特許 6012794 自己抗原を使用する原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）を診断するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6012794

(24)【登録日】2016年9月30日

(45)【発行日】2016年10月25日

(54)【発明の名称】自己抗原を使用する原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）を診断するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20161011BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20161011BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20161011BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20161011BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 NZNA

   G01N33/574 A

   G01N37/00 102

   !C12N15/00 A

【請求項の数】21

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2015-41977(P2015-41977)

(22)【出願日】2015年3月4日

(62)【分割の表示】特願2012-532147(P2012-532147)の分割

【原出願日】2010年10月5日

(65)【公開番号】特開2015-143695(P2015-143695A)

(43)【公開日】2015年8月6日

【審査請求日】2015年4月3日

(31)【優先権主張番号】61/248,768

(32)【優先日】2009年10月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512087331

【氏名又は名称】アンバージェン， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】501421557

【氏名又は名称】マサチューセッツ ジェネラル ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】マーク ジェイ． リム

(72)【発明者】

【氏名】ヘザー ピー． オステンドルフ

(72)【発明者】

【氏名】ケネス ジェイ． ロスチャイルド

(72)【発明者】

【氏名】ドナルド ビー． ブロチ

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１１−０７５８６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０７１４０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６１１１０７１（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開平１０−０８２７８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Chao-Jun Hu et al.，Identification of New Autoantigens for Primary Biliary Cirrhosis Using Human Proteome Microarrays，Molecular & Cellular Proteomics，２０１２年，Vol.11, No.9，Page.669-680

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種の自己抗体の存在を、個体における原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の指標とする方法であって、該方法は：
該個体由来の試験試料を、各々がｋｅｌｃｈ様１２またはｋｅｌｃｈ様１２のホモログの１種類以上の自己抗原エピトープを含む１種以上の標的抗原と接触させる工程であって、ｋｅｌｃｈ様１２の該ホモログの該１種類以上のエピトープは、ｋｅｌｃｈ様１２の該１種類以上のエピトープと少なくとも９０％同一であり、かつｋｅｌｃｈ様１２自己抗体結合活性を有する、工程；および
該１種類以上の標的抗原と該試験試料中の該標的抗原に特異的な１種類以上の自己抗体との結合を検出する工程であって、ここで、該１種類以上の標的抗原に対して結合した該１種類以上の自己抗体の存在は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の指標となる、工程
を包含する、方法。

【請求項2】

前記１種類以上の標的抗原を固相支持体上に固定化させる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記試験試料を、２種類以上の前記標的抗原と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記試験試料を、３種類以上の前記標的抗原と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記試験試料を、４種類以上の前記標的抗原と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記試験試料を、５種類以上の前記標的抗原と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記試験試料を、６種類以上の前記標的抗原と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記試験試料を、７種類以上の前記標的抗原と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記試験試料が細胞、組織または体液である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記試験試料が血液、血漿または血清である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記１種以上の自己抗体が、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択される、ｋｅｌｃｈ様１２配列またはｋｅｌｃｈ様１２配列のホモログに結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記ｋｅｌｃｈ様１２またはｋｅｌｃｈ様１２のホモログが、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択される配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

前記１種以上の標的抗原が、ｋｅｌｃｈ様１２の１種類以上の自己抗原エピトープを含み、該ｋｅｌｃｈ様１２は、配列番号１２の配列を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

固相イムノアッセイを行う工程を包含する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行う工程を包含する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

間接免疫蛍光（ＩＩＦ）アッセイを行う工程を包含する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

免疫クロマトグラフィー法を行う工程を包含する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記免疫クロマトグラフィー法が、ドットブロットアッセイである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

化学発光アッセイを行う工程を包含する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

比色アッセイを行う工程を包含する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記標的抗原が、組換えペプチドを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、分子生物学、生化学、細胞生物学、医学および医学的診断に関する。具体的には、本発明は、新規な核酸分子、それにコードされたタンパク質およびポリペプチド断片、それに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに自己免疫性障害、ウイルス疾患および癌の制御のための診断、予後、病期分類および治療のレジメンにおける該核酸分子、タンパク質／ポリペプチドおよび抗体の使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
自己反応性リンパ球の活性化および正常な組織または細胞成分（自己抗原）に対する自己抗体の生成と関連している既報の疾病は８０種類を超えている［ｖｏｎ ＭｕｈｌｅｎおよびＴａｎ（１９９５）Ｓｅｍｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２４：３２３−５８；Ｍｅｌｌｏｒｓ（２００２）２００５］。該疾病は、集合的に自己免疫疾患と称され、１４７０万〜２３５０万人（米国の全人口の８％に至る）が罹患していると推定されており、経済上および健康上の大きな負担となっている［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｇａｎｇｅ，ＲｏｓｅおよびＧｒａｈａｍ（１９９７）Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ８４：２２３−４３］。理由が不明なため、自己免疫疾患に罹患している人の数は上昇状態にある。自己免疫の診断は、一生涯の疾病と処置、器官損傷の可能性、衰弱および死亡する確率の増大を意味する。自己免疫疾患の慢性的で多くの場合、衰弱性である性質により、患者の健康不良、医療費の増大、および生産性の低下がもたらされる。自己免疫疾患の基礎となる免疫機能不全の根本的な原因は、現在もなお充分に理解されていない。そのため、自己免疫疾患は、一般的に、広く可変的な臨床像（これは、典型的には、一群の症状を伴う）のため、依然として診断は困難なままである。

【0003】

自己免疫疾患は、個体の免疫機構により明らかに正常な組織が標的化され、破壊される障害である。自己免疫疾患の例としては、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症（ＳＣＬ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）および原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）が挙げられる。自己抗体は、一般的には細胞内のタンパク質および核酸に指向される。ＰＶなどの特定の疾患では、自己抗体の標的が既知であり、自己抗体が疾患の病因に役割を果たしていると考えられている。ＳＬＥなどの他の疾患では、多くの異なる自己抗体の標的が特定されているが、ＳＬＥの病因における自己抗体の役割は未だ不明確である。

【0004】

患者の血清中における自己抗体の検出は、自己免疫疾患の診断を補助する。リウマチ因子（ヒトＩｇＧに指向されるＩｇＭ抗体）は、大部分のＲＡ患者で検出され、所与の個体におけるその診断が裏付けられる［Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｎ．ら １９８５．Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．第２版．Ｓａｕｎｄｅｒｓ．ｐｐ．６６７］。抗核抗体（ＡＮＡ）は、活動性ＳＬＥを有する個体のおよそ９８％に存在している。ＡＮＡはＳＬＥの診断に特異的ではないが、この抗体が存在しないことは、所与の患者におけるＳＬＥの診断に対して反対が主張される［Ｋｅｌｌｙら，１９８５（上掲）ｐｐ．６９１］。

【0005】

肝臓疾患と胆汁性疾患は合わせて、米国での死亡原因の上位１０位にランキングされている。慢性肝臓疾患は、アメリカ人の５〜１０パーセントが罹患しており、米国では１〜２パーセントが死に至る。慢性肝臓疾患および肝硬変の費用は、年間１６億ドルと推定されている［（２００４）］。肝臓疾患および胆汁性疾患の一般的な原因としては、感染性因子、遺伝的欠陥、代謝障害、アルコール、毒素および環境製毒物が挙げられる。最も一般的な肝臓疾患は、慢性Ｃ型肝炎、アルコール性肝臓疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、慢性Ｂ型肝炎、自己免疫性肝臓疾患および薬物誘発性肝臓疾患である。このような病状の多くは予防または処置が可能であるが、そうでない場合は、進行性の肝臓傷害、肝臓線維症に至り、最終的には、肝硬変、門脈圧亢進症、末期の肝臓疾患、場合によっては肝臓癌に至ることがあり得る。現在、末期の肝臓疾患に対する唯一の治療法は肝臓移植である。米国では、毎年５，０００例を超える肝臓移植が行なわれている。少なくとも１７，０００名が肝臓移植の待機リストに載せられており、毎年、１，５００名もの多くが待機中に死亡する［（２００４）］。肝臓疾患の研究では、多くの困難な必要性が提示されている。自己免疫性肝臓疾患としては、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、自己免疫性肝炎および原発性硬化性胆管炎が挙げられる。このような慢性肝臓疾患はすべて、末期の肝臓疾患に至るものであり得る。合わせると、自己免疫性肝臓疾患は、米国で年間の成人の肝臓移植の１３％を占める［（２００４）］。

【0006】

ＰＢＣは進行性の胆汁鬱滞性の肝臓疾患であり、米国での有病率は人口１００，０００人あたり成人およそ４０名（米国の人口１００，０００名あたり発生数は２．７例）と推定されている［Ｋｉｍ，Ｌｉｎｄｏｒら（２０００）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ
１１９：１６３１−６；ＦｅｌｄおよびＨｅａｔｈｃｏｔｅ（２００３）Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １８：１１１８−２８；２００４）］。女性では、主に年齢４０〜６５歳でＰＢＣに罹患し、男性に対する女性の比率は９：１であり［ＫａｐｌａｎおよびＧｅｒｓｈｗｉｎ（２００５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：１２６１−７３］、自己免疫疾患に典型的である。ＰＢＣは、肝線維症および肝臓不全に至る肝臓の排出管の緩徐な進行性の破壊を特徴とする（［Ｋａｐｌａｎ（１９９６）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３５：１５７０−８０；Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ（２０００）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１：１００５−１３；Ｋａｐｌａｎ（２００２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３：１３９２−４；ＴａｌｗａｌｋａｒおよびＬｉｎｄｏｒ（２００３）Ｌａｎｃｅｔ ３６２：５３−６１］に概説）。ＰＢＣは肝臓移植の有意な適応症であり、ＰＢＣ患者は、肝硬変のために肝臓移植を受ける全患者の１１％を構成する［Ｍｉｌｋｉｅｗｉｃｚ（２００８）Ｃｌｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ １２：４６１−７２；ｘｉ］。

【0007】

ＰＢＣの処置は、肝臓に対して毒性でない天然胆汁酸であるウルソデオキシコール酸（ウルソジオール）を用いて、ＰＢＣによって減少した胆汁酸を補充することにより行なわれる。機序は充分に理解されていないが、この処置により、最終的に、他の肝臓毒性胆汁酸細胞内蓄積（胆管の破壊によって引き起こされたもの）が低減される。ウルソジオールは肝硬変への進行を遅滞させるが、ウルソジオール処置はＰＢＣ経過の早期に実施した場合に最良に機能し、迅速で信頼性のあるＰＢＣ診断試験の重要性が強調される。実際、試験により、病期ＩＩＩおよびＩＶでのウルソジオール処置では、肝臓での進行の有意な遅滞はもたらされないが、組織学的病期ＩおよびＩＩでの早期に処置した患者では、ウルソジオール処置により肝臓破壊の有意な遅滞が示されることが示された。これは、速やかな医療処置を可能にするために、早期のＰＢＣ診断の必要性を強調している［Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ（２０００）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１：１００５−１３；Ｐｏｕｐｏｎ，Ｌｉｎｄｏｒ，Ｐａｒｅｓ，Ｃｈａｚｏｕｉｌｌｅｒｅｓ，Ｐｏｕｐｏｎ ａｎｄ Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ（２００３）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ３９：１２−６］。

【0008】

ＰＢＣ患者のほぼ半数は最初に血液検査での異常を示し、これは、最終的なＰＢＣ診断の誘因となる。一般的に、診断試験は、まず、肝臓機能試験の異常および胆汁性疾患の徴候から始めた後、血清抗ミトコンドリア自己抗体（ＡＭＡ）について試験し、この場合、推定８７〜９５％のＰＢＣ患者が試験で陽性となる［Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ（２０００）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１：１００５−１３；Ｙａｎｇ，Ｙｕ，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｎｅｕｂｅｒｇ，ＬｉｎｄｏｒおよびＢｌｏｃｈ（２００４）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２：１１１６−２２；ＫａｐｌａｎおよびＧｅｒｓｈｗｉｎ（２００５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：１２６１−７３；Ｌｉｕ，Ｓｈｉ，Ｚｈａｎｇ，ＺｈａｎｇおよびＧａｏ（２００８）Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ ２８：２３３−９］。胆管のイメージング試験を使用し、胆管疾患の他の原因を排除し、肝臓の生検により、診断を確認し、疾患病期の測度を示す（線維症の度合に基づいて）。

【0009】

しかしながら、ＰＢＣ患者の残りのほぼ半数では、さまざまな比較的非特異的な身体症状が示されるにすぎず、一般的な医師または診断の責任を担う専門家が直面する困難さが強調される。かかる症状の最も一般的なものは、心因掻痒、疲労感および筋骨格系疼痛である［Ｐｒｉｎｃｅ，Ｃｈｅｔｗｙｎｄ，Ｎｅｗｍａｎ，ＭｅｔｃａｌｆおよびＪａｍｅｓ（２００２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３：１０４４−５１］。さらに、ＰＢＣと関連して見られることがあり得る自己免疫性障害が数多くあり、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）［Ｃｚａｊａ（２００６）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ４４：２５１−２］、甲状腺機能不全、乾燥症状、レーノー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチ［Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ（２０００）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１：１００５−１３；Ｇｅｒｓｈｗｉｎ，Ｓｅｌｍｉ，Ｗｏｒｍａｎ，Ｇｏｌｄ，Ｗａｔｎｉｋ，Ｕｔｔｓ，Ｌｉｎｄｏｒ，ＫａｐｌａｎおよびＶｉｅｒｌｉｎｇ（２００５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４２：１１９４−２０２］が挙げられる。試験の一例では、ＰＢＣ患者の１９％は別の疾患の特長を有し［Ｃｚａｊａ（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２８：３６０−５］、それにより診断が不明確になることがわかった。懸念は、病因が認識されていないため、特に、患者が心因掻痒または関節の不快症状というあいまいな症状を示す場合、多くの患者において、適正な試験がオーダーされ得ないことである。

【0010】

自己抗体は、診断ツールとしてのみならず、ＰＢＣの将来的な開発品の先駆体として供される可能性を有する。実際、抗ミトコンドリア自己抗体（ＡＭＡ）により、ＰＢＣの臨床徴候および診断が事前に示されることが示されている［Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｐａｌｍｅｒ，Ｊｏｎｅｓ，ＢａｓｓｅｎｄｉｎｅおよびＪａｍｅｓ（１９９６）Ｌａｎｃｅｔ ３４８：１３９９−４０２］。これは、自己抗体バイオマーカーを用いてＰＢＣを早期の段階で診断することが可能であることを示す。ＰＢＣの血清学的ホールマークはＡＭＡであり、これは患者の８７〜９５％で検出され得る［Ｋａｐｌａｎ（１９９６）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３５：１５７０−８０；Ｎｉｓｈｉｏ，ＫｅｅｆｆｅおよびＧｅｒｓｈｗｉｎ（２００２）Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ２２：２９１−３０２］。このＡＭＡによって標的化される主な自己抗原としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ−Ｅ２）のＥ２サブユニット、分枝／鎖２−オキソ−酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２）および２−オキソ−グルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＧＤＣ−Ｅ２）が挙げられる［Ｆｕｓｓｅｙ，Ｇｕｅｓｔ，Ｊａｍｅｓ，ＢａｓｓｅｎｄｉｎｅおよびＹｅａｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５：８６５４−８；Ｎｉｓｈｉｏ，Ｋｅｅｆｆｅら（２００２）Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ２２：２９１−３０２］。

