特許 6007310 ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に対する二重特異性抗体並びにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6007310

(24)【登録日】2016年9月16日

(45)【発行日】2016年10月12日

(54)【発明の名称】ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に対する二重特異性抗体並びにその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20160929BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20160929BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20160929BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160929BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20160929BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160929BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20160929BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20160929BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20160929BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160929BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20160929BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20160929BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20160929BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46ZNA

   C07K16/28

   C07K16/24

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

   A61K39/395 N

   A61P29/00 101

   A61P29/00

   A61P19/02

   A61P37/06

【請求項の数】20

【全頁数】69

(21)【出願番号】特願2015-503864(P2015-503864)

(86)(22)【出願日】2013年4月3日

(65)【公表番号】特表2015-514102(P2015-514102A)

(43)【公表日】2015年5月18日

(86)【国際出願番号】EP2013056970

(87)【国際公開番号】WO2013150043

(87)【国際公開日】20131010

【審査請求日】2014年12月2日

(31)【優先権主張番号】12163396.0

(32)【優先日】2012年4月5日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(74)【代理人】

【識別番号】100078662

【弁理士】

【氏名又は名称】津国 肇

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(74)【代理人】

【識別番号】100146031

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 明夫

(74)【代理人】

【識別番号】100145104

【弁理士】

【氏名又は名称】膝舘 祥治

(74)【代理人】

【識別番号】100122736

【弁理士】

【氏名又は名称】小國 泰弘

(74)【代理人】

【識別番号】100122747

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 洋子

(74)【代理人】

【識別番号】100132540

【弁理士】

【氏名又は名称】生川 芳徳

(72)【発明者】

【氏名】アウアー，ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】バダー，マルティン

(72)【発明者】

【氏名】フィッシャー，イェンス

(72)【発明者】

【氏名】ケッテンベルガー，フーベルト

(72)【発明者】

【氏名】ケーニヒ，マクシミリアーネ

(72)【発明者】

【氏名】ローレンツ，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】モルケン，イェルク

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／１０２２５１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１１／１６３４７８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１２／０１８７９０（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００− １９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００− １５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含み、
ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
ａ）配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２２のＣＤＲ３Ｌ；又は
ｂ）配列番号１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ、配列番号３のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号４のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ、配列番号６のＣＤＲ３Ｌ；又は
ｃ）配列番号９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１１のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号１２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号１４のＣＤＲ３Ｌを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号４７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号４９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号５０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５２のＣＤＲ３Ｌを含むことを特徴とする、
二重特異性抗体。

【請求項2】

ａ）０．２nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＴＷＥＡＫ誘導性増殖を阻害し；且つ
ｂ）３．０nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ６サイトカイン刺激を阻害し；且つ
ｃ）２．０nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ８サイトカイン刺激を阻害する、請求項１に記載の二重特異性二価抗体。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の二重特異性抗体のキメラ又はヒト化変異体。

【請求項4】

ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４又は配列番号３５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５又は配列番号４６の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５５又は配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７又は配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
ａ）配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むか；又は
ｂ）配列番号５５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【請求項9】

少なくとも１本の重鎖に突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

少なくとも１本の重鎖に突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

少なくとも１本の重鎖に突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

少なくとも１本の重鎖に突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする、医薬組成物。

【請求項14】

医薬組成物を製造するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体の使用。

【請求項15】

炎症性疾患、自己免性疫疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス及びループス腎炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の処置に使用するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体。

【請求項16】

炎症性疾患、自己免性疫疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス及びループス腎炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患を処置するための医薬品を製造するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体の使用。

【請求項17】

請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体をコードする、核酸。

【請求項18】

原核又は真核ホスト細胞において請求項１〜１２のいずれかに記載の二重特異性抗体を発現させるための発現ベクターであって、請求項１７に記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。

【請求項19】

請求項１８に記載のベクターを含む、原核又は真核ホスト細胞。

【請求項20】

請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体のリコンビナントを生産するための方法であって、原核又は真核ホスト細胞において請求項１７に記載の核酸を発現させること、及び前記細胞又は細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に対する二重特異性抗体（二重特異性ＴＷＥＡＫ−ＩＬ１７抗体）、それらの生産方法、前記抗体を含有する医薬組成物、及びそれらの使用に関する。

【0002】

発明の背景
ヒトＴＷＥＡＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ４３５０８、ＴＮＦ関連アポトーシス弱誘導因子；配列番号６８）は、細胞表面に結合したＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＷＥＡＫは、Chicheportiche, Y., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 32401-32410; Marsters, S.A., et al., Curr. Biol. 8 (1998) 525-528; Lynch, C.N., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 8455-8459に記載されている。ＴＷＥＡＫの活性型は、可溶性のホモトリマーである。ヒト及びマウスのＴＷＥＡＫは、レセプター結合ドメインにおいて９３％の配列同一性を示す。ＴＷＥＡＫレセプターＦｎ１４（線維芽細胞成長因子誘導性の１４kDaのタンパク質）は、リガンド結合ドメインにおける単一システインリッチドメインからなる１２９アミノ酸（ａａ）のＩ型膜貫通タンパク質（配列番号９８）である。ＴＷＥＡＫのシグナル伝達は、ＮＦ−ΚＢ経路の活性化を介して起こる。ＴＷＥＡＫ ｍＲＮＡは様々な組織において発現され、大半の主要臓器、例えば心臓、脳、骨格筋及び膵臓、免疫系に関連する組織、例えば脾臓、リンパ節及び胸腺に見られる。Ｆｎ１４ ｍＲＮＡは、心臓、脳、肺、胎盤、血管ＥＣ及び平滑筋細胞において検出されている。ＴＷＥＡＫヌル及びＦｎ１４ヌルノックアウトマウスは生存可能で健康で繁殖性であり、より多くのナチュラルキラー細胞を有し、増強された自然炎症応答を示す。ＴＷＥＡＫは、アポトーシス、増殖、血管新生、虚血半影、脳浮腫、多発性硬化症に関与している。

【0003】

抗ＴＷＥＡＫ抗体は、国際公開第1998/005783号、国際公開第2000/042073号、国際公開第2003/086311号、国際公開第2006/130429号、国際公開第2006/130374号、国際公開第2006/122187号、国際公開第2006/089095号、国際公開第2006/088890号、国際公開第2006/052926号に記載されている。

【0004】

ヒトＩＬ−１７Ａ（ＣＴＬＡ−８、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ１６５５２、ＩＬ−１７又はＩＬ１７とも命名されている；配列番号７０））は、一部の記憶Ｔ細胞（Ｔｈ１７と称される）によって産生される炎症促進性サイトカインであり、ＭＳの病因に関与している。ＩＬ−１７Ａは、他の炎症性サイトカイン、ケモカイン及び接着分子の誘導において役割を果たす。ＩＬ−１７Ａ中和抗体による動物の処置は、自己免疫性脳脊髄炎の疾患発生率及び重症度を低下させる（Komiyama, Y. et al., J. Immunol. 177 (2006) 566-573）。ＩＬ−１７Ａは、ＭＳ患者の脳脊髄液で過剰発現している（Hellings, P.W. et al.,Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50; Matusevicius, D. et al., MultipleSclerosis 5 (1999) 101-104；国際公開第2005/051422号）。加えて、ＩＬ−１７Ａ中和抗体はコラーゲン誘導関節炎のマウスＲＡモデルの重症度及び発生率を軽減し、ＲＡ患者由来の炎症関節滑液では高レベルのＩＬ−１７Ａを検出することができる（Ziolkowska, M,. et al., J. Immunol. 164 (2000) 2832-2838; Kotake, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 1345-1352; Hellings, P.W., et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50）。

【0005】

国際公開第96/17939号、米国特許第5,716,623号；国際公開第95/18826号；国際公開第97/15320号；国際公開第99/35276号及び国際公開第00/69436号国際公開第95/18826号、米国特許第6,274,711号、米国特許第6,274,711号、国際公開第97/15320号、米国特許第6,063,372号、国際公開第2006/013107号及び国際公開第2008/02115号は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ａに対する抗体に関する。国際公開第2010/102251号は、ＩＬ１７結合タンパク質に関する。

【0006】

二重特異性抗体
多種多様なリコンビナント抗体フォーマットが近年に開発され、例えばＩｇＧ抗体フォーマット及び単鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体などである（例えば、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163;国際公開第2001/077342号;及びMorrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234を参照のこと）。

【0007】

また、２つ以上の抗原に結合することができる抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）がもはや保持されていないいくつかの他の新たなフォーマット、例えばダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディ、ミニボディ、いくつかの単鎖フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）が開発されている（Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297）。

【0008】

すべてのこのようなフォーマットは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）をさらなる結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）に融合するために、又は例えば２つのＦａｂフラグメント若しくはｓｃＦｖを融合するためにリンカーを使用する（Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14）。天然に存在する抗体に対して高度の類似性を維持することによって、エフェクター機能、例えばＦｃレセプター結合によって媒介される補体依存細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などを保持することが求められ得ることに留意しなければならない。

【0009】

国際公開第2007/024715号では、人工的な多価及び多重特異性結合タンパク質として二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物学的に活性な抗体二量体の調製方法が米国特許第6,897,044号に報告されている。ペプチドリンカーによって互いに連結された少なくとも４つの可変ドメインを有する多価ＦＶ抗体構築物が米国特許第7,129,330号に報告されている。二量体及び多量体抗原結合構造が米国特許出願公開第2005/0079170号に報告されている。結合構造によって互いに共有結合された３つ又は４つのＦａｂフラグメントを含む三価又は四価単一特異性抗原結合タンパク質であって、天然免疫グロブリンではないタンパク質が米国特許第6,511,663号に報告されている。国際公開第2006/020258号では、原核及び真核細胞で効率的に発現させることができ、治療及び診断方法に有用な四価二重特異性抗体が報告されている。２種類のポリペプチド二量体を含む混合物から、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されていない二量体から、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結された二量体を分離するか又は選択的に合成する方法が米国特許出願公開第2005/0163782号に報告されている。二重特異性四価レセプターが米国特許第5,959,083号に報告されている。３つ以上の機能的抗原結合部位を有する人工的な抗体が国際公開第2001/077342号に報告されている。

【0010】

多重特異性及び多価抗原結合ポリペプチドが国際公開第1997/001580号に報告されている。国際公開第1992/004053号では、同じ抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から典型的に調製されるホモコンジュゲートを、合成架橋結合によって共有結合することが報告されている。抗原に対して高アビディティを有するオリゴマーモノクローナル抗体が国際公開第1991/06305号に報告されており、それにより、四価又は六価のＩｇＧ分子を形成する２つ以上の免疫グロブリンモノマーを有するオリゴマー（典型的にはＩｇＧクラスのもの）が分泌される。インターフェロンガンマ活性が病原である疾患を処置するのに使用することができるヒツジ由来抗体及び人工的な抗体構築物が米国特許第6,350,860号に報告されている。米国特許出願公開第2005/0100543号では、二重特異性抗体の多価担体であるターゲティング可能な構築物（すなわち、ターゲティング可能な構築物の各分子が、２つ以上の二重特異性抗体の担体として機能し得る）が報告されている。遺伝子操作された二重特異性四価抗体が国際公開第1995/009917号に報告されている。国際公開第2007/109254号では、安定化ｓｃＦｖからなるか又は安定化ｓｃＦｖを含む安定化結合分子が報告されている。

【0011】

国際公開第2008/106131号は、ＩＬ２３及びＩＬ１７又はＴＮＦに対する二重特異性抗体に関する。国際公開第2007/027761号は、ＩＬ２３及びＩＬ１７に対する二重特異性抗体に関する。国際公開第2010/003108号は、ＴＮＦαアンタゴニストマルチターゲット結合タンパク質に関する。

【0012】

発明の概要
本発明の一態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体である。

【0013】

本発明の一実施態様では、二重特異性抗体は、
ａ）０．２nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＴＷＥＡＫ誘導性増殖を阻害し；且つ
ｂ）３．０nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ６サイトカイン刺激を阻害し；且つ
ｃ）２．０nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ８サイトカイン刺激を阻害する。

【0014】

本発明の一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体は、二価二重特異性抗体である。

【0015】

本発明の一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体は、
ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
ａ）配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２２のＣＤＲ３Ｌ；又は
ｂ）配列番号１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ、配列番号３のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号４のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ、配列番号６のＣＤＲ３Ｌ；又は
ｃ）配列番号９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１１のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号１２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号１４のＣＤＲ３Ｌを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号４７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号４９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号５０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５２のＣＤＲ３Ｌを含むことを特徴とする。

【0016】

本発明の一実施態様では、このような二重特異性抗体のキメラ又はヒト化変異体である。

【0017】

本発明の一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体は、
ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４又は配列番号３５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５又は配列番号４６の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５５又は配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７又は配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする。

【0018】

本発明の一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体は、
ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
ａ）配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むか；又は
ｂ）配列番号５５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする。

【0019】

本発明の一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体は、
ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする。

【0020】

本発明の一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体は、
ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；且つ
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする。

【0021】

一実施態様では、ＴＷＥＡＫ及びＩＬ１７に結合する二重特異性抗体であって、上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列フラグメントを特徴とする二重特異性抗体は、一実施態様では突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有し、一実施態様では突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１アイソタイプである。

【0022】

一実施態様では、ＴＷＥＡＫ及びＩＬ１７に結合する二重特異性抗体であって、上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列フラグメントを特徴とする二重特異性抗体は、一実施態様では突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅを有し、一実施態様では突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ４アイソタイプである。

【0023】

本発明のさらなる実施態様は、本発明の二重特異性抗体を含む医薬組成物である。

【0024】

本発明のさらなる実施態様は、医薬組成物を製造するための、本発明の二重特異性抗体の使用である。

【0025】

本発明のさらなる実施態様は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸である。

【0026】

本発明のさらなる実施態様は、本発明の二重特異性抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。

【0027】

本発明はさらに、原核又は真核ホスト細胞において前記核酸を発現することができる発現ベクターであって、本発明の核酸を含有する発現ベクター、及びこのような抗体のリコンビナント生産のためのこのようなベクターを含有するホスト細胞を提供する。

【0028】

本発明はさらに、本発明のベクターを含む原核又は真核ホスト細胞を含む。

【0029】

本発明はさらに、本発明のリコンビナントキメラ、ヒト又はヒト化抗体を生産するための方法であって、原核又は真核ホスト細胞において本発明の核酸を発現させること、及び前記細胞又は細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする方法を含む。本発明はさらに、このようなリコンビナント方法によって得られ得る抗体を含む。

【0030】

本発明の抗体は、ＴＷＥＡＫ及びＩＬ１７ターゲティング療法を必要とする患者に利益を示す。本発明の抗体は、ガン疾患を患っている、特に結腸ガン、肺ガン若しくは膵臓ガン又は炎症性疾患、特に自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を患っている患者に利益をもたらす新規かつ進歩的な特性を有する。

【0031】

本発明のさらなる実施態様は、ガン、炎症性疾患、自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷の処置に使用するための、本発明の二重特異性抗体である。

【0032】

本発明のさらなる実施態様は、ガン、炎症性疾患、自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を処置するための、特に全身性エリテマトーデス、ループス腎炎を処置するための医薬品を製造するための、本発明の二重特異性抗体である。

【0033】

本発明はさらに、ガン、特に結腸ガン、肺ガン若しくは膵臓ガン又は炎症性疾患、特に自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を患っている患者を処置するための方法であって、このような疾患を有すると診断された（従って、このような治療を必要とする）患者に、ＴＷＥＡＫ及びＩＬ１７に結合する有効量の本発明の二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。抗体は、好ましくは、医薬組成物で投与される。

【0034】

本発明はさらに、場合により、薬学的目的のための抗体の製剤化に有用な緩衝液及び／又はアジュバントと一緒に本発明の抗体を含む医薬組成物を含む。

【0035】

本発明はさらに、薬学的に許容しうる担体中に本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。一実施態様では、医薬組成物は、製品又はキットに含まれ得る。

【0036】

本発明の二重特異性抗体は、ＴＷＥＡＫ及びＩＬ１７ターゲティング療法の必要性があるヒト患者に利益を示し、有益な特性を有する。

【0037】

本発明の抗体は、このような疾患を患っている、特に、関節リウマチ又はループス腎炎などの炎症性疾患を患っている患者に利益をもたらす有益な特性を有する。このような有益な特性としては、ＴＷＥＡＫ及びＩＬ１７の両方を同時阻害して補完的な処置の恩恵をもたらすことが挙げられる。多くの患者が寛解のターゲットを達成することができないように、ＲＡには満たされていない持続的な高い医学的必要性がある。ＴＷＥＡＫ及びＩＬ１７の両方をターゲティングする二重特異性抗体は、ＩＬ−１７及びＴＷＥＡＫを阻害することによって有効性改善の機会を提供して、補完的な抗炎症及び抗血管形成活性並びに骨形成／吸収に対する最適な影響を提供する。ＴＷＥＡＫ発現は、ＲＡ及びＰｓＡ患者の滑膜組織−主にＣＤ５５^＋滑膜細胞及びＣＤ１６８^＋マクロファージで有意に増加している。（Van Kuijk, et al., Ann Rheum Dis 69 (2010) 301-304）。ＩＬ−１７Ａは炎症性滑膜組織で産生され、ＴＮＦ応答者ではＩＬ−１７がより低く、ＴＮＦ非応答者ではＩＬ−１７レベルがより高い（Moran, et al., Arthritis & Rheumatism 11 (2009) R113）。加えて、メサンギウム細胞、尿細管上皮細胞、内皮細胞に影響を与える腎炎、ケモカイン、サイトカインの上昇、好中球浸潤、並びにＩＬ−１７及びＴＷＥＡＫと疾患活性との正の相関関係におけるＩＬ−１７及びＴＷＥＡＫの役割が、入手可能なデータによって裏付けられている。尿のＴＷＥＡＫレベルは腎臓のＳＬＥＤＡＩスコアと相関しており、ＴＷＥＡＫは炎症中に上昇し、腎疾患特異的である（Schwartz, et al., J Autoimmunity 27 (2006) 242-25）。加えて、ＴＷＥＡＫの遮断は、急性腎損傷（ＡＫＩ）モデルにおける腎炎を軽減する（Sanz, et al., J Amer Soc Nephrol 19 (2008) 695-703）。ループス患者由来の組織ではＩＬ−１７の上昇が検出され、ＳＬＥを有する患者由来の罹患腎臓ではＩＬ−１７が検出される（Crispin, et al., J Immunol. 181 (2008) 8761-8766）。

