特許 6012624 活性プロテアーゼ耐性抗体Ｆｃ突然変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6012624

(24)【登録日】2016年9月30日

(45)【発行日】2016年10月25日

(54)【発明の名称】活性プロテアーゼ耐性抗体Ｆｃ突然変異体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/32 20060101AFI20161011BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20161011BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161011BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20161011BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161011BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161011BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20161011BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/32ZNA

   C07K16/46

   C12N15/00 A

   C07K19/00

   A61K39/395 H

   A61K39/395 N

   A61K39/395 T

   A61P43/00 105

   A61P35/00

   A61P31/04

   A61K39/395 Q

【請求項の数】35

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2013-546229(P2013-546229)

(86)(22)【出願日】2011年12月15日

(65)【公表番号】特表2014-504301(P2014-504301A)

(43)【公表日】2014年2月20日

(86)【国際出願番号】US2011065174

(87)【国際公開番号】WO2012087746

(87)【国際公開日】20120628

【審査請求日】2014年10月17日

(31)【優先権主張番号】61/540,882

(32)【優先日】2011年9月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/426,619

(32)【優先日】2010年12月23日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ブレズスキ，ランダール

(72)【発明者】

【氏名】ジョーダン，ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ストロール，ウィリアム

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３６０３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Proc Natl Acad Sci USA. 2009, vol.106, no.42, p.17864-17869

【文献】 Eur J Immunol, 1999, vol.29, p.2613-2624

【文献】 Curr Opin Biotechnol, 2009, vol.20, no.6, p.685-691

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩｇＧ１野生型Ｆｃ−含有分子と比較してタンパク質分解に対して耐性を有する、改変されたＦｃ−含有分子であって、変異ＩｇＧ１定常領域を有する抗体Ｆｃ−ドメインを含み、ＥＵ番号付けにより定義されるヒトＩｇＧ１のＥ２３３−Ｌ２３４−Ｌ２３５−Ｇ２３６の配列が、Ｐ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５で置き換えられ、かつＧ２３６が削除され、更にＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ；Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ；Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ；及びＧ２３７Ｘ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｑ又はＳである）から選択される野生型ヒトＩｇＧ１配列からの１つ以上の置換を含む、Ｆｃ−含有分子。

【請求項2】

前記Ｆｃ−含有分子が、ＩｇＧ１分子を残基２２２〜２３７（ＥＵ番号付けにより定義される）の間で切断することが可能なプロテアーゼによる分解に対して耐性である、請求項１に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項3】

前記Ｆｃ−含有分子が、野生型ＩｇＧ１と比較して、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＨＮＥ、プラスミン、カテプシンＧ、ペプシン、化膿性連鎖球菌（Strep. Pyrongenes）由来の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、又は黄色ブドウ球菌（Staph. aureus）由来のグルタミルエンドペプチダーゼＩ（ＧｌｕＶ８）による分解に対して耐性である、請求項２に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項4】

前記Ｆｃ−含有分子が、野生型ＩｇＧ１と比較して、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＩｄｅＳ、又はＧｌｕＶ８のうちの１つ以上による分解に対して耐性である、請求項３に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項5】

前記Ｆｃ−含有分子が、ＣＤ１４ ｐｏｓ及び／又はＣＤ１１ｂ ｐｏｓ血液単核細胞の存在下で測定して、ＡＤＣＰを促進することが可能であり、前記分子が、配列番号８、１０〜１５、及び１７〜２０の群から選択される配列を含む、請求項１に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項6】

分子が、ＥＵ番号付けにより定義されるＰ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５で置換され、かつＧ２３６が削除された野生型ＩｇＧ１のヒンジドメインを含み、又は配列番号３を含み、ＥＵ番号付けシステムにより定義される追加のＩ３３２Ｅを有する、請求項５に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項7】

前記Ｆｃ−含有分子が、血液単核細胞の存在下で測定して、ＡＤＣＣを促進することが可能である、請求項１に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項8】

分子が、ＥＵ番号付けにより定義されるＰ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５で置換され、かつＧ２３６が削除された野生型ＩｇＧ１のヒンジドメインを含み、又は配列番号３を含み、ＥＵ番号付けシステムにより定義される追加のＩ３３２Ｅを有する、請求項７に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項9】

前記分子が、配列番号８及び１０〜１２、及び１５、１７〜２０の群から選択される配列を含む、請求項７に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項10】

前記Ｆｃ−含有分子が、補体の存在下で、細胞溶解により測定される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進することが可能である、請求項１に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項11】

前記Ｆｃ−含有分子が、配列番号１３、１４及び１８〜２０の群から選択される配列を含む、請求項１０に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項12】

前記Ｆｃ−含有分子が、野生型ＩｇＧ２ Ｆｃ−ドメインと同等以上の親和性で、Ｆｃγ受容体に結合可能である、請求項１に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項13】

前記Ｆｃ−含有分子が、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ−ドメインと同等以上の親和性で、Ｆｃγ受容体に結合可能である、請求項１に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項14】

配列番号８を含む、請求項７に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項15】

前記Ｆｃ−含有分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項16】

前記抗体が、腫瘍細胞、腫瘍マトリックス、又は腫瘍血管系上の抗原に結合する、請求項１５に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項17】

前記抗体が、ＣＤ２０、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦ、ＲＯＮ、及び組織因子のうちの１つに結合する、請求項１６に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項18】

前記Ｆｃ−ドメイン配列が、ＥＵ番号付けシステムにおける野生型ヒトＩｇＧ１の２１４残基〜約３４０残基と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載のＦｃ−含有分子。

【請求項19】

組換えポリペプチドである単離された結合分子であって、（ｉ）細胞上の又は前記細胞に結合された標的分子に結合可能な結合ドメインと、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ１重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインの全部又は一部と実質的に相同のアミノ酸配列を有するＦｃ−ドメインであって、ＥＵ番号付けシステムにより定義される残基２１４〜２３８が、配列番号４及び５から選択される配列を含む、前記Ｆｃ−ドメインと、を含み、前記結合分子が、標的細胞上の前記標的分子に結合可能であり、前記分子が、必要なエフェクター細胞タイプの存在下で、前記標的細胞の測定可能な補体依存性溶解又は細胞媒介性破壊を生じさせることを特徴とする、結合分子。

【請求項20】

前記Ｆｃ−ドメインが、更にＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ；Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ；Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ；及びＧ２３７Ｘ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｑ又はＳである）から選択される野生型ヒトＩｇＧ１配列からの１つ以上の置換を含む、請求項１９に記載の結合分子。

【請求項21】

前記Ｆｃ−ドメインが、ＩｇＧ１分子を残基２２２〜２３７（ＥＵ番号付けにより定義される）の間で切断することが可能なプロテアーゼによる分解に対して耐性である、請求項１９に記載の結合分子。

【請求項22】

前記Ｆｃ−ドメインが、野生型ＩｇＧ１と比較して、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＨＮＥ、プラスミン、カテプシンＧ、ペプシン、ＩｄｅＳ、又はＧｌｕＶ８による分解に対して耐性である、請求項２１に記載の結合分子。

【請求項23】

前記結合ドメインが、抗体のパラトープを含むドメイン；酵素；ホルモン；受容体；サイトカイン；免疫細胞表面抗原；及び接着分子から選択される、請求項１９に記載の結合分子。

【請求項24】

前記分子が、２つ以上の標的結合ドメインを含み、結合活性を呈する、請求項２３に記載の結合分子。

【請求項25】

前記結合ドメインが、腫瘍細胞又は腫瘍血管系上の抗原に結合する抗体のパラトープを含む、請求項２４に記載の結合分子。

【請求項26】

前記結合分子が、ＣＤ２０、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＶＥＧＦ、ＲＯＮ及び組織因子のうちの１つに結合する、請求項２５に記載の結合分子。

【請求項27】

請求項１に記載のＦｃ−含有分子または請求項２６に記載の結合分子を含む医薬組成物。

【請求項28】

細胞の望ましくない増殖又は遊走により特徴付けられる疾病の治療用のものである、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記疾病が、悪性疾患、線維性疾患、又は望ましくない血管新生により特徴付けられる疾病である、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記Ｆｃが、Ｉ３３２Ｅ単独又はＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３７Ｘ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｘは、Ａ又はＳである）などの他の置換との組み合わせ；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；及びＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌから選択される置換を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記Ｆｃが、Ｓ２３９Ｄ単独又はＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３７Ｘ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｘは、Ａ又はＳである）などの他の置換との組み合わせ；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；及びＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌから選択される置換を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項32】

請求項１９に記載の結合分子を含む、原核生物の感染として特徴付けられる疾病の治療用医薬組成物。

【請求項33】

前記Ｆｃが、原核生物プロテアーゼに対して耐性であり、ＣＤＣが可能である、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記Ｆｃ−ドメインが、ＥＵ番号付けにより定義される約２１４残基〜約３３０残基の、ヒンジ及びＣＨ２領域内のヒトＩｇＧ１の配列を有し、少なくとも残基２３３〜２３７がＰＶＡ／（Ｇ２３６削除）で置換され、更にＫ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、及びＳ２６７／Ｉ３３２Ｅから選択される、ＣＨ２ドメイン内の１つ以上の置換を含む、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項35】

前記結合分子が、配列番号１３、１４、及び１８〜２０の群から選択される配列を含む、請求項３１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１０年１２月２３日出願の米国特許出願第６１／４２６，６１９号、及び２０１１年９月２９日出願の米特許出願第６１／５４０，８８２号に対する優先権を主張する。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、タンパク質分解切断部位を変更して、内因性及び病原体由来のプロテアーゼに対する耐性を付与するように変異され、更に、Ｆｃγ受容体に特異的に結合し、Ｆｃ受容体媒介による架橋又は補体カスケードの活性化により、免疫細胞による細胞分裂応答を活性化するように変更されたヒト抗体ＩｇＧ定常領域、特にＦｃ領域に関する。新規な配列は、タンパク質分解耐性及び細胞傷害エフェクター機能が所望される治療用抗体組成物に組み込まれることができる。

【背景技術】

【0003】

ヒト抗体のＩｇＧアイソタイプは、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなり、それぞれが２つの抗原結合アーム（Ｆａｂ）を含み、抗原結合アーム（Ｆａｂ）は、ヒンジ領域によって単一のＦｃドメインに接続されている。治療的モノクローナル抗体において示される主要なサブクラスであるＩｇＧ１は、循環中での１７．６〜５６．２日間の長い半減期を有する安定な分子であると見なされている（Ｓａｌｆｅｌｄ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５（１２）：１３６９〜７２，２００７）。しかしながら、ＩｇＧ１は、浸潤癌に関連した多数の生理学的関連プロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ）及び病的微生物によって、ヒンジ領域内でタンパク質分解を受けやすい。重鎖間のジスルフィド結合（コアヒンジ）の上方での切断は、一価Ｆａｂを遊離させ、ジスルフィド結合の下方での両側性切断は、二価構造、Ｆ（ａｂ’）₂断片を遊離させる。数個のメタロプロテアーゼと２つの細菌酵素、黄色ブドウ球菌（Staph. aureus）のグルタミルエンドペプチダーゼＶ８（ＧｌｕＶ８）、及び化膿性連鎖球菌（Strep. Pyrongenes）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）は、下部ヒンジ内（ジスルフィド結合の下方（図１）においてＩｇＧ１上に作用し、最終的にＦ（ａｂ’）₂及びＦｃ断片を生じさせる（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５（７）：１８３７〜４６ ２００８）。

【0004】

細胞表面抗原に指向される治療的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の有効性が、標的細胞の除去に関連する場合、Ｆｃドメインにより付与される抗体「エフェクター機能」は明らかに関与し、抗体の総合的な治療効果に重要である。（Ｂｉｂｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７：１１２２〜１１２９ ２００９；Ｃａｒｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９９：７５４〜７５８ ２００２；及びＭｕｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６：１７８９〜１７９６ ２００８）。免疫細胞上で発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）と相互作用する抗体のＦｃドメインと、補体とのＦｃドメイン相互作用とは、細胞表面抗原に指向されたいくつかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作用に寄与すると考えられる。これらの相互作用は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）による、ｍＡｂ標的細胞の除去をもたらし得る。 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

