特許 6011892 細胞増殖促進ペプチド及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6011892

(24)【登録日】2016年9月30日

(45)【発行日】2016年10月25日

(54)【発明の名称】細胞増殖促進ペプチド及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20161011BHJP

   C12N 5/00 20060101ALI20161011BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20161011BHJP

   C12N 5/073 20100101ALI20161011BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20161011BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161011BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20161011BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20161011BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20161011BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/00 FZNA

   C12N5/00

   C12N5/071

   C12N5/073

   A61K37/02

   A61P43/00 107

   !C07K19/00

   !C07K14/00

   !C07K7/08

【請求項の数】9

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-28054(P2015-28054)

(22)【出願日】2015年2月16日

(62)【分割の表示】特願2011-538478(P2011-538478)の分割

【原出願日】2010年10月28日

(65)【公開番号】特開2015-128431(P2015-128431A)

(43)【公開日】2015年7月16日

【審査請求日】2015年3月12日

(31)【優先権主張番号】特願2009-252010(P2009-252010)

(32)【優先日】2009年11月2日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003034

【氏名又は名称】東亞合成株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100117606

【弁理士】

【氏名又は名称】安部 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100136423

【弁理士】

【氏名又は名称】大井 道子

(72)【発明者】

【氏名】吉田 徹彦

(72)【発明者】

【氏名】小林 菜穂子

(72)【発明者】

【氏名】丹羽 幹夫

(72)【発明者】

【氏名】篠原 力

(72)【発明者】

【氏名】渡部 正利喜

(72)【発明者】

【氏名】畠 賢一郎

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−３３０２０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１５９４２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０９３６９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／００８５６９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００７／０１０９８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Cell. Mol. Life Sci.，２００１年１０月，Vol.58, No.11，pp.1627-1635

【文献】 Mol. Cell.，２００７年 １月２６日，Vol.25, No.2，pp.207-217

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００− １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種の真核細胞の増殖を促進し得る細胞増殖促進剤であって、
（Ａ）膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列と、
（Ｂ）配列番号２４に示すアミノ酸配列と、
を有する人為的に合成されたペプチドを有効成分として含み、
前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である、細胞増殖促進剤。

【請求項2】

前記合成ペプチドは、前記（Ａ）膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列として、配列番号１〜１８のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択されたアミノ酸配列のうちの１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の細胞増殖促進剤。

【請求項3】

前記合成ペプチドは、前記（Ａ）で規定されるアミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に隣接して前記（Ｂ）で規定されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の細胞増殖促進剤。

【請求項4】

前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項３に記載の細
胞増殖促進剤。

【請求項5】

前記合成ペプチドは、配列番号１１１を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞増殖促進剤。

【請求項6】

前記合成ペプチドは、配列番号１１１から構成されている、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞増殖促進剤。

【請求項7】

少なくとも１種の真核細胞を増殖させることにより該真核細胞若しくは該増殖した細胞由来の生合成産物を生産する方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞増殖促進剤を、該増殖対象の真核細胞に対して少なくとも１回供給することを特徴とする、方法。

【請求項8】

前記真核細胞は、ヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の細胞である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記真核細胞は、未分化状態にあるいずれかの種類の幹細胞である、請求項７又は８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、幹細胞その他の細胞の増殖を促進し得るペプチドとその利用に関する。特に該ペプチドを有効成分とする細胞増殖剤（組成物）ならびに該ペプチドを使用して増殖効率を向上させた目的細胞の生産方法に関する。
なお、本出願は２００９年１１月２日に出願された日本国特許出願２００９−２５２０１０号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。

【背景技術】

【0002】

再生医療分野における一つの課題として目的の細胞をより迅速に増殖させる方法の確立が挙げられる。また、細胞工学や培養工学分野においては、目的とする細胞自体の生産性を向上させるため、或いは目的の細胞（若しくは組織）が生産する生産物の生産効率を向上させるため、対象とする培養細胞（若しくは培養組織を構成する細胞）をより効率よく増殖させることが求められている。
従来、上記の目的のため、種々の細胞増殖因子が用いられている。かかる増殖因子として特によく用いられているものとして塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：以下「ｂＦＧＦ」という。）が挙げられる。ｂＦＧＦは線維芽細胞の他にも、中胚葉や神経外胚葉由来の種々の細胞に対して増殖促進作用を奏する物質として知られており、目的とする種々の細胞の増殖促進のためによく使用されている増殖因子である。