【0011】

抗核自己抗体（ＡＮＡ）はＰＢＣ患者の約５０％に存在している。核のコア複合体および多数の核内点状構造（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｏｔ）（ＭＮＤ）のタンパク質を認識する自己抗体は、ＡＭＡ陰性患者（有病率は１３〜４４％）において有用なＰＢＣマーカーである［Ｍａｎｕｅｌ Ｌｕｃｅｎａ，Ｍｏｎｔｅｓ Ｃａｎｏ，Ｌｕｉｓ Ｃａｒｏ，Ｒｅｓｐａｌｄｉｚａ，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍａｎ，Ｎｕｎｅｚ−Ｒｏｌｄａｎ ａｎｄ Ｗｉｃｈｍａｎｎ（２００７）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１０９：２０３−１１］。さらに、ＡＮＡは予後インジケータとしての機能を果たし得、抗セントロメアおよび／または抗核ポア糖タンパク質２１０（ｇｐ２１０）自己抗体は、ＰＢＣにおいて肝臓不全と関連している［Ｙａｎｇ，Ｙｕら（２００４）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２：１１１６−２２；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋｏｎｄｏら（２００７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４５：１１８−２７］。

【0012】

核小体（ＮＢ，核ドメイン１０、ＰＭＬ発癌性ドメイン、およびＫｒ体としても知られている）は、機能が不明の核小器官である［Ａｓｃｏｌｉ，Ｃ．Ａ．およびＭａｕｌ，Ｇ．Ｇ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：７８５−７９５（１９９１）；Ｂｒａｓｃｈ，Ｋ．およびＯｃｈｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０２：２１１−２２３（１９９２）；Ｄｙｃｋ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｅｌｌ ７６：３３３−３４３（１９９４）］。免疫組織化学的染色を使用すると、ＮＢは、核内に５〜３０個の離散した点状のドット様領域として見られる。ＮＢは、ＤＮＡの複製およびｍＲＮＡのプロセッシングに関与しているものなどの他の核ドメインとは相違している。また、ＮＢの成分は動原体またはセントロメアと共局在していない［Ｂｒａｓｃｈ，Ｋ．およびＯｃｈｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０２：２１１−２２３（１９９２）］。細胞内のＮＢの数、およびこのような構造の抗体染色強度は、インターフェロン（ＩＦＮ）、熱ショックおよびウイルス感染などの刺激に応答して増大する［Ａｓｃｏｌｉ，Ｃ．Ａ．およびＭａｕｌ，Ｇ．Ｇ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：７８５−７９５（１９９１）］。

【0013】

ＮＢは、自己免疫疾患である原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の患者の血清中の自己抗体の標的である。ＰＢＣの患者のおよそ４０％は、この構造に指向される抗体を有する［Ｅｖａｎｓ，Ｊ．ら，Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．３４７：３１−７３６（１９９１）；Ｓｚｏｓｔｅｃｋｉ，Ｃ．ら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：５５５−５６４（１９９２）］。ＰＢＣの患者由来の血清を使用し、ＮＢの１００ｋＤａの成分が同定および特性評価され、これは、Ｓｐ１００と命名された（Ｓｐｅｃｋｌｅｄ，１００ｋＤａ）［Ｓｚｏｓｔｅｃｋｉ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：４３３８−４３４７（１９９０）］。Ｓｐ１００とＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインとの融合体は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて遺伝子の転写を活性化させることが示されており、Ｓｐ１００はゲノム内の特定の領域の転写の活性化に関与しているのではないかということが提案されている［Ｘｉｅ，Ｋ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：６１７０−６１７９（１９９３）］。

【0014】

ＮＤＰ５２と命名されたＮＢの第２の成分は、ＮＢと反応するマウスモノクローナル抗体を用いて特性評価された［Ｋｏｒｉｏｔｈ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：１−１３（１９９５）］。ＮＤＰ５２をコードするｃＤＮＡを特定し、推定アミノ酸配列は、コイルドコイルモチーフ、ロイシンジッパーモチーフおよびジンクフィンガーモチーフを含むものであった。これらのドメインの１つ以上が、ＮＤＰ５２とＮＢの他の成分との相互作用に関与している可能性がある［Ｋｏｒｉｏｔｈ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：１−１３（１９９５）］。

【0015】

ＮＢの第３の成分であるＰＭＬは、ヒト急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）と関連しているｔ（１５；１７）転座を試験したいくつかの研究者グループによって特定された［ｄｅ Ｔｈｅ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４７：５５８−５６１（１９９０）；Ｂｏｒｒｏｗ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５７７−１５８０（１９９０）；Ｌｏｎｇｏ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１５７１−１５７５（１９９０）；Ｋａｋｉｚｕｋａ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ ６６：６６３−６７４（１９９１）］。この転座では、ＰＭＬのアミノ末端部分がレチノイン酸受容体αに融合されている。ＰＭＬは、ＮＢ内でＳｐ１００と共局在していることがわかった［Ｗｅｉｓ，Ｋ．ら，Ｃｅｌｌ ７６：３４５−３５６（１９９４）；Ｋｏｋｅｎ，Ｍ．Ｈ．Ｍ．ら，ＥＭＢＯ １３：１０７３−１０８３（１９９４）］。ＡＰＬ細胞でのＰＭＬ−α融合タンパク質の発現により、ＮＢが破壊されるようである；このような細胞内では、ＮＢ抗原が、核内の数多くの小領域（「微小スペックル（ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｋｌｅ）」と記載される）で検出される。ＡＰＬ細胞をレチノイン酸（ＲＡ）で処理すると、骨髄性前駆細胞の分化およびＮＢの再形成がもたらされる［Ｄｙｃｋ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｅｌｌ ７６：３３３−３４３（１９９４）；Ｗｅｉｓ，Ｋ．ら，Ｃｅｌｌ ７６：３４５−３５６（１９９４）；Ｋｏｋｅｎ，Ｍ．Ｈ．Ｍ．ら，ＥＭＢＯ １３：１０７３−１０８３（１９９４）］。ＡＰＬの患者では、ＲＡの処置により、白血病細胞の分化および一次的な疾患の寛解がもたらされる［Ｗａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：１７７−１８９（１９９３）］。

【0016】

しかしながら、ＡＮＡが、さまざまな他の蔓延している自己免疫性障害および広範な癌にも見られることに注意することは重要である［Ｂｅｉ，Ｍａｓｕｅｌｌｉ，Ｐａｌｕｍｂｏ，ＭｏｄｅｓｔｉおよびＭｏｄｅｓｔｉ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ］。

【0017】

間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）および固相イムノアッセイは、患者において自己抗体の有無を確立するのに使用される２つの形式である。どちらの方法も、以下に論考するように賛否両論がある。

【0018】

過去数十年間、間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）は、医師が、自己免疫患者の血清中に存在する自己抗体を検出するのに選択する方法であった。重要なことに、これは、依然として、例えばＰＢＣに関するＡＭＡおよびＡＮＡ試験の金標準である。典型的には、患者の血清を２倍ずつ連続希釈し、顕微鏡スライド上の細胞基質（例えば、ＨＥｐ−２肝臓細胞）に結合させ、次いで、これを蛍光染色し、結合された自己抗体を検出し、顕微鏡下で熟練技術者が調べ、細胞／組織染色パターンを確認する。ＩＩＦは、細胞／組織系基質として、理論的には、あらゆる細胞内自己抗原（基質内でのその発現および保持が保留中）を「普遍的に」カバーできるという利点を有する。これは、一部において、ＩＩＦ試験の高い診断鋭敏度、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）では９３％（ＡＮＡ）［Ｓｏｌｏｍｏｎ，ＫａｖａｎａｕｇｈおよびＳｃｈｕｒ（２００２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４７：４３４−４４］およびＰＢＣでは９０％（ＡＭＡ）［Ｔａｎａｋａ，Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｌｕｋｅｔｉｃ，Ｋａｐｌａｎ，ＳｔｏｒｃｈおよびＧｅｒｓｈｗｉｎ（２００２）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）４８：２９５−９］によって証明されている。

【0019】

ＩＩＦによるＡＭＡはＰＢＣの感度のよいマーカーであるが、特異性が両立しないことがあり得る。無症候性の患者はＡＭＡ陽性とみなされているが、大部分は数年後に症状が発現するにすぎず、一部は全く症状が発現しない［Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎら（１９９６）Ｌａｎｃｅｔ ３４８：１３９９−４０２］。さらに、ある試験では、ＡＩＨ患者の３４％がＡＭＡの試験で陽性であることが見出された［Ｎｅｚｕ，Ｔａｎａｋａ，Ｙａｓｕｉ，Ｉｍａｍｕｒａ，Ｎａｋａｊｉｍａ，ＩｓｈｉｄａおよびＴａｋａｈａｓｈｉ（２００６）Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２１：１４４８−５４］。

【0020】

さらに、ＩＩＦアッセイは、常套的な診断用スクリーニングツールとして使用される場合、基質および固定プロセスにおける多様性、顕微鏡検査装置における多様性により正規化することが困難であるため、ならびに結果の解釈が非常に主観的であるため、全体的に問題がある［Ｊａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｍｏｕｒｉｔｓｅｎ，ＬｉｔｗｉｎおよびＨｉｌｌ（１９９６）Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １０５：４６８−７３］。２００４年のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇｒｏｕｐ（ＩＡＩＨＧ）のＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｓｅｒｏｌｏｇｙの合意声明により、ＩＩＦは、齧歯類の３つの異なる器官において行なうよう推奨された［Ｖｅｒｇａｎｉ，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｃａｎｃａｄｏ，Ｍａｃｋａｙ，Ｍａｎｎｓ，ＮｉｓｈｉｏｋａおよびＰｅｎｎｅｒ（２００４）Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ４１：６７７−８３］。ＡＭＡおよび抗肝臓腎臓ミクロソーム−１（ＬＫＭ１）抗体は、ともに、腎臓の尿細管を染色するが、違いは熟練者の目にしかわからず、このあいまいさが、ＰＢＣでなく自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）の診断をもたらすことになり得る［Ｂｏｇｄａｎｏｓ，Ｉｎｖｅｒｎｉｚｚｉ，ＭａｃｋａｙおよびＶｅｒｇａｎｉ（２００８）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １４：３３７４−８７］。さらに、一部の自己抗原は、ＩＩＦの固定プロセス中に拡散または変性によって失われる（認識できなくなる）。直面する別の要素は、多くの場合、同じ患者に多くの自己免疫疾患が一緒に発症していることがあり得、ＩＩＦパターンの重複により、各々の正確な診断に混乱がもたらされ得ることである［Ａｓｓａｓｓｉ，Ｆｒｉｔｚｌｅｒら（２００９）Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ；Ｎｏｒｍａｎ，Ｂｉａｌｅｋ，Ｅｎｃａｂｏ，Ｂｕｔｋｉｅｗｉｃｚ，Ｗｉｅｃｈｏｗｓｋａ−Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ，Ｂｒｚｏｓｋｏ，ＳｈｕｍｓおよびＭｉｌｋｉｅｗｉｃｚ（２００９）Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４１：７６２−４］。最後に、ＩＩＦは、遅くて面倒であり、高処理量の自動化には適していない［Ｕｌｖｅｓｔａｄ，Ｋａｎｅｓｔｒｏｍ，Ｍａｄｌａｎｄ，Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ，ＨａｇａおよびＶｏｌｌｓｅｔ（２０００）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５２：３０９−１５］。

【0021】

ＩＩＦは依然としてＡＭＡ試験の金標準であるが、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）などの固相イムノアッセイが、特に高処理量研究所において注目が高まっている［ＦｒｉｔｚｌｅｒおよびＦｒｉｔｚｌｅｒ（２００６）Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：２５０３−１２］。この方法は、高処理量の自動化、高い解析感度、純粋に客観的な評点付け、信頼性、および特定の自己抗原種を、例えばマルチプレックス様式で試験することが可能という利点を有する［ＦｒｉｔｚｌｅｒおよびＦｒｉｔｚｌｅｒ（２００６）Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：２５０３−１２］。個々の抗原レベルでの解決（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に関して、この方法は、正しいマーカーパネルが選択された場合には疾患特異性が大きくなる潜在性を有する。しかしながら、欠点は、細胞基質系ＩＩＦアッセイの診断鋭敏度と適合するには、発見のため、および臨床的確認のための両方に、充分な数の自己抗原が必要とされることである。

【0022】

ＰＢＣのための市販の固相イムノアッセイの一例において、ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により、ＡＭＡの検出に基づいたＰＢＣのためのＦＤＡ承認済ＥＬＩＳＡ系イムノアッセイであるＭＩＴ３アッセイが市販されている。ＭＩＴ３では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の３つのすべてのＥ２サブユニットの免疫優性エピトープを含む組換えタンパク質が使用される［Ｍｏｔｅｋｉ，Ｌｅｕｎｇ，Ｃｏｐｐｅｌ，Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｋａｐｌａｎ，ＭｕｎｏｚおよびＧｅｒｓｈｗｉｎ（１９９６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２４：９７−１０３］。このような試験の全般的な目的は、ＰＢＣについて細胞のＩＩＦ系ＡＭＡ試験を模倣することであるが、個々の抗原の固相イムノアッセイの上述の有益性はすべて伴う。それでもなお、この試験は、ＰＢＣの臨床病理学的所見と一緒にされる診断の補助のみが意図される。試験の一例では、ＡＭＡ系ＭＩＴ３ ＥＬＩＳＡアッセイにより、８１．６％の診断鋭敏度が報告されたが、ＡＭＡ陰性ＰＢＣ疾患の血清試料は除外されていたことに注意することは重要である［Ｇａｂｅｔａ，Ｎｏｒｍａｎ，Ｌｉａｓｋｏｓ，Ｐａｐａｍｉｃｈａｌｉｓ，Ｚｏｇｒａｆｏｓ，Ｇａｒａｇｏｕｎｉｓ，ＲｉｇｏｐｏｕｌｏｕおよびＤａｌｅｋｏｓ（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：３７８−８７］。別の試験では、ＭＩＴ３アッセイは、例えば、ＰＢＣの最大診断鋭敏度で、必要なミトコンドリア自己抗原がすべて欠如していることが示された［Ｄａｈｎｒｉｃｈ，Ｐａｒｅｓら（２００９）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５５：９７８−８５］。

【0023】

これは、ＰＢＣなどの自己免疫疾患の最適な診断のために固相イムノアッセイで使用されるさらなる自己抗原バイオマーカーの発見と確認の必要性を強調する。最も有効な自己抗原の発見方法は、プロテオミクス系のものである。プロテオミクスは、ゲノムの全発現タンパク質コンプリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）の大域（例えば、パラレルまたは同時）解析と定義され得る［非特許文献１］。プロテオミクス法により、偏りのない様式での新規な自己抗原の発見が可能となる。新規な自己抗原の発見のための一般的なプロテオミクス法としては、ＳＥＲＥＸ（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的特定）［非特許文献２］ならびにヒトプロテオームマイクロアレイ（「チップ」、一般的に、標準的な顕微鏡スライドの寸法、その表面上に、微視的スポット（例えば、１００ミクロンの直径のスポット）の整列されたアレイ状にプリントされた数千の精製組換えヒトタンパク質を含む）［非特許文献３；非特許文献４］が挙げられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0024】

