｏｋ ＧＬ， Ｗａｇｅｎａａｒ Ｆ， ｔｅｒ Ｈｕｕｒｎｅ ＡＡ． Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ． （２０００） ４４（３）：５５６−６７

【非特許文献4】Ｐａｇｅ ＲＫ， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＯＪ， Ｒｏｗｌａｎｄ ＧＮ， Ｇａｕｄｒｙ Ｄ， Ｖｉｌｌｅｇａｓ Ｐ． Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ． （１９８２） ２６（３）：６１８−２４

【非特許文献5】Ｂｅｌｌｉｎｚｏｎｉ Ｒ， Ｍａｔｔｉｏｎ Ｎ， Ｖａｌｌｅｊｏｓ Ｌ， Ｌａ Ｔｏｒｒｅ ＪＬ， Ｓｃｏｄｅｌｌｅｒ ＥＡ． Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ． （１９８７） ４３（１）：１３０−１

【非特許文献6】Ｏｔｔｏ Ｐ， Ｌｉｅｂｌｅｒ−Ｔｅｎｏｒｉｏ ＥＭ， Ｅｌｓｃｈｎｅｒ Ｍ， Ｒｅｅｔｚ Ｊ， Ｌｏｅｈｒｅｎ Ｕ， Ｄｉｌｌｅｒ Ｒ． Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ． （２００６） ５０（３）：４１１−８

【非特許文献7】Ｍ． Ｓ． ＭｃＮｕｌｔｙ， Ｇ． Ｍ． Ａｌｌａｎ， Ｄ． Ｔｏｄｄ， Ｊ． Ｂ． ＭｃＦｅｒｒａｎ ａｎｄ Ｒ． Ｍ． ＭｃＣｒａｃｋｅｎ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． （１９８１） ５５：４０５−４１３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

ＡＲＶをまた、ＥＬＩＳＡ［８］、透過型電子顕微鏡、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）［６］を用いて検出し得る。ＰＡＧＥのみが、異なるＡＲＶ群の区別を可能にするが、低い程度の感度しか有さない。現在、ＰＣＲ法は、Ａ群ロタウイルスの検出のためにのみ利用可能である。優先日において、Ｄ群ＡＲＶに関してヌクレオチド配列データは存在しない。従って、他のロタウイルスおよび特にＤ群ロタウイルスを検出する代替方法を開発することへの、差し迫った必要性が存在する。特に、Ｄ群ＡＲＶの迅速で感度の高い検出方法を開発することへの、差し迫った必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、新規Ｄ群鳥類ロタウイルス（ＡＲＶＤ）［９］の同定に関連し、そして獣医学および医薬品分野においていくつかの機会を提供する。本発明は、以下のものを提供する：
・ＶＰ６ポリペプチドをコードする核酸、ならびにその断片および変異体、ならびにＶＰ６ポリペプチドをコードする核酸に相補的な核酸の配列。
・上記で述べた核酸によってコードされるＶＰ６ポリペプチド配列、ならびにその断片、変異体、および抗原性断片。
・プライマーおよびプローブを含む、高いストリンジェンシーの条件下で、ＶＰ６ポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする核酸分子。
・ＶＰ６ポリペプチド、その断片、変異体、および／または抗原決定基に結合する抗体。
・生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤの存在または非存在を同定するための診断試薬およびそのような試薬を含むキット、およびＡＲＶＤ感染を診断するために、または生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤウイルスの存在または非存在を同定するために使用し得る方法。
・ＡＲＶＤ感染の処置またはＡＲＶＤ感染からの保護のためのワクチン。
・卵、特にワクチン産生のための発育鶏卵が、ＡＲＶＤフリー（ＡＲＶＤ−ｆｒｅｅ）であることを証明する方法。

【0011】

核酸
本発明は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号１または配列番号２と少なくともｉ％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ｉの値を、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％から選択し得る。配列同一性は、ヌクレオチド配列の長さ全体にそって計算するべきである。

【0012】

配列番号２は、ＡＲＶＤ ＶＰ６をコードする配列全体を提供する。配列番号１は、配列番号２で示したようなＶＰ６をコードする配列の断片を含み、さらに３’非翻訳配列を含む核酸を提供する。

【0013】

好ましくは、核酸は、ＡＲＶＤ ＶＰ６ポリペプチドをコードする。本発明の核酸は、配列番号３または配列番号４で示したような、ＡＲＶＤ ＶＰ６ポリペプチドをコードし得る。

【0014】

本発明はまた、配列番号１および／または２において示したような核酸配列の断片を含む。従って、本発明は、配列番号１および／または２の、少なくともｎ個の連続的なヌクレオチドの断片を含む核酸を提供し、ここでｎは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上である。その核酸は、ｎ＋ｘヌクレオチドの全長を有し得、ここでｘ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上である。１つの実施態様において、ｎの値は２４である。

【0015】

さらなる実施態様において、本発明は、配列番号１または配列番号２の逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号１または配列番号２で示された核酸配列の逆相補体と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％またはそれ以上同一である核酸配列を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号１および／または２の逆相補体由来の、少なくともｎ個の連続的なヌクレオチドからなる断片を含む核酸を提供し、ここでｎは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上である。その核酸は、ｎ＋ｘヌクレオチドの全長を有し得、ここでｘ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上である。１つの実施態様において、ｎの値は１０である。

【0016】

さらなる実施態様において、本発明は、配列番号１および／または配列番号２からなる核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６５℃で１０分間であり、洗浄は２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１０分間の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでさらに１０分間である。

【0017】

本発明は、式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’の核酸を提供し、ここで：−Ｘ−は、ｘヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である；−Ｚ−は、ｚヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である；−Ｙ−は、（ａ）配列番号１または２の断片、または（ｂ）（ａ）の相補体のいずれかからなるヌクレオチド配列である；そして当該核酸５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’は、（ｉ）配列番号１または２の断片でも、（ｉｉ）（ｉ）の相補体でもない。−Ｘ−および／または−Ｚ−部分は、例えばプロモーター配列（またはその相補体）を含み得る。

【0018】

本発明はまた、本発明の核酸および断片を含み、さらなるヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または１つもしくはそれ以上の検出可能な標識も含む核酸を提供する。そのような核酸は、ＬＣＲ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、およびサザンブロッティングを含む方法において、プライマーおよび／またはプローブとして有用であり得る。