【0003】

しかしながら、現在入手可能なｂＦＧＦは非常に高価であり、該増殖因子を細胞増殖のために比較的大量に使用することは経済的に困難である。また、ｂＦＧＦを細胞増殖目的に使用することは当該増殖を伴う細胞生産や組織再生のコスト増の大きな要因となり得る。
かかる状況下、従来からｂＦＧＦのような高価な細胞増殖因子に代わる安価で大量生産可能な細胞増殖促進能を有する物質の探索ならびに開発が行われている。例えば以下の特許文献１〜３には、それぞれ、細胞増殖促進能を有するペプチドが記載されており、当該ペプチドを使用することによって供試細胞の増殖速度がある程度向上した旨、各特許文献に記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】日本国特許出願公開第２００３−１３７８９９号公報

【特許文献2】日本国特許出願公開第２００５−１５４３３８号公報

【特許文献3】日本国特許出願公開第２００９−２０９０６４号公報

【特許文献4】日本国特許出願公開第２００５−３３０２０６号公報

【特許文献5】国際公開第２００８／００８５６９号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】ＥＭＢＯレポート(EMBO reports)、１０巻（３号）、２００９年、ｐｐ．２３１−２３８

【非特許文献2】ＰＮＡＳ、９５巻、１９９８年、ｐｐ．１１４−１１９

【非特許文献3】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１２巻、１９９８年、ｐｐ．３８７２−３８８１

【非特許文献4】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．２８６７−２８７２

【非特許文献5】ジーン・アンド・ディベロップメント(GENES & DEVELOPMENT)、１８巻、２００４年、ｐｐ．３０５５−３０６５

【非特許文献6】モレキュラー・セル(Molecular Cell)、２５巻、２００７年、ｐｐ．２０７−２１７

【非特許文献7】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)、２８２巻（５１号）、２００７年、ｐｐ．３７０６４−３７０７３

【非特許文献8】セル・サイクル(Cell Cycle)、６巻（６号）、２００７年、ｐｐ．６５６−６５９

【発明の概要】

【0006】

本発明は、上記特許文献１〜３に記載されるような従前の細胞増殖促進能を有するペプチドとは異なる構成のペプチドであって、ｂＦＧＦと同等若しくはそれ以上の細胞増殖促進効果を発揮し得る人工ペプチドの提供を目的とする。また、そのようなペプチドを有効成分とする細胞増殖促進剤（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを使用して所定の目的細胞を生産する方法の提供を他の目的とする。

【0007】

本発明によって提供される細胞増殖促進剤は、ここで開示される少なくとも１種の細胞増殖促進能を有するペプチド（以下「細胞増殖促進能を有するペプチド」という。）を有効成分（即ち細胞増殖促進に関与する物質）として含むことで特徴付けられる。
即ち、上記細胞増殖促進剤の有効成分として使用し得る本発明に係るペプチドは、そのペプチド鎖中に以下の（Ａ）と（Ｂ）にそれぞれ規定される部分アミノ酸配列、即ち、
（Ａ）膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列と、
（Ｂ）配列番号１９〜１０３のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択されたアミノ酸配列のうちの１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列と、
を有する人為的に合成されたペプチドである。
典型的には、ここで開示される細胞増殖促進剤は、薬学上許容され得る少なくとも１種の担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む。

【0008】

本発明者は、本来は別の機能を有するペプチド若しくは所定のペプチド中の特定の機能により画定された部分（即ちペプチドモチーフ若しくはドメイン）を構成するアミノ酸配列を複数種組み合わせて構築した合成ペプチドがｂＦＧＦに匹敵する若しくはそれを上回る細胞増殖促進活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、上記（Ａ）に規定されるアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドのアミノ酸配列であり、上記（Ｂ）に規定されるアミノ酸配列は、例えば神経分化誘導活性を有するペプチドモチーフに該当するアミノ酸配列や或いは細胞核の構造を支えるタンパク質として知られるプレラミンＡ（prelamin A）のＣ末端の部分アミノ酸配列である。かかるアミノ酸配列の具体例が配列番号１９〜１０３としてここで開示されている。
従って、ここで開示される細胞増殖促進剤は、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造され得るペプチドを有効成分とするため、高価なｂＦＧＦ等の細胞増殖因子を大量に使用することなく（典型的にはｂＦＧＦの代替物として）目的とする真核細胞の増殖を促進することができる。また、高価なｂＦＧＦその他の細胞増殖因子の使用を削減できるため、細胞増殖を伴う細胞培養や生理活性物質等の生産にかかるコストの低減を実現することができる或いはコスト増を抑制することができる。