【非特許文献1】Ｗａｓｉｎｇｅｒ，Ｃｏｒｄｗｅｌｌら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９５）１６：１０９０−４

【非特許文献2】Ｋｒｅｂｓ，Ｋｕｒｒｅｒ，Ｓａｈｉｎ，ＴｕｒｅｃｉおよびＬｕｄｅｗｉｇ、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ（２００３）２：３３９−４５

【非特許文献3】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＤｉＧｅｎｎａｒｏら、Ｎａｔ Ｍｅｄ（２００２）８：２９５−３０１

【非特許文献4】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＳｔｅｉｎｍａｎおよびＵｔｚ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ（２００２）４６：８８５−９３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0025】

発明の概要
本発明は、自己免疫性肝臓疾患である原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の診断、予後、病期分類および治療のレジメンにおける、新規な自己抗原（表ＩおよびＶ）ヒトヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）および／またはｋｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）またはエピトープを含むその断片の使用方法に関する。また、本発明は、自己免疫性肝臓疾患である原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の診断、予後、病期分類および治療のレジメンにおける、ヒトヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）および／またはｋｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）またはエピトープを含むその断片の、好ましくは少なくとも７０％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一である、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるホモログ、ファミリーメンバー、転写物バリアントおよびアイソフォーム（例えば、表ＶＩ）の使用方法に関する。

【0026】

さらに、本発明は、上記のポリペプチドまたはエピトープを含むその断片に特異的に結合する単離された抗体を提供する。本明細書において提供する抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、アフィニティ精製されていてもよく、固相支持体上に固定化させてもよく、検出可能に標識してもよい。また、本発明は、体液試料、好ましくは血液、血清または血漿を動物から単離する工程、血清を、上記の単離されたＨＫ１および／またはＫＬＨＬ１２ポリペプチドとともにインキュベートする工程、および血清試料中の自己抗体と、該単離されたポリペプチドとの結合を検出する工程を含む、動物、好ましくはヒトにおいて自己免疫疾患の存在を検出するための方法を提供する。また、本発明は、体液試料、好ましくは血液、血清または血漿を動物から単離する工程、血清成分を固相支持体上に固定化させる工程、固定化した血清成分を、上記の単離されたポリペプチドと、該血清成分と該単離されたポリペプチドとの複合体の形成に有利な条件下で接触させる工程、形成された複合体を、ＨＫ１および／またはＫＬＨＬ１２に特異的に結合する抗体と接触させる工程、ならびに該抗体と該複合体との結合を検出する工程を含む、動物において自己免疫疾患の存在を検出するための択一的な方法を提供する。本発明の方法によって診断され得る自己免疫疾患としては、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられる。本発明の方法によって診断され得る癌としては、結腸直腸癌（ＣＲＣ）が挙げられる。また、本発明は、上述のＨＫ１および／またはＫＬＨＬ１２に対する自己抗体の検出方法を用いて、予後、疾患病期および処置レジメンを判定する方法を提供する。

【0027】

好ましい実施形態では、不均一系または均一系のイムノアッセイ（シングルプレックスまたはマルチプレックス）を用いて、前記自己抗原に指向される体液中に存在する自己抗体を検出する。本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面（図）および本発明の説明、ならびに特許請求の範囲に鑑みて、当業者に自明であろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
個体における原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）を診断する方法であって、該方法は：
ａ．該個体由来の試験試料を、各々が表Ｉの自己抗原を含む１種類以上の標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる工程；および
ｂ．該１種類以上の標的抗原と該試験試料中の１種類以上の抗体との結合を検出する工程であって、ここで、該１種類以上の標的抗原に対して結合した該１種類以上の抗体の存在は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の指標となる、工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記１種類以上の標的抗原を固相支持体上に固定化させる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試験試料を、表Ｉのすべての標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記試験試料が細胞、組織または体液である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記試験試料が血液、血漿または血清である、項目１に記載の方法。
（項目６）
個体における原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）を診断する方法であって、該方法は：
ａ．該個体由来の試験試料を、各々が表ＶＩの自己抗原を含む１種類以上の標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる工程；および
ｂ．該１種類以上の標的抗原と該試験試料中の該１種類以上の抗体との結合を検出する工程であって、ここで、該１種類以上の標的抗原に対して結合した該１種類以上の抗体の存在は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の指標となる、工程
を包含する、方法。
（項目７）
前記１種類以上の標的抗原を固相支持体上に固定化させる、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記試験試料を、表ＶＩの２種類以上の標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記試験試料を、表ＶＩの４種類以上の標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記試験試料を、表ＶＩの６種類以上の標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記試験試料を、表ＶＩの８種類以上の標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる、項目６に記載の方法。
（項目１２）
前記試験試料を、表ＶＩのすべての標的抗原またはエピトープを含むその断片と接触させる、項目６に記載の方法。
（項目１３）
前記試験試料が細胞、組織または体液である、項目６に記載の方法。
（項目１４）
前記試験試料が血液、血漿または血清である、項目６に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１：マイクロアレイ解析から無作為に選択した陽性および陰性血清試料に対するＰＢＣ自己抗原ヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）のＥＬＩＳＡに基づく予備確認。グラフのデータはＥＬＩＳＡのものである。「＋」および「−」は、「ＥＬＩＳＡ」アッセイまたはマイクロアレイ（「アレイ」）解析のいずれかに基づいて、所与の血清がＨＫ１自己抗体について陽性であったか陰性であったかを示す。接頭辞「Ｎ」を示した血清試料は健常個体由来のものであり、「ＰＢＣ」は原発性胆汁性肝硬変患者由来のものであり、「ＳＬＥ」は全身性エリテマトーデス患者由来のものである。ＥＬＩＳＡアッセイによる自己抗体単位の計算は実施例２に詳述している。

【図2】図２：マイクロアレイ解析から無作為に選択した陽性および陰性血清試料に対するＰＢＣ自己抗原Ｋｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）のＥＬＩＳＡに基づく予備確認。グラフのデータはＥＬＩＳＡのものである。「＋」および「−」は、「ＥＬＩＳＡ」アッセイまたはマイクロアレイ（「アレイ」）解析のいずれかに基づいて、所与の血清がＫＬＨＬ１２自己抗体について陽性であったか陰性であったかを示す。接頭辞「Ｎ」を示した血清試料は健常個体由来のものであり、「ＰＢＣ」は原発性胆汁性肝硬変患者由来のものである。ＥＬＩＳＡアッセイによる自己抗体単位の計算は実施例２に詳述している。

【図3】図３：プロテオームマイクロアレイで以前に試験されていない新たなＰＢＣ患者コホートに対するＰＢＣ自己抗原ヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）のＥＬＩＳＡに基づく確認。グラフのデータはＥＬＩＳＡ解析からのＬｏｇ_２変換自己抗体単位である。ＥＬＩＳＡアッセイによる自己抗体単位の計算は実施例２に詳述している。患者試料は、実施例３に詳述したようにして計算したカットオフ値（赤い点線）に基づいてＨＫ１陰性または陽性で評点付けした。赤色の囲みの領域はＰＢＣコホートを示し、囲みなしの領域は正常コホートを示す。

【図4】図４：プロテオームマイクロアレイで以前に試験されていない新たなＰＢＣ患者コホートに対するＰＢＣ自己抗原Ｋｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）のＥＬＩＳＡに基づく確認。グラフのデータはＥＬＩＳＡ解析からのＬｏｇ_２変換自己抗体単位である。ＥＬＩＳＡアッセイによる自己抗体単位の計算は実施例２に詳述している。患者試料は、実施例３に詳述したようにして計算したカットオフ値（赤い点線）に基づいてＫＬＨＬ１２陰性または陽性で評点付けした。赤色の囲みの領域はＰＢＣコホートを示し、囲みなしの領域は正常コホートを示す。

【図5】図５：新たなＰＢＣ抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）陰性コホートでのＰＢＣ自己抗原ヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）の検出。グラフのデータは、実施例２において計算したＥＬＩＳＡ解析からのＬｏｇ_２変換自己抗体単位である。赤い点線は実施例３で先に決定した診断用評点閾値を示す。ＨＫ１により、１７名のＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者のうち４名が検出された（２４％鋭敏度）。注目すべきことに、１名のＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者（緑色のバー）はＨＫ１によって検出されたが、ＩＮＯＶＡ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＰＢＣ用のいずれの市販のＦＤＡ承認済ＥＬＩＳＡアッセイでも検出されなかった。

【図6】図６：新たなＰＢＣ抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）陰性コホートでのＰＢＣ自己抗原Ｋｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）の検出。グラフのデータは、実施例２において計算したＥＬＩＳＡ解析からのＬｏｇ_２変換自己抗体単位である。赤い点線は実施例３で先に決定した診断用評点閾値を示す。ＫＬＨＬ１２により、１７名のＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者のうち６名が検出された（３５％鋭敏度）。注目すべきことに、１名のＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者（緑色のバー）はＫＬＨＬ１２によって検出されたが、ＩＮＯＶＡ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＰＢＣ用のいずれの市販のＦＤＡ承認済ＥＬＩＳＡアッセイでも検出されなかった。

【図7】図７：ベン図 − 新規なＰＢＣ特異的自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２、これまでは検出不可能なＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者の捕捉。各数値は患者を表す。

【図8】図８：ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ’ｓ ＭＩＴ３アッセイに加えてヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）およびＫｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）の検出により、非定型間接免疫蛍光染色（ＩＩＦ）で多数のこれまで診断未確定のＰＢＣ患者が示され得る。接頭辞「Ｃｙｔｏ」または「ＮＭ」が示された血清試料は、それぞれ、散在性の細胞質または核膜ＩＩＦ染色を有する患者由来のものである。尺度影響を回避するため、各抗原のグラフのデータは、該抗原での最大自己抗体単位を有する患者（該患者を各抗原について青色矢印で表示する）に対するパーセントとして正規化したものである。本発明者らは、Ｙ軸を、ＩＮＯＶＡのＭＩＴ３カットオフ２５単位に設定し、これは１７％に相当する。グラフに示したバーはすべて、陽性結果を示し、バーがないものは陰性結果である。「高陽性」は、各自己抗原に対して選択された陽性対照血清である。

【図9A】図９Ａ：選択したＰＢＣ患者における比色ＥＬＩＳＡによるＨＫ１の検出−化学発光ＥＬＩＳＡ読出しとの合致。比色ＥＬＩＳＡの結果をバックグラウンド減算シグナルとしてプロットし、バックグラウンドは、発現ブランク（発現自己抗原なし）に対して実施した同じ血清である。化学発光ＥＬＩＳＡ評点は、Ｘ軸の下方に「＋」（陽性）または「−」（陰性）で示している。化学発光によるＥＬＩＳＡの評点は、既に実施例４で測定した同じ血清のものとした。緑色の輪郭のバーは、ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのすべての利用可能なＰＢＣ ＥＬＩＳＡアッセイでは先で陰性と評点付けされたがＨＫ１では陽性である実施例４（ＰＢ−ＡＭＮ−０４４）の同じ試料に対応する。

【図9B】図９Ｂ：選択したＰＢＣ患者における比色ＥＬＩＳＡによるＫＬＨＬ１２の検出−化学発光ＥＬＩＳＡ読出しとの合致。比色ＥＬＩＳＡの結果をバックグラウンド減算シグナルとしてプロットし、バックグラウンドは、発現ブランク（発現自己抗原なし）に対して実施した同じ血清である。化学発光ＥＬＩＳＡ評点は、Ｘ軸の下方に「＋」（陽性）または「−」（陰性）で示している。化学発光によるＥＬＩＳＡの評点は、既に実施例４で測定した同じ血清のものとした。緑色の輪郭のバーは、ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのすべての利用可能なＰＢＣ ＥＬＩＳＡアッセイでは先で陰性と評点付けされたがＫＬＨＬ１２では陽性である実施例４（ＰＢ−ＡＭＮ−２６３）の同じ試料に対応する。

【図10】図１０：ＰＢＣおよび正常患者の血清とプローブ結合させた（ｐｒｏｂｅｄ）ＰＢＣ自己抗原ＨＫ１の比色ドットブロット。新たに発見されたＰＢＣ自己抗原ＨＫ１、ならびにバッファー（陰性対照）およびヒトＩｇＧ（陽性対照）をニトロセルロース上にスポットした。ＰＢＣ患者および正常患者由来の希釈血清を結合させ、洗浄した後、コロイド状金標識抗ヒトＩｇＧを添加した。「ｈＩｇＧ」はヒトＩｇＧ陽性対照であり；「ＡＡｇ」は新たなＰＢＣ自己抗原ＨＫ１であり；「Ｃｔｒｌ」は陰性対照（担体バッファー）である。

【図11】図１１：Ｓｐ１００自己抗原およびＰＢＣ血清を用いたＴ^２−ＥＬＩＳＡと市販の（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＥＬＩＳＡとの比較。接頭辞「ＰＢＣ」を示した血清試料は、原発性胆汁性肝硬変患者由来ものである。赤色囲みの領域はＩＮＯＶＡ ＥＬＩＳＡの結果を表し；黄色の囲みの領域はＴ^２−ＥＬＩＳＡの結果を表す。^＊「低陽性」対照（赤線）より上の単位は、診断により陽性と評点付けされる。

【図12】図１２：癌血清中のｐ５３自己抗体の検出に対するＴ^２−ＥＬＩＳＡおよび慣用的なＥＬＩＳＡ（対比）。正常血清には接頭辞「Ｎ」を示し（緑色の囲み）、他はすべてＣＲＣ血清である。データは、該アッセイの最大限血清に対するパーセントとして正規化したものである。

【図13】図１３：種々の血清−抗原ペアに対する二重レポーターおよび単一レポーターのＴ^２−ＥＬＩＳＡアッセイ。グラフのデータはＥＬＩＳＡ解析による自己抗体単位である。ＥＬＩＳＡアッセイによる自己抗体単位の計算は実施例１２に詳述している。青字は抗原を表す。接頭辞「Ｎ」を示した血清試料は正常（健常個体由来）であり、「ＳＬＥ」は全身性エリテマトーデス、「ＰＢＣ」は原発性胆汁性肝硬変である。

【図14】図１４：ポリスチレンマイクロタイタープレート表面に直接コートした予備精製ヒトヘキソキナーゼ１自己抗原（ＨＫ１）を用いたＥＬＩＳＡにおける自己抗体の検出。予備精製した発現組換えタンパク質自己抗原を、ポリスチレンマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート表面に直接結合させ、患者の血清の自己抗体の存在についてのアッセイに使用した。先のマイクロアレイおよびＴ^２−ＥＬＩＳＡデータ（実施例１および２）に基づいて予測した結果を、Ｘ軸の下方に「＋」（自己抗体陽性）または「−」（自己抗体陰性）で示す。この実施例でのアッセイの実際の結果は、４つの予測陰性試料の平均より２標準偏差上として計算した棒グラフの評点付けカットオフ（赤色点線）に基づいて示している。

