特許 6013654 改良されたアデノウイルス製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6013654

(24)【登録日】2016年9月30日

(45)【発行日】2016年10月25日

(54)【発明の名称】改良されたアデノウイルス製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/761 20150101AFI20161011BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 39/235 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 47/14 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 47/34 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20161011BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20161011BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/761

   A61K48/00

   A61K39/235

   A61K47/14

   A61K47/40

   A61K47/02

   A61K47/34

   A61K47/10

   A61K9/08

【請求項の数】18

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2016-519869(P2016-519869)

(86)(22)【出願日】2014年9月16日

(65)【公表番号】特表2016-530220(P2016-530220A)

(43)【公表日】2016年9月29日

(86)【国際出願番号】EP2014069654

(87)【国際公開番号】WO2015040002

(87)【国際公開日】20150326

【審査請求日】2016年3月31日

(31)【優先権主張番号】13185200.6

(32)【優先日】2013年9月19日

(33)【優先権主張国】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】301055549

【氏名又は名称】クルセル ホランド ベー ヴェー

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100119530

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 和幸

(74)【代理人】

【識別番号】100136858

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 浩

(72)【発明者】

【氏名】ジャニク アドリアーセン

【審査官】 常見 優

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０００／０２９０２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／００３１５２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０５２１１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５２５９０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３５８５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／００８５４２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Pharmaceutical Research, Vol.15, No.9, Page.1348-1355, 1998

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３５／００−３５／７６８

３６／０６−３６／０６８

Ａ６１Ｋ４８／００

Ａ６１Ｋ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ４７／００−４７／４８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）組換え型アデノウイルス；
ｂ）クエン酸緩衝剤；
ｃ）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）；
ｄ）塩；
ｅ）非イオン性洗剤
を含み、５．５〜６．５の範囲のｐＨを有する、アデノウイルスの製剤。

【請求項2】

クエン酸塩濃度が５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である、請求項１に記載の製剤。

【請求項3】

ＨＢＣＤの濃度が１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１又は２記載の製剤。

【請求項4】

前記塩が塩化ナトリウムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項5】

塩化ナトリウム濃度が２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である、請求項４に記載の製剤。

【請求項6】

前記非イオン性洗剤がポリソルベート−８０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項7】

ポリソルベート−８０濃度が０．００５％（ｗ／ｗ）〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項６に記載の製剤。

【請求項8】

５．７〜６．３の範囲のｐＨを有し、且つ５〜３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項9】

２又は４−炭素アルコールをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項10】

前記２又は４−炭素アルコールがエタノールである、請求項９に記載の製剤。

【請求項11】

エタノール濃度が０．１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１０に記載の製剤。

【請求項12】

５．７〜６．３の範囲のｐＨを有し、且つ５〜３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０；及び０．２％（ｗ／ｗ）〜０．６％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のエタノールを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項13】

６のｐＨを有し、且つ２０ｍＭの濃度のクエン酸塩；５％（ｗ／ｗ）の濃度のＨＢＣＤ；８０ｍＭの濃度のＮａＣｌ、０．０２５％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０、及び０．４％（ｗ／ｗ）の濃度のエタノールを含む、請求項１２に記載の製剤。

【請求項14】

５．９〜６．２の範囲のｐＨを有し、且つ１０〜２５ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；４％（ｗ／ｗ）〜６％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；７０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；０．０１８％（ｗ／ｗ）〜０．０３５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０；及び０．３％（ｗ／ｗ）〜０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のエタノールを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項15】

液体製剤である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項16】

非経口使用に好適である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項17】

請求項１〜１６のいずれか一項に記載の製剤を調製することを含む、アデノウイルスを保護する方法。

【請求項18】

請求項１〜１６のいずれか一項に記載の製剤を調製すること及び前記製剤を２℃〜８℃の範囲の温度で保存することを含む、アデノウイルスを保護する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば、遺伝子治療及び／又はワクチン用途に使用するためのアデノウイルス製剤及び関連した医薬製品に関する。とりわけ、非経口投与にも適合性がある一方で、約２〜８℃の範囲又はより高温で保存される場合、含まれるアデノウイルスの量、効力（感染力）、及び質を保護することによりアデノウイルスの安定性を向上させるアデノウイルス用の液体製剤が本明細書に開示される。

【背景技術】

【0002】

アデノウイルスベクターは、遺伝子送達のための最も効率よい、広く使用されているビヒクルである。遺伝子治療及びワクチン研究の分野での継続している問題は、約２℃〜約８℃などの医薬製品用の現実的な保存温度範囲内でより長期間、これらのウイルスを安定化できる液体アデノウイルス製剤を生成することである。

【0003】

アデノウイルスの生物学的活性は、少なくとも、カプシドタンパク質からなる二十面体のカプシド構造により囲まれているヌクレオチドのコア配列の立体配座の完全性に依存する。従来の有機及び無機の薬物とは異なり、これらは、非常に複雑な生物学的構造であり、軽微な化学的又は物理的ストレッサーもアデノウイルスの粒子の分解の一因になり得る。したがって、アデノウイルス調製物の良好な製剤は、妥当な保存寿命を保証するのに極めて重要であるが、これらのベクターを安定化させることは特殊な課題を提起する。アデノウイルスは、変性、凝集（可溶性及び不溶性の両方の凝集物形成）、沈殿、及び吸着を含む物理的な不安定性、並びに加水分解、脱アミド、及び酸化を含む化学的不安定性の結果として、効力を失い得る。これらの分解経路のいずれも生物学的活性の低下を招き得るが、潜在的に、増加した毒性及び／又は変化した免疫原性を有する副生成物又は誘導体の形成も起こし得る。

【0004】

したがって、広範囲の条件にわたって安定性を保証するアデノウイルスの堅固な製剤を見出すには、適合した手法が必要である。アデノウイルスを、化学的、物理的、及び生物学的に安定に保つには、緩衝剤の種類、ｐＨ、及び特殊化された賦形剤を綿密に最適化する必要があるであろう。変動し得る因子の全てを考慮すると、アデノウイルスを製剤化する最適な条件を見出すことには困難が伴い、良好な製剤の組成は直観的に予測不可能である。

【0005】

凍結乾燥製剤が存在し、安定である。しかし、凍結乾燥製剤は、比較的高価である傾向があり、投与前に時間のかかる取扱いが必要であり、凍結乾燥プロセスで効力がある程度失われ得る。凍結状態下（−８０℃）で安定な液体製剤は存在するが、それらは、特殊化された出荷及び高価な保存施設を必要とし、特に流通網の末端では信頼できるコールドチェーンがほとんど不可能になる。したがって、アデノウイルスの好ましい製剤は、２〜８℃の温度範囲又はより高温でアデノウイルスの安定性を与える液体製剤である。そのような製剤は通常の冷蔵庫で保存でき、素早く容易に投与できる。

【0006】

アデノウイルスの液体製剤は、例えば、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００４において、以前に記載されてきた。前記出願中の例示された最良の製剤は、７．５〜８．５の範囲のｐＨを有するトリス緩衝製剤である。本発明者らは、前記製剤がアデノウイルスにとって最適状態に及ばないことを本明細書において見出した。アデノウイルスの製剤は、国際公開第００／２９０２４号パンフレットにも開示されており、それは主に凍結乾燥技法に関する。ポリオールを含むアデノウイルスの他の製剤は、国際公開第００／２９０２４号パンフレットに言及されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、長期間にわたる保存の間に、含まれるアデノウイルスの量及び効力を保護することにより、アデノウイルスの安定性を向上させる製剤を見出す必要が当技術分野に存在する。アデノウイルスの安定性は、輸送の間の撹拌ストレス、又は製造若しくは臨床使用の間のせん断力の場合に、及び広範囲の気候条件、とりわけ高温下で、又は繰り返された凍結／解凍サイクルの後でも維持されなければならない。さらに、製剤は、意図される投与経路に好適で、忍容性が良好で、好ましくはできるだけ少ない成分の組成を有さなければならない。本発明の目的は、そのようなアデノウイルスの製剤を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、アデノウイルスの量及び効力（感染力）及び質を保護することにより、先に開示された製剤に比べてアデノウイルスの安定性を向上させたアデノウイルスの製剤を見出し、本明細書に記載する。意外なことに、５．５〜６．５の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝剤と、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）との組み合わせは、アデノウイルスの量、効力（感染力）、及び質を保護し、それにより、当技術分野に公知である他の製剤に比べて全体的なアデノウイルスの安定性を向上させる、優れた製剤を生み出す。