【0009】

ここで開示される好ましい一態様の細胞増殖促進剤では、上記合成ペプチド（細胞増殖促進ペプチド）として、上記（Ａ）膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列として配列番号１〜１８のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列、若しくは該選択されたアミノ酸配列のうちの１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列を有するペプチドを含む。
配列番号１〜１８としてここで開示されているアミノ酸配列は、上記（Ａ）膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、本発明の実施に好適に採用することができる。タンパク質を核内の核小体へ局在化させるシグナル配列であり核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ：Nucleolar localization signal、非特許文献１参照）として知られるいずれかのアミノ酸配列（典型的には配列番号１〜１５、特には配列番号１４，１５）を採用することが特に好ましい。

【0010】

また、ここで開示される好ましい他の一態様の細胞増殖促進剤では、上記合成ペプチド（細胞増殖促進ペプチド）を構成する全アミノ酸残基数が５０以下である。このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、且つ、安価で取扱性に優れるため、細胞増殖促進剤の成分として好ましい。

【0011】

また、ここで開示される好ましい他の一態様の細胞増殖促進剤では、上記合成ペプチド（細胞増殖促進ペプチド）が上記（Ａ）で規定されるアミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に隣接して上記（Ｂ）で規定されるアミノ酸配列を含む。
このような構成のペプチドは、特に細胞増殖促進能に優れる。該ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下であるものが、シンプルな構成であり化学合成も容易であるために特に好ましい。
本発明によって提供される合成ペプチド（細胞増殖促進ペプチド）の好ましい具体例として配列番号１０４〜１１１のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド（特に全アミノ酸残基数が５０以下若しくは３０以下のもの）、或いは配列番号１０４〜１１１のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列から構成されているペプチドが挙げられる。このような合成ペプチド（細胞増殖促進ペプチド）を含む細胞増殖促進剤は、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の細胞（例えばいずれかの種類の幹細胞）の増殖を促進する用途に好適である。

【0012】

また、本発明は、他の側面として、少なくとも１種の真核細胞を増殖させる（典型的には生体外で増殖させる、若しくは生体内で増殖させる）ことにより、該真核細胞若しくは該増殖した細胞由来の生合成産物を生産する方法であって、ここで開示されるいずれかの細胞増殖促進剤（換言すればここで開示されるいずれかの細胞増殖促進ペプチド）を該増殖対象の真核細胞に対して少なくとも１回供給することを特徴とする方法を提供する。
かかる生産方法によると、高価なｂＦＧＦその他の細胞増殖因子の使用を削減できるため、細胞増殖による細胞自体の生産や生理活性物質等の生産にかかるコストの低減を実現することができる或いはコスト増を抑制することができる。
また、被験体（患者）の患部の修復や再生を促進させる目的に、ここで開示される生産方法を好適に実施することができる。即ち、ここで開示される方法は、修復や再生に資する細胞を生体外で高効率に増殖（生産）することができるため、本方法の実施によって効率よく生体外で増殖させた細胞を、被験体（患者）の体内に導入することによって、修復や再生に要する時間を短縮することができる。

【0013】

ここで開示される上記生産方法の好ましい一態様では、上記真核細胞がヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の細胞である。ここで開示される細胞増殖促進ペプチドは、この種の細胞の増殖促進に好適に使用することができる。特に上記真核細胞の好適例として、未分化状態にあるいずれかの種類の幹細胞が挙げられる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、一実施例に係る細胞増殖促進ペプチド（サンプル１）を添加して培養したラットの骨髄由来の未分化状態の幹細胞（間葉系幹細胞）の培養開始から３日経過後の細胞増殖状況を示す顕微鏡写真である。

【図2】図２は、一実施例に係る細胞増殖促進ペプチド（サンプル２）を添加して培養したラットの骨髄由来の未分化状態の幹細胞（間葉系幹細胞）の培養開始から３日経過後の細胞増殖状況を示す顕微鏡写真である。