【図15】図１５：ポリスチレンマイクロタイタープレート表面に直接コートした予備精製ヒトＫｅｌｃｈ様１２自己抗原（ＫＬＨＬ１２）を用いたＥＬＩＳＡにおける自己抗体の検出。予備精製した発現組換えタンパク質自己抗原を、ポリスチレンマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート表面に直接結合させ、患者の血清の自己抗体の存在についてのアッセイに使用した。先のマイクロアレイおよびＴ^２−ＥＬＩＳＡデータ（実施例１および２）に基づいて予測した結果を、Ｘ軸の下方に「＋」（自己抗体陽性）または「−」（自己抗体陰性）で示す。この実施例でのアッセイの実際の結果は、４つの予測陰性試料の平均より２標準偏差上として計算した棒グラフの評点付けカットオフ（赤色点線）に基づいて示している。

【図16】図１６：９２例の相違する血清試料でのヒトヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）の場合での分位点正規化プロテオームマイクロアレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ）自己抗体データ。患者の各血清試料での自己抗体蛍光シグナル強度「アレイシグナル」（９２メンバーのマイクロアレイ全体において正規化した分位点は、各ロット基準で設定）を新規な自己抗原ヒトＨＫ１の場合について示す。ＰＢＣ＝原発性胆汁性肝硬変；正常またはＮｏｒｍ＝健常個体；ＳＬＥ＝全身性エリテマトーデス；ＳｊＳ＝シェーグレン症候群；ＣＲＣ＝結腸直腸癌；ＡＩＨ＝自己免疫性肝炎。

【図17】図１７：９２例の相違する血清試料でのヒトＫｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）の場合での分位点正規化プロテオームマイクロアレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ）自己抗体データ。患者の各血清試料での自己抗体蛍光シグナル強度「アレイシグナル」（９２メンバーのマイクロアレイ全体において正規化した分位点は、各ロット基準で設定）を新規な自己抗原ヒトＫＬＨＬ１２の場合について示す。ＰＢＣ＝原発性胆汁性肝硬変；正常またはＮｏｒｍ＝健常個体；ＳＬＥ＝全身性エリテマトーデス；ＳｊＳ＝シェーグレン症候群；ＣＲＣ＝結腸直腸癌；ＡＩＨ＝自己免疫性肝炎。

【発明を実施するための形態】

【0029】

実施例１：新規な原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）自己抗原のプロテオームマイクロアレイによる発見
マイクロアレイでの血清スクリーニング
患者の血清を、高い密度で二連でプリントされた約８，０００独自のヒト組換え（真核生物で発現）タンパク質で標準的な顕微鏡スライドのサイズの「チップ」に構成された市販のヒトプロテオームマイクロアレイ（Ｈｕｍａｎ ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）ｖ４．０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に対してスクリーニングした［Ｓｈｅｒｉｄａｎ（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：３−４］。マイクロアレイは、製造業者の使用説明書に従って使用した。マイクロアレイを、ＡｒｒａｙＷｏＲｘ^ｅ ＢｉｏＣｈｉｐ蛍光リーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ＬＬＣ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）において、適切な標準内蔵フィルターセットを用いて画像化した。画像解析およびデータ取得は、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ｖ６．１ソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を、マイクロアレイの製造業者（Ｈｕｍａｎ ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）ｖ４．０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の使用説明書に従って用いて行なった。

【0030】

アレイ型タンパク質（潜在的自己抗原）に対する自己抗体の存在を検出するため、正常個体および種々の疾患を有する患者由来の９２例の異なる血清試料を、個々にプロテオームマイクロアレイに対してスクリーニングした。このため、２つの異なるロットのマイクロアレイを２つの逐次試験で使用した。全患者集団の組成は以下のとおりとした：マイクロアレイロット＃１（８０独自の試料）−１８名の原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）患者対６２名の非ＰＢＣ対照試料［１３例の正常、２５例の結腸直腸癌（ＣＲＣ）、２２例の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、２例のシェーグレン症候群（ＳｊＳ）］。マイクロアレイロット＃２（１２独自の試料）−さらに３例のＰＢＣおよびさらに９例の非ＰＢＣ対照［４例の正常および５例の自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）］。正常血清は、ほぼ年齢と性別をＰＢＣコホートと適合させた。ＡＩＨ血清は、ＰＢＣと異なる自己免疫性肝臓疾患であるが、自己抗体と関連していることがわかっているため使用した。ＣＲＣ血清は、癌患者も、いわゆる腫瘍関連自己抗原（ＴＡＡ）、例えば、癌と自己免疫疾患の両方で観察される核の自己抗体の一般的なレパートリーに対する種々の自己抗体を有することがわかっているため使用した［Ｂｅｉ，Ｍａｓｕｅｌｌｉ，Ｐａｌｕｍｂｏ，ＭｏｄｅｓｔｉおよびＭｏｄｅｓｔｉ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ］。アーカイブ血清を、以下の供給源：本発明者らの共同研究者Ｄｏｎａｌｄ Ｂｌｏｃｈ博士，Ｍ．Ｄ．，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ａｓｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの貯蔵所から取得した（１２例のＳＬＥ血清ならびにＳｊＳおよびＰＢＣ血清をご提供頂いた）。残りのＳＬＥ血清およびＡＩＨ血清はすべて、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）製であり、正常血清はＰｒｏＭｅｄＤｘ、ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）製であり、ＣＲＣ血清はＡｓｔｅｒａｎｄ Ｉｎｃ．（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）製であった。

【0031】

マイクロアレイデータの生物統計学的解析
マイクロアレイデータから自己抗原バイオマーカーを特定するため、使用した生物統計学的方法は、マイクロアレイの製造業者によって提供された、Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＩＲＰ）アドオンを使用する、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ ｖ４．０ソフトウェアパッケージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の形態の標準的なアプローチとした［Ｈｕｄｓｏｎ、Ｐｏｚｄｎｙａｋｏｖａ、Ｈａｉｎｅｓ、ＭｏｒおよびＳｎｙｄｅｒ（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４：１７４９４−９］。このソフトウェアパッケージの生物統計学的方法のうち２つを使用し、２つの対応するＰＢＣ自己抗原リストを以下のようにして作成した。

【0032】

「ヒットコーリング」自己抗原リスト：データをバイナリー形式に変換するため、各マイクロアレイ（１血清／マイクロアレイ）上のタンパク質（すなわち、潜在的自己抗原）を、「ヒット」（すなわち、陽性）であるか、ヒットでないか（すなわち、陰性）で評点付けした。自己抗原ヒットを、マイクロアレイ平均の３標準偏差上のカットオフ閾値でＺ−評点を用いてマイクロアレイ毎にコールした。各自己抗原でのＰＢＣ群および対照群のヒット数を使用し、各自己抗原の存在パーセントを調べた。最終的にこのリストに載せる自己抗原は、ＰＢＣコホートにおいて対照コホート（すなわち、すべての非ＰＢＣ試料）よりも大きな存在パーセントを有するものでなければならなかった。

【0033】

Ｍ−統計解析自己抗原リスト：このアプローチでは、分位点正規化マイクロアレイデータを使用し、各タンパク質について２つの患者群（すなわち、ＰＢＣ群と、すべての非ＰＢＣ患者に対応する対照群）間のペアワイズｔ−検定を行なう。また、このアルゴリズムでは、分位点正規化データによって設定されたカットオフに基づいて自己抗原の存在率が推定される。最終的にこのリストに載せる自己抗原は、ＰＢＣコホートにおいて対照コホート（すなわち、すべての非ＰＢＣ試料）よりも大きな存在パーセントを有するものでなければならず、＜０．１のＭ−統計解析ｐ値を有するものでなければならなかった。

【0034】

マイクロアレイロット＃１および２を別々に解析した。マイクロアレイ由来ＰＢＣ自己抗原の単一の最終リストを構成するため、マイクロアレイロット＃１（のみ）についての前述の生物統計学的リストの両方に重複して観察されたものを採用した。次に、この編集リストにおいて、「ヒットコーリング」法での測定時にＡＩＨ患者（マイクロアレイロット＃２）のいずれかにおいて陽性であったマーカーはいずれも除外した。次いで、最後に、Ｍ−統計解析ｐ値ならびに診断鋭敏度および特異性に基づいてリストに優先順位をつけた。

【0035】

結果：
プロテオームマイクロアレイから特定し、本特許において請求項に記載した２つのＰＢＣ自己抗原マーカー、ヒトヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）およびヒトＫｅｌｃｈ−Ｌｉｋｅ １２（ＫＬＨＬ１２）を、そのＭ−統計解析ｐ値ならびにその診断の感度および特異性（マイクロアレイロット＃１から計算）とともに表Ｉに示す。ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２について、すべての９２例の試料（すなわち、９２個のマイクロアレイすべて）の分位点正規化マイクロアレイデータ（正規化自己抗体シグナル強度）を、それぞれ、図１６および図１７に示す。要約すると（表Ｉ）、いずれかの自己抗原に対する血清自己抗体の存在は、ＰＢＣコホートと強く相関しており、高度に有意なｐ値（それぞれ、ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２で１×１０^−１０および８×１０^−５）ならびにそれぞれ、ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２で８５〜８９％および３３〜４０％の感度、ならびにそれぞれ、ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２で８４〜９０％および９７〜９８％の特異性が示されている（詳細については表Ｉ参照）。定義（この実施例で上記の「マイクロアレイデータの生物統計学的解析」参照）により、５例の自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）血清はいずれもＨＫ１またはＫＬＨＬ１２について陽性でなかった（また、図１６および図１７も参照のこと；マイクロアレイロット＃２）。また、ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２自己抗原バイオマーカーは、他の実験の実施例で詳述するように、さらなる確認の主体でもあった。

【0036】

また、ＨＫ１自己抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および結腸直腸癌（ＣＲＣ）においても低存在率で観察されることにも注意のこと（図１６）。Ｎ−０３は、ＨＫ１について陽性である唯一の「正常」血清試料である（図１６；赤色バー）。また、Ｎ−０３は、ＫＬＨＬ１２について陽性である唯一の「正常」血清試料でもある（図１７；赤色バー）。したがって、実際には、Ｎ−０３が、実際には、まだ診断されていない、または報告されていない／記録されていないＰＢＣを有する可能性があると考えられる（自己抗体により、自己免疫疾患（ＰＢＣなど）の臨床症状／徴候が事前に示されることが示されていることに注意のこと）。

【0037】

実施例２：ＥＬＩＳＡを用いた新規な原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２の予備確認
本明細書において本実施例に記載し、多くの後続の実施例で使用するＥＬＩＳＡアッセイは、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡと称され、二重エピトープタグ化無細胞発現タンパク質抗原の使用に基づいたものであることに注意のこと。この実施例では、該抗原をＨＫ１およびＫＬＨＬ１２とし、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡをこのマイクロアレイ由来新規な自己抗原の臨床的予備確認（および最終的に、後の実施例での確認）のためのツールとして使用する。

【0038】

自己抗原の発現
ヒトＨＫ１およびＫＬＨＬ１２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を、標準的で認知された分子生物学的実務手段を用いて、ＯＲＦ挿入物に加えて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｋｏｚａｋ（リボソーム結合）配列、開始コドン、Ｎ末端ＶＳＶ−Ｇエピトープタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、およびＣ末端ＨＳＶエピトープタグ（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）を含む無細胞タンパク質発現に適合性のプラスミドベクター内にクローニングした。発現ベクター内へのクローニングのための供給源ＤＮＡとして、完全長配列確認クローンをＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入した［ＨＫ１には、カタログＯＨＳ１７７０−９３８１０２１（ＵｎｉＧｅｎｅ Ｈｓ．３７０３６５）、ＫＬＨＬ１２にはＭＨＳ１０１１−６１２１１（ＵｎｉＧｅｎｅ Ｈｓ．７０６７９３）］。発現ベクターを正しいＯＲＦ挿入物について、標準的なＥｃｏＲＩ消化方法および／またはＤＮＡ配列決定を用いて確認した。

【0039】

自己抗原は、上述のプラスミドクローンから無細胞タンパク質発現によって作製した。無細胞タンパク質発現反応は、ウサギ網状赤血球ライセート系（ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ ｆｏｒ ＰＣＲ ＤＮＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と組みにした転写／翻訳を、製造業者の使用説明書に従って用いて行なった。自己抗原発現反応には、対応するプラスミドＤＮＡを含めたが、ブランク発現反応では、プラスミドＤＮＡのみを無しとした。発現反応は、ＴＤＢ［１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）］中で１／２０に希釈することにより停止させた。

【0040】

自己抗原の二重タグ酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ ９６ウェルＰｏｌｙｓｏｒｐ（商標） Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（商標）白色不透明で平底の未処理のポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、サンドイッチ型酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した。プレートを、０．５μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗ＨＳＶ（登録商標）タグ捕捉抗体（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（炭酸／重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．３）中）で、振盪しながら３０分間コートした（５０μＬ／ウェル）。次いで、ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ Ｒｏｂｏｔｉｃ Ｐｌａｔｅ Ｗａｓｈｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）において、プレートをＴＢＳ−Ｔ中で６回洗浄した（ウェルを最大限まで満たす）。プレートの洗浄はすべて、特に記載のない限り、この様式で行なった。次いで、プレートを３００μＬ／ウェルで１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ中で３０分間ブロックした。この溶液をプレートから取り出し、上述の停止（すなわち、希釈）無細胞発現反応液（自己抗原およびブランク反応液）を次いで、１００μＬ／ウェルで添加し、３０分間振盪した。プレートを洗浄し、血清試料（１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ中で１／１，０００に希釈）を１００μＬ／ウェルで添加し、３０分間振盪した。各血清試料は、三連ウェルの自己抗原および三連ウェルの無細胞発現ブランクに対して実験した。さらに、一組の三連ウェルの自己抗原と一組の三連ウェルの無細胞発現ブランクを、ＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出用に指定し、したがって、希釈血清の代わりにそのままの１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔを加えた。ロボット型プレート洗浄機へのヒト血清の混入を回避するため、続いて、プレートを、ＴＢＳ−Ｔの手作業の添加によって４回洗浄した（ウェルを最大限まで満たす）後、真空吸引し、次いで、ロボット型プレート洗浄機で、この実施例で先に記載のようにして６回洗浄した。ＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出用に指定したウェルに、次いで、抗ＶＳＶ−Ｇホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｐ５Ｄ４、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１／２０，０００に希釈）を加えた。血清自己抗体の検出用に指定したウェルには、マウス抗［ヒトＩｇＧ］ＨＲＰ標識モノクローナル二次抗体（マウス免疫グロブリンとの交差反応性は最小限；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１／２０，０００に希釈）を加えた。プレートを３０分間振盪した。次いで、この溶液を、プレートを反転させた後、反転させたプレートをドライペーパータオル上で激しくたたいて残留液を除去することによって、プレートから手作業で放出した。次いで、プレートをロボット型プレート洗浄機で、この実施例で先に記載のようにして洗浄した。化学発光シグナルを、５０μＬ／ウェルのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのＰｉｅｒｃｅ Ｂｒａｎｄ）の添加によって生成させた。プレートを１５分間振盪することにより発色させ、次いで、ＬｕｍｉＣｏｕｎｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー（１秒間の露光、６５０ＶのＰＭＴ、ゲイン１）（Ｐａｃｋａｒｄ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）において読取りを行なった。

【0041】

結果：
表Ｉに示した新たなＰＢＣ自己抗原マーカーのこの予備確認では、マイクロアレイ解析（実施例１参照）で所与の自己抗原について陽性または陰性と検出された無作為に選択した血清を、ここでは、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡでも解析した。