【0019】

代表的な標識は、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン、塩基対ミスマッチ、ヘアピン構造等を含む。多くの適当なフルオロフォアが公知であり、そして使用し得、例としては、フルオレセイン、特に５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも呼ばれる；スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸，３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセインとも呼ばれる）；リサミン；フィコエリトリン；ローダミン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）；Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７；ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および参考文献［１０］において記載されたようなさらなる標識が挙げられるがこれらに限らない。そのような標識を、核酸分子に組込むことは、分子生物学の当業者の技術の範囲内である。１つの特定の実施態様において、その核酸は、蛍光標識および消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を含む。適当な消光剤は、６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；Ｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ、９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；およびＤＡＢＣＹＬ（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）を含むがこれに限らない。核酸を、ＦＡＭ（例えば５’において）およびＤＡＢＣＹＬ（例えば３’において）の両方で標識することが好ましい。

【0020】

さらなる実施態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。例えば、本発明は、本発明の核酸を含むクローニングまたは発現ベクターを含む。本発明はまた、本発明の核酸を含み、そしてさらなる核酸、例えばさらなるポリペプチドをコードする核酸、プロモーターまたはターミネーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位等をさらに含むベクターを提供する。

【0021】

本発明による核酸は、様々な形態（例えば１本鎖、２本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識化等）を取り得る。上記で記載したいずれの実施態様においても、その核酸およびポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、および／または修飾ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）であり得る。その核酸およびポリヌクレオチドはまた、少なくとも１つの修飾糖および／または塩基部分を含み得、または修飾バックボーンもしくは非天然ヌクレオシド間結合を含み得る。

【0022】

核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列の「Ｕ」は、ＤＮＡにおいて「Ｔ」に置換されることが認識される。同様に、例えばＡＲＶのゲノムにおけるように、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列（配列番号１または配列番号２におけるような）の「Ｔ」は、ＲＮＡにおいて「Ｕ」に置換されることが認識される。

【0023】

本発明の核酸およびポリヌクレオチドをまた、そのオリゴヌクレオチドを１つまたはそれ以上の部分または結合体に化学的に結合することによって修飾して、そのオリゴヌクレオチドの活性、安定性、または検出を増強し得る。そのような部分または結合体は、上記で記載したような発色団およびフルオロフォアを含み、そしてさらにコレステロールのような脂質、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、および例えば参考文献１１から１８において開示されるような他のものを含む。

【0024】

本発明の核酸は、好ましくは、精製されたかまたは実質的に精製された形態で提供される。すなわち実質的に他の核酸、特に他のＡＲＶＤまたは宿主細胞核酸を含まず（例えば天然に存在する核酸を含まない）、一般的に少なくとも約５０％純粋（重量で）、および通常少なくとも約９０％純粋である。本発明の核酸は、好ましくはＡＲＶＤ核酸である。

【0025】

本発明の核酸を、多くの方法で、例えば全部または部分的な化学的合成（例えばＤＮＡのホスホラミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば制限酵素）を用いて長い核酸を消化することによって、短い核酸またはヌクレオチドを結合することによって（例えばリガーゼまたはポリメラーゼを用いて）、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー等から調製し得る。

【0026】

本発明の核酸を、固体支持体（例えばビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ支持体、レジン等）に結合し得る。本発明の核酸を、例えば放射性もしくは蛍光標識、またはビオチン標識で標識し得る。その核酸を、検出技術において使用する場合、例えばその核酸がプライマーまたはプローブである場合に、これは特に有用である。

【0027】

「核酸」という用語は、一般的な意味において、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を含み、それはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそのアナログを含む。それはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。それはまた、修飾バックボーン（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）、または修飾塩基を含むもののような、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログを含む。従って、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマー等を含む。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合、それは５’キャップを有しても有さなくてもよい。

【0028】

ポリペプチド
本発明は、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明はさらに、配列番号３および／または４で示されたポリペプチド配列と少なくともｊ％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ｊの値を、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％から選択し得る。配列同一性は、アミノ酸配列の長さ全体にそって計算するべきである。

【0029】

好ましくは、そのポリペプチドはＡＲＶＤ ＶＰ６ポリペプチドである。配列番号３は、配列番号１によってコードされるポリペプチドに対応し、配列番号４は、配列番号２によってコードされるポリペプチドに対応する。配列番号３および４を、図３に並べる。

【0030】

本発明はまた、配列番号３または配列番号４の少なくとも１つの断片を含むポリペプチドを提供し、ここでその断片は、配列番号３および／または配列番号４の少なくともｗ個の連続的なアミノ酸からなり、ここでｗは６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上である。そのポリペプチドは、ｗ＋ｘアミノ酸の全長を有し得、ここでｘ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上である。

【0031】

本発明はまた、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む、本発明のポリペプチドおよび断片の変異体を提供する。例えば、配列番号３は、１つのアミノ酸置換を含む、配列番号４のＣ末端断片の変異体である（図３）。

【0032】

本発明のポリペプチドは、配列番号３または４と比較して、１つまたはそれ以上の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のものとの置換を含み得る。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、一緒に芳香族アミノ酸と分類されることもある。一般的に、これらのファミリー内の単一のアミノ酸の置換は、生物学的活性に対して大きな影響を有さない。さらに、そのポリペプチドは、配列番号３または４と比較して、１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の単一のアミノ酸の欠失を有し得る。さらに、そのポリペプチドは、配列番号３または４と比較して、１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の挿入（例えばそれぞれ１、２、３、４、または５つのアミノ酸）を含み得る。

【0033】

１つの特定の実施態様において、その断片は、被験体において免疫反応を誘導し得る。その被験体は、鳥類または哺乳類であり得る。１つの特定の実施態様において、その被験体は、家禽、例えばニワトリまたはシチメンチョウである。