【図3】図３は、一実施例に係る細胞増殖促進ペプチド（サンプル３）を添加して培養したラットの骨髄由来の未分化状態の幹細胞（間葉系幹細胞）の培養開始から３日経過後の細胞増殖状況を示す顕微鏡写真である。

【図4】図４は、一比較例として細胞増殖促進ペプチド及びｂＦＧＦのいずれも添加せずに培養したラットの骨髄由来の未分化状態の幹細胞（間葉系幹細胞）の培養開始から３日経過後の細胞増殖状況を示す顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば細胞増殖促進ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬剤組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。

【0016】

本明細書において「人為的に合成された細胞増殖促進ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみで独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の系（例えば神細胞増殖促進剤を構成する組成物）の中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下、好ましくは５０以下（更に好ましくは３０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。

【0017】

本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。また、本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する細胞増殖促進能を損なうことなく、１個又は数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。

【0018】

ここで開示される細胞増殖促進剤は、本発明者によって見出された少なくとも１種の細胞に対して良好な細胞増殖促進活性を有する合成ペプチド（即ち細胞増殖促進ペプチド）を有効成分として含有することで特徴付けられる組成物である。
上述のとおり、ここで開示される細胞増殖促進ペプチドは、部分アミノ酸配列として、上記（Ａ）で規定される膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列（以下「（Ａ）パート配列」と略称する場合がある。）を有する。
（Ａ）パート配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。例えば、本明細書の配列表における配列番号１〜１８に示すアミノ酸配列およびそれらの改変アミノ酸配列（膜透過性を保持しているものに限られる。）は、（Ａ）パート配列を構成するアミノ酸配列として好ましい。具体的には以下のとおりである。

【0019】

即ち、配列番号１のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号２のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の１種（ＡｐＬＬＰ）由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３のアミノ酸配列は、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス タイプ１）のタンパク質（γ（１）３４．５）由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号４のアミノ酸配列は、ＨＩＣ（human I-mfa domain-containing protein）のｐ４０タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号５のアミノ酸配列は、ＭＤＶ（Ｍａｒｅｋ病ウイルス）のＭＥＱタンパク質由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号６のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計１７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号７のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号８のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってｐ５３腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するＭＤＭ２由来の合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号９のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるＧＧＮＮＶα由来の合計９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１０のアミノ酸配列は、ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１１のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計１５アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１２のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるｐ１２０由来の合計１８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１３のアミノ酸配列は、ＨＶＳ（ヘルペスウイルスsaimiri）のＯＲＦ５７タンパク質由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１４のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１５のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成る核小体局在シグナル（Nucleolar localization sequence）に対応する。
配列番号１６のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計１１アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号１７のアミノ酸配列は、上記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）の合計１１アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号１８のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ由来の合計１８アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
これらのうち、特にＮｏＬＳに関連するアミノ酸配列（又はその改変アミノ酸配列）が好ましい。特に、配列番号１４や１５に示すようなＮｏＬＳ関連のアミノ酸配列が細胞増殖促進ペプチドの（Ａ）パート配列として好ましい。

【0020】

一方、細胞増殖促進ペプチドの（Ｂ）パート配列を構成するアミノ酸配列は、上記（Ａ）パート配列と組み合わせることにより良好な細胞増殖促進活性を有するペプチドが構築し得るものとして本発明者により見出された配列（ペプチドモチーフ）であり、配列番号１９〜１０３に列挙されている。具体的には以下のとおりである。