【0042】

Ｔ^２−ＥＬＩＳＡによる自己抗体単位の計算は、手短に言うと、データからバックグラウンドを減算し、各アッセイ（すなわち、各プレート）の各抗原について一般的なＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出に対して正規化することにより行なった。より詳しくは、各血清−自己抗原ペアについて、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡデータの三連ウェルの各々について、自己抗体単位は、以下のようにして計算した：［１つのウェル（すなわち、血清と自己抗原（対比）の自己抗体シグナル）］−［三連（すなわち、同じ血清と３つのすべてのブランク発現ウェルの平均（対比）の平均バックグラウンド）］により、各血清−自己抗原ペアでの三連バックグラウンド減算値（ＢＳＶ）が得られる。１つのアッセイは、１つの９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートと定義していることに注意のこと。各自己抗原のアッセイ間分散（日にち毎およびアッセイ毎）を正規化するため、各アッセイのウェルを該アッセイでの各自己抗原に対して、一般的なＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出のために単独で専用にした。ＶＳＶ−Ｇ正規化係数（ＶＮＦ）を以下のようにして計算した：［三連ウェル（すなわち、ＶＳＶ−Ｇ抗体をプローブ結合させた自己抗原ウェル）の平均ＶＳＶ−Ｇシグナル］−［三連ウェル（すなわち、ＶＳＶ−Ｇ抗体をプローブ結合させたブランク発現ウェルの平均ＶＳＶ−Ｇバックグラウンド］。次いで、アッセイ毎に、すべての血清−自己抗原ペアでの三連ＢＳＶを該アッセイのＶＮＦで除算し、１００を乗算し、各血清−自己抗原ペアでの三連自己抗体単位値を得た（すなわち、ＶＮＦのパーセントで表示）。自己抗体単位に対してゼロフロアを設定したことに注意のこと。平均および標準偏差（エラーバー）を計算し、新たなＰＢＣ自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２について、それぞれ、図１および２においてプロットした。

【0043】

マイクロアレイとの合致を確認するため、血清をＴ^２−ＥＬＩＳＡでの陽性または陰性として「解析により」評点付けした。このためには、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡで解析により陽性と評点付けされた各血清−自己抗原ペアについて、以下：ｉ）バックグラウンド（すなわち、同じ血清とブランク発現ウェル（対比））と比べて三連ウェルの自己抗体シグナル（すなわち、血清と自己抗原（対比））の未加工Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ値の片側等分散対応なしのｔ−検定において≦０．０５のｐ値；ｉｉ）自己抗体の≧２の信号対バックグラウンド比の両方の基準が満たされていなければならなかった。図１および２において、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ評点およびマイクロアレイ（「アレイ」）評点を陽性（＋）または陰性（−）で表す。ＨＫ１（図１）では、マイクロアレイ解析で陽性であった１２例の無作為に選択した血清のうち、１０例がＥＬＩＳＡで陽性であり８３％の合致であった。さらに、ＨＫ１（図１）では、マイクロアレイで陰性であった５例の血清を無作為に選択し、そのすべてが、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡでも陰性であり、１００％の合致であった。ＫＬＨＬ１２では、マイクロアレイ解析（実施例１参照）から無作為に選択した７例の陰性および４例の陽性血清のうち、図２に示すＴ^２−ＥＬＩＳＡの結果と完全に１００％の合致がみられた。

【0044】

実施例３：事前にマイクロアレイによってスクリーニングしていない新たなＡＭＡ陽性ＰＢＣ患者コホートにおいてＥＬＩＳＡを用いた、新規な原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２の確認
自己抗原の発現
実施例２の場合と同様。

【0045】

自己抗原の二重タグ酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
実施例２の場合と同様。

【0046】

結果：
新たに発見された該マーカーの重要な確認は、プロテオームマイクロアレイで事前にスクリーニングしていない新たな患者コホート（２２例のＰＢＣ試料）において試験を行なうことである。この実施例では、これを、新たなＰＢＣ自己抗原ＨＫ１とＫＬＨＬ１２（表Ｉに先に記載）の両方を用いて行なった。

【0047】

新たなＰＢＣ血清は、本発明者らの共同研究者Ｄｏｎａｌｄ Ｂｌｏｃｈ博士、Ｍ．Ｄ．，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ａｓｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから取得したものであり、正常血清はＰｒｏＭｅｄＤｘ、ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）のものとした。

【0048】

Ｔ^２−ＥＬＩＳＡによる自己抗体単位の計算は、手短に言うと、データからバックグラウンドを減算し、各アッセイ（すなわち、各プレート）の陽性対照に対して正規化することにより行なった。このとき、陽性対照を１，０００自己抗体単位に設定する。より詳しくは、各血清−自己抗原ペアについて、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡデータの三連ウェルの各々について、自己抗体単位は、以下のようにして計算した：［１つのウェル（すなわち、血清と自己抗原（対比）の自己抗体シグナル）］−［三連（すなわち、同じ血清と３つのすべてのブランク発現ウェルの平均（対比）の平均バックグラウンド）］。これにより、各血清−自己抗原ペアでの三連バックグラウンド減算値（ＢＳＶ）が得られる。１つのアッセイは、１つの９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートと定義していることに注意のこと。各自己抗原のアッセイ間分散（日にち毎およびアッセイ毎）を正規化するため、ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２について一般的な陽性対照ＰＢＣ血清をアッセイ毎に実験した（実施例１のマイクロアレイＰＢＣコホートから選択）。陽性対照のＴ^２−ＥＬＩＳＡデータを上述の様式でアッセイ毎に処理し、三連ＢＳＶを平均して各アッセイでの陽性対照正規化係数（ＰＣＮＦ）を得た。アッセイ毎に、すべての血清−自己抗原ペアでの三連ＢＳＶを、次いで、該アッセイのＰＣＮＦで除算し、１，０００を乗算し、各血清−自己抗原ペアでの三連自己抗体単位値を得た。重要なことに、ＶＳＶ−Ｇの一般的なエピトープタグの検出（実施例２）は、成功裡で一貫性のある自己抗原発現を検証するのになお使用されたが、自己抗体単位の計算において、ここでは使用しなかった。

【0049】

所与の自己抗原に対する診断用評点閾値を設定するため、２２例の正常患者血清の群においてＴ^２−ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、そのときのカットオフを、約９５％の統計学的信頼性になるように、この正常コホートの平均の２標準偏差上に設定した。２〜３標準偏差でのこの方法の使用は一般的な実務である（例えば、［Ｌｉｕ、Ｗａｎｇ、Ｌｉ、Ｘｕ、Ｄａｉ、ＷａｎｇおよびＺｈａｎｇ（２００９）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６９：５７−６３］）。しかしながら、この標準偏差に基づくカットオフ計算法の重要な要件は、データがガウス分布に従うことであるが、正常性に関するシャピロ・ウイルク検定で測定したこれは該当しなかった。解決策として、本発明者らは、自己抗体単位をｌｏｇ_２変換し、フロアを０に設定して（すなわち、≦０の非変換値は変換せずに０のままにして）ガウス分布（＞０の値）を得、カットオフが上述の標準偏差方法論に基づいて設定されることを可能にした。自己抗体単位の計算でバックグラウンド減算を使用しており、≦０の値をもたらす患者試料は、定義により、関係なく自己抗体陰性と評点付けしなければならない（すなわち、カットオフは必要とされず、≦０の値にも該当しない）ことを意味するため、≦０の自己抗体単位値はカットオフ計算から除外した。

【0050】

ＨＫ１についての図３のデータからわかるように、２．０のカットオフを使用すると、この新たな試料コホートにおける８２％診断鋭敏度（１００％特異性）は、最初の試料コホートにおいて行なったマイクロアレイ解析と良好に整合している（表Ｉ参照）。ＫＬＨＬ１２についての図４のデータからわかるように、２．５のカットオフを使用すると、この新たな試料コホートにおける３６％診断鋭敏度（１００％特異性）は、最初の試料コホートにおいて行なったマイクロアレイ解析と良好に整合している（表Ｉ参照）。
実施例４：事前にマイクロアレイによってスクリーニングしていない新たな抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）陰性ＰＢＣ患者コホートにおいてＥＬＩＳＡを用いた新規な原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２の確認
ＰＢＣが疑われるが抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）陰性状態を有する患者は、全ＰＢＣ患者のおよそ５〜２０％を構成するが［Ｏｅｒｔｅｌｔ、Ｒｉｅｇｅｒら Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００７；４５：６５９−６６５］、ＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者は、血清検査に基づいて診断により確認することが特に困難である。既知および確認済の自己抗原Ｓｐ１００およびｇｐ２１０を使用した場合のみ、少数割合のＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者の検出がもたらされ（例えば、最近の試験の一例では１７〜３３％［Ｌｉｕ、Ｓｈｉ、Ｚｈａｎｇ、ＺｈａｎｇおよびＧａｏ（２００８）Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ ２８：２３３−９］）、これは、ＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者を検出することができる特異的自己抗原の必要性を示す。

【0051】

本発明者らの新規な自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２がＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者を検出できる能力を試験するため、本発明者らは、間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）ではＡＭＡ陰性であるが、慣用的な方法［Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ（２０００）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３１：１００５−１３］および肝臓生検により確認済のＰＢＣを有する１７例の患者血清を使用した。新たなＡＭＡ陰性ＰＢＣ血清は、本発明者らの共同研究者Ｄｏｎａｌｄ Ｂｌｏｃｈ博士、Ｍ．Ｄ．，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ａｓｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから取得したものであった。本発明者らは、本発明者らの新規な自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２の能力を、利用可能な市販の試験体と比較し、確認済のＰＢＣを有するがＡＭＡ陰性状態が既知であるこのような患者を検出した。

【0052】

自己抗原の発現
実施例２の場合と同様。

【0053】

自己抗原の二重タグ酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
実施例２の場合と同様。

【0054】

ＦＤＡ承認済の市販のＰＢＣ ＥＬＩＳＡ
また、ＰＢＣ診断のためのＦＤＡ承認済の市販のＥＬＩＳＡも実施し、これらは、Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） Ｍ２ ＥＰ（ＭＩＴ３）、Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） ｓｐ１００、Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） ｇｐ２１０およびＱｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） ＰＢＣ Ｓｃｒｅｅｎ ＩｇＧ／ＩｇＡアッセイ（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製）であり；製造業者の使用説明書に従って行なった。

【0055】

結果：
評点付けの目的のため、自己抗体単位の計算および実施例３で確立した診断閾値をもう一度、ここで、各自己抗原（ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２）に対して使用した。

【0056】

ＨＫ１についての図５のデータによって示されるように、１７例のＡＭＡ陰性ＰＢＣ血清のうち４例が、この自己抗原について試験結果が陽性であった（２４％感度）。ＫＬＨＬ１２についての図６のデータからわかるように、１７例のＡＭＡ陰性ＰＢＣ血清のうち６例が、診断による試験結果が陽性であった（３５％感度）。また、本発明者らは、上述の１７例のＡＭＡ陰性ＰＢＣ血清を、４つのすべてのＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の市販のＦＤＡ承認済ＰＢＣ試験、すなわち、Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） Ｍ２ ＥＰ（ＭＩＴ３）、Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） ｓｐ１００、Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） ｇｐ２１０およびＱｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） ＰＢＣ Ｓｃｒｅｅｎ ＩｇＧ／ＩｇＡ ＥＬＩＳＡでも試験した。ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２でのこれらの試験の結果ならびに本発明者らのＴ^２−ＥＬＩＳＡの結果を表ＩＩにまとめる。ＩＮＯＶＡの試験では、１７名の患者のうち３名（１８％）を検出することができなかった。しかしながら、驚くべきことに、ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２では各々、先の検出不可能だったＡＭＡ陰性ＰＢＣ血清（それぞれ、ＰＢ−ＡＭＮ−０４４およびＰＢ−ＡＭＮ−２６３）を検出することができた。第３の患者（ＰＢ−ＡＭＮ−０８４）は、上述の自己抗原でも検出されないままであったが、Ｓｐ１４０では検出された（詳細については実施例６参照）。これらの結果を図７にベン図としてまとめると、種々のバイオマーカー間に重複が示される（か、またはそれがない）。Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） ＰＢＣ Ｓｃｒｅｅｎ ＩｇＧ／ＩｇＡ ＥＬＩＳＡの結果は、ベン図（図７）に示されていないことに注意のこと。しかしながら、表ＩＩにおいてわかるように、このアッセイでは、その他のＩＮＯＶＡアッセイと比べて検出は増大しなかった。総合すると、このような所見は、本発明者らの２つの新規な自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２は、診断に非常に有意であることを示す。本発明者らの新規なバイオマーカーを既存のＰＢＣバイオマーカーパネルに加えることにより、検出の改善がもたらされ得、したがって、ＰＢＣ患者、特にＡＭＡ陰性ＰＢＣ患者の早期処置および転帰の改善がもたらされ得ることが示唆される。

【0057】

実施例５：非定型間接免疫蛍光（ＩＩＦ）染色による患者でのＨＫ１およびＫＬＨＬ１２の評価
間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）で測定したときの明確なＡＭＡ染色または適正な抗核の自己抗体（ＡＮＡ）染色パターンがなく、ＰＢＣの最終診断を導くことが極めて困難であるため、本発明者らは、ＰＢＣ患者の数は、これまでに疑わしいとされている数よりも多い可能性があると提案する。この理論を試験するため、本発明者らは、散在性の細胞質または核膜ＩＩＦ染色パターンを有する診断未確定の患者由来の血清を調べた。この新たな患者の血清は、本発明者らの共同研究者Ｄｏｎａｌｄ Ｂｌｏｃｈ博士、Ｍ．Ｄ．，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ａｓｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから取得したものであった。

【0058】

自己抗原の発現
実施例２の場合と同様。

【0059】

自己抗原の二重タグ酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
実施例２の場合と同様。

【0060】

Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） Ｍ２ ＥＰ（ＭＩＴ３）ＥＬＩＳＡ
アッセイは、製造業者の使用説明書（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って行なった。

【0061】

結果：
本発明者らは、ＨＫ１、ＫＬＨＬ１２およびＭ２ ＥＰ（ＭＩＴ３）Ｑｕａｎｔａ Ｌｉｔｅ（商標） Ａｓｓａｙ（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を２０名の患者において実施し、その結果を図８に示す。接頭辞「Ｃｙｔｏ」または「ＮＭ」が示された血清試料は、それぞれ、散在性の細胞質または核膜ＩＩＦ染色を有する患者由来のものである。ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２において実行したＴ^２−ＥＬＩＳＡの自己抗体単位の計算は、実施例２の場合と同様にして行なった。Ｔ^２−ＥＬＩＳＡアッセイでの評点付けは、実施例２に記載の「解析」方法に従って行なった（図８のグラフのバーの血清試料はいずれも陽性であることに注意のこと）。尺度影響を回避するため、図８の各抗原のグラフのデータは、該抗原での最大自己抗体単位を有する患者（該患者を各抗原について青色矢印で表示する）のパーセントとして正規化したものである。本発明者らは、Ｙ軸を、ＩＮＯＶＡのＭＩＴ３カットオフ２５単位に設定した（低い陽性対照に基づいて；カットオフは製造業者の使用説明書どおりに決定）、これは１７％に相当し、そのため、表示されたバーはすべて、陽性結果を示す。