【0038】

凝集（＞５５℃）における低粘性及び高安定性は、このような抗体を皮下適用可能な高濃度製剤に適切なものにする（He, F., et al., J Pharm Sci.100 (2010) 1330-1340）。

【0039】

一実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、（実施例４、１０、１１、１６、１７及び１９で決定したように）以下の特性の１つ以上をさらに特徴とする：二重特異性抗体は、
ａ）ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｄ、ＩＬ１７Ｆとの交差反応性を示さず（これは、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｄ及びＩＬ１７Ｆに対する結合が、ＩＬ１７Ａに対する結合（これを１００％と設定する）と比較して０％であることを意味する）；
ｂ）２．０nM以下のＩＣ５０値で（例えば、２．０nM〜０．０nMのＩＣ５０値で）、ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞のＩＬ１７誘導性ＩＬ８サイトカイン刺激を阻害し；
ｃ）５．０nM以下のＩＣ５０値で（例えば、５．０nM〜０．０nMのＩＣ５０値で）；好ましくは２．０nM以下のＩＣ５０値で、ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞のＩＬ１７誘導性ＩＬ６サイトカイン刺激を阻害し；
ｄ）４．０［ng/ml］以下のＩＣ５０値で（例えば、４．０［ng/ml］〜０．０［ng/ml］のＩＣ５０値で）；好ましくは３．０［ng/ml］以下のＩＣ５０値で、ヒトＴＷＥＡＫ／ヒトＦｎ１４相互作用；
ｅ）０．１nM以下の結合親和性のＫＤ値でヒトＴＷＥＡＫに結合し、０．３nM以下の結合親和性のＫＤ値でヒトＩＬ−１７に結合し；及び／又は
ｆ）ヒト＜ＴＷＥＡＫ＞及びヒト＜ＩＬ１７＞に同時に結合することができ、ここで、ヒト＜ＴＷＥＡＫ＞及びヒト＜ＩＬ１７＞の１：１混合物に対する二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体の結合の（表面プラズモン共鳴アッセイにおける）シグナル強度（RU単位）は、ａ）ヒト＜ＴＷＥＡＫ＞単独に対する二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体の結合のシグナル強度（RU単位）、及びｂ）ヒト＜ＩＬ１７＞単独に対する二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体の結合のシグナル強度（RU単位）の合計と比較して少なくとも同じであるか又は高い。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1a】本発明の二重特異性＜ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７＞抗体のための例示的な二重特異性二価抗体フォーマットを示す。

【図1b】本発明の二重特異性＜ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７＞抗体のための例示的な二重特異性二価抗体フォーマットを示す。

【図2】本発明の二重特異性＜ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７＞抗体のための１つの例示的な二重特異性四価抗体フォーマットを示す。

【0041】

発明の詳細な説明
本明細書で使用される場合、「抗体」は、抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「結合部位」又は「抗原結合部位」という用語は、リガンド（すなわち、抗原）が実際に結合する抗体分子の領域を示す。「抗原結合部位」という用語は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／若しくは抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又はＶＨ／ＶＬ対を含み、抗体全体又は抗体フラグメント、例えば単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２に由来し得る。本発明の一実施態様では、抗原結合部位はそれぞれ、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、好ましくは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる対によって形成される。本発明の特徴的な特性が保持されている限り、本発明の抗体は、好ましくは、ヒト化抗体、キメラ抗体又はさらに遺伝子操作された抗体である。

【0042】

ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する抗原結合部位、特に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ａ）例えば、国際公開第1998/005783号、国際公開第2000/042073号、国際公開第2003/086311号、国際公開第2006/130429号、国際公開第2006/130374号、国際公開第2006/122187号、国際公開第2006/089095号、国際公開第2006/088890号、国際公開第2006/052926号、国際公開第2010/115555号又は国際特許出願第PCT/EP2011/067070号に記載されている公知の抗ＴＷＥＡＫ抗体；又はｂ）例えば、とりわけヒトＴＷＥＡＫタンパク質若しくは核酸又はそれらのフラグメントのいずれかを使用してｄｅ ｎｏｖｏ免疫感作法によって、又はファージディスプレイ法によって得られる新たな抗ＴＷＥＡＫ抗体に由来し得る。

【0043】

ヒトＩＬ１７に特異的に結合する抗原結合部位、特に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ａ）例えば、国際公開第96/17939号、米国特許第5,716,623号；国際公開第95/18826号；国際公開第97/15320号；国際公開第99/35276号、国際公開第00/69436号、国際公開第95/18826号、米国特許第6,274,711号、米国特許第6,063,372号、国際公開第2006/013107号、国際公開第2008/02115号、国際公開第2010/102251号又は国際公開第2010/034443号に記載されている公知の抗ＩＬ１７抗体；又はｂ）例えば、とりわけヒトＩＬ１７タンパク質若しくは核酸又はそれらのフラグメントのいずれか使用してｄｅ ｎｏｖｏ免疫感作法によって、又はファージディスプレイ法によって得られる新たな抗ＩＬ１７抗体に由来し得る。

【0044】

ヒトＴＷＥＡＫ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ４３５０８、ＴＮＦ関連アポトーシス弱誘導因子；配列番号６８）は、細胞表面に結合したＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＷＥＡＫは、Chicheportiche, Y., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 32401-32410; Marsters, S.A., et al., Curr. Biol. 8 (1998) 525-528; Lynch, C.N., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 8455-8459に記載されている。ＴＷＥＡＫの活性型は、可溶性のホモトリマーである。ヒト及びマウスＴＷＥＡＫは、レセプター結合ドメインにおいて９３％の配列同一性を示す。ＴＷＥＡＫレセプターＦｎ１４（線維芽細胞成長因子誘導性の１４kDaのタンパク質）は、リガンド結合ドメインにおける単一システインリッチドメインからなる１２９ａａのＩ型膜貫通タンパク質（配列番号９８）である。ＴＷＥＡＫのシグナル伝達は、ＮＦ−ΚＢ経路の活性化を介して起こる。ＴＷＥＡＫ ｍＲＮＡは様々な組織において発現され、大半の主要臓器、例えば心臓、脳、骨格筋及び膵臓、免疫系に関連する組織、例えば脾臓、リンパ節及び胸腺に見られる。Ｆｎ１４ ｍＲＮＡは、心臓、脳、肺、胎盤、血管ＥＣ及び平滑筋細胞において検出されている。ＴＷＥＡＫヌル及びＦｎ１４ヌルノックアウトマウスは生存可能で健康で繁殖性であり、より多くのナチュラルキラー細胞を有し、増強された自然炎症応答を示す。ＴＷＥＡＫは、アポトーシス、増殖、血管新生、虚血半影、脳浮腫、多発性硬化症に関与している。

【0045】

ヒトＩＬ−１７Ａ（ＣＴＬＡ−８、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ１６５５２、ＩＬ−１７とも命名されている。ＩＬ１７；配列番号７０））は、一部の記憶Ｔ細胞（Ｔｈ１７と称される）によって産生される炎症促進性サイトカインであり、ＭＳの病因に関与している。ＩＬ−１７Ａは、他の炎症性サイトカイン、ケモカイン及び接着分子の誘導において役割を果たす。ＩＬ−１７Ａ中和抗体による動物の処置は、自己免疫性脳脊髄炎の疾患発生率及び重症度を低下させる（Komiyama, Y. et al., J. Immunol. 177 (2006) 566-573）。ＩＬ−１７Ａは、ＭＳ患者の脳脊髄液で過剰発現している（Hellings, P.W. et al.,Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50; Matusevicius, D. et al., MultipleSclerosis 5 (1999) 101-104；国際公開第2005/051422号）。加えて、ＩＬ−１７Ａ中和抗体はコラーゲン誘導関節炎のマウスＲＡモデルの重症度及び発生率を軽減し、ＲＡ患者由来の炎症関節滑液では高レベルのＩＬ−１７Ａを検出することができる（Ziolkowska, M. et al., J. Immunol. 164 (2000) 2832-2838; Kotake, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 1345-1352; Hellings, P.W. et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28 (2003) 42-50）。

【0046】

抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然の抗体は、例えば、単一特異性である。

【0047】

本発明の「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が１つよりも多くの特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原又は１つよりも多くの抗原に関連し得る。本発明の抗体は、２つの異なる抗原（すなわち、第１の抗原としてＴＷＥＡＫ及び第２の抗原としてＩＬ１７）に対して特異的である。

【0048】

本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。

【0049】

本出願で使用される場合、「価」という用語は、抗体分子における特定数の結合部位の存在を示す。このようなものとして、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、抗体分子におけるそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を示す。本発明の二重特異性抗体は少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば、「四価」又は「六価」）であり得る。一実施態様では、本発明の二重特異性抗体は二価、三価又は四価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は二価である。一実施態様で、前記二重特異性抗体は三価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は四価である。

【0050】

本発明の抗体は２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、２つよりも多くの結合部位が存在する（すなわち、抗体が三価又は多価である）場合でさえ、抗体は二重特異性であり得る。本発明の二重特異性抗体としては、例えば、多価単鎖抗体、ダイアボディ及びトリアボディ、並びにさらなる抗原結合部位（例えば、単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２）が１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が挙げられる。抗体は単一種由来の全長でもよいし、又はキメラ化若しくはヒト化されたものでもよい。２つよりも多くの抗原結合部位を有する抗体の場合、タンパク質が２つの異なる抗原に対する結合部位を有する限り、いくつかの結合部位が同一でもよい。すなわち、第１の結合部位はＴＷＥＡＫに対して特異的であり、第２の結合部位はＩＬ１７に対して特異的である（その逆もまた同様である）。

【0051】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子調製物を指す。

【0052】

「ヒト化抗体」という用語は、フレームワーク及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンと比較して異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変されている抗体を指す。好ましい実施態様では、「ヒト化抗体」を調製するために、非ヒト（例えば、マウス、ウサギ又はハムスター）ＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323 327;及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。

【0053】

「キメラ抗体」という用語は、マウス由来の可変領域（すなわち、結合領域）と、異なる起源又は種由来の定常領域の少なくとも一部とを含むモノクローナル抗体を指し、通常はリコンビナントＤＮＡ技術によって調製される。例えば、マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体。このようなマウス／ヒトキメラ抗体は、ラット免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子発現産物である。本発明によって包含される他の形態の「キメラ抗体」は、クラス又はサブクラスが元の抗体のものから改変又は変化されたものである。このような「キメラ」抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を生産するための方法は、当技術分野で現在周知の従来のリコンビナントＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855;米国特許第5,202,238号及び米国特許第5,204,244号を参照のこと。

【0054】

本明細書で使用される場合、「結合する」、「結合している」又は「特異的に結合する」という用語は、二重特異性抗体が、本発明によるヒトＴＷＥＡＫ及び／又はヒトＩＬ１７のターゲティングにおいて治療剤として有用であるように、十分な親和性で抗原のエピトープに結合することを指す。抗原（ヒトＴＷＥＡＫ又はヒトＩＬ１７のいずれか）のエピトープに対する二重特異性抗体の結合は、精製野生型ヒト抗原を用いる（好ましくは、ヒトＩＬ１７抗原の場合にはＩＬ１７Ａホモ二量体を用いる）ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ（例えば、BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden）において測定することができる（例えば、実施例１９を参照のこと）。結合の親和性は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合速度定数）、ｋｄ（解離定数）及びＫＤ（ｋｄ／ｋａ）という用語によって定義される。ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体は、１．０×１０^−８Ｍ以下、例えば１．０×１０^−８Ｍ〜１．０×１０^−１３Ｍ（一実施態様では、１．０×１０^−９Ｍ〜１．０×１０^−１３Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）でヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、１．０×１０^−８Ｍ以下、例えば１．０×１０^−８Ｍ〜１．０×１０^−１３Ｍ（一実施態様では、１．０×１０^−９Ｍ〜１．０×１０^−１３Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）でヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを有する二重特異性抗体を指す。

【0055】

「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、エピトープは、通常、特異的な三次元構造特徴及び特異的な電荷特性を有する。立体構造的エピトープ及び非立体構造的エピトープは、後者でなく前者に対する結合が変性溶媒の存在下で失われるという点で区別される。

【0056】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原結合部位が、配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２２のＣＤＲ３Ｌを含む抗体と同じヒトＴＷＥＡＫ上のエピトープに結合し；且つ
ｂ）第２の抗原結合部位が、配列番号４７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号４９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号５０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５２のＣＤＲ３Ｌを含む抗体と同じヒトＩＬ１７上のエピトープに結合することを特徴とする二重特異性抗体である。

【0057】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原結合部位が、配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含む抗体と同じヒトＴＷＥＡＫ上のエピトープに結合し；且つ
ｂ）第２の抗原結合部位が、配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含む抗体と同じヒトＩＬ１７上のエピトープに結合することを特徴とする二重特異性抗体である。

【0058】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原結合部位が、配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２２のＣＤＲ３Ｌを含む抗体と同じヒトＴＷＥＡＫ上のエピトープに対する結合について競合し；且つ
ｂ）第２の抗原結合部位が、配列番号４７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号４９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号５０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５２のＣＤＲ３Ｌを含む抗体と同じヒトＩＬ１７上のエピトープに対する結合について競合することを特徴とする二重特異性抗体である。

【0059】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体であって、
ａ）第１の抗原結合部位が、配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含む抗体と同じヒトＴＷＥＡＫ上のエピトープに対する結合について競合し；且つ
ｂ）第２の抗原結合部位が、配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含む抗体と同じヒトＩＬ１７上のエピトープに対する結合について競合することを特徴とする二重特異性抗体である。

【0060】

同じエピトープに対する結合について競合する（従って、同じエピトープに結合する可能性が高い）抗体は、例えば、実施例７に記載されているように表面プラズモン共鳴競合アッセイによって同定することができる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）、重鎖の可変ドメイン（Ｖ_Ｈ））は、抗原に対する抗体の結合に直接関与している軽鎖及び重鎖ドメインの対のそれぞれを示す。可変軽鎖及び重鎖ドメインは同じ一般的な構造を有し、各ドメインは、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、これらは３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続されている。フレームワーク領域はβシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲはβシート構造を接続するループを形成し得る。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によってその三次元構造が保持されており、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明の抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすので、本発明のさらなる目的を提供する。

【0062】

本明細書で使用される場合、「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端にドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を規定する。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義及び／又は「超可変ループ」からの残基に従って決定される。

【0063】

「ＣＤＲ１Ｈ」という用語は、Kabat(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))に従って計算された重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を示す。ＣＤＲ２Ｌ、ＣＤＲ３Ｈなどは、重鎖（Ｈ）又は軽鎖（Ｌ）からの各領域を意味する。例えば、配列番号３のＣＤＲ１Ｈを含むことを特徴とする抗原結合部位は、抗原結合部位が、その可変重鎖において重鎖可変鎖ＣＤＲ１領域としてこのアミノ酸配列を含むことを意味する。例えば、配列番号１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ、配列番号３のＣＤＲ３Ｈを含むことを特徴とする抗原結合部位は、抗原結合部位が、その重鎖において、ＣＤＲ１の配列として配列番号１、ＣＤＲ２の配列として配列番号２及びＣＤＲ３の配列として配列番号３を含むことを意味する。

【0064】

本明細書で使用される場合、「核酸」又は「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖又は二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0065】

本出願で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を示す。

【0066】

核酸は、別の核酸と機能的関係に配置されている場合に「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに関するＤＮＡと機能的に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が同一線上にあり、分泌リーダーの場合には隣接しており、リーディングフレーム内にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、便利な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、従来の慣行に従って合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。

【0067】

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、すべてのこのような名称は子孫を含む。従って、「トンスフォーマント」及び「トランスフォーメーションされた細胞」という語句は、初代の対象細胞及び継代数に関係なくそれ由来の培養物を含む。すべての子孫は、計画的又は偶発的な突然変異により、ＤＮＡ含有量が正確に同一ではない場合があることも理解される。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。

【0068】

抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原に対する抗体の結合に直接関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者には周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ；「アイソタイプ」又は「サブクラス」という表現は本明細書では互換的に使用される）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域に従って、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃレセプター結合に基づくＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与している。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分に対する補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響はある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑに対する結合は、Ｆｃ部分における規定の結合部分によって引き起こされる。このような結合部位は当技術分野で公知であり、例えば、Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324;欧州特許出願公開第0 307 434号によって記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である（ナンバリングは、定常ドメインのナンバリングに使用されるKabatのＥＵインデックスに従う、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。

【0069】

サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。

【0070】

一実施態様では、本発明の抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野で周知であり、例えばKabat（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218及びKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照のこと）によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６４（ヒトＩｇＧ１サブクラスアロタイプ（白人及びアフリカ系アメリカ人又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）、配列番号６５、配列番号６６又は配列番号６７（ヒトＩｇＧ４サブクラス又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号５９のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列、又は配列番号６０のラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域のすべての他の部分を含む。本明細書で使用される場合、「ヒト起源由来のＦｃ部分」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、一実施態様ではヒトＩｇＧ１サブクラス由来のＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の突然変異Ｆｃ部分（好ましくは、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するもの）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラス由来の突然変異Ｆｃ部分（好ましくは、突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを有するもの）のいずれかであるＦｃ部分を示す。一実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６４（ヒトＩｇＧ１サブクラスアロタイプ（白人及びアフリカ系アメリカ人又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）、配列番号６５、配列番号６６又は配列番号６７（ヒトＩｇＧ４サブクラス又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）のヒト重鎖定常領域を含む（ナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従う）。これらのヒト重鎖定常領域は、改変及び又は突然変異をさらに含むことができる（例えば、ヘテロ二量化を増強する下記ノブ及びホール突然変異又は他の改変を参照のこと）。一実施態様では、二重特異性抗体は２つの重鎖の定常領域を含み、ここで、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方では突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗが、２つのＣＨ３ドメインのうちの他方では突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖが、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６４（ヒトＩｇＧ１サブクラスアロタイプ（白人及びアフリカ系アメリカ人又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）、配列番号６５、配列番号６６又は配列番号６７（ヒトＩｇＧ４サブクラス又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）のアミノ酸配列にさらに含まれる（ナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従う）。