【0021】

即ち、配列番号１９〜３６に示す各アミノ酸配列は、ＳＯＣＳ系タンパク質として同定された各種タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である（非特許文献２〜５参照）。ここでＳＯＣＳ系タンパク質とは、エロンジンＡ（ＥｌｏｎｇｉｎＡ）と複合体を形成して転写調節因子として働くことが知られているエロンジンＢＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＢＣ）コンプレックス（具体的にはエロンジンＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＣ）の一部）に結合し得る領域（アミノ酸配列）であるＳＯＣＳ−ボックスを有する種々のＳＯＣＳタンパク質（サイトカイン情報伝達のサプレッサー）及びそれらのファミリータンパク質の総称である。
具体的には、ｍＳＯＣＳ−１（配列番号１９），ｍＳＯＣＳ−２（配列番号２０），ｍＳＯＣＳ−３（配列番号２１），ｍＳＯＣＳ−４（配列番号２２），ｍＳＯＣＳ−５（配列番号２３），ｈＳＯＣＳ−６（配列番号２４），ｈＳＯＣＳ−７（配列番号２５），ｈＲＡＲ−１（配列番号２６），ｈＲＡＲ−ｌｉｋｅ（配列番号２７），ｍＷＳＢ−１（配列番号２８），ｍＷＳＢ−２（配列番号２９），ｍＡＳＢ−１（配列番号３０），ｍＡＳＢ−２（配列番号３１），ｈＡＳＢ−３（配列番号３２），ＬＲＲ−１（配列番号３３），ｈＡＳＢ−７（配列番号３４），ｍＡＳＢ−１０（配列番号３５），ｈＡＳＢ−１４（配列番号３６）に含まれるＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する。
また、特に詳細な説明は省略するが、配列番号３７〜９７は、ウイルス（ＨＩＶ、ＡｄＶ、ＳＩＶ等）や哺乳動物から同定された種々のＳＯＣＳ系タンパク質のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列に対応する。例えば、配列番号９２および配列番号９６は、ヒトから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質（ＭＵＦ１）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。また、配列番号９７は、マウスから同定されたＳＯＣＳ系タンパク質ｍＣＩＳ（cytokine-inducible SH2-containing protein）のＢＣ−ボックスに含まれるアミノ酸配列である。

【0022】

また、配列番号９８は、中枢神経系の神経細胞に特異的に発現することが知られているフォン・ヒッペル・リンドー（ＶＨＬ）タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から１５７番目〜１７１番目迄の合計１５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する（特許文献４参照）。
また、配列番号９９〜１０２は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１：Hypoxia-Inducible Factor 1）を構成する二つのサブユニット（即ちＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１β）のうちの一つであるＨＩＦ−１αのＰＡＳ−Ａドメイン（即ちPer-Arnt-Sim ホモロジードメインのサブドメインＡ）に結合するＨＩＦ−１α結合タンパク質であって活性化プロテインＣキナーゼ受容体として同定されたタンパク質「ＲＡＣＫ１(a Receptor of Activated Protein Kinase C)」中のＷＤ６ドメイン、即ちエロンジンＣに結合し得る領域のアミノ酸配列に対応する（非特許文献６〜８参照）。
また、配列番号１０３は、近年、幹細胞の分化誘導シグナルとしての機能が示唆されているプレラミンＡ（prelamin A）タンパク質のＮ末端から６４７番目〜６６１番目迄の合計１５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列に対応する（特許文献５参照）。

【0023】

ここで開示される細胞増殖促進ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）は、上述したような（Ａ）パート配列と、（Ｂ）パート配列とを適宜組み合わせることにより構築される。（Ａ）パート配列と（Ｂ）パート配列のいずれが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、（Ａ）パート配列と（Ｂ）パート配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、（Ａ）パート配列と（Ｂ）パート配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか存在しても１〜３個程度が好ましい。
好ましくは、細胞増殖促進ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させ得る。

【0024】

細胞増殖促進活性を失わない限りにおいて、（Ａ）パート配列と（Ｂ）パート配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分配列としては（Ａ）パート配列と（Ｂ）パート配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該細胞増殖促進ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が望ましく、５０以下が好ましい。３０以下が特に好ましい。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に細胞増殖促進ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）で細胞増殖促進能を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、細胞増殖促進剤に適用する細胞増殖促進ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には５０以下（特に３０以下）のアミノ酸残基数）のものが好適である。

【0025】

全体のアミノ酸配列に対する（Ａ）パート配列と（Ｂ）パート配列の占める割合（即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占める（Ａ）パート配列と（Ｂ）パート配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、細胞増殖促進活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。
なお、本発明の細胞増殖促進ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、細胞増殖促進活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。

【0026】

ここで開示される細胞増殖促進ペプチドのうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示される細胞増殖促進ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、PerSeptive Biosystems社、Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。

【0027】

或いは、遺伝子工学的手法に基づいて細胞増殖促進ペプチドを生合成してもよい。このアプローチは、一般にポリペプチドと呼ばれるようなペプチド鎖の比較的長いペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する細胞増殖促進ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の細胞増殖促進ペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の細胞増殖促進ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。