【0009】

製剤開発に使用される全ての賦形剤と同様に、本発明による製剤に存在する成分の一部は、従来技術に別々に引用されている。しかし、本発明の製剤に優れた性質及び安定化能力を与えるのは、まさにいくつかの成分の特定の組み合わせである。本発明によるまさにその製剤は従来技術に開示されていなかった。さらに、この本質的に予測不可能な分野における従来技術に基づいては、前記製剤がアデノウイルスに対するそのような向上した安定性を与えることを予測できなかったであろう。

【0010】

したがって、本発明は、例えば、遺伝子治療及び／又はワクチン用途に使用できる安定化されたアデノウイルス製剤及び関連する医薬製品に関する。

【0011】

本発明による製剤は、５．５〜６．５の範囲のｐＨのクエン酸緩衝剤を含み、さらにヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）を含む。製剤は、塩及び非イオン性洗剤をさらに含む。任意選択で、本発明による製剤は、２又は４−炭素アルコールをさらに含む。本発明のアデノウイルス製剤は、２℃〜８℃又は−６５℃以下で、６か月超、１年、１．５年、２年、又はそれを超える長期の保存に適している。

【0012】

本発明のアデノウイルス製剤は、ａ）組換え型アデノウイルスをｂ）クエン酸緩衝溶液中に含み、さらに、ｃ）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）；ｄ）塩；及びｅ）非イオン性洗剤を含む。アデノウイルス安定性を保護するために、この製剤のｐＨが５．５〜６．５の範囲であることが必須である。

【0013】

好ましくは、本発明による製剤は、約１×１０^７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０^１３ｖｐ／ｍＬの範囲の力価のアデノウイルスを含む。

【0014】

本発明による好ましい実施形態において、製剤中のクエン酸塩濃度は、約５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。

【0015】

ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）が好ましい凍結保護剤である。ＨＢＣＤは、好ましくは、約１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度で存在する。

【0016】

塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましい塩であり、好ましくは、約２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度で存在する。

【0017】

ポリソルベート−８０が好ましい非イオン性洗剤であり、好ましくは、約０．００５％（ｗ／ｗ）〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度で存在する。

【0018】

本発明による、より好ましい実施形態において、製剤は、約５．７〜６．３の範囲のｐＨを有し、且つ約５〜３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０を含む。

【0019】

本発明による別の好ましい実施形態において、製剤は、約５．８〜６．２の範囲のｐＨを有し、且つ約１５〜２５ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０を含む。

【0020】

さらにより好ましい実施形態において、本発明による製剤は約６のｐＨを有し、且つ約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩；約５％（ｗ／ｗ）の濃度のＨＢＣＤ；約７５ｍＭの濃度のＮａＣｌ；約０．０２％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０を含む。

【0021】

２又は４−炭素アルコール、とりわけエタノールの本発明の製剤への添加が、意外にも、アデノウイルスを凍結／解凍の損傷から強く保護し、その結果凍結保護剤として作用することが本明細書において示された。

【0022】

したがって、好ましい一実施形態において、本発明による製剤は、２又は４−炭素アルコールをさらに含む。さらにより好ましい実施形態において、本発明による製剤はエタノールを含む。エタノール濃度は、好ましくは、約０．１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）の範囲である。

【0023】

本発明による好ましい実施形態において、製剤は、約５．７〜６．３の範囲のｐＨを有し、且つ約５〜３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０；及び約０．２％（ｗ／ｗ）〜０．６％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のエタノールを含む。

【0024】

本発明による別の好ましい実施形態において、製剤は、約５．８〜６．２の範囲のｐＨを有し、且つ約１５〜２５ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０；及び約０．２％（ｗ／ｗ）〜０．６％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のエタノールを含む。

【0025】

さらにより好ましい実施形態において、本発明による製剤は約６のｐＨを有し、且つ約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩；約５％（ｗ／ｗ）の濃度のＨＢＣＤ；約７５ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約０．０２％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０、及び約０．４％（ｗ／ｗ）の濃度のエタノールを含む。

【0026】

別の好ましい実施形態において、本発明による製剤は約６のｐＨを有し、且つ約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩；約５％（ｗ／ｗ）の濃度のＨＢＣＤ；約８０ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約０．０２５％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０、及び約０．４％（ｗ／ｗ）の濃度のエタノールを含む。

【0027】

さらにより好ましい実施形態において、本発明による製剤は約６のｐＨを有し、且つ約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩；約５％（ｗ／ｗ）の濃度のＨＢＣＤ；約８０ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約０．０２５％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０、及び約０．４％（ｗ／ｗ）の濃度のエタノールを含む。

【0028】

本発明の別の好ましい実施形態において、製剤は（凍結）液体製剤である。さらに別の実施形態において、本発明の製剤は、非経口使用に好適である。

【0029】

一実施形態において、本発明による製剤はバイアルに収容されている。別の実施形態において、製剤は、バッグ又はボトルに収容されている。さらに別の実施形態において、製剤は、シリンジ又はカートリッジに収容されている。

【0030】

本発明は、本発明による製剤を調製することを含む、アデノウイルスを保護する方法にも関する。

【0031】

さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される製剤を調製すること及び前記製剤を２℃〜８℃の範囲の温度で保存することを含む、アデノウイルスを保護する方法に関する。

【0032】

幅広い温度範囲にわたる増大した長期安定性は、本明細書に開示されるウイルス製剤の長期の保存寿命をもたらし、ウイルス効力の低下を許容できるものにしながら（すなわち、２〜８℃で２年あたり０．３ｌｏｇ以下）、好ましくは約１〜２年の期間、又はそれを超える期間にわたるこれらの製剤の保存及び最終的な宿主投与を可能にする。さらに、本発明の製剤は、高温、長期の凍結／解凍サイクル、及び撹拌への曝露の間に安定性を示す。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】製剤Ｂ（白菱形）及び対照製剤（黒丸）における、２５℃の加速温度（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）の間のＡｄ２６の効力（ｌｏｇ ＩＵ／ｍＬで表す）低下（Δ）。効力_{ストレスを受けた試料}−効力_対照試料を反映している、平均Δ効力（ｎ＝４）が示されている。効力はＱＰＡにより測定された。

【図2】製剤Ｂ（白菱形）及び対照製剤（黒丸）における、２５℃の加速温度の間のＡｄ３５の効力（ｌｏｇ ＩＵ／ｍＬで表す）低下（Δ）。効力_{ストレスを受けた試料}−効力_対照試料を反映している、平均Δ効力（ｎ＝４）が示されている。効力はＱＰＡにより測定された。

【図3】製剤Ｂ及び対照製剤中のＡｄ２６の熱融解温度。Ａｄ２６のＴＭＡ（熱融解アッセイ）分析（ｎ＝３）はｔ＝０試料で実施された。

【図4】製剤Ｂ及び対照製剤中のＡｄ３５の熱融解温度。Ａｄ３５のＴＭＡ（熱融解アッセイ）分析（ｎ＝３）はｔ＝０試料で実施された。

【図5】２５℃で６９日後の、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、エタノール、及びこれらの組み合わせのある場合とない場合の製剤Ｂ中のＡｄ２６のデルタＣｔ（ΔＣｔ）値。ΔＣｔ値は効力の低下に直接相関し、数字が大きいほど、より多くの効力低下を意味する。

【図6】３５℃で１６日後の、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、エタノール、及びこれらの組み合わせのある場合とない場合の製剤Ｂ中のＡｄ２６のデルタＣｔ（ΔＣｔ）値。ΔＣｔ値は効力の低下に直接相関し、数字が大きいほど、より多くの効力低下を意味する。

【図7】３０サイクルの凍結／解凍と、それに続く１日の撹拌の後の、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、エタノール、及びこれらの組み合わせのある場合とない場合の製剤Ｂ中のＡｄ２６のデルタＣｔ（ΔＣｔ）値。ΔＣｔ値は効力の低下に直接相関し、数字が大きいほど、より多くの効力低下を意味する。

【図8】ｔ＝０（黒丸）、２５℃で６９日（白菱形）、３５℃で１６日（黒三角）、及び３０サイクルの凍結／解凍とそれに続く撹拌（白四角）の、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、エタノール、及びこれらの組み合わせのある場合とない場合の製剤Ｂ中のＡｄ２６の、３５０ｎｍでの吸光度により測定された濁度測定。