【0062】

１名の患者は、３つのすべてのマーカーによって検出される。新規な自己抗原ＫＬＨＬ１２では、他のマーカーでは検出されない２名の核膜患者が検出される。最後に、ＭＩＴ３では、他のマーカーでは検出されない１名の核膜患者および数名の細胞質患者が検出される。これらの結果は、ＨＫ１、ＫＬＨＬ１２およびＭＩＴ３抗原の検出により、ＰＢＣに苦しんでいるがＩＩＦ染色が非定型である、これまで診断未確定の多数の患者を明らかにするのに有用であり得ることを強く示唆する。

【0063】

実施例６：Ｓｐ１４０の検出による原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）のＥＬＩＳＡによる診断鋭敏度の改善
５〜２０個の核内点状構造と反応する抗核抗体が、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の患者の２０〜３０％において検出される。「多数の核内点状構造」（ＭＮＤ）染色パターンは、前骨髄球性白血病タンパク質核小体（ＰＭＬ ＮＢ）成分に指向されるこのような抗体によってもたらされ、該成分のうち１つは、最近、Ｓｐ１４０と特定された。Ｓｐ１４０は、ＰＢＣ患者の１３％に存在し、ＡＭＡ陽性ＰＢＣ患者と比べて大部分がＡＭＡ陰性患者に存在している（８％に対して５３％）と報告されている［Ｇｒａｎｉｔｏ、Ａ、Ｙａｎｇ、Ｗ．ら、２００９、Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ］。したがって、本発明者らは、本発明者らのＴ^２−ＥＬＩＳＡにおいてＳｐ１４０を試験した。

【0064】

ＰＢＣ患者の血清は、本発明者らの共同研究者Ｄｏｎａｌｄ Ｂｌｏｃｈ博士、Ｍ．Ｄ．，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ａｓｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから取得したものであった。Ｓｐ１４０の状態は、最初に、ＩＩＦによってＳｐ１４０発現細胞と陰性細胞（対比）において測定された。

【0065】

自己抗原の発現
実施例２の場合と同様。

【0066】

自己抗原の二重タグ酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
実施例２の場合と同様。

【0067】

ＱＵＡＮＴＡ Ｌｉｔｅ（商標） Ｓｐ１００ ＥＬＩＳＡ アッセイは、製造業者の使用説明書（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って行なった。

【0068】

結果：
Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ自己抗体単位の計算および「解析による」評点付けは実施例２の場合と同様にして行なった。ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｐ１００ ＥＬＩＳＡの評点付けは、製造業者の使用説明書に従って行なった。結果は表ＩＩＩである。注目すべきことに、Ｓｐ１００は、本発明者らのＴ^２−ＥＬＩＳＡまたはＩＮＯＶＡのアッセイのいずれかでは、ＰＢＣ患者ＰＢ−ＡＭＰ−０２０またはＰＢ−ＡＭＮ−０８４（オレンジ色の斜線部）において検出され得なかったが、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ基本型では、Ｓｐ１４０自己抗原を用いてこれらのＰＢＣ患者を検出することができた。ＰＢ−ＡＭＮ−０８４の検出は、この患者が、以下：Ｓｐ１４０間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）法（図示せず）、任意のＩＮＯＶＡの利用可能なＰＢＣ ＥＬＩＳＡ試験、またはＴ^２−ＥＬＩＳＡによって測定された新規な自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２のいずれかのいずれによっても検出され得なかった（これらのＥＬＩＳＡの結果については先の実施例４および表ＩＩを参照のこと）ため、最も注目に値する。

【0069】

そのため、総合すると、ＨＫ１、ＫＬＨＬ１２およびＳｐ１４０は、強力な診断の自己抗原パネルとしての機能を果たし得、これにより、これまで見逃されていたＰＢＣ患者の迅速で正確な診断が可能になる。

【0070】

また、この実施例は、Ｓｐ１００に関して、本発明者らのＴ^２−ＥＬＩＳＡ基本型は、ＩＮＯＶＡのＦＤＡ承認済Ｓｐ１００ ＥＬＩＳＡと本質的に１００％合致しているという別の重要な結果を示す。合致しない唯一の結果はＴ^２−ＥＬＩＳＡにより陰性結果が得られた場合と、ＩＮＯＶＡアッセイによりあいまいな結果（これは、ＩＮＯＶＡの指定カットオフに近すぎて結論（製造業者の評点付け方法どおりの）が出せない）が得られた場合の２つであった。

【0071】

実施例７：ＰＢＣ患者の血清を用いた新規な原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２に対する自己抗体の比色検出と化学発光ＥＬＩＳＡ検出（対比）
自己抗原と自己抗体間の結合を利用するＥＬＩＳＡ実験では、通常、２つの検出ストラテジーのうちの１つが使用される。化学発光は、一般的に、感度が高い方、およびダイナミックレンジがより広い方であると認知されており、一方、比色は、一般的に、より安定で一貫性のある方と認知されている。この実験の目的は、厳密に同じ実験を２回行ない、次いで、１つは比色検出、１つは化学発光による検出でパラレルで発色させることであった。

【0072】

自己抗原の発現およびＴ^２−ＥＬＩＳＡ
比色ＥＬＩＳＡ検出では、ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＱＵＡＮＴＡ Ｌｉｔｅ（商標） ＥＬＩＳＡ基本型（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の以下の試薬：ＨＲＰ試料希釈剤、ＨＲＰ洗浄濃縮液、ＨＲＰ ＩｇＧコンジュゲート、ＴＭＢ色原体、ＨＲＰ停止溶液を使用したこと以外は、実施例２の場合と同様にして行なう。製造業者による使用説明書に従った。化学発光によるＥＬＩＳＡの診断用評点付けは、同じ血清について実施例４で既に測定されたものとした。

【0073】

結果：
ＰＢＣ患者由来の血清でのＨＫ１のＥＬＩＳＡの結果を図９Ａに示し、ＫＬＨＬ１２の結果を図９Ｂに示し、比色および化学発光の両方による検出を示す。比色アッセイの結果は、バックグラウンド減算シグナルとしてプロットしており、バックグラウンドは、発現ブランク（自己抗原の発現なし）に対して実施した同じ血清である。化学発光ＥＬＩＳＡ評点は、Ｘ軸の下方に「＋」（陽性）または「−」（陰性）で示している。化学発光によるＥＬＩＳＡの評点は、既に実施例４で測定した同じ血清のものであることに注意のこと（血清ＰＢ−ＡＭＮ−０４４およびＰＢ−ＡＭＮ−２６３（図９ＡおよびＢの緑色の輪郭）は、ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのすべての利用可能なＰＢＣ ＥＬＩＳＡアッセイでは先で陰性と評点付けされたがそれぞれＨＫ１およびＫＬＨＬ１２では陽性のものである）。これらの結果は、化学発光による読出し法と比色ＥＬＩＳＡ読出し法との合致を明白に示す。

【0074】

実施例８：ポイント・オブ・ケア診断法の実現可能性−ＰＢＣ患者の血清を用いた新規な原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）自己抗原ＨＫ１に対する自己抗体の比色ドットブロット検出
この実施例の目的は、自己免疫疾患のポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）自己抗体に基づく診断のアッセイ（すなわち、医師の診療所で、例えば、内科医、一般的な医師またはリウマチ専門医によって迅速かつ容易に行なわれるアッセイ）における自己抗原の使用のための原理証明を示すことである。

【0075】

ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）診断のための固相イムノアッセイの一般的な形式の一例は、多孔質固相膜マトリックス（ニトロセルロースなど）で行なわれる側方流動型免疫クロマトグラフィー方法である。例えば、血液試料ならびに比色標識検出試薬（一般的には、コロイド状金標識）をニトロセルロース細片の長さ方向に毛管作用によって流動させ、続いて、例えば、抗原、捕捉抗体または他の捕捉剤を事前に固定化（すなわち、縞模様に）させておいた試験領域に接触させる。陽性結果は、試験領域内で着色縞模様として可視化される。

【0076】

かかるアッセイの最も広く認識されている形態は「自宅」妊娠検査であるが、ヒト血液中の抗体を迅速に検出するための（例えば、病原体感染の検出のための）種々の形式が可能である［Ｂｉａｇｉｎｉ、Ｓａｍｍｏｎｓ、Ｓｍｉｔｈ、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ、Ｓｔｒｉｌｅｙ、Ｓｎａｗｄｅｒ、ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＱｕｉｎｎ（２００６）Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：５４１−６；Ｌａｄｅｒｍａｎ、Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ、Ｄｕｍａｕａｌ、Ｊｏｎｅｓ、Ｈｕｄａｋ、Ｈｏｇｒｅｆｅ、ＣａｒｎｅｙおよびＧｒｏｅｎ（２００８）Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：１５９−６３］。

【0077】

この型のデバイスを模倣し、本特許において報告する新たなＰＢＣ自己抗原ＨＫ１での実現可能性を示すため、ドットブロットアッセイを行なった。このアッセイでは、自己抗原をニトロセルロース膜上に固定化させ、次いで、これを患者の血清とプローブ結合させた。結合された自己抗体の検出は、コロイド状金標識抗ヒトＩｇＧ検出抗体を用いて行なわれる。手順の詳細および結果は以下のとおりである。

【0078】

自己抗原の比色ドットブロット
組換え精製ヒトヘキソキナーゼ１タンパク質（ＨＫ−１、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）を、ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ）中で２００ｎｇ／μＬに希釈した。ヒトＩｇＧを、ＰＢＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で２５０ｎｇ／μＬに希釈した。

【0079】

ニトロセルロース（ＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を切断して０．５ｃｍ×３ｃｍの細片を形成した。各々１μＬのＴＢＳ、ＨＫ１およびヒトＩｇＧをニトロセルロース上に個々にスポットし、３７℃で１時間のインキュベーションによって充分に乾燥させた。次いで、細片をブロックバッファー［１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）］中で室温（ＲＴ）にて３０分間処理した。ブロック液を真空吸引した。患者の血清をブロック液中で１：１００に希釈し、次いで、ニトロセルロース細片とともに室温で３０分間インキュベートした。血清を吸引し、細片を各々、１．５ｍＬのＴＢＳ−Ｔ：４×５分間で洗浄した。

【0080】

細片を、ブロック液中で１：１０に希釈したコロイド状金コンジュゲート二次抗体［抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、金標識（４０ｎｍ）、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ］と、振盪しながら室温で３時間プローブ結合させた。

【0081】

結果：
側方流動イムノアッセイにより、簡単、正確かつ高速な結果報告および易使用性の形式がもたらされ、したがって、好評なポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）診断の基本型である。側方流動系デバイスは、免疫クロマトグラフィー原理を用いて生体液（血液など）を種々の解析物について、ものの数分で「現場」条件下で特別な機器も専門知識もなしでアッセイするものである。ＰＢＣ自己抗原の比色側方流動ＰＯＣアッセイの実現可能性を試験するため、本発明者らは、モデルドットブロット実験を行なった。

【0082】

組換え精製ヒトＨＫ１、ならびに担体バッファー（陰性対照）およびヒトＩｇＧ（陽性対照）をニトロセルロース上にスポットした。ＰＢＣ患者および正常患者由来の希釈血清（１：１００）を結合させ、洗浄した後、コロイド状金標識抗ヒトＩｇＧを添加した。結果を図１０に示す。１時間２０分後、ＩｇＧスポット（陽性対照）はすべてピンク色になった。ＨＫ１スポットは、ＰＢＣ患者の血清の１：１００希釈物ではピンク色になったが、正常血清では陰性（着色なし）であった。陰性対照スポット（担体バッファーのみ）は無色のままであった。

【0083】

実施例９：タンパク質相互作用の検出のツールとしての二重エピトープタグ系固相不均一系アッセイ（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
本発明者らは、（インビトロ）発現された標的タンパク質を表面上に捕捉する二重エピトープタグ化無細胞を主体とする、新規な高処理量内部正規化固相不均一系アッセイを開発した。このアッセイでは、表面固定化無細胞発現標的タンパク質に対する「プローブ」（例えば、薬物、オリゴヌクレオチドまたは抗体）の結合が検出され得るとともに、同じ表面上の標的タンパク質の量が正規化され得る。本明細書に示した実施例は、ヒト血清由来の自己抗体と標的タンパク質としての無細胞発現自己抗原との結合の検出に関するものであるが、この方法論は広く適用可能である。さらに、この実施例で使用したアッセイ形式はマイクロウェル（マイクロタイター）プレート型ＥＬＩＳＡ形式であるが、種々のアッセイ形式が可能である。

【0084】

本発明者らの新規なアッセイの一実施形態は、本発明者らがＴ^２−ＥＬＩＳＡ方法と称するものであり、１つのエピトープタグ（捕捉タグ）を有するマイクロタイタープレートウェル上への自己抗原（標的タンパク質）の捕捉、続いて、同じウェル内の自己抗体（プローブ）シグナルの読取りを含むとともに、別のウェルで発現させたタンパク質の量を、他方のタグ（検出タグ）を用いて正規化する。本発明者らのＴ^２−ＥＬＩＳＡアッセイを、ヒト血清中の抗ｓｐ１００ ＩｇＧ抗体の検出のためのＦＤＡ承認済の市販の半定量的ＥＬＩＳＡアッセイ（ＱＵＡＮＴＡ Ｌｉｔｅ（商標） ｓｐ１００；ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と比較するため、本発明者らは以下の実験を設定した：簡単には、自己抗原を無細胞発現させ、マイクロタイタープレート型アッセイに沿って精製し（すなわち、ウェル表面上に捕捉し）、患者の血清に対して自己抗体結合について従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を用いてスクリーニングする。酵素タグ化検出抗体（各々、異なる化学発光基質を有する）を順次添加した後、自己抗体結合ならびに検出タグ（正規化シグナル）の両方の読取りが行なわれるように、２種類の異なる化学発光基質を適切なウェルに１つずつ添加する。

【0085】

自己抗原の発現
推定自己抗原（この場合、ヒトＳｐ１００）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を、標準的で認知された分子生物学的実務手段を用いて、ＯＲＦ挿入物に加えて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｋｏｚａｋ（リボソーム結合）配列、開始コドン、Ｎ末端ＶＳＶ−Ｇエピトープタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、およびＣ末端ＨＳＶエピトープタグ（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）を含む無細胞タンパク質発現に適合性のプラスミドベクター内にクローニングした。発現ベクター内へのクローニングのための供給源ＤＮＡとして、完全長配列確認クローンをＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入した。発現ベクターを正しいＯＲＦ挿入物について、標準的なＥｃｏＲＩ消化方法を用いて確認した。

【0086】

自己抗原は、上述のプラスミドクローンから無細胞タンパク質発現によって作製した。無細胞タンパク質発現反応は、ウサギ網状赤血球ライセート系（ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７
Ｑｕｉｃｋ ｆｏｒ ＰＣＲ ＤＮＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と組みにした転写／翻訳を、製造業者の使用説明書に従って用いて行なった。自己抗原発現反応には、対応するプラスミドＤＮＡを含めたが、ブランク発現反応では、プラスミドＤＮＡのみを無しとした。発現反応は、ＴＤＢ［１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）］中で１／２０に希釈することにより停止させた。