【0028】

例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の細胞増殖促進ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した細胞増殖促進ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、本発明の細胞増殖促進ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち細胞増殖促進ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
従って、利用する（Ａ）パート配列ならびに（Ｂ）パート配列をひとたび決定し、ペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の細胞増殖促進ペプチドを容易に合成・生産することができる。例えば、日本の（株）ポストゲノム研究所のピュアシステム（登録商標）に基づいて本発明の細胞増殖促進ペプチドを容易に生産することができる。

【0029】

ここで開示される細胞増殖促進ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、細胞増殖促進ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、細胞増殖促進ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
本発明によると、新規なアミノ酸配列の細胞増殖促進ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。例えば、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が５０以下（好ましくは３０以下）であって、配列番号１０４〜１１１で示されるアミノ酸配列或いは該配列の改変アミノ酸配列、または該配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む（又はそれら配列から実質的に構成された）人為的に設計されたポリヌクレオチドが提供される。

【0030】

好適な本発明の細胞増殖促進ペプチドは少なくとも１種の真核細胞に対して高い細胞増殖促進活性を有する。このため、細胞増殖促進剤の有効成分として好適に使用し得る。なお、細胞増殖促進剤に含有される細胞増殖促進ペプチドは、細胞増殖促進活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、細胞増殖促進活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。

【0031】

ここで開示される細胞増殖促進剤は、有効成分である細胞増殖促進ペプチドをその細胞増殖促進活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。細胞増殖促進剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、細胞増殖促進剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
細胞増殖促進剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、細胞増殖促進ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。

【0032】

ここで開示される細胞増殖促進剤（細胞増殖促進ペプチド）の適用対象細胞は特に制限されず、種々の生物種の真核細胞の増殖能を向上させることができる。
特に、ヒト又はヒト以外の動物（特に哺乳動物）の細胞が適用対象として好ましい。また、医学上の価値から、特に幹細胞を対象とすることが好ましい。この種の幹細胞として胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞、神経幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、等が挙げられる。その他、体細胞（皮膚線維芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、等）や生殖細胞も増殖対象として好ましい。細胞増殖の観点から幹細胞は特に未分化状態のもの（即ち分化誘導処理が行われていない状態の幹細胞）を使用することが好ましい。

【0033】

ここで開示される細胞増殖促進剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、生体外（インビトロ）で細胞（例えば樹立細胞株）を培養して増殖させる場合においては、ここで開示される細胞増殖促進ペプチド(即ち該ペプチドを含む細胞増殖促進剤）の適当量を、培養（増殖）対象の真核細胞に対し、培養過程のいずれかの段階、好ましくは培養開始と同時若しくは培養開始後の早い段階で培地に添加するとよい。
添加量及び添加回数は、培養する細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されないが、一般的な真核細胞（特にヒトを含む哺乳動物細胞）を培養する場合、培地中の細胞増殖促進ペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ〜２０μＭ（例えば１μＭ〜１０μＭ）の範囲内となるように、１〜複数回添加する（例えば培養開始時ならびに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する）ことが好ましい。
ここで開示される細胞増殖促進剤（細胞増殖促進ペプチド）をインビトロ培養系に添加することにより、目的とする細胞自体若しくは該細胞が産生する生合成産物（例えば種々の生理活性物質や酵素類）を効率よく生産することができる。しかも高価なｂＦＧＦ等の増殖因子を使用しないか又はその使用量を低減し得るため、生産コストの低減を図ることができる。

【0034】

或いはまた、生体内（インビボ）で細胞（例えば所定の部位に移植した組織片若しくは細胞塊）を増殖させる場合においては、ここで開示される細胞増殖促進剤（即ち細胞増殖促進ペプチド）の適当量を液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者（即ち生体内）に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを直接患部（例えば火傷や創傷のような体表面）に投与することができる。或いは経口投与若しくは座薬の形態で導入してもよい。これにより、生体内で、典型的には患部又はその周辺に存在する増殖させたい目的の細胞の増殖速度を向上させることができる。なお、添加量及び添加回数は、増殖させたい細胞の種類、存在部位、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。
ここで開示される細胞増殖促進剤（細胞増殖促進ペプチド）を生体内の必要な部位に投与することにより、その細胞増殖促進活性によって、神経再生能力、血管新生能力、皮膚再生能力等の向上を実現することができる。また、細胞増殖能の向上により、例えば、皮膚の老化防止、移植臓器の早期定着、交通事故その他の物理的障害による創傷部や火傷部の早期修復を実現することができる。また、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することに資する薬剤組成物として使用することができる。