【0071】

一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスである。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスである。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスである。

【0072】

一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に特異的に結合する本発明の二重特異性抗体は、例えば、国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号又はSchaefer, W., et al., PNAS 108 (2011) 11187-92 ("CrossMabs"又は"domain exchanged antibodies"−実施例１４及び例示的な図１ａを参照のこと；＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２４は、国際公開第2009/080253号に記載されているフォーマットを有する)、国際公開第2011/117330号("bispecific one-armed scFab antibodies"実施例１４を参照のこと；＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃４、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２０、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２１、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２３；例示的な図１ａも参照のこと)、Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 国際公開第96/027011号; 国際公開第98/050431号、Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35、欧州特許出願公開第1 870 459号、Muda, M., et al , Protein Engineering, Design & Selection 24 (2011) 447-454、国際公開第2010/129304号、国際公開第2011/028952号、国際公開第2012/009544号など（これらはすべて参照により組み込まれる）に記載されているように、２つの異なる特異性を有する二重特異性二価抗体である。

【0073】

典型的には、このような二重特異性二価抗体は、多くの場合にＦｃ部分を含み、ヘテロ二量体を形成する２つの異なる重鎖又は重鎖様ペプチドを含む。このようなヘテロ二量体の形成を強制するためには（及び、ホモ二量体副産物の形成を減少させるためには）、ヘテロ二量体形成が優先されるようにＣＨ３（及び／又はＣＨ２）ドメインを改変する。このようなヘテロ二量体形成を増強するための当技術分野で公知の様々な改変があり、例えば、国際公開第96/027011号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681、国際公開第96/027011号、国際公開第98/050431号、米国特許出願公開第2010/0015133号、国際公開第2007/147901号、国際公開第2009/089004号、国際公開第2010/129304号及びMuda, M., et al., Protein Engineering, Design & Selection 24 (2011) 447-454に記載されている。

【0074】

本発明の一実施態様では、二重特異性二価抗体は、ヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域のすべての他の部分を含み、二重特異性二価抗体のＣＨ３（及び／又はＣＨ２）ドメインは、ヘテロ二量体形成を増強するための１つ以上の改変によって変更されている。

【0075】

従って、本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。

【0076】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。

【0077】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。

【0078】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。

【0079】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号９１、配列番号９２及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。

【0080】

本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性二価抗体である。

【0081】

本発明の一実施態様では、二重特異性二価抗体のＣＨ３ドメインは、例えば国際公開第96/027011号、国際公開第98/050431号、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621;及びMerchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681にいくつかの例と共に詳細に記載されている「ノブ−インツ−ホール」技術によって変更される。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用面が、これら２つのＣＨ３ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増加させるように変更される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインはそれぞれ「ノブ」であり得、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はヘテロ二量体を安定化し（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677 681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収率を増加させる。

【0082】

本発明の好ましい態様では、本発明の二重特異性抗体はすべて、
一方の重鎖のＣＨ３ドメイン及び他方の重鎖のＣＨ３ドメインがそれぞれ、抗体ＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスを含むインターフェイスで会合することを特徴とし；
前記インターフェイスは二重特異性抗体の形成を促進するように変更されており、該変更は以下を特徴とする：
ａ）
二重特異性抗体内で他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスに会合する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティに配置可能な隆起が生成されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されること、
及び
ｂ）
二重特異性抗体内で第１のＣＨ３ドメインの元のインターフェイスと会合する第２のＣＨ３ドメインの元のインターフェイス内で、
アミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に、第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起が配置可能なキャビティが生成されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されること。

【0083】

従って、本発明の抗体は、好ましくは、
ａ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインがそれぞれ、抗体ＣＨ３ドメイン間の元のインターフェイスの変更を含むインターフェイスで会合し；
ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインでは、
アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティに配置可能な隆起が生成され、
及びｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインでは、
アミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に、第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の隆起が配置可能なキャビティが生成されることを特徴とする。

【0084】

好ましくは、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。

【0085】

好ましくは、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。

【0086】

本発明の一態様では、両ＣＨ３ドメインは、両ＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによってさらに変更される。

【0087】

一実施態様では、二重特異性二価抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む。例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を導入することによって（ナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従う）、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も使用することができる（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681）。

【0088】

別の実施態様では、本発明の二重特異性二価抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む。別の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＹ３４９Ｃ突然変異及び他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異は、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングは常に、Kabat; (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))のＥＵインデックスに従う）。しかし、欧州特許出願公開第1870459号に記載されている他のノブ−イン−ホール技術も代替的に又は加えて使用することができる。従って、二重特異性抗体の別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異である（ナンバリングは常に、Kabat; (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従う）。

【0089】

別の実施態様では、二重特異性二価抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異、及びさらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。

【0090】

別の実施態様では、二重特異性二価抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は前記二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインのうちの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異、及びさらに「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含む。ＣＨ３ドメインにおけるこのようなノブ及びホール突然変異は、典型的には、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６４（ヒトＩｇＧ１サブクラスアロタイプ（白人及びアフリカ系アメリカ人又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）、配列番号６５、配列番号６６又は配列番号６７（ヒトＩｇＧ４サブクラス又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）のヒト重鎖定常領域に使用される（ナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従う）。

【0091】

従って、一実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインにおけるこのような「ノブ」及び「ホール」突然変異（例えば、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、及び２つのＣＨ３ドメインのうちの他方におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異）をさらに含む配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６４（ヒトＩｇＧ１サブクラスアロタイプ（白人及びアフリカ系アメリカ人又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）、配列番号６５、配列番号６６又は配列番号６７（ヒトＩｇＧ４サブクラス又は突然変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）のヒト重鎖定常領域を含む（ナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスに従う）。

【0092】

ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に特異的に結合するこのような本発明の二価二重特異性抗体は、（高度に凝集することなく、優れた収率でそれらを生産することができるような）低粘性及び高安定性などの特に有益な特性を有する。低粘性及び高安定性を有するこのような二価二重特異性抗体は、例えば、皮下投与に使用することができる高濃度製剤／組成物に特に有用である。

【0093】

従って、本発明の一実施態様は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性二価抗体であって、
ａ）（実施例１８で決定したように）１００mg/mlにおける粘度が４．０mPa.s以下であり（及び／又は７０mg／ｍにおける粘度が３．０mPa.s以下であり、及び／又は１５０mg/mlにおける粘度が８．５mPa.s以下である）
ｂ）（実施例１８で決定したように）凝集温度が５５℃以上であることを特徴とする二重特異性二価抗体である。

【0094】

凝集温度は、ＤＬＳ凝集開始温度を指す（実施例１８を参照のこと）。

【0095】

一実施態様では、前記二重特異性抗体は、例えば、２つの抗原ＴＷＥＡＫ又はＩＬ１７のうちの一方に特異的に結合する全長抗体に、２つの抗原ＴＷＥＡＫ又はＩＬ１７のうちの他方に特異的に結合するｓｃＦａｂフラグメントが一方の重鎖の一方のＣ末端でのみ融合されているものに基づくフォーマット（例えば、国際公開第2010/112193号に記載されているノブ−インツ−ホール技術を含む）、又は例えば、２つの抗原ＴＷＥＡＫ又はＩＬ１７のうちの一方に特異的に結合する全長抗体に、２つの抗原ＴＷＥＡＫ又はＩＬ１７のうちの他方に特異的に結合するＶＨ又はＶＨ−ＣＨ１フラグメントが第１の重鎖の一方のＣ末端で融合されており、２つの抗原ＴＷＥＡＫ又はＩＬ１７のうちの他方に特異的に結合するＶＬ又はＶＬ−ＣＬフラグメントが第２の重鎖の他方のＣ末端で融合されているものに基づくフォーマット（例えば、国際公開第2010/115589号又は国際公開第2011/028952号に記載されているノブ−インツ−ホール技術を含む）を使用した三価のものである。

【0096】

一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に特異的に結合する本発明の二重特異性抗体は、例えば、国際公開第2007/024715号又は国際公開第2007/109254号、国際公開第2010/112193号、国際公開第2010/145792号又は国際公開第2010/145793号に記載されているように、２つの異なる特異性を有する四価抗体（「４つの結合アーム」）である（実施例１４；＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃５も参照のこと）。

【0097】

本発明の一実施態様では、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む二重特異性四価抗体であって、配列番号８３及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする二重特異性四価抗体である。

【0098】

国際公開第2011/117330号（"bispecific one-armed scFab antibodies"）の二重特異性二価抗体フォーマット及び国際公開第2010/112193号の二重特異性四価抗体フォーマットは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖フラグメントがペプチドリンカーを介して連結されている単鎖Ｆａｂフラグメント（ｓｃＦａｂ）を含む（図１ｂ及び図２並びに国際公開第2011/117330号及び国際公開第2010/112193号を参照のこと）。ペプチドリンカーは、典型的には、アミノ酸配列を有するペプチドであって、好ましくは合成起源であり、少なくとも３０アミノ酸長、好ましくは３０〜５０アミノ酸長を有する（一実施態様では、３２〜４０アミノ酸長を有する）ペプチドである。一実施態様では、前記リンカーは、（ＧｘＳ）ｎ（式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８、９又は１０及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７又は８及びｍ＝０、１、２又は３））である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２である。

【0099】

国際公開第2007/024715号又は国際公開第2007/109254号、国際公開第2010/112193号、国際公開第2010/145792号又は国際公開第2010/145793号の二重特異性四価抗体フォーマットは、抗原結合部位を全長抗体に連結するためのペプチドコネクタを含む。典型的には、このようなペプチドコネクタは、アミノ酸配列を有するペプチドであって、好ましくは合成起源であり、少なくとも５アミノ酸長、好ましくは５〜１００個の長さを有する（一実施態様では、１０〜５０アミノ酸長を有する；一実施態様では、１０〜５０アミノ酸長を有する）ペプチドである。一実施態様では、前記ペプチドコネクタは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ（式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５及びｍ＝０、１、２又は３））である。一実施態様では、前記ペプチドコネクタは（Ｇ３Ｓ）３又は（Ｇ４Ｓ）２である。

【0100】

本発明のさらなる実施態様は、本発明の二重特異性抗体を生産するための方法であって、本発明の抗体の重鎖をコードする核酸及び前記抗体の軽鎖をコードする核酸の配列を１つ又は２つの発現ベクターに挿入し、前記ベクターを真核ホスト細胞に挿入し、コードされた抗体を発現させ、ホスト細胞又は上清から回収することを特徴とする方法である。

【0101】

本発明の抗体は、好ましくは、リコンビナント手段によって生産される。このような方法は当技術分野で周知であり、原核細胞及び真核細胞においてタンパク質を発現させること、続いて抗体ポリペプチドを単離すること、及び通常は薬学的に許容しうる純度に精製することを含む。タンパク質の発現のために、軽鎖及び重鎖又はそれらのフラグメントをコードする核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。適切な原核又は真核ホスト細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又はE.coli細胞において発現を実施し、細胞から抗体を回収する（上清から又は細胞溶解後）。

【0102】

抗体のリコンビナント生産は当技術分野で周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Arzneimittelforschung (Drug Res.) 48 (1998) 870-880の総説論文に記載されている。

【0103】

抗体は、細胞そのもの中、細胞溶解物液中に存在してもよいし、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。他の細胞成分又は他の混入物質、例えば他の細胞性核酸又はタンパク質を排除するために、カラムクロマトグラフィー及び当技術分野で周知の他の技術を含む標準的な技術によって精製が実施される。Ausubel, F. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。

【0104】

ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。

【0105】

モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として役立ち得る。単離したらＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いでこれを別の方法で免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄腫細胞などのホスト細胞にトランスフェクションして、ホスト細胞においてリコンビナントモノクローナル抗体の合成を得ることができる。

【0106】

抗ＴＷＥＡＫ／抗ＩＬ１７二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、限定されないが、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、又は以前に調製した変異体バージョン若しくは非変異体バージョンの抗ＴＷＥＡＫ／抗ＩＬ１７二重特異性抗体のオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。

【0107】

本発明の重鎖及び軽鎖可変ドメインを、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列及び転写終結配列と合わせて発現ベクター構築物を形成する。重鎖及び軽鎖発現構築物を合わせて単一のベクターに入れるか、ホスト細胞にコトランスフェクションするか、連続的にトランスフェクションするか、又は別々にトランスフェクションし、次いでこれを融合して両方の鎖を発現する単一のホスト細胞を形成することができる。

【0108】

二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体、特に二重特異性二価抗体は、優れた発展性及び生産可能性（例えば、特定の生産条件を必要とするホットスポットが含まれない）、優れた力価及び収率などの有益な特性を有し、多量かつ比較的少ない不純物（プロテインＡ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）後のモノマーは＞６０％であり、セカンドカラム後の推定純度（ＥＳＩ−ＭＳ）は＞８０％である）で生産可能である（実施例１４及び１５を参照のこと）。

【0109】

医薬組成物
本明細書に記載される二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体の医薬組成物は、所望の純度を有するこのような抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容しうる担体と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することによって調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）。薬学的に許容しうる担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエント無毒であり、限定されないが、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベンの；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖、二糖及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容しうる担体としてはさらに、間質薬物分散剤（interstitial drug dispersion agent）、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）, Baxter International, Inc.)が挙げられる。ｒｈｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号及び米国特許出願公開第2006/0104968号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと合わせる。

【0110】

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第6,171,586号及び国際公開第2006/044908号に記載されている製剤が挙げられ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。

【0111】

本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応症の必要に応じて、１つよりも多くの有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する有効成分を含有し得る。

【0112】

ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に特異的に結合する本発明の二重特異性抗体（特に、二重特異性二価）は、（高度に凝集することなく、優れた収率でそれらを生産することができるような）低粘性及び高安定性などの特に有益な特性を有する（実施例１８を参照のこと）。低粘性及び高安定性を有するこのような二価二重特異性抗体は、例えば、皮下投与に使用することができる高濃度製剤／組成物に特に有用である。

【0113】

本発明の二重特異性抗体は単一の有効成分として、又は例えば上述の疾患を処置若しくは予防するための他の薬物、例えば免疫抑制剤若しくは免疫調節剤若しくは他の抗炎症剤と併せて（例えば、これらに対するアジュバントとして又はこれらと組み合わせて）投与することができる。例えば、本明細書に記載される二重特異性抗体は、ＤＭＡＲＤ、例えば金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ又はＦＫ５０６；リンパ球再循環のモデュレーター、例えばＦＴＹ７２０及びＦＴＹ７２０類似体；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３又はＴＡＦＡ−９３；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン（azathioprene）；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスパルグアリン又はそれらの免疫抑制性ホモログ、類似体若しくは誘導体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば白血球レセプター、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４又はその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有するリコンビナント結合分子、例えばＣＴＬＡ４又はその突然変異体の少なくとも細胞外部分を非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合したもの、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、指定ＡＴＣＣ ６８６２９）又はその突然変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１若しくは−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニスト又はＶＬＡ−４アンタゴニスト；又は化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラスチン、ドキソルビシン又は５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えばＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０又はＴＮＦ−ＲＩ若しくはＴＮＦ−ＲＩＩに対するレセプター構築物、例えばエタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症促進性サイトカインの遮断薬、ＩＬ−１遮断薬、例えばアナキンラ又はＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ８８５、ＩＬ−６遮断薬；ケモカイン遮断薬、例えばプロテアーゼの阻害剤又は活性化剤、例えばメタロプロテアーゼ、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−２３抗体、抗ＣＤ２０抗体、ＮＳＡＩＤ、例えばアスピリン又は抗感染剤と組み合わせて使用することができる（このリストは前記薬剤に限定されない）。