最近、ＩｇＧ１の重鎖ポリペプチドの１つにおける単一のタンパク質分解切断が、鎖の関連にとって分裂的ではなく、したがって循環中での抗原結合能力の長寿命を維持するが、ＦｃγＲに結合し及びＦｃ媒介エフェクター機能を駆動するＩｇＧ１の能力の損失を生じることが示されている（Ｂｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１７８６４〜１７８６９ ２００９）。治療的モノクローナル抗体の単一の及び多数の切断は、両方とも、標的に結合するが、有効性のいくつか又は全部が失われた種をもたらし得る。したがって、プロテアーゼ耐性を操作されているが、エフェクター機能が増強されたＦｃ−プラットホームは、標的細胞又は組織の破壊が所望されるいくつかの使用の中でも、抗癌及び抗感染症治療薬の有効性を改善するための有意な利点を提供する可能性がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、抗体又は抗体様治療薬の設計に有用な、改変された免疫グロブリン定常ドメインからなる組成物を提供する。Ｆｃ領域及び標的細胞表面リガンドを含む、治療薬として使用されるＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、本組成物を使用した改変にとって注目すべき候補である。本発明の改変免疫グロブリンは、ＩｇＧの抗原結合ドメインにより標的とされる環境内、例えば癌細胞又は腫瘍血管系関連の抗原を含む腫瘍内環境内でのタンパク質分解酵素に対して耐性であるが、抗体のＦｃ領域に関連した重要なエフェクター機能を保持する。

【0007】

本発明によれば、プロテアーゼ耐性を付与する突然変異をＩｇＧ１ Ｆｃ領域内に組み込むことによる、プロテアーゼ耐性ＩｇＧ１モノクローナル抗体を生じさせる手段を提供する。更なる態様では、Ｆｃ領域の遠位位置に追加のアミノ酸変化を導入することにより、そのような突然変異を含むＩｇＧｓに機能活性が回復され得る。

【0008】

本発明の組成物は、ＩｇＧ１の下部ヒンジ内に、変更されたアミノ酸残基を含むプロテアーゼ耐性ＩｇＧ１抗体であり、該アミノ酸残基は、ＦｃγＲのＦｃ結合に関与し、また生理学的関連タンパク質分解切断の部位として同定されている。一態様において、ヒトＩｇＧ１サブクラスの残基は、ヒトＩｇＧ２の対応する下部ヒンジ残基で置き換えられる。一実施形態において、ヒトＩｇＧ１の配列Ｅ２３３−Ｌ２３４−Ｌ２３５−Ｇ２３６は、ＩｇＧ２ Ｐ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５で置き換えられ、Ｇ２３６は削除される（ＥＵ番号付け（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８〜８５ １９６９））。別の実施形態では、ＩｇＧ１残基Ｅ２３３−Ｌ２３４−Ｌ２３５−Ｇ２３６−Ｇ２３７は、Ｐ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５で置き換えられ、Ｇ２３６は削除され、Ｇ２３７は、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｑ又はＳから選択されるアミノ酸配列で置き換えられる。尚別の実施形態では、残基２１４〜２３６、ＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴ ＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ ＬＧ（配列番号３）に対応する、ＩｇＧ１定常ドメイン内の全部の残基が、ヒトＩｇＧ２内の対応する位置の配列、即ちＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣ ＰＰＣＰＡＰＰＶＡ（配列番号４）で置き換えられる。

【0009】

第２の態様において、本発明のプロテアーゼ耐性ＩｇＧ１突然変異体がＦｃγＲ及び／又は補体に結合する能力は、更なる突然変異を組み込むことにより回復され得る。したがって、そのような更なる置換を有さない場合、Ｐ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５を含み、Ｇ２３６が削除されたプロテアーゼ耐性ヒンジ領域を含むプロテアーゼ耐性ＩｇＧ１突然変異体、又は残基２１４〜２３６のＩｇＧ１定常領域配列の全部が、ＩｇＧ２からの対応する配列（配列番号４）で置き換えられている突然変異体は、ＦｃγＲに結合する能力が低下されている。ＦｃＲ及びＣ１ｑの結合に関連したエフェクター機能の損失を克服するために、改変ＩｇＧ１分子が、適度の、又は野生型ヒトＩｇＧ１と比較して増強さえもされている、ＦｃγＲに結合する能力を保持するように、追加の突然変異が抗−ヒンジ定常領域内に組み込まれる。したがって、本発明の一実施形態では、プロテアーゼ耐性ＩｇＧ１は、約ＥＵ残基２１４〜約残基３３０の、ヒンジ及びＣＨ２領域内のヒトＩｇＧ１の配列を有するＦｃドメインを含む分子であって、少なくとも残基２３３〜２３７が、ＰＶＡ／（Ｇ２３６削除）で置換され、加えて、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ；Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；Ｇ２３７Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；及びＧ２３７Ｓ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ及びＳ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅから選択される特定の置換を有する、分子を含む。特定の実施形態において、野生型ＩｇＧ１定常ドメイン配列に由来するＩｇＧ分子は、配列番号６を含む。別の実施形態では、プロテアーゼ耐性ＩｇＧは、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅにおける置換を有する野生型ＩｇＧ２定常ドメインに由来する。したがって、これら追加の突然変異を含めることにより、プロテアーゼ耐性を維持する一方でＦｃ機能が可能となり、ある場合には、インビトロでのＦｃγＲ−結合アッセイと、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのインビトロでの細胞アッセイとの両方での、ＩｇＧ１野生型と比較して改善されたＦｃ媒介エフェクター機能が可能となる。本発明のＦｃドメインを組み込んだ、エフェクター機能を有するプロテアーゼ耐性モノクローナル抗体は、腫瘍成長又は感染の部位内の高い局所プロテアーゼの存在によりＩｇＧが切断される抗癌及び抗菌治療薬に有用である。

【0010】

別の態様では、本明細書に記載した組成物は、それを必要とする哺乳動物対象に投与される治療分子の成分としての有用性を見出している。組成物を使用する１つの方法において、それを必要とする対象の処置に使用される、野生型ヒトＩｇＧ１配列及びリガンド結合ドメインを含む抗体は、プロテアーゼ耐性ヒンジ配列Ｐ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５を組み込む（Ｇ２３６は削除される）ように改変され、所望の場合、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ；Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ；Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、及びＳ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ；Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；Ｇ２３７Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；及びＧ２３７Ｓ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅから選択されるエフェクター機能回復改変を有する。一実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ突然変異体組成物は、ｉ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、ｉｉ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ｉｉｉ）抗体依存性細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）ｉｖ）ＦｃＲ媒介細胞活性化（例えば、ＦｃＲ架橋を介したサイトカイン放出）、及びｖ）及びＦｃＲ媒介血小板活性化／枯渇などの、免疫及びエフェクター機能に関連したＦｃγＲの活性化が、組成物の有効性に必須である適応症に使用される。一態様において、ＩｇＧ１ Ｆｃ突然変異は、増殖性疾患の細胞、例えば腫瘍細胞；腫瘍血管系細胞；線維芽細胞；活性化Ｂ細胞若しくはＴ細胞、又は病原性宿主若しくは非宿主由来細胞、特に細菌細胞上のリガンドを標的とする多価バインダーの治療的抗体又はＦｃ融合物に組み込まれる。

【0011】

別の実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ突然変異は、医薬組成物を含む。別の実施形態において、ＩｇＧ１ Ｆｃ突然変異は、薬剤的に活性な分子の一部を含む。ＩｇＧ１ Ｆｃ突然変異又は活性ＩｇＧ１ Ｆｃ突然変異含有分子を含む医薬組成物は、望ましくない又は制御されない細胞の増殖又は遊走によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。一態様において、リガンド結合ドメインと組み合わされた本発明のプロテアーゼ耐性定常ドメイン組成物は、全身送達方法又は局所送達方法を用いて、ＩｇＧ１サブクラス分子を分解することが可能な１つ以上のプロテアーゼが見出される身体区画への投与経路を使用して、それを必要とする対象に投与される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ヒンジ領域内とＦｃγＲ及び補体との相互作用に重要な領域内とに見出されるアミノ酸配列と、位置付けられたプロテアーゼ切断地点とが付随する、ヒトＩｇＧ１抗体の描写。

【図2】各残基に関する対応するＥＵ番号付けを示す、新たなコンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（配列番号８）及び２ｈ Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（配列番号９）と整列された野生型ヒトＩｇＧ１（配列番号１）及びＩｇＧ２（配列番号２）の定常領域の部分のアミノ酸配列の整列を示し、ここでＩｇＧ１及びＩｇＧ２の両方のヒンジ領域は、両方とも、新たなコンストラクトと同様、ＥＵ残基２２６及び２２９においてシステイン残基を含む。

【図3A】プロテアーゼＩｄｅＳを用いた、図２に記載したような、異なるＩｇＧアイソタイプ（Ａ）と、その新たなコンストラクト（Ｂ）とを含む抗体の、異なる時点における消化分析。

【図3B】プロテアーゼＩｄｅＳを用いた、図２に記載したような、異なるＩｇＧアイソタイプ（Ａ）と、その新たなコンストラクト（Ｂ）とを含む抗体の、異なる時点における消化分析。

【図4A】２４時間のインキュベーション後の、ＩｄｅＳ（Ａ）ＧｌｕＶ８（Ｂ）、ＭＭＰ−３（Ｃ）及びＭＭＰ−１２（Ｄ）を用いたＩｇＧコンストラクトの消化を示す（ｎ＝２）。

【図4B】２４時間のインキュベーション後の、ＩｄｅＳ（Ａ）ＧｌｕＶ８（Ｂ）、ＭＭＰ−３（Ｃ）及びＭＭＰ−１２（Ｄ）を用いたＩｇＧコンストラクトの消化を示す（ｎ＝２）。

【図4C】２４時間のインキュベーション後の、ＩｄｅＳ（Ａ）ＧｌｕＶ８（Ｂ）、ＭＭＰ−３（Ｃ）及びＭＭＰ−１２（Ｄ）を用いたＩｇＧコンストラクトの消化を示す（ｎ＝２）。

【図4D】２４時間のインキュベーション後の、ＩｄｅＳ（Ａ）ＧｌｕＶ８（Ｂ）、ＭＭＰ−３（Ｃ）及びＭＭＰ−１２（Ｄ）を用いたＩｇＧコンストラクトの消化を示す（ｎ＝２）。

【図5A】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクト：ＦｃγＲＩ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｂ及びＣ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ及びＥ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ及びＧ）のグループに関するＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）分析によるＦｃγＲ−結合結果を示し、％最大シグナルからの低下は、非標識コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１と結合を競合する能力を表す（ｎ＝２）。

【図5B】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクト：ＦｃγＲＩ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｂ及びＣ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ及びＥ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ及びＧ）のグループに関するＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）分析によるＦｃγＲ−結合結果を示し、％最大シグナルからの低下は、非標識コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１と結合を競合する能力を表す（ｎ＝２）。

【図5C】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクト：ＦｃγＲＩ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｂ及びＣ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ及びＥ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ及びＧ）のグループに関するＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）分析によるＦｃγＲ−結合結果を示し、％最大シグナルからの低下は、非標識コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１と結合を競合する能力を表す（ｎ＝２）。

【図5D】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクト：ＦｃγＲＩ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｂ及びＣ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ及びＥ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ及びＧ）のグループに関するＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）分析によるＦｃγＲ−結合結果を示し、％最大シグナルからの低下は、非標識コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１と結合を競合する能力を表す（ｎ＝２）。

【図5E】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクト：ＦｃγＲＩ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｂ及びＣ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ及びＥ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ及びＧ）のグループに関するＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）分析によるＦｃγＲ−結合結果を示し、％最大シグナルからの低下は、非標識コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１と結合を競合する能力を表す（ｎ＝２）。

【図5F】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクト：ＦｃγＲＩ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｂ及びＣ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ及びＥ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ及びＧ）のグループに関するＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）分析によるＦｃγＲ−結合結果を示し、％最大シグナルからの低下は、非標識コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１と結合を競合する能力を表す（ｎ＝２）。

【図5G】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクト：ＦｃγＲＩ（Ａ）、ＦｃγＲＩＩａ（Ｂ及びＣ）、ＦｃγＲＩＩｂ（Ｄ及びＥ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ及びＧ）のグループに関するＡＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ（登録商標）分析によるＦｃγＲ−結合結果を示し、％最大シグナルからの低下は、非標識コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１と結合を競合する能力を表す（ｎ＝２）。

【図6A】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトと、野生型ＩｇＧ₁及びＩｇＧ₂とを用いて行われた別個のＡＤＣＰアッセイのグラフであり、Ｙ軸上の％貪食作用は、サンプル細胞の総数に対するもの。

【図6B】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトと、野生型ＩｇＧ₁及びＩｇＧ₂とを用いて行われた別個のＡＤＣＰアッセイのグラフであり、Ｙ軸上の％貪食作用は、サンプル細胞の総数に対するもの。

