特許 6010136 ナチュラルキラー細胞の製造方法、その方法により製造されたナチュラルキラー細胞、並びにそれを含む腫瘍及び感染性疾患治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6010136

(24)【登録日】2016年9月23日

(45)【発行日】2016年10月19日

(54)【発明の名称】ナチュラルキラー細胞の製造方法、その方法により製造されたナチュラルキラー細胞、並びにそれを含む腫瘍及び感染性疾患治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20161006BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20161006BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20161006BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20161006BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20161006BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0783

   A61P35/00

   A61P31/00

   A61P1/00

   A61P1/16

   A61P13/08

   A61P15/00

   A61P1/18

   A61P5/14

   A61P11/04

   A61P35/02

   A61P25/00

   A61P27/02

   A61P1/02

   A61P31/16

   A61P31/20

   A61P31/14

   A61K47/42

   A61K35/15 Z

【請求項の数】8

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2014-548657(P2014-548657)

(86)(22)【出願日】2012年12月18日

(65)【公表番号】特表2015-502756(P2015-502756A)

(43)【公表日】2015年1月29日

(86)【国際出願番号】KR2012011114

(87)【国際公開番号】WO2013094988

(87)【国際公開日】20130627

【審査請求日】2014年8月25日

(31)【優先権主張番号】10-2011-0140361

(32)【優先日】2011年12月22日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】504385351

【氏名又は名称】モガム バイオテクノロジー インスティチュート

(73)【特許権者】

【識別番号】514159313

【氏名又は名称】グリーン クロス ラボ セル コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｌａｂ Ｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100185915

【弁理士】

【氏名又は名称】長山 弘典

(74)【代理人】

【識別番号】100194973

【弁理士】

【氏名又は名称】尾崎 祐朗

(72)【発明者】

【氏名】ミン ボギョン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ ハナ

(72)【発明者】

【氏名】リム オクジェ

(72)【発明者】

【氏名】ヘル ジュンヒョン

(72)【発明者】

【氏名】カン サンミ

(72)【発明者】

【氏名】イ ウンギョン

(72)【発明者】

【氏名】チュン ヘジン

(72)【発明者】

【氏名】ファン ユギョン

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／１１０７３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０６０８６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２９３４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００６８３０６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９８／００６８２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５０１１７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Immunological Methods，２００５年，Vol. 307, No. 1-2，p. 24-33

【文献】 "CTS (TM) AIM V (R) Medium"，Thermo Fisherホームページ，(2015年8月24日入手(URL：http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/0870112BK?ICID=search-product))

【文献】 "Data Sheet: CellGro/CellGenix GMP Serum-free Stem Cell Growth Medium (SCGM) Xeno-free"，岩井化学薬品株式会社ホームページ，２０１１年 ５月１６日，(2015年8月24日入手(URL：http://www.iwai-chem.co.jp/products/cellgenix/20802-0500.pdf))

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ヒト末梢血からＮＫ細胞を分離する段階と；
（ｉｉ）抗−ＣＤ３抗体、サイトカイン、及び支持細胞としての不活性化された末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含む培地に２〜１５日間静置培養してＮＫ細胞を刺激し、細胞間接触を生じさせる段階と；
（ｉｉｉ）前記段階（ｉｉ）から静置培養が完了した後、サイトカイン、抗−ＣＤ３抗体、及び支持細胞としての不活性化された末梢血単核球細胞を添加して再刺激し、再び静置培養し、細胞間接触を誘導する段階と、ここで、前記の細胞の再刺激及び静置培養の実施は、２回以上繰り返されるものとし；
（ｉｖ）静置培養が完了した後、静置または浮遊培養のために必要なサイトカインが含有された培地を追加し、細胞濃度及びサイトカイン濃度を一定に維持しながら静置または浮遊培養する段階と；
を含み、ここで、前記サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、及びインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）からなる群より選択される一つ以上であるものとする、ＮＫ細胞の製造方法。

【請求項2】

前記（ｉｉｉ）段階の静置培養は２〜７日間行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記（ｉｖ）段階の浮遊培養は振盪フラスコ、振盪培養器、発酵槽、Ｔ−フラスコ及び使い捨ての細胞培養バックからなる群より選択される反応器を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記（ｉｉ）または前記（ｉｉｉ）段階の静置培養及び前記（ｉｖ）段階の静置または浮遊培養は同じ反応器または相異な反応器で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記（ｉｖ）段階の静置または浮遊培養の間に、細胞濃度及びサイトカイン濃度を測定し、サイトカインを含む培地を添加することにより細胞濃度及びサイトカイン濃度を一定に維持することを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記抗−ＣＤ３抗体はＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１、及びＨＩＴ３ａからなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記抗−ＣＤ３抗体はＯＫＴ３であることを特徴とする請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記サイトカインは、ＩＬ−２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ、以下、「ＮＫ細胞」という）の製造方法、その方法により得られたＮＫ細胞、並びにそれを含む腫瘍及び感染性疾患治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

癌治療のために、手術、放射線治療、化学療法などの様々な治療法が開発されて用いられているが、癌の種類や患者の状態によっては、上記の治療法の適用が困難である場合があり、再発可能性が高いという欠点がある。

【0003】

したがって、患者の免疫機能を用いた免疫療法（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）に対する関心が高まっている。免疫療法は、様々な機能を有する免疫細胞の複雑な相互作用により腫瘍が除去される特性を利用した治療法である。癌細胞を直接除去する免疫細胞としては、ＮＫ細胞や細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）などが挙げられ、これらエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）に抗原を提示する抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）としては、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）やＢ細胞が挙げられ、その他に、各種サイトカインを分泌するヘルパーＴ細胞（Ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ；Ｔｈ ｃｅｌｌ）、調節性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ；Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌ）などがともに関与する。これらのうちＮＫ細胞は、免疫細胞治療法で最も効果が速く、且つ効率的な免疫細胞として重要視されている。

【0004】

ＮＫ細胞は、血球細胞の約１０％程度を占めており、免疫反応において重要な役割をするリンパ球系細胞の一つである。ＮＫ細胞は、諸機能を果たすことができるが、特に、癌細胞や外部から侵入した病原菌に感染された細胞などを殺す能力を有していて、腫瘍化したかまたは腫瘍化が進んでいる異常細胞を除去する役割をする。

【0005】

正常な状態で体内に存在する大部分のＮＫ細胞は不活性化状態で存在する。しかし、実際にＮＫ細胞を治療用途に用いるためには、活性化されたＮＫ細胞が必要であるため、正常血液からまたは不活性化した患者血液からＮＫ細胞を活性化させる研究が活発に行われている。

【0006】

体外でＮＫ細胞を活性化させることで達成される、ＮＫ細胞の高い細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によるＮＫ細胞の免疫細胞治療の可能性が確認されている。体外で活性化されたＮＫ細胞を、様々な種類の癌、特に白血病などの血液癌（ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）を対象として、同種骨髄移植後に投与することで、その治療効果が確認されたという報告（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＆Ｄｉｓｅａｓｅ，３３：ｐ２６１−２６６，２００４）があるが、血液癌でなく固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ）に対しては、臨床的に確実な治療効果が未だに立証されていない。具体的に、ＮＫ細胞を腫瘍が生じる前から投与することで、腫瘍の生着を抑えることができるという報告があるが（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５６（１１）：ｐ１７３３−１７４２，２００７）、適した治療モデルとはいえず、腹腔内にＮＫ細胞を投与することで乳癌細胞の成長を阻害した動物実験結果もあるが、ＮＫ細胞による効果であるかが不明である（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１０４（３）：ｐ２６７−２７５，２００７）。

【0007】

一方、上記のような癌や感染性疾患の治療剤としてのＮＫ細胞の可能性にもかかわらず、体内に存在するＮＫ細胞の数は多くない。そのため、ＮＫ細胞を治療用途に使用できる程度の十分な効能を保持しながらも、大量に生産することができる技術が必須であるが、ＮＫ細胞は、インビトロで大量増殖及び培養が十分になされない。したがって、ＮＫ細胞を実際に有用な水準に増幅及び培養するための技術に対する関心が高まっており、多くの研究が行われているが、臨床に適用可能な水準には未だに達していない。