【0114】

本発明の二重特異性抗体を以下の薬剤の１つ以上と組み合わせて、又はこれらに加えて提供することができる：
− サイトカイン機能のアンタゴニスト（例えば、サイトカインシグナリング経路に対して作用する薬剤、例えばＳＯＣＳ系のモデュレーター）、例えばα、β及び／又はγ−インターフェロン；インスリン様成長因子Ｉ型（ＩＧＦ−１）のモデュレーター、そのレセプター及び関連する結合タンパク質；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜３３のうちの１つ以上、及び／又はインターロイキンアンタゴニスト若しくは阻害剤、例えばアナキンラ；インターロイキンファミリーメンバーのレセプターの阻害剤又はこのようなレセプターの特定のサブユニットの阻害剤；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）阻害剤、例えば抗ＴＮＦモノクローナル抗体（例えば、インフリキシマブ；アダリムマブ及び／若しくはＣＤＰ−８７０）及び／若しくはＴＮＦレセプターアンタゴニスト、例えば免疫グロブリン分子（例えば、エタネルセプト）及び／若しくは低分子量薬剤、例えばペントキシフィリン；
− Ｂ細胞のモデュレーター、例えばＢリンパ球（例えば、ＣＤ２０（リツキシマブ）若しくはＭＲＡ−ａＩＬ１６Ｒ）又はＴリンパ球（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＨｕＭａｘ Ｉｌ−１５若しくはアバタセプト）をターゲティングするモノクローナル抗体；
− 破骨活性を阻害するモデュレーター、例えばＲＡＮＫＬに対する抗体；
− ケモカイン又はケモカインレセプター機能のモデュレーター、例えばＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０及びＣＣＲ１１（Ｃ−Ｃファミリーについて）；ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ５及びＣＸＣＲ６（Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーについて）並びにＣＸ３ＣＲ１（Ｃ−Ｘ３−Ｃファミリーについて）のアンタゴニスト；
− マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、すなわちストロメリジン、コラゲナーゼ及びゼラチナーゼ並びにアグレカナーゼのうちの１つ以上；特に、コラゲナーゼ−１（ＭＭＰ１）、コラゲナーゼ−２（ＭＭＰ８）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ１３）、ストロメリジン−１（ＭＭＰ３）、ストロメリジン−２（ＭＭＰ１０）及び／若しくはストロメリジン−３（ＭＭＰ１１）及び／若しくはＭＭＰ９及び／若しくはＭＭＰ１２の阻害剤、例えばドキシサイクリンなどの薬剤；ロイコトリエン生合成阻害剤、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）阻害剤又は５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）アンタゴニスト、例えば；ジロートン；ＡＢＴ−７６１；フェンロートン；テポキサリン；Ａｂｂｏｔｔ−７９１７５；Ａｂｂｏｔｔ−８５７６１；Ｎ−（５−置換）−チオフェン−２−アルキルスルホンアミド；２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールヒドラゾン；メトキシテトラヒドロピラン、例えばＺｅｎｅｃａ ＺＤ−２１３８；化合物ＳＢ−２１０６６１；ピリジニル−置換２−シアノナフタレン化合物、例えばＬ−７３９，０１０；２−シアノキノリン化合物、例えばＬ−７４６，５３０；インドール及び／又はキノリン化合物、例えばＭＫ−５０１、ＭＫ−８８６及び／又はＢＡＹｘ１００５；
− フェノチアジン−３−１ｓ、例えばＬ−６５１，３９２；アミジノ化合物、例えばＧＧＳ−２５０１９ｃ；ベンゾキサラミン、例えばオンタゾラスト；ベンゼンカルボキシミダミド、例えばＢＩＩＬ２８４／２６０；並びにザフィルルカスト、アブルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、ベルルカスト（ＭＫ−６７９）、ＲＧ−１２５２５、Ｒｏ−２４５９１３、イラルカスト（ＣＧＰ４５７１５Ａ）及びＢＡＹｘ７１９５などの化合物からなる群より選択される、ロイコトリエン（ＬＴ）Ｂ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４及びＬＴＥ４に対するレセプターアンタゴニスト；ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、例えばメチルキサンタニン、例えばテオフィリン及び／若しくはアミノフィリン；並びに／又は選択的ＰＤＥイソ酵素阻害剤、例えばＰＤＥ４阻害剤及び／若しくはアイソフォームＰＤＥ４Ｄの阻害剤及び／若しくはＰＤＥ５の阻害剤；
− ヒスタミン１型レセプターアンタゴニスト、例えばセチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、アクリバスチン、テルフェナジン、アステミゾール、アゼラスチン、レボカバスチン、クロルフェニラミン、プロメタジン、シクリジン及び／又はミゾラスチン（一般には、経口的、局所的又は非経口的に適用される）；
− プロトンポンプ阻害剤（例えば、オメプラゾール）又は胃保護ヒスタミン２型レセプターアンタゴニスト；−ヒスタミン４型レセプターのアンタゴニスト；α−１／α−２アドレナリンレセプターアゴニスト血管収縮性交感神経様作用剤、例えばプロピルヘキセドリン、フェニルエフリン、フェニルプロパノールアミン、エフェドリン、シュードエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、塩酸トラマゾリン及び塩酸エチルノルエピネフリン；抗コリン剤、例えばムスカリンレセプター（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３）アンタゴニスト、例えばアトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、臭化オキシトロピウム、ピレンゼピン及びテレンゼピン；
− β−アドレナリンレセプターアゴニスト（βレセプターサブタイプ１−４を含む）、例えばイソプレナリン、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、ビトルテロールメシラート及び／又はピルブテロール、例えばそのキラルエナンチオマー；
− クロモン、例えばナトリウムクロモグリケート及び／又はネドクロミルナトリウム；
− 糖質コルチコイド、例えばフルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデゾニド、プロピオン酸フルチカゾン、シクレゾニド及び／又はフロ酸モメタゾン；核ホルモンレセプターをモデュレーションする薬剤、例えばＰＰＡＲ；
− 免疫グロブリン（Ｉｇ）若しくはＩｇ調製物又はＩｇ機能をモデュレーションするアンタゴニスト若しくは抗体、例えば抗ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ）；
− 他の全身若しくは局所適用される抗炎症剤、例えばサリドマイド若しくはその誘導体、レチノイド、ジフラノール及び／又はカルシポトリオール；
− アミノサリチル酸とスルファピリジンとの組み合わせ、例えばスルファサラジン、メサラジン、バルサラジド及びオルサラジン；並びに免疫調節剤、例えばチオプリン及びコルチコステロイド、例えばブデゾニド；
− 抗細菌剤、例えばペニシリン誘導体、テトラサイクリン、マクロライド、β−ラクタム、フルオロキノロン、メトロニダゾール及び／若しくは吸入用アミノグリコシド；並びに／又は抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル；アマンタジン、リマンタジン；リバビリン；ザナマビル及び／若しくはオセルタマビル；プロテアーゼ阻害剤、例えばインジナビル、ネルフィナビル、リトナビル及び／若しくはサキナビル；ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えばジダノシン、ラミブジン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン；非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えばネビラピン、エファビレンズ；心血管剤、例えばカルシウムチャンネル遮断剤、β−アドレナリンレセプター遮断剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン−２レセプターアンタゴニスト；脂質低下剤、例えばスタチン及び／若しくはフィブラート；血液細胞形態のモデュレーター、例えばペントキシフィリン；血栓溶解剤及び／又は凝固防止剤、例えば血小板凝集阻害剤；
− ＣＮＳ剤、例えば抗うつ剤（例えば、セルトラリン）、抗パーキンソン病剤（例えば、デプレニル、Ｌ−ドーパ、ロピニロール、プラミペキソール、ＭＡＯＢ阻害剤、例えばセレギン及びラサギリン、ｃｏｍＰ阻害剤、例えばタスマール、Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取込み阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニスト並びに／又は神経一酸化窒素合成酵素）、並びに抗アルツハイマー剤、例えばドネペジル、リバスチグミン、タクリン、ＣＯＸ−２阻害剤、プロペントフィリン若しくはメトリフォナート；急性及び慢性疼痛の処置のための薬剤、例えば中枢若しくは末梢作用性鎮痛剤、例えばオピオイド類似体若しくは誘導体、カルバマゼピン、フェニトイン、バルプロ酸ナトリウム、アミトリプチジン又は他の抗うつ剤、パラセタモール若しくは非ステロイド系抗炎症剤；非経口又は局所適用（吸入を含む）局所麻酔剤、例えばリグノカイン又はその類似体；抗骨粗鬆症剤、例えばホルモン剤、例えばラロキシフェン又は二ホスホン酸、例えばアレドロナート；
（ｉ）トリプターゼ阻害剤；（ｉｉ）血小板活性化因子（ＰＡＦ）アンタゴニスト；（ｉｉｉ）インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤；（ｉｖ）ＩＭＰＤＨ阻害剤；（ｖ）接着分子阻害剤（ＶＬＡ−４アンタゴニストを含む）；（ｖｉ）カテプシン；（ｖｉｉ）キナーゼ阻害剤、例えばチロシンキナーゼの阻害剤（例えば、Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、Ｊａｋ３ ＭＡＰ阻害剤の例としては、ゲフィニチブ、イマチニブメシラートが挙げられ得る）、セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、ｐ３８、ＪＮＫ、タンパク質キナーゼＡ、Ｂ及びＣ並びにＩＫＫなどのＭＡＰキナーゼの阻害剤）、又は細胞周期調節に関与するキナーゼ（例えば、サイクリン依存的キナーゼ）；（ｖｉｉｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤；（ｉｘ）キニン−Ｂ．ｓｕｂ１．及び／又はＢ．ｓｕｂ２．レセプターアンタゴニスト；（ｘ）抗痛風剤、例えばコルチシン；（ｘｉ）キサンチンオキシダーゼ阻害剤、例えばアロプリノール；（ｘｉｉ）尿酸排泄剤、例えばプロベネシド、スルフィンピラゾン及び／又はベンズブロマロン；（ｘｉｉｉ）成長ホルモン分泌促進剤；（ｘｉｖ）トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦβ）；（ｘｖ）血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；（ｘｖｉ）線維芽細胞成長因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）；（ｘｖｉｉ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；（ｘｖｉｉｉ）カプサイシンクリーム；（ｘｉｘ）タシキニンＮＫ．ｓｕｂ１．及び／又はＮＫ．ｓｕｂ３．レセプターアンタゴニスト、例えばＮＫＰ−６０８Ｃ、ＳＢ−２３３４１２（タルネタント）及び／又はＤ−４４１８；（ｘｘ）エラスターゼ阻害剤、例えばＵＴ−７７及び／又はＤＺ−０８９２；（ｘｘｉ）ＴＮＦ−α変換酵素阻害剤（ＴＡＣＥ）；（ｘｘｉｉ）誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤又は（ｘｘｉｉｉ）ＴＨ２細胞上で発現される化学誘因物質レセプター相同分子（例えば、ＣＲＴＨ２アンタゴニスト）、（ｘｘｉｖ）Ｐ３８の阻害剤、（ｘｘｖ）Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）の機能をモデュレーションする薬剤及び（ｘｘｖｉ）Ｐ２Ｘ７などのプリン作動性レセプターの活性をモデュレーションする薬剤；（ｘｘｖｉｉ）ＮＦκＢ、ＡＰＩ及び／又はＳＴＡＴなどの転写因子活性化の阻害剤。

【0115】

阻害剤は特異的なものでもよいし、又は混合阻害剤、例えば、１つよりも多くの分子（例えば、レセプター）又は上述の分子クラスをターゲティングする阻害剤でもよい。

【0116】

二重特異性抗体は化学療法剤又は別のチロシンキナーゼ阻害剤と共に同時投与に使用することもできるし、又はイムノコンジュゲートの形態で使用することもできる。前記抗体のフラグメントを、リコンビナント機構若しくは生化学的カップリングによって得られる二重特異性抗体に使用し、次いで上記抗体の特異性を、ＩＬ−１７が関連する活性に関与する他の分子を認識することができる他の抗体の特異性と関連させることもできる。炎症性疾患の処置のために、本発明の二重特異性抗体を、１つ以上の薬剤、例えば：局所若しくは全身適用にかかわらず、非選択的シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１／ＣＯＸ−２阻害剤を含む非ステロイド系抗炎症剤（以下、ＮＳＡＩＤと称される）（例えば、ピロキシカム、ジクロフェナク、プロピオン酸、例えばナプロキセン、フルリビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン及びイブプロフェン、フェナメート、例えばメフェナミン酸、インドメタシン、スリンダック、アザプロパゾン、ピラゾロン、例えばフェニルブタゾン、サリチル酸塩、例えばアスピリン）；選択的ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルマロコキシブ、パラコキシブ及びエトリコキシブ）；シクロオキシゲナーゼ阻害一酸化窒素供与体（ＣＩＮＯＤ）；糖質コルチコステロイド（局所、経口、筋肉内、静脈内又は関節内経路による投与にかかわらず）；メトトレキサート、レフルノミド；ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オーラノフィン又は他の非経口若しくは経口金調製物；鎮痛剤；ジアセレイン；関節内治療、例えばヒアルロン酸誘導体；並びにの栄養補給物質、例えばグルコサミンと組み合わせることができる。

【0117】

本発明の二重特異性抗体を、ガン処置のための既存の治療剤と組み合わせて使用することもできる。組み合わせて使用されるべき適切な薬剤としては、（ｉ）内科的腫瘍に使用される抗増殖剤／抗新生物剤、例えばアルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン及びニトロソウレア）；代謝拮抗剤（例えば、抗葉酸剤、例えばフルオロピリミジン、例えば５−フルオロウラシル及びテガフール、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン並びにパクリタキセル；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン及びミトラマイシン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン並びにタキソイド、例えばタキソール及びタキソテール）；並びにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド、アムサクリン、トポテカン並びにカンポテシン）；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン及びヨードキシフェン）、エストロゲンレセプターダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド及び酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニスト又はＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン及びブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール及びエキセメスタン）並びに５α−リダクターゼの阻害剤、例えばフィナステリド；
（ｉｉｉ）ガン細胞侵襲を阻害する薬剤（例えば、メタロプロテイナーゼ阻害剤、例えばマリマスタット及びウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター機能の阻害剤）；（ｉｖ）成長因子機能の阻害剤、例えば、このような阻害剤としては、成長因子抗体、成長因子レセプター抗体（例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ及び抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤並びにセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮成長因子ファミリーの阻害剤（例えば、ＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＡＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）及び６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３））、例えば血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤並びに例えば肝細胞成長因子ファミリーの阻害剤；（ｖ）抗血管新生剤、例えば血管内皮成長因子の効果を阻害するもの（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ、国際公開第97/22596号、国際公開第97/30035号、国際公開第97/32856号及び国際公開第98/13354号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものなどの化合物）並びに他の機構によって作用する化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤及びアンギオスタチン）；（ｖｉ）血管損傷剤、例えばコンブレタスタチンＡ４並びに国際公開第99/02166号、国際公開第00/40529号、国際公開第00/41669号、国際公開第01/92224号、国際公開第02/04434号及び国際公開第02/08213号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている化合物；（ｖｉｉ）アンチセンス治療、例えば上記ターゲットに対するもの、例えばＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンス；（ｖｉｉｉ）遺伝子治療アプローチ、例えば異常なｐ５３又は異常なＢＲＣＡ１若しくはＢＲＣＡ２などの異常な遺伝子を置換するアプローチ、ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ治療）アプローチ、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ若しくは細菌ニトロリダクターゼ酵素を使用するもの並びに多剤耐性遺伝子治療などの化学療法若しくは放射線療法に対する患者の寛容性を増加させるアプローチ；並びに（ｉｘ）免疫治療アプローチ、例えばインターロイキン２、インターロイキン４若しくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインを使用するトランスフェクションなどの、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増加させるためのｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインをトランスフェクションされた樹状細胞などのトランスフェクションされた免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカインをトランスフェクションされた腫瘍細胞系を使用するアプローチ並びに抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチ、

【0118】

このような有効成分は、適切には、意図される目的に有効な量で組み合わせて存在する。

【0119】

有効成分は、例えばコアセルベーション技術若しくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に封入することができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。

【0120】

徐放製剤を調製してもよい。徐放製剤の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。

【0121】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用されるべき組成物は、一般に滅菌されている。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成することができる。

【0122】

本発明の二重特異性抗体、特に二重特異性二価抗体は、（実施例３、４、１０、１１、１６、１７及び１９に記載されているアッセイにおいて決定した）有益な生物学的特性を有する：
Ａ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、
ａ）（実施例１７でＩＣ５０／価として決定したように）０．２nM以下のＩＣ５０値で（例えば、０．２nM〜０．０nMのＩＣ５０値で）；好ましくは、０．１nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＴＷＥＡＫ誘導性増殖を阻害し；及び
ｂ）（実施例１６で決定したように）３．０nM以下のＩＣ５０値で（例えば、３．０nM〜０．０nMのＩＣ５０値で）；好ましくは、２．０nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ６サイトカイン刺激を阻害し；及び
ｃ）（実施例１６で決定したように）２．０nM以下のＩＣ５０値で（例えば、２．０nM〜０．０nMのＩＣ５０値で）；好ましくは、１．５nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ８サイトカイン刺激を阻害する、
Ｂ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、ヒト＜ＴＷＥＡＫ＞及びヒト＜ＩＬ１７＞に同時に結合することができ、ここで、ヒト＜ＴＷＥＡＫ＞及びヒト＜ＩＬ１７＞の１：１混合物に対する二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体の結合の（表面プラズモン共鳴アッセイ（実施例１９）における）シグナル強度（RU単位）は、（実施例１９で決定したように）ａ）ヒト＜ＴＷＥＡＫ＞単独に対する二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体の結合のシグナル強度（RU単位）、及びｂ）ヒト＜ＩＬ１７＞単独に対する二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体の結合のシグナル強度（RU単位）の合計と比較して少なくとも同じであるか又は高い。
Ｃ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、（実施例１０で決定したように）ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｄ、ＩＬ１７Ｆとの交差反応性を示さず（これは、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｄ及びＩＬ１７Ｆに対する結合が、ＩＬ１７Ａに対する結合（これを１００％と設定する）と比較して０％であることを意味する）；
Ｄ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、（実施例１１で決定したように）２．０nM以下のＩＣ５０値で（例えば、２．０nM〜０．０nMのＩＣ５０値で）、ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞のＩＬ１７誘導性ＩＬ６サイトカイン刺激を阻害し；
Ｅ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、（実施例１１で決定したように）５．０nM以下のＩＣ５０値で（例えば、５．０nM〜０．０nMのＩＣ５０値で）；好ましくは２．０nM以下のＩＣ５０値で、ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞のＩＬ１７誘導性ＩＬ８サイトカイン刺激を阻害し；
Ｆ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、（実施例４で決定したように）４．０［ng/ml］以下のＩＣ５０値で（例えば、４．０［ng/ml］〜０．０［ng/ml］のＩＣ５０値で）；好ましくは３．０［ng/ml］以下のＩＣ５０値で、ヒトＴＷＥＡＫ／ヒトＦｎ１４相互作用を阻害し；
Ｇ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、（実施例１９で決定したように）０．１nM以下の結合親和性のＫＤ値でヒトＴＷＥＡＫに結合し、０．３nM以下の結合親和性のＫＤ値でヒトＩＬ−１７に結合し；及び／又は
Ｈ）二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体は、（実施例１９で決定したように）Biacoreによって測定した場合に、可溶性ヒトＴＷＥＡＫ（配列番号６８のアミノ酸９９〜２４９）と抗体との複合体について２５℃で１００分間以上の半減期を示す。

【0123】

「ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）」という用語は、ＲＡ患者から得られたヒト成人繊維芽細胞様滑膜細胞（ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ））、例えば、Cell Applications Inc. (San Diego, CA, USA)から入手可能なＨＦＬＳ−ＲＡ（Cat. #408RA-05a）を指す。ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）は、関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者から得られた滑膜組織から単離される。それらを第２継代で凍結保存し、培養して少なくとも５回の集団倍加で繁殖させることができる。ＨＦＬＳは、軟骨分解に寄与するサイトカイン及びメタロプロテイナーゼを産生することによって関節破壊において役割を果たしていることが古くから公知である（Firestein, G.S., et al., J. Immunol. 149 (1992) 1054; Firestein, G.S., et al., Arthritis and Rheumatism 37(5) (1994) 644）。炎症促進性サイトカインは、増殖、コラゲナーゼ及びアグリカナーゼの産生、並びにＨＦＬＳに対するＧＭ−ＣＳＦの分泌を誘導する（Alvaro, J.M., et al., J. Clin. Immunol. 13(3) (1993) 212; Yamanishi, Y., et al., J. Immunol. 168(3) (2002) 1405）。進行中の関節炎研究はまた、ＨＦＬＳがアポトーシス及びＰ５３突然変異を発現することを示している（Firestein, G.S., et al., J. Clin. Invest. 96 (1995) 1631; Firestein, G.S., et al., Am. J. Pathol. 148(6) (1996) 2143）。本発明者らは、ＨＦＬＳ−ＲＡとＨＦＬＳ−ＯＡとの間の違い、例えば、プロテアーゼ（Firestein, G.S., et al., Am. J. Pathol. 148(6) (1996) 2143）及びインテグリンサブユニット（Rinaldi, N., et al., Ann. Rheum. Dis. 56(12) (1997) 729）の発現及びレギュレーションを研究するのに有用な細胞モデルである２種類のＨＦＬＳを提供する。