【0034】

その断片は、少なくとも１つのＴ細胞、または好ましくはＢ細胞エピトープを含み得る。ＴおよびＢ細胞エピトープを、経験的に同定し得る（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［１９、２０］または同様の方法を用いて）か、またはそれらを予測し得る（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックス［２１］、マトリックスに基づくアプローチ［２２］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２３］、神経ネットワーク［２４］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２５、２６］、ＡＤＥＰＴ［２７］、Ｔｓｉｔｅｓ［２８］、親水性［２９］、抗原インデックス［３０］、または参考文献３１および３２等において開示された方法を用いて）。配列番号４において見出され、そして参考文献３２において記載された方法によって同定された、代表的なエピトープを表１に示す。

【0035】

ポリペプチドが、本明細書中で記載されたように、抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体に特異的に結合し得る場合、そのポリペプチドも抗原と呼び得る。本発明は、ＡＲＶＤウイルス抗原であるポリペプチド、およびこれらのＡＲＶＤウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0036】

本発明のポリペプチドを、多くの方法で、例えば化学的合成によって（全部または部分的に）、プロテアーゼを用いて長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物からの精製によって（例えば組換え発現から）、生物自体から（例えば細菌培養後、または患者から直接）、等によって調製し得る。＜４０アミノ酸長のペプチドを産生するために好ましい方法は、インビトロ化学的合成を含む［３３、３４］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［３５］化学に基づく方法のような、固相ペプチド合成が特に好ましい。さらに、部分的にまたは完全に、酵素的合成［３６］を使用してもよい。化学的合成の代替として、生物学的合成を使用し得る。例えばそのポリペプチドを翻訳によって産生し得る。これを、インビトロまたはインビボにおいて行い得る。生物学的方法は、一般的に、Ｌ−アミノ酸に基づくポリペプチドの産生に限られるが、翻訳機構（例えばアミノアシルｔＲＮＡ分子）の操作を使用して、Ｄ−アミノ酸（またはヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン等のような他の非天然アミノ酸）の導入を可能にし得る［３７］。しかし、Ｄ−アミノ酸を含む場合、化学的合成を使用することが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端において共有結合の修飾を有し得る。

【0037】

本発明のポリペプチドは、好ましくは精製されたかまたは実質的に精製された形態で提供される。すなわち他のポリペプチド、特に他のＡＲＶＤまたは宿主細胞ポリペプチドを実質的に含まず（例えば天然に存在するポリペプチドを含まない）、そして一般的に少なくとも約５０％純粋（重量で）、および通常少なくとも約９０％純粋である。すなわち、組成物の約５０％未満、そしてより好ましくは約１０％未満（例えば５％またはそれより少ない）は、他の発現したポリペプチドで構成されている。本発明のポリペプチドは、好ましくはＡＲＶＤポリペプチドである。

【0038】

本発明のポリペプチドを、固体支持体に結合し得る。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識を含み得る（例えば放射性もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）。

【0039】

「ポリペプチド」という用語は、あらゆる長さのアミノ酸ポリマーを指す。そのポリマーは直鎖状または分岐であり得、それは修飾アミノ酸を含み得、そしてそれは非アミノ酸によって中断され得る。その用語はまた、天然に、または介入；例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合体化のような、あらゆる他の操作または修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーを含む。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸アナログ（例えば非天然アミノ酸等を含む）、および当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも、その定義の範囲内に含まれる。ポリペプチドは、１本鎖または結合した鎖として生じ得る。本発明のポリペプチドを、天然にまたは非天然にグリコシル化し得る（すなわち、そのポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドにおいて見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。本発明のポリペプチドを、単離または精製し得る。

【0040】

本発明は、配列−Ｘ−Ｙ−または−Ｙ−Ｘ−を含むポリペプチドを提供し、ここで：−Ｘ−は上記で定義したようなアミノ酸配列であり、そして−Ｙ−は上記で定義したような配列ではない。すなわち本発明は、融合タンパク質を提供する。

【0041】

本発明は、本発明の宿主細胞を、ポリペプチドの発現を誘導する条件下で培養する工程を含む、本発明のポリペプチドを産生するためのプロセスを提供する。

【0042】

本発明は、本発明のポリペプチドを産生するためのプロセスを提供し、ここでそのポリペプチドを、部分的にまたは全体として化学的手段を用いて合成する。

【0043】

ＡＲＤＶ核酸を検出するための方法およびキット
本発明はまた、生物学的サンプルにおいて、ＡＲＶＤの存在または非存在を検出するためのキットおよび方法を提供する。特に、本発明は、本発明の核酸を検出するためのキットおよび方法を提供する。

【0044】

特定の実施態様において、本発明は、本発明の核酸に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマーを含むキットを提供し、そのキットは第１のプライマーおよび第２のプライマーを含む。ここで第１のプライマーは当該鋳型配列の一部に実質的に相補的な配列を含み、そして第２のプライマーは当該鋳型配列の相補体の一部に実質的に相補的な配列を含む。ここで当該プライマー内の配列が、増幅される鋳型配列の末端を規定する。

【0045】

プライマー配列に関して、「実質的に相補的な」によって、そのプライマーが鋳型配列またはその相補体に対して、４５から６５℃の温度で、例えば４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５℃で、５０ｍＭの一価陽イオンの塩濃度で、その鋳型配列またはその相補体にアニーリングするために十分な相補性を有することを意味する。

【0046】

その鋳型配列（プライマーに相補的な部分を含む）は、５０ヌクレオチドから１５００ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、その鋳型配列は、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、または１５００ヌクレオチドの長さであり得る。１つの実施態様において、その鋳型核酸は、配列番号１または配列番号２で示された核酸配列内に含まれる。１つの実施態様において、その鋳型核酸は、配列番号１または配列番号２で示されたような核酸配列である。本発明のプライマーはまた、配列番号１または配列番号２と異なる鋳型配列の検出において使用するために適当である。

【0047】

本発明はまた、当該鋳型配列の一部に実質的に相補的なプローブ配列、または当該鋳型配列の逆相補体の一部に実質的に相補的なプローブ配列をさらに含むキットを提供する。そのプローブ配列はまた、検出可能な標識を含み得る。プローブ配列に関して、「実質的に相補的な」によって、そのプローブが、鋳型配列またはその相補体に対して、４５から６５℃の温度で、例えば４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５℃で、５０ｍＭの一価陽イオンの塩濃度で、その鋳型配列またはその相補体にアニーリングするために十分な相補性を有することを意味する。