【0008】

ＮＫ細胞の培養に、既存のＴ細胞増殖／活性に用いられていたＩＬ−２だけでなく、ＩＬ−１５（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７（６）：ｐ３１２９−３１３８，２００１；Ｂｌｏｏｄ，１０６（１）：ｐ１５８−１６６，２００５，韓国特許出願公開第２００９−０１２１６９４号公報）、ＬＰＳ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５（１）：ｐ１３９−１４７，２０００）、ＣＤ３を刺激するＯＫＴ−３抗体（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９（１）：ｐ１０４−１１３，２００１）を用いる研究が行われてきたが、これらは、従来から用いられてきたＩＬ−２の使用の変形及び発展の形態で新たな増殖物質を見出したものにすぎず、画期的な増殖方法は提示していない。通常、ＩＬ−２またはその他のサイトカイン及び化合物を用いたＮＫ細胞培養では、初期ＮＫ細胞に比べ３〜１０倍程度しか細胞数が増加されないと知られている。

【0009】

一部の研究者らにより、腫瘍細胞株を支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）として用いてＮＫ細胞を増幅させた例も報告されたことがある。白血病細胞株であるＣＴＶ−１を用いた場合には、増殖の改善が殆どなく（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８（１）：ｐ８５−９４，２００７）、ＥＢＶ−ＬＣＬを用いて２１日間培養した場合には、平均４９０倍程度に増殖されたと報告されている（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１１（３）：ｐ３４１−３５５，２００９）。また、Ｋ５６２細胞株に４−１ＢＢＬと膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ）されたＩＬ−１５を発現させた人工抗原提示細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ））を用いて３週間培養した結果、平均２７７倍に増加されて、インビトロ及びインビボで高い細胞毒性を示したが、細胞死滅による制限された増殖を示した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６９（９）：ｐ４０１０−４０１７，２００９）。近年、ＭＩＣＡ、４−１ＢＢＬ、及びＩＬ−１５をＫ５６２細胞株に発現させ、３週間培養することで、平均３５０倍に増殖させたという報告もあり（Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：ｐ４６７−４７５、２０１０）、Ｋ５６２細胞株に膜結合されたＩＬ−２１を発現させ、７日間隔で再刺激しながら２週間培養することで、平均２１，０００倍に増殖させたという報告もあった。しかし、上記の全ての報告は、癌細胞株を支持細胞として用いるなど、臨床適用において重要な安全性を保障するには適していない方法を利用しており、正常細胞でなく特定癌細胞株を支持細胞として用いるため、特定癌細胞に対するプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）特異性が付与されたＮＫ細胞であるという限界がある。

【0010】

ＮＫ細胞の分離過程を経ずに末梢血リンパ球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＰＢＬ）からＮＫ細胞を選択的に増幅させる方法により得られた細胞は、純粋なＮＫ細胞群に比べ細胞殺傷能が劣り、純粋なＮＫ細胞だけでなくＴ−細胞も存在するため、自己ＭＨＣ分子により自己と非自己を認識するＴ細胞を除去しない限り、自己移植に限定されるしかないという問題点がある。近年、ＮＫ細胞のみを精製した後、支持細胞を用いながら適切な刺激を与えて増幅させる方法や、全体ＰＢＬまたは末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を用いてＮＫ細胞を選択的に増幅する方法などが開発されており、抗−ＣＤ３抗体及びインターロイキンが含有された培地を用いて、末梢血リンパ球細胞の存在下でＮＫ細胞を培養する工程を含むＮＫ細胞の培養方法が開発されて報告されている（韓国特許出願公開第２０１０−００１１５８６号公報）。同種に適用するための一般的増殖過程はＣＤ３＋Ｔ細胞の磁性除去及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞増殖という二つ連続的な段階から始まる。ＮＫ細胞増殖を刺激するため、ＰＢＭＣｓ（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １２：７５０−７６３，２０１０），ＥＢＶ−ＬＣＬｓ［Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ］のような不活性化支持細胞がしょっちゅう使用される。不活性化支持細胞は体液性因子及び直接的な細胞間の接触を通じてＮＫ細胞を刺激する［Ｂｌｏｏｄ ８０：２２２１−２２２９，１９９２］。
本発明の本出願の発明者らは、臨床的使用のため健康な支援者らから収得したＮＫ細胞を大量増殖及び活性化するための簡単で効率的な方法を打ち立てた。ＣＤ３＋Ｔ細胞を磁性除去する段階を経てＴ細胞が除去されたＰＢＭＣｓを刺激してＯＫＴ３及びＩＬ−２存在下で反復的に不活性化支持細胞と共に増殖した結果、同種目的のため、望ましい高純度のＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団を製造した。

【0011】

一方、アルブミンは、細胞の基本物質を構成するタンパク質の一つであり、自然状態で存在する単純タンパク質のうち分子量が最も少ない。一般に、生物学的製剤の保存剤として使用される場合はあるが、ＮＫ細胞の安全性を高めるために使用された報告は全くない。

【0012】

上述のように様々なＮＫ細胞の培養方法が開発されてきたが、依然として、免疫細胞治療に適用するに十分な数のＮＫ細胞を、臨床適用に適した方法で、安全で且つ安定的に培養及び増殖できる方法、及び生産されたＮＫ細胞を長期間にわたって安定して保存し、必要な時期に供給できる技術に対する需要が強く要求されている状況である。特に、生きているＮＫ細胞を治療用として用いるためには、その活性が維持される期間、すなわち、有効期間が数日に過ぎないという欠点を解決するべきであるが、ＮＫ細胞を培養して製造した後、凍結保存し、必要な時に解凍して提供することで、免疫細胞の活用を画期的に改善することができる技術に対する需要も強く要求されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明の目的は、ＮＫ細胞を、臨床適用に適するように、効率的で且つ安全な方法で培養及び増殖することで、高い細胞殺傷能を有するＮＫ細胞を短期間内に大量生産することができる方法を提供することにある。

【0014】

また、本発明の他の目的は、長期保存安定性が向上されたＮＫ細胞を含む組成物及びそれを用いた医薬製剤を提供することにある。特に、本発明による組成物は、凍結された形態で製品化されて提供されることができ、解凍時にもＮＫ細胞の高い細胞生存率及び細胞殺傷能を保持することができる。

【0015】

上記の特性により、本発明による方法で製造されたＮＫ細胞及びそれを含む組成物は、腫瘍及び感染性疾患の治療に有用に用いられることができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】支持細胞を用いた再刺激によるＮＫ細胞の増殖率の変化を示した図面である。（ａ）は、再刺激回数によるＮＫ細胞の増殖率差を示した図面であって、１回は、０日目に刺激を１回与えた場合を示し、２回は、０日目及び７日目に刺激を２回与えた場合を示し、３回は、０日目、７日目、及び１４日目に刺激を３回与えた場合を示す。また、（ｂ）は、再刺激を与える時期によるＮＫ細胞の増殖率差を示した図面であって、Ｄ０は、０日目に刺激を１回与えた場合を示し、Ｄ０／Ｄ７は、０日目及び７日目に刺激を２回与えた場合を示し、Ｄ０／Ｄ１０は、０日目及び１０日目に刺激を２回与えた場合を示す。

【図2】支持細胞で再刺激して培養されたＮＫ細胞の細胞生存率の変化を示した図面であって、Ｄ０は、０日目に刺激を１回与えた場合を示し、Ｄ０／Ｄ７は、０日目及び７日目に刺激を２回与えた場合を示し、Ｄ０／Ｄ１０は、０日目及び１０日目に刺激を２回与えた場合を示す。

【図3】支持細胞で再刺激して培養されたＮＫ細胞の細胞殺傷能の変化を示した図面であって、Ｄ０は、０日目に刺激を１回与えた場合を示し、Ｄ０／Ｄ７は、０日目及び７日目に刺激を２回与えた場合を示し、Ｄ０／Ｄ１０は、０日目及び１０日目に刺激を２回与えた場合を示す。

【図4】支持細胞で再刺激して培養されたＮＫ細胞の表現型をＦＡＣＳで分析した結果を示した図面であって、（ａ）はＮＫ細胞表現型の確認及び純度を示し、（ｂ）はＮＫ細胞表現型の活性因子を示し、（ｃ）はＮＫ細胞表現型の抑制因子を示す。

【図5】ＮＫ細胞を含む組成物に添加されたアルブミンの濃度による細胞生存率及び細胞殺傷能の変化を示した図面であって、（ａ）はＮＫ細胞生存率の変化を示し、（ｂ）はＮＫ細胞殺傷能の変化を示す。

【図6】アルブミンの添加による組成物中におけるＮＫ細胞の細胞生存率、細胞殺傷能、及び表現型の変化を示した図面であって、（ａ）はＮＫ細胞生存率の変化を示し、（ｂ）はＮＫ細胞殺傷能の変化を示し、（ｃ）はＮＫ細胞表現型の変化を示す。

【図7】凍結によるＮＫ細胞の変化を示した図面であって、（ａ）は凍結／解凍後の細胞生存率を示し、（ｂ）は凍結／解凍後の回収率を示し、（ｃ）は凍結／解凍後の細胞殺傷能を示し、（ｄ）は凍結／解凍後のＣＤ５６^＋細胞発現率を示す。