【0124】

「ＩＬ１７誘導性ＩＬ６又はＩＬ８サイトカイン刺激」は、ヒトＩＬ１７によるヒトＩＬ６又はヒトＩＬ８サイトカイン刺激を指す。ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＴＷＥＡＫ誘導性増殖及びヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ６サイトカイン刺激のＩＣ５０値は、一価当たりの（各抗原（実施例１６ではＩＬ１７、及び実施例１７ではＴＷＥＡＫ）に対する結合アーム当たりの）ＩＣ５０値として計算される。これは、各抗原に対する１つの結合アームを有する二重特異性二価抗体（＝これは各抗原に対して一価である）の場合には、ＩＣ５０値が（実施例１６及び１７の）決定したＩＣ５０値と同一であることを意味する。このような一価の結合を、各抗原に対する２つの結合アームを有する二重特異性四価抗体（＝これは各抗原に対して二価である）の結合と比較するためには、そのＩＣ５０値を達成するために２倍モル濃度の結合アームを使用したと仮定してＩＣ５０値を計算するので、（結合アーム当たりの対応する５０％阻害濃度を求めるために）そのＩＣ５０値を２倍にする。

【0125】

本発明は、治療を必要とする患者を処置するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体を患者に投与することを特徴とする方法を含む。

【0126】

本発明は、ガン、特に結腸ガン、肺ガン若しくは膵臓ガンを処置するための、又は自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を処置するための薬品を調製するための、本発明の抗体の使用を含む。

【0127】

本発明は、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎を処置するための薬品を調製するための、本発明の抗体の使用を含む。

【0128】

本発明は、ガン又は炎症性疾患を処置するための、好ましくは、結腸ガン、肺ガン若しくは膵臓ガンを処置するための、又は自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を処置するための、本発明の抗体の使用を含む。

【0129】

本発明は、ガン又は炎症性疾患を処置するための、好ましくは、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎を処置するための、本発明の抗体の使用を含む。本発明は、ガン、特に結腸ガン、肺ガン若しくは膵臓ガン、又は自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、乾癬、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を患っている患者を処置するための、ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に特異的に結合する本発明の二重特異性抗体の使用（又は、前記処置に使用するための前記二重特異性抗体）を含む。

【0130】

本発明は、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎を患っている患者を処置するための、ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に特異的に結合する本発明の二重特異性抗体の使用（又は、前記処置に使用するための前記二重特異性抗体）を含む。

【0131】

本発明は、様々な炎症性障害、免疫障害及び増殖性障害、例えば関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症、関節リウマチ、骨粗鬆症、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症及び肝硬変）、歯肉炎、歯周炎又は他の炎症性歯周病、炎症性腸障害（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎及び炎症性腸疾患）、喘息（アレルギー性喘息を含む）、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬及びガン、強直性脊椎炎、全身性硬化症（systemic scleroris）、乾癬性関節炎（psioriatic arthritis）、炎症性関節炎、変形性関節症、炎症性関節疾患、自己免疫性疾患、例えば自己免疫性血管炎、多発性硬化症、狼瘡、糖尿病（例えば、インスリン糖尿病）、炎症性腸疾患、移植拒絶、移植片対宿主病、及び挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患過程に起因する炎症状態を処置するための、ヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に特異的に結合する本発明の二重特異性抗体の使用（又は、前記処置に使用するための前記二重特異性抗体）を含む。免疫系の機能不全によって影響を受ける他の疾患は本発明の範囲内に包含され、限定されないが、アレルギーが挙げられる。

【0132】

本発明の二重特異性抗体は、自己免疫性疾患及び炎症状態、特に、自己免疫成分を含む病因による特定の炎症状態、例えば、関節炎（例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎及び変形性関節炎）並びにリウマチ性疾患、例えば骨量減少を伴う炎症状態及びリウマチ性疾患、炎症性疼痛、脊椎関節症（spondyloarhropathies）、例えば強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎及び腸疾患性関節炎、過敏症（気道過敏症及び皮膚過敏症の両方を含む）並びにアレルギーを処置、予防又は改善するのに特に有用である。本明細書に記載される二重特異性抗体が用いられ得る具体的な自己免疫性疾患としては、自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血及び特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、炎症性筋障害、多発性軟骨炎、浮腫性硬化症（sclerodoma）、ウェゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群を含む）、内分泌眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春季カタル、間質性肺線維症、乾癬性関節炎並びに糸球体腎炎（ネフローゼ症候群の有無にかかわらず、例えば、特発性ネフローゼ症候群又は微小変化型腎症を含む）、腫瘍、多発性硬化症、皮膚及び角膜の炎症性疾患、筋炎、骨のインプラントの緩み、代謝障害、例えばアテローム性動脈硬化症、糖尿病及び脂質異常症が挙げられる。本発明の二重特異性抗体はまた、喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫及び気道の他の閉塞性又は炎症性疾患を処置、予防又は改善するのに有用である。

【0133】

本発明はまた、このような疾患を患っている患者を処置するための方法を含む。

【0134】

本発明はさらに、薬学的に許容しうる担体と一緒に有効量の本発明の抗体を含む医薬組成物を製造するための方法、及びこのような方法のための本発明の抗体の使用を提供する。

【0135】

本発明はまた、ガン、特に結腸ガン、肺ガン若しくは膵臓ガン、又は自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を患っている患者を処置するための医薬品を製造するための、好ましくは薬学的に許容しうる担体との有効量の本発明の抗体の使用を提供する。

【0136】

本発明はまた、自己免疫性疾患及び炎症状態、特に、自己免疫成分を含む病因による特定の炎症状態、例えば、関節炎（例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎及び変形性関節炎）並びにリウマチ性疾患、例えば骨量減少を伴う炎症状態及びリウマチ性疾患、炎症性疼痛、脊椎関節症（spondyloarhropathies）、例えば強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎及び腸疾患性関節炎、過敏症（気道過敏症及び皮膚過敏症の両方を含む）並びにアレルギーを患っている患者を処置するための医薬品を製造するための、好ましくは薬学的に許容しうる担体との有効量の本発明の抗体の使用を提供する。本明細書に記載される二重特異性抗体が用いられ得る具体的な自己免疫性疾患としては、自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血及び特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、炎症性筋障害、多発性軟骨炎、浮腫性硬化症（sclerodoma）、ウェゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病及び過敏性腸症候群を含む）、内分泌眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春季カタル、間質性肺線維症、乾癬性関節炎並びに糸球体腎炎（ネフローゼ症候群の有無にかかわらず、例えば、特発性ネフローゼ症候群又は微小変化型腎症を含む）、腫瘍、多発性硬化症、皮膚及び角膜の炎症性疾患、筋炎、骨のインプラントの緩み、代謝障害、例えばアテローム性動脈硬化症、糖尿病及び脂質異常症が挙げられる。本発明の二重特異性抗体はまた、喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫及び気道の他の閉塞性又は炎症性疾患を処置、予防又は改善するのに有用である。

【0137】

別の態様では、本発明は、例えば上記治療方法のいずれかに使用するための組成物（例えば、医薬組成物）であって、薬学的に許容しうる担体と一緒に製剤化された本明細書に記載される二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体を含有する組成物を提供する。

【0138】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容しうる担体」は、生理学的に適合性である任意の及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収／再吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、注射又は点滴に適切である。

【0139】

本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与され得る。当業者によって認識されているように、投与経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化するであろう。

【0140】

薬学的に許容しうる担体は、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射溶液又は分散液の調製のための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。水に加えて、担体は、例えば、等張緩衝生理食塩溶液であり得る。

【0141】

別の実施態様では、医薬製剤は、本明細書で提供される二重特異性ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７抗体のいずれかと、少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記のもの）とを含む。

【0142】

治療では、本発明の抗体を単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与することができる。ある特定の実施態様では、さらなる治療剤は、免疫抑制剤若しくは免疫調節剤又は他の抗炎症剤である。例えば、本明細書に記載される二重特異性抗体は、ＤＭＡＲＤ、例えば金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡ又はＦＫ５０６；リンパ球再循環のモデュレーター、例えばＦＴＹ７２０及びＦＴＹ７２０類似体；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３又はＴＡＦＡ−９３；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン（azathioprene）；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスパルグアリン又はそれらの免疫抑制性ホモログ、類似体若しくは誘導体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば白血球レセプター、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４又はその突然変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有するリコンビナント結合分子、例えばＣＴＬＡ４又はその突然変異体の少なくとも細胞外部分を非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合したもの、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、指定ＡＴＣＣ ６８６２９）又はその突然変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１若しくは−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニスト又はＶＬＡ−４アンタゴニスト；又は化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラスチン、ドキソルビシン又は５−フルオロウラシル；抗ＴＮＦ剤、例えばＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ＣＤＰ８７０又はＴＮＦ−ＲＩ若しくはＴＮＦ−ＲＩＩに対するレセプター構築物、例えばエタネルセプト、ＰＥＧ−ＴＮＦ−ＲＩ；炎症促進性サイトカインの遮断薬、ＩＬ−１遮断薬、例えばアナキンラ又はＩＬ−１トラップ、ＡＡＬ１６０、ＡＣＺ８８５、ＩＬ−６遮断薬；ケモカイン遮断薬、例えばプロテアーゼの阻害剤又は活性化剤、例えばメタロプロテアーゼ、抗ＩＬ−１５抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−２３抗体、抗ＣＤ２０抗体、ＮＳＡＩＤ、例えばアスピリン又は抗感染剤と組み合わせて使用することができる（このリストは前記薬剤に限定されない）。

【0143】

このような上述の併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる）、及び別個の投与（この場合、本発明の抗体の投与は、さらなる治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に起こり得る）を包含する。

【0144】

本発明の抗体（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって、並びに局所処置が望まれる場合には病巣内投与によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与が挙げられる。投与は、部分的には投与が短期又は慢性であるかに応じて、任意の適切な経路、例えば静脈内注射又は皮下注射などのな注射によるものであり得る。限定されないが、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入などの様々な投与スケジュールが、本明細書で企図される。

【0145】

本発明の抗体は、優れた医療プラクティスに合った様式で製剤化、投薬及び投与されよう。この状況での検討要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師に公知の他の要因が挙げられる。抗体は、対象となる障害を予防又は処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される必要はないが、場合により製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で使用されるか、又は本明細書に記載される投与量の約１〜９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。

【0146】

疾患の予防又は処置のために、（単独で、又は１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて使用する場合の）本発明の抗体の適切な投与量は、処置されるべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は、一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１回以上の別個の投与又は連続注入によるかにかかわらず、抗体約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば、０．５mg/kg〜１０mg/kg）が、患者に投与するための初回投与量候補であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて約１μg/kg〜１００mg/kg又はそれ以上の範囲であり得る。数日間以上にわたる反復投与の場合、条件に応じて、処置は、一般に、疾患症候について所望の抑制が起こるまで継続されよう。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲である。従って、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量を患者に投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に（例えば、患者が約２〜約２０又は例えば約６用量の抗体を受けるように）投与することができる。より多くの初回ローディング用量に続いて、１つ以上のより少ない用量を投与することができる。例示的な投与計画は、投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有用な場合がある。この治療の進展は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。

【0147】

選択した投与経路に関係なく、適切な水和形で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容しうる剤形に製剤化される。

【0148】

患者に毒性を及ぼすことなく、特定の患者、組成物及び投与様式にとって所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量（有効量）が得られるように、本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルを変更することができる。選択された投与量レベルは、用いられる特定の本発明の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態及び過去の病歴並びに医学分野で周知の同様な要因を含む、様々な薬物動態要因に依存するであろう。

【0149】

製品
本発明の別の態様では、上記障害の処置、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器及びその容器上又はその容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ用溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で又は別の組成物との組み合わせで、症状の処置、予防及び／又は診断に有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有する場合がある（例えば、その容器は、静脈用溶液バッグ又は皮下針によって刺通することができるストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、その組成物が選択された状態の処置に使用されることを示す。また、製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物がその中に含まれている第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞毒又は別の治療剤を含む組成物がその中に含まれている第２の容器を含み得る。本発明のこの実施態様では、製品は、組成物が特定の症状を処置するのに使用することができることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは又は加えて、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などのな薬学的に許容しうる緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。それは、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の物質、例えば他の緩衝液、希釈液、フィルター、針及びシリンジをさらに含み得る。

【0150】

【表1】

【0151】

本発明の実施態様を以下に列挙する：

【0152】

１． ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ヒトＩＬ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む、二重特異性抗体。

【0153】

２． ａ）０．２nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＴＷＥＡＫ誘導性増殖を阻害し；及び
ｂ）３．０nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ６サイトカイン刺激を阻害し；及び
ｃ）２．０nM以下のＩＣ５０値で、ヒト繊維芽細胞様滑膜細胞関節リウマチ（ＨＦＬＳ−ＲＡ）のＩＬ１７誘導性ＩＬ８サイトカイン刺激を阻害する、実施態様１に記載の二重特異性二価抗体。

【0154】

３． 二価であることを特徴とする、実施態様１に記載の二重特異性二価抗体。

【0155】

４． ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
ａ）配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号２１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２２のＣＤＲ３Ｌ；又は
ｂ）配列番号１のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ、配列番号３のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号４のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ、配列番号６のＣＤＲ３Ｌ；又は
ｃ）配列番号９のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１１のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号１２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号１４のＣＤＲ３Ｌを含み；及び
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号４７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号４８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号４９のＣＤＲ３Ｈ、及び配列番号５０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号５１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５２のＣＤＲ３Ｌを含むことを特徴とする、実施態様１〜３のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0156】

５． 実施態様４に記載の二重特異性抗体のキメラ又はヒト化変異体。

【0157】

６． ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４又は配列番号３５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５又は配列番号４６の可変軽鎖ドメインとを含み；及び
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５５又は配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７又は配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、実施態様１〜３のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0158】

７． ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；及び
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
ａ）配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むか；又は
ｂ）配列番号５５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、実施態様１〜３のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0159】

８． ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；及び
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５６の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５８の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、実施態様１〜３のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0160】

９． ｉ）前記第１の抗原結合部位が、
配列番号２８の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３７の可変軽鎖ドメインとを含み；及び
ｉｉ）前記第２の抗原結合部位が、
配列番号５５の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と、配列番号５７の可変軽鎖ドメインとを含むことを特徴とする、実施態様１〜３のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0161】

１０． ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする、前記実施態様のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0162】

１１． 突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする、前記実施態様のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0163】

１２． 突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする、前記実施態様のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0164】

１３． 突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする、前記実施態様のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0165】

１４． 突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする、前記実施態様のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0166】

１５． 実施態様１〜１４に記載の抗体を含むことを特徴とする、医薬組成物。

【0167】

１６． 医薬組成物を製造するための、実施態様１〜１４に記載の抗体の使用。

【0168】

１７． ガン又は炎症性疾患、自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷の処置に使用するための、実施態様１〜１４に記載の抗体。

【0169】

１８． ガン又は炎症性疾患、自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を処置するための医薬品を製造するための、実施態様１〜１４に記載の抗体の使用。

【0170】

１９． 実施態様１〜１４に記載の抗体をコードする、核酸。

【0171】

２０． 原核又は真核ホスト細胞において実施態様１〜１４に記載の二重特異性抗体を発現させるための発現ベクターであって、実施態様１９に記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。

【0172】

２１． 実施態様２０に記載のベクターを含む、原核又は真核ホスト細胞。

【0173】

２２． 実施態様１〜１４に記載のリコンビナント抗体を生産するための方法であって、原核又は真核ホスト細胞において実施態様１９に記載の核酸を発現させること、及び前記細胞又は細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする、方法。

【0174】

２３． ガン又は炎症性疾患、自己免性疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷を患っている患者を処置するための方法であって、実施態様１〜１４に記載の抗体を患者に投与することを特徴とする、方法。

【0175】

以下の実施例、図面及び配列表は本発明の理解を助けるために提供するものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなく、示されている手順に改変を行なうことができることが理解される。

【0176】

実施例
材料及び一般的な方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示されている。抗体定常鎖のアミノ酸については、KabatのＥＵインデックス（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）に従ってナンバリングし、これを参照する。

【0177】

リコンビナントＤＮＡ技術
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)に記載されているように標準的な方法をＤＮＡの操作に使用した。製造業者の説明書に従って、分子生物学試薬を使用した。

【0178】

遺伝子の合成
化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製することができる。ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーションによって、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する遺伝子セグメントをアセンブリし、続いて、示されている制限部位（例えば、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ又はＡｓｃＩ／ＰａｃＩ）を介してpPCRScript (Stratagene)ベースのｐＧＡ４クローニングベクターにクローニングした。ＤＮＡ配列決定によって、サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を確認した。

【0179】

Geneart (Regensburg, Germany)における所定の規格に従って、遺伝子合成フラグメントを注文した。真核細胞における分泌のためのタンパク質をターゲティングするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列と、合成遺伝子の５’及び３’末端の独自の制限部位とを用いて、Ｔｗｅａｋ／ＩＬ−１７二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖をコードするすべての遺伝子セグメントを合成した。「ノブ」重鎖におけるＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ突然変異と、「ホール」重鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異とを用いて、ジスルフィド安定化「ノブ−インツ−ホール」改変重鎖を有するＤＮＡ配列を設計した。

【0180】

ＤＮＡ配列の決定
MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany)又はSequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany)で実施した二本鎖配列決定によって、ＤＮＡ配列を決定した。

【0181】

ＤＮＡ及びタンパク質配列の分析及び配列データの管理
ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）ソフトウェアパッケージversion 10.2及びInfomax's Vector NT1 Advance suite version 11.5を、配列作製、マッピング、分析、アノテーション及び図説に使用した。