【図9】ｔ＝０（黒丸）、２５℃で６９日（白菱形）、３５℃で１６日（黒三角）、及び３０サイクルの凍結／解凍とそれに続く撹拌（白四角）の、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、エタノール、及びこれらの組み合わせのある場合とない場合の製剤Ｂ中のＡｄ２６の内部蛍光。

【図10】製剤Ｆ及び対照製剤中のＡｄ２６の熱融解温度。Ａｄ２６のＴＭＡ分析（ｎ＝３）は、ｔ＝０試料で実施された。

【図11】ストレス条件凍結／解凍（ＦＴ）＋撹拌（ＡＧ）＋３５℃での保存による、ＣＱＡ効力の成功確率のペアプロット（Δ効力限界≧−０．３０ｌｏｇ ＩＵ／ｍＬ）。成功確率の目盛は、０．４（薄い灰色）〜１（黒）である。完全な実験領域が調査される。白い四角には、プロットに基づいて提案された設計空間がある。

【発明を実施するための形態】

【0034】

上述の通り、長期間にわたる保存の間に、含まれるアデノウイルスの量及び効力を保護することにより、アデノウイルスの安定性を向上させる製剤を見出すことが当技術分野に必要とされている。

【0035】

いくつかの参考文献は、アデノウイルスの製剤のための特定の成分の使用を開示している。Ａｌｔａｒａｓ ｅｔ ａｌ．は、フリーラジカル酸化の阻害剤になり得るものの膨大なリストの一部としてクエン酸塩を開示している。前記リストは、ＥＤＴＡとエタノールとの組み合わせ（ＥＤＴＡ／エタノール）も含むが、それは、フリーラジカル酸化のさらなる阻害剤として特定されている。本発明の製剤は、クエン酸塩を酸化防止剤としてではなく緩衝剤として使用する。

【0036】

Ｒｅｎｔｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．は、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）を、特定のタンパク質の安定性を高め、鼻腔内投与中の凝集を避けるために使用される添加剤の１つとして特定している。Ｒｅｎｔｅｒｉａ ｅｔ ａｌ．は、粘膜取込みを増大させる鼻腔内投与に適切な製剤に関連して、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの使用を開示している。タンパク質は全て、アデノウイルスなどの生きているウイルスと比べて、構造、電荷、及びサイズの点で非常に異なっている。その結果、タンパク質の安定化機構を考慮すると、アデノウイルスのための安定化機構は、完全に異なり、予測不可能である。

【0037】

国際公開第０２９０２４号パンフレットは、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを、凍結乾燥製剤の調製に使用される凍結乾燥保護剤になり得るものの膨大なリストの一部として、開示している。国際公開第０２９０２４号パンフレットは、本発明に開示される液体組成物とは異なり、凍結乾燥された組成物に関する。液体製剤の利点は、あまり費用がかからず、投与前の取り扱いにあまり時間がかからず、臨床の投薬又は再構成の間違いを起こしにくいことである。さらに、凍結乾燥プロセスの規模拡大は、厄介な試みになり得る。

【0038】

本発明者らは、先に開示された製剤に比べて、アデノウイルスの量及び効力（感染力）並びに質を保護することにより、アデノウイルスの安定性を向上させるアデノウイルスの製剤を見出し、本明細書に記載する。

【0039】

本発明の製剤は、少なくとも１種の組換え型アデノウイルスを含む。アデノウイルスベクターの構築は、当技術分野に十分に理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｄ ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ（１９９２），ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、及び本明細書に言及される他の参照文献に記載されている技法など、標準的な分子生物学的技法の使用を含む。手短に言うと、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えば、Ｅ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須な遺伝子機能を欠損し得る。アデノウイルスを製造する当業者に公知である通り、アデノウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域によりコードされる機能は、組換え型アデノウイルスを製造する際に、好ましくは、例えばゲノムに一体化された産生細胞により、又はいわゆるヘルパーアデノウイルス若しくはヘルパープラスミドの形態で、トランスに与えられなくてはならない。

【0040】

組換え型アデノウイルスの増殖は、米国特許第６，４９２，１６９号明細書、又は国際公開第０３／１０４４６７号パンフレット、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書、及び同第６，１１３，９１３号明細書、並びにＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）のそれぞれ６７章及び６８章のＴｈｏｍａｓ Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”に詳記されており、これは引用により本明細書に組み込まれる。複製欠損アデノウイルスベクターは、ベクターＤＮＡの源として、アデノウイルス又はキメラのアデノウイルスのあらゆる種、菌株、サブタイプ、又は種、菌株、若しくはサブタイプの混合物を使用して生成できる（例えば、国際公開第９６／２６２８１号パンフレット、同第００／０３０２９号パンフレット参照）。本発明の特定の実施形態において、ヒトアデノウイルスの血清型は、血清型２、４、５、７、１１、２６、３４、３５、３６、４８、４９、若しくは５０、又はあらゆるハイブリッド若しくは変異型アデノウイルス血清型のいずれか１つを含む。本発明の好ましい一実施形態において、組換え型アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、２６、又は３５由来である。

【0041】

さらなる実施形態において、本発明のアデノウイルスは、サルアデノウイルス、好ましくは、チンパンジー又はゴリラアデノウイルスである。これらのアデノウイルスは、一般的に、ヒトの集団において低い血清有病率及び／又は低い既存の中和抗体価を有する。

【0042】

さらなる実施形態において、本発明のアデノウイルスは、さらに、非相同核酸を含む。好適な非相同核酸は当業者に周知であり、例えば、導入遺伝子オープンリーディングフレーム、例えば、ベクターがワクチン接種目的で使用される場合に免疫応答が望まれるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、全て当業者に周知である、マラリア（例えば、国際公開第２００４／０５５１８７号パンフレット参照）、ＨＩＶ、結核（例えば、国際公開第２００６／０５３８７１号パンフレット参照）、特定のウイルスなどに対する免疫応答を発生させるのに好適な導入遺伝子を含み得る。実際には、導入遺伝子の性質は本発明にとって重要でなく、どのような非相同の核酸配列でもよいため、ここではさらなる詳述は必要ない。

【0043】

本明細書での用語「安定性」は、期待される有用性の時間尺度での、アデノウイルス粒子の効力を保持する製剤中でのその分解に対する相対的な抵抗を指す。効力が、２〜８℃で２年あたり０．３ｌｏｇ以下の減少を示すことが好ましい。

【0044】

本明細書での用語「効力」は、以下で説明されるセルベースの効力アッセイで測定される感染単位で表されるアデノウイルス活性の尺度を指す。

【0045】

本発明による組成物は、２５℃±２℃で１〜３か月間の製剤のインキュベーションにより実施される加速安定性試験において、６０日あたり０．４ｌｏｇ以下の効力の減少及び６０日あたり０．３ｌｏｇ以下の力価の減少を示す。

【0046】

本発明による組成物は、バイアルが、反復される凍結／解凍サイクルと、それに続いて、室温で、２００ｒｐｍで水平方向の２４時間の撹拌に付される試験において、１０サイクルあたり０．２ｌｏｇ以下の効力の減少も示す。

【0047】

「薬学的に許容できる賦形剤」とは、望ましい又は簡便な剤形を調製するためにウイルスなどの活性分子と組み合わされる、あらゆる不活性な物質を意味する。「薬学的に許容できる賦形剤」は、利用される用量及び濃度で受容者にとって非毒性であり、ウイルス調製物を含む製剤の他の成分と適合性のある賦形剤である。賦形剤の例は、凍結保護剤、非イオン性洗剤、緩衝剤、塩、及びフリーラジカル酸化の阻害剤である。

【0048】

用語「副生成物」は、所与の製剤中の治療的／予防的なアデノウイルスの比率を減じるか、又は減少させる望まれない生成物を含む。典型的な副生成物には、例えば、タンパク質変性、脱アミド、加水分解、又はこれらに組み合わせから生じるアデノウイルスの凝集物及びアデノウイルスの断片がある。典型的には、凝集物は、単離されたウイルス粒子よりも分子量が大きい複合体である。