【図8】リンパ腫動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗癌効果を示した図面であって、（ａ）は実験モデルの下肢麻痺の改善効果を示し、（ｂ）は実験モデルの生存率の改善効果を示す。

【図9】脳腫瘍動物モデルにおける頭蓋内投与時のＮＫ細胞の抗癌効果を示した図面であって、（ａ）は、組織検査により癌細胞の体積を観察した結果を示し、（ｂ）は、ＮＫ細胞数によるＴＵＮＥＬ分析結果を示し、（ｃ）は、ＮＫ細胞数による癌細胞の体積変化を示す。

【図10】脳腫瘍動物モデルにおける静脈内投与時のＮＫ細胞の抗癌効果を示した図面であって、（ａ）は、組織検査により癌細胞の体積を観察した結果を示し、（ｂ）は、ＮＫ細胞数による癌細胞の体積変化を示す。

【図11】抗癌剤との併用投与による脳腫瘍動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗癌効果を示した図面である。

【図12】卵巣癌動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗癌効果を示した図面であって、（ａ）は、ＮＫ細胞の投与期間による癌細胞のサイズ変化（生体イメージ）を示し、（ｂ）は、ＮＫ細胞の投与による癌細胞のサイズ変化を観察した結果を示す。

【図13】肝臓癌動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗癌効果を示した図面である。

【図14】神経芽細胞腫におけるＮＫ細胞の抗癌効果を示した図面である。

【図15】多様な癌細胞株及びウイルス感染細胞株におけるＮＫ細胞のインビトロでの効能を示した図面である：（ａ）Ｋ５６２細胞株（白血病）に対する細胞殺害能及びサイトカイン分泌能；（ｂ）Ｒａｊｉ細胞株（リンパ腫）に対する細胞殺害能；（ｃ）ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株（神経芽細胞腫）に対する細胞殺害能及びサイトカイン分泌能；（ｄ）ＳＮＵＯＴ−Ｒｂ１細胞株（網膜芽腫）に対する細胞殺害能；（ｅ）Ｕ８７−ＭＧ細胞株（神経膠芽腫）に対する細胞殺害能；（ｆ）ＯＶＣＡＲ−３細胞株（卵巣癌）に対する細胞殺害能及びサイトカイン分泌能；（ｇ）Ｈｕｈ−７細胞株（ＨＣＣ，原発性肝細胞癌）に対する細胞殺害能及びサイトカイン分泌能；（ｈ）ＳＮＵ３９８細胞株（ＨＢＶ感染ＨＣＣ）に対する細胞殺害能及びサイトカイン分泌能；（ｉ）Ｈｕｈ−７．５（ＨＣＶ感染ＨＣＣ）に対する細胞殺害能及びサイトカイン分泌能。

【発明を実施するための形態】

【0017】

特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練した当業者が通常的に理解しているものと同一の意味を有する。一般に本明細書で用いられた命名法は、本技術分野において公知であり、通常的に用いられるものである。

【0018】

本発明によるＮＫ細胞の製造方法は、Ｔ細胞が除去された単核球細胞を、サイトカインを含有する培地で抗−ＣＤ３抗体及び支持細胞を用いて刺激した後、数日間静置培養することで細胞間接触を刺激し、細胞濃度及びサイトカイン濃度を一定に維持しながらＮＫ細胞反応器で静置または浮遊培養を繰り返すことを含む。増加された含量のＮＫ細胞を収得するため、以降の静置または浮遊培養の前に刺激及び静置培養を繰り返して行うことができる。本発明の方法により製造されたＮＫ細胞は、高い細胞生存率及び細胞殺傷能を保持するため、腫瘍及び感染性疾患に対して高い治療効果を示し、高効率及び高濃度で体外培養が可能である。

【0019】

本発明によれば、最初刺激後の静置培養は、約２〜１５日間、好ましくは５〜１０日間行われ、再刺激後の静置培養は、約２〜７日間、好ましくは３〜５日間行われる。また、静置培養が完了した後には、サイトカインの濃度を一定に維持しながら浮遊培養器で培養することが好ましい。

【0020】

本発明によるＮＫ細胞の製造方法は、特に制限されないが、例えば、下記の段階を含んで行われることができる。

【0021】

（ｉ）ヒト末梢血から末梢血リンパ球細胞及びＮＫ細胞を分離する段階；
（ｉｉ）分離したＮＫ細胞を抗−ＣＤ３抗体及びサイトカインが含有された培地に入れた後、支持細胞を添加して刺激し、細胞間接触が起こるように２〜１５日間、好ましくは５〜１０日間静置培養する段階；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）段階の静置培養が完了した後、サイトカイン、抗−ＣＤ３抗体及び支持細胞を添加して再刺激し、細胞間接触が起こるように２〜７日間、好ましくは３〜５日間さらに静置培養する段階；
（ｉｖ）静置培養が完了した後、浮遊培養のために必要なサイトカインなどが含有された培地を追加し、細胞濃度及びサイトカイン濃度を一定に維持しながら浮遊培養する段階。

【0022】

前記ＮＫ細胞の製造方法において、必要に応じて、段階（ｉｉｉ）により再刺激してさらに静置培養する段階を１回以上繰り返して行うことができる。また、前記ＮＫ細胞の製造方法は、段階（ｉｉ）の前に、支持細胞を準備する段階をさらに含むことができる。

【0023】

本発明における静置培養（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、培養器で撹拌（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）または振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）することなく放置した状態で培養することを意味し、浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、通気（ａｅｒａｔｉｏｎ）や撹拌などにより、細胞が反応器の下部または側面部に付着されずに懸濁された状態で培養することを意味する。

【0024】

本発明において、静置培養のための反応器として、フラスコ、Ｔ−フラスコ、使い捨ての細胞培養バックなどが使用できるが、これに制限されるものではない。また、本発明において、浮遊培養のための反応器として、振盪フラスコ、振盪培養器、発酵槽、Ｔ−フラスコ、使い捨ての細胞培養バック（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）などが使用できるが、これに制限されるものではない。さらに、本発明の目的を達成するのに適した生物反応器として、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に採択可能な如何なる反応器も使用できる。

【0025】

また、静置培養のための反応器と浮遊培養のための反応器とは、同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。静置培養のための反応器と浮遊培養のための反応器とが同一である場合には、同一の反応器で静置培養を完了した後、サイトカインなどの必要な栄養成分を含有する培地をさらに供給して浮遊培養方式で培養することができる。また、互いに異なる種類の反応器を用いる場合には、静置培養が完了した後、培養物を浮遊培養のための反応器に移して浮遊培養することができる。

【0026】

このような浮遊培養のための反応器の例としては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＷａｖｅ生物反応器（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社の使い捨ての生物反応器（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｕｓｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ；ＳＵＢ）、Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ社の使い捨てのＸＤＲ生物反応器（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｕｓｅ ＸＤＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、ニプロ株式会社の細胞培養バック、ＰＢＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社のＰＢＳシリーズ細胞培養器（国際公開第０７／１１１６７７Ａ号、国際公開第０８／１３３８４５Ａ号、国際公開第０９／１３２１９２Ａ号など参照）、藤森工業株式会社の細胞培養バック（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ社の使い捨ての振盪フラスコ（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｓｈａｋｅ Ｆｌａｓｋｓ）などが挙げられるが、これに限定されるのではなく、特に、ＰＢＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＰＢＳシリーズ細胞培養器が好ましい。

【0027】

本発明における「支持細胞（培養補助細胞ともいう）」とは、分裂増殖能力はないが、代謝活性能を有するため、様々な代謝物質を生産して目的ＮＫ細胞の増殖を助ける細胞を意味する。本発明で使用できる支持細胞としては、遺伝子が導入された動物細胞株、各種サイトカインや化合物で処理された末梢血リンパ球細胞（ＰＢＬ）、自己または他人の末梢血リンパ球細胞、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞（Ｂ−ｃｅｌｌ）、または単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などが挙げられ、好ましくは、自己末梢血単核球細胞が使用できるが、これに限定されるものではない。すなわち、本発明が属する技術分野において通常的に使用可能であると知られた他の支持細胞も、本発明の目的にかなうかぎり、制限されずに使用可能であることはいうまでもない。

【0028】

前記支持細胞として使用される自己末梢血単核球細胞を不活性化させて使用することで、安全性を確保することができる、不活性化させる方法としては、当業界に公知された通常の方法が用いられることができ、例えば、ガンマ線を照射する方法が用いられることができる。このように不活性化された支持細胞は、分離されたＴ−細胞を含む。本発明のように支持細胞を用いる増殖方法は、ＮＫ細胞を純粋分離した後に増殖させる方法であって、以後にも純粋ＮＫ細胞のみが増殖するという利点がある。