【図6C】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトと、野生型ＩｇＧ₁及びＩｇＧ₂とを用いて行われた別個のＡＤＣＰアッセイのグラフであり、Ｙ軸上の％貪食作用は、サンプル細胞の総数に対するもの。

【図7A】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトと、野生型ＩｇＧ₁及びＩｇＧ₂とを用いて行われた別個のＡＤＣＣアッセイのグラフであり、Ｙ軸上の％溶解は、洗剤による同数の細胞の１００％溶解に対するものである（ｎ＝２）。

【図7B】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトと、野生型ＩｇＧ₁及びＩｇＧ₂とを用いて行われた別個のＡＤＣＣアッセイのグラフであり、Ｙ軸上の％溶解は、洗剤による同数の細胞の１００％溶解に対するものである（ｎ＝２）。

【図7C】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトと、野生型ＩｇＧ₁及びＩｇＧ₂とを用いて行われた別個のＡＤＣＣアッセイのグラフであり、Ｙ軸上の％溶解は、洗剤による同数の細胞の１００％溶解に対するものである（ｎ＝２）。

【図8】プロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトと、野生型ＩｇＧ₁及びＩｇＧ₂とを用いて行われたＣＤＣアッセイのグラフであり、Ｙ軸上の％溶解は、洗剤による同数の細胞の１００％溶解に対するものである（ｎ＝２）。

【0013】

【表1】

【発明を実施するための形態】

【0014】

略称
ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞性細胞傷害；ＡＤＣＰ、抗体依存性細胞性貪食作用；ＣＤＣ＝補体依存性細胞傷害；ＦＤＣＲ＝Ｆｃ依存性サイトカイン放出；ＦｃγＲ＝Ｆｃガンマ受容体；ＧｌｕＶ８＝黄色ブドウ球菌のグルタミルエンドペプチダーゼＶ８；ＩｄｅＳ＝化膿性連鎖球菌の免疫グロブリン分解酵素ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ；ＩＴＡＭ＝免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ；ＩＴＩＭ＝免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ；Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ＭＭＰ＝マトリックスメタロプロテイナーゼ；用語プロテアーゼはプロテイナーゼと等価であり、交換可能に使用される；ＰＲ＝プロテアーゼ耐性。

【0015】

定義＆用語の説明
「抗体依存性細胞傷害」「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合してその後標的細胞を細胞毒で殺傷することを可能にするような、細胞傷害の形態を意味する。標的細胞の表面に指向されるリガンド特異的高親和性ＩｇＧ抗体は、細胞傷害性細胞を刺激し、またそのような殺傷に絶対に必要である。標的細胞の溶解は細胞外であり、直接の細胞間接触を必要とし、また補体に関与しない。

【0016】

任意の特定の抗体の、ＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を媒介する能力が測定され得る。ＡＤＣＣ活性を評価するために、目的の抗体は、標的細胞の細胞溶解をもたらす抗原抗体複合体によって活性化され得る免疫エフェクター細胞と共同して、標的リガンドを示す、標的細胞に添加される。細胞溶解は、通常、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出される。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。インビトロでのＡＤＣＣアッセイの具体的な例は、Ｗｉｓｅｃａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ，１９：２１１、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６：１３５１、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５８：１８３、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：２９に説明される（これらのそれぞれは、参照によって組み込まれる）。別の方法として、又は追加として、目的の抗体のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、その内容が参照によってその全体において組み込まれるＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２に開示されるような動物モデルにおいて、評価されてもよい。エフェクター細胞が殆ど貪食作用を介して作用する場合、プロセスは、抗体依存性細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）として記載され得る。

【0017】

「補体指向性細胞傷害」又はＣＤＣは、補体カスケードが、抗体Ｆｃに結合する補体成分Ｃ１ｑによって活性化される、細胞傷害の形態を指す。

【0018】

用語「エフェクター機能」は、溶解性プロセスによる、又はエフェクター細胞及び補体成分による貪食作用による抗原発現細胞の除去をもたらす、免疫細胞上に発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）とのＦｃの相互作用、及び補体のＦｃドメイン相互作用を含む。

【0019】

本明細書で使用される用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」、又は「Ｆｃ含有分子」は、少なくとも免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、単量体、二量体、又はヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、タンパク質／分子（例えば、抗体）の二量体領域の少なくとも一部を形成することができる。

【0020】

本明細書で使用される用語「抗体」は、動物抗体の少なくとも１つの種の重鎖又は軽鎖抗体可変ドメインのうちの少なくとも１つに対して実質的に相同性を含む又は保持する、少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含む、Ｆｃ含有タンパク質の特定の形態である。

【0021】

野生型ヒトＩｇＧサブクラス定常配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに目録されており、オンラインでＰ０１８５７（ＩｇＧ１）、Ｐ０１８５９（ＩｇＧ２）、Ｐ０１８６０（ＩｇＧ３）、及びＰ０１８６１（ＩｇＧ４）として入手可能である。本明細書で使用される「野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域」は、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けによる、ヒトＩｇＧ重鎖の残基Ｋ２１４〜残基Ｋ４４７である、配列番号１のアミノ酸配列又はその断片を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を指す。定常領域内のアミノ酸は、ヒトＩｇＧ１抗体、ＥＵとの整列によって番号付けされる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７０ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，９：３１６１〜７０参照）。即ち、抗体の重鎖及び軽鎖は、アミノ酸配列同一性を最大化するようにＥＵの重鎖及び軽鎖と整列され、抗体内のそれぞれのアミノ酸は、ＥＵにおける対応するアミノ酸と同じ番号を割り当てられる。ＥＵ番号付け方式は、当技術分野において従来使用されている（概略的には、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１〜３２４２，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）を参照）。慣習に従って、野生型ＩｇＧ２定常領域と、ＥＵのＩｇＧ２定常領域との整列は、位置２２１〜２２３及び２３６にて空のアミノ酸をもたらす（図２、配列番号２）。

【0022】

哺乳動物のＩｇＧ重鎖の定常ドメインの配列は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３として、配列内に指定される。ＩｇＧの「ヒンジ」、「ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」は一般に、Ｋａｂａｔシステムによれば、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６を含み、Ｐｒｏ２３０で終結するとして定義されるが、機能的には、鎖の可撓性部分は、Ｇｌｕ２１６〜Ｇｌｙ２３７などの上部及び下部ヒンジ領域と称される追加の残基を含むと見なされてもよく（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１：４０８３）、下部ヒンジは一般に、Ｆｃ領域の残基２３３〜２３９と称され、ＦｃγＲ結合は該残基に帰される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間のＳ−Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を配置することによって、ＩｇＧ１配列と整列されてもよい。Ｋａｂａｔシステムにより番号付けされるように、境界は僅かに異なり得るが、ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインと、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対するアミノ末端とに隣接し、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端寄りの）定常領域ドメイン、例えば、約ＥＵ位置１１８〜２１５を含む。Ｆｃドメインは、アミノ酸２３１〜アミノ酸４４７に延び；ＣＨ２ドメインは、Ａｌａ２３１〜Ｌｙｓ３４０又はＧｌｙ３４１に延び、ＣＨ３は、ほぼＧｌｙ３４１又はＧｌｎ３４２〜Ｌｙｓ４４７に延びる。ＣＨ１領域のＩｇＧ重鎖定常領域の残基は、Ｌｙｓで終結する。

【0023】

用語「プロテアーゼ耐性」は、ペプチド結合を含む分子が、タンパク質分解酵素の存在下で、該分子の１つ以上のペプチド結合の加水分解切断に耐える能力を指す。タンパク質分解酵素に対する耐性は、相対的な特性であり、特定の時間の間、切断耐性が試験されるｐＨ及び又は温度を含む特定の条件下で、その１つ以上のペプチド結合の加水分解切断に耐える能力が比較的低い分子と比較される。切断が起こったことを示すタンパク質分解切断の１つの結果は、無傷の非切断親分子の分子量と比較して小さい断片（小さい分子量）の生成である。

【0024】

用語「治療的有効量」は、抗体、抗体断片、又は誘導体であってもよい、Ｆｃドメインを含む本明細書に記載した治療薬が、対象における疾病又は疾患を処置する量を指す。

【0025】

概論
本発明は、インサイチューでのタンパク質分解に対する改善された耐性を有し、また、サイトカイン放出を引き起し、又は標的細胞を囲む標的抗原提示細胞を損傷若しくは殺傷する能力が維持された、治療用抗体、Ｆｃ融合体、及び類似のバイオ医薬品生物薬剤の製造に使用するためのＦｃドメインを同定することへの関心によって動機付けられている。

【0026】

プロテアーゼは、触媒部位の構造と、該プロテアーゼの活性に必須の（構成成分の１つとしての）アミノ酸とに従って５つの主要なグループ、セリンプロテイナーゼ、スレオニンプロテイナーゼ、システイン（チオール）プロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びメタロプロテアーゼに分割される。

【0027】

様々な細胞外プロテアーゼが、身体全体にて、及び重要な調節及び代謝プロセスを行う身体区画内で機能している。胃内に分泌される酸耐性プロテアーゼ（ペプシンなど）及び十二指腸内に存在するセリンプロテアーゼ（トリプシン及びキモトリプシン）は、胃腸管内で食物タンパク質を分解することが可能であり、血液又は血清中に存在するプロテアーゼ（トロンビン、プラスミン、ハーゲマン因子など）は、血液凝固及び血餅の溶解、並びに免疫系の細胞の調節に重要な役割を果たす。プロテアーゼは、白血球内に存在し又は白血球から放出される（エラスターゼ、カテプシンＧ）。プロテアーゼは、他のタンパク質の寿命を決定し、したがって重要な代謝的役割を果たす。ホルモン、インターロイキン又はケモカインとは異なり、細胞内シグナル伝達、又はタンパク質発現機構の変更を必要とせず、タンパク質分解制御を最速の調節切り替えメカニズム（regulatory switching mechanism）の１つとしている。更に、カスケード反応におけるようなプロテアーゼの協働作用は、生理学的シグナルに対する生物の応答の急速かつ効率的な増幅をもたらす。

【0028】

ヒトＩｇＧアイソタイプ（成熟γグロブリンクラスＧ抗体のサブクラス；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は、免疫機能を補充する差別的能力を有する。例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３により促進され、抗体依存性細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４により促進され、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）はＩｇＧ１及びＩｇＧ３により促進される。そのような免疫機能のアイソタイプ特異的な結合は、別個の免疫細胞上のＦｃ受容体に対する選択性と、Ｃ１ｑに結合することにより膜攻撃複合体（ＭＡＣ）のアセンブリを活性化する能力とに基づく。様々なアイソタイプの中でも、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｂ／ｃ、及びＦｃγＲＩＩＩａ／ｂを含むＦｃγ受容体に対する相対的な親和性は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３が高い。しかしながら、ＩｇＧ２のＦｃγ親和性は、ＦｃγＲＩＩａ Ｈ１３１多型を除いて相当低く、ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩに対して測定可能な親和性のみ有する。比較配列分析及び共結晶構造を使用して、受容体結合のための主要な接触残基が、下部ヒンジとＣＨ２領域に及ぶアミノ酸残基に対して位置付けられている（（Ｈｅｚｅｒｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：１２１６１〜１２１６８ ２００１；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１〜６６０４ ２００１）。

【0029】

ＩｇＧ２の下部ヒンジの残基内の置換（ＥＵ位置２３３〜２３５）が、ＦｃγＲ媒介機能及び補体活性化を無効にすることを、多数の以前の研究が結論付けている。１つの報告において、Ｇ２３６が削除された、ＩｇＧ１の下部ヒンジ内のＥ２３３Ｐ−Ｌ２３４Ｖ−Ｌ２３５Ａの置換は、Ｆｃ媒介エフェクター機能を損失したことが示されたヒトＩｇＧ１のＦｃコンストラクトのパネルの１つであった（Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３〜２６２４）。この情報は、ＩｇＧ１のヒンジ内又はヒンジ付近の残基を、対応するＩｇＧ２残基で置き換えることにより、ＦｃγＲに対する結合の親和性が相当損失し、また、補体固定及び細胞殺傷に影響を与える能力が損失することを示唆する。

【0030】

第２に、同じ残基位置のいくつかは、プロテアーゼがＩｇＧ１配列を切断する箇所であり（図１）、また、ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ２との整列により示されるように（図２）、よりタンパク質分解耐性が高いＩｇＧ２配列内の異なるアミノ酸が占める位置である。本発明者らは、この情報を、プロテアーゼ耐性であるが、エフェクター機能能力を有するＩｇＧ−Ｆｃを設計する出発点として使用した。