【0049】

本明細書で「安定製剤」とも称される、アデノウイルスの安定性を向上させる製剤は、その中のアデノウイルスが、保存時にその物理的及び／若しくは化学的完全性並びに／又は生物学的活性を基本的に保持している製剤である。安定性は、特定の保存条件下である期間にわたり、（製剤中のアデノウイルスの）量、製剤中のアデノウイルスの効力、及び／又は他の質的な側面などの種々の特性を決定することにより評価できる。アデノウイルス製剤のこれらの特性は、高温（実時間での温度を予測する）でも、他のストレス条件下でも測定でき、例えば、保存寿命を最大にする異なる製剤の影響を試験するために、製剤を、２５℃でのインキュベーションに付すことも、凍結／解凍サイクル及び撹拌に付すこともできる。安定性を決定する前記特性は、目視検査、ウイルス粒子定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｖｐ−ＱＰＣＲ）、ＱＰＣＲ系効力アッセイ（ＱＰＡ）、逆相高速液体クロモトグラフィー（Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び頻度別遠心沈降法（ＤＣＳ）、熱融解アッセイ（ＴＭＡ）、濁度測定、並びに内部蛍光からなる群から選択される方法の少なくとも１つにより決定できる。

【0050】

ウイルス粒子定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｖｐ−ＱＰＣＲ）
ｖｐ−ＱＰＣＲは、アデノウイルスベクター内に存在する導入遺伝子カセットのＣＭＶプロモーターの１００ｂｐ領域を標的にするプライマーを利用するアデノウイルス粒子の定量化のために開発された。簡単に言うと、このＱＰＣＲ法は、Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に基づいており、それは、１００ｂｐアンプリコンの真中でアニールされた特定の蛍光プローブの分解を起こす。このプローブは発光体及び消光体に共有結合しており、その分解は、発光体を消光体から解放し、その結果、テンプレートの量に比例する蛍光発光が生じる。定量値は、蛍光シグナルの増加が閾値を超えるサイクルである閾値サイクル（Ｃｔ）から得られる。ＤＮＡ系の蛍光の検出の閾値は、バックグラウンドよりわずかに高く設定される。蛍光が閾値を超えるサイクルの数は閾値サイクル（Ｃｔ）と呼ばれ、或いは、ＭＩＱＥガイドラインによると、定量化サイクル（Ｃｑ）と呼ばれる（Ｂｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ，２００９）。対数増殖期の間に、標的ＤＮＡ配列はサイクルごとに２倍になる。例えば、Ｃｔが別の試料のＣｔより３サイクル高いＤＮＡ試料は、２^３＝８倍多くのテンプレートを含んでいた。したがって、高いＣｔ値はより少量の標的ＤＮＡを表し、低いＣｔ値は標的ＤＮＡの高いアベイラビリティを表す。絶対的な定量化は、濃度が２６０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ_２６０）により決定されたストックアデノウイルスの段階希釈液により作成された標準曲線を比較することにより実施できる。試験物質のＣｔ値は、標準曲線のＣｔ値に対してプロットされ、ベクター粒子の正確で精密な数がもたらされる。

【0051】

Ｅ１コンピテントセル上でのインキュベーション後に読み取られたまま使用される場合（ＱＰＡ、以下参照）、より分解した試料はより高いデルタ（ｔ＝０が引かれている）Ｃｔ値につながり、より安定化する製剤はより低いＣｔ値につながるであろう。

【0052】

ＱＰＣＲ系効力アッセイ（ＱＰＡ）
ＱＰＡは、アデノウイルス効力を定量化するためにＱＰＣＲを組織培養系感染力アッセイと組み合わせるものである。アッセイは、新たに合成されたウイルスＤＮＡの出現が、細胞単層の接種後、非常に急速であり、幅広い感染多重度（ＭＯＩ）にわたってウイルス投入（ｉｎｐｕｔ）濃度に比例するという実験観察に基づいている。試料の希釈液（非終点希釈）は、９６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞単層に接種される。３５℃で３時間感染が進行する。ウェルは吸引され、アデノウイルスを含まない培地で満たされる。プレートがさらに４２時間インキュベートされてから、アデノウイルスＤＮＡを放出するために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液により細胞溶解され、１回の凍結／解凍工程にかけられる。ＱＰＣＲは、上述の方法に従って、希釈された細胞ライセートに対して実施される。感染価は、終点滴定（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により決定される、既知の感染力の試料のＣｔ値により作成された標準曲線との比較により計算される。或いは、感染価、又は効力がＣｔ値に直接相関しているため、デルタ効力はＣｔ値として直接表現できる。特に、製剤間の効力の相対的な違いを比較する際には、これは、迅速で信頼できる方法である。

【0053】

逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
アデノウイルスのいくつかの質の側面を決定するために、アデノウイルスタンパク質プロファイルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分析できる。ＨＰＬＣは、試料と、移動相（緩衝剤又は溶媒）と、固定相（カラム中のクロマトグラフィーの充填材）との間の種々の化学的相互作用を利用して、混合物の成分を分離する。高圧ポンプは、移動相をカラム内に移動させ、検出器は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出を利用して分子の保持時間（ｔ_Ｒ；試料注入とピーク極大の出現の間の時間）を示す。ＲＰ−ＨＰＬＣの分離は、疎水性の違いに基づいている。非極性の固定相は、疎水性アルキル鎖（鎖長：Ｃ４、Ｃ８、及びＣ１８）でできている。極性の移動相は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水である。カラムに結合する化合物は、増加する濃度の０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用して溶離する。一般に、疎水性表面積が大きい分析物がより長い保持時間を有する一方で、極性基の存在は保持時間を短くする。典型的なアデノウイルスのＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルは、コアタンパク質（ＶＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）、及びヘキソン（ＩＩ）を含む１０又は１４タンパク質からなる。

【0054】

頻度別遠心沈降法（ＤＣＳ）
ＤＣＳは、沈降により粒径分布（凝集）を測定する方法である。ディスク型遠心分離機において、粒子は、ストークスの式に従い、高重力の下で、スクロース勾配（既知の粘度及び密度）中で沈殿する。沈降速度は、粒径の二乗と共に増加し、そのため、大きさがわずか数パーセント異なる粒子が、著しく異なる速度で沈殿する。検出器に到達するのに要する時間が、粒子の大きさの計算に使用される。この方法の測定範囲は約０．０２〜３０ミクロンである。

【0055】

熱融解アッセイ（ＴＭＡ）
熱融解アッセイ（ＴＭＡ）を利用して、ウイルスのカプシドが変性する温度である、実験的製剤中のアデノウイルスの融解温度（Ｔ_ｍ）を測定できる。このウイルスの崩壊は、ｄｓＤＮＡ挿入蛍光色素を使用してリアルタイムに測定できる。この蛍光色素はＤＮＡに結合した時のみ蛍光シグナルを与えるが、ＤＮＡはウイルス粒子が崩壊する時に放出される。カプシド融解時の指数関数的な蛍光の増加は、通常のＱＰＣＲ機を利用して、段階的な温度上昇の間に測定できる。試料は、特定の製剤中で同じ濃度（範囲は、４×１０^９〜１×１０^１２ｖｐ／ｍＬ）に希釈され、５０μＬの体積のＳＹＢＲＧｒｅｅｎ色素（１×最終濃度）と混合される。温度は、３０℃から出発して７９℃まで、３０秒あたり０．５℃上昇された。蛍光生データから、一次導関数及び二次導関数が計算され、融解温度が、二次導関数のｘ軸との切片で読み取られる。高い融解温度（Ｔ_ｍ）は、より安定化する製剤を示し得る。

【0056】

濁度アッセイ
濁度測定は、試料中の分子が光を吸収しない波長（例えば、タンパク質が主な発色団である試料では３５０ｎｍ）で検出される、試料中の粒子の散乱による透過光（見かけの吸光度）の強度の低下を測定するものである。分子が凝集するか、又は超分子複合体を形成すると、別々な粒子から来る場合にはランダムであった光散乱がコヒーレントになり、そのため測定される強度が増加する。これにより、光散乱及び濁度測定は、凝集及び複合体の形成又は分離を検出する有用な技法になる。

【0057】

濁度アッセイにおいて、試料は、三連で、ＵＶ透過平底マイクロプレートに移される。プレートはＵＶ透過シールで覆われる。吸光度スペクトルが、マイクロプレートリーダーにより、２３０と５００ｎｍの間で記録され、９７５ｎｍでの吸光度が測定されて、光路長の差が決定され、おそらくそれに対して補正される。アデノウイルスを含まない製剤からなる対照試料がアッセイに含められて、必要な場合、散乱又は吸収マトリックス成分に対して補正される。３５０ｎｍでの見かけの吸光度が、濁度の定量的な尺度として使用される。