【0087】

自己抗原の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ ９６ウェルＰｏｌｙｓｏｒｐ（商標） Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（商標）白色不透明で平底の未処理のポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、サンドイッチ型酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した。プレートを、０．５μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗ＨＳＶ（登録商標）タグ捕捉抗体（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（炭酸／重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．３）中）で、振盪しながら３０分間コートした（５０μＬ／ウェル）。プレートの洗浄はすべて、ＴＢＳ−Ｔ（ウェルを最大限、すなわち３００Μｌまで充填）の手作業による添加後真空吸引の４回の反復からなるものであった。プレートの洗浄はすべて、特に記載のない限り、この様式で行なった。次いで、プレートを３００μＬ／ウェルで１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ中で３０分間ブロックした。この溶液をプレートから取り出し、上述の停止（すなわち、希釈）無細胞発現反応液（自己抗原およびブランク反応液）を次いで、１００μＬ／ウェルで添加し、３０分間振盪した。プレートを洗浄し、血清試料（１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ中で１／１，０００に希釈）を１００μＬ／ウェルで添加し、３０分間振盪した。プレートを洗浄し、血清試料（１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ中で１／１，０００に希釈）を１００μＬ／ウェルで添加し、３０分間振盪した。各血清試料は、二連のウェルの自己抗原および二連のウェルの無細胞発現ブランクに対して実験し、さらなる組の二連のウェルの無細胞発現ブランクをＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出用に指定した［したがって、希釈血清ではなくそのままの１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔを加えた］。ＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出用に指定したウェルに、次いで、抗ＶＳＶ−Ｇホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体を加え、一方、血清自己抗体の検出用に指定したウェルには、マウス抗［ヒトＩｇＧ］ＨＲＰ標識モノクローナル二次抗体を加えた。続いて、この実施例で先に記載のようにして、ＴＢＳ−Ｔ（ウェルを最大限まで満たす）の手作業の添加によってプレートを４回洗浄した後、真空吸引した。ＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出用に指定したウェルに、次いで、抗ＶＳＶ−Ｇホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｐ５Ｄ４、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１／２０，０００に希釈）を加えた。血清自己抗体の検出用に指定したウェルには、マウス抗［ヒトＩｇＧ］ＨＲＰ標識モノクローナル二次抗体（マウス免疫グロブリンとの交差反応性は最小限；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１／２０，０００に希釈）を加えた。プレートを３０分間振盪した。次いで、この溶液を、プレートを反転させた後、反転させたプレートをドライペーパータオル上で激しくたたいて残留液を除去することによって、プレートから手作業で放出した。次いで、この実施例で先に記載のようにしてプレートを洗浄した。化学発光シグナルを、５０μＬ／ウェルのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのＰｉｅｒｃｅ Ｂｒａｎｄ）の添加によって生成させた。プレートを１５分間振盪することにより発色させ、次いで、ＬｕｍｉＣｏｕｎｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー（１秒間の露光、６５０ＶのＰＭＴ、ゲイン１）（Ｐａｃｋａｒｄ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）において読取りを行なった。

【0088】

ＱＵＡＮＴＡ Ｌｉｔｅ（商標） ｓｐ１００ ＥＬＩＳＡ
アッセイは、製造業者の使用説明書（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って行なった。

【0089】

結果：
本発明者らは、本発明者らのＴ^２−ＥＬＩＳＡを市販のＥＬＩＳＡと比較し、合致を試験した（図１１）。これは、３５例の原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）血清を既知の自己抗原Ｓｐ１００に対する自己抗体について試験することにより行なった。市販のＥＬＩＳＡ（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、自己抗原がプレート表面上に固定化されて構成されたＦＤＡ承認済比色ＥＬＩＳＡであり、製造業者の使用説明書に従って行なった。ＰＢＣコホートのサブセットを用いたデータを図１１に示す。「単位」の計算に使用したＩＮＯＶＡの標準的な陽性対照血清は、両方のアッセイにおいて実験し、各アッセイのシグナルを同じスケール（単位／μＬ未希釈血清）に変換した。どちらのアッセイもＩＮＯＶＡ方法論を用いて評点付けした、すなわち、単位＞２５の場合が陽性；これは、標準的な陽性対照血清に対して設定される「低陽性」である。図１１に示されるように、血清の陽性または陰性の評点付けに関して完璧な合致がみられる。しかしながら、ＩＮＯＶＡアッセイは非常に急速に飽和状態になるが、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡでは、少なくとも５倍広いダイナミックレンジで表示される。

【0090】

実施例１０：合致を評価するための癌血清のｐ５３腫瘍関連自己抗体の検出に関するＴ^２−ＥＬＩＳＡと慣用的な市販のＥＬＩＳＡとの比較
Ｔ^２−ＥＬＩＳＡの自己抗原の発現
ヒトｐ５３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を、標準的で認知された分子生物学的実務手段を用いて、ＯＲＦ挿入物に加えて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｋｏｚａｋ（リボソーム結合）配列、およびＣ末端ＨＳＶ（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）および６Ｘ Ｈｉｓエピトープタグを含む無細胞タンパク質発現に適合性のプラスミドベクター内にクローニングした。発現ベクターを正しいＯＲＦ挿入物について、ＤＮＡ配列決定を用いて確認した。

【0091】

ｐ５３自己抗原は、上述のプラスミドクローンから無細胞タンパク質発現によって作製した。無細胞タンパク質発現反応は、ウサギ網状赤血球ライセート系（ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ ｆｏｒ ＰＣＲ ＤＮＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と組みにした転写／翻訳を、製造業者の使用説明書に従って用いて行なった。自己抗原発現反応には、対応するプラスミドＤＮＡを含めたが、ブランク発現反応では、プラスミドＤＮＡのみを無しとした。発現反応は、ＴＤＢ［１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）］中で１／２０に希釈することにより停止させた。

【0092】

自己抗原の酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
種々の病期（ＡＪＣＣ／ＵＩＣＣの病期Ｉ〜病期ＩＶの範囲）の結腸直腸癌（ＣＲＣ）と診断された３４名の患者由来、および７例の無疾患個体由来の血清（ＰｒｏＭｅｄＤｘ、Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）を、ｐ５３腫瘍自己抗原に対する自己抗体について、組換えヒト細胞内発現ｐ５３で構成された市販のＥＬＩＳＡ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＴ^２−ＥＬＩＳＡを用いて、二連でスクリーニングした。市販のＥＬＩＳＡでは、血清（４℃でマイクロ遠心機にて１６，０００×ｇで５分間のスピンにより予め清浄化したもの）を１：１００に希釈し、二連で、製造業者によって提供された使用説明書に従って文献に記載のようにして実験した［ＯｓｈｉｋａｗａおよびＳｕｇｉｙａｍａ（２０００）Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ ９４：１０８５−９１］。また、確認済の陰性対照血清（製造業者によって提供）も二連で実験し、アッセイバックグラウンドの測定に使用した。各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度の読み値を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレート分光測光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にて収集した。

【0093】

Ｔ^２−ＥＬＩＳＡでの血清のスクリーニングには、以下のプロトコルを使用した。Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ ９６ウェルＰｏｌｙｓｏｒｐ（商標） Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（商標）白色不透明で平底の未処理のポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、サンドイッチ型酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した。プレートを、０．５μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗ＨＳＶ（登録商標）タグ捕捉抗体（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（炭酸／重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．３）中）で、振盪しながら３０分間コートした（５０μＬ／ウェル）。次いで、マルチチャネルピペットを用いて洗浄バッファーを添加し、プレートを反転させた後、反転させたプレートをドライペーパータオル上で激しくたたいて洗浄バッファーおよび残留液を除去することによって、プレートを３００μｌのＴＢＳ−Ｔ中で手作業で４回洗浄した。３００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔを用いてブロックを３０分間行なった。記載したばかりのとおりにして溶液をプレートから取り出し、上述の停止（すなわち、希釈）無細胞発現反応液（自己抗原およびブランク反応液）を次いで、１００μＬ／ウェルで添加し、３０分間振盪した。プレートを上記のようにして洗浄し、血清試料（４℃でマイクロ遠心機にて１６，０００×ｇで５分間のスピンにより予め清浄化したもの）を、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ中で１／２，０００に希釈した。１００μＬ容量の血清／ウェルを添加し、プレートを室温で３０分間振盪させた。一方は無細胞発現自己抗原を含み、他方は無細胞発現ブランクを含む（ＤＮＡ鋳型なしでの発現反応）２つの別々のプレートの各々の二連のウェルに対して、各血清試料の実験を行なった。血清インキュベーション後、真空吸引によって血清を除去し、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。血清自己抗体検出には、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１／２０，０００に希釈した１００μｌのマウス抗［ヒトＩｇＧ］ＨＲＰ標識モノクローナル二次抗体（マウス免疫グロブリンとの交差反応性は最小限；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を各ウェルに添加した。室温で３０分間プレートを振盪した後、上記のようにして３００μｌのＴＢＳ−Ｔ中で４回洗浄した。化学発光シグナルを、５０μＬ／ウェルのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ ＦＥＭＴＯ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのＰｉｅｒｃｅ Ｂｒａｎｄ）の添加によって生成させた。室温で１５秒間振盪することによりプレートを発色させ、次いで、ＬｕｍｉＣｏｕｎｔ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー（１秒間の露光、６９３ＶのＰＭＴ、ゲイン１）（Ｐａｃｋａｒｄ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）において読取りを行なった。

【0094】

結果：
既知の腫瘍自己抗原ｐ５３に対する自己抗体の検出における本発明者らのＴ^２−ＥＬＩＳＡと市販のＥＬＩＳＡとの合致を試験するため、ＣＲＣ患者由来の３４例の血清（図１２、１〜３４）および７無疾患「正常」個体由来の血清［図１２、Ｎ１〜Ｎ７（緑色の四角の囲み）］を、２つのアッセイの各々において二連で試験した。各ＥＬＩＳＡの実施後、各血清でのバックグラウンド減算シグナル値をまず計算した。市販のＥＬＩＳＡでは、バックグラウンドを、製造業者によって提供された確認済陰性血清とプローブ結合させた２つのウェルの各々の未加工の値の平均として計算した。次いで、このバックグラウンド値を、ＣＲＣまたは「正常」血清のいずれかとプローブ結合させた試験ウェルの各々の未加工の値から減算し、各血清での二連のバックグラウンド減算シグナル値を得た。これらのバックグラウンド減算シグナル値について、ゼロフロアを設定した（すなわち、マイナスの値（あれば）はゼロに設定した）ことに注意のこと。次いで、各血清での二連のバックグラウンド減算シグナル値を平均し、単一の平均バックグラウンド減算シグナル値を得た。Ｔ^２−ＥＬＩＳＡでは、バックグラウンドは、無細胞発現ブランク（減算ＤＮＡ鋳型反応）に対して実験した各血清での二連のウェルの平均として求めた。次いで、このバックグラウンド値を、無細胞発現自己抗原（ｐ５３）に対して実施した同じ血清の二連の未加工の値の各々から独立して減算し、各血清について２つのバックグラウンド減算シグナル値を得た。市販のＥＬＩＳＡデータの解析の場合同様、ゼロフロアをもう一度、バックグラウンド減算シグナル値に対して設定した。次いで、各血清での二連のバックグラウンド減算シグナル値を平均し、各血清での単一の平均バックグラウンド減算シグナル値を得た。次に、２つのアッセイ間の合致を確認するため、市販のＥＬＩＳＡとＴ^２−ＥＬＩＳＡの両方について、血清を、解析による陽性または陰性に単純に評点付けした（図１２は、解析により陽性と評点付けされた血清のみを示す）。このためには、各血清−自己抗原ペアについて、該ペアがＥＬＩＳＡにおいて解析により陽性と評点付けされるために、以下：ｉ）バックグラウンドシグナル（同じ血清とブランク発現ウェル（対比））の二連のウェルの値と比べて、自己抗体シグナル（血清と自己抗原（対比））の二連のウェルの未加工ＥＬＩＳＡ値に対する片側等分散対応なしｔ−検定において≦０．０５のｐ値；ｉｉ）自己抗体信号対バックグラウンド比が≧２、の両方の基準が満たされていなければならなかった。これらの基準を満たさない血清自己抗原ペアは０に設定する。最後に、各アッセイについて独立して、解析により陽性と評点付けされた血清の平均バックグラウンド減算シグナル値を、同アッセイにおいて最高値を有する血清（市販のＥＬＩＳＡではＣＲＣ１２およびＴ^２−ＥＬＩＳＡではＣＲＣ１９）に対して正規化し、これを１００％に設定した。次いで、この正規化した値をプロットした。エラーバーは標準偏差を表す（図１２）。図１２からわかるように、市販のＥＬＩＳＡでｐ５３自己抗体について陽性と評点付けされた血清はすべて、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡでも陽性と評点付けされた（また、相対シグナル強度もほぼ等しい）。さらに、ＣＲＣ血清ではさらに１例（血清１８）が、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡではわずかに陽性、市販のＥＬＩＳＡでは陰性と評点付けされたが、正常血清ではさらにはなかった。総合すると、このデータにより、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡは、市販のＥＬＩＳＡと少なくとも同等に鋭敏度がよく、おそらく、さらに１例のＣＲＣ試料が特定され得たことによって示されるように、わずかに鋭敏度がよい場合すらあり得ることが示唆される。どちらのアッセイでも、正常血清ではいずれも自己抗体シグナルは検出されず、同様に、特異性に関して非常に良好な合致が示唆される。

【0095】

実施例１１：タンパク質同士の相互作用を検出するためのツールとしての二重エピトープタグおよび二重レポーターによる固相不均一系アッセイ
実施例２に記載の二重タグ化Ｔ^２−ＥＬＩＳＡでは、自己抗体検出および標的タンパク質の正規化のために単一レポーター系を使用する。実施例２は、プローブ読出し（その場合、自己抗体）およびエピトープタグ読出しのために別々のウェルの使用を示しているが、この実施例は、該アッセイにより、二重レポーター系を用いて、表面固定化無細胞発現標的タンパク質に対する「プローブ」（例えば、薬物、オリゴヌクレオチドまたは抗体）の結合を検出するとともに、同じ表面（すなわち、同じウェル）で標的タンパク質の量を正規化することができることを示す。本明細書に示した実施例は、ヒト血清由来の自己抗体と標的タンパク質としての無細胞発現自己抗原との結合の検出に関するものであるが、この方法論は広く適用可能である。さらに、この実施例で使用したアッセイ形式はマイクロウェル（マイクロタイター）プレート型ＥＬＩＳＡ形式であるが、種々のアッセイ形式が可能である。

【0096】

自己抗原（標的タンパク質）を、一方のエピトープタグ（捕捉タグ）を有するマイクロタイタープレートウェル上に捕捉し、他方の（検出タグ）で正規化するとともに、同じウェル内でなお自己抗体（プローブ）シグナルの読取りを行なうことが可能であることを示すため、本発明者らは、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡアッセイを、以下のこと：無細胞発現および抗原捕捉ならびに酵素タグ化抗体の逐次添加後、２種類の異なる化学発光基質も逐次添加し、それにより自己抗体結合シグナルと検出タグ（正規化）シグナルの両方の読取りが同じウェル内で逐次、行なわれることを可能にした以外は実施例２に記載のようにして行なった。

【0097】

同じウェル内での二重検出が可能であるのを示すことに加え、ウェル毎の正規化、すなわち、存在し得るタンパク質の発現または捕捉の多様性を正規化することの潜在的利点を示すため、本発明者らは、種々の患者の血清を用いてさまざまな自己抗原において二重ウェル検出と単独ウェル検出を直接比較する。