【0029】

本発明における抗−ＣＤ３抗体とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合して抗原認識複合体を形成する分子群であるＣＤ３抗原に特異的に結合する抗体を意味し、ＣＤ３分子は、ＴＣＲと結合して抗原認識信号を細胞内に伝達する役割を担当する。本発明で使用可能な抗−ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３に結合する特性を有する抗体であれば制限されないが、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１、及びＨＩＴ３ａからなる群から選択されることが好ましい。

【0030】

本発明における培地に含有されるサイトカインは、インターロイキン類から選択される一つ以上であることが好ましい。インターロイキンとは、リンパ球や単球及びマクロファージなど、免疫担当細胞が生産するタンパク質性生物活性物質の総称である。本発明で使用可能なインターロイキンは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、及びインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）からなる群から選択される一つ以上であることが好ましく、特に、ＩＬ−２を使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。すなわち、本発明に属する技術分野において通常の知識を有する者により、本発明の目的にかなう限り、他のサイトカインも制限されずに使用可能である。

【0031】

本発明の静置培養及び浮遊培養のために使用される抗−ＣＤ３抗体の培地中濃度は、０．１〜１，０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、サイトカインの培地中濃度は、１０〜２，０００ＩＵ、好ましくは１００〜１，０００ＩＵ、より好ましくは約２００〜７００ＩＵである。

【0032】

本発明における「刺激」とは、支持細胞などを添加してＮＫ細胞の増殖を誘導することを意味し、抗−ＣＤ３抗体がともに用いられることもできる。本発明における「再刺激」とは、所定の培養時間が経過した後、培地に支持細胞及び／または抗−ＣＤ３抗体をさらに添加してＮＫ細胞の増殖を再誘導することを意味する。

【0033】

本発明によるＮＫ細胞を製造するための培地としては、ＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＩＭＩ１６４０培地、Ｘ−ＶＩＶＯ２０などの通常の動物細胞培養用培地が用いられることができる。この動物細胞培養用培地に、必要に応じて、ヒト末梢血から分離したＮＫ細胞、末梢血単核球細胞、抗−ＣＤ３抗体、及びインターロイキンから選択される一つ以上の成分が添加されて用いられることができる。

【0034】

特に、本発明のＮＫ細胞の製造方法において、浮遊培養を行う際に、細胞濃度及びサイトカインの濃度を一定に維持するために、培地中のサイトカイン及び細胞の濃度を所定時間間隔で測定し、その測定値に基づいて、サイトカインが含有された培地を細胞濃度及びサイトカイン濃度に応じて提供することができる。

【0035】

また、前記培地に、血清または血漿及びリンパ球の増殖を支持する増殖因子をさらに添加して培養してもよい。培地に添加する血清または血漿の種類は特に限定されず、市販の各種動物来由のものが使用できるが、ヒト来由、特に自己来由のものがより好ましい。例えば、末梢血単核球細胞からリンパ球を増殖させるサイトカインの組み合わせや、リンパ球の増殖を刺激するレクチン類などを添加するなど、通常の技術者に公知の方法を用いることができる。

【0036】

本発明の方法により製造されたＮＫ細胞を、適切な付形剤及び添加剤を用いて治療用組成物として提供することができ、その組成物を治療が必要な患者に投与することで、治療効果を奏することができる。

【0037】

特に、本発明の方法により製造されたＮＫ細胞を含む組成物にアルブミンを添加することで、ＮＫ細胞の長期保存安全性が向上されて細胞殺傷能及び細胞生存率が著しく向上されることができる。本発明による組成物に添加されるアルブミンの含量は特に制限されないが、全体組成物中に０．１〜５重量％の範囲で含まれることが好ましく、０．５〜２重量％の範囲で含まれることがより好ましい。

【0038】

また、ＮＫ細胞の製造のために、細胞濃度を一定に維持させる培養方法を適用することで、細胞の過剰成長（ｏｖｅｒ ｇｒｏｗｔｈ）を防止することができるため、細胞が最適の状態に維持される。特に、凍結後にさらに解凍する場合にも、細胞の機能が損傷することなく高い細胞生存率及び細胞殺傷能を保持することができるため、追加的な処理過程を行わなくても液状または凍結形態で保存されて容易に供給されることができるという利点がある。

【0039】

本発明の方法により製造されたＮＫ細胞及びそれを含む組成物は、腫瘍及び感染性疾患の治療に用いられることができる。本発明の方法により製造されたＮＫ細胞は、固形癌及び血液癌を含む全ての種類の腫瘍に適用されることができる。固形癌とは、血液癌と異なって臓器で塊をなして形成される癌を意味し、大部分の臓器で生じる癌がこれに該当する。本発明によるＮＫ細胞を用いて治療可能な腫瘍としては、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、リンパ腫などが挙げられるが、これに制限されるものではない。感染性疾患は、ウイルスまたは病原菌の感染により発生する疾患であって、呼吸器及び血液、肌接触などにより伝染されて感染され得る全ての疾患を含む概念である。この感染性疾患の非制限的な例として、Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）感染、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザなどが挙げられるが、これに制限されるものではない。

【0040】

以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないということは、当業界で通常の知識を有する者において自明である。

【0041】

≪実施例１：支持細胞で繰り返して刺激することによるＮＫ細胞の培養及び特性評価≫
（１）支持細胞で繰り返して刺激することによるＮＫ細胞の培養
健常なドナーから採取した末梢血単核球を１回生産分量に小分けしてバイアルに入れた後、液体窒素で凍結させた。凍結した一つのＰＢＭＣバイアルを解凍して５０ｍＬのチューブに移し、１体積％のＦＢＳまたは自己血漿（ａｕｔｏｐｌａｓｍａ）を含有するＰＢＳ２０ｍＬで懸濁して、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。

【0042】

ＰＢＭＣペレットをＭＡＣＳランニングバッファー１０ｍＬで懸濁し、トリパンブルーで染色して細胞数を測定した。ＰＢＭＣフィーダーの準備及びＣＤ３の除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）のために、それぞれ５×１０^７ずつ、新しい５０ｍＬのチューブに移した後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。

【0043】

ＰＢＭＣフィーダーは、１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）１０ｍＬでペレットを懸濁した後、ガンマ線照射器で２０００ｃＧｙで照射することで準備した。

【0044】

ＣＤ３が除去されたＮＫ細胞を得るために、５×１０^７の細胞ペレットに４００μＬのＭＡＣＳランニングバッファー及び１００μＬのＣＤ３磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ社）を入れた後、４℃で２０分間反応させた。２０ｍＬのＭＡＣＳランニングバッファーを入れて洗浄した後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、さらに２ｍＬのＭＡＣＳランニングバッファーで懸濁した。ＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１３０−０４１−３０５）を取り付けて細胞を分離し、最終的に２０ｍＬとなるまでカラムを洗浄して、細胞を回収した。

【0045】

トリパンブルーで染色して細胞数を測定し、１×１０^７の細胞を新しい５０ｍＬのチューブに入れた後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）１０ｍＬで懸濁した。

【0046】

バック（ｂａｇ）培養時に、５００ＩＵのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３をＰＢＭＣフィーダー入りのチューブに入れた。ニプロ３５０バック（Ｎｉｐｒｏ３５０ ｂａｇ、ニプロ株式会社）に、ＰＢＭＣフィーダー１０ｍＬ、ＮＫ細胞１０ｍＬ、及び１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）１０ｍＬを入れ、３７℃の培養器で５日間静置培養した。この際、ニプロ３５０バックを、上端から６ｃｍ、下端から５ｃｍとなる点を折って、面積が約７０ｃｍ^２となるようにして静置培養した。フラスコ培養は、前記バックの培養と同一の組成を用いて行った。具体的に、１２ウェルプレートを用いて、ＰＢＭＣフィーダー０．５ｍＬ、ＮＫ細胞０．５ｍＬ、１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地０．５ｍＬで、同一の条件で培養した。この際、１２ウェルプレートの面積は３．５〜３．８ｃｍ^２であった。

【0047】

培養開始５日目に細胞数を測定し、約２×１０^５細胞／ｍＬとなるようにＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）５００ＩＵ及び１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）で希釈し、適切な培養容器に入れて静置培養した。この際、細胞濃度及び面積は、２×１０^５細胞／ｍＬ及び３．５ｃｍ^２となるようにした。