【0035】

或いはまた、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料、即ち生組織や細胞塊(例えば体性幹細胞の培養物)に、適当量の細胞増殖促進剤（細胞増殖促進ペプチド）を付与することによって、高価なｂＦＧＦ等の増殖因子を大量に用いることなく生体外(インビトロ)で目的細胞（延いては組織や器官）を効率よく生産することができる。
また、ここで開示される細胞生産方法（インビトロでの細胞生産方法）や細胞増殖促進剤を採用することによって生体外（インビトロ）で効率よく生産（増殖）した目的細胞（或いは細胞数の増えた組織や器官）を、修復や再生が必要とされる患部に（即ち患者の生体内に）導入することにより、当該修復や再生に要する時間を短縮することができる。

【0036】

以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。

【0037】

＜実施例１：ペプチド合成＞
計１１種類のペプチド（サンプル１〜１１）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。

【0038】

【表1】

【0039】

表１に示すように、サンプル１のペプチド（配列番号１０４）は、Ｎ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号９８の上記ＶＨＬタンパク質由来のアミノ酸配列を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１４の上記ＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（ＮｏＬＳ）を有する合計２８アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル２のペプチド（配列番号１０５）は、Ｎ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号９９の上記ＲＡＣＫ１由来のアミノ酸配列を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１４の上記ＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（ＮｏＬＳ）を有する合計２７アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル３のペプチド（配列番号１０６）は、Ｎ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１４の上記ＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（ＮｏＬＳ）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号１０３の上記プレラミンＡ由来のアミノ酸配列を有する合計２８アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル４のペプチド（配列番号１０７）は、Ｎ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１４の上記ＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（ＮｏＬＳ）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号９８の上記ＶＨＬタンパク質由来のアミノ酸配列を有する合計２８アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル５のペプチド（配列番号１０８）は、Ｎ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１７の上記ＰＴＤ４のアミノ酸配列を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号９８の上記ＶＨＬタンパク質由来のアミノ酸配列を有する合計２６アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル６のペプチド（配列番号１０９）は、Ｎ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１５の上記ＩＢＶのＮタンパク質由来のアミノ酸配列（ＮｏＬＳ）を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号９８の上記ＶＨＬタンパク質由来のアミノ酸配列を有する合計２３アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル７のペプチド（配列番号１１０）は、Ｎ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１６の上記ＨＩＶのＴＡＴ由来のアミノ酸配列を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号９８の上記ＶＨＬタンパク質由来のアミノ酸配列を有する合計２６アミノ酸残基から成るペプチドである。
また、サンプル８のペプチド（配列番号１１１）は、Ｎ末端側に（Ａ）パート配列として配列番号１７の上記ＰＴＤ４のアミノ酸配列を有し、該配列に隣接してそのＣ末端側に（Ｂ）パート配列として配列番号２４の上記ｈＳＯＣＳ−６由来のアミノ酸配列を有する合計２６アミノ酸残基から成るペプチドである。

【0040】

また、表１に示すように、サンプル９は、（Ａ）パート配列である配列番号１４の上記ＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列のみから成る合計１３アミノ酸残基のペプチドである。
また、サンプル１０は、（Ａ）パート配列である配列番号１７の上記ＰＴＤ４のアミノ酸配列のみから成る合計１１アミノ酸残基のペプチドである。
また、サンプル１１は、（Ａ）パート配列である配列番号１５の上記ＩＢＶのＮタンパク質由来のアミノ酸配列のみから成る合計１１アミノ酸残基のペプチドである。

【0041】

なお、いずれのペプチドも、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はアミド化（−ＣＯＮＨ_２）されている。いずれのペプチドも、市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。

【0042】

＜実施例２：合成ペプチドの細胞増殖促進活性評価＞
上記実施例１で得られた細胞増殖促進ペプチド（サンプル１〜８）及び比較例として合成した（Ａ）パート配列のみから成るペプチド（サンプル９〜１１）のそれぞれについて細胞増殖促進活性を調べた。また、対象として市販されるｂＦＧＦを細胞増殖促進剤として使用した実験区をサンプル１２とした。また、対象区としてペプチド無添加区（勿論ｂＦＧＦを添加していない。）をサンプル１３とした。評価試験の詳細は以下のとおりである。合成した各サンプルペプチドは、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶かし、ペプチド濃度が１ｍＭのストック液を調製した。