【0182】

発現ベクター
記載されている抗体の発現のために、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターによるｃＤＮＡ構築又はＣＭＶプロモーターによるゲノム構築のいずれかに基づく一過性発現（例えば、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ又はＨＥＫ２９３−Ｆ細胞）又は安定発現（例えば、ＣＨＯ細胞）用発現プラスミドの変異体を適用した。

【0183】

ＩｇＧ４＿ＳＰＬＥの場合、ＣＨ１ドメイン及びヒンジドメインの間のイントロンを除去し、ゲノム構築における残りの抗体遺伝子を維持した。イントロンを削除したバージョンのＩｇＧ４＿ＳＰＬＥはもはや、全ゲノム構築でコードされるＩｇＧ４＿ＳＰＬＥで一般的に見られるスプライスアーチファクトの結果としてヒンジレス抗体を示さない。

【0184】

抗体発現カセットの他に、ベクターは以下のものを含有していた：
− E.coliにおけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、及び
− E.coliにおけるアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。

【0185】

抗体遺伝子の転写ユニットは以下の要素から構成される：
− ５’末端における独自の制限部位
− ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
− その後ろにイントロンＡ配列（ｃＤＮＡ構築の場合）、
− ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
− 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− ヒト抗体鎖（重鎖、改変重鎖又は軽鎖）（ｃＤＮＡとして、又は免疫グロブリンエキソン−イントロン構築によるゲノム構築として）、
− ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、及び
− ３’末端における独自の制限部位。一過性及び安定トランスフェクションのために、トランスフォーメーションされたE.coli培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）からのプラスミド調製によって、より多量のプラスミドを調製した。

【0186】

細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。

【0187】

ＨＥＫ２９３−Ｆシステムにおける一過性トランスフェクション
製造業者の説明書（Invitrogen, USA）に従ってFreeStyle（商標）２９３発現システムを使用して、ヒト胎児由来腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって、リコンビナント免疫グロブリン変異体を発現させた。簡潔に言えば、FreeStyle（商標）２９３発現培地中で、懸濁FreeStyle（商標）２９３−Ｆ細胞を３７℃／８％ＣＯ_２で培養し、トランスフェクションの日に、生細胞１〜２×１０^６個／mlの密度で細胞を新鮮培地に播種した。単一特異性親抗体の最終トランスフェクション容量が２５０mlの場合、３２５μlの293fectin（商標）（Invitrogen, Germany）並びに２５０μgの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを１：１のモル比で使用して、Opti-MEM（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, USA）中で、DNA-293fectin（商標）複合体を調製した。最終トランスフェクション容量が２５０mlの場合、３２５μlの293fectin（商標）（Invitrogen, Germany）並びに２５０μgの「ノブ−インツ−ホール」重鎖１及び２及び軽鎖プラスミドＤＮＡを一般には１：１：１のモル比で使用して、Opti-MEM（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, USA）中で、２つの重鎖及び１つの軽鎖を有する「ノブ−インツ−ホール」DNA-293fectin複合体を調製した（フォーマットについては、国際公開第2011/117330号（"bispecific one-armed scFab antibodies"）に記載されている）。発現収率及び産物の質の最適化により、比は変化し得る。最終トランスフェクション容量が２５０mlの場合、３２５μlの293fectin（商標）（Invitrogen, Germany）並びに２５０μgの「ノブ−インツ−ホール」重鎖１及び２及び軽鎖１及び２プラスミドＤＮＡを１：１：１：１のモル比で使用して、Opti-MEM（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, USA）中で、DNA-293fectin複合体を調製した（フォーマットについては、国際公開第2009/080253号（"CrossMabs"又は"CH1-CL domain exchanged antibodies"）に記載されている）。発現収率及び産物の質の最適化により、比は変化し得る。トランスフェクションの７日後、１４０００ｇで３０分間遠心分離することによって、抗体を含有する細胞培養上清を回収し、滅菌フィルター（０．２２μm）に通してろ過した。上清を精製まで−２０℃で保存した。

【0188】

タンパク質の決定
Pace, C.N., et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423に従ってアミノ酸配列に基づいて計算したモル消衰係数を使用して、２８０nmの光学密度（ＯＤ）を決定することによって、精製抗体及び誘導体のタンパク質濃度を決定した。

【0189】

上清中の抗体濃度の決定
プロテインＡアガロースビーズ（Roche）による免疫沈降によって、細胞培養上清中の抗体及び誘導体の濃度を推定した。６０μLのプロテインＡアガロースビーズを、ＴＢＳ−ＮＰ４０（５０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）で３回洗浄する。続いて、１〜１５mLの細胞培養上清を、ＴＢＳ−ＮＰ４０でプレ平衡化したプロテインＡアガロースビーズにアプライする。室温で１時間インキュベーションした後、Ultrafree-MC-filterカラム（Amicon］上で、ビーズを０．５mLのＴＢＳ−ＮＰ４０で１回洗浄し、０．５mLの２×リン酸緩衝生理食塩水（２×ＰＢＳ，Roche）で２回洗浄し、０．５mLの１００mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で簡単に４回洗浄する。３５μlのNuPAGE（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Invitrogen）を追加することによって、結合した抗体を溶出する。サンプルの半分をそれぞれ、NuPAGE（登録商標）サンプル還元剤と合わせるか又は非還元状態のままにしておき、７０℃で１０分間加熱する。そして、２０μlを、４〜１２％NuPAGE（登録商標）Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen)(非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合にはＭＯＰＳ緩衝液を用い、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合にはNuPAGE（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加物（Invitrogen）を含むＭＥＳ緩衝液を用いる）にアプライし、クーマシーブルーで染色する。

【0190】

プロテインＡ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、細胞培養上清中の抗体及び誘導体の濃度を測定した。簡潔に言えば、プロテインＡに結合する抗体及び誘導体を含有する細胞培養上清を、HiTrapプロテインＡカラム(GE Healthcare)（５０mM Ｋ２ＨＰＯ４、３００mM ＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中）にアプライし、Dionex HPLCシステムで５５０mM酢酸（ｐＨ２．５）を用いてマトリックスから溶出させた。ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって、溶出したタンパク質を定量した。精製標準ＩｇＧ１抗体を標準として用いた。

【0191】

あるいは、サンドイッチ−ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡによって、細胞培養上清中の抗体及び誘導体の濃度を測定した。簡潔に言えば、StreptaWell High Bind Strepatavidin A−９６ウェルマイクロタイタープレート（Roche）を、０．１μg/mLのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ−Ｆｃガンマ＞ＢＩ（Dianova）を１００μL／ウェルで用いて室温で１時間あるいは４℃で一晩コーティングし、続いて、２００μL／ウェルのＰＢＳ、０．０５％Tween（ＰＢＳＴ、Sigma）で３回洗浄した。各抗体を含有する細胞培養上清の希釈系列ＰＢＳ（Sigma）溶液を１００μL／ウェルでウェルに追加し、マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で１〜２時間インキュベーションした。ウェルを２００μL／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、０．１μg/mLのＦ（ａｂ’）２＜ｈＦｃガンマ＞ＰＯＤ（Dianova）１００μlを検出抗体として用いて、マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で１〜２時間にわたって、結合した抗体を検出した。未結合の検出抗体を２００μL／ウェルのＰＢＳＴで３回洗い流し、１００μLのＡＢＴＳ／ウェルを追加することによって、結合した検出抗体を検出した。Tecan Fluor分光計において測定波長４０５nm（参照波長４９２nm）で、吸光度の決定を実施した。

【0192】

二重特異性抗体の精製
Protein A-Sepharose（商標）（GE Healthcare, Sweden）を使用するアフィニティークロマトグラフィー及びSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から二重特異性抗体を精製した。簡潔に言えば、滅菌ろ過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１mM ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７mM ＮａＣｌ及び２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したHiTrap ProteinA HP（５ml）カラムにアプライした。未結合のタンパク質を平衡緩衝液で洗い流した。０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．８）を用いて抗体及び抗体変異体を溶出させ、タンパク質を含有する画分を０．１mlの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、Amicon超遠心ろ過機（カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）：３０Ｋ，Millipore）を用いて容量３mlに濃縮し、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120 ml 16/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Sweden）にローディングした。高分子量凝集物が５％未満の精製二重特異性抗体を含有する画分をプールし、１．０mg/mlアリコートとして−８０℃で保存した。

【0193】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
製造業者の説明書に従って、NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen）を使用した。特に、４〜２０％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）ＴＲＩＳ−グリシンPre-Castゲル及びNovex（登録商標）ＴＲＩＳ−グリシンＳＤＳランニング緩衝液を使用した。ゲルを流す前にNuPAGE（登録商標）サンプル還元剤を追加することによって、サンプルの還元を達成した。

【0194】

分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィーを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔に言えば、プロテインＡ精製抗体を、Agilent HPLC 1100システムのTosoh TSKgel G3000SWカラム（３００mM ＮａＣｌ、５０mM ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中）、又はDionex HPLCシステムのSuperdex 200カラム（GE Healthcare）（２×ＰＢＳ中）にアプライした。ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって、溶出したタンパク質を定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準として用いた。

【0195】

質量分析
電子噴霧イオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、二重特異性抗体の全脱グリコシル化質量を決定及び確認した。また、誤対合しているＬＣ及びＨＣなどの潜在的な副産物を検出し、相対定量した。簡潔に言えば、１００mM ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）中で１４又は２８ＵのＮ−グリコシダーゼＦ（Roche）を用いて、最大３mg/mlのタンパク質濃度の精製抗体１００μgを３７℃又は４５℃で１６時間又は２時間脱グリコシル化し、続いてSephadex G25カラム（GE Healthcare）のＨＰＬＣによって脱塩した。脱グリコシル化及び還元の後、ＥＳＩ−ＭＳによって各重鎖及び軽鎖の質量を決定した。簡潔に言えば、１１５μl中の抗体５０μgを、０．５Ｍ ＴＣＥＰの４Ｍ塩酸グアニジン溶液６０μl及び５０μlの８Ｍグアニジン塩酸塩と共に３７℃で３０分間インキュベーションし、続いて脱塩した。TriVersa NanoMate (Advion)ソースを備えるmaXis UHR-TOF (Bruker)MSシステムのＥＳＩ−ＭＳによって、全質量並びに還元重鎖及び軽鎖の質量を決定した。

【0196】

実施例１
免疫感作によるＴＷＥＡＫ抗原結合部位の作製（ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７二重特異性抗体のＴＷＥＡＫ抗原結合部位が由来し得る親ＴＷＥＡＫ抗体の作製）
ヒト／マウスＴＷＥＡＫによるウサギの免疫感作
ニュージーランドホワイトウサギ（Oryctolagus cuniculus）を、０日目に４００μgのリコンビナントヒトＴＷＥＡＫと完全フロイントアジュバントで免疫感作し、２１日目、４３日目及び６５日目に２００μgのヒトＴＷＥＡＫと不完全フロイントアジュバントで免疫感作し、８５日目に２００μgのマウスＴＷＥＡＫと不完全フロイントアジュバントで免疫感作した。すべての免疫感作は、いくつかの部位に皮下的に行なった。力価決定のために、７７日目及び９８日目に血清を調製した。２００μgのヒト及び２００μgのマウス可溶性ＴＷＥＡＫを静脈内注射することによって最後の追加免疫を行い、ヒト及びマウスＴＷＥＡＫに結合する能力（実施例２）、ヒト及びマウスＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４相互作用を中和する能力（実施例４及び５）、並びにＩＬ８分泌を阻害する能力（実施例６）に基づいて、抗体を選択した。加えて、抗体−ＴＷＥＡＫ複合体の半減期を調べた（実施例３）。Ｂ１６ＢＬ６（マウスメラノーマ；Ｂ１６の転移性肺亜系統）、ＳＪＳＡ（骨肉腫、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０９８）及びＨＣＴ−１１６（結腸、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）異種移植片モデルにおいて、抗体の抗腫瘍効果を試験した。

【0197】

実施例２
ヒト及びマウスＴＷＥＡＫに対する結合（ＥＬＩＳＡ）
ヒト及びマウスＴＷＥＡＫに対する親抗ＴＷＥＡＫ抗体の結合をＥＬＩＳＡによって決定した。２５μl／ウェルの０．５Ｍ炭酸コーティング緩衝液（ｐＨ９．５）を２〜８℃で一晩インキュベーションすることによって、ヒト又はマウスリコンビナントＴＷＥＡＫを１μg/mlで３８４ウェルNunc Maxisorpプレート上に固定化した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡでプレートを室温で１時間ブロッキングし、続いて２回の洗浄工程（０．１％Tween（登録商標）20のＰＢＳ溶液）を行って、様々な濃度の抗ＴＷＥＡＫ抗体のブロッキング緩衝液又は前記抗体のハイブリドーマ上清と共に室温で１時間インキュベーションした。さらに４回洗浄した後、ブロッキング緩衝液で１：５０００希釈した抗ウサギ−ＨＲＰ抗体を用いて、抗体を室温で１時間検出した。さらに４回の洗浄工程の後、ABTS（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH）を１０〜３０分間追加することによって、シグナルを発生させた。吸光度を４０５nmで読み取った。

【0198】

実施例３
Biacoreを使用した抗体−ＴＷＥＡＫ複合体の半減期の決定
Biacore 2000機器を、このシステムにマウントされているBiacoreストレプトアビジンコーティングセンサーと共に使用した。システム緩衝液ＨＢＳ−ＥＴ（１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．０５％Tween（登録商標）20）を流速１００μl／分で使用した。サンプル緩衝液はシステム緩衝液であった。ビオチン化ヒト可溶性ＴＷＥＡＫ（配列番号６８のアミノ酸９９〜２４９）及びビオチン化マウス可溶性ＴＷＥＡＫ（配列番号６９のアミノ酸８１〜２２５）を、それぞれ１５０RUでＳＡセンサー上の異なるフローセル上に固定化した。フローセルＦＣ１をブランクのリファレンスセルとして使用した。各抗体を、１００nMの分析物として１００μl／分、会合時間２分間でシステムに注入した。免疫複合体の解離を５分間モニタリングした。センサー表面をＨＢＳ−ＥＴで１０秒間洗浄し、１０mMグリシン（ｐＨ２．２５）による２分間の注入を２回使用して再生した。この手順を２５℃で行った。［２４０秒〜３００秒］の区間における複合体解離期の速度律速段階を用いて、解離速度ｋｄ［１／ｓ］を計算した（Biacore評価ソフトウェア４．０）。

【0199】

式ｔ１／２ｄｉｓｓ＝ｌｎ（２）／（６０×ｋｄ）に従って、免疫複合体の半減期（分単位）を計算した。結果を表１ａ及び１ｂ並びに表２ｂに示す。

【0200】

【表2】

^１）：配列番号５９のヒトカッパ軽鎖定常領域及び配列番号６１のヒトＩｇＧ１定常領域のヒト定常領域

【0201】

さらなる実験では、キメラ＜ＴＷＥＡＫ＞３０５ｃｈｉ及び国際公開第2006/130374号のＰ２Ｄ１０のキメラバージョンについての抗体−ＴＷＥＡＫ複合体の半減期（２５℃におけるｔ／２ｄｉｓｓ［分］）を決定した（両キメラ抗体は、ヒト定常領域として配列番号５９のヒトカッパ軽鎖定常領域及び配列番号６１のヒトＩｇＧ１定常領域を有する）。

【0202】

【表3】

^１）：配列番号５９のヒトカッパ軽鎖定常領域及び配列番号６１のヒトＩｇＧ１定常領域のヒト定常領域

【0203】

本発明の抗体は、Biacoreによって測定した場合に、可溶性ヒトＴＷＥＡＫ（配列番号６８のアミノ酸９９〜２４９）と抗体との複合体について２５℃で１００分間以上、好ましくは１１０分間以上の半減期のような有益な特性を示す。このような半減期を示す抗ＴＷＥＡＫ抗体は、自己免疫性疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎（psoratic arthritis）、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎及び血管損傷の処置に使用するのに特に好ましい。

【0204】

実施例４
ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４相互作用（ヒト）の中和
レセプター相互作用ＥＬＩＳＡによって、ヒトＴＷＥＡＫ／ヒトＦｎ１４相互作用の遮断が示された。１ウェル当たり１００μlの１μg/mlヒトＦｎ１４：Ｆｃ（ヒトＦｎ１４の細胞外ドメイン（配列番号９８のアミノ酸１〜７５）をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したもの）のＰＢＳ溶液を用いて９６ウェルMaxisorp（登録商標）プレート（Nunc）を室温で１．５時間コーティングし、５％ＦＢＳのＰＢＳ溶液を用いて室温で振盪しながら３０分間ブロッキングした。一方、２．５ng/mlのヒトＦｌａｇタグ付可溶性ＴＷＥＡＫ（アミノ酸１０６〜２４９）のブロッキング溶液を、様々な濃度の抗ＴＷＥＡＫ抗体又はハイブリドーマ上清と共に室温で振盪しながら２時間インキュベーションした。Ｆｎ１４コーティングプレートを洗浄緩衝液（０．１％Tween（登録商標）20のＰＢＳ溶液）で１回洗浄した後、１００μlのＴＷＥＡＫ−抗体溶液を各ウェルに移し、プレートを室温で１時間インキュベーションし、続いて洗浄緩衝液で４回洗浄した。ブロッキング緩衝液で１：５０００希釈した１００μlの抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ検出抗体でウェルを満たし、室温で１時間インキュベーションした。４回のさらなる洗浄工程の後、１００μlの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を約１０分間追加することによって、シグナルを発生させた。１００μlの１Ｎ ＨＣｌを追加することによって反応を停止させ、吸光度を４５０nmで測定した（参照波長６２０nm）。結果を表２ａ及びｂに示す。