【0048】

培養開始７日目、１０日目、及び１４日目に細胞数を測定し、培養中の細胞を基準として２〜５×１０^５細胞／ｍＬとなるように、１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）で希釈した。次に、１〜５倍数の支持細胞を準備し、１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）で懸濁した後、ガンマ線照射器で２０００ｃＧｙで照射して準備した。５００ＩＵのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３を入れ、準備された二つの細胞を３日間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した。

【0049】

支持細胞で再刺激した後、さらに３日間静置培養してから、２〜３日間隔で細胞数を測定し、５〜１０×１０^５細胞／ｍＬとなるように５００ＩＵのＩＬ−２及び１体積％の自己血漿が含有されたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）で希釈して、２１日間浮遊培養した。浮遊培養開始２１日目にＮＫ細胞を得た。

【0050】

得られたＮＫ細胞を、１重量％のアルブミン（Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が懸濁されたハートマン溶液（中外製薬）で、１〜５×１０^７／ｍＬとなるようにＮＫ細胞を懸濁し、４℃で保存した。

【0051】

支持細胞で再刺激した結果、図１の（ａ）のように、刺激を１回のみ与えた場合に比べ、２回または３回持続的に刺激を与えることで、ＮＫ細胞の増殖が著しく増加されることを確認することができた。従来の製造方法による場合には、ＮＫ細胞が約１６１倍に増殖したが、支持細胞で２回再刺激した場合には４２５倍、３回再刺激した場合には１，３２０倍まで爆発的に増殖することが観察された。また、図１の（ｂ）に示したように、７日目または１０日目にさらに支持細胞で再刺激を与える場合、ドナーによって差はあったものの、追加刺激せずに培養された場合より高い増殖率を示した。したがって、培養初期に１回のみ刺激させながら、細胞数でなく培地量を中心として細胞を増殖させる方法に比べ、支持細胞で追加刺激を与え、一定の細胞数を維持させながら培地量を調節する新たな培養方法が、ＮＫ細胞の増殖において非常に効果的であることを確認した。

【0052】

（２）ＮＫ細胞のインビトロ細胞生存率
インビトロ細胞生存率を比較及び評価するために、細胞内の核と結合できるＰＩ染色液を用いる細胞カウンタ方法の一つであるＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）システムを用いた。

【0053】

再刺激を行わずに培養された細胞、７日及び１０日目に再刺激して培養された細胞をＰＢＳで１０倍に希釈した後、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒシステムを用いて総細胞数及び死細胞数をそれぞれ測定した。１０倍に希釈した細胞１００μＬを、溶解バッファーであるＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ−１００（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）１００μＬと混合した後、安定化バッファーであるＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）１００μＬを追加した。次に、ＮｕｃｌｅｏＣａｓｅｔｔｅのピストンを用いて総細胞数を測定した。死細胞数は、ＮｕｃｌｅｏＣａｓｅｔｔｅのピストンを用いて、１０倍に希釈させた細胞をそのまま測定した。

【0054】

測定された総細胞数から死細胞数を引いて生存細胞数を計算した後、次の式を利用して細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を計算した。

【0055】

細胞生存率（％）＝（生存細胞数／総細胞数）×１００

【0056】

その結果、図２に示したように、支持細胞で再刺激して２１日間培養したＮＫ細胞が、再刺激せずに培養したＮＫ細胞より高い増殖率を示すとともに、約９０％程度の高い細胞生存率を示した。

【0057】

（３）インビトロ細胞殺傷能
標的腫瘍細胞株（Ｋ５６２など）を回収し、３×１０^６個の細胞を１５ｍＬのチューブに入れて遠心分離した。細胞ペレットを６００μＬのＲＰＭＩ培地で懸濁した後、そのうち４００μＬを新しい１５ｍＬのチューブに移し、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ、Ｃ３４８５２）を５０ｎＭの濃度で入れた。次に、銀箔で光を遮断し、３７℃の培養器で２０分間染色した。一方、残りの細胞懸濁液２００μＬには、ＲＰＭＩ培地８００ｕＬを入れて、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度となるように準備した。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色が終わった腫瘍細胞株は、ＲＰＭＩ培地１５ｍＬを入れて洗浄し、遠心分離した後、ペレットを２ｍＬのＲＰＭＩ培地で懸濁して、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度となるようにした。

【0058】

ＮＫ細胞は、３×１０^６個を１５ｍＬのチューブに入れて遠心分離し、ペレットを標的腫瘍細胞株に対して所望の比率となるようにＲＰＭＩ培地で懸濁した。準備された標的腫瘍細胞株及びＮＫ細胞株を丸底９６−ウェルプレートに１００μＬずつ混合して分注した。各ウェルを２個ずつ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）準備して平均値を得た。光を遮断して３７℃の培養器で２時間反応させた後、プレートを２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清液を除去し、ＦＡＣＳバッファー（２．５重量％ＦＢＳ ｉｎ ＰＢＳ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ入れて細胞を懸濁させた後、７−ＡＡＤ（ＢＤ、５５９９２５）を予め５μＬずつ入れたＦＡＣＳチューブに移した。常温で２０分間反応させた後、ＦＡＣＳアリア（Ａｒｉａ）装置を用いて、ＮＫ細胞の腫瘍細胞殺傷能を次のように分析した。

【0059】

細胞殺傷能＝Ａ値−Ｂ値

【0060】

Ａは、ＮＫ細胞と標的腫瘍細胞とを反応させた時に殺される標的細胞の比率（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ及び７−ＡＡＤが両方とも染色された、殺された標的腫瘍細胞株の平均値−Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭのみが染色された対照群）である。

【0061】

Ｂは、標的腫瘍細胞が基本的に殺された比率（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ及び７−ＡＡＤが両方とも染色された、殺された標的腫瘍細胞株−Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭのみが染色された対照群）である。

【0062】

その結果、図３に示したように、支持細胞で再刺激して２１日間培養したＮＫ細胞は、再刺激せずに培養したＮＫ細胞より高い細胞増殖率を示したにもかかわらず、Ｅ：Ｔ比率＝３：１で約９０％程度と、却って高い細胞殺傷能を示した。

【0063】

（４）インビトロ細胞表現型の分析
実施例１の（１）に記載の培養方法により培養されたＮＫ細胞の培養前及び培養後の細胞を回収して１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養溶液を吸込み（ｓｕｃｔｉｏｎ）により除去した。１ｍＬのＦＡＣＳバッファー（２．５％のＦＢＳが含有されたＰＢＳ）で希釈して細胞数を測定し、５×１０^６細胞／ｍＬとなるようにＦＡＣＳバッファーで希釈した。５ｍＬのＦＡＣＳチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、３５２０５２）で希釈した細胞溶液を１００μＬずつ入れた後、次のように抗体を入れた。

【0064】

【表1】

【0065】

対照群用として用いられるチューブは、下記のように準備した。

【0066】

【表2】

【0067】

表１及び表２のチューブを冷蔵温度で３０分間放置して染色した後、染色が終わった細胞にＦＡＣＳバッファー２ｍＬを入れて、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を除去した後、さらにＦＡＣＳバッファー２ｍＬを入れて、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、さらに上清液を除去し、ＦＡＣＳバッファー３００μＬを入れて懸濁した後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて表現型を分析した。

【0068】

その結果、図４に図示されたように、支持細胞を用いた刺激をさらに与えた場合及び与えていない場合、確認及び純度に該当する表現型、ＮＫ細胞の活性及び抑制に係る表現型において、大きい差はなかった。

【0069】

したがって、上記のように支持細胞を用いた再刺激により改善された培養法で生産されたＮＫ細胞は、従来の方式により培養されたＮＫ細胞に比べ、高い増殖率を示すにもかかわらず、細胞生存率、細胞殺傷能、細胞表現型などにおいて大きい差がない。

【0070】

≪実施例２：アルブミンの添加によるインビトロ安定性（使用中における安定性）≫
ハートマン溶液に添加されたアルブミンの濃度（２重量％、１重量％、０．５重量％）による、培養された細胞の安定性を評価するために、実施例１の（１）の方法により最終培養された細胞を４℃で７２時間保存しながら、２４時間単位でインビトロ細胞殺傷能及びインビトロ細胞生存率を評価した。

【0071】

最終培養されたＮＫ細胞を遠心分離して細胞ペレットを作った後、上清液を除去した。次に、フラスコを用いて培養した細胞は、ハートマン溶液または２重量％、１重量％、０．５重量％のヒト血清アルブミンが含有されたハートマン溶液で細胞ペレットを解砕して、細胞希釈液を作った。この際、ハートマン溶液またはヒト血清アルブミンが含有されたハートマン溶液の量を調節して、最終細胞希釈液の濃度を１．１×１０^７細胞／ｍｌとなるようにした後、細胞培養バックに入れて４℃で保存した。２４時間後、４８時間後、７２時間後にそれぞれ細胞を取り出してインビトロ細胞殺傷能（実施例１の（３）参照）及びインビトロ細胞生存率（実施例１の（２）参照）を評価した。