【0058】

濁度アッセイは、アデノウイルス試料の安定性を示すものである。ウイルスの凝集は濁度の上昇をもたらし、カプシドの分離は低下をもたらす。アッセイの精度は、１ＮＴＵを超える濁度値で５％（ＣＶ％）未満である。

【0059】

ストレスを受けた試料に関して得られた濁度は、常に対照試料と比較しなければならない。ストレスを加えた後の上昇又は低下は分解経路に依存し、各医薬品原体（ＡＰＩ）に特異的であるため、それは予測できない。ｔ＝０試料に比較した変化（上昇でも低下でも）は、安定性の低い製剤を示す。ｔ＝０試料に同等な、ストレスを受けた試料は、より安定であると予測される。

【0060】

内部蛍光アッセイ
アデノウイルスのカプシドタンパク質は、励起の後に光を再び発する芳香族アミノ酸、とりわけトリプトファンを含み、程度は低いがチロシン及びフェニルアラニンも含む。トリプトファンの発光極大及び量子収量は、その環境の極性に強く依存する。極性水性環境（例えば、球状のタンパク質の表面）中では量子収量は比較的低く、無極性環境（例えば、凝集物の内部）中では量子収量は増加する。この特徴のため、トリプトファン蛍光は、タンパク質の配座変化、凝集、及び分子相互作用の研究に有用なツールである。

【0061】

内部蛍光アッセイにおいて、試料は、三連で、ＵＶ透過平底マイクロプレートに移される。プレートはＵＶ透過シールで覆われる。トリプトファンの蛍光は、中心波長が２８０ｎｍでバンド幅が１０ｎｍである励起フィルター及び中心波長が３４０ｎｍでバンド幅が１０ｎｍの発光フィルターを利用して、マイクロプレートリーダーにより測定される。シール及びメニスカス形状の影響を最小限にするため、底部光学部品（Ｂｏｔｔｏｍ ｏｐｔｉｃ）が使用される。

【0062】

蛍光強度は、アデノウイルス安定性の感度の良い尺度であることが当技術分野に公知である。ストレスを受けると、試料中で起こる変化の性質に依存して、増加か減少のいずれかが観察され得る。タンパク質のアンフォールディング及びカプシドの分離は内部蛍光の減少につながると予測され、凝集は増加につながると予測される。アッセイの精度は、利用された範囲で５％（ＣＶ％）未満である。

【0063】

ストレスを受けた試料に関して得られた蛍光は、常に対照試料と比較しなければならない。ストレスを受けた後の増加又は減少は分解経路に依存し、各医薬品原体（ＡＰＩ）に特異的であるため、それは予測できない。ｔ＝０試料に比較した変化（上昇でも低下でも）は、安定性の低い製剤を示す。ｔ＝０試料値に近いままでいる、ストレスを受けた試料は、より安定である。

【0064】

アデノウイルスは、とりわけ量及び効力の点で最小限の低下（すなわち０．３ｌｏｇ／２年）を示し、大きなタンパク質修飾を全く示さない場合、医薬製剤中で「その物理的安定性を保つ」。さらに、目視調査で、凝集、沈殿、色の変化及び／又透明性の徴候が全く観察されてはいけない。

【0065】

本願で使用される「約」は、特記されない限り、±１０％を意味する。

【0066】

本発明は、好ましくは、遺伝子治療及び／又はワクチン用途に使用するための、アデノウイルスを安定化させる製剤及び関連する医薬製品に関する。本明細書に開示される好ましい安定化されたウイルス含有製剤は液体アデノウイルス製剤であり、非経口投与にも適合性がある一方で、約２〜８℃の範囲で保存される場合向上したアデノウイルスの安定性を示す。しかし、これらの製剤は、より低温で、例えば、−２０℃以下、−４０℃以下、−６５℃以下、−８０℃以下でも保存できる。それらは、８℃を超える温度、例えば、２５℃以上でもより安定であり得る。

【0067】

アデノウイルスを安定化できるこれらの製剤は、クエン酸緩衝剤、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、塩、及び非イオン性洗剤、並びに加えられるウイルスに対する安定性を増大させる任意選択の追加成分を含む。前記緩衝剤のｐＨは、５．５〜６．５である。

【0068】

本発明の製剤は、種々のウイルス濃度、一価又は多価のアデノウイルスに安定性を与え、種々の脊椎動物生物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに投与できる。安定化された本発明のウイルス製剤は、例えば、以前に感染していない個体に予防的な利点を与え、且つ／又は治療効果を与え得るワクチンとして投与できるアデノウイルス系の組成物である。

【0069】

本発明の好ましい態様は、約１×１０^７ｖｐ／ｍＬ（ウイルス粒子／ｍＬ）〜約１×１０^１３ｖｐ／ｍＬの範囲のウイルス濃度で本明細書に記載される増大した安定性特性を示す、組換え型アデノウイルス（すなわち、当業者に利用可能なあらゆる哺乳類／ヒトの遺伝子治療系又は遺伝子ワクチン接種系の方法におけるなど、宿主投与の後に標的宿主内で発現される導入遺伝子の全体又は一部を含むアデノウイルス）のための製剤である。より好ましい範囲は、約１×１０^９〜１×１０^１３ｖｐ／ｍＬであり、特に好ましいウイルス濃度は約１×１０^１０〜５×１０^１２ｖｐ／ｍＬである。本発明の製剤の治療的又は予防的な組成物は、それぞれの疾病を治療又は予防するのに十分な量で個体に投与できる。もちろん、ヒト投与の有効量は、個体の状態、体重、性別、及び年齢などの種々の因子により様々になり得る。他の因子には、投与様式がある。好ましい一実施形態において、本発明の製剤は、非経口使用に好適である。

【0070】

本発明の製剤は、５．５〜６．５の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝溶液であり、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）をさらに含み、任意選択で２又は４炭素アルコールを含む。意外にも、前記組み合わせが、本明細書に示される通り、アデノウイルスの量、効力（感染力）、及び質の保護のための優れた製剤であることが判明した。

【0071】

好ましい一実施形態において、クエン酸塩の濃度は、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、例えば、約５ｍＭ〜２５ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ〜２５ｍＭの範囲、例えば、約２０ｍＭである。

【0072】

広い温度範囲にわたり長期の保存期間の間ウイルス安定化に寄与する、これらの製剤中の別の必須成分はＨＢＣＤであり、凍結保護剤として使用される。好ましい一実施形態において、ＨＢＣＤの濃度は約１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）、例えば、約３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）、例えば、約４％（ｗ／ｗ）〜６％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば、約５％（ｗ／ｗ）である。

【0073】

本発明の製剤の追加成分は塩である。塩はウイルスの安定性を増大させる。製剤に塩を含める目的は、所望のイオン強度又は重量オスモル濃度を得て、さらに静電相互作用を最適化することである。塩は、宿主にとって生理的に許容し得る重量オスモル濃度で存在する。イオン強度への寄与は、緩衝性化合物により作られるイオン並びに非緩衝性の塩のイオンから生じ得る。本発明の製剤に適切な塩には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、又は塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）があるが、これらに限定されない。従来技術とは対照的に、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）はアデノウイルスの安定性に有害であることが示された。したがって、好ましい一実施形態において、本発明による製剤は塩化マグネシウムを含まない。

【0074】

好ましい一実施形態において、本発明によるウイルス製剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。好ましい一実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１０ｍＭ〜２５０ｍＭ、例えば、約２０ｍＭ〜２００ｍＭ、例えば、約３０ｍＭ〜１５０ｍＭ、例えば、約５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、例えば、約８０ｍＭである。

【0075】

本発明の製剤は、容器表面への吸着を減らし、できればウイルス安定化の増大を与える（例えば、凝集の減少により）ために加えられる少なくとも１種の非イオン性洗剤（非イオン性界面活性剤とも称される）を含む。本発明の製剤に使用するための非イオン性洗剤には、ポリソルベート−８０（ツイン８０（登録商標））、ポリソルベート−６０（ツイン６０（登録商標））、ポリソルベート−４０（ツイン４０（登録商標））、及びポリソルベート−２０（ツイン２０（登録商標））を含むがこれらに限定されないポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、並びに非イオン性界面活性剤のプルロニックシリーズ（例えば、プルロニック１２１）があるが、これらに限定されない。