【0048】

そのプライマーおよびプローブは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。そのプローブおよびプライマーは、５’末端、３’末端のいずれか、またはその両方で、さらなるヌクレオチドまたは他の修飾を含み得る。さらなるヌクレオチドは、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または他の核酸配列を含み得る。一般的に、そのプローブおよびプライマーは、１００ヌクレオチド以下の長さ、例えば≦７５ヌクレオチドである。

【0049】

そのプライマーおよびプローブはまた、例えばその鋳型配列に部位特異的変異を導入するために、１つまたはそれ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。

【0050】

本発明のキットおよび方法において使用し得る、１つの特定のプライマーペアは、ＡＲＶＤフォワード（

【0051】

【化1】

−配列番号２４）およびＡＲＶＤリバース（

【0052】

【化2】

−配列番号２５）の配列を含む。このプライマーペアを、あらゆるプローブ配列と共に使用し得るが、特にｑＲＴ−ＰＣＲにおいて

【0053】

【化3】

（配列番号２６）を含むプローブ配列と共に使用し得る。

【0054】

さらなるプライマー配列を、下記の表２で提供する。１つの実施態様において、そのプライマーを、以下のペアで使用する：配列番号２７および２８；配列番号２９および３０；配列番号３１および３２；配列番号３３および３４；配列番号３５および３６。

【0055】

本発明はまた、本発明の核酸分子の存在または非存在を検出する工程を含む、ＡＲＶＤ感染を診断するための、または生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤウイルスの存在または非存在を同定するための方法を提供する。特定の実施態様において、その方法は、配列番号１および／または配列番号２で示された核酸配列を含む核酸の存在または非存在の検出を含む。

【0056】

その検出工程の前に、例えば当該分野で公知のあらゆる核酸増幅技術、および特にＬＣＲ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、およびｑＲＴ−ＰＣＲを用いた、増幅工程が先行し得る。本発明の核酸の存在または非存在を検出するために、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、およびアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動と続くエチジウムブロミドを用いた核酸の視覚化を含むがこれに限らない、あらゆる適当な方法を使用し得る。本発明の核酸をまた、リアルタイムアッセイ（例えば「ｑＰＣＲ」；Ｔａｑｍａｎ^ＴＭ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ^ＴＭ；Ｓｃｏｒｐｉｏｎ^ＴＭ等）を用いて検出し得る。

【0057】

ＡＲＶＤはＲＮＡゲノムを有するので、本発明の１つの特定の実施態様において、増幅工程のためにＲＴ−ＰＣＲを使用する。しかし、当業者に公知であるような、同等のＲＮＡ増幅方法も適用可能である（ＮＡＳＢＡ^ＴＭ；３ＳＲ^ＴＭ；ＴＭＡ^ＴＭ等）。特定の実施態様において、ワンステップＲＴ−リアルタイムＰＣＲアッセイを適用する（「ワンステップＲＴ−ｑＰＣＲ」）。市販で入手可能なＲＴ−ＰＣＲキット、例えばＱｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ^ＴＭ ＶｉｒｕｓキットまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＴＭ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ^ＴＭキットを使用し得る。生じた蛍光シグナルを、当該分野で公知であるように、それぞれのリアルタイムサイクラーソフトウェアを用いて分析し得る。従って本発明のキットは、逆転写酵素を含み得る。

【0058】

上記で記載したようなプライマーおよびプローブを、本発明の方法のいずれにおいても使用し得る。

【0059】

生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤの存在または非存在を検出するための、上記で記載した本発明の方法は、家禽の群れ、および特にニワトリの群れを、ＡＲＶＤによる感染に関してスクリーニングするために特に有用である。ＡＲＶＤの存在または非存在に関する家禽のスクリーニングを、ＲＳＳおよびＭＡＳの大発生を制御または予防するための方法において使用し得る。

【0060】

上記で記載した本発明の方法は、ＡＲＶＤの存在または非存在に関して、家禽の卵をスクリーニングするために有用である。ＡＲＶＤの存在または非存在に関する卵のスクリーニングを、ワクチン産生に使用する卵がＡＲＶＤフリーであることを保証するために使用し得る。

【0061】

本発明はまた、卵においてＡＲＶＤの存在または非存在を検出することを含む、卵がＡＲＶＤを含まないことを証明するための方法を提供する。本発明の核酸の存在または非存在を検出するための、上記で記載したいずれの方法も、卵がＡＲＶＤフリーであることを証明するために使用し得る。

【0062】

上記で記載した方法において、その卵はニワトリ卵であり得る。さらなる実施態様において、その卵は発育鶏卵であり、そして特にワクチン産生に使用する発育鶏卵である。産生するワクチンは、インフルエンザワクチンであり得る。

【0063】

抗体およびイムノアッセイ
１つの実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明の抗体は、配列番号３および／または配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する。「特異的に結合する」によって、その抗体が、本発明のポリペプチドに、実質的にＢＳＡより高い親和性で結合することを意味する。好ましくは、その親和性は、本発明のポリペプチドに関して、ＢＳＡよりも少なくとも１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍等高い。

【0064】

１つの実施態様において、その抗体は、本発明のポリペプチドに、任意の他のレオウイルス由来のＶＰ６ポリペプチドに対するその結合親和性より、少なくとも１０倍、１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍等高い親和性で結合する。別の実施態様において、その抗体は、本発明のポリペプチドに、別のロタウイルス由来のＶＰ６ポリペプチドに対するその結合親和性より、少なくとも１０倍、１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍等高い親和性で結合する。

【0065】

本発明の抗体に特異的に結合する本発明のポリペプチドは、抗原と呼ばれる。

【0066】

当該分野で公知の「抗体」は、化学的または物理的手段によって、目的のポリペプチドのエピトープに結合し得る、１つまたはそれ以上の生物学的部分を含む。本発明の抗体は、本発明のＶＰ６ポリペプチド由来のＡＲＶＤウイルス抗原に特異的に結合する抗体を含む。「抗体」という用語は、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、および以下のものを含む：ハイブリッド（キメラ）抗体分子［３８および３９］；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆｖ分子［４０および４１］；１本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）［４２］；二量体および三量体抗体断片構築物；およびそのような分子から得られる、任意の機能的な断片。そのような断片は、親抗体分子の免疫学的結合性質を保持する。「抗体」という用語はさらに、ファージディスプレイのような、非従来型のプロセスによって得られる抗体を含む。