【0072】

その結果、図５の（ａ）に示したように、ハートマン溶液中に４８時間冷蔵保存した際に、細胞生存率が６５％に低下した。一方、１％のヒトアルブミンが添加された場合には、４８時間冷蔵保存した際に、または使用時間を考慮して常温で２時間保存した際にも、約９０％前後の細胞生存率を保持することを確認することができた。

【0073】

図５の（ｂ）は、保存時間による細胞殺傷能を比較した図面であり、ハートマン溶液中に保存する場合には、２４時間後から細胞殺傷能が急激に減少し、４８時間後には、Ｅ：Ｔ比率＝３：１を基準として、１０％未満に細胞殺傷能が減少されたが、１重量％のヒトアルブミンが添加された場合には、４８時間冷蔵保存した後にも同一のＥ：Ｔ比率で７０％以上の高い細胞殺傷能を示すことが観察された。

【0074】

図６は、ハートマン溶液及び１重量％のヒトアルブミン−ハートマン溶液の累積データを比較した図面である。図６の（ａ）に図示されたように、１重量％のアルブミンを添加した場合には、７２時間経過時にも８０％以上の高い生存率を維持したが、ハートマン溶液中では、４８時間経過時に既に６０％の水準に生存率が急激に減少した。図６の（ｂ）は、Ｅ：Ｔ比率＝３：１で細胞毒性を比較した図面であり、１重量％のアルブミンを添加した場合には、７２時間経過時にも７０％以上の細胞殺傷能を維持したが、ハートマン溶液の場合、４８時間経過時に既に５０％まで細胞殺傷能が減少された。図６の（ｃ）は、前記二つの条件でＮＫ細胞の表現型の変化を観察した図面であり、細胞殺傷能と直接的な連関を有するＮＫｐ４６が、１重量％のアルブミンが添加された場合より高く発現することが観察された。また、残りの表現型は大きい差がないことが確認された。

【0075】

したがって、最終的に、ＮＫ細胞治療剤に１重量％のヒトアルブミンを添加することは、時間経過時にもＮＫ細胞の細胞生存率及び細胞殺傷能が維持されるため、安定性の確保に大きく寄与することが分かる。

【0076】

≪実施例３：ＮＫ細胞の凍結及び解凍実験：細胞数、収率、表現型、生存率、傷害能≫
実施例１の（１）に記載の方法により培養されたＮＫ細胞間の凍結安定性を確認した。

【0077】

培養されたＮＫ細胞を凍結させるために、細胞数が２〜８×１０^７細胞／ｍＬとなるようにし、凍結しようとする細胞を別のチューブに移した後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。凍結バック（Ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｂａｇ、ＭＥＤＩ−ＲＵＴＩＯＮ社）の凍結は、２０ｍＬを基準とした。遠心分離された細胞を、１４ｍＬのヒト血清ＡＢで十分に懸濁させた。４ｍＬのデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）４０と２ｍＬのＤＭＳＯとを予め混合して冷たくした後、準備された細胞懸濁液に一滴ずつ滴下しながら十分に混合した。凍結バックに細胞を注入した後、気泡を極力除去した。プログラムフリーザで冷却させた後、液体窒素タンクに保存した。

【0078】

細胞の解凍は、窒素タンクから凍結バックを取り出して、凍結バックをジッパ袋に入れ、３７℃の恒温槽で速い速度で解凍させた。完全に解凍されると、細胞を該当チューブに移し、１０倍量の、１重量％のＦＢＳを含有するＰＢＳ溶液で徐々に懸濁させた。十分に混合した後、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、１０分、４℃）した。遠心分離後、細胞が１０^７細胞／ｍＬとなるように、１重量％のＦＢＳを含有するＰＢＳで懸濁した。１０倍に希釈した後、細胞数及び生存率を測定した。測定された細胞数に基づいて、Ｋ５６２細胞株に対する傷害能を評価した。この際、Ｅ：Ｔ比率＝３：１を基準として測定した。細胞表現型は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ５７などに対して測定した。最終的に、凍結前と凍結後の細胞収率、生存率、細胞殺傷能、細胞表現型の変化を評価した。

【0079】

その結果、培養されたＮＫ細胞を凍結後に解凍した際に、高い細胞生存率（図７の（ａ）参照）及び回収率（図７の（ｂ）参照）を維持し、特別に活性誘導しなくても、Ｋ５６２癌細胞株に対する高い細胞殺傷能を有していた（図７の（ｃ）参照）。また、細胞表現型（図７の（ｄ）参照）も維持されていることを確認することができた。

【0080】

≪実施例４：リンパ腫動物モデルにおけるナチュラルキラー細胞の抗癌効果の評価≫
（１）リンパ腫動物モデルの構築
１）Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞株の培養
Ｒａｊｉ及びＳＵ−ＤＨＬ−４（ヒトＢ細胞リンフォーマ細胞株）（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ４９５）細胞株を、ＲＩＭＩ培地（Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ＦＢＳ１０重量％、２−メルカプトエタノール０．０５５ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｕｇ／ｍｌ）を用いて、３７℃、ＣＯ^２５％の培養器で培養した。

【0081】

２）動物モデルの製作
６〜８週齢のＣ．Ｂ−１７雌性マウスに対して、７日間の順化期間を経た後、１ｍＬの注射器を用いてＲａｊｉ及びＳＵ−ＤＨＬ−４細胞株をそれぞれ１×１０^５細胞／１００μＬずつ尾静脈内に注入した。

【0082】

（２）ナチュラルキラー細胞の投与及び抗癌効果の評価
１）ナチュラルキラー細胞の投与
腫瘍移植後、無作為に群を分離し、個体識別法により表示した。次に、対照群には、４００μＬのＰＢＳを尾静脈内に注入した。また、実験群には、１×１０^７／４００μＬのナチュラルキラー細胞を、０日から２〜３日間隔で尾静脈内に５回投与した。

【0083】

２）抗癌効果の評価
実験を行った後、マウスの一般的な状態変化、運動性、下肢麻痺発病及び生存率を毎日確認した。公知のリンパ腫モデルであるＲａｊｉ及びＳＵ−ＤＨＬ−４をマウスの尾静脈内に投与すると、脊髄の周辺に腫瘍が生じて、下肢麻痺症状が現れ、２〜３日後には死亡することになる。したがって、下肢麻痺の発病有無及び生存率をともに評価して、抗癌効果の指標として判断した。

【0084】

その結果、ＰＢＳを投与した対照群では、下肢麻痺症状（図８の（ａ）参照）と生存率（図８の（ｂ）参照）の中間値が３７日及び３９日であることに比べ、ＮＫ細胞を投与した群では、中間値が算定されないほどに下肢麻痺症状が著しく改善され、生存率が大きく向上された。

【0085】

≪実施例５：脳腫瘍動物モデルにおけるナチュラルキラー細胞の抗癌効果の評価≫
（１）脳腫瘍動物モデルの構築
６週齢のＢＡＬＢ／Ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスに対して、一度に７匹に同時に腫瘍を植えることができる自動化装置であるセブンフレーム（ｓｅｖｅｎ ｆｒａｍｅ）及びマルチ−シリンジインジェクタ（ｍｕｌｔｉ−ｓｙｒｉｎｇｅ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）を用いて、２×１０^５細胞／５μＬのＵ−８７ＭＧ（ヒト神経膠芽腫細胞株）（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４）を大脳に注入した。この際、ハミルトンシリンジ（ｈａｍｉｌｔｏｎ ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて１０分間注入し、５分間中断した後、５分間シリンジの針を抜いて消毒後、縫合した。実験期間中にマウスの状態及び重量を観察し、実験日程に応じて犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）にして組職分析を行った。

【0086】

（２）ナチュラルキラー細胞の投与
脳腫瘍動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗腫瘍効果を確認するために、Ｕ−８７ＭＧを投与し、１週目から１週間隔でＮＫ細胞を３回注入した。ＮＫ細胞は、脳に直接注入する頭蓋内投与（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ）方式及びマウスの尾静脈に注射する静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）方式により投入した。頭蓋内投与方式を利用する場合には、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５個のＮＫ細胞を、静脈内投与方式を利用する場合には、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７個のＮＫ細胞を投与した。Ｕ−８７ＭＧを投与して４週後に犠牲にして、抗癌効果を評価した。