【0076】

好ましい一実施形態において、非イオン性洗剤の濃度は、約０．００１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．００５％（ｗ／ｗ）〜０．５％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．１％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０５％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１５％（ｗ／ｗ）〜０．０３％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば、約０．０２５％（ｗ／ｗ）である。

【0077】

好ましい一実施形態において、本発明によるウイルス製剤はポリソルベート−８０を含む。ポリソルベート−８０の濃度は、好ましくは、約０．００１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．００５％（ｗ／ｗ）〜０．５％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．１％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０５％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１５％（ｗ／ｗ）〜０．０３％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば、約０．０２５％（ｗ／ｗ）である。

【0078】

好ましい一実施形態において、本発明によるウイルス製剤はＥＤＴＡをさらに含む。より好ましい実施形態において、ＥＤＴＡの濃度は、約０．０５ｍＭ〜０．２ｍＭ、例えば、約０．０５ｍＭ〜０．１５ｍＭ、例えば、約０．０８ｍＭ〜０．１２ｍＭの範囲、例えば、約０．１ｍＭである。

【0079】

別の好ましい実施形態において、本発明によるウイルス製剤はエタノールをさらに含む。より好ましい実施形態において、エタノールの濃度は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．２％（ｗ／ｗ）〜０．８％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．２％（ｗ／ｗ）〜０．６％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば、約０．４％（ｗ／ｗ）である。

【0080】

好ましい一実施形態において、本発明によるウイルス製剤がエタノールを含む場合、必ずしも同時にＥＤＴＡを含む必要はない。

【0081】

上記の議論を考慮すると、本発明は、当技術分野に公知である最良の製剤（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００４に開示）に比べて向上した安定性を示し、少なくとも、クエン酸緩衝剤、凍結保護剤としてのＨＢＣＤ、塩、及び界面活性剤を含む、例えば、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種用途に使用できる組換え型Ａｄ５、Ａｄ２６、又はＡｄ３５などのアデノウイルスを含む製剤に関する。

【0082】

本発明の特定の実施形態は、クエン酸塩により５．５〜６．５の範囲のｐＨに緩衝され、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、塩、非イオン性洗剤、及び２又は４−炭素アルコールをさらに含む、そのような組換え型アデノウイルス製剤に関する。

【0083】

本発明による好ましい実施形態において、製剤は、約ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝剤を含み、凍結保護剤としてのＨＢＣＤ、塩としてのＮａＣｌ、界面活性剤としてのポリソルベート−８０、及び前例のない追加の凍結保護剤としての２−又は４−炭素アルコールを含む。

【0084】

本発明による別の好ましい実施形態において、製剤は、約ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝剤を含み、凍結保護剤としてのＨＢＣＤ、塩としてのＮａＣｌ、界面活性剤としてのポリソルベート−８０、及びＥＤＴＡを含む。

【0085】

本発明による別の好ましい実施形態において、製剤は、約ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝剤を含み、凍結保護剤としてのＨＢＣＤ、塩としてのＮａＣｌ、界面活性剤としてのポリソルベート−８０、及び前例のない追加の凍結保護剤としてエタノールを含む。

【0086】

本発明による別の好ましい実施形態において、製剤は、約ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝剤を含み、凍結保護剤としてのＨＢＣＤ、塩としてのＮａＣｌ、界面活性剤としてのポリソルベート−８０を含む。この製剤はエタノールをさらに含み、ＥＤＴＡを含まない。

【0087】

本発明による好ましい実施形態において、製剤は、約５．９〜６．２の範囲のｐＨを有し、約１０〜２５ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；４％（ｗ／ｗ）〜６％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；７０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１８％（ｗ／ｗ）〜０．０３５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０；及び約０．３％（ｗ／ｗ）〜０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のエタノールを含む。

【0088】

本発明による別の好ましい実施形態において、製剤は約５．８〜６．２の範囲のｐＨを有し、約１５〜２５ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；３％（ｗ／ｗ）〜８％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０；及び約０．０５ｍＭ〜０．１５ｍＭの範囲の濃度のＥＤＴＡを含む。

【0089】

本発明による別の好ましい実施形態において、製剤は約５．９〜６．２の範囲のｐＨを有し、約１０〜２５ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；４％（ｗ／ｗ）〜６％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；７０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１８％（ｗ／ｗ）〜０．０３５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０；及び約０．０５ｍＭ〜０．１５ｍＭの範囲の濃度のＥＤＴＡを含む。

【0090】

本発明のさらにより好ましい実施形態において、製剤は約２０ｍＭのクエン酸塩により約６のｐＨに緩衝され；ＨＢＣＤは約５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在し；ＮａＣｌは約８０ｍＭの濃度で存在し；界面活性剤は約０．０２５％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０であり；ＥＤＴＡは約０．１ｍＭの濃度で存在する。

【0091】

本発明のさらにより好ましい実施形態において、製剤は約２０ｍＭのクエン酸塩により約６のｐＨに緩衝され；ＨＢＣＤは約５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在し；ＮａＣｌは約８０ｍＭの濃度で存在し；界面活性剤は約０．０２５％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０であり；エタノールは約０．４％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。さらに、上述の要素の組み合わせが使用できる。

【0092】

一実施形態において、本発明による製剤は、例えば、ＤＩＮ ２ＲタイプＩホウケイ酸塩ガラスバイアルなどのバイアルに収容されている。別の実施形態において、製剤はバッグに収容されている。本発明の製剤を収容するバッグは、例えば、エチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）又はエチルビニルアルコール（ＥＶＯＨ）でできた層を含み得る。本発明のさらに別の実施形態において、製剤はシリンジに収容されている。

【0093】

本明細書に記載される組換え型ウイルス製剤は、脊椎動物宿主（好ましくは、哺乳類の宿主、特にヒト受容者）に、当技術分野に公知であるあらゆる手段で投与できる。これらの送達経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、吸入若しくは鼻腔内送達、経口送達、舌下投与、皮下投与、経皮投与、皮内投与、唾液腺管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ）投与、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、又は経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与があるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態において、本発明の製剤は非経口投与に適合性がある。

【0094】

本明細書に開示される製剤によると、本発明は、アデノウイルスを保護する方法であって、非経口投与、特にヒトへの非経口投与にも適合性がある一方で、−６５℃未満及び約２〜８℃の範囲及び恐らくこれより高温で保存される場合に向上したウイルス安定性をもたらす、本明細書に開示されるウイルス含有製剤を調製することを含む方法にも関する。

【0095】

したがって、本発明の別の態様は、アデノウイルスを保護する方法であって、本明細書に開示される製剤を調製すること及び前記製剤を２℃〜８℃の範囲の温度で保存することを含む方法に関する。

【0096】

以下の実施例は、本発明を限定せずに、本発明を説明するために与えられる。

【実施例】

【0097】

実施例１．
実験計画及び方法論
いくつかの異なる製剤を試験した後で、１つの製剤が他の製剤より優れていた。この新たな製剤は「製剤Ｂ」とされ、ｐＨ６．０で、５％（ｗ／ｗ）のＨＢＣＤ、２０ｍＭのクエン酸塩、０．０２％（ｗ／ｗ）のＰＳ−８０、及び７５ｍＭのＮａＣｌを含む。

【0098】

２種のアデノウイルス（Ａｄ３５．ＴＢ−Ｓ及びＡｄ２６．Ｍｏｓ１．Ｇａｇ−Ｐｏｌ）の調製物（１つは血清型３５アデノウイルス（Ａｄ３５）を含み、１つは血清型２６アデノウイルス（Ａｄ２６）を含む）を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して緩衝剤交換して製剤Ｂにした。

【0099】

両アデノウイルス調製物を、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００４に記載され、今のところ利用可能な最良の製剤である「対照製剤」にも製剤した。前記「対照製剤」は、ｐＨ７．４で、１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのヒスチジン、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｗ）のスクロース、０．０２％（ｗ／ｗ）のＰＳ−８０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．４％（ｗ／ｗ）のＥｔＯＨを含む。