【0031】

本発明は、予想外にプロテアーゼ耐性と機能的（ＦｃｇＲ−結合）Ｆｃドメインとを提供する、ＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）の多数の位置における置換を初めて示すものである。当技術分野で認識されているように、特定のアミノ酸配列を有するＦｃドメインの特性が一旦既知となると、この情報は、現存する抗体設計又はＦｃ−ポリペプチド融合体の構成又は改変に適用され得る。本発明の組成物により付与されるプロテアーゼ耐性としては、例えば、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＨＮＥ、プラスミン、カテプシンＧ、ペプシン、ＩｄｅＳ、又は黄色ブドウ球菌からのグルタミルエンドペプチダーゼＩ（図１）などの、対応するＩｇＧ２残基に由来する代替のアミノ酸で置換されたＩｇＧ１ヒンジ領域の残基を切断するプロテアーゼが挙げられる（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００８前出）。

【0032】

多置換ＩｇＧ１突然変異は、ヒトＦｃＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃＲｎ）に対するそれらの相対親和性に基づき選択された（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）競合アッセイにより評価）。これらの突然変異体は更に、適切な細胞系内で、ＰＢＭＣによるＡＤＣＣを誘導する能力、及びインビトロで分化されたマクロファージによるＡＤＣＰを誘導する能力について試験された。本明細書に提供した実験データにおいて、特定の導入突然変異を有するＩｇＧ１（表２）は、Ｆｃ増強突然変異を有する、ＩｇＧ１から誘導され、設計されたロテアーゼ耐性ｍＡｂであった。

【0033】

野生型（ｗｔ）ヒトＩｇＧ１（配列番号１）を使用して、プロテアーゼ耐性を付与して作製された、ＥＵ番号付けシステムにおけるＩｇＧ１ヒンジ領域残基２１４〜２３７（配列番号３）に対する代替的な組成物は、表１に示すように、完全ＩｇＧ２配列（配列番号４）ヒンジ、又は残基２３３〜２３５のみが変更されたキメラヒンジ（配列番号５）のいずれかを含む。

【0034】

【表2】

【0035】

エフェクター機能増強領域内の補償突然変異は、下記の表２に示すような、前述した置換から選択されてもよい。

【0036】

【表3】

【0037】

１．Ｌａｚａｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：４００５〜４０１０（２００６）
２．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１〜２５７５（２００１）
３．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７（１８）：８８８２〜９０（２００７）
４．Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ２（２）：１８１〜１８９（２０１０）
５．Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１〜６６０４（２００１）により以前に引用されている、増大されたＦｃ機能を有するコンストラクト。

【0038】

インビトロでのアッセイに基づいた、Ｆｃ機能の様々な測定を用いて、完全ＩｇＧ構造（Ｈ２Ｌ２）に組み込まれた際に、下部ヒンジ残基（ＥＵ２３２〜２３７）に作用するプロテアーゼの１つ以上に対する耐性を提供する一方、ＦｃγＲに結合する能力を有し、又は細胞溶解を促進する、数個のプロテアーゼ耐性Ｆｃ配列が同定された。ヒンジ及びＣＨ２領域内の変化を含む選択されたコンストラクトのＦｃ関連活性における変化と、受容体親和性とインビトロでの生物活性とによる分類を、表３に示す。

【0039】

【表4】

【0040】

変更Ｆｃ含有分子を作製する方法
置換のための部位は、天然抗体Ｆｃの構造的特徴を有し、安定性を維持し、ＦｃＲ結合と補体カスケード、細胞溶解、細胞貪食作用又はサイトカイン放出の刺激能力とを保持する組成物を製造したいという要望に基づき、選択された。タンパク質、特に、変更又は変異されたアミノ酸を有する長いポリペプチド鎖の多量体は、所望のアミノ酸の対応する遺伝子コドンの変化のための、親配列をコードする発現ベクター内の核酸の改変により都合よく形成される。遺伝暗号及びそのような方法は、当技術分野にて周知である。ＩｇＧ１の部分及びＩｇＧ２の部分を含む本発明のＦｃのようなキメラ配列を形成する場合、それぞれをコードする核酸のより大きいセグメントが継ぎ合わされ、又は、セグメントが標準的なクローニング技術により置き換えられ得る。

【0041】

タンパク質分解試験
１つのＦｃ含有組成物又は抗体が他のＦｃ含有組成物よりも、又は野生型組成物よりもタンパク質分解に対して耐性であるか否かを決定するために、タンパク質分解酵素が、単離された異なるＦｃ含有組成物又は抗体を分解する速度又は程度を評価する。一定時間後、独特の切断部位構造の形成などの、鎖の切断を直接測定すること、又は新たに形成された断片を測定することのいずれかが可能な方法を用いて、異なる組成物に関する分解を測定する。代替的に、切断が活性の損失をもたらす場合、結合アッセイを含む機能的アッセイを行ってもよい。

【0042】

ＩｇＧ１のタンパク質分解切断は、二量体のヘテロ二量体構造の４つのポリペプチド鎖のいずれにも起こり得る。ＩｇＧの切断は、およそであるが特有の分子量を有する、よく特徴付けられているＦａｂ、（Ｆａｂ’）₂、及びＦｃ断片などの断片の生成をもたらす。タンパク質分解実験中に生成したそれらの断片の分離は、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ゲル電気泳動により、以前に記載されているように（国際公開第２００７０２４７４３Ａ２号、同第２００９０４５８９４Ａ１号）ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ）を使用した脱グリコシル化の後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー／脱離イオン化−飛行時間型質量分析）分析により、達成することができる。

【0043】

したがって、タンパク質分解切断に耐性を有するＦｃ含有組成物を参照することの意図は、野生型ヒトＩｇＧ１などの比較器分子と比較して、組成物が、タンパク質分解酵素に暴露された後、分解され、活性を失い、ＦｃＲなどのＦｃ結合パートナーに対する親和性を失う可能性が低下されることである。

【0044】

突然変異体の生物学的特徴付け
Ｆｃ含有タンパク質は、いくつかの周知のインビトロでのアッセイによって、機能性を比較され得る。具体的には、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩファミリーのメンバー対する親和性が対象となる。これらの測定値は、受容体の組換え可溶型又は受容体の細胞結合型を使用して作製され得る。加えて、ＩｇＧの長期の循環半減期に関与する受容体、ＦｃＲｎに対する親和性は、例えば、組換え可溶性ＦｃＲｎを使用する「ＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ」などの、リガンド結合型ビーズフォーマットを使用して、測定することができる。高処理量スクリーニングで使用される、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）は、結合など分子現象の検出を可能にする均質アッセイ技術である。コーティングされた「ドナー」及び「アクセプター」ビーズが、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ技術の基礎である。ビーズに基づくアッセイであるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）は、大いに増幅された信号を産生するように働く化学反応のカスケードをもたらす、近接近したビーズの相互作用を通して機能する。例えば、競合結合測定といった、直接又は非直接的測定は、タンパク質間の相対親和性及び結合活性を評価するために、適用され得る。

【0045】

それぞれが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ、例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３）などの、異なる能力範囲を有して免疫機能を補充する、ヒトＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）の自然進化が存在した。これらの機能のアイソタイプ特異的結合は、別個の免疫細胞上に存在するＦｃ受容体に対する差別的な選択性と、Ｃ１ｑに結合し、かつエフェクターマクロファージ上の特定受容体結合補体成分を通じて、ＣＤＣ及びＣＤＰ（補体依存性貪食作用）をもたらす膜攻撃複合体（ＭＡＣ）のアセンブリを活性化する能力と、に基づく。ヒトアイソタイプの、補体カスケードの初期成分、Ｃ１ｑに結合する能力の優先順位は、ＩｇＧ１＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ４であるが、感染においてはＩｇＧ２及びＩｇＧ４による補体活性化が十分に立証されている。

【0046】

ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイなどの細胞ベースの機能性アッセイは、特定のコンストラクト構造の可能な機能性の結果に関する見識を提供する。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は細胞媒介性反応であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異性の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）は、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす。一実施形態において、ＡＤＣＣアッセイは、主要エフェクター細胞としてＮＫ細胞を有し、これらの細胞によって発現されることが知られている唯一の活性化Ｆｃγ型受容体である、ＦｃγＲＩＩＩａ上の機能的作用を反映するように構成される。

【0047】

過酸化物又は炎症媒介放出などの細胞応答を測定できるため、貪食作用アッセイを使用して、異なる突然変異の免疫エフェクター機能を比較することもできる。インビボモデルも同様に、例えば、抗ＣＤ３抗体の突然変異体を使用して、マウスにおけるＴ細胞活性を測定する場合に使用することができ、活性は、Ｆｃγ受容体などの特定リガンドを結合するＦｃドメインに依存する。マクロファージの抗体指向性活性化は、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を媒介し、オプソニン化された標的細胞がマクロファージによって飲み込まれ消化されるようにする。高レベルのＦｃＲを発現するインビトロで分化されたマクロファージは、ＩＦＮγ又はＧＭ−ＣＳＦを使用して単核細胞に対する全ＦｃＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）の上昇したレベルを発現することによって、Ｍ１表現型へと分化され得る。

【0048】

抗体突然変異体の生成
本発明の組成物は、操作された宿主細胞によって最も都合よく生成される複合タンパク質である。本明細書に記載するように、組換えＦｃ含有タンパク質又はモノクローナル抗体の発現のために選択される宿主細胞は、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン内でタンパク質を修飾するオリゴ糖部分の組成物における変化を含むが、しかしそれに限定されず、最終的な組成物にとって重要な寄与因子である。したがって、本発明の一態様は、所望の治療的タンパク質を発現する生産細胞としての使用のための、又は該細胞の開発のための、本発明のＦｃ含有コンストラクトをコードするポリヌクレオチド配列を含む適切な宿主細胞の選択を含む。

【0049】

更に、宿主細胞は、哺乳類起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化細胞、若しくは形質転換細胞から選択されてもよい。

【0050】

代替的に、宿主細胞は、ポリペプチドのグリコシル化が不可能である種又は生物、例えば、原核細胞又は原核生物、及び天然又は工学的大腸菌ｓｐｐ、クレブシェラｓｐｐ、又はシュードモナスｓｐｐ、工学的植物又は昆虫細胞から選択されてもよい。

【0051】

ＩｇＧ重鎖（Ｎ２９７、ＥＵ番号付け）内の、天然に存在するグリコシル化部位のグリコシル化も、ＦｃγＲに対するＦｃ結合親和性に寄与する。定常領域はアイソタイプにより様々であるため、各アイソタイプは、Ｎ−結合炭水化物構造の区別されるアレイを所有し、このことはタンパク質アセンブリ、分泌、又は機能的活性に様々に影響する（Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６〜３２（１９９７））。結合されたＮ−結合炭水化物の構造は、加工の程度に応じて相当様々であり、高−マンノースの、多数回分岐した、及び二分岐の複合体オリゴ糖と、末端糖としてのシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、即ち、ＮＡＮＡ）、フコース、ガラクトース及びＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）残基とを含み得る。宿主細胞と、抗体のオリゴ糖含有量との、エフェクター機能に対する影響が認められている（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３〜８２２；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９〜７６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，前出；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１３（４）：５１９〜２５）。更に、抗体内の糖鎖に関して、抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖の還元末端の近位Ｎ−アセチルグルコサミンにおけるフコースの付加又は改変が、抗体のＡＤＣＣ活性を有意に変化させることが報告されている（国際公開第００／６１７３９号）。

【0052】

更に、二分岐オリゴ糖のガラクトシル化、分岐ＧｌｃＮａｃの存在、及びフコシル化の相対的な寄与は、非フコシル化Ｍａｂが、インビトロ及びインビボで測定して、Ｎ−結合二分岐オリゴ糖構造の他の改変と比較して、ＡＤＣＣを増強させるより高い能力を呈することを示す（Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜４０；Ｎｉｗａ，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２１２７〜２１３３）。

【0053】

低いフコース含有率を有するｍＡｂを生じさせることが可能な、又は低いフコース含有率を有するｍＡｂを生じさせるように操作された（特定の酵素の不活性化又は分解などによって、Ｓｈｉｎｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：３４６６〜３４７３；ＥＰ１１７６１９５Ａ１）、又は、例えば環境的若しくは栄養的操作により誘導された、宿主細胞を使用した本発明のプロテアーゼ耐性ｍＡｂの発現又は製造は、本発明の範囲内である。