【0087】

脳腫瘍動物モデルにおけるＮＫ細胞と抗癌剤の併用投与及び投与時期による抗腫瘍効果を確認するために、下記の表３のように様々な時期に１×１０^７個のＮＫ細胞を静脈内投与方式で注入した。併用治療剤として使用したテモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＴＭＺ）は、２．５ｍｇ／ｋｇの用量でＵ−８７ＭＧを投与した後３週目から毎日総５回を腹腔内投与（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）方式で注入した。Ｕ−８７ＭＧを投与して４週後に犠牲にして、腫瘍のサイズを測定した。

【0088】

【表3】

【0089】

（３）抗癌効果の評価
腫瘍のサイズを測定するために、ヘマトキシリン、エオシン染色法を用いた。脳を摘出してブレインマトリックス（ｂｒａｉｎ ｍａｔｒｉｘ）に載せ、２ｍｍ間隔で切片を製作した。緩衝化した１０％のホルマリン溶液に入れ、４℃で２４時間固定した後、パラフィンブロックを製作した。パラフィンフォーマットされた組職を４μＬ切片として、コーティングされたスライドガラスに付けて、一晩乾燥させた。組職をキシレンで脱パラフィン処理した後、アルコールを順に作って（１００体積％、９５体積％、８０体積％、エタノール／蒸溜水）再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）処理し、Ｇｉｌｌ’ｓヘマトキシリン及びエオシンで染色した。その染色程度を確認した後、脱水過程及びシール過程を行った。上記のように染色された組職から、腫瘍の長さ及び幅を算出した後、次の式で腫瘍の体積を計算した。

【0090】

腫瘍の体積（ｍｍ^３）＝腫瘍の長さ（ｍｍ）×腫瘍の幅（ｍｍ）^２×０．５

【0091】

頭蓋内投与方式（図９）で１×１０^４、１×１０^５のＮＫ細胞を投与した場合及び静脈内投与方式（図１０）で１×１０^６、１×１０^７のＮＫ細胞を投与した場合に、対照群に比べ腫瘍の体積が減少することを確認することができた。ＮＫ細胞と抗癌剤の併用投与及び投与時期による効果を観察した結果（図１１）、ＴＭＺとＮＫ細胞を併用投与した場合、単独で投与した場合に比べ腫瘍の体積が減少され、腫瘍投与後１週以内にＮＫ細胞を３回注入した場合、腫瘍の体積が最も多く減少されて、その効果が最も大きいことが分かる。

【0092】

細胞死滅程度を分析するために、ＴＵＮＥＬ分析（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。組職は、パラフィン切片（４ｍｍ）を製作してコーティングされたスライドガラスに載せ、一晩乾燥させた。組職をキシレンで脱パラフィン処理した後、アルコールを順に作って（１００ｖ％、９５ｖ％、８０ｖ％、エタノール／蒸溜水）再水和処理し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で水洗した。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社のＴＵＮＥＬキットを用いて、組職中の細胞死滅程度を検査した。染色されたスライドは、Ｇｉｌｌ'ｓヘマトキシリンで１分間処理して対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）を施した後、シールした。染色の終わったスライドを顕微鏡にセットして、腫瘍の端部周辺を基準として１０枚の写真を４００倍の倍率で取り、陽性反応を示した細胞を基準として数えて平均値を計算した。

【0093】

その結果、頭蓋内投与方式で１×１０^４、１×１０^５のＮＫ細胞を投与した場合、対照群に比べ死細胞数が多くて、効果があることが分かった（図９ｃ）。

【0094】

≪実施例６：卵巣癌動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗癌効果の評価≫
（１）卵巣癌動物モデルの構築
１）ＯＶＣＡＲ−３−Ｌｕｃ細胞株の製作
ルシフェラーゼ遺伝子をｐＧＬ３ベクターにクローニングしてＯＶＣＡＲ−３細胞株に一過性導入（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。ルシフェリンによりルシフェラーゼが発現される細胞株を１次選別し、表現型及びＮＫ細胞による細胞毒性がＯＶＣＡＲ−３と同等な細胞株を２次選別した。

【0095】

２）ＯＶＣＡＲ−３−Ｌｕｃ細胞株の培養
ＯＶＣＡＲ−３−Ｌｕｃ（ヒト卵巣癌細胞株、ＫＴＣＣ（韓国細胞バンク）３０１６２）細胞株は、ＲＩＭＩ培地（２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＢＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ｕｇ／ｍＬのＧ４１８）組成培地を用いて、３７℃、５％のＣＯ^２培養器で培養した。

【0096】

３）動物モデルの製作
６〜８週齢のＣ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤ雌性マウスに対して、７日間の順化期間を経た後、ＯＶＣＡＲ−３−Ｌｕｃ細胞株５×１０^６細胞／１００ｕＬを腹腔内に注入した。

【0097】

（２）ＮＫ細胞の投与及び抗癌効果の評価
１）ＮＫ細胞の投与
腫瘍移植後、無作為に群を分離し、個体識別法により表示した。対照群には、２００μＬのハートマン溶液（中外製薬）を腹腔内に注入した。ＮＫ細胞投与群には、１×１０^７／２００μＬ個のＮＫ細胞を腫瘍移植１週後から２〜３日間隔で腹腔内に５回投与した。

【0098】

２）抗癌効果の評価
ＯＶＣＡＲ−３−Ｌｕｃ移植後、マウスの一般的な状態の変化及び運動性を毎日観察し、２〜７日間隔でルシフェリンを腹腔内に投与して、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を利用してルシフェラーゼイメージを撮影し、腫瘍移植８週後に、全ての群のマウスを開腹して腫瘍のサイズを測定した。

【0099】

腫瘍細胞が投入された直後には、腫瘍細胞が腹腔全体に広がってルシフェラーゼイメージが大きくみえるが、７日以後には腫瘍が生着されてルシフェラーゼ数値が減少した。７日目からＮＫ細胞を投与した群では、２３日まで持続的にルシフェラーゼ数値が減少したが、陰性対照群では、ルシフェラーゼ数値が増加した（図１２の（ａ）参照）。

【0100】

８週目にマウスを犠牲にして腫瘍を摘出し、腫瘍のサイズ及び重量を測定した（図１２の（ｂ）参照）。陰性対照群に比べＮＫ細胞投与群の腫瘍の重量が５４．９１％減少することを確認した。換言すれば、陰性対照群に比べＮＫ細胞投与群の腫瘍の体積が顕著に減少することを確認した。卵巣癌腹腔転移モデルにＮＫ細胞を腹腔内に投与すると、腫瘍の成長が抑えられることが分かる。

【0101】

≪実施例７：肝臓癌動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗癌効果の評価≫
（１）肝臓癌動物モデルの構築
ＮＫ細胞の肝臓癌に対する抗癌効能を評価するため、人体由来肝臓癌細胞株であるＳＮＵ−３５４を移植した人間腫瘍移植モデルを構築し、ＮＫ細胞投与した。人体由来肝臓癌細胞株であるＳＮＵ−３５４は６×１０^６細胞／マウスの濃度でヌードマウス側面に皮下移植した。

【0102】

（２）ＮＫ細胞投与及び抗癌効果評価
１）ＮＫ細胞の投与
ＳＮＵ−３５４移植２時間後に１×１０^６細胞または１×１０^７細胞の容量でＮＫ細胞をマウスの尾静脈を通じて２００μＬ投与した。最初の投与以降、同じ容量のＮＫ細胞を１週間隔で３回以上投与した。

【0103】

【表4】

【0104】

２）抗癌効能評価
試験期間の間、ＮＫ細胞による毒性を評価するため、一般症状を毎日観察して、動物の体重及び腫瘍体積を試験終了時まで１１回（０、７、９、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２６及び２８日）測定した。２８日以降、動物を犠牲にして抽出した腫瘍の重さを測定した。

【0105】

陰性対照群に比べ、ＮＫ細胞群の腫瘍体積が３７．７％（１×１０^６細胞／マウス）及び５０．６％（１×１０^７細胞／マウス）減少することが確認できた（図１３）。

【0106】

また、陰性対照群に比べ、ＮＫ細胞群の腫瘍の重さが３６．０％％（１×１０６細胞／マウス）及び５０．２％（１×１０７細胞／マウス）減少した。したがって、ＮＫ細胞は肝臓癌治療に使用できることが確認された。

【0107】

≪実施例８：神経芽細胞腫動物モデルにおけるＮＫ細胞の抗癌効果の評価≫
（１）神経芽細胞腫動物モデルの構築
１）ＮＢ−１６９１ｌｕｃ細胞株培養
ＮＢ−１６９１（ヒト神経芽細胞腫細胞株，ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）にルシフェラーゼ遺伝子を形質感染させて製造したＮＢ−１６９１ｌｕｃ（ヒト神経芽細胞腫）細胞株を、ＲＩＭＩ培地（Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ＦＢＳ１０重量％、２−メルカプトエタノール０．０５５ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ，Ｇ４１８ １００μｇ／ｍｌ）を使用して、３７℃、ＣＯ_２２５％の培養器で培養した。