【0100】

製剤あたり、１２本のカラムを使用した。溶出液を貯め、滅菌濾過し、ガラス瓶中で、２〜８℃で保存した。ｖｐ−ＱＰＣＲによるウイルス価決定のために試料を取出し、全力価を、適切な緩衝製剤により１．７×１０^１１ｖｐ／ｍＬに調整した。その後に、製剤をガラスバイアルに充填し（バイアルあたり０．７ｍＬ）、栓をして、蓋をした。

【0101】

ｔ＝０試料（対照、１群あたり６バイアル）を、−６５℃以下で直接保存した。その後に、１群あたり６つのバイアル（ｎ＝６）を２５℃でインキュベートし、ＱＰＡによる試料分析を試料あたり三連で実施するまで、ｔ＝１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、及び９０日で、−６５℃以下で凍結した。

【0102】

さらに、両製剤中のベクターのｔ＝０試料をＴＭＡ（熱融解アッセイ）により分析して、カプシド融解温度を決定した。より高い融解温度は、ウイルスカプシドのより高い熱安定性に関連する。終点試料（ｔ＝９０日）は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及び頻度別遠心沈降法（ＤＣＳ）によっても分析して、ｔ＝０対照と比べた。

【0103】

結果及び結論
試験の完了後、全試料をＱＰＡにより分析し、ｔ＝０値を引くことにより効力の低下をデルタとして表した。本発明による製剤Ｂ（白菱形）は、有意に（ｐ＝１．４４Ｅ−０５）対照製剤（黒丸）より優れ、両アデノウイルス（図１及び２）で、時間経過に伴う分解が少なく、予測される保存寿命が長かった（表１）。Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳソフトウェア）により、一次（Ａｄ２６）及び二次（Ａｄ３５）モデルを、時間及び時間の二乗を固定効果として使用して、効力データにフィッティングした。固定された「時間」効果は効力の直線的な減少を表す一方で、固定された「時間×時間」効果はこの減少の曲率を表す。両効果をモデルに使用して、その重要性を評価した。赤池情報量基準（ＡＩＣ）は、モデルの複雑さ及びそのフィットの正確度を考慮した統計モデルの相対的な質の尺度である。ＡＩＣが小さいほど、モデルは良好にフィットする。線形モデルでは、傾きは効力低下速度を表わす。傾きを比較すれば、最良の緩衝剤（最低の傾き）を特定できる。

【0104】

保存寿命は、この間隔の下限が所与の仕様を下回る（すなわち効力の低下）時点に相当する。二次モデルでは、保存寿命を計算するために、平均の周りの両側９５％信頼区間をとった。保存寿命評価の下限のみを維持すると、評価は、一変量の低い信頼区間で９７．５％信頼水準につながる。切片（ｔ＝０での効力を反映）を平均化し、生データ及びモデルから除いた。保存寿命を両製剤に関して計算した。

【0105】

【表1】

【0106】

ＲＰ−ＨＰＬＣは、アデノタンパク質修飾の徴候も酸化の徴候も全く示さなかった。ＤＣＳは、凝集の徴候を全く明らかにしなかった。さらに、本発明による製剤は、対照製剤に比べて、Ａｄ２６（図３）とＡｄ３５（図４）の両方で著しく高い融解温度をもたらし、製剤Ｂ中のアデノウイルスの増大した安定性を示している。

【0107】

実施例２
実験計画及び方法論
実施例１に記載した実験の後、１種又は数種の成分（ＮａＣｌ、エタノール、ＥＤＴＡ、又はこれらの組み合わせ）の添加又は省略により、製剤Ｂを改変して、８つの実験的製剤（Ａ〜Ｈ、表２参照）を生み出し、対照製剤（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．に記載、本明細書中上記に詳述）と比べた。製剤は全て、５％のＨＢＣＤ、２０ｍＭのクエン酸塩、及び０．０２％のＰＳ−８０を含む。表２に示される通り、製剤は、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、及び／又は０．５％のエタノール（ＥｔＯＨ）をさらに含む。アデノウイルス（Ａｄ２６）を、これらの９種の製剤中で、２５℃で６９日間若しくは３５℃で１６日間インキュベートするか、又は３０サイクルの凍結／解凍とそれに続く撹拌（室温で１日）に付した。効力低下をＱＰＡにより評価し、デルタ（ｔ＝０を差し引く）Ｃｔ（閾値サイクル）値として表した。さらに、３５０ｎｍでの吸光度を、濁度の尺度として読み取り、内部蛍光を測定して、タンパク質の配座変化及び凝集を検出した。最後に、ＴＭＡ及びｖｐ−ＱＰＣＲを実施して、融解温度及びｖｐ／ＩＵ比を決定した。

【0108】

【表2】

【0109】

結果及び結論
図５に示される２５℃安定性結果に基づき、ＥＤＴＡ（Ｃ及びＤ）又はエタノール（Ｅ及びＦ）と組み合わせたＮａＣｌの添加は、ウイルスの安定性にとって明らかに有益であり、エタノールは明らかにＥＤＴＡより優れていると結論付けることができる。意外にも、ＥＤＴＡとエタノールとの組み合わせは、ＮａＣｌがあってもなくても、より安定な製剤をもたらさない（Ｇ及びＨ）。これは、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの具体的な組み合わせが通常フリーラジカル酸化の阻害剤であり、それによりアデノウイルスの安定性の優れた促進剤であると称される従来技術、例えば、Ａｌｔａｒａｓ ｅｔ ａｌ，２００５及びＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００４から予測されたこととは逆である。

【0110】

３５℃で１６日間のより過酷なモデルに移ると、図６に見られる通り、識別力がより顕著になる。明らかに、ＮａＣｌの添加は安定性を向上させており、エタノールの有益な効果は図６に確認される。驚くべきことに、ＥＤＴＡとエタノールとの組み合わせは、ＮａＣｌがあってもなくても、ウイルスの安定性に明らかな負の効果を有する。これは、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの組み合わせが、フリーラジカル酸化の阻害剤として良好に作用する（例えば、Ａｌｔａｒａｓ ｅｔ ａｌ．２００５及びＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００４）という通常の認識の逆である。まとめると、両方の熱ストレッサーは、この特定の製剤におけるＥＤＴＡかエタノールのいずれかと組み合わせたＮａＣｌの有益な効果を示している。

【0111】

異なる分解経路を有する製剤の性能を調査するために、前記製剤（Ａ〜Ｈ）を凍結／解凍サイクル及び撹拌ストレスに曝した（図７）。観察される効果は、顕著であり、意外でもある。明らかに、ＥＤＴＡ（Ｃ及びＤ）には全く効果がなかった。他方で、エタノールは、凍結／解凍の損傷から強力に保護し、その結果、凍結保護剤として作用した（Ｅ〜Ｈ）。

【0112】

これらの予測不可能な結果を、濁度測定アッセイにおいて３５０ｎｍでの吸光度の読み取りにより確認した（図８）。凍結／解凍（図８の白四角）は、エタノールを含まない製剤において、ｔ＝０に比べて濁度の減少をもたらした。この減少は、おそらくは、ウイルス粒子の崩壊によるものであった。これらの観察と一致して、加速温度ストレス（図８の黒三角）は、エタノール不含製剤において、やはり濁度の減少をもたらしたが、エタノールを含む製剤、具体的には製剤Ｆは、ｔ＝０試料（図８の黒丸）に比べて著しい変化を全く示さない。

【0113】

さらに、内部蛍光（図９）は、先の観察をさらに確認する。エタノールを含まない製剤は、ｔ＝０に比べて、凍結／解凍ストレス後にトリプトファン蛍光の著しい減少を生じ（図９の白四角）、ウイルスカプシド中の激しい配座変化を示す。それとは際立って対照的に、エタノールを含む製剤は、このストレッサーからウイルスを保護している。熱ストレスは、エタノールを含む製剤に、わずかな影響しか与えなかった。

【0114】

ＴＭＡデータは、対照製剤に比べて、製剤Ｆの融解温度の著しい上昇を明らかにしたが（図１０）、これは、製剤Ｆ中のより安定なウイルスカプシドを示している。

【0115】

重要なことに、ウイルス調製物の感染性を反映するｖｐ／ＩＵ比（ウイルス粒子の質を示す）が、加速された温度（２５℃）に曝露された後、製剤Ｆに比べて対照製剤におけるより高い値（粒子の総量あたり感染性粒子が少ない）を明らかにした。表３を参照されたい。これは、製剤Ｆが、対照製剤に比べてはるかに高くアデノウイルスの感染力を保護できることを示す。