【0067】

本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、均質な抗体集団を有する抗体組成物を指す。その用語は、抗体の種または供給源に関して制限されず、それが作られた様式によって制限されることも意図しない。

【0068】

抗体を、当業者に周知であり、そして例えば参考文献４３および４４において開示された技術を用いて産生する。例えば、ポリクローナル抗体を、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、またはヤギのような適当な動物を、目的の抗原で免疫化することによって産生する。免疫原性を増強するために、その抗原を、免疫化の前にキャリアに結合し得る。そのようなキャリアは当業者に周知である。一般的に、その抗原を生理食塩水、好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント中で混合または乳化し、そしてその混合物またはエマルジョンを非経口的に（一般的に皮下または筋肉内に）注射することによって、免疫化を行う。一般的に２〜６週間後に、生理食塩水中（好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いる）の抗原を１回またはそれ以上注射することによって、その動物を追加免疫化する。抗体をまた、当該分野で公知の方法を用いて、インビトロ免疫化によって産生し得る。次いでポリクローナル抗血清を、免疫した動物から得る。

【0069】

モノクローナル抗体を、一般的にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［４５］の方法、またはそれを改変した方法を用いて調製する。典型的には、マウスまたはラットを、上記で記載したように免疫化する。ウサギも使用し得る。しかし、血清を抽出するために動物から採血するのではなく、脾臓（および任意でいくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一の細胞に分離する。望ましい場合、細胞懸濁物を、抗原をコーティングしたプレートまたはウェルに加えることによって、その脾臓細胞をスクリーニングし得る（非特異的接着細胞を除去した後に）。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、懸濁物の残りと共に洗い流されることはない。結果として生じたＢ細胞、または全ての分離した脾臓細胞を、次いで骨髄腫細胞と融合するように誘導して、ハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）で培養する。結果として生じたハイブリドーマを、限界希釈によってプレートに入れ、そして免疫抗原に特異的に結合する（そして無関係な抗原に結合しない）抗体の産生に関してアッセイする。次いで選択したモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを、インビトロ（例えば組織培養ビンまたは中空繊維リアクターで）、またはインビボ（例えばマウスの腹水で）のいずれかで培養する。

【0070】

本発明はまた、本発明のポリペプチドを検出するためのキットおよび方法を提供する。ポリペプチドを検出するための当該分野で公知のあらゆる方法を使用し得る。そのような方法は、質量分析、免疫拡散法、免疫電気泳動、免疫化学的方法、バインダー−リガンドアッセイ、免疫組織化学的技術、凝集および補体アッセイを含むがこれに限らない［４６］。

【0071】

本発明はまた、天然抗体または本発明の抗体のいずれかの抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体のＡＲＶＤ ＶＰ６抗原との相互作用を検出することを含む、生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤ ＶＰ６抗原または抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体の存在または非存在を検出することによって、生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤの存在または非存在を決定するための方法を提供する。

【0072】

「天然抗体」は、被験体から得た生物学的サンプルに存在する抗体であり、ここで、その被験体は、ＡＲＶＤ ＶＰ６に曝露され、そしてそれに対する免疫反応を起こし、結果として抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体を産生した。その被験体は、哺乳類または鳥類であり得る。１つの実施態様において、その被験体はニワトリである。別の実施態様において、その被験体は発育鶏卵である。

【0073】

イムノアッセイのデザインには、非常に多くのバリエーションがあり、そして多くの方式が当該分野で公知である。プロトコールは、例えば固体支持体、または免疫沈降を使用し得る。ほとんどのアッセイは、標識した抗体またはポリペプチドの使用を含む；その標識は、例えば酵素、蛍光、化学発光、放射性、または色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイも公知である；その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイのような酵素標識および媒介イムノアッセイである。

【0074】

そのイムノアッセイは、制限無しに、不均質な、または均質な方式であり得、そして標準的な、または競合的な型であり得る。不均質な方式において、そのポリペプチドを、典型的には固体マトリックスまたは支持体に結合して、インキュベーション後のサンプルのポリペプチドからの分離を容易にする。使用し得る固体支持体の例は、ニトロセルロース（例えば膜、またはマイクロタイターウェルの形態で）、ポリ塩化ビニル（例えばシートまたはマイクロタイターウェルで）、ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレートで）、フッ化ポリビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、マイクロチップ、高または低密度バイオチップ、組換えイムノアッセイ（ＲＩＢＡ）、微小流動デバイス、マイクロ磁気ビーズ、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズである。例えば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＩｍｍｕｎｌｏｎまたはＩｍｍｕｎｌｏｎ２マイクロタイタープレートまたは０．２５インチポリスチレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂａｌｌ）を、不均質な方式で使用し得る。抗原性ポリペプチドを含む固体支持体を、典型的にはそれをテストサンプルと分離した後に、および結合した抗体の検出の前に洗浄する。標準的なおよび競合的な方式の両方が、当該分野で公知である。

【0075】

均質な方式において、そのテストサンプルを、溶液中で抗原の組み合わせとインキュベートする。例えば、それは、形成された任意の抗原抗体複合体が沈殿する条件下であり得る。これらのアッセイの標準的および競合的方式の両方が、当該分野で公知である。

【0076】

標準的な方式において、抗体−抗原複合体における抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体の量を検出する。これを、抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体上のエピトープを認識する標識した抗異種（例えば抗ニワトリ）抗体が、複合体形成を原因として結合するか否かを決定することによって達成し得る。競合的な方式において、サンプル中の抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体の量を、複合体における公知の量の標識抗体（または他の競合リガンド）の結合に対する競合的効果をモニターすることによって推測する。

【0077】

抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体を含む形成された複合体（または競合的アッセイの場合は、競合する抗体の量）を、方式に依存して、多くの公知の技術のいずれかによって検出する。例えば、複合体における非標識抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体を、標識（例えば酵素標識）と複合体化した抗異種Ｉｇの結合体を用いて検出し得る。

【0078】

免疫沈降または凝集アッセイ方式において、ＡＲＶＤ抗原と抗体との間の反応は、溶液または懸濁物から沈殿するネットワークを形成し、そして沈殿の目に見える層またはフィルムを形成する。テスト検体に抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗体が存在しない場合、目に見える沈殿は形成されない。