【0054】

抗体、Ｆｃ及びＦｃ−融合タンパク質
抗体結合ドメイン又はその断片は、当技術分野にて既知の方法を用いて、本明細書に提供された情報と組み合わせて生じさせることができ、例えば、非限定的にヒト、マウス、ウサギ、ラット、齧歯類、霊長類、ヤギ、若しくはこれらの任意の組み合わせなどの任意の哺乳動物の配列を含んでもよく、又は該動物に由来することができる。そのような抗体は、本発明の抗体コンストラクトの生成に有用な基本構造と、結合ドメインの構成成分とを提供することができる。一態様において、「抗体結合ドメイン」は、マウス又は他の動物を、標的ペプチド、細胞、又は組織抽出物によって免疫化して調製されるハイブリドーマから、都合よく得られる。抗体は、例えば参照により完全に本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）を参照して、当技術分野にて周知の任意のハイブリドーマ技術を使用して、又は抗体産生リンパ球の分泌と、当技術分野にて既知の技術を使用した、結合ドメインをコードする核酸配列のクローニングとにより、得ることができる。

【0055】

本発明は、ヒトＩｇＧの定常領域に関する。したがって、インビトロでのアッセイで、最終組成物が、タンパク質分解耐性（本明細書に記載した）と、ＦｃｇＲに結合し、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣを促進する能力との両方を呈することが望ましい、ヒトＦｃドメインを含む任意の抗体又は融合タンパク質は、本発明に包含される。抗体Ｆｖ又は単一の可変ドメインを含むが、これに限定されない標的部分を、所望によりＦｃ組成物に融合してもよい。「Ｆｖ」は、堅固に非共有結合的会合した１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みにより、アミノ酸残基の抗原結合に寄与し、抗体に対する結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖のそれぞれから３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、多くの場合、完全な結合部位よりも低い親和性においてであるが、抗原を認識し、該抗原に結合する能力を有する。「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓｃＦｖポリペプチドは一般に、ＶＨとＶＬとの間のポリペプチドリンカーを含む。標的部分は、コンストラクトが完全に組換え方法により生成される場合、抗体のパラトープ（ＣＤＲ又は可変ドメイン構造に限定されない結合残基）；酵素；ホルモン；受容体；サイトカイン；免疫細胞表面抗原；及び接着分子からも選択され得る。標的部分は、炭水化物、脂質、リポ多糖体、有機分子、又は金属若しくは金属錯体など、非タンパク性でもあり得る。一般に、存在する場合、標的分子は、ポリペプチド又は非ポリペプチドであってもよいリンカーによってＦｃ−に接続されるであろう。

【0056】

本明細書に記載されるＦｃ含有タンパク質、又はＦｃ断片は、当技術分野にて周知のいくつかの方法で得ることができる。抗体結合ドメイン若しくはＦｃ融合タンパク質、又はその成分及びドメインは、そのようなドメイン又は成分のライブラリ、例えば、ファージライブラリから選択することにより得られてもよい。ファージライブラリは、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリ又は関心の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリを挿入することによって、例えば、免疫付与した動物又はヒトのＢ細胞から形成することができる。（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５〜１３１７）。抗体ファージライブラリは、１つのファージ内に重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）可変領域の対を含有し、単鎖Ｆｖ断片又はＦａｂ断片の発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ｅｔ ａｌ．２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１〜８）。ファージミドライブラリの多様性は、ライブラリのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大及び／又は変化させ、追加の望ましいヒトモノクローナル抗体を産生しその後同定するように、操作され得る。例えば、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の免疫グロブリン分子をコードする遺伝子は、組み立てられた免疫グロブリン分子における新規のＨＬ対を作成するように、無作為に混合（入れ替え）され得る。更に、Ｈ鎖及びＬ鎖の一方又は双方をコードする遺伝子は、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）において変異誘発され、かつその後に望ましい親和性及び中和能力について篩分けされ得る。抗体又はＦｃライブラリはまた、１つ以上のヒトフレームワーク配列を選択し、かつヒト抗体レパートリーから得られるか又は設計変更を通じて得られるＣＤＲカセットの収集を導入することによって、合成的に作成され得る（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８〜６０２）。多様性の位置はＣＤＲに限定されないが、可変領域のフレームワークセグメントを含むこともでき、又はペプチドなどの抗体可変領域以外を含んでもよい。一態様において、本出願人らの同時係属出願（米国出願第６１／２６１７６７号）に記載されているようなファージコートタンパク質ｐＩＸに結合された二量体Ｆｃ構造を提示可能なファージライブラリを使用して、本発明による新規なＦｃ含有構造を選択してもよい。

【0057】

抗体可変領域以外の標的結構成成分を含み得る、標的結合構成成分の他のライブラリとしては、リボソームディスプレイライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ及び細菌ディスプレイライブラリを挙げることができる。リボソームディスプレイは、タンパク質のＲＮＡとの付着を保ちつつ、ｍＲＮＡをそれらの同属タンパク質へと翻訳する方法である。核酸コード配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって回復される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合αアグルチニン酵母接着受容体の融合タンパク質の構築物ａｇａ１及びａｇａ２に基づき、接合型システムの一部である（Ｂｒｏｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３〜７）。細菌ディスプレイは、細胞膜又は細胞壁に関係している、標的と排出された細菌タンパク質との融合に基づく（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３）。

【0058】

本発明はまた、本発明の組成物をコードする核酸を、単離したポリヌクレオチドとして、又は、組成物若しくはその定方向突然変異の原核、真核、若しくは繊維状ファージ発現、分泌及び／若しくは表示に適合性のベクターを含む発現ベクターの一部分として提供する。

【0059】

Ｆｃ含有分子の使用
上述された方法のうちのいずれかによって生成される組成物（抗体、Ｆｃ融合体、Ｆｃ断片）は、ヒトの疾患、又は細胞、組織、器官、体液、若しくは概して宿主における特定の病理を、診断、治療、検出、又は調節するために使用され得る。本明細書に教示されるように、測定可能なＦｃγ受容体結合又は特定のエフェクター機能を保持すると共にタンパク質分解を低減し又は除去するための、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｃ断片のＦｃ部分の改変は、元の標的特異性及び生物学的活性を保持する抗体のパラトープ又はリガンド結合ドメインなどの結合ドメインと組み合わせることができる。例示的な結合ドメインは、抗体のパラトープ、１つ以上の抗体ＣＤＲ、又は１つ以上の抗体可変ドメイン；酵素；ホルモン；受容体；膜受容体の細胞外ドメイン；サイトカイン；免疫細胞表面抗原；及び接着分子である。得られたコンストラクトは、活性、生物物理学的特性、安定性、及び宿主の身体内で存続する能力の優位な範囲を有する抗体及びＦｃコンストラクトを提供する。

【0060】

本発明者らによる、生理学的関連プロテアーゼに対する耐性と、１つ以上のＦｃγ受容体に結合する能力若しくは能力の欠如、及び／又はエフェクター細胞若しくは補体の活性化による細胞溶解に影響を与える能力との組み合わせを有するＦｃ配列の発見は、特定の適応症での最大の有効性に結合分子を目標付ける能力を提供する。例えば、新生組織形成、又は例えば不適切な血管新生、不適切な線維症などの他の望ましくない増殖に関与する異常な宿主細胞を標的とする能力は、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰが可能な本発明の真核生物プロテアーゼ耐性Ｆｃを含む分子が最も適しているであろう。対照的に、細菌細胞は、補体媒介メカニズムにより容易に破壊される。したがって、細菌感染は、細菌プロテアーゼに耐性であり、ＣＤＣを引き起こす能力を有する本発明の好適なＦｃコンストラクトにより処置することができる。

【0061】

本発明者らは、適切な特性の組み合わせを有するＦｃの選択方法を同定し、目的特異的な改変Ｆｃ含有分子の実用的な例を提供している。真核生物プロテアーゼ耐性であり、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣのうちの１つ以上が可能な分子は、約ＥＵ残基２１４〜約残基３３０の、ヒンジ及びＣＨ２領域内のヒトＩｇＧ１の配列を有するＦｃドメインを含み、少なくとも残基２３３〜２３７は、ＰＶＡ／（Ｇ２３６削除）で置換され、更にＣＨ２ドメイン内の１つ以上の置換を含み、それによりＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣのうちの１つ以上が可能な分子は、コンストラクト５、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６及び１７を含む。特定の実施形態において、そのような分子は、Ｉ３３２Ｅと、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５、１４）、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｉ３３２Ｅ（作製せず）、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（８）、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）、Ｇ２３７Ｘ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ここで、ＸはＡ又はＳ（１２）である）；、Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ（１５）、及びＳ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ（１７）などの他の置換と、の組み合わせから選択される置換を含む。

【0062】

原核生物プロテアーゼに対して耐性であり、ＣＤＣが可能な分子は、約ＥＵ残基２１４〜約残基３３０の、ヒンジ及びＣＨ２領域内のヒトＩｇＧ１の配列を有するＦｃドメインを含み、少なくとも残基２３３〜２３７は、ＰＶＡ／（Ｇ２３６削除）で置換され、更に、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）、Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ（１５）、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１６）及びＳ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ（１７）から選択される、ＣＨ２ドメイン内の１つ以上の置換を含む。

【0063】

真核生物プロテアーゼ耐性であるが標的細胞溶解を促進しない分子もまた、例えば、プロテアーゼ耐性であるが、野生型ＩｇＧ１と比較して低下されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣを有する、本明細書に教示した抗体又は他のＦｃコンストラクトを使用することによって、標的細胞改変を目的とするが標的細胞破壊を目的としない疾病又は疾患の処置に有利に使用することができる。プロテアーゼ耐性を有する非天然、非野生型Ｆｃドメインを含む分子としては、ＥＵ残基２１４〜約残基３３０の、ヒンジ及びＣＨ２領域内のヒトＩｇＧ１の配列を有するＦｃドメインを含む分子が挙げられ、少なくとも残基２３３〜２３７は、ＰＶＡ／（Ｇ２３６削除）で置換されている。

【0064】

したがって、本明細書の教示及び実施例に基づいて、目下可能にされた、哺乳動物対処内に存在するプロテアーゼに対して向上された耐性を示し、かつ場合により細胞上の抗原を標的とする能力を有する、Ｆｃを含むコンストラクトは、プロテアーゼ耐性ではない治療的分子と比較して改善された治療的分子を提供する。

【0065】

投与
タンパク質分解酵素、例えば消化管内のペプシン、又は組織リモデリング若しくは悪性増殖の領域内のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、それらの形成及び蓄積速度に従って局在化しているため、本発明の組成物は、身体区画がプロテアーゼを含む、又はプロテアーゼ含有量が異常に高いことが既知の場合の使用に特に好適である。

【0066】

本発明は、抗体などのプロテアーゼ耐性ＩｇＧ組成物の安定な製剤を提供し、前記製剤は、好ましくは、水性リン酸緩衝生理食塩水又は混合塩溶液、並びに保存溶液及び製剤、並びに医薬的用途又は家畜への使用に適した多目的の保存製剤であり、薬剤的に許容できる製剤中に少なくとも１つのプロテアーゼ耐性抗体を含む。好適なビヒクル及びその製剤（ヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^st Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。

【0067】

本明細書に記載され又は当技術分野にて既知のような安定な製剤又は保存製剤中の、エフェクター機能を有するプロテアーゼ耐性ＩｇＧ組成物は、本発明に従って、当技術分野にて周知なように、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ；又は当技術分野にて既知の他の手段中の製剤を使用して、静脈内（Ｉ．Ｖ．）；筋肉内（Ｉ．Ｍ．）；皮下（Ｓ．Ｃ．）；経皮；経肺；経粘膜；を含む多様な送達方法を介して、患者に投与することができる。

【0068】

例えば身体区画又は腔への部位特異的投与の場合、投与は、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、経膣、経直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段によるものであり得る。

【0069】

本発明により提供される組成物を使用した処置を受け入れ得る疾病又は疾患には、組成物がＦｃγＲ−駆動メカニズムを介した宿主免疫系の細胞傷害又は細胞溶解のメカニズムの活性化を提供するため、悪性腫瘍などの、細胞の望ましくない増殖、活性化若しくは遊走が有害である疾病、過活性の若しくは不均衡な免疫応答、線維性組織形成、又は感染症が挙げられるが、これらに限定されない。そのような疾病には、悪性腫瘍：白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、骨髄異形成症候群（myelodyplastic syndrome）（ＭＤＳ）、リンパ増殖性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、キャッスルマン病、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、腺管癌、脂肪腫、上咽頭癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、網膜芽細胞腫、悪性組織球症、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、形質細胞腫、軟骨肉腫、肉腫、メルケル細胞癌、肝細胞癌、肝細胞腫、基底細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、肉腫（ユーイング肉腫、カポジ肉腫、小児軟部組織肉腫、成人肉腫など）、黒色腫、転移性黒色腫、血管腫、転移性疾病、骨肉腫、横紋筋肉腫、胸腺腫及び胸腺癌、癌関連の骨吸収、子宮内膜癌、腟癌、子宮癌、ウィルムス腫瘍、癌関連の骨痛などが挙げられる。