【0116】

【表3】

【0117】

実施例３．
実験計画及び方法論
製剤緩衝剤設計空間を定義するために、各賦形剤のロバスト性範囲を評価した。因子を選択した後、表４に報告される通り各成分に対して実験範囲を定義した。

【0118】

実験計画法（ＤＯＥ）の手法に従って、実験空間をマッピングした。６つの因子のそれぞれの低水準と高水準の設計を利用して（表４）、３つの中心値を含む１５の製剤を調製し、各因子の影響及び因子間のあり得る相互作用を高い検出力で試験した（表５）。

【0119】

【表4】

【0120】

【表5】

【0121】

各賦形剤及びｐＨの適切な水準を評価するために（製剤ロバスト性）、各群をガラスバイアルに充填し、１０の凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）サイクルとそれに続く２００ｒｐｍで室温での（ＲＴ）の１日の撹拌及び３５℃で７日間の保存（加速劣化モデル）に付した。次いで、ＱＰＡによる効力（ｎ＝３）を、読み取ったまま使用した。

【0122】

Ａｄ２６調製物を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して緩衝剤交換し、表５に列記した製剤のそれぞれにした。各製剤の溶出液を貯め、滅菌濾過し、ガラス瓶中で２〜８℃で保存した。ｖｐ−ＱＰＣＲによるウイルス価決定のために試料を取出し、全力価を、適切な製剤により１×１０^１１ｖｐ／ｍＬに調整した。その後に、製剤をガラスバイアルに充填し（バイアルあたり０．７５ｍＬ）、栓をして、蓋をした。ｔ＝０試料（対照、１群あたり６バイアル）を、−６５℃以下で直接保存した。その後に、１群あたり４つのバイアル（ｎ＝４）を、ＱＰＡによる試料分析を試料あたり三連で実施するまで、インキュベートし、凍結／解凍し、撹拌し、３５℃で７日間保存した（表６）。

【0123】

結果及び結論
試験の完了後、全試料をＱＰＡにより分析し、ｔ＝０値を引くことにより効力の低下をデルタとして表した。このデータを統計分析に使用した。

【0124】

統計分析のアウトプットは成功確率であったが、成功は、選択された重要品質特性（ＣＱＡ）：効力のための仕様セットを満たす安定な製剤であると定義される。同等性検定を、Ｔ０とストレス後の間で実施して、同等性を比較し、受容基準を、許容され得る効力（ＩＵ／ｍＬ）の最大低下の上に定義した。この実験では、許容される効力低下は、Δ効力限界≧−０．３０ｌｏｇＩＵ／ｍＬであると定義した。

【0125】

得られた実験データを表６に示すが、これを使用して実験領域を減らし、効力に基づいて、設計空間を計算した。

【0126】

データは４５の観察結果を含む。三連で試験された１２の異なる緩衝剤及び３回別々に調製された追加の１つがあり、独立した調製物のそれぞれは三連で試験した（中心値）。

【0127】

【表6】

【0128】

【表7】

【0129】

以下のモデルをデータにフィッティングした：

【数1】

式中、アルファ−ｒ−バッチはランダムなバッチを表し、シグマは残差を表す。

【0130】

モデルから予測を得てリスクベースの設計空間手法を得るために、ベイズの枠組みを採用したが、それは、製剤パラメーターを考慮するとＣＱＡの予測する同時分布が容易に誘導できるからである（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．及びＬｅｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．参照）。リスクベースの設計空間は、以下の確率の記述を使用して定義される。

【数2】

【0131】

言い換えると、設計空間は実験領域χ（しばしば知識空間と呼ばれる）の領域であり、ＣＱＡが仕様内である事後確率（Λ）は、観察されたデータを考慮すると、明示される品質水準πより高い。この表記は、統計モデルに含まれる不確実性の包含を暗黙のものにする。確率は、共同で仕様を満たす保証の直接的な尺度である。この確率を計算するために、統計モデルを、以下の一般的な線形方程式として書くことができる。ｊ番目のＣＱＡに関して、モデルは以下の通り調整される：

【数3】

式中、ｙ_ｉは、良好な統計パラメーターを得るために、ｉ番目のＣＱＡに適用される任意の変換（例えば、恒等変換、対数変換、又はロジット変換）であり、ｉ＝１，．．．，７である。モデルパラメーターｂ_ｉ及び

【数4】

が評価されるものとする（上記の項目参照）。

【0132】

式（１）の事後確率は、以下のスチューデント分布として特定される、新たな応答の予測分布から計算される（添え字ｉは、簡潔のために略される）。

【数5】

【0133】

この３パラメータースチューデント分布は、ｎ−ｐ自由度（ｎの観察結果及びｐのモデルパラメーターに関する）を有し、平均回帰直線

【数6】

を中心とし、

【数7】

の通常の最小二乗推定から計算される。

【0134】

【数8】

式中、パラメーターａは残差平方和であり、すなわち、

【数9】

である。このように、Ｓは、スチューデント分布の規模を定義する。分散推定量はＳ／（ｎ−ｐ）として計算される。

【0135】

実験領域を調査するには、５つの因子でグリッドを作ることは推奨されない（次元性の問題のため：因子あたり２水準が評価される場合、それは２５のサイズのグリッドになるであろう；因子あたり１０水準では、それは１０５サイズのグリッドになるであろう、など）。代りに、いくつかの無作為標本を作り、以下の通り調査した：
ａ）実験領域内で、多数のランダムな（χにわたって不均一に分布する）動作条件（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）（因子設定）

【数10】

を選択する。
ｂ）各操作状態に関して：多数のシミュレーションを実施する：
各ＣＱＡに関して、ｎ^＊試料

【数11】

を式（３）の通り予測分布から抜き出す。
ｃ）ＣＱＡ予測の異なるシミュレーションから、仕様内にある試料の比率を計算する。

【0136】

この比率は、重要品質特性及びその仕様を考慮して品質のアウトプットを得る事後確率推定である。最後に、二次元空間中での結果の投影のペアプロット上でランダムな動作分布（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を目視評価し、設計空間（図１１）を特定することが提案される。

【0137】

次いで、計算を適合させ、因子範囲を減らして、これらの範囲中でＣＱＡ効力の成功確率を最大にするが（表７）、これはいわゆる正常動作範囲（ＮＯＲ）及び設計空間を反映する。表７に示されている範囲は、安定な製剤を有する最高の成功確率を確実にする。そのため、これらの範囲は、最適な製品安定性を確実にする。

【0138】

【表8】

【0139】

参考文献
Ａｌｔａｒａｓ Ｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＤＥ，ｖｏｌ．９９，１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５．
Ｂｏｘ，Ｇ．Ｅ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｇ．，“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｒｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２００５．
Ｂｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．２００９，“Ｔｈｅ ＭＩＱＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５５：４．
Ｅｖａｎｓ ＲＫ，Ｎａｗｒｏｃｋｉ ＤＫ，Ｉｓｏｐｉ ＬＡ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＭ，Ｃａｓｉｍｉｒｏ ＤＲ，Ｃｈｉｎ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｍ，Ｚｈｕ ＤＭ，Ｓｈｉｖｅｒ ＪＷ，Ｖｏｌｋｉｎ ＤＢ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｌｉｑｕｉｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００４ Ｏｃｔ；９３（１０）：２４５８−７５．
Ｌｅｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２３：１３３０−１３５１，２０１３．
Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｊ．Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，１８：９５９−９７５，２００８．
Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ Ｋ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ａ，Ｌｅｍｃｋｅｒｔ ＡＡ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ Ｍ，Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ Ｇ，Ｗａｒｎａｒ Ｃ，ｖｏｎ Ｅｙｂｅｎ Ｒ，Ｐａｕ ＭＧ，Ｇｏｕｄｓｍｉｔ Ｊ．Ｔｈｅ Ｔｈ１ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｂｏｏｓｔｅｄ ｂｙ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ３５ ａｎｄ ２６ ｗｉｔｈ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｓｅｒｔ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｎｏｖ；１７（１１）：１６８７−９４．
Ｒｅｎｔｅｒｉａ Ｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎａｓａｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｔｉｔｅｒ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｔｕａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｄｅｖｉｃｅｓ”Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２８，ｎｏ．９，２５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】