【0079】

少なくとも３つの特異的な型の粒子凝集（ＰＡ）アッセイが存在する。これらのアッセイを、支持体にコーティングされた様々な抗原に対する抗体を検出するために使用する。このアッセイの１つの型は、ＲＢＣへの抗原（または抗体）の受動的吸着で感作した赤血球（ＲＢＣ）を用いた赤血球凝集アッセイである。体の成分に存在する特異的抗原抗体（あれば）の添加は、精製抗原でコーティングされたＲＢＣの凝集を引き起こす。

【0080】

赤血球凝集アッセイにおいて、潜在的な非特異的反応を排除するために、ＰＡにおいてＲＢＣの代わりに２つの人工的キャリアを使用し得る。これらのうち最も一般的なものは、ラテックス粒子である。しかし、ゼラチン粒子も使用し得る。これらのキャリアのいずれかを利用するアッセイは、精製抗原でコーティングされた粒子の受動的な凝集に基づく。

【0081】

抗ＡＲＶＤ ＶＰ６抗原を、典型的にはこれらのイムノアッセイにおいて使用するためのキットの形態にパッケージングする。そのキットは通常、別々の容器に、ＡＲＶＤ ＶＰ６抗原、コントロール抗体処方物（ポジティブおよび／またはネガティブ）、アッセイ形態がそれを必要とする場合は標識抗体、およびその標識が直接シグナルを生じない場合にシグナル産生試薬（例えば酵素基質）を含む。ＡＲＶＤ ＶＰ６抗原は、既に固体マトリックスに結合していてもよく、またはそれをマトリックスに結合する試薬を伴って、別々であってもよい。アッセイを行うための説明書（例えば書いたもの、ＣＤ−ＲＯＭ等）が、通常そのキットに含まれる。

【0082】

本発明の代替の実施態様において、生物学的サンプルにおけるＡＲＶＤの存在または非存在を、免疫組織化学的な手段によって決定し得る（サンプル中の特異的抗原を調べるために抗体を使用する）。当該分析は、当分野において標準的であり、ここで、組織における抗原の検出は、免疫組織化学として公知であり、一方培養細胞における検出は、一般的に免疫細胞化学と呼ばれる。簡単には、その特異的抗原への結合によって検出される一次抗体がある。その抗体−抗原複合体に、次いで酵素結合二次抗体を結合させる。必要な基質および色素原の存在下で、結合した酵素は、抗体−抗原結合部位における着色した沈着物によって検出される。幅広い範囲の適当なサンプルの型、抗原−抗体親和性、抗体の型、および検出増強法が存在する。従って、免疫組織化学的または免疫細胞化学的検出のための最適な条件を、個々の場合それぞれに関して、当業者が決定しなければならない。

【0083】

生物学的サンプルにおけるＡＲＶＤの存在または非存在に関する、本発明のイムノアッセイ、免疫組織化学的検出および免疫細胞化学的検出の方法は、家禽の群れ、および特にニワトリの群れにおいて、ＡＲＶＤの感染に関してスクリーニングするために特に有用である。ＡＲＶＤの存在に関する家禽のスクリーニングを、ＲＳＳおよびＭＡＳの大発生を制御または予防するための方法において使用し得る。

【0084】

本発明のイムノアッセイ、免疫組織化学的検出および免疫細胞化学的検出の方法はまた、ＡＲＶＤの存在または非存在に関して家禽の卵をスクリーニングするために有用である。ＡＲＶＤの存在または非存在に関する卵のスクリーニングを、ワクチン産生に使用する卵が、ＡＲＶＤフリーであることを保証するために使用し得る。

【0085】

本発明はまた、卵におけるＡＲＶＤの存在または非存在を検出することを含む、卵がＡＲＶＤを含まないことを証明するための方法を提供する。本発明のポリペプチドまたは抗ＡＲＶＤ抗体の存在または非存在を検出するための、上記で記載したあらゆる方法を、卵がＡＲＶＤフリーであることを証明するために使用し得る。

【0086】

上記で記載した方法において、その卵はニワトリ卵であり得る。さらなる実施態様において、その卵は発育鶏卵であり、そして特にワクチン産生に使用するための発育鶏卵である。産生されるワクチンは、インフルエンザワクチンであり得る。

【0087】

本発明の抗体は、好ましくは、精製されたかまたは実質的に精製された形態で提供される。典型的には、その抗体は、実質的に他のポリペプチドを含まない組成物中に存在し、例えばここで、組成物の９０％未満（重量で）、通常６０％未満、そしてより通常には５０％未満が、他のポリペプチドから構成されている。

【0088】

ワクチン
本発明はまた、ＡＲＶＤによる感染に対する処置または保護のためのワクチンを提供し、そして１つの実施態様において、ＲＳＳおよび／またはＭＡＳの処置または予防のために使用する。本発明のワクチン処方物は、本発明のポリペプチドを含む弱毒化ＡＲＶＤウイルス、またはＡＲＶＤ ＶＰ６抗原を含む１つまたはそれ以上のＡＲＶＤウイルス抗原の組換えまたは精製サブユニット処方物を含む。ワクチン処方物は、アジュバントをさらに含み得る。

【0089】

本発明は、本明細書中で記載したような、ＶＰ６ポリペプチド配列を有する弱毒化ＡＲＶＤウイルスを含む組成物を含む。この組成物を、予防的または治療的ＡＲＶＤウイルスワクチンとして使用し得る。ウイルスを弱毒化する方法は、当該分野で公知である。そのような方法は、ＡＲＶＤウイルスが弱毒化した機能を示すまで、培養細胞物（例えば鳥類または哺乳類細胞培養物）においてＡＲＶＤウイルスを連続継代することを含む。ウイルスが増殖する温度は、組織継代培養弱毒化が起こるあらゆる温度であり得る。細胞培養物における１回またはそれ以上の継代後に、ＡＲＶＤウイルスの機能の弱毒化を、当業者が測定し得る。本明細書中で使用される場合、弱毒化は、家禽被験体、特にニワトリにおけるＡＲＶＤウイルスのビルレンスの減少を指す。機能弱毒化の証拠を、ウイルス複製のレベルの減少、または動物モデルにおけるビルレンスの減少によって示し得る。