【0205】

実施例５
ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４相互作用（マウス）の中和
マウスＴＷＥＡＫ／マウスＦｎ１４相互作用ＥＬＩＳＡは、ヒトタンパク質について記載したのと同様の原理に従うものであったが、マウス可溶性ＴＷＥＡＫにタグを付加しなかったように異なる検出系を使用した。簡潔に言えば、ヒトＦｎ１４：Ｆｃについて上記したようにマウスＦｎ１４：Ｆｃ（マウスＦｎ１４の細胞外ドメイン（配列番号９８のアミノ酸１〜７５）をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したもの）を用いてMaxisorpプレートをコーティングし、続いてブロッキング及び洗浄した。４ng/mlのマウス可溶性ＴＷＥＡＫを、抗ＴＷＥＡＫ抗体又はハイブリドーマ上清のブロッキング緩衝液と共にプレインキュベーションし、１ウェル当たり１００μlの混合物をＦｎ１４コーティングプレートに追加した。室温で１時間インキュベーションして４回洗浄した後、１２５ng/mlのビオチン化抗マウスＴＷＥＡＫ抗体のブロッキング緩衝液を室温で１時間追加し、続いてさらに４回の洗浄工程を行った。ブロッキング緩衝液で１：５０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰと共に室温で３０分間インキュベーションすることによって、ＴＷＥＡＫ抗体を検出した。上記のように、シグナルを発生させて吸光度を測定した。結果を以下の表２ａ及び２ｂに示す。

【0206】

実施例６
ＩＬ−８分泌のＥＬＩＳＡ
Ａ３７５メラノーマ細胞を使用してＩＬ−８分泌アッセイにおいて、細胞系における抗ＴＷＥＡＫ抗体によるＴＷＥＡＫ活性の遮断を示した。１０，０００個のＡ３７５細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９）を、９６ウェル細胞培養プレートの１ウェル当たり１００μlの成長培地（４．５g/Lグルコース、ピルビン酸塩及びGlutaMAX（商標）／１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間インキュベーションした。ヒトリコンビナント可溶性ＴＷＥＡＫを、３００ng/mlで、成長培地中の様々な濃度の抗ＴＷＥＡＫ抗体と共に室温で３０分間プレインキュベーションした。次いで、５０μlの混合物を細胞プレートの各ウェルに追加し、続いてさらに４８時間インキュベーションしてＩＬ−８を分泌させた。プレートを２００×ｇで５分間遠心分離した後に２０μlの細胞上清を回収し、「CXCL8 Quantikine ELISA」キット（R&D Systems）のＲＤ５Ｐキャリブレーター希釈液９８０μlと混合した。製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−８を検出した。結果を表２ａ及び２ｂに示す。

【0207】

【表4】

【0208】

【表5】

【0209】

実施例７
＜ＴＷＥＡＫ＞３０１、＜ＴＷＥＡＫ＞３０４、＜ＴＷＥＡＫ＞３０５（ＴＷ−３０１、ＴＷ−３０４、ＴＷ−３０５と略す）のエピトープ領域の決定
Biacore 2000機器を、Biacore評価ソフトウェア４．０と一緒に使用した。サンプル及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＴ（ｐＨ７．４）であった。センサー表面に対するＴＷＥＡＫ分析物の非特異的結合が強いため、Johne, B., et al., J. Immun. Meth. 160 (1993) 191-198に記載されているようにBiacore交差競合実験によって、個々の抗体のエピトープマッピングを通常のとおりに行うことができなかった。

【0210】

ＴＷＥＡＫタンパク質の個々の生化学的特性のために、リガンドとしてＴＷＥＡＫを使用して別の方法を開発しなければならなかった。ビオチン化ＴＷＥＡＫをストレプトアビジンコーティングチップ表面上に固定化し、連続注入した抗体（抗体１）のエピトープカバー度を測定した。目的は、既に結合した一次抗体の存在下における二次抗体（抗体２）の相対的結合レベルを検出することであった。これらの相対結合レベルから、指数を計算した（Ａｂ２／Ａｂ１、モル比を％で単位で示す、表３）。

【0211】

５nMのビオチン化ＴＷＥＡＫを、ストレプトアビジンコーティングセンサーフローセル上に２０μl／分で１分間固定化した。一次及び二次ｍＡｂを、各ＴＷＥＡＫエピトープの飽和が達成されるまで１００nMのシステムに１０μl／分で４分間連続注入した。参照としてＳＡでコーティングフローセルを使用した。

【0212】

ＨＢＳ−ＥＴを用いてシステムを３０μl／分で２０秒間洗浄し、続いて、６Ｍ ＧｕａｄＨＣｌ及び１００mM ＨＣｌによる２回の再生工程（３０μl／分で１分間）を行なった。これらの再生工程は、結合したｍＡｂをセンサー表面から剥ぎ取り、固定化されたビオチン化ＴＷＥＡＫを不可逆的に変性した。ストレプトアビジンセンサー表面がビオチン化ＴＷＥＡＫによって完全に飽和されるまで、ネイティブなビオチン化ＴＷＥＡＫタンパク質を同じフローセル上に固定化することによって（フィードバッチモード）、この過程を反復した。

【0213】

【表6】

【0214】

交差遮断実験は、各抗体について１０％未満のアクセスビリティ値を示しているが、これはこのアッセイのノイズの範囲内である。ＴＷ−３０１ｃｈｉ、ＴＷ−３０４ｃｈｉ及びＴＷ−３０５ｃｈｉは同じエピトープ領域に結合することが明らかに示されている。

【0215】

実施例８
コラーゲン誘導関節炎（関節リウマチのマウスモデル）のｉｎ ｖｉｖｏ阻害−抗体＜ＴＷＥＡＫ＞３０５（キメラ；ＴＷ３０５）は、関節リウマチのマウスモデルであるコラーゲン誘導関節炎を阻害する
６〜８週齢の雄性ＤＢＡ１／Ｊマウス（Jackson Laboratory, Bal Harbor, Maine）を、ＩＩ型ウシコラーゲンを含む完全フロイントアジュバントで免疫感作し、３週間後にＩＩ型ウシコラーゲンを含む不完全フロイントアジュバントで再度免疫感作した（追加免疫、０日目）。追加免疫の前日から開始して１日毎に、キメラ抗体＜ＴＷＥＡＫ＞３０５（＝ＴＷ３０５）（１０mg/kg、ｎ＝１２）、エンブレル（１０mg/kg、ｎ＝１２）又はビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、ｎ＝１２）をマウスに投与した。追加免疫後０日目、２日目、５日目、７日目、９日目、１２日目及び１４日目に、関節炎についてマウスを調べた。関節炎の重症度を以下の基準に基づいてスコア化した：１＝１本の指が腫脹及び／又は発赤している；２＝２つ以上の関節が腫脹している；３＝３つ以上の関節が関与する足が全体的に腫脹している；４＝足及び指全体が重度の関節炎である。ビヒクルと比較して、ＴＷ−３０５は、ＴＮＦ遮断薬エンブレルと類似した程度に臨床スコアを有意に減少させた（ｐ＜０．０５、１４日目）。

【0216】

実施例９
免疫感作によるＩＬ１７抗原結合部位の作製（ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７二重特異性抗体のＩＬ１７抗原結合部位が由来し得る親ＩＬ１７抗体の作製）
５匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して、マウス１匹当たり２５０（１×）及び１００μg（３×）のPeprotech製リコンビナントヒトＩＬ１７（http://www.peprotech.com; Cat.No.: 200-17、１％アルブミンを含む１％ＰＢＳ溶液）を使用して、２０週間以内に免疫感作を実施した。ハイブリドーマの作製。マウスのリンパ球を単離し、ＰＥＧベースの標準的なプロトコールを使用してマウス骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを作製した。次いで、抗原特異的抗体の産生について、得られたハイブリドーマをスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ及びサイトカイン放出アッセイ（ＩＬ−１７Ａ誘導性ｈＩＬ−６及びｈＩＬ−８放出の阻害による）によって測定したＩＬ−１７サブタイプに対する結合を使用して、得られたハイブリドーマからマウスクローン＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６を選択した。マウスクローン＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６をヒト化することにより、ヒト化変異体＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６−１３４（ＶＨのヒト化変異体＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６−ＨＣ１３４及びＶＬのヒト化変異体＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６−ＬＣ１３４（配列番号５５及び５７）を有する）及び＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６（ＶＨのヒト化変異体＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６−ＨＣ１３６及びＶＬのヒト化変異体＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６−ＬＣ１３６（配列番号５６及び５８）を有する）を得た。

【0217】

実施例１０
ＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ−１７に対する結合及びＩＬ１７サブタイプとの交差反応性
濃度０，５μg/mlのリコンビナントヒトＩＬ−１７（Peprotech # 200-17, www.peprotech.com）のＰＢＳ溶液（１００ml／ウェル）を用いて、NUNC（登録商標）Maxisorpプレート（９６ウェル）をコーティングする。オービタルシェーカー上で撹拌しながら、プレートを３７℃で２時間インキュベーションする。その後、コーティング溶液を除去し、１００μl／ウェルのＰＢＳＴＣ（リン酸緩衝生理食塩水、０，０５％Tween（登録商標）20、２％ニワトリ血清）を追加する。プレートを室温で１時間インキュベーションする。ブロッキング溶液を除去し、サンプル（ブランク：ＰＢＳＴＣ、サンプル（１０μg/mlのＰＢＳ溶液）：抗ヒトＩＬ−１７抗体＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６、＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６−１３４、＜ＩＬ１７＞９Ｃ６−２Ｂ６−１３６、eBioscience (www.ebioscience.com)のＭａｂ１６−７１７８−８５；R&D Systems (www.rndsystems.com)のＭＡＢ３１７、ＮＶＰ−ＡＩＮ−４９７（国際公開第2006/013107号）；をプレートに追加する（１００μl／ウェル）。プレートを撹拌しながら室温でインキュベーションする。サンプルを除去し、プレートを２００μl／ウェルのＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、０，０５％Tween（登録商標）20）で３回洗浄し、マウス抗体を検出する場合には二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃガンマ、ＨＲＰコンジュゲート；Chemicon AP127P, www.millipore.com）、又はヒト化抗体を検出する場合にはヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃガンマ、ＨＲＰコンジュゲート（Chemicon AP113P）を追加する。二次抗体をＰＢＳＴＣで１：１００００希釈し、プレートを撹拌しながら室温で１時間インキュベーションする。二次抗体を除去し、プレートを２００μl／ウェルのＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、０，０５％Tween（登録商標）20）で３回洗浄し、１００μl／ウェルのABTS（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH）を追加する。ＩＬ−１７Ａ結合に関して、光学密度を４０５／４９２nmで測定する（１００％と設定）。同じアッセイフォーマットを用いて、他のヒトＩＬ−１７サブタイプ（ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆ）に対する結合を実施した。結果を表４に示す。この結果は、様々なＩＬ１７サブタイプに対する結合挙動が最も類似する抗体がR&D Systems (www.rndsystems.com)のＭＡＢ３１７であることを示している。

【0218】

【表7】

【0219】

実施例１１
サイトカイン放出アッセイ、ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞におけるＩＬ−１７Ａ誘導性ｈＩＬ−６及びｈＩＬ−８放出の阻害
抗ＩＬ−１７抗体をプレインキュベーションしてＩＬ−１７Ａ及びＴＮＦ−αで刺激した後のＣＣＤ−２５ＳＫ細胞（皮膚線維芽細胞、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４７４）のｈＩＬ−８産生の検出として、このアッセイを実施する。ＣＣＤ−２５ＳＫ細胞は、ＩＬ−１７レセプターを有する。可溶性ＩＬ−１７Ａは、これらのＩＬ−１７レセプターに結合する。ＩＬ−１７Ａに対する抗体は、ＩＬ−１７Ａに結合する。この機構は、ＴＮＦαの存在下でのみ作用している。ＩＬ−１７レセプターに対するＩＬ−１７Ａの結合を介して、この細胞はｈＩＬ−６及びｈＩＬ−８（これらは、リードアウトとしてＥＬＩＳＡによって検出することができる）を産生する。ｈＩＬ−６及びｈＩＬ−８の測定により、抗ＩＬ−１７抗体がＩＬ−１７によるＣＣＤ−２５ＳＫ細胞の刺激を阻害する濃度の情報が得られる。

【0220】

細胞２，５×１０^４個／ウェルの細胞密度でＣＣＤ−２５ＳＫ細胞を４８ウェルプレート（容量０，４５ml／ウェル）に播種し、３７℃及び５％ＣＯ_２で２４時間インキュベーションした。一晩インキュベーションした後、最終濃度９０００；３０００；１０００；３３３，３；１１１，１；３７，０３；１２，３４；及び４，１１ng/mlの抗ＩＬ−１７抗体で細胞を３０分間処置した。各抗体の希釈系列を培地で作った（５０μl／ウェル（１０倍濃縮））。３０分後、１０ng/mlのＩＬ−１７Ａ及び５０pg/mlのＴＮＦ−αの混合物で細胞を刺激した。５０μl／ウェルとし（１０倍濃縮）３７℃及び５％ＣＯ_２で２４時間インキュベーションした。一晩インキュベーションした後、上清を９６ウェルプレートに移し、ｈＩＬ−８ ＥＬＩＳＡ用の中間体として−２０℃で凍結した。

【0221】

ｈＩＬ−６及びｈＩＬ−８ ＥＬＩＳＡを以下のように実施した。１００μlの希釈捕捉抗体を各ウェルに追加し、４℃で一晩インキュベーションした。コーティング緩衝液で希釈を行った。プレートを吸引し、２００μl／ウェルで３回洗浄し、２００μl／ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした。プレートを吸引し、２００μl／ウェルで３回洗浄した。１００μlの標準及びサンプルを追加し、室温（ＲＴ）で２時間インキュベーションした。標準希釈系列：４００pg/ml；２００pg/ml；１００pg/ml；５０pg/ml；２５pg/ml；１２，５pg/ml；６，３pg/ml及びアッセイ希釈液（ネガティブコントロールとして）。サンプルの希釈は１：２００であった。プレートを吸引し、２５０μl／ウェルで４回洗浄した。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに追加した。検出抗体及びアッセイ希釈液で１：２５０希釈した酵素試薬を用いて、コンジュゲートを調製した。プレートを吸引し、２５０μl／ウェルで６回洗浄した。１００μlの基質を各ウェルに追加し、１２分間インキュベーションした。インキュベーション後、５０μl／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させた。３０分以内に４５０nmで読み取りを実施し、５７０nmでλ補正した。結果を表５に示す（ＩＣ_５０値は、８０％の最大阻害に関して測定したものである）。

【0222】

【表8】

【0223】

実施例１２
カニクイザルＩＬ−１７Ａとの交差反応性（結合アッセイ）
ヒト及びカニクイザルＩＬ１７Ａに対する相対結合を決定した。実施例２に従って、結合アッセイを実施した。２つの別個の実験（１つはマウスＩＬ１７抗体を比較したものでり、１つはヒト及びヒト化ＩＬ１７抗体を比較したものである）の結果を表６ａ及び表６ｂに示す。

【0224】

【表9】

【0225】

【表10】

【0226】

実施例１３
カニクイザル（Maccaca Fasicularis）サイトカイン放出アッセイ、カニクイザルＩＬ−１７Ａ誘導性ＩＬ−６及びＩＬ−８産生の阻害
カニクイザル皮膚線維芽細胞（ＣＤＦ）細胞は、ヒト又はカニクイザルＩＬ−１７Ａ刺激に応じてカニクイザルＩＬ−６及びＩＬ−８を産生する。ヒトＩＬ−１７に対して産生された抗ＩＬ−１７抗体と共に細胞を刺激前にプレインキュベーションした後、このカニクイザルＩＬ−１７Ａによって刺激されるＣＤＦ細胞によるＩＬ−６及びＩＬ−８産生の阻害を測定するために、このアッセイを実施する。

【0227】

細胞２×１０^５個／mlの細胞密度、０．５mlの容量でＣＤＦ細胞を４８ウェルプレーに播種し、３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩インキュベーションして接着させる。一晩インキュベーションした後、培地を４００μlの新鮮培地と交換し、広範な抗体濃度（１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０、３、０ng/ml）にわたって抗ＩＬ−１７抗体で細胞を３０分間処置する。５０μl／ウェル（１０倍濃縮）を使用して、各抗体の希釈系列を培地で作る。３０分後、１００ng/mlのＩＬ−１７Ａ（５０μlの１０００ng/ml、１０倍濃縮）で細胞を刺激し、３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩（１８時間）インキュベーションする。インキュベーション期間の後、上清を新たな試験管に移して直ぐに分析するか、又はＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃で保存する。ｈＩＬ−６及びｈＩＬ−８ ＥＬＩＳＡは、それらの各カニクイザルサイトカインと交差反応性であることが示されたので、サイトカインレベルを定量するのに使用する。ＥＬＩＳＡでは、１００μlの希釈捕捉抗体を各ウェルに追加し、４℃で一晩インキュベーションする。コーティング緩衝液で希釈を行う。プレートを吸引し、２００μl／ウェルで３回洗浄し、２００μl／ウェルのアッセイ希釈液でブロッキングし、室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションする。プレートを吸引し、２００μl／ウェルで３回洗浄する。１００μlの標準及びサンプルを追加し、製造業者の説明書に従って室温（ＲＴ）で２時間インキュベーションする。プレートを吸引し、２５０μl／ウェルで少なくとも３回洗浄する。１００μlのコンジュゲートを各ウェルに追加する。検出抗体及びアッセイ希釈液で１：２５０希釈した酵素試薬を用いて、コンジュゲートを調製する。プレートを吸引し、２５０μl／ウェルで少なくとも３回洗浄する。１００μlの基質を各ウェルに追加し、読み取るのに十分な発色までインキュベーションした。インキュベーション後、５０μl／ウェルの１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を停止させ、３０分以内に４５０nmの波長をプレートリーダーで読み取る。

【0228】

実施例１４
二重特異性＜ＴＷＥＡＫ−ＩＬ−１７＞抗体分子＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃４、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２０、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２１、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２３、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２４、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃５の発現及び精製
以下の二重特異性抗体＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃４、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２０、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２１、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２３、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃５（これらは、以下の表７に記載されている抗原結合部位（ＶＨ／ＶＬ）をベースとする）の軽鎖及び重鎖を、記載されているようにゲノム、部分ゲノム又はｃＤＮＡ由来の発現ベクターで構築した。二重特異性二価抗体＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２４の場合、国際公開第2009/080253号（"CrossMabs"又は"CH1-CL domain exchanged antibodies"）に記載されているフォーマットを使用した。二重特異性二価抗体＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃４、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２０、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２１、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃２３の場合、国際公開第2011/117330号（"bispecific one-armed scFab antibodies"）に記載されているフォーマットを使用し、＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞＃５の場合、国際公開第2010/112193号に記載されている二重特異性四価フォーマット（ｓｃＦａｂが重鎖のＮ末端に融合されている）を使用した。国際公開第2009/080253号、国際公開第2011/117330号及び国際公開第2010/112193号は、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0229】