【0070】

悪性リンパ球上の抗原に結合可能な標的分子には、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ２２などのＢ細胞抗原が挙げられる。上皮組織に由来する固形腫瘍は、多くの場合、シグナル伝達が可能であり、又は腫瘍の野放しの成長に繋がる増殖応答若しくは抗アポトーシス応答の原因となり得るＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３として既知の上皮増殖因子受容体、及び他の受容体に対するリガンド結合を呈し、該結合により刺激される。固形腫瘍上の他の通常の抗原は、組織因子又はＲＯＮである。

【0071】

組成物は、適切な標的結合ドメインと組み合わされた際、細菌（連鎖球菌、ブドウ球菌、及び大腸菌など）、ウィルス（インフルエンザ、ＡＩＤＳ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ、及びウエストナイルウイルスなど）、真菌（アスペルギルス症、コクシジオイデス症（coccidiodomycosis）、クリプトコッカス症、又はカンジダ症など）を原因とする感染症、又は原生動物感染（トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、ジアルジア属、又はマラリアなど）の処置にも有用である。

【0072】

組成物は、一般的な免疫疾患、並びにリウマチ性疾患、乾癬及び強皮症を含むが、これらに限定されない自己免疫疾患の処置に有用である。

【0073】

組成物は、不適切な血管新生に関連した疾患の処置に有用である。血管新生は、新しい毛細血管の生成のプロセスであり、内皮細胞増殖の活性化によりもたらされる。新血管新生は、厳重に調節され、胚発生、組織リモデリング、創傷治癒、及び、黄体発生の周期的サイクル中にのみ生じる（Ｆｏｌｋｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｔｒａｎ，Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．’１６，２０７〜２４８（１９７６））。内皮細胞は、通常、身体内の他のタイプの細胞よりも遙かにゆっくりと増殖する。しかしながら、これらの細胞の増殖速度の調節が行われなくなった場合、病的血管新生がもたらされ得る。病的血管新生は、多数の疾病に関与する。例えば、血管腫、血管線維腫、血管変形、アテローム性動脈硬化症、癒着及び浮腫硬化症などの心臓血管疾病；並びに角膜移植後の新血管新生、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、血管由来の角膜疾患、黄斑変性症、翼状片、網膜変性症、後水晶体線維増殖症、及び顆粒性結膜炎などの眼科学的疾病は、血管新生に関連している。関節炎などの慢性炎症性疾病；乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、静脈性潰瘍、ざ瘡、酒さ（酒さ性ざ瘡又はエリテマトーデス（erythematosa））、疣贅（いぼ）、湿疹、血管腫、リンパ脈管新生などの皮膚科学的疾病も、血管新生依存性である。

【0074】

糖尿病性網膜症は、非−増殖性又は増殖性の２つの形態のうちの１つをとり得る。増殖網膜症は、硝子体表面上で成長し、又は硝子体腔内に延びる、異常な新しい血管形成（新血管新生）により特徴付けられる。黄斑変性症は、同様に乾燥及び湿潤の２つの形態をとる。遙かに一般的でない滲出性黄斑変性症（湿潤形態）では、多くの場合、網膜内出血、網膜下液、色素上皮剥離、及び色素増加症を伴う、脈絡膜新生血管の網膜下ネットワークの形成が存在する。血管新生緑内障は、糖尿病、又は網膜中心静脈閉塞症、又は虹彩を隅角内へ引き上げるぶどう膜炎に関連した炎症性沈殿物（inflammatory precipitate）を有する患者に生じる（Ｃｈ．９９．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ １７ｔｈ Ｅｄ．１９９９）。

【0075】

炎症性疾病である関節リウマチも、不適切な血管新生をもたらす。滑液腔内の血管内皮細胞の増殖は、炎症性サイトカインにより活性化され、軟骨破壊と、関節内でのパンヌスとの交替をもたらす（Ｋｏｃｈ ＡＫ，Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ ＰＪ ａｎｄ Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ ＳＪ，Ａｒｔｈ；１５ Ｒｈｅｎｉｕｍ，２９，４７１〜４７９（１９８６）；Ｓｔｕｐａｃｋ ＤＧ，Ｓｔｏｒｇａｒｄ ＣＭ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ ＤＡ，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３２，５７８〜５８１（１９９９）；Ｋｏｃｈ ＡＫ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，４１，９５１ ９６２（１９９８））。

【0076】

組成物は、皮膚細胞の制御されない増殖を原因とする乾癬の処置に有用である。急速に増殖する細胞は、十分な血液供給が必要であり、乾癬内に異常な血管新生が誘導される（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５９，４０〜４８（１９７２））。

【0077】

多数の因子が、血管新生に繋がるプロセス及び事象に関与している。細胞接着分子、インテグリン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＴＮＦα、ｂＦＧＦ、並びにＩＬ−６及びＩＬ−１２を含むサイトカイン。例えば、密接に関連するが、区別されるインテグリンαＶβ３及びａＶｂ５は、血管新生プロセスにおいて独立した経路を媒介することが示されている。αＶβ３に対して生成された抗体は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）誘導による血管新生を遮断した一方、ａＶｂ５に特異的な抗体は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導による血管新生を阻害した（Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２２７〜１２３０（１９９９）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１５００〜１５０２（１９９５））。したがって、本発明は、血管新生の阻害が指示される疾病の処置に使用するための、これらの標的に指向された標的結合ドメインの、本発明の組成物中での使用を包含する。

【0078】

参照により本出願に組み込まれる、公開された同時係属の国際特許出願第２００９０２３４５７Ａ１号の出願人は、抗−ヒンジ切断部位エピトープ特異的モノクローナル抗体を使用して、切断されたＩｇＧｓにエフェクター機能を回復する戦略を開示している。本発明によるプロテアーゼ耐性かつエフェクター機能能力を有するＦｃを抗−ヒンジドメインと共に組み込んで二価抗体を生じさせることは、切断ＩｇＧｓにＦｃエフェクター機能を回復することと、タンパク質分解切断によるサイレンシング対する治療的耐性を付与することの両方が可能な治療的ｍＡｂを生じさせるであろう。したがって、本発明は、本発明のプロテアーゼ耐性Ｆｃ定常領域を、記載したような抗−ヒンジ可変領域ｍＡｂと共に組み込むことを包含する。

【0079】

本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。

【実施例】

【0080】

実施例１：Ｆｃ突然変異体の構成及び試験
標準的な組換え技術を使用して、（図２に示し、表１のヒンジ領域を表２から選択されたＣＨ２領域内の活性回復突然変異と組み合わせた）一連のコンストラクトを生成した。表記２ｈｃは、ＥＵ抗体のＫａｂａｔ番号付け（ＥＵ番号付け）２１４〜２３６（配列番号３）に対応するＩｇＧ１定常ドメインが、対応するＩｇＧ２配列（配列番号４）で置き換えられていることを示す。表記２ｈは、ＩｇＧ１ Ｅ２３３−Ｌ２３４−Ｌ２３５−Ｇ２３６の残基が、対応するＩｇＧ２ Ｐ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５の残基で置き換えられている（Ｇ２３５は削除された）ことを示す。

【0081】

【表5】

【0082】

１セットの抗体コンストラクトの可変領域は、ＣＤ１４２（組織因子）に結合し、これは組織因子を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２６（商標））を使用した細胞アッセイにおいて、抗体のＦｃ依存性細胞殺傷の試験を可能にする（Ｂｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１７８６４〜１７８６９ ２００９）。ＣＤ２０に結合する可変領域を有する追加のパネルを生成し、これはＣＤ２０を示すＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−８８８５）を使用したＣＤＣ活性の試験を可能にした（Ｂｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１７８６４〜１７８６９ ２００９）。抗体の全部は、標準的なクローニング方法及び手順を使用して、２９３Ｔ細胞内で過渡的に発現された。実験的分析の前に、タンパク質Ａカラムを使用して、ＭＡｂを９５％を超える純度に精製した。

【0083】

野生型及びｍＡｂコンストラクトのプロテアーゼ消化
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にてｐＨ ７．５で、又はＭＭＰｓ（ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２及びＭＭＰ−１３は全て、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得た）の場合、トリス緩衝生理食塩水緩衝液中にて３７℃で、精製されたＩｇＧｓのプロテアーゼ消化を行った。ＩｄｅＳはＧｅｎｏｖｉｓから得、ＧｌｕＶ８はＰｉｅｒｃｅから得た。試験した全ＭＭＰにおいて、ＭＭＰ反応に５ｍＭのＣａＣｌ₂を含めた。抗体濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり、反応は、特に明記しない限り、ＩｇＧに対しておよそ１〜２％（ｗ／ｗ）の割合で酵素を添加することにより開始した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏｓｉｚｉｎｇマイクロキャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）後の電気泳動図の分析により、ＩｇＧ切断を評価した。全消化は、２回行った。

【0084】

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）競合結合アッセイ
半容積（half-well volume）９６ウェル不透明プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ ＢＳＡ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中にてｐＨ ７．４で競合結合試験を行った。全ての競合試験は、固定濃度のビオチン化ＩｇＧ１（１ ＩｇＧ：２ビオチン、ＥＺ Ｌｉｎｋ（商標）ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅを使用）に対して、連続３倍希釈にて、野生型とプロテアーゼ耐性コンストラクトとを競合させて行った。ＦｃγＲ濃度は、アッセイの最終濃度において０．２μｇ／ｍｌであった。ビオチン化ＩｇＧ１（０．２μｇ／ｍｌ最終）と、野生型及びプロテアーゼ耐性抗体（１０μｌ）とを、９６ウェルプレートの各列に順次加え、これを２重で行った。その後、指定ＦｃγＲを加え、次に１／５０希釈ニッケルキレート（Ｎｉ）−アクセプタービーズ及びストレプトアビジン（ＳＡ）−ドナービーズをそれぞれ１０μｌ、順次加えた。オービタルシェーカー上で３０分間振盪する間、不透明プレートをアルミニウムシールで覆って、遮光（light-safe）条件を維持した。その後、シールを除去し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）励起／発光スペクトルの適切なフィルターセットを備えたＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で蛍光を読み取った。未加工データをＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェアに転送し、最大シグナルに関して正規化し、非線形回帰曲線適合ソフトウェアを使用して、競合曲線をプロットした。

【0085】

結果
当初の興味は、ＩｇＧ１を下部ヒンジ領域内で切断することが以前に示された多数の生理学的関連プロテアーゼ；ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＧｌｕＶ８及びＩｄｅＳに対するｍＡｂコンストラクトの感受性を決定することであったコンストラクト１〜５、７、９〜１１、１２（Ｇ２３７Ａ）、１３、１４をＣＤ１４２結合抗体として試験した。プロテアーゼは、ＩｇＧ１を２４時間にわたって様々な程度で切断した。ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１２、ＩｄｅＳは全ての無傷ＩｇＧ１（コンストラクト１）を２４時間以内に除去した一方、ＭＭＰ−７は約３０％、ＭＭＰ−１３は、約４０％、ＧｌｕＶ８は約６０％を切断した。コンストラクト４（２ｈ）と、２ｈ下部ヒンジ改変を有するコンストラクトとは、おおよそ同一の程度で、全部のＭＭＰに対して耐性であった。コンストラクト４は、ＧｌｕＶ８に対して耐性であったが、ＩｄｅＳに対して耐性ではなかった。コンストラクト２も、ＧｌｕＶ８消化に対してより耐性であった。

【0086】

ＩｄｅＳは、全部のヒトＩｇＧアイソタイプを切断することが示されている（ｖｏｎ Ｐａｗｅｌ−Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２１：１６０７〜１６１５ ２００２）。経時的試験のデータ（図３Ａ）は、ＩｄｅＳが（インキュベーションの５分以内に）ＩｇＧ１（１）及びＩｇＧ２（２）をＦ（ａｂ’）₂断片に急速に変換した一方、ＩｇＧ１サンプル２ｈ（４）は、１２０分間の間、単一−切断中間体を有したことを示す。試験したコンストラクトのうち、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）はＩｄｅＳに対して最もタンパク質分解耐性が高いコンストラクトであり（図３Ｂ）、２４時間のインキュベーション後でさえも、無傷ＩｇＧが検出された（他の抗体コンストラクトは、５分までに、検出可能な無傷ＩｇＧを有さなかった）。Ｇ２３６とＧ２３７との間のＩｄｅＳ切断地点付近の、（５）におけるＳ２３９Ｄの突然変異は、ＩｇＧ１ ２ｈ（４）と比較した場合の追加のプロテアーゼ耐性に寄与し得る。