【0108】

２）動物モデルの製作
７週齢のＣ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤ雌性マウスに対して、７日間の順化期間を経た後、ＮＢ−１６９１ｌｕｃ細胞株５×１０^５細胞／１００μＬをマウスの尾静脈に注入した。

【0109】

（２）ＮＫ細胞投与及び抗癌効果評価
１）ＮＫ細胞の投与
腫瘍移植後、マウスをランダムに分類し、表示した。対照群としては２００μＬのハートマン溶液（中外製薬、韓国）を尾静脈に注入した。ＮＫ細胞投与群には、腫瘍移植した１週後から２〜３日間隔で１×１０^７細胞／２００μＬのＮＫ細胞を尾静脈に５回注入した。

【0110】

２）抗癌効果の評価
ＮＢ−１６９１ｌｕｃ移植後、マウスの一般的な状態の変化及び運動性を毎日観察した。腫瘍の生成を確認するため、ルシフェリンをマウスの腹腔に投与して、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を利用して７日間隔でルシフェラーゼイメージ映像を撮影した。

【0111】

試験の間、週５回死亡動物の有無を確認した。その結果、対照群及びＮＫ細胞投与群に対する生存日数は各々４９日及び５１日であった。ただし、ＮＫ細胞投与群の生存はロングランク（ｌ−ｒａｎｄ）テストの結果、有意に増加した（図１４）。

【0112】

≪実施例９：多様な腫瘍細胞株及びウイルス感染細胞株におけるＮＫ細胞のインビトロの抗癌効能の評価≫
実施例１に記載されたように製造されたＮＫ細胞を使用して、ＮＫ細胞の殺害能を実施例１（３）に記載されたように評価した。

【0113】

ＮＫ細胞のサイトカイン分泌能を次のように測定した；
５×１０^６細胞／ｍＬ ＮＫ細胞と５×１０^６細胞／ｍＬ ターゲット腫瘍細胞株（Ｋ５６２等）を準備し、準備されたＮＫ細胞及びターゲット腫瘍細胞株を丸底９６−ウェルプレートにいれた。細胞内に蓄積されたサイトカインの分泌を防ぐため、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ５５４７２４）を共に入れた。
ウェル１：懸濁されたＮＫ細胞１００μＬ、ＲＰＭＩ培地１００μＬ、抗ヒトＣＤ１０７ａ−ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５６０６６４）１μＬ
ウェル２：懸濁されたＮＫ細胞１００μＬ、懸濁されたターゲット腫瘍細胞株１００μＬ、抗ヒトＣＤ１０７ａ−ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５６０６６４）１μＬ
ウェル３：懸濁されたＮＫ細胞１００μＬ、懸濁されたターゲット腫瘍細胞株１００μＬ、ＡＰＣマウスＩｇＧ１ｋイソタイプコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５７５１）５μＬ

【0114】

９６ウェルプレートをフォイルで囲んだ後、３７℃インキュベーターで４時間置いた。４時間後、９６ウェルプレートの上層液を除去し、１００μＬのＦＡＣＳバッファー、７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５９９２５）５μＬ、 ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４５−００３６−４２）１μＬ及び抗ヒト−ＣＤ５６−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４７−０５６７−４２）１μＬを各ウェルに入れた。

【0115】

９６ウェルプレートを３０分間４℃で保管し染色した後、２００μＬＦＡＣＳバッファーを入れて、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した（２回）。

【0116】

９６ウェルプレートの上層液を除去し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ，５１−２０９０ＫＺ）を各ウェルに２００μＬずつ入れた。ピペットを利用して各ウェルの混合物をよく混ぜた後、固定するため３０分間４℃で保管した。

【0117】

固定の後、蒸留水で１０倍希釈された２００μＬのＰｅｒｍ／ｗａｓｈバッファー（ＢＤ，５１−２０９０ＫＺ）を各ウェルにいれて９６ウェルプレートを２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した（２回）。

【0118】

上層液を除去し、下に記載された抗体セットを上層液除去後にいれた。
ウェル１，２：希釈されたＰｅｒｍ／ｗａｓｈバッファー１００μＬ、抗ヒトＩＦＮ−ｇ−ＦＩＴＣ（ＢＤ，５５４７００）１μＬ，抗ヒトＴＮＦ−ａ−ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２５−７３４９−８２）１μＬ
ウェル３：希釈されたＰｅｒｍ／ｗａｓｈバッファー１００μＬ、ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１ｋイソタイプコントロール（ＢＤ，５５５７４８）５μＬ、ＰＥ−Ｃｙ７マウスＩｇＧ１ｋイソタイプコントロール（ＢＤ，５５７８７２）５μＬ

【0119】

９６ウェルプレートを３０分間４℃で保管し、サイトカインを染色した。染色後、蒸留水で１０倍希釈された２００μＬのＰｅｒｍ／ｗａｓｈバッファー（ＢＤ，５１−２０９０ＫＺ）を各ウェルにいれて９６ウェルプレートを２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した（２回）。

【0120】

最終的に、希釈されたＰｅｒｍ／ｗａｓｈバッファー（ＢＤ、５１−２０９０ＫＺ）２００μＬを入れて、懸濁し、サイトカイン分泌能をＦＡＣＳＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）で評価した。

【0121】

図１５は次の多様な癌細胞株及びウイルス感染細胞株におけるＮＫ細胞のインビトロの効能（細胞殺害能及びサイトカイン分泌能）を示す：
（ａ）Ｋ５６２細胞株（白血病）
（ｂ）Ｒａｊｉ細胞株（リンパ腫）
（ｃ）ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株（神経芽細胞腫）
（ｄ）ＳＮＵＯＴ−Ｒｂ１細胞株（網膜芽腫）
（ｅ）Ｕ８７−ＭＧ細胞株（神経膠芽腫）
（ｆ）ＯＶＣＡＲ−３細胞株（卵巣癌）
（ｇ）Ｈｕｈ−７細胞株（ＨＣＣ，原発性肝細胞癌）
（ｈ）ＳＮＵ３９８細胞株（ＨＢＶ感染ＨＣＣ）
（ｉ）Ｈｕｈ−７．５（ＨＣＶ感染ＨＣＣ）

【0122】

ＮＫ細胞は殆どの癌細胞株に対して非常に高い細胞殺害能を表した。また、ＮＫ細胞はウイルスが感染された細胞株に対しても優秀な殺傷能を表した。

【0123】

ＮＫ細胞のサイトカイン分泌能は一部の細胞で観察したが、特にＮＫ細胞はＫ５６２細胞株とウイルスが感染された癌細胞株（ＨＢＶ及びＨＣＶ感染細胞株）に対する強いサイトカイン分泌能を表した。

【0124】

結論的に、本発明により製造されたＮＫ細胞は多様な癌細胞株及びウイルス感染細胞株における優秀な効能（細胞殺害能及びサイトカイン分泌能）をあらわすことを確認した。

【産業上の利用可能性】

【0125】

本発明によるＮＫ細胞の培養技術、すなわち、支持細胞で繰り返して刺激しながら抗−ＣＤ３抗体及びサイトカインを含有する培地で静置培養した後、さらに浮遊培養してＮＫ細胞を製造する場合、従来の方法に比べ臨床適用に適した方法で高純度及び高い細胞殺傷能及び細胞生存率を有するＮＫ細胞を高効率で且つ短期間に生産することができる。また、本発明の製造方法により得られたＮＫ細胞は、細胞生存率及び細胞殺傷能が長期間にわたって安定して維持されるため、優れた長期保存性を有するという利点がある。

【0126】

特に、本発明の方法により製造されたＮＫ細胞を含む組成物にアルブミンを添加することで、ＮＫ細胞の細胞殺傷能及び細胞生存率が著しく向上されることができる。本発明の製造方法の特性により、凍結後にさらに解凍する場合にも、ＮＫ細胞の細胞殺傷能、すなわち治療効果及び細胞生存率が維持されるため、追加的な処理過程を行わなくても、液状または凍結形態で保存されて容易に供給されることができるという利点がある。さらに、本発明の方法により製造されたＮＫ細胞は、生体内でも安定してその効能を発揮することができるため、それを有効成分として含む組成物が、腫瘍及び感染性疾患の治療に有用に活用できるという利点がある。

【0127】

以上、本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当業界の通常の知識を有する者には、このような具体的説明が好ましい実施様態にすぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないということが理解できる。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物により定義されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】