【0043】

ラットの骨髄由来の幹細胞（間葉系幹細胞）を供試細胞とした。具体的には、供試幹細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ：Gibco社製品）、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むダルベッコのＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地：Gibco社製品）で継代培養した。２継代目（パッセージ２）を本評価試験に使用した。
而して、予め１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む上記ＤＭＥＭ培地で一晩プレ培養した供試幹細胞を回収し、細胞数が１ウェルあたり１×１０^３個となるように９６穴（ウェル）プレートの各ウェルに播種した。このときの培地量はウェルあたり１００ｍＬとした。
次いで、ウェル中のペプチド濃度が２μＭとなるように、各ウェルにサンプル１〜１１のいずれかのペプチドの上記ストック液を注入した。また、比較のため、一部のウェルに濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように市販のｂＦＧＦ（PeproTech社製品）を添加した（サンプル１２）。また、いずれのサンプルペプチドもｂＦＧＦを添加しないウェルを設けた（サンプル１３）。

【0044】

上記のようにしてサンプルペプチド若しくはｂＦＧＦを添加後、当該９６穴（ウェル）プレートを、ＣＯ_２インキュベータ内に配置し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で静置培養した。なお、培地の交換は一日おきとした。交換培地は培養開始時に使用したものと同じである（即ち、サンプルペプチド若しくはｂＦＧＦの添加区では同様にサンプルペプチド若しくはｂＦＧＦを交換培地にも添加した。）。
かかる培養試験中において、培養開始時点（ｄａｙ０）と、培養開始から２日経過時点（ｄａｙ２）と、培養開始から４日経過時点（ｄａｙ４）に、一部のウェルに発色試薬として「水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）」を添加した。添加から２時間インキュベートした後、該発色試薬を添加した細胞培養液を回収した。そして、テトラゾリウム塩の還元に基づき波長４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ_４５０）を測定する比色法により、細胞増殖の程度を評価した。結果を表２に示す。

【0045】

【表2】

【0046】

表２に示す吸光度から明らかなように、ここで開示される細胞増殖促進ペプチド（サンプル１〜８）を添加した培養区では、ｂＦＧＦを添加した培養区（サンプル１２）と同等かそれ以上の細胞増殖能の向上が認められた。このことは、これらサンプルペプチドが極めて良好な細胞増殖促進活性を有するペプチドであることを示している。特に、（Ａ）パート配列としてＮｏＬＳ由来のアミノ酸配列を有するペプチド（例えばサンプル１〜４，６）やＴＡＴ由来のアミノ酸配列を有するペプチド（サンプル７）は、特に顕著な細胞増殖促進活性を有していた。図１、図２、図３は、それぞれ、サンプル１、２、３を添加した培養区の培養開始から３日経過時点で撮影した顕微鏡写真である。これら顕微鏡写真と図４のサンプル１３の培養区（即ちペプチド無添加区）の培養開始から３日経過時点で撮影した顕微鏡写真とを比較すると、ここで開示される細胞増殖促進ペプチドの細胞増殖促進活性の高さが視覚的にも確認された。
また、詳細なデータは示していないが、本実施例において増殖・生産された供試幹細胞を回収し、市販の材料を用いてこの種の幹細胞に対して行われる一般的な骨分化誘導処理を行ったところ、正常な骨分化が認められた。このことは、ここで開示される細胞増殖促進ペプチド（細胞増殖促進剤）によると、増殖対象の細胞に異常（例えば癌化）をきたすことなく正常に細胞増殖が促進され得ることを示している。

【0047】

＜実施例３：顆粒剤の調製＞
サンプル１のペプチド５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、細胞増殖促進ペプチドを主成分とする顆粒剤（即ち、顆粒状の細胞増殖促進剤）を得た。

【産業上の利用可能性】

【0048】

上述のように、ここで開示される細胞増殖促進ペプチドは、高い細胞増殖促進活性を有しているため、ｂＦＧＦ等の高価な細胞増殖因子の代替物として有用であり、該ペプチドを含む細胞増殖促進剤は、例えば医薬用途の組成物として利用することができる。

【配列表フリーテキスト】

【0049】

配列番号１〜配列番号１１１ 合成ペプチド

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]