【0098】

自己抗原の発現
Ｒａｐ５５がカラム精製ＰＣＲ産物から発現させたものであること以外は、実施例２の場合と同様にして行なう。Ｒａｐ５５は、ｃＤＮＡから標準的で認知された分子生物学的実務手段を用いてＰＣＲ増幅させた。プライマーは、Ｒａｐ５５挿入物に加えて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｋｏｚａｋ（リボソーム結合）配列、開始コドン、Ｎ末端ＶＳＶ−Ｇエピトープタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、およびＣ末端ＨＳＶエピトープタグ（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）を含む無細胞タンパク質発現に適合性のＰＣＲ産物が得られるように設計した。

【0099】

自己抗原の酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
以下のこと以外は実施例２の場合と同様にして行なう。二重レポーターアッセイ（実施例２に記載の単一レポーターアッセイとは異なる）では、タグとプローブ（自己抗体）が同じウェル内で逐次検出されるため、ＶＳＶ−Ｇエピトープタグの検出用に確保しておくさらなるウェルはなかった。酵素タグ化抗体をすべてのウェルに逐次添加した後、その都度、本明細書に記載のようにして洗浄した：まず、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１／２０，０００に希釈したマウス抗［ヒトＩｇＧ］アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識モノクローナル二次抗体（マウス免疫グロブリンとの交差反応性は最小限；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を添加した。次いで、プレートを３０分間振盪した。次いで、この溶液を、プレートを反転させた後、反転させたプレートをドライペーパータオル上で激しくたたいて残留液を除去することによって、プレートから手作業で放出した。次いで、プレートを手作業で、実施例８で先に記載のようにして洗浄した。このプロセスを、抗ＶＳＶ−Ｇホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｐ５Ｄ４、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中で１／２０，０００に希釈）に対しても繰り返した。ＡＰ化学発光シグナルを、５０μＬ／ウェルのＢＭ 化学発光ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の使用説明書に従って添加することにより生成させた。シグナルを生成させた後、プレートの読取りを実施例８に記載のようにして行なった後、２回目の読取りを行ない、このとき、プレート上の最大シグナルに対するＰＭＴを設定した。プレートの読取り後、プレートを手作業で洗浄した後、５０μＬ／ウェルのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのＰｉｅｒｃｅ Ｂｒａｎｄ）を添加した。プレートを１５分間振盪することにより発色させ、次いで、実施例１に記載のようにして読取りを行なった後、２回目の読取りを行ない、このとき、プレート上の最大シグナルに対するＰＭＴを設定した。

【0100】

表ＩＶのデータとは異なり、図１３で行なった二重レポーターおよび単一レポーターＥＬＩＳＡは、ロボット型プレート洗浄機の補助を伴って洗浄した。具体的には、プレートをＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ Ｒｏｂｏｔｉｃ Ｐｌａｔｅ Ｗａｓｈｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）において、ＴＢＳ−Ｔ（ウェルを最大限まで満たす）中で６回洗浄した。血清の添加後、ロボット型プレート洗浄機へのヒト血清の混入を回避するため、続いて、プレートを、ＴＢＳ−Ｔの手作業の添加によって４回洗浄した（ウェルを最大限まで満たす）後、真空吸引し、次いで、ロボット型プレート洗浄機で、この実施例で先に記載のようにして６回洗浄した。

【0101】

結果：
まず、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡの二重検出プロセスが単独検出と同程度に効率的であることを確立するため、本発明者らは、これを、既知のＰＢＣ自己抗原であるＲａｐ５５およびＰＢＣ患者の血清試料を用いて直接比較した。表ＩＶ−Ａからわかるように、二重レポーターアッセイでの自己抗体（ＡＰ）シグナル［ＡＰ信号−雑音（すなわち、同じ血清とブランク発現ウェル（対比））として計算］を、単一レポーター（ＡＰ）アッセイの対応する自己抗体シグナルに対するパーセントとして計算した。両方の方法で、ほぼ同一の結果が得られ（二重レポーターのＡＰシグナルは、対応する単一レポーターの９７％であり、二重レポーターのＨＲＰシグナルは、対応する単一レポーターの９６％であった）、ＶＳＶ−Ｇエピトープタグ（ＨＲＰ）の検出により、同じウェル内でのその後の自己抗体シグナル（ＡＰ）の検出は阻害されないことを明白に示す。同様に、自己抗体（ＡＰ）検出により、同じウェル内でのＶＳＶ−Ｇエピトープタグ（ＨＲＰ）検出は有意に妨げられない。また、本発明者らは、二重レポーターアッセイから、単一レポーターアッセイ（表ＩＶ−Ｂ）と比べた自己抗体（ＡＰ）シグナルの信号雑音比：［ＡＰ信号／雑音（すなわち、同じ血清とブランク発現ウェル（対比））として計算］を計算し、同じウェル内での二重検出による信号雑音比の減少は少しもないことを示した。

【0102】

次に、二重レポーターと単一レポーターでのＴ^２−ＥＬＩＳＡアッセイを、いくつかの血清−抗原ペアで比較した。図１３は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＰＢＣならびに正常患者の血清対さまざまな公知の自己抗原（ＣＥＮＰＢ、Ｒｏ−６０、Ｓｍｉｔｈ
Ｂ、およびＳｐ１４０）でのＴ^２−ＥＬＩＳＡの実施例データを示す。参照として、試料の臨床的注釈によって報告のとおり種々の自己抗原について陽性であることが既にわかっている試料とした。自己抗体単位のＥＬＩＳＡ値を各血清−自己抗原ペアについて測定し、その平均および標準偏差（エラーバー）を計算し、上述の自己抗原について個々に図１３にプロットした。自己抗体単位についてゼロフロアを設定したことに注意のこと。ＣＥＮＰＢで試験した正常血清は、予測どおり、実際に陰性である。陽性結果の信号雑音比は、３：１（Ｓｍｉｔｈ ＢとＳＬＥ−Ｈ（対比））〜３００：１（ＳＰ１４０とＰＢＣ−Ｉ−２１（対比））の範囲であった。また、この実験で、二重レポーターアッセイと単一レポーターアッセイを比較し、このとき、別々のウェルをＶＳＶ−Ｇ正規化エピトープタグの検出に対して単独で使用した。二重レポーター検出の潜在的利点は、各自己抗体シグナルが、起こり得るタンパク質発現（例えば、日にち毎）または捕捉の多様性（アッセイ内またはアッセイ間）についてウェル毎に正規化されることである。データは、二重レポーターアッセイの使用に有意な弊害はないことを示す。さらに、予測どおり、二重レポーターアッセイの標準偏差（ウェル毎の正規化）は、単一レポーターアッセイ（アッセイ毎（プレート毎）でしか正規化されない）より有意に小さい。

【0103】

実施例１２：コムギ胚芽主体の系で組換え発現させ、ＥＬＩＳＡプレートの表面への直接自己抗原コートを用いてアッセイした新規な原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）自己抗原ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２に対する自己抗体の検出
自己抗原およびＥＬＩＳＡアッセイ
この実施例では、重要な特長は、ＥＬＩＳＡアッセイを、予備精製組換え発現自己抗原を直接コートしたポリスチレンマイクロタイタープレートにおいて行なったことである（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡの場合のようにＥＬＩＳＡプレート表面での抗体媒介性インサイチュ捕捉／精製ではない）。別の注目すべき特長は、ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２を、先の実施例と比較したときと異なる系において発現させたことである。ヒトＨＫ１およびＫＬＨＬ１２の完全長組換えタンパク質を無細胞コムギ胚芽主体の系で発現させ、Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｗａｎ）から購入したＮ末端ＧＳＴ融合タグによって精製した。プレートをｌ００μＬ／ウェルの０．５μｇ／ｍＬの組換えタンパク質（ＰＢＳ中で希釈）で一晩コートした。実施例２において詳述したように、次いで、プレートをＴＢＳ−Ｔ（ウェルを最大限まで満たす）中で６回洗浄し、次いで、３００μＬ／ウェルで１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）含有ＴＢＳ−Ｔ中で３０分間ブロックした。ブロック溶液をプレートから取り出し、血清試料（１／１００に希釈）（ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ’ ＱＵＡＮＴＡ Ｌｉｔｅ（商標） ＥＬＩＳＡ系の希釈剤；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で３０分間振盪した。プレートの洗浄および二次抗体の添加は実施例２に記載のとおりとする。ＩＮＯＶＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ’ ＱＵＡＮＴＡ Ｌｉｔｅ（商標） ＥＬＩＳＡ系（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の比色基質および停止溶液を製造業者の使用説明書に従って用いてＥＬＩＳＡを発色させた。

【0104】

結果：
図１４は、比色アッセイがＨＫ１対いくつかのＰＢＣおよび正常血清に対して良好に機能を果たすことを示し、結果は、予測した結果と１００％合致している（マイクロアレイおよびＴ^２−ＥＬＩＳＡの結果に基づく；実施例１および２参照）。この予測評点は、グラフに「＋」および「−」で示していることに注意のこと。赤い線はこのアッセイのカットオフであることに注意のこと（４つの予測陰性試料の平均より２標準偏差上に設定）。また、これは、組換え抗原での直接プレートコーティングであり、ここではバックグラウンド減算はない（捕捉抗体が存在しないため必要でない）ことに注意のこと。最後に、Ｎ−０３は、実際、実施例１および２の先の結果に基づくと陽性である（また、ＰＢＣ−０４とＰＢＣ−０５は陰性）とされることに注意のこと。

【0105】

同様に、ＫＬＨＬ１２についての図１５も、予測した結果と１００％合致している（マイクロアレイおよびＴ^２−ＥＬＩＳＡの結果に基づく；実施例１および２参照）比色アッセイの結果を示す。この予測評点は、グラフに「＋」および「−」で示していることに注意のこと。カットオフは、赤い線で示し、４つの予測陰性試料の平均より２標準偏差上に設定した。実施例１および２の先の結果に基づくと、Ｎ−０３は陽性、ＰＢＣ−０２とＰＢＣ−０７は陰性であると予測される。

【0106】

実施例１３：ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２のホモログを用いた原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）における自己抗体の検出
以下の段落の情報は、公に入手可能なＵｎｉＰｒｏｔデータベース［Ｔｈｅ−ＵｎｉＰｒｏｔ−Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７：Ｄ１６９−７４］ならびに種々の公に入手可能なＮＣＢＩデータベース［Ｎａｔｉｏｎａｌ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ］から取得した。

【0107】

ヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）は、ミトコンドリアの外膜に局在するタンパク質である。ＨＫ１をコードする遺伝子の選択的スプライシングにより、異なるアイソフォームをコードする５種類の転写物バリアントがもたらされる。各アイソフォームは相違するＮ末端を有するが、すべてのアイソフォーム間でタンパク質の残部は同一である［ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ］。したがって、上述のいずれかのアイソフォームで、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）のヘキソキナーゼ１に対する自己抗体が充分に検出され得ると仮定することは妥当である。

【0108】

さらに、ヘキソキナーゼ１は、ヘキソキナーゼ２、ヘキソキナーゼ３、グルコキナーゼ（ヘキソキナーゼ４）、およびヘキソキナーゼドメイン含有１を含むタンパク質ファミリーの一メンバーである。前述のタンパク質は有意な配列相同性を示す（例えば、ＮＣＢＩ
ＢＬＡＳＴエンジンを使用すると、ヒトＨＫ１とＨＫ２は７３％の同一性を有し、８６％が陽性；それぞれ、ＮＣＢＩ受託ＢＣ００８７３０．２コード配列およびＮＰ＿０００１８０．２）とともに、一般的な保存ドメイン、例えば、ヘキソキナーゼドメイン＿１および＿２（それぞれ、ｐｆａｍ００３４９およびｐｆａｍ０３７２７）、ならびに保存されたマルチドメインＣＯＧ５０２６ヘキソキナーゼ［糖質輸送および代謝］を共有している。

【0109】

Ｋｅｌｃｈ様１２（ＫＬＨＬ１２）は、ユビキチンリガーゼのコンジュゲーションおよびｗｎｔ細胞−シグナル伝達経路に関与しているタンパク質である。これは、６回ｋｅｌｃｈ反復ドメインとＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメインを含んでいる。上述のドメインを含むいくつかのＫｅｌｃｈ様タンパク質および他のタンパク質が存在している（例えば、表ＶＩ参照）。

【0110】

タンパク質の配列類似性と分子内および分子間エピトープの拡延現象の両方のため［ＶａｎｄｅｒｌｕｇｔおよびＭｉｌｌｅｒ（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：８５−９５］、本発明者らには、上述のＨＫ１およびＫＬＨＬ１２ホモログ（また、表ＶＩの実施例も参照のこと）も原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）における疾患特異的自己抗体の検出に関して同様の成績を示し得ることが充分に予測される。さらに、ホモログの使用により、診断鋭敏度および／または特異性が増大するかもしれない。この実施例では、これを評価する。

【0111】

自己抗原の発現
ＨＫ１およびＫＬＨＬ１２のホモログ（この実施例で上記のものおよび表ＶＩに示したホモログの例など）を、発現させ、自己抗体の検出のための自己抗原として使用すること以外は、実施例３の場合と同様にして行なう。

【0112】

自己抗原の二重タグ酵素免疫測定法（Ｔ^２−ＥＬＩＳＡ）
実施例３の場合と同様にして行なう。

【0113】

結果：
実施例３の場合と同様、所与の自己抗原に対する診断用評点閾値種を設定するため、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡアッセイを２２例の正常患者血清群において行ない、次いで、カットオフを、約９５％統計学的信頼性のために、この正常コホートの平均の２標準偏差上に設定する。２〜３標準偏差でのこの方法の使用は一般的な実務である（例えば、［Ｌｉｕ、Ｗａｎｇ、Ｌｉ、Ｘｕ、Ｄａｉ、ＷａｎｇおよびＺｈａｎｇ（２００９）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６９：５７−６３］）。次いで、Ｔ^２−ＥＬＩＳＡを２２例のＰＢＣ患者血清（例えば、２２例のＡＭＡ−陰性および／または２２例のＡＭＡ−陽性）において実施する。次いで、自己抗原特異的カットオフを用いて、正常患者およびＰＢＣ患者の両方の評点を自己抗体陰性または陽性として行なう。自己抗体単位の計算およびデータ処理を実施例３の場合のようにして行なう。次いで、各自己抗原種での診断鋭敏度および特異性の計算を実施例３の場合のようにして行なう。

【0114】

タンパク質の配列類似性と分子内および分子間エピトープの拡延現象の両方のため［ＶａｎｄｅｒｌｕｇｔおよびＭｉｌｌｅｒ（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：８５−９５］、少なくとも一部のＨＫ１およびＫＬＨＬ１２ホモログは、ＡＭＡ−陽性では実施例３の場合、ＡＭＡ陰性ＰＢＣでは実施例４の場合（ここでは、ヒトＨＫ１およびＫＬＨＬ１２自体を使用）と同様の診断成績を示すという予測がなされる。また、一部のものは、診断鋭敏度もしくは特異性のいずれかまたは両方において、より良好な成績を示すことが予測される。

【0115】

【表1】

【0116】

【表2】

【0117】

【表3】

【0118】

【表4】

【0119】

【表5-1】

【0120】

【表5-2】

【0121】

【表5-3】

【0122】

【表6-1】

【0123】

【表6-2】

【0124】

【表6-3】

【0125】

【表6-4】

【0126】

【表6-5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]