【0090】

特定の実施態様において、そのＡＲＶＤを、ＶＰ６ポリペプチドをコードする核酸配列に変異を導入することによって弱毒化する。

【0091】

弱毒化ＡＲＶＤウイルスを産生する他の方法は、最適以下または「冷たい」温度における細胞培養物におけるウイルスの継代、およびランダム変異誘発（例えば化学的変異誘発）または部位特異的変異誘発による、ＡＲＶＤウイルスゲノムへの弱毒化変異の導入を含む。弱毒化ＲＳＶワクチンの調製および産生（その方法は一般的にＡＲＶＤウイルスに適用可能である）が、例えば参考文献４７から５０において開示されている。

【0092】

本発明は、本発明のポリペプチド由来の単離または精製ＡＲＶＤウイルス抗原を含む組成物を含む。特に、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその抗原性断片を含むワクチン組成物を提供する。その組成物はさらに、１つまたはそれ以上のアジュバントを含み得る。

【0093】

ＡＲＶＤウイルス抗原を、細胞培養物において増殖したＡＲＶＤウイルスから単離または精製し得る。あるいは、ＡＲＶＤウイルス抗原を、当該分野で公知の方法によって、組換え的に産生し得る。

【0094】

本発明で使用するＡＲＶＤウイルス抗原を、当該分野で公知である、様々な異なる発現システム；例えば哺乳類細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母と共に使用されるものにおいて産生し得る。そのような発現システムは、典型的には本発明のウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを使用する。そのような配列を、本明細書中で列挙したアミノ酸配列を翻訳することを含む、分子生物学の標準的な技術を用いて得ることができる。よって、本発明は、本発明のウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。それに加えて、本発明のウイルス抗原を、合成化学的方法によって産生し得る（少なくとも部分的に、好ましくは全部）。

【0095】

本発明のワクチンを、筋肉内もしくは皮下注射、眼内投与、鼻腔内投与、または経口投与を含む、ワクチン投与のための当該分野で公知のあらゆる経路によって投与し得る。１つの実施態様において、本発明のＡＲＶＤワクチンは、経口投与のために適当である。特に、そのワクチンを、飲用水を用いて家禽の群れに投与し得る。

【0096】

一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得、または何かさらなるものを含み得る（例えばＸ＋Ｙ）。

【0097】

「実質的に」という用語は、「完全に」を排除しない。例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まない場合もある。必要な場合、「実質的に」という用語を、本発明の定義から省略し得る。

【0098】

数値ｘに関連する「約」という用語は、任意であり、そして例えばｘ±１０％を意味する。

【0099】

２つの配列間の配列同一性パーセントへの言及は、アラインメントさせた場合に、２つの配列を比較してそのパーセントのモノマーが同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性パーセントを、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献５１の７．７．１８節において記載されたものを用いて決定し得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性を、好ましくはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム［５２］によって、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１のデフォルトパラメーターで、アフィンギャップ検索を用いて決定する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し得る。

【0100】

上記の本文において示すように、本発明の核酸およびポリペプチドは、以下のような配列を含み得る：
（ａ）配列番号１から４由来の配列と同一である（すなわち１００％同一）；
（ｂ）配列番号１から４由来の配列と、配列同一性を共有する；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の単一のヌクレオチドまたはアミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を有し、それらは別々の位置にあっても、または隣接していてもよい；および
（ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて、配列番号１から４由来の特定の配列とアラインメントさせた場合に、ｘ個のモノマー（アミノ酸またはヌクレオチド）の移動ウィンドウが、開始（Ｎ末端または５’）から末端（Ｃ末端または３’）へ移動し、ｐ個のモノマー（ここでｐ＞ｘ）にわたるアラインメントに関してｐ−ｘ＋１個のそのようなウィンドウが存在し、ここで、それぞれのウィンドウは少なくともｘ・ｙ個の同一のアラインメントしたモノマーを有する。ここで：ｘは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択される；ｙは０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択される；そしてｘ・ｙが整数でない場合、それを一番近い整数に切り上げる。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメーター（例えばギャップオープンペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用）を用いた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［５３］である。このアルゴリズムを、ＥＭＢＯＳＳパッケージ［５４］におけるｎｅｅｄｌｅツールにおいて簡便に実行する。

【0101】

本発明の核酸およびポリペプチドは、さらに、これらの配列（ａ）から（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’に、さらなる配列を有し得る。

【0102】

本発明の実施は、他に示さなければ、当該分野の技術の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、参考文献５５〜６２等を参照のこと。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）配列番号１または配列番号２に示す核酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列；
（ｂ）配列番号１または配列番号２に示す核酸配列の逆相補体に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列；
（ｃ）配列番号１および／または２に示す核酸配列の断片であって、配列番号１および／または２からの少なくとも２４個の連続的なヌクレオチドからなる、断片；
（ｄ）配列番号１および／または２に示す核酸配列の逆相補体の断片であって、配列番号１および／または２の逆相補体の少なくとも１０個の連続的なヌクレオチドからなる、断片；または
（ｅ）配列番号１または配列番号２に示す核酸配列に、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸配列
を含む、核酸。
（項目２）
検出可能な標識をさらに含む、項目１に記載の核酸。
（項目３）
項目１に記載のＡＲＶＤウイルス核酸に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマーを含むキットであって、該キットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、ここで、該第１のプライマーは、該鋳型配列の一部に実質的に相補的な配列を含み、該第２のプライマーは、該鋳型配列の相補体の一部に実質的に相補的な配列を含み、ここで、実質的な相補性を有する該プライマー内の該配列は、増幅される該鋳型配列の末端を規定する、キット。
（項目４）
上記鋳型配列の一部に実質的に相補的か、または該鋳型配列の逆相補体の一部に実質的に相補的であるプローブ配列をさらに含む、項目３に記載のキット。
（項目５）
上記鋳型配列が、配列番号１または配列番号２に示す核酸配列に含まれる、項目３または項目４に記載のキット。
（項目６）
ＡＲＶＤ感染を診断するための、または生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤウイルスの存在もしくは非存在を同定するための方法であって、項目１に記載の核酸分子の存在または非存在を検出する工程を含む、方法。
（項目７）
（ａ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号３および／または４に示すアミノ酸配列の断片であって、配列番号３および／または４に由来する少なくとも８個の連続的なアミノ酸からなる、断片
を含む、ポリペプチド。
（項目８）
項目７に記載のポリペプチドおよび／またはその抗原性断片に特異的に結合する抗体。
（項目９）
モノクローナル抗体である、項目８に記載の抗体。
（項目１０）
鳥類の抗体である、項目８に記載の抗体。
（項目１１）
生物学的サンプルにおいてＡＲＶＤ抗原の存在または非存在を検出するためのイムノアッセイであって、該サンプルを項目８から１０のいずれか一項に記載の抗体と接触させる工程を含む、イムノアッセイ。
（項目１２）
上記生物学的サンプルが卵である、項目６に記載の方法または項目１１に記載のイムノアッセイ。
（項目１３）
ＡＲＶＤに対する処置またはＡＲＶＤからの保護のためワクチンであって、項目７に記載のポリペプチドを含む、ワクチン。