プラスミドをE. coliで増幅し、精製し、続いてリコンビナントタンパク質の一過性発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。７日間の培養後、ＨＥＫ２９３細胞の上清を回収し、ろ過し、二重特異性二価抗体を精製した。

【0230】

【表11】

【0231】

MabSelect SuRe（商標）（GE Healthcare, Sweden）を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって、細胞培養上清から二重特異性抗体を精製した。MabSelect SuRe（商標）クロマトグラフィー後の二重特異性抗体の個々の生成物に関連する副生成物に関して、その後のクロマトグラフィー工程（サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60ゲルろ過カラム、GE Healthcare, Sweden）又はイオン交換クロマトグラフィー（MacroPrep CHT（商標）TypeII 10 ml, Bio-Rad＋サイズ排除クロマトグラフィー））を選択した。

【0232】

簡潔に言えば、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１mM ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７mM ＮａＣｌ及び２．７mM ＫＣｌ（ｐＨ７．４））で平衡化したMabSelect SuRe樹脂上に、滅菌ろ過した細胞培養上清を捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、２５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出したタンパク質画分をプールし、２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和した。１０mM ＮａＨ_２ＰＯ_４、２０mM ＭＥＳ、５０mM ＮａＣｌ、０．１mM ＣａＣｌ_２（ｐＨ７．５）でリバッファリングすることによって、抗体プールを疎水性相互作用クロマトグラフィー用に調製した。平衡化緩衝液（１０mM ＮａＨ_２ＰＯ_４、２０mM ＭＥＳ、５０mM ＮａＣｌ、０．１mM ＣａＣｌ_２（ｐＨ７．５））でＣＨＴカラムを平衡化した後、抗体をＣＨＴカラムにアプライし、平衡化緩衝液で洗浄し、直線勾配で１０mM ＮａＨ_２ＰＯ_４、２０mM ＭＥＳ、５００mM ＮａＣｌ、０．１mM ＣａＣｌ_２（ｐＨ７．５）に溶出させた。（イオン交換クロマトグラフィー又はMabSelect SuReアフィニティークロマトグラフィーからの）二重特異性抗体を含有する画分をプールし、２０mMヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。二重特異性抗体を含有する画分をプールし、Vivaspin限外ろ過装置（Sartorius Stedim Biotech S.A., France）を使用して必要濃度に濃縮し、−８０℃で保存した。

【0233】

実施例１５
二重特異性分子のＳＤＳ−ＣＥ及び分析的ＳＥＣ
ＳＤＳ−ＣＥ
マイクロ流体Labchip技術（Caliper Life Science, USA）を使用してＣＥ−ＳＤＳによって、二重特異性及びコントロール抗体の純度、抗体の完全性及び分子量を分析した。製造業者の説明書に従ってHT Protein Express Reagent Kitを使用して、５μlのタンパク質溶液をＣＥ−ＳＤＳ分析用に調製し、HT Protein Express Chipを使用してLabChip GXIIシステムで分析した。LabChip GXソフトウェアを使用して、データを分析した。

【0234】

分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィーを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔に言えば、様々なレベルの精製工程で精製した抗体を、Agilent HPLC 1100システムのTosoh TSKgel G3000SWカラム（３００mM ＮａＣｌ、５０mM ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中）、又はDionex HPLCシステムのSuperdex 200カラム（GE Healthcare）（２×ＰＢＳ中）にアプライした。ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって、溶出したタンパク質を定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準として用いた。

【0235】

【表12】

【0236】

実施例１６
ヒト滑膜線維芽細胞のＩＬ−１７誘導性サイトカイン刺激の阻害
ＲＡ患者から得られたヒト成人線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＲＡ）による炎症促進性サイトカイン（例えば、ヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−８）のＩＬ−１７誘導性産生の阻害について、様々な＜Ｔｗｅａｋ−ＩＬ−１７＞二重特異性抗体の抗ＩＬ−１７成分を試験した。様々なＲＡ−ＦＬＳドナーの用量反応応答の確立後、いくつかのリード候補の効力を評価した。

【0237】

ＨＦＬＳ−ＲＡ（Cat. #408RA-05a）は、Cell Applications Inc. (San Diego, CA, USA;ドイツの販売業者: tebu-bio, Offenbach, Germany)から購入した。細胞を解凍し、滑膜細胞成長培地（Cell Applications, Inc.; Cat. #415-500）で増殖させ、アキュターゼ（PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; Cat. #L11-007）で剥がしてから、９６ｗＦ細胞培養プレート（Costar/Corning Life Sciences, Amsterdam, The Netherlands; Cat. #3596）中の２００μl／ウェル培地に、１ウェル当たり約２×１０^４個のＨＦＬＳ−ＲＡ細胞を播種した。

【0238】

細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２日間前培養してから、サイトカイン（及び場合により抗体）を追加した。サイトカインを追加する前に培地を除去し、１５０μl/wの対応するサイトカイン（場合により抗体）希釈物を追加した：０〜１０μg/mlのリコンビナントヒトＩＬ−１７Ａ（PeproTech, Hamburg, Germany; Cat. #200-17）；０〜２５μg/mlのリコンビナントヒトＴＷＥＡＫ（R&D Systems, Wiesbaden, Germany; Cat. #1090-TW/CF）又は０〜１０μg/mlのリコンビナントヒトＴＮＦα（R&D Systems; Cat. #210-TA/CF）を１０回の１：１０希釈工程で滴定して、示されているサイトカインのＥＤ５０値を求めた。ＴＷＥＡＫをネガティブとして使用し、ＴＮＦをポジティブコントロールとして使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６時間、２４時間及び７２時間インキュベーションしたところ、７２時間で最も強いサイトカイン応答が（タンパク質レベルで）得られたので、このインキュベーション時間を以下の実験に使用した。細胞を様々な濃度（ｃ_ｆｉｎ＝０〜１５０／５００nM）のいくつかの抗体と共に３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間プレインキュベーションしてから、１００ng/ml〜１０μg/mlのＴＷＥＡＫによる刺激をさらに７２時間適用した。

【0239】

【表13】

【0240】

【表14】

【0241】

興味深いことに、本発明の二重特異性抗体は、親ＩＬ１７抗体と比較して改善されたＩＣ５０／結合価を示す。

【0242】

ＣＢＡによるサイトカイン決定
この後、約１２０μl/wの上清を９６ｗＲＢプレートに移し、サイトカイン分析を実施するまで−２０℃で保存した。これについては、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）プラットフォームを使用し、特にＩＬ−６及びＩＬ−８の産生（又はその阻害）を分析した。ヒトＩＬ−６（BD Biosciences, Cat. #558276）及びＩＬ−８（BD; Cat. #558277）フレックスセットを使用してHuman Soluble Protein Master Buffer Kit (BD Biosciences, Heidelberg, Germany, Cat. #558265)の製造業者の説明書に従って、アッセイを実施した。ＦＡＣＳアレイでプレートを測定し、ＦＣＡＰソフトウェアを使用して分析した（両方ともBD製）。

【0243】

実施例１７
ヒト滑膜線維芽細胞のＴｗｅａｋ誘導性増殖の阻害
ＲＡ患者から得られたヒト成人線維芽細胞様滑膜細胞（HFLS-RA; Cat. #408RA-05a）は、Cell Applications Inc. (San Diego, CA, USA;ドイツの販売業者: tebu-bio, Offenbach, Germany)から購入した。細胞を解凍し、増殖させ、アキュターゼ（PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria; Cat. #L11-007）で剥がした後、この後のCellTiter Glo増殖／生存率アッセイのために、９６ｗＦホワイトチムニープレート（Greiner Bio-one, Frickenhausen, Germany; #655098）中の１００μl／ウェル培地に、１ウェル当たり約２×１０^４個のＨＦＬＳ−ＲＡ細胞を播種した。予備実験では、製造業者の説明書に従ってClick-iT EdUキットを使用して、増殖を評価した（以下を参照のこと）。

【0244】

１：３希釈工程において、リコンビナントヒトＴＷＥＡＫ（R&D Systems, Wiesbaden, Germany; Cat. #1090-TW/CF）を０〜６，０００ng/ml、１００μl/w、トリプリケートで滴定して、用量反応曲線のＥＣ５０値を求めた。１ウェル当たりの総容量は２００μlであった。次いで、増殖が測定されるまで、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベーションした。

【0245】

最後の実験では、細胞を様々な濃度（ｃ_ｆｉｎ＝０〜１５０nM）の示されている抗体と共に３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間プレインキュベーションした。この後、１０〜２０ng/mlのリコンビナントヒトＴＷＥＡＫを各ウェル（５０μl/w）に追加し、さらに７２時間培養することによって、細胞を刺激した。リコンビナントＩＬ−１７又はＴＮＦαによる刺激は、測定可能なＨＦＬＳ増殖誘導をもたらさなかった。

【0246】

増殖アッセイ
一般的な細胞生存率／活性によって測定した場合の増殖を評価するために、CellTiter Gloキット(Promega GmbH, Mannheim, Germany; Cat. #G7571）を使用した。簡潔に言えば、基質及び緩衝液を解凍し、基質を１０mlの緩衝液に溶解した。平衡化のために、プレートを室温で３０分間インキュベーションし、遠心分離し、１００μlの細胞上清を１００μlのCellTiter Glo試薬（１ウェル当たり）に追加した。プレートを２分間振盪し、１０分間のシグナル平衡化後、以下の設定：96 w F Greinerチムニーホワイト／発光／０〜１０００msでTecan Infinite 2000リーダー（Tecan, Crailsheim, Germany）を使用して、発光を測定した。

【0247】

予備実験では、製造業者の説明書（Invitrogen, Cat. # A10208）に従ってClick-iT EdU A647キットを使用して、増殖を評価した。

【0248】

【表15】

【0249】

【表16】

【0250】

実施例１８
＜ＴＷＥＡＫ−ＩＬ−１７＞抗体分子の小スケール動的光散乱（ＤＬＳ）ベースの粘度測定。
本質的には[He, F., et al., Analytical Biochemistry 399(1) (2009), 141-3]に記載されているように、粘度測定を実施した。簡潔に言えば、サンプルを濃縮して様々なタンパク質濃度の２００mMコハク酸アルギニン溶液（ｐＨ５．５）にしてから、ポリスチレンラテックスビーズ（直径３００nm）及びポリソルベート２０（０．０２％v/v）を追加する。０．４μmフィルタプレートによる遠心分離によって、サンプルをオプティカル３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで被覆する。２５℃における動的光散乱によって、ラテックスビーズの視直径を決定する。溶液の粘度は、η＝η_０（ｒ_ｈ／ｒ_ｈ，０）（η：粘度；η_０：水の粘度；ｒ_ｈ：ラテックスビーズの流体力学視半径；ｒ_ｈ，０：水中におけるラテックスビーズの流体力学半径）のように決定することができる。

【0251】

同じ濃度で様々なサンプルの比較を可能にするために、Mooney式（式１）[(Mooney, Colloid Sci, 1951; Monkos, Biochem. Biophys. Acta 1997)]を用いて、粘度−濃度データをフィッティングし、それに応じてデータを補間する。

【0252】

【数1】

（Ｓ：タンパク質の流体力学的相互作用パラメータ；Ｋ：自己込み合い係数（self-crowding factor）；Φ：溶解したタンパク質の体積分率）

【0253】

比較のために、国際公開第2010/102251号に記載されているＩＬ１７ベースの二重特異性抗体Ｄ２Ｅ７−Ｂ６−１７．８ＤＶＤ−Ｉｇ（これは、第２の特異性としてＴＮＦαに結合する）のデータも決定した。

【0254】

【表17】

【0255】

二重特異性抗体の安定性
サンプルを濃縮して最終濃度１５０mg/mLの２００mMコハク酸アルギニン溶液（ｐＨ５．５）にし、滅菌ろ過し、４０℃で４日間静止保存する。保存前後に、サイズ排除クロマトグラフィーによって、高分子量（ＨＭＷ）種の含有量を決定する。保存したサンプルと、調製直後に測定したサンプルとの間のＨＭＷ含有量の差異を「ＨＭＷの増加」と報告する。比較のために、国際公開第2010/102251号に記載されているＩＬ１７ベースの二重特異性抗体Ｄ２Ｅ７−Ｂ６−１７．８ＤＶＤ−Ｉｇ（これは、第２の特異性としてＴＮＦαに結合する）のデータも決定した。

【0256】

【表18】

【0257】

実施例１９
本発明の二重特異性＜ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７＞抗体の結合
２５℃でBIAcore（登録商標）T100機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、二重特異性抗体及び親抗体の＜ＩＬ１７＞及び＜ＴＷＥＡＫ＞結合親和性を測定した。BIAcore（登録商標）システムは、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。ＳＰＲ−技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップの表面に近い屈折率の測定に基づくものである。屈折率の変化は、固定化リガンドと、溶液中の注入された分析物との相互作用によって引き起こされる表面上の質量変化を示す。分子が表面上の固定化リガンドに結合する場合には質量が増加し（その逆もまた同様である）、固定化リガンドから分析物が解離する場合には質量が減少する（複合体の解離を反映）。ＳＰＲは、リガンド／分析物結合の連続的なリアルタイムモニタリングを可能にするので、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡定数（ＫＤ）の決定を可能にする。

【0258】

ＩＬ１７結合親和性
GE Healthcareが供給しているアミンカップリングキットを使用することによって、約１２０００反応単位（RU）の捕捉系（１０μg/mlのヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２；注文コード：28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Schweden）をCM5チップ上にｐＨ５．０でカップリングした。サンプル及びシステムバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Tween20を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）であった。流量１０μl／分で５０nM溶液を１分間注入することによって、二重特異性抗体を捕捉した。１：１希釈で５０nMから開始して流量３０μl／分で様々な濃度のヒトＩＬ１７溶液を３分間注入することによって、会合を測定した。解離期を最大５分間モニタリングし、サンプル溶液からランニング緩衝液に切り替えることによってトリガーした。グリシン溶液（ｐＨ２．１）による６０秒間の洗浄を流速３０μl／分で２回行うことによって、表面を再生した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた反応を差し引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。ブランクの注入も差し引く（＝二重参照）。見掛けのＫ_Ｄ及び他の動態パラメータの計算のために、Langmuir１：１モデルを使用した。結果を以下の表１７に示す。

【0259】

【表19】

【0260】

ＴＷＥＡＫ結合親和性
センサー表面に対するＴＷＥＡＫ分析物の非特異的結合が強いため、逆の設定（ＴＷＥＡＫをリガンドとして使用）を選択した。GE Healthcareが供給しているアミンカップリングキットを使用して、約１００反応単位（RU）のＴＷＥＡＫをCM1チップ表面上にｐＨ５．０で固定化した。サンプル及びシステムバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Tween20を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）であった。１：１希釈で５０nMから開始して流量３０μl／分で様々な濃度の二重特異性抗体溶液を３分間注入することによって、会合を測定した。解離期を最大１０分間モニタリングし、サンプル溶液からランニング緩衝液に切り替えることによってトリガーした。３Ｍ ＭｇＣｌ２溶液による３０秒間の洗浄を流速３０μl／分で３回行うことによって、表面を再生した。ブランクカップリング表面から得られた反応を差し引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。ブランクの注入も差し引く（＝二重参照）。見掛けのＫ_Ｄ及び他の動態パラメータの計算のために、Langmuir１：１モデルを使用した。結果を以下の表１８に示す。

【0261】

【表20】

【0262】

両ターゲットヒトＴＷＥＡＫ及びヒトＩＬ１７に対する＜ＴＷＥＡＫ／ＩＬ１７＞抗体の同時結合
GE Healthcareが供給しているアミンカップリングキットを使用することによって、約１２０００反応単位（RU）の捕捉系（１０μg/mlのヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２；注文コード：28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Schweden）をCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）上にｐＨ５．０でカップリングした。サンプル及びシステムバッファーは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Tween20を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）（ｐＨ７．４）であった。フローセルの温度を２５℃に設定し、サンプルブロックの温度を１２℃に設定した。捕捉前に、フローセルをランニング緩衝液で２回プライミングした。流量１０μl／分で５０nM溶液を６０秒間注入することによって、二重特異性抗体を捕捉した。連続して又は同時に追加（流量３０μl／分）した各リガンドの活性結合能を決定することによって、二重特異性抗体に対する各リガンドの個別の結合を分析した：

【0263】

１）濃度５０nMのヒトＴｗｅａｋ−Ｆｃを１２０秒間注入する（抗原の単一結合を同定する）。２）濃度５０nMのヒトＩＬ１７Ａ／Ａを１２０秒間注入する（抗原の単一結合を同定する）。３）濃度５０nMのヒトＴｗｅａｋ−Ｆｃを１２０秒間注入し、続いて濃度５０nMのヒトＩＬ１７Ａ／Ａをさらに注入する（Ｔｗｅａｋの存在下でＩＬ１７Ａ／Ａの結合を同定する）。４）濃度５０nMのヒトＩＬ１７Ａ／Ａを１２０秒間注入し、続いて濃度５０nMのヒトＴｗｅａｋ−Ｆｃをさらに注入する（ＩＬ１７Ａ／Ａの存在下でＴｗｅａｋの結合を同定する）。５）濃度５０nMのヒトＩＬ１７Ａ／Ａ及び濃度５０nMのヒトＴｗｅａｋ−Ｆｃを１２０秒間同時注入する（Ｔｗｅａｋ及びＩＬ１７Ａ／Ａの結合を同時に同定する）。

【0264】

グリシン溶液（ｐＨ２．１）による６０秒間の洗浄を流速３０μl／分で２回行うことによって、表面を再生した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ表面から得られた反応を差し引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。アプローチ３、４及び５の得られた最終シグナルが、アプローチ１及び２の個々の最終シグナルの合計に等しい場合、二重特異性抗体は両抗原に相互に独立して結合することができる。

【0265】

【表21】

【図1a】

【図1b】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]