【0087】

１２個の抗ＣＤ１４２抗体コンストラクトのパネル（１〜５、７、９〜１３、及び１４）を、それらの野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ２対応物と共に、ＩｄｅＳ、ＧｌｕＶ８、ＭＭＰ−３、及びＭＭＰ−１２によるタンパク質分解の受けやすさに関して試験した。２４時間のインキュベーション後に残留した無傷ＩｇＧに関するデータを電気泳動図から計算し、図４Ａ〜Ｄに示した。

【0088】

データは、ＩｇＧ１ ｗｔ（１）、ＩｇＧ２ ｗｔ（２）、２ｈｃ（３）、ＩｇＧ１ ２ｈ（４）、２ｈｃ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１３）、ＩｇＧ２ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１４）、及び２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）が、２４時間のインキュベーション後、ＩｄｅＳによるタンパク質分解を受けやすいことを示した。対照的に、コンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）、２ｈ Ｇ２３７Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１２）、２ｈ Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ（７）、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）、及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）は、ＩｄｅＳによるタンパク質分解に対して耐性であった。驚くべきことに、より多くのＩｇＧ２ヒンジ領域置換を有するコンストラクト（配列番号４を含む）は、ＩｄｅＳタンパク質分解に対して耐性ではなかった。コンストラクトＩｇＧ２ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅは、ＩｄｅＳを用いた２４時間の消化後、４０％未満の残留無傷ＩｇＧを有した。

【0089】

黄色ブドウ球菌由来のＧｌｕＶ８プロテアーゼを用いた消化は、コンストラクトＩｇＧ２ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１４）、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）、２ｈ Ｇ２３７Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１２）、及び２ｈ Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ（７）が、２４時間の消化後、４０〜６０％の範囲の残留無傷ＩｇＧを有したことを示した。これはＩｇＧ１ ｗｔ（１）に関して見られたものと同様の切断レベルであった。コンストラクトＩｇＧ２ ｗｔ（２）、２ｈｃ（３）、２ｈｃ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１４）、ＩｇＧ１ ２ｈ（４）、ＩｇＧ１ ２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）、及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）は、ＧｌｕＶ８によるタンパク質分解に対して、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して増大された耐性を示した（全て、７５％を超える残留無傷ＩｇＧを有した）。

【0090】

ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２は、癌関連プロテアーゼの２つのタイプを表す。ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２の両方を用いた消化後、５％未満の無傷ＩｇＧ１ ｗｔが検出された。対照的に、ヒトＩｇＧ２ ｗｔと、試験した全部のコンストラクトは、２４時間の消化後、６０％を超える残留無傷ＩｇＧにより示されるように、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２の両方に対する増大されたプロテアーゼ耐性を示した。

【0091】

Ｆｃγ受容体結合の結果
Ｆｃコンストラクトのいくつかが、受容体のＦｃγファミリーに対する結合に関してｗｔ ＩｇＧ１と競合する能力を評価した。コンストラクトがビオチン化ＩｇＧ１により生成される最大シグナルを低下させる能力を、図５Ａ〜Ｇに示す。初期スクリーンには、コンストラクト１〜２、４〜６が含まれた。試験したコンストラクトの初期グループでは、ＩｇＧ２（２）、ＩｇＧ１ ２ｈ（４）、及び２ｈ Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（６）は、高親和性ＦｃγＲＩに対して検出可能な結合を示さなかった一方、野生型ＩｇＧ１は強い結合を示した。２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）は、検出可能であるが、ＩｇＧ１と比較して低下されたＦｃγＲＩに対する結合を示した。ＩｇＧ１ ２ｈ（４）及び２ｈ Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（６）は、ＦｃγＲＩＩａに対する検出可能な結合を示さなかった一方、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）コンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔと同等の結合を示した（図５Ｂ）。３つのコンストラクト：ＩｇＧ２（２）、ＩｇＧ１ ２ｈ（４）、及び２ｈ Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（６）は、ＦｃγＲＩＩｂに対する検出可能な結合を示さなかった一方、ＩｇＧ１（１）及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）は、同等の結合を示した（図５Ｄ）。ＩｇＧ２（２）、ＩｇＧ１ ２ｈ（４）、及び２ｈ Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（６）は、同等であるが、ＩｇＧ１と比較して低下されたＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を示した。２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）コンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔさえも超える、ＦｃγＲＩＩＩａに対する最高レベルの結合を示した（図５Ｆ）。

【0092】

加えて、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）コンストラクトは、ＩｇＧ１に対する同等の結合を示したが、２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）コンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して増大されたＦｃγＲＩＩａに対する結合を有した（図５Ｃ）。コンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）の両方は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して増大されたＦｃγＲＩＩｂに対する結合を示した（図５Ｅ）。コンストラクト２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）は、ＦｃγＲＩＩａ（図５Ｃ）及びＦｃγＲＩＩｂ（図５Ｅ）の両方に対する最小の検出可能な結合を示した。

【0093】

コンストラクト２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して僅かに低下されたＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を示したが、コンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する増大された結合を有した（図５Ｇ）。２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して弱いＦｃγＲＩＩＩａに対する結合を示した（図５Ｇ）。

【0094】

概要
これらの結果は、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）、及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）を含むタンパク質分解耐性コンストラクトが、ＦｃγＲＩＩａ、ＩＩｂ、及びＩＩＩａに対して様々な程度で結合することが可能であり、３つのコンストラクトの全部が、２ｈ（４）突然変異単独と比較して増大された結合を有することを示した。コンストラクト２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）のように、ＦｃγＲＩＩａ結合親和性をＩｇＧ１ ｗｔを超えて向上させた他のＣＨ２突然変異と組み合わせた、ＩｇＧ１の下部ヒンジ内の残基の突然変異、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）のＦｃγＲＩＩｂに対する向上された親和性、コンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）のように、ＩｇＧ１ ｗｔを超えて向上されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性は、予想外の結果であった。

【0095】

実施例２．抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）
インビトロでのＦｃ依存性細胞殺傷を媒介するプロテアーゼ耐性ｍＡｂの能力を試験するために、ＡＤＣＰアッセイを行った。このアッセイでは、食細胞が抗体結合により標的抗原提示細胞に動員され、標的細胞破壊が測定される。

【0096】

手順
正常なヒトドナーからＰＢＭＣｓがＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用して単離された。ＣＤ１６ｐｏｓ単球を枯渇させないＣＤ１４単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したネガティブ枯渇（negative depletion）により、ＰＢＭＣｓからＣＤ１４ｐｏｓ単球を精製した。単球を、１０％ ＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ−１０培地（Ｌｏｎｚａ）中に０．１×１０⁶細胞／ｃｍ²で７日間播種した。１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、分化の最終２４時間中、加えた。ＡＤＣＰアッセイに関する標的細胞は、ＧＦＰ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞であった。単離されたマクロファージをＧＦＰ−発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と共に４：１の比で、野生型及びプロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトを有して又は有さずに、９６ウェルＵ底プレート内で４時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、細胞を９６ウェルプレートから除去した。マクロファージを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合された抗−ＣＤ１１ｂ及び抗−ＣＤ１４抗体（両方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより）を用いて同定した後、細胞をＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で獲得した。ＦｌｏＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを分析した。パーセント貪食作用を次の等式により決定した（（ＧＦＰｐｏｓ、ＣＤ１１ｂｐｏｓ、ＣＤ１４ｐｏｓ細胞）／（ＧＦＰｐｏｓ、ＣＤ１１ｂｐｏｓ、ＣＤ１４ｐｏｓ細胞＋ＧＦＰｐｏｓ単独細胞）×１００％。

【0097】

単離された単球は、上述したようにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮγを使用してインビトロで分化された。他者によって示されたように、分化されたマクロファージは、ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａ）の全部を発現した（データは示さず）。

【0098】

結果
図６Ａに表されたデータは、ＩｇＧ１ ｗｔ（１）及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）が最高レベルのＡＤＣＰを達成したことを示す。ＩｇＧ２ ｗｔ（２）、ＩｇＧ１ ２ｈ（４）、及び２ｈ Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（６）のＡＤＣＰ能力は、低いが検出可能なＡＤＣＰ能力を生成した。これらの結果は、プロテアーゼ耐性コンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）がＩｇＧ１ ｗｔと同等のレベルで腫瘍細胞を貪食することが可能であったことを示す。別個の実験では、ＩｇＧ１ ２ｈヒンジ領域を含むＣＨ２コンストラクトの追加のパネルを、ＡＤＣＰ能力に関して試験した（図６Ｂ）。このグループでは、コンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）、２ｈ Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ（７）、及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）はＩｇＧ１ ｗｔ（１）と類似したＡＤＣＰを有したが、コンストラクト２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）、２ｈ Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（８）、及び２ｈ Ｇ２３７Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１２）は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して僅かに低下された最大貪食作用を有した。コンストラクト２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）は、ＩｇＧ２ ｗｔ（２）及びＩｇＧ１ ２ｈ（４）と類似した、低いが検出可能なＡＤＣＰを有した。最後に、ＩｇＧ２の完全ヒンジを含むコンストラクトを、ＡＤＣＰに関して試験した。コンストラクトＩｇＧ２ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１４）はＩｇＧ１ ｗｔと類似したＡＤＣＰを示したが、コンストラクト２ｈｃ（３）及び２ｈｃ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１３）は、低いが検出可能なＡＤＣＰを示した。

【0099】

実施例３．抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
このアッセイでは、単核細胞が標的抗原提示細胞に動員され、標的細胞破壊が測定される。

【0100】

手順
ＡＤＣＣアッセイを、以前記載されたように行った（Ｓｃａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４：１５２４〜１５３４ ２００７）。簡潔には、ヒト血液からＰＢＭＣｓをＦｉｃｏｌｌ勾配により精製し、ＡＤＣＣアッセイ用のエフェクター細胞として使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）を標的細胞として、１標的細胞対５０エフェクター細胞の割合で使用した。標的細胞をＢＡＴＤＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により３７℃で２０分間前標識し、２回洗浄し、ＤＭＥＭ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）中に再懸濁した。標的（１×１０⁴細胞）及びエフェクター細胞（０．５×１０⁶細胞）を一緒にし、１００μｌの細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに加えた。野生型及びプロテアーゼ耐性ｍＡｂコンストラクトを有する又は有さない追加の１００μｌを加えた。全てのサンプルは、２組で実行された。プレートは、２００ｇで３分間遠心分離され、３７℃で２時間培養され、次に、２００ｇで３分間再び遠心分離された。１ウェル当たり合計２０μＬの上清が除去され、細胞溶解が、２００μＬのＤＥＬＰＨＩＡ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ系試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の添加によって測定された。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０１ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、蛍光性が測定された。データは、６７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて最大の細胞傷害に対して正規化され、また任意の抗体の不在下で、標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照が決定された。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５を使用して、Ｓ字状用量−応答モデルにフィッティングされた。

【0101】

結果
細胞溶解のレベルを抗体濃度の関数としてＹ軸に表すように、データをプロットした。図７Ａに示すデータは、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）コンストラクトが、説明したアッセイにおいて、ＩｇＧ１ ｗｔのおよそ８倍（見かけ上のＥＣ５０におけるシフトから明かなように）の改善である最高レベルのＡＤＣＣ能力を有したことを示す。

【0102】

別の実験では、コンストラクトの延長パネルのＡＤＣＣ能力を比較した。図７Ｂは、データにより生成された曲線を表す。３つのコンストラクト（２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）、２ｈ Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ（７）、及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して増大されたＡＤＣＣ能力を有した。２ｈ Ｇ２３７Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１２）及び２ｈ Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（８）コンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔを超える僅かに増大されたＡＤＣＣを有した一方、コンストラクト２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）は、検出可能であるが、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して低下されたＡＤＣＣを有した。図７Ｃは、ＩｇＧ２の完全ヒンジ領域を含んでいたコンストラクトのパネルのＡＤＣＣ結果を示す。ＩｇＧ２ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１４）コンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔよりも低いＥＣ５０を有したが、より低い最大溶解も有した。コンストラクト２ｈｃ（３）及び２ｈｃ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１３）は、ＩｇＧ２ ｗｔを上回るが、ＩｇＧ１ ｗｔよりも低い検出可能なＡＤＣＣを有した。総合すれば、これらの結果は、下部ヒンジ内の重要な残基の突然変異が、多数のＣＨ２突然変異によって、ＡＤＣＣ及びＦｃγＲ−結合を回復するよう補償され得ることを示す。しかしながら、試験された、ＩｇＧ１ ２ｈ（３）骨格鎖に形成されたＣＨ２突然変異の全部が、ＩｇＧ１ ｗｔに対して、ＡＤＣＣを回復／増強することは可能ではなかった。