【図面の簡単な説明】

【0103】

【図1】図１は、連続希釈物（２倍）中のＡＲＶＤポジティブサンプルおよびネガティブコントロール（水）の増幅プロットである。

【図2】図２は、配列番号１および配列番号２のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントである。

【図3】図３は、配列番号３および配列番号４のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントである。

【発明を実施するための形態】

【0104】

材料および方法
腸内容物サンプル
腸内容物を、１０日齢の発育阻害ヒヨコから収集した。このヒヨコの腸内容物において、多数のＡＲＶＤの粒子が、ＰＡＧＥによって同定された。サンプルの調製、ウイルスｄｓＲＮＡの単離およびＰＡＧＥは、参考文献６において記載された。

【0105】

Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ Ｍｉｎｉキット、ＶＰ６ゲノムセグメントのゲル抽出
ウイルスｄｓＲＮＡの増幅およびクローニング（参考文献６３によって記載された改変された方法）
オリゴライゲーション：１０μｌのｄｓＲＮＡ、２．５μｌのプライマーＰＣ３ １００μＭ、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤、２．５μｌのＢＳＡ、２．５μｌのＡＴＰ １０ｍＭ、４μｌのＲＮＡリガーゼ、２．７５μｌの緩衝液および２．５μｌのＰＥＧ４０００を、１７℃で２４時間インキュベートした。ライゲーションしたｄｓＲＮＡを、ＴＥ緩衝液中で１００μｌに希釈し、そして製造会社によって記載されたように、エッペンドルフゲル抽出カラムで精製した。溶出液に、１μｌのオリゴＴ１７、１００μＭおよび１．５μｌのＤＭＳＯを加え、そしてサーモサイクラーで２分間、９９℃でインキュベートし、そして氷上で冷却した。この工程のすぐ後に、以下の試薬を加えた：２μｌの水、１μｌのＲｉｂｏｌｏｃｋ、１．５μｌのＴＲＩＳ ｐＨ８．３ １Ｍ、６μｌのＭｇＣＬ２ ５０ｍＭ、２．１μｌのＫＣｌ １Ｍ、６μｌのｄＮＴＰ ２．５ｍＭ、０．３５μｌのＡＭＶ逆転写酵素。その反応物を、４２℃で４５分間インキュベートし、続いて５０℃で１５分間インキュベートした。１μｌのＥＤＴＡ １Ｍを加えることによって、反応を停止させた。３．４μｌのＮａＯＨ １Ｍを加え、そして６５℃で３０分間インキュベートすることによって残りのＲＮＡを除去した。

【0106】

４．３μｌのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５、１Ｍ）および４．３μｌのＨＣｌ（１Ｍ）を加えた後に、ｃＤＮＡのアニーリングを、６５℃で１時間行った。５μｌのｃＤＮＡ反応物を、５μｌのＥｘＴａｑ緩衝液、４μｌのｄＮＴＰ ２．５ｍＭ、１μｌのＰＣ２プライマー １００μＭ、１μｌのＥｘＴａｑを含む５０μｌのＰＣＲ反応物に加えた。７２℃で５分間のプレインキュベーションの間に、ｃＤＮＡの部分的なオーバーハングが埋められる。これに続いて、９４℃で２分間のインキュベーション、さらに９４℃で３０秒間、６７℃で３０秒間、および７２℃で５分間の３０サイクルを行う。ＰＣＲ増幅産物の質および量を、アガロースゲル電気泳動によってチェックした。ＰＣＲ産物をＴ／Ａクローニングによってクローニングし、そして配列決定した。

【0107】

ｑＲＴ−ＰＣＲ
１〜４μｌのｄｓＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ウイルスＲＮＡ Ｍｉｎｉ キットで抽出した）に、３μｌの各１０μＭのプライマーを加え（ＡＲＶＤフォワード

【0108】

【化4】

（配列番号２４）およびＡＲＶＤリバース

【0109】

【化5】

（配列番号２５））、そして９９℃で１０分間変性させた。ＰＣＲチューブを、氷上で冷却し、そしてマスターミックス（１０μｌのエッペンドルフＲｅａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ ＲＴプローブ２．５×、０．５μｌのＡＲＶＤ１０μＭプローブ（

【0110】

【化6】

（配列番号２６））、０．２５μｌのｒｅａｌＭａｓｔｅｒＲＴ酵素、０．２５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤溶液）およびＰＣＲグレードの水を、全部で２５μｌまで加えた。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３０００ＰリアルタイムＰＣＲ機で、逆転写を５０℃で３０分間行い、続いて最初の変性を９５℃で２分間、さらに９５℃で１０秒間の変性および６０℃で３０秒間のアニーリング／増幅の２工程のサイクルを４５回行った。

【0111】

結果
ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を図１に示す。増幅した断片の配列を、配列番号１に示す。

【0112】

完全なＡＲＶＤ ＶＰ６ヌクレオチド配列を、配列番号２に示す。コードされたポリペプチド配列を、配列番号４に示す。

【0113】

本発明を、ほんの一例によって説明した。本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら修飾を行い得ることが理解される。

【0114】

【表1】

【0115】

【表2】

【0116】

【数1】

【0117】

【数2】

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]