【0103】

これらの結果は、ＦｃγＲＩＩＩａ−発現ＮＫ細胞がＡＤＣＣにおいて関連エフェクター細胞であると考えられるため、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）の向上された親和性を示したＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイ（図５Ｆ〜Ｇ）と一致した。

【0104】

実施例４補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
このアッセイでは、補体成分が標的抗原提示細胞に動員され、標的細胞破壊が測定される。

【0105】

手順
ＣＤＣアッセイを、以前記載されたように行った（Ｂｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（５）：３１８３〜３１９２ ２００８）。ＷＩＬ２−Ｓ細胞をＣＤＣアッセイの標的細胞として使用した。５０μｌの細胞を９６ウェルプレートのウェルに、ウェル当たり最終濃度８×１０⁴細胞にて、ＲＰＭＩ、５％加熱不活性化ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）中に加えた。抗体を有して又は有さずに、追加の５０μｌをウェルに追加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。５０μｌの１０％のウサギ補体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェルに加え、プレートを３７℃で２０分間インキュベートした。全てのサンプルは２組で実行された。プレートを２００ｇで３分間遠心分離し、５０μｌの上清を別個のプレートに除去し、ＣＤＣをＬＤＨ細胞傷害検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で測定した。吸収度を、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。データは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）並びに細胞及び補体のみを含む最小対照で最高細胞傷害に対して正規化された。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５を使用して、Ｓ字状用量−応答モデルにフィッティングされた。

【0106】

結果
図８に示すデータは、コンストラクト２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）及び２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）の両方が、ＩｇＧ１ ｗｔと同様の細胞溶解レベルを達成したことを示す。コンストラクトＩｇＧ１ ２ｈ（４）、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）、２ｈ Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ（７）、及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（９）は、ＩｇＧ２ ｗｔ（２）に関して測定したものと同様の最小のＣＤＣ能力を有した。

【0107】

実施例５：追加のプロテアーゼ耐性コンストラクト
Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａと組み合わせた２つのみのＣＨ２突然変異（Ｇ２３６が削除された）、即ち２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｋ３３４Ａ（１１）及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）は、ＩｇＧ１ ｗｔと同等のＣＤＣ活性が可能であった。しかしながら、２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｋ３３４Ａ（１１）は最小のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を有し、２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（１０）は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して低下されたＡＤＣＣ活性を有した。３つの活性（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣ）の全部を有するプロテアーゼ耐性コンストラクトを設計することが有益であろう。Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異単独は、以前に、ＦｃγＲに対する親和性を増大させることが示されなかった（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．）が、コンストラクト２ｈ Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅは、２ｈと比較して増大されたＡＣＤＤを有した。したがって、Ｉ３３２Ｅ突然変異単独は、２ｈプロテアーゼ耐性ヒンジコンストラクトにＡＤＣＣを回復し得る。したがって、２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ（１５）（配列番号１８）、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（配列番号１９）（１６）、及びＳ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ（１７）（配列番号２０）を含む、２ｈ親ヒンジに対してＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ回復及びＣＤＣ回復の両方を組み合わせたコンストラクトが生成されるであろう。

【0108】

この３つのコンストラクトを、実施例１に記載した材料及び方法を使用して試験した。３つのコンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２に対する耐性を示した。

【0109】

以前に示したように、ＩｇＧ２ ｗｔ（２）はＧｌｕＶ８に耐性であった一方、ＩｇＧ１ ｗｔ（１）は、２４時間の消化後、６０％未満の無傷ＩｇＧが残留した。３つのコンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して増大された、ＧｌｕＶ８に対する耐性を有した。しかしながら、コンストラクト２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ（１５）及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ（１７）は、ＩｇＧ２ ｗｔと比較して低下されたＧｌｕＶ８に対する耐性を有した一方、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１６）は、ＩｇＧ２ ｗｔと同等の耐性を有した。これらのデータは、下部ヒンジ突然変異と組み合わせた、ＣＨ２内へ追加のＧｌｕを導入する突然変異は、新規なＧｌｕＶ８切断部位（例えば、２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（５）、２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ（１５）及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ（１７））を形成する一方、ＣＨ２内にＧｌｕを組み込まない突然変異は、ＩｇＧ２ ｗｔと同様のＧｌｕＶ８に対する耐性を示す（例えば、２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１１）及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１６））ことを示唆する。

【0110】

ＩｇＧ１ ｗｔ及びＩｇＧ２ ｗｔの両方は、ＩｄｅＳによるタンパク質分解を受けやすかった。２つのコンストラクト２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ（１５）及び２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ（１７）は、ＩｄｅＳと共に２４時間インキュベートした後、９０％を超える無傷ＩｇＧが残留した一方、コンストラクト２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１６）は、２０％未満の無傷ＩｇＧが残留した。これらの結果は、下部ヒンジ突然変異と組み合わせた、ＣＨ２内へのＧｌｕの追加は、下部ヒンジ突然変異単独、２ｈ（４）では付与されない特性である、ＩｄｅＳに対するプロテアーゼ耐性を増大させることを示唆する。

【0111】

３つのコンストラクトのＡＤＣＰ、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣを行う能力について試験した。３つのコンストラクトは、ＩｇＧ２ ｗｔ及び２ｈ（４）の両方と比較して増大されたＡＤＣＰ能力を有したが、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して低下された最大ＡＤＣＰを有した。コンストラクトの２つ、２ｈ Ｋ３２６Ａ／Ｉ３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ（１５）及び２ｈ Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ（１６）は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して僅かに増大されたＡＤＣＣを有した。コンストラクト２ｈ Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ（１７）は、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して低下されたＡＤＣＣを有したが、ＩｇＧ２ ｗｔ及び２ｈ（４）と比較して増大されたＡＤＣＣを有した。３つのコンストラクトの全部がＩｇＧ２ ｗｔ及び２ｈ（４）と比較して増大されたＣＤＣ能力を有したが、３つの全部に関してＣＤＣは、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して僅かに低下された。

【0112】

実施例６：有益な突然変異の概略
以下の１１個のＦｃ異型は、野生型ヒトＩｇＧ１が有する１つ以上のエフェクター機能を提供すると共に、下部ヒンジ内のＩｇＧ１を切断することが可能な１つ以上のプロテアーゼに対して耐性を有する抗体組成物を提供することが示された。記号２ｈは、Ｇ２３６が削除された、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａを有するＩｇＧ１を指定する。

【0113】

【表6】

【0114】

十分なデータが入手可能な場合、インビトロでのアッセイにおいて、細胞殺滅が完全又はほぼ完全な場合、様々なエフェクター機能の代理として用いられた、計算されたＥＣ５０値を下記に示す。表６Ａ及び６Ｂに示すデータは、ドナーＰＢＭＣ源が異なることを除いて同一条件下で生成された。したがって、各実験において、ＩｇＧ１ ｗｔ（１）からの倍変化を用いて相対的な生物活性を標準化した。

【0115】

【表7】

【0116】

【表8】

ｎ／ａ＝該当なし（ＥＣ５０の決定に不十分な結合曲線データ）、^*最大下の溶解が達成された
ｎ．ｄ．＝データなし
倍＝ＥＣ５０ ＩｇＧ１ ｗｔ／ＥＣ５０コンストラクト

【0117】

Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ及び２３３ＰＶＡ／２３６に加えた、下部ヒンジ内のＧ２３７における追加の改変の、ＡＤＣＣ及びＡＣＤＰに対する効果を、下記の表７に列挙したコンストラクトを使用して調べた。Ｇ２３７Ａコンストラクトを試験し、ＭＭＰｓ、ＩｄｅＳ、及びＧｌｕＶ８に対する耐性を有することが見出された。他のコンストラクトは消化アッセイにて評価されなかった。これらのデータは、Ａｌａ（Ａ）及びＳｅｒ（Ｓ）が２３７にて耐えるが、親分子、２ｈ ＤＥ（５）が示した上記のＦｃの細胞溶解活性を増大させないことを示す。

【0118】

【表9】

【0119】

生理学的に関連した特定のプロテアーゼに対する相対的なプロテアーゼ耐性（ＰＲ）と、可能なエフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ）を示す代理アッセイに関するインビトロ結果との組み合わせの概略を、下記の表８に示す。プロテアーゼ耐性と、確認できる１つ以上のエフェクター活性との組み合わせを有するコンストラクトは、白色で示される。

【0120】

【表10】

【0121】

結果の概要
本明細書に提示したＦｃコンストラクトの試験は、プロテアーゼがＩｇＧ１分子を切断することが示された部位である残基ＥＵ ２３３〜２３６をＰＶＡ／で置換することにより、残基２３２と２３４との間で切断するプロテアーゼである（図１）ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１２、及びＧｌｕＶ８に対して耐性を有するＦｃが生成されることを示した。これらの置換と組み合わせた際、置換された残基位置が推定切断部位（ＥＵ２３６〜２３７）、又はより遠位の位置の改変のいずれを含む場合でも、追加の改変がブドウ球菌プロテアーゼＩｄｅＳに対する耐性を生成した。

【0122】

残基ＥＵ ２３３〜２３６のＰＶＡ／による置換（２ｈ、コンストラクト４）単独は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣに関して記載したインビトロでのアッセイにより測定可能な、細胞溶解機能の損失をもたらした。１つ以上のエフェクター機能を増強することが以前に報告された、下部ヒンジＰＶＡ／置換を有するＩｇＧ１ Ｆｃ改変の組み合わせ（表２）に関しては、インビトロでの細胞溶解活性の１つ以上の局面が予想外に回復された。したがって、単一のコンストラクトはいずれも、プロテアーゼ耐性と、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣに関するインビトロでの細胞殺傷又は細胞溶解アッセイにより測定可能な、３つのエフェクター機能の全部に関する測定可能な又は増強された活性との両方を有さなかった。
１．８個のコンストラクト、５、７、８、９、１２、１４、１５、及び１６は、プロテアーゼ耐性と、ＩｇＧ１ ｗｔと比較して増強された又は同等のＡＤＣＣとを有した。ＩｇＧ１ ２ｈ ＤＥ（５）、ＩｇＧ１ ２ｈ ＦＴＥ（８）、ＩｇＧ１ ２ｈ ＤＦＴＥ（９）、ＩｇＧ１ ２ｈ ＡＤＥ（１２）、ＩｇＧ２ ＤＥ（１４）及びＩｇＧ１ ２ｈ ＡＥＡ（１５）を含む、それらのうちの６個は、Ｉ３３２Ｅ置換を組み込んでいる。
２．ＩｇＧ１ ２ｈ ＤＥ（５）、ＩｇＧ１ ２ｈ ＬＰＬ（７）、及びＩｇＧ１ ２ｈ ＤＦＴＥ（９）を含む３つのＰＲコンストラクトは、ＩｇＧ１ ｗｔと同様のＡＤＣＰを有した。ＩｇＧ１ ２ｈ ＦＴＥ（８）、ＩｇＧ１ ２ｈ ＥＦＴＥ（１０）、ＩｇＧ１ ２ｈ ＡＤＥ（１２）、及びＩｇＧ２ ＤＥ（１４）を含む３つのコンストラクトは、ＩｇＧ１と比較して僅かに低下されたＡＤＣＰを有した。
３．５個のＰＲ突然変異、ＩｇＧ１ ２ｈ ＡＡ（１１）、ＩｇＧ ２ｈ ＥＦＴＥ（１０）、２ｈ ＡＥＡ（１５）、２ｈ ＤＡＡ（１６）、及び２ｈ ＥＥ（１７）は、ＣＤＣ能力を回復した。加えて、５個の全部は、検出可能であるがＩｇＧ１ ｗｔと比較して低下されたＡＤＣＰを有した。２つの異型、２ｈ ＡＥＡ（１５）、２ｈ ＤＡＡ（１６）も、ＩｇＧ１ ｗｔ（１）と比較して増強されたＡＤＣＣを有した。

【0123】

Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ突然変異を含む２つのコンストラクト（８及び９）は、プロテアーゼ耐性ヒンジが存在する場合、ＣＤＣが回復されなかった。Ｓ２６７Ｅ突然変異（ＥＦＴＥ（１０））はＣＤＣを回復したが、ＦｃγＲＩＩＩａ結合が低下した（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ２０１０ ２（２）：１８１．にも記されている）。Ｓ２６７Ｅ突然変異は、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を増大させた。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]